PT1317488E

PT1317488E - Activação mediada por anticorpos, específica do local, de citoquinas pró-apoptóticas: amaize (citoquinas indutoras de apoptose mediada por anticorpos)

Info

Publication number: PT1317488E
Application number: PT1984646T
Authority: PT
Inventors: Harald Wajant; Klaus Pfizenmaier; Dieter Moosmayer; Thomas Wueest
Original assignee: Biontech Ag
Priority date: 2000-09-15
Filing date: 2001-09-07
Publication date: 2013-05-07
Also published as: EP1317488B1; AU2002218163A1; US9944708B2; DE10045591A1; WO2002022680A3; ES2403041T3; DK1317488T3; US8980265B2; EP1317488A2; US20040033511A1; WO2002022680A2; JP2004508819A; US20150152186A1

Description

ΕΡ 1 317 488/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Activação mediada por anticorpos, especifica do local, de citoquinas pró-apoptóticas: AMAIZe (Citoquinas Indutoras de Apoptose Mediada por Anticorpos)" A presente invenção refere-se a polipéptidos que como tal não possuem, ou possuem uma limitada actividade biológica e que apenas são activos quando correspondentemente activados por ligação especifica do local e mediada por anticorpos, os polipéptidos contendo uma região que é um ligante peptídico, contendo adicionalmente uma região de anticorpo ou uma região derivada de um anticorpo, em que a referida região reconhece selectivamente uma molécula especifica na superfície de uma célula, e adicionalmente contendo uma porção citoquina que por si só não possui, ou possui apenas uma limitada actividade biológica. Adicionalmente, a presente invenção refere-se a sequências de ácido nucleico em que os polipéptidos se baseiam, vectores contendo essas sequências de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, células transfectadas com sequências de ácido nucleico ou vectores de acordo com a presente invenção, utilizações da matéria objecto da presente invenção para fins terapêuticos, e composições contendo a matéria objecto do presente pedido.

As citoquinas, e.g. membros da família de ligandos TNF, e.g. TRAIL (do inglês "TNF Related Apoptose ^nducing Ligand", ligando indutor de apoptose relacionado com TNF) , também denominadas Apo2L (Wiley et al. (1995), Immunity 6: 673 -682, Pitti et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 12687 - 12689), e e.g. FasL, apresentam uma forte actividade apoptótica sobre muitas células tumorais de origem animal e humana em estudos in vitro. No caso do TRAIL parece que células não malignas não são afectadas. Além disso, nos estudos pré-clínicos com modelos animais (ratinho, macaco), não foram encontradas pistas de uma toxicidade aguda ou de outros efeitos secundários sistémicos do TRAIL que pudessem ser vistos como limitantes da terapia (Walczak et al. (1999) Nat. Med. 5: 157 - 163; Ashkenazi et al. (1999) J. Clin. Invest. 104: 155 - 162) . Estudos recentes in vitro com hepatócitos primários humanos, contudo, mostraram uma forte actividade citotóxica, e.g. no caso de um produto TRAIL produzido recombinantemente 2 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ e de um TRAIL ligado à membrana da forma de ocorrência natural desta citoquina, respectivamente (Jo et al. (2000) Nat. Med. 6: 564 - 567; Ichikawa et al. (2001) Nat. Med. 7: 954 - 960). Portanto, está interdita uma aplicação clinica directa das citoquinas até agora disponíveis, e.g. moléculas de TRAIL recombinantes que imitam completamente a reactividade do TRAIL ligado à membrana. Adicionalmente, também para a molécula FasL relacionada (ligando do receptor de FasL (Fas, CD95), o protótipo de citoquinas apoptóticas, foi excluída a priori uma aplicação clínica por razões de segurança, pois anticorpos agonistas contra o seu receptor, Fas, são extremamente hepatotóxicos in vivo (Ogasawara et al. (1993) Nature 364: 806 - 809). Finalmente, foi também mostrado que o FasL na sua forma solúvel virtualmente não exibe bioactividade, em contraste com a sua forma ligada à membrana (Schneider et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 1205 - 1213).

Consequentemente, os membros da família de ligandos TNF disponíveis no estado da técnica não são aplicáveis ou apenas podem ser aplicados de uma maneira limitada (e.g. no caso do TNF sob as denominadas condições de "perfusão isolada do membro") para aplicações terapêuticas, e.g. no tratamento de tumores, quer devido à ausência de bioactividade quer devido à extrema toxicidade.

Portanto, o problema subjacente à presente invenção consiste em exercer a actividade da citoquina de uma maneira dirigida e específica do tecido ou da célula e, consequentemente, para evitar, ou pelo menos para limitar estritamente, efeitos secundários indesejáveis potencialmente sistémicos em aplicações clínicas em tecidos/células que não pertencem ao tecido alvo.

Este problema é resolvido de acordo com a invenção pela matéria objecto das reivindicações. Assim, a presente invenção é baseada no facto de que citoquinas de ocorrência natural ligadas a membranas não possuem, ou possuem apenas uma limitada actividade biológica, e.g. em certos subtipos de receptores membranares, quando são proteoliticamente processadas pelo organismo numa forma solúvel correspondente ao domínio extracelular. Isto aplica-se também aos derivados 3 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ produzidos recombinantemente correspondentes ao domínio extracelular do ligando respectivo. Constitui a constatação da presente invenção o facto de que uma citoquina não possuindo actividade/possuindo uma actividade limitada reganha a sua actividade biológica (completa), nomeadamente em relação às próprias células alvo assim como em relação a células vizinhas, desde que essas células expressem os respectivos receptores de citoquinas correspondentes para a proteína de fusão anticorpo-citoquina utilizada, por e.g. ligação específica mediada por anticorpos a um antigénio ligado à membrana celular. A invenção proporciona um polipéptido possuindo propriedades pró-apoptóticas e imunomoduladoras, compreendendo: (i) um segmento (1) consistindo na sequência de aminoácidos de um domínio extracelular de um membro da família do TNF; (ii) em posição N-terminal em relação ao segmento (1), um segmento (2) que é um ligante peptídico; e (iii) um segmento (3) que é um fragmento de anticorpo que se liga a um antigénio na membrana celular, em que o polipéptido reconhece um receptor de citoquinas na membrana celular e em que o fragmento de anticorpo está presente na forma de scFv. Assim, o segmento (3) está localizado no terminal N de um polipéptido de acordo com a presente invenção, o segmento (2) seguindo-se primeiro em posição C-terminal, e o segmento (1) está localizado mais C-terminal. Estes polipéptidos da presente invenção (= proteínas de fusão de acordo com a presente invenção = construções de acordo com a presente invenção) são biologicamente inactivos/têm uma actividade limitada sem ligação específica do local e/ou selectiva do segmento (3) à molécula alvo. É especialmente preferido como segmento (1) um domínio extracelular de TRAIL ("TNF Related Apoptose Inducing Ligand", AA 95-281, n.° de Acesso no NCBI AAC50332 U37518) ou de FasL (AA 139-281, n.° de Acesso no NCBI AAC50124 U11821). 0 modo de actividade destas construções de acordo com a presente invenção, e.g. construções da invenção contendo o indutor apoptótico TRAIL ou FasL como segmento (1), aplica-se particularmente a todos os membros da família de ligandos TNF que são exclusivamente, ou num grau especialmente elevado, 4 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ activos como molécula membranar para certos receptores. Para além do TRAIL, também lhe pertencem o TNF (que analogamente ao TRAIL se relaciona com TNF-R2) e também, por exemplo, os imunomoduladores CD40L e CD30L. Portanto, são especialmente preferidos os polipéptidos de acordo com a presente invenção que reconhecem um receptor de citoquinas ligado à membrana celular como molécula alvo especifica. Pertencem-lhe também, numa listagem não limitante e.g. os seguintes ligandos: TNFSF1 (LTalfa), TNFSF2 (TNF), TNFSF3 (LTbeta), TNFSF4 (OX40L), TNFSF5 (CD40L), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27L), TNFSF8 (CD30L), TNFSF9 (4-1 BBL), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (RANKL), TNFSF12 (TWEAK), TNFSF13 (APRIL), TNFSF13B (BLYS), TNFSF14 (LIGHT), TNFSF15 (VEGI), TNFSF16 (CD30L), TNFSF18 (AITRL) e EDA. Estes podem também servir como segmento (1) numa construção da presente invenção. Neste contexto, são divulgadas em particular todas as proteínas do tipo 2 ligadas a membranas (terminal C extracelular) que dependem de uma organização trimérica das suas subunidades como pré-requisito para a sua actividade biológica. 0 segmento (2) ligante entre os segmentos (1) e (3) (módulos citoquina e anticorpo, respectivamente) das construções polipeptídicas da presente invenção representa, e.g. uma ligação flexível, preferivelmente, contudo, sem influenciar negativamente as propriedades intrínsecas de trimerização da citoquina correspondente, como mostrado nas construções exemplificativas (C) , (D) e (F) (sequência de aminoácidos ligante AAAVELE, cf. Fig. 4). São preferivelmente escolhidos ligantes possuindo propriedades intrínsecas de di-ou multimerização (e.g. trímeros ou hexâmeros) , e.g. de modo a conseguir uma estabilidade acrescida das construções multiméricas, e.g., por propriedades estruturais intrínsecas do péptido ligante tais como estruturas em serpentina enrolada ("coiled-coil") e/ou a formação de pontes de dissulfureto intermoleculares resultantes em ligações covalentes. Neste caso o ligante (segmento (2)) representa um módulo de polimerização.

No caso de um ligante que actua como módulo de dimerização (ligante do tipo 2a), prefere-se por exemplo uma região de charneira de imunoglobulina e um domínio CH3 de um gene de imunoglobulina humana (AA363-489, IgGl humana, N.° de 5 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ

Acesso na NCBI AAF21613) (ligante na construção exemplificativa (A), cf. Fig. 4). Um módulo de trimerização (ligante do tipo 2b) como ligante pode ser formado a partir de, por exemplo, um domínio da molécula de Tenascina (AA110-139, N.° de Acesso na Swiss Prot. P10039, galinha; ou N.° de Acesso na Swiss Prot. P24821, humana). Finalmente, um ligante como módulo de hexamerização, desse modo possuindo propriedades de hexamerização, pode compreender um domínio da molécula de Tenascina prolongado em comparação com um ligante do tipo 2b (AA 34-139, N.° de Acesso na Swiss Prot. P10039, galinha; ou N. ° de Acesso na Swiss Prot. P24821, humana) (ligante do tipo 2c). Em qualquer caso, as sequências de polipéptidos nativos ou fragmentos destes polipéptidos nativos, que são empregues como ligante no segmento (2) do polipéptido de acordo com a presente invenção, podem também estar presentes na forma de suas variantes biologicamente activas no sentido da invenção e de acordo com a definição dada acima.

Alternativamente, são considerados no segmento (2) outros péptidos ligantes de ocorrência natural ou produzidos sinteticamente. Em princípio, um ligante pode corresponder a uma sequência nativa ou variada (parcial) de todos os organismos, preferivelmente de vertebrados, em particular de mamíferos, especialmente de seres humanos. Adicionalmente, por exemplo, são adequados como ligantes todos os segmentos de sequências de proteínas que geram dímeros ou multímeros pela formação de superestruturas secundárias, e.g. "hélices em serpentina enrolada" ("coiled-coil") ou hélices triplas típicas do tipo colagénio (e.g. CMP, COMP, colagénio, laminina). Também, segmentos de proteínas da família Clq, ou das colectinas, são tipicamente adequados para di- ou multimerização. Por exemplo, o domínio extracelular de um membro da família de ligandos TNF como segmento (1) de um polipéptido de acordo com a presente invenção pode ser expresso na forma de um pentâmero por recombinação com os correspondentes domínios de pentamerização de COMP como segmento (2) ligante. De acordo com a presente invenção, estes podem ser homo- ou hetero- dímeros ou multímeros de proteínas de fusão da presente invenção. 6 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ

Um polipéptido da presente invenção será portanto especialmente preferido quando o segmento (3) é um fragmento de anticorpo de mamífero, em particular de origem murina ou humana, ou um fragmento de anticorpo humanizado, por exemplo de origem mamífera. No caso da humanização, o segmento (3) consiste tipicamente num scFv de murino, humanizado por enxerto de CDR ou totalmente de origem humana, sendo produzido de acordo com o estado da técnica. 0 segmento (3) de um polipéptido de acordo com a presente invenção preferivelmente possui uma especificidade para um antigénio selectiva ou predominantemente expresso no tecido tumoral. Em princípio, este antigénio tumoral pode ser expresso nas próprias células malignas ou também na parte não maligna do tumor, nas células estromais ou no endotélio tumoral. Estes antigénios de partes de tecido não maligno de um tumor sólido (carcinoma) são, por um lado, geneticamente invariantes, e por outro lado, estão presentes em diversas entidades tumorais e são, portanto, marcadores tumorais universais. Os exemplos destes antigénios tumorais, contra os quais um fragmento de anticorpo do fragmento (3) do polipéptido de acordo com a presente invenção pode ser dirigido, são o VEGFR e o complexo VEGFR/VEGF, respectivamente, assim como Integrina a^3 e a isoforma βΡη de fibronectina como estruturas alvo grandemente selectivas do endotélio tumoral, e a proteína de activação de fibroblastos (FAP) como marcador selectivo dos estromas tumorais. Todos os exemplos supramencionados podem ser eficientemente capturados com scFv específicos. Por esta razão, estes scFv ("Fv de cadeia única") são especialmente adequados como segmento (3) num anticorpo de acordo com a presente invenção.

Desse modo, um polipéptido preferido de acordo com a presente invenção (vejam-se os exemplos da Fig. 2 e 3) é uma proteína de fusão recombinante, homo-dimérica ou -trimérica, em princípio contendo os seguintes elementos estruturais numa sequência definida (monómero): (segmento (3)) em posição N-terminal, um fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv) murino, humanizado ou humano, consistindo em VH-péptido-ligante-VL; (segmento (2)) uma sequência ligante com ou sem propriedades de multimerização covalente, e.g. um domínio de dimerização (2a), trimerização (2b) ou hexamerização (2c); 7 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ (segmento (1)) em posição C-terminal, o domínio extracelular humano de TRAIL (AA 95-281; N.° de Acesso na NCBI U37518) ou de FasL (AA 139-281, N.° de Acesso na NCBI U11821). Analogamente, por exemplo, o CD40L ou outras citoquinas membros da família dos TNF, podem servir como segmento (1) de polipéptidos correspondentes de acordo com a presente invenção.

No contexto da presente invenção são também divulgados todos os di- ou multímeros que resultam de construções de acordo com a presente invenção por escolha específica do ligante (2), aos quais toda a divulgação em relação às construções de acordo com a presente invenção identicamente se refere. Na medida em que um di- ou multímero de polipéptidos de acordo com a presente invenção de acordo com a presente divulgação caiem sempre na ampla expressão "polipéptido de acordo com a presente invenção".

Outra matéria objecto da presente invenção são sequências de ADN que codificam proteínas de fusão do tipo supramencionado da presente invenção (construções de ácido nucleico) ou que contêm uma região que codifica um polipéptido de acordo com a presente invenção. Estas sequências de ADN são expressas em vectores de expressão, pelo que também os correspondentes vectores de expressão contendo uma sequência de ADN para as proteínas de fusão de acordo com a presente invenção pertencem à matéria objecto da presente invenção. Preferivelmente, os vectores de acordo com a presente invenção são capazes de expressão e/ou amplificação numa célula procariota e/ou eucariota. Em particular, a presente invenção refere-se a vectores plasmídicos, e.g. pBABEpuro, ou também vectores retrovirais, em particular também todos os sistemas de vector que podem ser aplicados em terapia génica, e.g. também sistema de vectores adenovirais. Portanto, no contexto da presente invenção, são também divulgados métodos de terapia génica utilizando vectores ou construções de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção como método de tratamento para as indicações médicas que são divulgadas de acordo com a presente invenção. 8 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ

Adicionalmente, a presente invenção refere-se às células hospedeiras que são transfectadas com sequências de ADN (construções de ácido nucleico) que codificam proteínas de fusão de acordo com a presente invenção. Neste contexto, são especialmente preferidas células hospedeiras que são transfectadas com vectores de expressão ou construções de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, em que os vectores de expressão novamente contêm sequências de ADN que codificam para as proteínas de fusão de acordo com a presente invenção.

Outra matéria objecto da presente invenção são métodos para a produção (expressão e isolamento) de polipéptidos de acordo com a presente invenção, em que um método de isolamento de acordo com a presente invenção é tipicamente caracterizado por (a) se proporcionar um vector ou construção de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, (b) se transfectarem células com um vector ou construção de ácido nucleico obtidos de acordo com o passo step (a) do método, (c) se cultivarem as células transfectadas de acordo com (b) , e (d) se isolarem polipéptidos da presente invenção, expressos sob as condições apropriadas, a partir das células hospedeiras e/ou do sobrenadante da cultura. A expressão da proteína de fusão é tipicamente realizada em sistemas de expressão adequados de acordo com o estado da técnica, preferivelmente na forma de um produto segregado de transfectantes estáveis, e.g. células CHO, ou em outras células animais tais como Cos7 ou Sf9 (células de insecto) ou outros sistemas de células eucariotas, e.g. Pichia pastoris. Preferivelmente, os polipéptidos expressos de acordo com a presente invenção conterão sequências de comando respectivas adequadas para a secreção no sistema celular. Portanto, os vectores de acordo com a presente invenção utilizados para a expressão irão também conter regiões de codificação que codificam uma sequência de comando funcional, e.g. como descrito em Brocks et al. (Immunotechnology 3: 173-184, 1997) para células de mamífero e de insecto, ou vectores pPICZalpha (INVITROGEN) para expressão e secreção na levedura Pichia pastoris.

Os polipéptidos de acordo com a presente invenção, mas opcionalmente também construções de ácido nucleico, vectores ou células hospedeiras (sumarizados aqui na categoria 9 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ "substâncias de acordo com a presente invenção") são também considerados como medicamentos ou para a preparação de um medicamento. São utilizados especialmente no caso de as substâncias de acordo com a presente invenção serem para exercer a sua actividade biológica completa por via do correspondente receptor de citoquinas após ligação mediada por anticorpos da proteína de fusão a uma molécula alvo específica expressa na membrana celular. Escolhendo adequadamente a especificidade do anticorpo, a actividade de citoquina da substância de acordo com a presente invenção é dirigida para o tecido a tratar, e.g. um tecido tumoral, e pode ser produzido um agente terapêutico que é especificamente desenhado/optimizado para a respectiva indicação/entidade tumoral. Por exemplo, na aplicação como agente terapêutico tumoral, em particular para o tratamento de tumores sólidos mas também de tumores linfáticos (benignos ou malignos), primeiro um polipéptido de acordo com a presente invenção é especificamente enriquecido após aplicação in vivo devido à porção anticorpo na área tumoral por marcadores membranares formados pelo próprio tumor ou pelo sistema estromal tumoral/ vascular tumoral reactivo e aí é apresentado às células tumorais positivas para o receptor da citoquina ou células sensíveis à citoquina do tecido normal que fornece o tumor reactivo. A utilização de substâncias de acordo com a presente invenção é em princípio, também, sempre desejável para a aplicação em terapia quando se pretende desencadear a activação de uma via de transdução de sinal, e.g. as cascatas de sinal desencadeadas pela família de receptores de TNF, e.g. uma cascata de sinal apoptótica. Portanto, é divulgada a utilização de substâncias de acordo com a presente invenção para o tratamento ou para a produção de um medicamento para o tratamento de todas as desordens hiperproliferativas, e.g. também para a eliminação direccionada de células do sistema imunitário no caso de reacções imunitárias excessivas, e.g. doenças auto-imunes tais como esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabetes mellitus e TEN, ou reacções imunitárias mal dirigidas contra antigénios estranhos que ocorrem no caso de, e.g. doenças infecciosas (bacterianas (por exemplo, por micobactérias) , virais ou protozoológicas) . Adicionalmente, é divulgado o tratamento de doenças metabólicas ou condições 10 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ hiper-inflamatórias gerais, em particular inflamações crónicas, e.g. também alergias, mas também o tratamento de reacções de rejeição do sistema imunitário de um paciente contra tecidos estranhos. Nos casos acima mencionados, o respectivo segmento (3) de ligação ao antigénio de um polipéptido de acordo com a presente invenção tem que reconhecer marcadores caracteristicos da superfície das células alvo em que preferivelmente deve ser desencadeada uma cascata de sinal apoptótico com o objectivo de morte celular. Portanto, no caso do tratamento após transplantação de tecido estranho, e.g. as células endogénicas do sistema imunitário do paciente de transplantação responsáveis pela reacção de rejeição servirão como células alvo. A matéria objecto da presente invenção tal como construções de ácido nucleico, vectores de expressão ou células hospedeiras são - como acima divulgado - também descritas como medicamentos, e.g. para o tratamento das doenças acima mencionadas. Neste caso, preferivelmente, as células a transfectar são tomadas do paciente a tratar, sendo as referidas células transfectadas in vitro com vectores de expressão de acordo com a presente invenção, cultivadas e depois transferidas para o paciente na forma de um re-transplante. A transfecção é preferivelmente realizada por construções de ácido nucleico ou vectores de expressão que combinam a expressão com um promotor controlável. O endotransplante transfectado pode ser, por exemplo, localmente injectado - dependendo da doença específica e das células alvo específicas. Uma administração local é preferida, e.g. no caso de uma terapia tumoral. Nesta, as células tumorais são tomadas do paciente, transfectadas in vitro e depois, se possível, injectadas directamente no tumor, e.g. no tratamento de tumores dérmicos (e.g. melanomas), tumores do sistema nervoso (e.g. glioblastomas).

Constitui outra matéria objecto da presente invenção uma composição contendo polipéptidos, construções de ácido nucleico, vectores e/ou células hospedeiras de acordo com a presente invenção, assim como excipientes, aditivos e/ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis (e.g. também solubilizantes). Portanto, a presente invenção divulga uma combinação de substâncias de acordo com a presente invenção 11 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ com transportadores, excipientes e/ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis. Modos de produção correspondentes estão divulgados em "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) que faz parte da divulgação da presente invenção. Como transportadores para administração parentérica são divulgados, e.g., água estéril, soluções estéreis de cloreto de sódio, polialquilenoglicóis, naftalenos hidrogenados e, em particular polímeros biocompatíveis de lactida, copolímero de lactida/glicolida ou copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno. Estas composições de acordo com a presente invenção são consideradas para todas as indicações médicas como acima divulgado. Além disso, as composições de acordo com a presente invenção podem conter enchimentos ou substâncias tais como lactose, manitol, substâncias para ligação covalente de polímeros, tais como, por exemplo, polietilenoglicol, a inibidores da presente invenção, para complexação com iões metálicos ou para inclusão de materiais no interior ou sobre preparações especiais de compostos poliméricos tais como, por exemplo, polilactato, ácido poliglicólico, hidrogel ou sobre lipossomas, microemulsões, micelas, vesículas unilamelares ou multilamelares, fragmentos de eritrócitos ou esferoplastos. As concretizações particulares das composições são escolhidas dependendo do comportamento físico, por exemplo em relação à solubilidade, à estabilidade, à biodisponibilidade ou à degradabilidade. Uma libertação controlada ou constante da substância activa da presente invenção na composição inclui formulações com base em depósitos lipófilos (e.g. ácidos gordos, ceras ou óleos). No contexto da presente invenção são também divulgados revestimentos de substâncias ou composições de acordo com a presente invenção contendo estas substâncias, ou seja, revestimentos com polímeros (e.g. polioxâmeros ou polioxaminas). Adicionalmente, as substâncias ou composições de acordo com a presente invenção podem compreender revestimentos protectores tais como inibidores de proteases ou agentes promotores da permeabilidade.

Em princípio, no contexto da presente invenção, são divulgadas todas as vias de administração conhecidas no estado da técnica para substâncias ou composições de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, a preparação de um 12 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ medicamento para ο tratamento das doenças ou desordens acima mencionadas é realizada para a via de administração parentérica, i.e., por exemplo, subcutânea, intramuscular ou intravenosa, oral ou intranasal. Tipicamente, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção estarão na forma sólida, líquida ou na forma de um aerossol (e.g. spray) - dependendo do tipo de formulação.

Em resumo, de acordo com a presente invenção, pode-se notar que são proporcionadas proteínas de fusão anticorpo-citoquina possuindo propriedades pró-apoptóticas e imunomoduladoras contendo formas solúveis de citoquinas a priori ligadas a membranas. Porque a função do anticorpo está presente no polipéptido de acordo com a presente invenção, por ligação a uma molécula alvo específica ligada à membrana celular, as citoquinas, que de outro modo não possuem actividade, ou possuem actividade limitada, exercem a sua actividade biológica completa de citoquina por via do(s) correspondente(s) receptor(es) da citoquina. Pela escolha adequada da especificidade do anticorpo, a actividade da citoquina é dirigida para o tecido, e.g. tecido tumoral, a tratar, e pode ser preparado um agente terapêutico que é especificamente desenhado/optimizado para a indicação/entidade tumoral respectivas. No global, a selectividade da actividade da citoquina nos polipéptidos de acordo com a presente invenção é conseguida através de dois mecanismos: Por um lado através do enriquecimento selectivo mediada por anticorpos, i.e. scFv, da citoquina no tumor, a citoquina não possuindo, ou possuindo actividade limitada no estado não ligada ao antigénio, e por outro lado através da activação específica do local da citoquina por via de apresentação numa molécula que é completamente capaz de sinalização, em particular também uma molécula indutora de apoptose. A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelas figuras que se seguem. A Fig. 1 mostra o resultado de uma separação electroforética em gel após expressão de uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção (para a estrutura da proteína de fusão veja-se o Exemplo 1, TRAIL-AMAIZe(MB0S4), abreviada na Fig. 1 por MB0S4-TRAIL) . A análise Western blot mostra que a proteína de fusão resulta numa banda de aproximadamente 140 kDa sob condições não redutoras, que 13 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ corresponde bem ao PM calculado do dímero ligado a CH3 de 2 x 65 = 130 kDa. A Fig. 2 representa os resultados de estudos em relação a uma indução preferencial de apoptose de células tumorais positivas para FAP por vários exemplos de AMAIZe-polipéptido de acordo com a presente invenção. A Fig. 2 mostra em todos os painéis (Fig. 2A a 2F) um gráfico da actividade celular (em %) em função da concentração das proteínas AMAIZe respectivas indicadas. As curvas traçadas na Fig. 2A (legenda na Fig. 2) representam os resultados do tratamento de células positivas para FAP (HT1080-FAP) ou negativas para FAP (HT1080) com TRAIL-AMAIZe(MBOS4) após pré-incubação com o anticorpo específico para FAP, cFl9, ou sem uma pré-incubação correspondente.

Em todos os outros casos ilustrados (Fig. 2B-F), pode-se reconhecer que a citotoxicidade das diferentes construções de AMAIZe é sempre maior nas células que expressam antigénio (HT1080-FAP), i.e. nas células às quais as construções de AMAIZe de acordo com a presente invenção se ligam por mediação do anticorpo, do que em relação às correspondentes células progenitoras negativas para o antigénio (HT1080). A dependência da sensibilidade acrescida de células que expressam FAP da ligação das construções de AMAIZe a FAP é mostrada como exemplo na Fig. 2A: aqui, por competição de um anticorpo específico para Fap, cFl9 (cF19, quadrados pretos) com a construção de AMAIZe, TRAIL-AMAIZe(MB0S4) pela ligação ao FAP expresso celularmente, a actividade citotóxica desta construção de AMAIZe em relação às células positivas para FAP é reduzida para um grau que é também observado no caso de células negativas para FAP. Em contraste, a adição de cF19 não tem influência sobre células negativas para FAP. Assim, a especificidade mediada por anticorpos é demonstrada sem ambiguidade pela inibição competitiva da indução amplificada de apoptose por via do anticorpo monoclonal específico para FAP, cFl9. A Fig. 3 mostra exemplos de construções de AMAIZe da presente invenção com TRAIL e com FasL como módulo de citoquina, os anticorpos específicos para FAP independentes, 14 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ clone 0S4 e clone 40, assim como diferentes ligantes entre o módulo de anticorpo e o de citoquina (construções (A)-(F) de acordo com a presente invenção). Todas as construções de acordo com a presente invenção possuem a propriedade de uma indução/amplificação de apoptose dependente do antigénio.

No que segue, as construções produzidas são representadas esquematicamente. A sua actividade especifica de AMAIZe (indução preferencial de apoptose em células positivas para o antigénio) é descrita na Fig. 2. O código escolhido para as sequências de aminoácidos é o código de uma letra. O fragmento (2) (ligante) forma a ligação entre o segmento (3) e a porção citoquina (1) (e.g. TRAIL ou FasL na construções mostradas) na molécula de acordo com a presente invenção e, no caso da utilização de ligantes especiais tais como os do tipo 2a, 2b ou 2c, asseguram ao mesmo tempo a ligação covalente da proteína de fusão durante a biogénese.

Construção (A): TRAIL—AMAIZe(MBOS4)

NH2-[Comando]-[OS4-VH/VL]-[Ligantel]-[CH3]-[Ligante2]-[TRAIL(95-281)]-COOH OS 4-VH/VL: CH3 : Ligantel:

Ligante2 : TRAIL(95-281) fragmento de anticorpo de cadeia única humano específico para FAP domínio CH3 (AA 363-489) de uma IgGl humana região de charneira de uma IgGl humana (negrito) com um ligante poli-Gly C-terminal (itálico) (RTVAAPSVFAVFAAAVEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSG) ligante poli-Gly (GGGGTGGGS) domínio extracelular de TRAIL humano (AA 95- 281 O ligante da construção (A): TRAIL-AMAIZe(MBOS4) tem propriedades de dimerização. EP 1 317 488/PT 15

Construção (B): TRAIL—AMAIZe(0S4)

NH2-[Comando]-[OS 4-VH/VL]-[Ligante]-[TRAIL(95-281)]-COOH OS 4-VH/VL: fragmento de anticorpo de cadeia única humano específico para FAP Ligante: RTVAAPSVFAVFAAAVELE TRAIL(95-281) : domínio extracelular de TRAIL humano (AA 95-281)

Construção (C) : TRAIL-AMA.IZe (40)

NH2-[Comando]-[40-VH/VL]-[Ligante]-[TRAIL(95-281)]-COOH 40-VH/VL: fragmento de anticorpo de cadeia única humano específico para FAP Ligante: AAAVELE TRAIL(95-281) : domínio extracelular de TRAIL humano (AA 95-281) Construção (D) : FasL-AMAIZe(40) NH2-[Comando]-| [40-VH/VL]-[Ligante]-[FasL(139-281)]-COOH 40-VH/VL: fragmento de anticorpo de cadeia única humano específico para FAP Ligante: AAAVELE FasL(139-281) : domínio extracelular de FasL humano (AA 139-281) Construção (E) : FasL-AMAIZe(OS4)

NH2-[Comando]-[OS4-VH/VL]-[Ligante]-[FasL(139-281)]-COOH

OS 4-VH/VL: fragmento de anticorpo de cadeia única humano específico para FAP

Ligante:

RTVAAPSVFAVFAAA 16 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ

FasL(139-281): domínio extracelular de FasL humano (AA139- 281)

Construção (F): FasL-AMAIZe(40-Flag)

NH2-[Comando]-[40-VH/VL]-[marcador Flag-][Ligante]-[FasL(139-281)]-COOH fragmento de anticorpo de cadeia única humano específico para FAP DYKDDDDK AAAVELE domínio extracelular de FasL humano (AA 139-281) 40-VH/VL: marcador Flag:

Ligante:

FasL(139-281): A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos que se seguem.

Exemplo 1

Expressão de uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção A proteína de fusão de acordo com a invenção foi expressa em células CHO-DG44. Esta proteína de fusão é a construção TRAIL-AMAIZe(MB0S4), abreviada por MBOS 4-TRAIL na Fig. 1, (dímero covalente) possuindo a estrutura seguinte (cf. também Fig. 3):

NH2-[Comando]-[OS 4-VH/VL]-[Ligantel]-[CH3]-[Ligante2]-[TRAIL(95-281)]-COOH 0S4-VH/VL: fragmento de anticorpo de cadeia única humano

específico para FAP CH3: domínio CH3 (AA 363-489) de uma IgGl humana

Ligantel: região de charneira de uma IgGl humana (negrito) com um ligante poli-Gly C-terminal (itálico) (RTVAAPSVFAVFAAAVEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSG) Ligante2: ligante poli-Gly (GGGGTGGGS) TRAIL(95-281): domínio extracelular de TRAIL humano (AA 95-281) 17 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ

Exemplo 2

Construção dos polipéptidos FasL-AMAIZe(40) e TRAIL-AMAIZe(40) de acordo com a invenção.

As proteínas de fusão foram produzidas como se segue: 1. 0 fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv) N.° 40 (adiante designado por 40) foi isolado de acordo com métodos padrão com base na ligação a FAP a partir de uma biblioteca de expressão em fagos de scFv que estava presente no vector pSEX (veja-se Brocks et al., Molecular Medicine 7: 461-469; Mersmann et al., Int. J. Câncer 92: 240-248) . 2. 0 scFv 40 foi excisado de pSEX com Pvu2 e Notl e foi inserido nos locais correspondentes da construção de minicorpo pW6 (Wuest, T., Dissertation, University of Stuttgart, 2001) . Para este fim, a região do ADN localizada entre estes locais foi removida do plasmídeo pW6 por uma digestão de restrição correspondente e electroforese preparativa em gel de agarose juntamente com eluição de ADN. Através deste passo de clonagem, o scFv 40 foi clonado entre uma sequência de comando de Ig eucariota (a montante de 40) e a região constante (região Fc) de um anticorpo humano (IgGl, a jusante de 40) de modo a ser possível a expressão de um minicorpo bivalente segregável, como descrito por Hu et al. (Câncer Research 56: 3055). 3. Comando + scFv 40 + Fc foram amplificados por "proob- reading PCR" utilizando os iniciadores 1 e 2, e o fragmento scFv foi inserido nos correspondentes locais de restrição do vector de expressão eucariota pcDNA3.1 (Invitrogen) por meio do local de restrição Kpnl introduzido pelo iniciador 1 e do local de restrição Notl localizado entre scFv 40 e a região Fc. 4a. Para a preparação final de FasL-AMAIZe(40), amplificaram-se os AA 139 a 281 + codão de stop de FasL humano por meio de proof-reading PCR utilizando os iniciadores 3 e 4 e inseriram-se nos locais de restrição Notl e Xbal do intermediário de clonagem pcDNA3.1 obtido 18 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ em 3. Para este propósito, introduziram-se um local de restrição Notl e um Nhel, compatíveis com Xbal, no amplicão de FasL pelos iniciadores utilizados. A construção final assim obtida permite a expressão da proteína de fusão FasL-AMAIZe(40). 4b. Para a preparação final de TRAIL-AMAIZe(40), amplificaram-se os AA 95 a 281 + codão de stop de TRAIL humano por proof-reading PCR utilizando os iniciadores 5 e 6 e inseriram-se nos locais de restrição Notl e Xbal do intermediário de clonagem pcDNA3.1 obtido em 3. Para este propósito, introduziram-se um local de restrição Notl e um Xbal no amplicão de TRAIL pelos iniciadores utilizados. A construção final assim obtida permite a expressão da proteína de fusão TRAIL-AMAIZe(40). 5. Para recuperar TRAIL-AMAIZe(40) e FasL-AMAIZe(40), respectivamente, transfectaram-se células HEK293 com uma construção descrita em 4. utilizando lipofectamina (Gibco-BRL) de acordo com as instruções do fabricante. Passadas 48 horas da transfecção, esterilizaram-se os sobrenadantes da construção de AMAIZe por filtração e armazenaram-se a 4°C até posterior utilização.

Todos os passos de clonagem e amplificação por PCR foram realizados de acordo com procedimentos padrão usuais utilizando os iniciadores que se seguem. Todas as construções foram sequenciadas para verificação da sequência de ADNc.

Iniciador 1 5'CGG GGT ACC TCG ACC ATG GAC TGG ACC TGG CGC GTG 3'

Iniciador 2 5'CCG GAA TTC CAC AGC CAG GTG CAA CTA GTT GAG CC 3'

Iniciador 3 5'CTA GGT GCG GCC GCA GTT GAG CTC GAG GAA AAA AAG GAG CTG AGG AAA GTG 3'

Iniciador 4 5'CTA GCT AGC GTG CTT CTC TTA GAG CTT ATA TAA GCC 3' 19 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ

Iniciador 5 5'GTC TTC GCG GCC GCA GTT GAG CTC GAG ACC TCT GAG GAA ACC ATT TCT ACA G 3'

Iniciador 6 5'TGC TCT AGA CCA GGT CAG TTA GCC AAC TAA AAA GGC 3'

Exemplo 3

Demonstração da activação dependente do antigénio por TRAIL-AMAIZe (MBOS4) especifico para FAP como exemplo (veja-se também a Fig. 2A). 0 TRAIL-AMAIZe(MB0S4) foi proporcionado em analogia com a descrição no Exemplo 2,

Subsequentemente, células positivas para FAP (HT1080-FAP) e negativas para FAP (HT1080) foram pré-incubadas (1 h) com o anticorpo especifico para FAP, cF19, ou deixadas sem tratamento. As células foram incubadas durante a noite na presença de CHX (2,5 pg/ml) com as concentrações indicadas de TRAIL-AMAIZe(MB0S4). A quantificação das células sobreviventes foi realizada por meio de coloração com violeta de cristal. A Fig. 2A representa a actividade de TRAIL-AMAIZe(MB0S4) em células alvo que são especificamente reconhecidas pela porção anticorpo da proteína de fusão (HT1080 positivo para FAP) .

Exemplo 4

Indução preferencial de apoptose por TRAIL-AMAIZe e FasL-AMAIZe em células tumorais positivas para FAP (veja-se também as Fig. 2A-F).

Cultivaram-se 15 x 103 células HT1080 ou HT1080-FAP por poço de uma placa de 96 poços durante a noite. No dia seguinte, trataram-se as células com as quantidades indicadas das diferentes construções durante mais 14 a 18 horas na presença de 2,5 pg/ml de CHX (para a sensibilização das células em relação à indução da morte por apoptose mediada por receptores). Finalmente, a viabilidade das células foi determinada por coloração com violeta de cristal. Os valores respectivos para grupos não tratados estavam em todos os casos entre 700 e 850 mOD. Grupos de controlo em que todas as células eram propensas a morte celular apresentaram valores de 20 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ 100 a 150 mOD. A morte celular dos grupos de controlo positivo correspondentes foi conseguida por ligação cruzada secundária de uma construção solúvel de FasL marcada com Flag (500 ng/ml) por meio do anticorpo especifico para Flag, M2 (Sigma). Também neste caso foram adicionados 2,5 pg de CHX às culturas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS REQUERENTE NOME: RUA: LOCAL: CÓDIGO POSTAL: TELEFONE: TELEFAX:

Prof. Dr. Klaus Pfizenmaier SeehausstraBe 7 Tiefenbronn 75233 07 11/6 85 69 86 07 11/6 85 74 84 N.° DE REFERÊNCIA: TÍTULO DA INVENÇÃO :

Activação mediada por anticorpos, especifica do local, de citoquinas pró-apoptóticas: AMAIZe (Citoquinas Indutoras de Apoptose Mediada por Anticorpos)

NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 6 sequências de ADN 6 sequências de proteína FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: SUPORTE DE DADOS: Disquete

COMPUTADOR: PC

SISTEMA OPERATIVO: MS DOS SOFTWARE:

Windows NT 21 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ

Listagem de sequências para o pedido de patente AMAIZe Número do processo: Número do pedido:

Descrição da sequência 1: sequência de ADN de codificação (linhas inferiores, apenas a cadeia de ADN de codificação, nucleótidos (NT) 1-1845) e sequência de aminoácidos traduzida (linhas superiores, código de uma letra dos aminoácidos (AA) 1-614) de uma proteína de fusão anticorpo-citoquina AMAIZe da invenção exemplificada por TRAIL-AMAIZe(MB0S4) (construção A). 1 M D W T W R V F C L L A V A P G 16 1 ATG GAC TGG ACC TGG CGC GTG TTT TGC CTG CTC GCC GTG GCT CCT GGG 48 17 Ά H S Q V Q L V Q S G A E V K K 32 49 GCC CAC AGC CAG GTG CAA CTA GTG CAG TCC GGC GCC GAA GTG AAG AAA 96 33 P G A S V K V s C K T S R Y T F 48 97 ccc GGT GCT TCC GTG AAA GTC AGC TGT AAA ACT AGT AGA TAC ACC TTC 144 49 T E Y T I H W V R Q A P G Q R L 64 145 ACT GAA TAC ACC ATA CAC TGG GTT AGA CAG GCC CCT GGC CAA AGG CTG 192 65 E W I G G I N P N N G I P N Y N 80 193 GAG TGG ATA GGA GGT ATT AAT CCT AAC AAT GGT ATT CCT AAC TAC AAC 240 81 Q K F K G R V T X T V D T S A S 96 241 CAG AAG TTC AAG GGC CGG GTC ACC ATC ACC GTA GAC ACC TCT GCC AGC 288 97 T A Y M E L S S L R S E D T A V 112 289 ACC GCC TAC ATG GAA CTG TCC AGC CTG CGC TCC GAG GAC ACT GCA GTC 336 113 Y Y C A R R R I A Y G Y D E G H 128 337 TAC TAC TGC GCC AGA AGA AGA ATC GCC TAT GGT TAC GAC GAG GGC CAT 384 129 A M D Y W G Q G T L V T V S S A 144 385 GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC CTT GTC ACC GTC TCC TCA GCC 432 145 S T K G P K L E E G E F S E A R 160 433 TCC ACC AAG GGC CCA AAG CTT GAA GAA GGT GAA TTT TCA GAA GCA CGC 480 161 V D I V M T Q S P D S L A V S L 176 481 GTA GAC ATT GTG ATG ACC CAA TCT CCA GAC TCT TTG GCT GTG TCT CTA 528 177 G E R A T I N C K S S Q S L L Y 192 529 GGG GAG AGG GCC ACC ATC AAC TGC AAG TCC AGT CAG AGC CTT TTA TAT 576 193 S R N Q K N Y L A ff Y Q Q K P G 208 577 TCT AGA AAT CAA AAG AAC TAC TTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGA 624 209 Q P P K L L I F W A S T R E S G 224 625 CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TTT TGG GCT AGC ACT AGG GAA TCT GGG 672 225 V P D R F S G S G F G T D F T L 240 673 GTA CCT GAT AGG TTC AGT GGC AGT GGG TTT GGG ACA GAC TTC ACC CTC 720 22 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ 241 Τ I S S L Q Α Ε D V Α V Υ Υ C Q 256 721 ACC ATT AGC AGC CTG CAG GCT GAA GAT GTG GCA GTT ΤΑΤ TAC TGT CAG 768 257 Q Υ F S Υ Ρ L Τ F G Q G Τ Κ V Ε 272 769 CAA ΤΑΤ ΤΤΤ AGC ΤΑΤ CCG CTC ACG TTC GGA CAA GGG ACC AAG GTG GAA 816 273 I Κ R Τ V Α Α Ρ S V F Α V F Α Α 288 817 ΑΤΑ ΑΑΑ CGT ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC GCT GTC TTC GCG GCC 864 289 Α V Ε Ρ Κ S C D Κ Τ Η Τ C Ρ Ρ C 304 865 GCA GTT GAG CCC ΑΑΑ TCT TGT GAC ΑΑΑ ACT CAC ACA TGC CCA CCA TGC 912 305 G G G S S G G G S G G Q Ρ R ε Ρ 320 913 GGA GGA GGA AGT AGC GGA GGA GGA TCA GGA GGG CAG CCC CGA GAA CCA 960 321 Q V Υ Τ L Ρ Ρ S R Ε Ε Μ τ Κ Μ Q 336 961 CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG 1008 337 V S Ιι Τ C L V κ G F Υ Ρ S D I Α 352 1009 GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC ΑΑΑ GGC TTC ΤΑΤ CCC AGC GAC ATC GCC 1056 353 V Ε W Ε S Ν G Q Ρ Ε Ν Ν Υ Κ Τ Τ 368 1057 GTG GAG TGG GAG AGC ΑΑΤ GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG 1104 369 Ρ Ρ V L D S D G S F F L Υ S Κ L 384 1105 CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC ΤΑΤ AGC AAG CTC 1152 385 τ V D Κ S R W Q Q G Ν V F S C S 400 1153 ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC 1200 401 V Μ Η Ε Α L Η Ν Η Υ Τ Q Κ S L S 416 1201 GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC 1248 417 L S G G G G Τ G G G S Τ S Ε Ε τ 432 1249 CTG TCC GGA GGT GGC GGT ACC GGA GGT GGG TCT ACC TCT GAG GAA ACC 1296 433 I S Τ V Q Ε Κ Q Q Ν 1 S Ρ L V R 448 1297 ATT TCT ACA GTT CAA GAA AAG CAA CAA ΑΑΤ ATT TCT CCC CTA GTG AGA 1344 449 Ε R G Ρ Q R V Α Α Η I τ G Τ R. G 464 1345 GAA AGA GGT CCT CAG AGA GTA GCA GCT CAC ΑΤΑ ACT GGG ACC AGA GGA 1392 465 R S Ν τ L S S Ρ Ν S Κ Ν Ε Κ Α L 480 1393 AGA AGC AAC ACA TTG TCT TCT CCA AAC TCC AAG ΑΑΤ GAA AAG GCT CTG 1440 481 G R Κ ' I Ν S W Ε S S R S G Η S F 496 1441 GGC CGC ΑΑΑ ΑΤΑ AAC TCC TGG GAA TCA TCA AGG AGT GGG CAT TCA TTC 1488 497 L S Ν L Η L R Ν G Ε L V X Η Ε Κ 512 1489 CTG AGC AAC TTG CAC TTG AGG ΑΑΤ GGT GAA CTG GTC ATC CAT GAA ΆΑΑ 1536 513 G F Υ Υ I Υ S Q Τ Υ F R F Q Ε Ε 528 1537 GGG ΤΤΤ TAC TAC ATC ΤΑΤ TCC CAA ACA TAC ΤΤΤ CGA ΤΤΤ CAG GAG GAA 1584 529 1 Κ Ε Ν Τ Κ Μ D Κ Q Μ V Q Υ I Υ 544 1585 ΑΤΑ ΑΑΑ GAA AAC ACA AAG AAC GAC ΑΑΑ CAA ATG GTC CAA ΤΑΤ ATT TAC 1632 545 Κ Υ Τ S Υ Ρ 0 Ρ I L L Μ Κ S Α R 560 1633 ΆΑΑ TAC ACA AGT ΤΑΤ CCT GAC CCT ΑΤΑ TTG TTG ATG ΑΑΑ AGT GCT AGA 1680 561 Ν S C W S κ D Α Ε Υ G L Υ S I Υ 576 1681 ΑΑΤ AGT TGT TGG TCT ΑΑΑ GAT GCA GAA ΤΑΤ GGA CTC ΤΑΤ TCC ATC ΤΑΤ 1728 577 Q G G I F Ε L Κ Ε Ν D R I F V S 592 1729 CAA GGG GGA ΑΤΑ ΤΤΤ GAG CTT AAG GAA ΑΑΤ GAC AGA ATT ΤΤΤ GTT TCT 1776 23 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ 593 VTNEHLIDMDHEASFF 608 1777 GTA ACA ΑΑΤ GAG CAC TTG ΑΤΑ GAC ATG GAC CAT GAA GCC AGT ΤΤΤ TTC 1824 609 G A F L V G * 615 1825 GGG GCC ΤΤΤ ΤΤΑ GTT GGC ΤΑΑ 1845

Caracteristicas da construção A:

Sequência do péptido de comando: NT 1-57, AA 1-19

Sequência do fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv) 0S4 (especifico para o antigénio do estroma tumoral FAP) : NT 58-822, AA 20-274

Sequência do ligante 1 (Ll) entre scFv e o domínio CH3 de imunoglobulina: NT 823-942, AA 275-314

Sequência do domínio CH3 de imunoglobulina: NT 943-1254, AA 315-418

Sequência do ligante 2 entre o domínio CH3 de Ig e TRAIL: NT 1254-1281, AA 419-427

Sequência do fragmento de TRAIL humano (domínio extracelular, dos AA 95-281 da molécula de TRAIL humano natural) : NT 1282-1842, AA 428-614

Codão de stop: NT 1843-1845.

Descrição da sequência 2: sequência de ADN de codificação (linhas inferiores, apenas a cadeia de ADN de codificação, nucleótidos (NT) 1-1443) e sequência de aminoácidos traduzida (linhas superiores, código de uma letra dos aminoácidos (AA) 1-480) de uma proteína de fusão anticorpo-citoquina AMAIZe da invenção exemplificada por TRAIL-AMAIZe(0S4) (construção B). 24 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ 1 Μ D W Τ W R V F C L L A V A P G 16 1 ATG GAC TGG ACC TGG CGC GTG TTT TGC CTG CTC GCC GTG GCT CCT GGG 48 17 Α Η S Q V Q L V Q S G A E V K K 32 49 GCC CAC AGC CAG GTG CAA CTA GTG CAG TCC GGC GCC GAA GTG AAG AAA 96 33 Ρ G Α S V Κ V s C K T S R Y T F 48 97 CCC GGT GCT TCC GTG ΑΑΑ GTC AGC TGT AAA ACT AGT AGA TAC ACC TTC 144 49 τ Ε Υ τ ' I Η W V R Q A P G Q R L 64 145 ACT GAA TAC ACC ΑΤΑ CAC TGG GTT AGA CAG GCC CCT GGC CAA AGG CTG 192 65 Ε η I G G I N P N N G I P N Y N 80 193 GAG TGG ΑΤΑ GGA GGT ATT AAT CCT AAC AAT GGT ATT CCT AAC TAC AAC 240 81 Q Κ F Κ G R V T I T V D T S A S 96 241 CAG AAG TTC AAG GGC CGG GTC ACC ATC ACC GTA GAC ACC TCT GCC AGC 288 97 Τ Α Υ Μ Ε L S S L R S E D T A V 112 289 ACC GCC TAC ATG GAA CTG TCC AGC CTG CGC TCC GAG GAC ACT GCA GTC 336 113 Υ Υ C Α R R R I A Y G Y D Ξ G H 128 337 TAC TAC TGC GCC AGA AGA AGA ATC GCC TAT GGT TAC GAC GAG GGC CAT 384 129 Α Μ D Υ W G Q G T L V T V S S A 144 385 GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC CTT GTC ACC GTC TCC TCA GCC 432 145 S Τ Κ G Ρ K L Ξ E G E F S E A R 160 433 TCC ACC AAG GGC CCA AAG CTT GAA GAA GGT GAA TTT TCA GAA GCA CGC 480 161 V D I V Μ T Q S P D S L A V S L 176 481 GTA GAC ATT GTG ATG ACC CAA TCT CCA GAC TCT TTG GCT GTG TCT CTA 528 177 G Ε R Α Τ I N c K S S Q S L L Y 192 529 GGG GAG AGG GCC ACC ATC AAC TGC AAG TCC AGT CAG AGC CTT TTA TAT 576 193 S R Ν Q Κ N Y L A w Y Q Q K P G 208 577 TCT AGA ΑΑΤ CAA AAG AAC TAC TTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGA 624 209 Q Ρ Ρ Κ L L I F W A S T R E S G 224 625 CAG CCA CCC ΑΑΑ CTC CTC ATC TTT TGG GCT AGC ACT AGG GAA TCT GGG 672 225 V Ρ D R F S G S G F G T D F T L 240 673 GTA CCT GAT AGG TTC AGT GGC AGT GGG TTT GGG ACA GAC TTC ACC CTC 720 241 Τ I S S L Q A E D V A V Y Y C Q 256 721 ACC ATT AGC AGC CTG CAG GCT GAA GAT GTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG 768 257 Q Υ F S Υ P L T F G Q G T K V E 272 769 CAA ΤΑΤ ΤΤΤ AGC ΤΑΤ CCG CTC ACG TTC GGA CAA GGG ACC AAG GTG GAA 816 25 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ 273 I K R T V A A P S V F A V F A A 288 817 ATA AAA CGT ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC GCT GTC TTC GCG GCC 864 289 A V E L E T S E E T I S T V Q E 304 865 GCA GTT GAG CTC GAG ACC TCT GAG GAA ACC ATT TCT ACA GTT CAA GAA 912 305 K Q Q N I S P L V R Ξ R G P Q R 320 913 AAG CAA CAA AAT ATT TCT CCC CTA GTG AGA GAA AGA GGT CCT CAG AGA 960 321 V A A H I T G T R G R S N T L S 336 961 GTA GCA GCT CAC ATA ACT GGG ACC AGA GGA AGA AGC AAC ACA TTG TCT 1008 337 S P N S K N E K A L G R K I N S 352 1009 TCT CCA AAC TCC AAG AAT GAA AAG GCT CTG GGC CGC AAA ATA AAC TCC 1056 353 w E S S R S G H S F L S N L H L 368 1057 TGG GAA TCA TCA AGG AGT GGG CAT TCA TTC CTG AGC AAC TTG CAC TTG 1104 369 R N G E L V I H E K G F Y Y I Y 384 1105 AGG AAT GGT GAA CTG GTC ATC CAT GAA AAA GGG TTT TAC TAC ATC TAT 1152 385 S Q T Y F R F Q E E I K E N T K 400 1153 TCC CAA ACA TAC TTT CGA TTT CAG GAG GAA ATA AAA GAA AAC ACA AAG 1200 401 N D K Q M V Q Y I Y K Y T S Y P 416 1201 AAC GAC AAA CAA ATG GTC CAA TAT ATT TAC AAA TAC ACA AGT TAT CCT 1248 417 D P I L L M K S A R N S C W S K 432 1249 GAC CCT ATA TTG TTG ATG AAA AGT GCT AGA AAT AGT TGT TGG TCT AAA 1296 433 D A E Y G L Y S I Y Q G G I F E 448 1297 GAT GCA GAA TAT GGA CTC TAT TCC ATC TAT CAA GGG GGA ATA TTT GAG 1344 449 L K E N D R I F V S V T N E H L 464 1345 CTT AAG GAA AAT GAC AGA ATT TTT GTT TCT GTA ACA AAT GAG CAC TTG 1392 4 65 I D M D H E A s F F G A F L V G 480 1393 481 1441 ATA ★ TAA GAC ATG GAC CAT GAA GCC AGT TTT TTC GGG GCC TTT TTA GTT GGC 1440 481 1443

Caracteristicas da construção B:

Sequência do péptido de comando: NT 1-57, AA 1-19

Sequência do ligante entre scFv e o fragmento de TRAIL (AA 95-281): NT 823-879, AA 275-293

Sequência do fragmento de TRAIL humano (dominio extracelular, AA 95-281 da molécula de TRAIL humano natural): NT 880-1440 AA 294-480

Codao de stop: NT 1441-1443 26 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ

Descrição da sequência 3: sequência de ADN de codificação (linhas inferiores, apenas a cadeia de ADN de codificação, nucleótidos (NT) 1-1386) e sequência de aminoácidos traduzida (linhas superiores, código de uma letra dos aminoácidos (AA) 1-461) de uma proteína de fusão anticorpo-citoquina AMAIZe da invenção exemplificada por TRAIL-AMAIZe(40) (construção C). 27 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ Μ D W Τ W R V F C L L Α V Α P G 16 1 ATG GAC TGG ACC TGG CGC GTG ΤΤΤ TGC CTG CTC GCC GTG GCT CCT GGG 48 17 Α Η S Q V Q L V Q S G G G M V E 32 49 GCC CAC AGC CAG GTA CAG CTG GTG CAG TCT GGG GGA GGC ATG GTA GAG 96 33 Ρ G G S L R L S C Α Α S G F T F 48 97 CCT GGG GGG TCC CTT AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC 144 49 S Μ Α η Μ S Η V R Q Α Ρ G K G L 64 145 AGT ΑΑΤ GCC TGG ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG 192 65 Ε W V G R I Κ S Κ Α G G G T A E 80 193 GAG TGG GTT GGC CGT ΑΤΑ ΑΑΑ AGC ΑΑΑ GCT GGT GGT GGG ACA GCA GAG 240 81 Υ Α Α Ρ V Κ G R F Τ I S R D D S 96 241 TAC GCT GCA CCC GTG ΑΑΑ GGC AGA TTC ACC ATC TCA AGA GAT GAT TCA 288 97 Q Ν Τ L Υ L Q Μ Ν S L Κ Τ D D T 112 289 CAA AAC ACG CTG ΤΑΤ CTG CAA ATG AAC AGC CTG ΑΑΑ ACC GAC GAC ACA 336 113 Α V Υ Υ C Τ Τ Η V Υ G Α Ρ R N W 128 337 GCC GTG ΤΑΤ TAC TGT ACC ACA CAT GTC TAC GGT GCC CCC CGG AAC TGG 384 129 G Q G S L V Τ V S S Α S τ K G P 144 385 GGC CAG GGA TCC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA 432 145 Κ L Ξ Ε G Ε F S Ε Α R V Q S V L 160 433 AAG CTT GAA GAA GGT GAA τττ TCA GAA GCA CGC GTA CAG TCT GTG TTG 480 161 Τ Q Ρ Ρ S V S Α Α Ρ G Q Κ V T I 176 481 ACT CAG CCG CCC TCA GTG TCT GCG GCC CCA GGA CAG AAG GTC ACC ATC 528 177 S C S G S S S Ν I G Ν Ν Υ V S N 192 529 TCC TGC TCT GGA AGC AGC TCC AAC ATT GGA ΑΑΤ ΑΑΤ ΤΑΤ GTC TCC TGG 576 193 Υ V Q L Ρ G τ Α Ρ Κ L L I Y D N 208 577 TAC GTT CAA CTC CCA GGA ACA GCC CCC ΑΑΑ CTC CTC ATT TAT GAC AAT 624 209 Ν Κ R F S G V Ρ 0 R F S G S K S 224 625 ΑΑΤ AAG CGA TTC TCA GGA GTT CCT GAC CGA TTC TCT GGC TCC AAG TCT 672 225 G Τ S Α Τ L G I Τ G L Q Τ G D E 240 673 GGC ACG TCA GCC ACC CTG GGC ATC ACC GGG CTC CAG ACT GGG GAC GAG 720 241 Α D Υ Υ C G Α W D G S L R E A V 256 721 GCC GAT ΤΑΤ TAC TGC GGA GCA TGG GAT GGC AGC CTG CGT GAA GCG GTA 768 257 F G G G Τ Κ V Τ V L G Α A A V E 272 769 TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTC ACC GTC CTA GGT GCG GCC GCA GTT GAG 816 28 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ 273 L· E T S E E T I s T V Q E K Q Q 288 817 CTC GAG ACC TCT GAG GAA ACC ATT TCT ACA GTT CAA GAA AAG CAA CAA 864 289 N I S P L· V R E R G P Q R V A A 304 865 AAT ATT TCT ccc CTA GTG AGA GAA AGA GGT CCT CAG AGA GTA GCA GCT 912 305 H I T G T R G R S N T L S S P N 320 913 CAC ATA ACT GGG ACC AGA GGA AGA AGC AAC ACA TTG TCT TCT CCA AAC 960 321 S K N E K A I. G R K I N S W E S 336 961 TCC AAG AAT GAA AAG GCT CTG GGC CGC AAA ATA AAC TCC TGG GAA TCA 1008 337 S R S G H S F L S N L H L R N G 352 1009 TCA AGG AGT GGG CAT TCA TTC CTG AGC AAC TTG CAC TTG AGG AAT GGT 1056 353 E L V I H E K G F Y Y I Y S Q T 368 1057 GAA CTG GTC ATC CAT GAA AAA GGG TTT TAC TAC ATC TAT TCC CAA ACA 1104 369 Y F R F Q E E X K E N T K N D K 384 1105 TAC TTT CGA TTT CAG GAG GAA ATA AAA GAA AAC ACA AAG AAC GAC AAA 1152 385 Q M V Q Y I Y K Y T S Y P D P I 400 1153 CAA ATG GTC CAA TAT ATT TAC AAA TAC ACA AGT TAT CCT GAC CCT ATA 1200 401 L L M K S A R N S C W S K D A E 416 1201 TTG TTG ATG AAA AGT GCT AGA AAT AGT TGT TGG TCT AAA GAT GCA GAA 1248 417 Y G L Y S I Y Q G G I F E L K E 432 1249 TAT GGA CTC TAT TCC ATC TAT CAA GGG GGA ATA TTT GAG CTT AAG GAA 1296 433 N D R I F V S V T N E H L I D M 448 1297 AAT GAC AGA ATT TTT GTT TCT GTA ACA AAT GAG CAC TTG ATA GAC ATG 1344 449 D H E A S F F G A F I» V G * 462 1345 GAC CAT GAA GCC AGT TTT TTC GGG GCC TTT TTA GTT GGC TAA 1386

Características da construção C:

Sequência do péptido de comando: NT 1-57, AA 1-19

Sequência do fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv) 40 (especifico para o antigénio do estroma tumoral FAP) : NT 58-801, AA 20-267

Sequência do ligante entre scFv e o fragmento de TRAIL (AA 95-281): NT 802-822, AA 268-274

Sequência do fragmento de TRAIL humano (domínio extracelular, AA 95-281 da molécula de TRAIL humana natural): NT 823-1383, AA 275-461

Codão de stop: NT 1384-1386 29 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ

Descrição da sequência 4: sequência de ADN de codificação (linhas inferiores, apenas a cadeia de ADN de codificação, nucleótidos (NT) 1-1254) e sequência de aminoácidos traduzida (linhas superiores, código de uma letra dos aminoácidos (AA) 1-417) de uma proteína de fusão anticorpo-citoquina AMAIZe da invenção exemplificada por FasL-AMAIZe(40) (construção D). 30 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ 1 Μ 0 W Τ η R V F C L L Α V A P G 16 1 ATG GAC TGG ACC TGG CGC GTG ΤΤΤ TGC CTG CTC GCC GTG GCT CCT GGG 48 17 Α Η S Q V Q L V Q S G G G M V E 32 49 GCC CAC AGC CAG GTA CAG CTG GTG CAG TCT GGG GGA GGC ATG GTA GAG 96 33 Ρ G G S L R L S C Α Α S G F T F 48 97 CCT GGG GGG TCC CTT AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC 144 49 S Ν Α W Μ S W V R Q Α Ρ G K G L 64 145 AGT ΑΑΤ GCC TGG ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG 192 65 Ε W V G R I Κ S Κ Α G G G T A E 80 193 GAG TGG GTT GGC CGT ΑΤΑ ΑΑΑ AGC ΑΑΑ GCT GGT GGT GGG ACA GCA GAG 240 81 Υ Α Α Ρ V Κ G R F Τ I S R D D S 96 241 TAC GCT GCA CCC GTG ΑΑΑ GGC AGA TTC ACC ATC TCA AGA GAT GAT TCA 288 97 Q Κ Τ L · Υ L Q Μ Ν S L Κ Τ D D T 112 289 CAA AAC ACG CTG ΤΑΤ CTG CAA ATG AAC AGC CTG ΑΑΑ ACC GAC GAC ACA 336 113 Α V Υ Υ C Τ Τ Η V Υ G Α Ρ R N W 128 337 GCC GTG ΤΑΤ TAC TGT ACC ACA CAT GTC TAC GGT GCC CCC CGG AAC TGG 384 129 G Q G S L V Τ V S S Α S τ K G P 144 385 GGC CAG GGA TCC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA 432 145 ' Κ L Ε Ε G Ε F S Ε Α R V Q S V L 160 433 AAG CTT GAA GAA GGT GAA ΤΤΤ TCA GAA GCA CGC GTA CAG TCT GTG TTG 480 161 Τ Q Ρ Ρ S V S Α Α Ρ G Q Κ V T I 176 481 ACT CAG CCG CCC TCA GTG TCT GCG GCC CCA GGA CAG AAG GTC ACC ATC 528 177 $ C 3 G S S S Ν X G Ν Η Υ V S W 192 529 TCC TGC TCT GGA AGC AGC TCC AAC ATT GGA ΑΑΤ ΑΑΤ ΤΑΤ GTC TCC TGG 576 193 Υ V Q L Ρ G τ Α Ρ Κ L L I Y D N 208 577 TAC GTT CAA CTC CCA GGA ACA GCC CCC ΑΑΑ CTC CTC ATT TAT GAC AAT 624 209 Ν Κ R F S G V Ρ D R F S G S K S 224 625 ΑΆΤ AAG CGA TTC TCA GGA GTT CCT GAC CGA TTC TCT GGC TCC AAG TCT 672 225 G Τ S Α Τ L G I Τ G L Q Τ G D E 240 673 GGC ACG TCA GCC ACC CTG GGC ATC ACC GGG CTC CAG ACT GGG GAC GAG 720 241 Α D Υ Υ C G Α W D G S L R E A V 256 721 GCC GAT ΤΑΤ TAC TGC GGA GCA TGG GAT GGC AGC CTG CGT GAA GCG GTA 768 257 F G G G Τ Κ V Τ V L G Α A A V E 272 769 TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTC ACC GTC CTA GGT GCG GCC GCA GTT GAG 816 31 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ 273 LEEKKELRKVAHLTGK 288 817 CTC GAG GAA ΑΑΑ AAG GAG CTG AGG ΑΑΑ GTG GCC CAT ΤΤΑ ACA GGC AAG 864 289 SNSRSMPLEWEDTYGI 304 865 TCC AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACC ΤΑΤ GGA ATT 912 305 VI.LSGVKYKKGGI.VIN 320 913 GTC CTG CTT TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAG GGT GGC CTT GTG ATC AAT 960 321 ETGLYFVYSKVYFRGQ 336 961 GAA ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAA 1008 337 SCNNLPLSHKVYMRNS 352 1009 TCT TGC AAC AAC CTG CCC CTG AGC CAC AAG GTC TAC ATG AGG AAC TCT 1056 353 KYPQDLVMMEGKMMSY 368 1057 AAG TAT CCC CAG GAT CTG GTG ATG ATG GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC 1104 369 CTTGQMWARSSYLGAV 384 1105 TGC ACT ACT GGG CAG ATG TGG GCC CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG 1152 385 FNLTSADHLYVNVSEL 400 1153 TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAT CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC 1200 401 SLVNFEESQTFFGLYK 416 1201 TCT CTG GTC AAT TTT GAG GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG 1248 417 L * 418 1249 CTC TAA 1254

Características da construção D: Sequência do péptido de comando: NT 1-57, AA 1-19

Características da construção D:

Sequência do péptido de comando: NT 1-57, AA 1-19 AA 20-267

Sequência do fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv) 40 especifico para o antigénio do estroma tumoral FAP: NT 58-801, AA 20-267 281): NT 802-822, AA 268-274

Sequência do ligante entre scFv e o fragmento de FasL (AA 139-281): NT 802-822, AA 268-274

Sequência do fragmento de FasL humano (domínio extracelular, AA 139-281 da molécula de FasL humano natural): NT 823-1251, AA 275-417

Codão de stop: NT 1552-1554 32 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ

Descrição da sequência 5: sequência de ADN de codificação (linhas inferiores, apenas a cadeia de ADN de codificação, nucleótidos (NT) 1-1299) e sequência de aminoácidos traduzida (linhas superiores, código de uma letra dos aminoácidos (AA) 1-432) de uma proteína de fusão anticorpo-citoquina AMAIZe da invenção exemplificada por FasL- AMAIZe(OS4) (construção E) . 1 M D w T W R V F C L L A V A P G 16 1 ATG GAC TGG ACC TGG CGC GTG TTT TGC CTG CTC GCC GTG GCT CCT GGG 48 17 A H S Q V Q X. V Q S G A E V K K 32 49 GCC CAC AGC CAG GTG CAA CTA GTG CAG TCC GGC GCC GAA GTG AAG AAA 96 33 P G A S V K V S C K T S R Y T F 48 97 ccc GGT GCT TCC GTG AAA GTC AGC TGT AAA ACT AGT AGA TAC ACC TTC 144 49 T E Y T I H W V R Q A P G Q R h 64 145 ACT GAA TAC ACC ATA CAC TGG GTT AGA CAG GCC CCT GGC CAA AGG CTG 192 65 E W X G G X N P N N G I P N Y N 80 193 GAG TGG ATA GGA GGT ATT AAT CCT AAC AAT GGT ATT CCT AAC TAC AAC 240 81 Q K F K G R V T I T V D T S A S 96 241 CAG AAG TTC AAG GGC CGG GTC ACC ATC > O o GTA GAC ACC TCT GCC > O o 288 97 T A Y M E L S s L R S E D T A V 112 289 ACC GCC TAC ATG GAA CTG TCC AGC CTG CGC TCC GAG GAC ACT GCA GTC 336 113 Y Y C A R R R I A Y G Y D E G H 128 337 TAC TAC TGC GCC AGA AGA AGA ATC GCC TAT GGT TAC GAC GAG GGC CAT 384 129 A M D Y W G Q G T L V T V S S A 144 385 GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC CTT GTC ACC GTC TCC TCA GCC 432 145 S T K G P K L Ξ E G E F S E A R 160 433 TCC ACC AAG GGC CCA AAG CTT GAA GAA GGT GAA TTT TCA GAA GCA CGC 480 161 V D I V M T Q S P D S L A V S L 176 481 GTA GAC ATT GTG ATG ACC CAA TCT CCA GAC TCT TTG GCT GTG TCT CTA 528 177 G E R A T I N c K S s Q S X. L Y 192 529 GGG GAG AGG GCC ACC ATC AAC TGC AAG TCC AGT CAG AGC CTT TTA TAT 576 193 S R N Q K N Y Xl A W Y Q Q K P G 208 577 TCT AGA AAT CAA AAG AAC TAC TTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGA 624 209 Q P P K L L I F W A S T R E S G 224 625 CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TTT TGG GCT AGC ACT AGG GAA TCT GGG 672 225 V P D R F S G s G F G T D F T L 240 673 GTA CCT GAT AGG TTC AGT GGC AGT GGG TTT GGG ACA GAC TTC ACC CTC 720 241 T I S S X. Q A E D V A V Y Y C Q 256 721 ACC ATT AGC AGC CTG CAG GCT GAA GAT GTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG 768 257 Q Y F S Y P L T F G Q G T K V E 272 769 CAA TAT TTT AGC TAT CCG CTC ACG TTC GGA CAA GGG ACC AAG GTG GAA 816 33 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ 273 I K R T V A A P S V F A V F A A 288 817 ATA AAA CGT ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC GCT GTC TTC GCG GCC 864 289 A E K K E L R K V A H L T G K S 304 865 GCA GAA AAA AAG GAG CTG AGG AAA GTG GCC CAT TTA ACA GGC AAG TCC 912 305 N S R S M P L E W E D T Y G I V 320 913 AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACC TAT GGA ATT GTC 960 321 L L S G V K Y K K G G L V I N E 336 961 CTG CTT TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAG GGT GGC CTT GTG ATC AAT GAA 1008 337 T G h Y F V Y S K V Y F R G Q S 352 1009 ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAA TCT 1056 353 C N N L P L S H K V Y M R N S K 368 1057 TGC AAC AAC CTG ccc CTG AGC CAC AAG GTC TAC ATG AGG AAC TCT AAG 1104 369 Y P Q D L V M M E G K M M S Y C 384 1105 TAT ccc CAG GAT CTG GTG ATG ATG GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC 1152 385 T T G Q M W A R S S Y L G A V F 400 1153 ACT ACT GGG CAG ATG TGG GCC CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG TTC 1200 401 N L T S A D H L Y V N V S E L s 416 1201 AAT CTT ACC AGT GCT GAT CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC TCT 1248 417 L V N F E E S Q T F F G L Y K L 432 1249 433 1297 CTG * TAA GTC AAT TTT GAG GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC 1296 433 1299

Características:

Sequência do péptido de comando: NT 1-57, AA 1-19

Sequência do fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv) 0S4 especifico para o antigénio do estroma tumoral FAP: NT 58-822, AA 20-274

Sequência do ligante entre scFv e o fragmento de FasL (AA 139-281): NT 823-867, AA 275-289

Sequência do fragmento de FasL humano (dominio extracelular, AA 139-281 da molécula de FasL humano natural): NT 868-1296, AA 290-432

Codao de stop: NT 1441-1443 34 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ

Descrição da sequência 6: sequência de ADN de codificação (linhas inferiores, apenas a cadeia de ADN de codificação, nucleótidos (NT) 1-1278) e sequência de aminoácidos traduzida (linhas superiores, código de uma letra dos aminoácidos (AA) 1-425) de uma proteina de fusão anticorpo-citoquina AMAIZe da invenção exemplificada por FasL-AMAIZe(40-Flag) (construção F). 35 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ 1 Μ D VJ Τ W R V F C L L Α V A P G 16 1 ATG GAC TGG ACC TGG CGC GTG ΤΤΤ TGC CTG CTC GCC GTG GCT CCT GGG 48 17 Α Η S Q V Q L V Q S G G G M V E 32 49 GCC CAC AGC CAG GTA CAG CTG GTG CAG TCT GGG GGA GGC ATG GTA GAG 96 33 Ρ G G S L R L S C Α Α S G F T F 48 97 CCT GGG GGG TCC CTT AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC 144 49 S Ν Α W Μ S W V R Q Α Ρ G K G L 64 145 AGT ΑΑΤ GCC TGG ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG 192 65 Ε W V G R I Κ S Κ Α G G G T A E 80 193 GAG TGG GTT GGC CGT ΑΤΑ ΑΑΑ AGC ΑΑΑ GCT GGT GGT GGG ACA GCA GAG 240 81 Υ Α Α Ρ V Κ G R F Τ I S R D D S 96 241 TAC GCT GCA CCC GTG ΑΆΑ GGC AGA TTC ACC ATC TCA AGA GAT GAT TCA 288 97 Q Ν Τ L Υ L Q Μ Ν S L Κ Τ D D T 112 289 CAA AAC ACG CTG ΤΑΤ CTG CAA ATG AAC AGC CTG ΑΑΑ ACC GAC GAC ACA 336 113 Α V Υ Υ C Τ Τ Η V Υ G Α Ρ R N W 128 337 GCC GTG ΤΑΤ TAC TGT ACC ACA CAT GTC TAC GGT GCC CCC CGG AAC TGG 384 129 G Q G S L V Τ V S S Α S τ K G P 144 385 GGC CAG GGA TCC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA 432 145 Κ L Ε Ε G Ε F S Ε Α R V Q S V I> 160 433 AAG CTT GAA GAA GGT GAA ΤΤΤ TCA GAA GCA CGC GTA CAG TCT GTG TTG 480 161 Τ Q Ρ Ρ S V S Ά Α Ρ G Q Κ V T I 176 481 ACT CAG CCG CCC TCA GTG TCT GCG GCC CCA GGA CAG AAG GTC ACC ATC 528 177 S C S G S S S Μ I G Ν Ν Υ V S W 192 529 TCC TGC TCT GGA AGC AGC TCC AAC ATT GGA ΑΑΤ ΑΑΤ ΤΑΤ GTC TCC TGG 576 193 Υ V Q L Ρ G τ Α Ρ Κ Ιι L I Y D N 208 577 TAC GTT CAA CTC CCA GGA ACA GCC CCC ΑΑΑ CTC CTC ATT TAT GAC AAT 624 209 Ν Κ R F S G V Ρ D R F S G S K S 224 625 ΑΑΤ AAG CGA TTC TCA GGA GTT CCT GAC CGA TTC TCT GGC TCC AAG TCT 672 225 G Τ S Α Τ L G X Τ G L Q Τ G D B 240 673 GGC ACG TCA GCC ACC CTG GGC ATC ACC GGG CTC CAG ACT GGG GAC GAG 720 241 Α D Υ Υ C G Α W D G S L R E A V 256 721 GCC GAT ΤΑΤ TAC TGC GGA GCA TGG GAT GGC AGC CTG CGT GAA GCG GTA 768 257 F G G G Τ Κ V Τ V L G 0 Υ K 0 D 272 769 TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTC ACC GTC CTA GGT GAT TAC ΑΑΆ GAC GAT 816 36 ΕΡ 1 317 488/ΡΤ 273 D 0 K A A A V E L E E K K E L R 288 817 GAC GAT AAA GCG GCC GCA GTT GAG CTC GAG GAA AAA AAG GAG CTG AGG 864 289 K V A H L T G K S N S R S M P L 304 865 AAA GTG GCC CAT TTA ACA GGC AAG TCC AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG 912 305 E W E D T Y G 1 V I» L S G V K Y 320 913 GAA TGG GAA GAC ACC TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA GTG AAG TAT 960 321 K K G G L V I N E T G L Y F V Y 336 961 AAG AAG GGT GGC CTT GTG ATC AAT GAA ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT 1008 337 S K V Y F R G Q S C N N L P L S 352 1009 TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC AAC CTG CCC CTG AGC 1056 353 H K V Y M R N S K Y P Q D L V M 368 1057 CAC AAG GTC TAC ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCC CAG GAT CTG GTG ATG 1104 369 M E G K M M S Y C T T G Q M W A 384 1105 ATG GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC ACT ACT GGG CAG ATG TGG GCC 1152 385 R S S Y L G A V F N L T S A D H 400 1153 CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAT CAT 1200 401 L Y V N V S E L S L V N F Ξ E S 416 1201 TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG GAA TCT 1248 417 Q T F F G L Y K L k 426 1249 CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC TAA 1278

Características da construção F:

Sequência do péptido de comando: NT 1-57, AA 1-19

Sequência do fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv) 40 específico para o antigénio do estroma tumoral FAP: NT 58-801, AA 20-267

Sequência do marcador Flag entre scFv e a sequência ligante: NT 802-825, AA 268-275

Sequência do ligante entre o marcador Flag e o fragmento de FasL (AA 139-281): NT 826-846, AA 276-282

Sequência do fragmento de FasL humano (domínio extracelular, AA 139-281 da molécula de FasL humano natural): NT 847-1275, AA 283-425

Codão de stop: NT 1276-1278.

Lisboa, 2013-04-26

Claims

ΕΡ 1 317 488/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido possuindo propriedades pró-apoptóticas e imunomoduladoras, compreendendo: (i) um segmento (1) consistindo na sequência de aminoácidos de um domínio extracelular de um membro da família TNF; (ii) em posição N-terminal relativamente ao segmento (1), um segmento (2) que é um ligante peptídico; e (iii) um segmento (3) que é um fragmento de anticorpo que se liga a um antigénio na membrana celular, em que o polipéptido reconhece um receptor de citoquinas na membrana celular e em que o fragmento de anticorpo está presente na forma scFv.
2. Polipéptido da reivindicação 1, em que o segmento (1) compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular de TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand (ligando indutor de apoptose relacionado com TNF), AA 95-281, N.° de Acesso na NCBI AAC50332) ou de FasL (AA 139-281, N.° de Acesso na NCBI AAC50124).
3. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o segmento (3) é um fragmento de anticorpo de um mamífero, em particular de origem murina ou humana, ou um fragmento de anticorpo humanizado.
4. Construção de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido de qualquer uma das reivindicações precedentes.
5. Vector compreendendo uma construção de ácido nucleico da reivindicação 4.
6. Célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico da reivindicação 4 e/ou um vector da reivindicação 5.
7. Método para o isolamento de um polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 compreendendo: (a) a produção de um vector da reivindicação 5 ou de uma construção de ácido nucleico da reivindicação 4; (b) a transfecção de células com o vector ou a construção de ácido nucleico obtidos de acordo com o passo (a); (c) a cultura das células transfectadas de acordo com o passo (b); e ΕΡ 1 317 488/ΡΤ 2/2 (d) ο isolamento dos polipéptidos expressos sob as condições apropriadas a partir das células hospedeiras e/ou do sobrenadante da cultura.
8. Utilização de um polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, de uma construção de ácido nucleico da reivindicação 4, de um vector da reivindicação 5 ou de uma célula hospedeira da reivindicação 6, para a preparação de um medicamento.
9. Utilização de um polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, de uma construção de ácido nucleico da reivindicação 4, de um vector da reivindicação 5 ou de uma célula hospedeira da reivindicação 6, para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças cancerosas, em particular tumores sólidos ou linfáticos, doenças infecciosas, doenças metabólicas, condições inflamatórias, doenças auto-imunes, em particular doenças artríticas reumatóides.
10. Composição compreendendo polipéptidos de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, construções de ácido nucleico da reivindicação 4, vectores da reivindicação 5 e/ou células hospedeiras da reivindicação 6, e excipientes, aditivos e/ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis.
11. Utilização de uma composição da reivindicação 10 para a preparação de um medicamento, em particular para o tratamento de doenças cancerosas, em particular tumores sólidos ou linfáticos, doenças infecciosas, doenças metabólicas, condições inflamatórias, doenças auto-imunes, em particular doenças artríticas reumatóides. Lisboa, 2013-04-26