JP2008539225A - 人参サポニンＲｇ２の抽出方法及びその抽出物を含む医薬組成物とその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、一種の企業化規模の大量生産に適した人参サポニンRg2の抽出方法に関するもので、グラジエント塩析方(Gradient salting out)を利用して、従来のシリカゲルクロマトグラフィ方法を代替することによって、操作が簡便で、人参サポニンRg2の大量生産が可能な方法である。
また、本発明は、人参サポニンRg2を活性成分にした医薬組成物及びこの痴呆、憂鬱症及び末梢循環障害などの関連疾病を予防し、治療する予防及び治療剤に関するものである。
また、本発明は、人参サポニンRg2を活性成分にした医薬組成物及びこの痴呆、憂鬱症及び末梢循環障害などの関連疾病を予防し、治療する予防及び治療剤に関するものである。
Description
本発明は、人参サポニンRg2の抽出方法と、前記化合物を活性成分にした医薬組成物及びこれを利用した痴呆、憂鬱症及び末梢循環障害など関連疾病を予防し、治療する予防及び治療剤に関するものである。
人参にはいろいろな種類の人参サポニンが含有されているが、現在既に明かされた成分は３０余種で、そのうち人参サポニンRg2（Ginsengnoside Rg2）は、かなり以前から分離されて命名されたプロトパナキサトリオールグルコシド（Protopanaxatriol glycoside）に属する物質である。
従前の研究によると、紅参の加工過程のうち、人参サポニンＣ-２０の位置に結合されている配糖体結合が容易に加水分解されると同時に、水酸基が反平衡を起こし、人参サポニンＣ-２０（Ｓ）またはＣ-２０（Ｒ）異性体を形成するということが知られており、一般的に紅参には混合型人参サポニンRg2Ｃ-２０（ＲＳ）が水参や白参に比べ格段多く含有されていると公開されている。
しかし、前記のような人参サポニンRg2は、その医学的用途が知られていなかったため、これに対する抽出及び分離方法は実験室規模の分離方法で、有機溶媒で人参総サポニンを抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ方法または高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）方法で人参サポニンRg2を分離するのが通常的な抽出方法であった。
まず、シリカゲルカラムクロマトグラフィ工程は、人参総サポニン抽出物をシリカゲルクロマトグラフィカラムに吸着させた後、一定比率で混合された有機溶媒（クロロホルム：メチルアルコール：エチルアセテート：水）を洗浄剤に用いて人参サポニンRg2を分離する方法を言う。
前記したシリカゲルカラムクロマトグラフィを利用した方法の重要欠点は、毎回カラムから分離される量が少なく、分離速度も大変遅く、また人体に有毒な有機溶剤を大量に使用するため、以後別途の分離工程を必要とすると同時に、原価が高くなり、収得率が低く不安定で、大規模生産に適していないということである。
また、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）方法は、たとえ高純度の人参サポニンRg2を分離することはできるが、設備及び作動費用が高く、これやはりメチルアルコールまたはアセトニトリル（Acetonitrile）のような高価な有機溶媒を大量に使用するため、これによって生産原価も増加されるという問題点があった。結論的に、従来の人参サポニンRg2抽出方法は、大規模生産に適せず、価格が高く、商品化させるのが難しいということである。
つまり、企業化規模の大量生産に適した工程とは、操作及び工程が簡便で、実施が容易であり、収得率と純度が高く、人体に無害でありながらも安全な条件を備えることが好ましいが、今まではこれらに対する研究が未備な実情であった。
一方、人参サポニンRg2の医療用途に関する研究は大変稀で、たとえば本発明者が先出願した中国特許ＺＬ０１１０２１１７.９である“心脳血管疾病薬物製造における人参サポニンRg2の応用”で、人参サポニンRg2の医学的用途を提示したことがあるが、これは心筋虚血、脳虚血及びショック性疾患などのような心脳血管疾患の治療にだけ局限されている。従って、人参サポニンRg2の新しい医学的用途に対してより一歩進んだ研究が要求されている。
本発明の目的のうちの一つは、企業化規模の大量生産に適した新しい人参サポニンRg2の抽出方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、人参サポニンRg2を含有する医薬組成物を提供することにある。
本発明のまた別の目的は、人参サポニンRg2を含有する痴呆症、憂鬱症、末梢循環障害などの関連疾患を予防または治療する治療剤を提供することにある。
本発明のまた別の目的は、人参サポニンRg2を含有する痴呆症、憂鬱症、末梢循環障害などの関連疾患を予防または治療する治療剤を提供することにある。
前記のような目的を達成するために、本発明は、たらの木科人参属原料から人参サポニンRg2を抽出する方法において、原料を水で熱水抽出し、濃縮して得られた濃縮液を、低級アルコールを加えて沈殿された異物質を除去した後、残った上澄み液を脱色処理し、添加された低級アルコールを回収した後、塩析剤を投与して飽和濃度下で得られた沈殿物を水に再溶解させ、再びグラジエント塩析法を施行し、各自異なる塩析剤の濃度ごとに差等沈殿物を得た後、前記沈殿物を分析して人参サポニンRg2集中部分と非集中部分とに区分し、このうち人参サポニンRg2集中部分だけを取って脱塩剤で脱塩及び脱色し、濃縮した後、再び低級アルコールで精製して再結晶化することを特徴とする人参サポニンRg2の抽出方法を提供することによって達成される。
以下では、本発明に関してより詳細に説明する。
既に知られているように、人参サポニンRg2はその分子式がＣ４２Ｈ７２Ｏ１３であり、分子量は７８４であり、その構造式は下記の通りである。
＜構造式１＞
前記構造式１のような人参サポニンRg2を抽出する本発明は、従来のシリカゲルカラムクロマトグラフィ方法の代わりに、グラジエント塩析法（Gradient salting out）を利用することによって、操作が簡便であり、人参サポニンRg2の企業的規模の大量生産に適するようにした。使用される塩析剤としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム及びその他毒性のない無機塩の中から選択される一つまたは二つ以上の混合物が使用される。このような塩析剤は低毒性であり、価格が低廉で容易に得ることができ、回収することができてリサイクルが容易である。
また、従来の高価な有機溶剤の代わりに比較的価格の安い低級アルコールを使っても、高純度の人参サポニンRg2を同一に獲得することができるだけでなく、グラジエント塩析過程で、人参サポニンRg2以外にも他の人参総サポニンを獲得することができる。
本発明で抽出しようとする人参サポニンRg2は、たらの木科人参属（Araliacease panax）の原料中から抽出できるところ、前記原料に対して優先的に選択した方法は下記のような段階を含む。
ａ．たらの木科人参属の原料を１６倍量の水に入れて３時間のあいだ加熱抽出する過程を３回繰り返す。たらの木科人参属の原料は、人参（Panax ginseng）と洋参（Panax quinquefoilius Linn.）などの植物の葉、根または実を含む；
ｂ．前記のように加熱して得られた抽出液を濃縮し、その３〜４倍量に該当する低級アルコールを混合する。前記低級アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アミルアルコールの中から選択される一つまたは二つ以上の混合物である；
ｃ．前記混合液を撹拌して異物質を沈殿させ、濾過処理して得られた上澄み液を脱色処理した後、溶媒に使用されたアルコールを回収する；
ｄ．前記溶媒の除去された溶液に塩析剤を飽和濃度まで添加し、８時間のあいだ沈殿させて沈殿物を得て、前記沈殿物を２０倍量の水に再溶解させた後、再び塩析剤を添加しながらグラジエント塩析を行って、各々ちがう塩析剤濃度ごとに生成される沈殿物たちを分離して回収する。前記塩析剤には、前述した塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、この他にも毒性のない無機塩の中から選択される一つまたは二つ以上の混合物が使用される；
ｅ．前記グラジエント塩析法によって各自異なる塩析剤濃度から得られた沈殿物たちを、薄層クロマトグラフィ分析を実施して、人参サポニンRg2集中部分と人参サポニンRg2非集中部分とに分けて収集する；
ｆ．前記収集された人参サポニンRg2集中部分だけを選択して脱塩剤で脱塩、脱色した後再び濃縮する。前記脱塩剤には、陰陽イオン交換樹脂または吸着樹脂、充填剤などが使用されるのだが、イオン交換樹脂を使用の際は、人参サポニンRg2集中部分の沈殿物をその１０倍量の９５％エタノールに溶解させ濾過して得られた濾過液を１倍の蒸留水で希釈した後、脱塩を行い、吸着樹脂を使用の際は、人参サポニンRg2集中部分の沈殿物をその２０倍量の水に溶解させた後、吸着樹脂に通して無機物を除去し、５０％エタノールで洗浄して脱塩を行う；
ｇ．前記脱塩及び濃縮された人参サポニンRg2濃縮液にエタノールまたはメタノールなどのようなアルコールを投入しながら、５０％以上の濃度から析出される人参サポニンRg2粗製品（crude product）を獲得する；
ｈ．前記人参サポニンRg2粗製品を、再び各自異なるアルコールの濃度下で溶解度の差による再結晶を行い、高純度の各構造型人参サポニンRg2を収得する。例えば、人参サポニンRg2粗製品をまず７０％アルコールに溶解させ、常温で１２時間放置して、単一型Ｃ-２０(Ｒ)人参サポニンRg2を析出し、その上澄み液を取ってアルコール濃度を８０％に調節し、４℃で２４時間再結晶して結晶体を析出した後、前記結晶体を再び９０％アルコールに投入し８０℃まで加熱して溶解させた後、１０℃で２４時間放置して、混合構造型Ｃ-２０(ＳＲ)人参サポニンRg2を析出し、その上澄み液を再び-２０℃で１２時間放置して、単一型Ｃ-２０(Ｓ)人参サポニンRg2を析出する。
ｂ．前記のように加熱して得られた抽出液を濃縮し、その３〜４倍量に該当する低級アルコールを混合する。前記低級アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アミルアルコールの中から選択される一つまたは二つ以上の混合物である；
ｃ．前記混合液を撹拌して異物質を沈殿させ、濾過処理して得られた上澄み液を脱色処理した後、溶媒に使用されたアルコールを回収する；
ｄ．前記溶媒の除去された溶液に塩析剤を飽和濃度まで添加し、８時間のあいだ沈殿させて沈殿物を得て、前記沈殿物を２０倍量の水に再溶解させた後、再び塩析剤を添加しながらグラジエント塩析を行って、各々ちがう塩析剤濃度ごとに生成される沈殿物たちを分離して回収する。前記塩析剤には、前述した塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、この他にも毒性のない無機塩の中から選択される一つまたは二つ以上の混合物が使用される；
ｅ．前記グラジエント塩析法によって各自異なる塩析剤濃度から得られた沈殿物たちを、薄層クロマトグラフィ分析を実施して、人参サポニンRg2集中部分と人参サポニンRg2非集中部分とに分けて収集する；
ｆ．前記収集された人参サポニンRg2集中部分だけを選択して脱塩剤で脱塩、脱色した後再び濃縮する。前記脱塩剤には、陰陽イオン交換樹脂または吸着樹脂、充填剤などが使用されるのだが、イオン交換樹脂を使用の際は、人参サポニンRg2集中部分の沈殿物をその１０倍量の９５％エタノールに溶解させ濾過して得られた濾過液を１倍の蒸留水で希釈した後、脱塩を行い、吸着樹脂を使用の際は、人参サポニンRg2集中部分の沈殿物をその２０倍量の水に溶解させた後、吸着樹脂に通して無機物を除去し、５０％エタノールで洗浄して脱塩を行う；
ｇ．前記脱塩及び濃縮された人参サポニンRg2濃縮液にエタノールまたはメタノールなどのようなアルコールを投入しながら、５０％以上の濃度から析出される人参サポニンRg2粗製品（crude product）を獲得する；
ｈ．前記人参サポニンRg2粗製品を、再び各自異なるアルコールの濃度下で溶解度の差による再結晶を行い、高純度の各構造型人参サポニンRg2を収得する。例えば、人参サポニンRg2粗製品をまず７０％アルコールに溶解させ、常温で１２時間放置して、単一型Ｃ-２０(Ｒ)人参サポニンRg2を析出し、その上澄み液を取ってアルコール濃度を８０％に調節し、４℃で２４時間再結晶して結晶体を析出した後、前記結晶体を再び９０％アルコールに投入し８０℃まで加熱して溶解させた後、１０℃で２４時間放置して、混合構造型Ｃ-２０(ＳＲ)人参サポニンRg2を析出し、その上澄み液を再び-２０℃で１２時間放置して、単一型Ｃ-２０(Ｓ)人参サポニンRg2を析出する。
このような本発明の抽出方法は、特殊な設備が必要なく、操作が簡便で、純度と収得率が高く、人体に無害でありながらも安全で、大規模工業化生産に適している。また、本発明は、剰余のその他人参総サポニンを回収するのに影響を与えないという効果がある。
並びに、本発明は、前述した抽出方法によって抽出された人参サポニンRg2を含有する医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、任意の一種の異性体または混合異性体の人参サポニンRg2１〜９９重量％と；医薬的な面で受容可能な担体及び補助剤９９〜１重量％からなることを特徴とする。より好ましくは、前記医薬組成物は、５０％以上の人参サポニンRg2を活性成分に含有するのがよい。
前記した担体及び補助剤は、澱粉、滑石粉、糖、矯味剤、デキストリン類、医学用エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、植物油、ゼラチン及びツイン８０（tween80；Polyoxyethyelene Sorbitan Monooleate）またはその他界面活性剤から選択することができる。
より詳細に説明すると、水のような希釈剤及び賦形剤；澱粉、蔗糖などのような充填剤；繊維素派生物質、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニールピロリドン（Polyvinylpyrolidone）などのような接合剤；グリセリンのような湿潤剤；アガ（Agar）、炭酸カルシウムと炭酸水素ナトリウムのような崩解剤；４価アンモニウム（Quaternary Ammonium）化合物のような吸収促進剤；ヘキサデカノール（Hexadecanole）のような表面活性剤；高嶺土及び粗粘土のような吸着担体；滑石粉、カルシウムステアレート（Calsium Stearate）とマグネシウム及びポリエチレンなどのような潤滑剤を更に含む。この他にも、構成物質として、香味剤、甘味剤などのその他補助剤を添加することができる。
また、本発明は、前述した人参サポニンRg2を含有する医薬組成物を利用して漢方薬または洋薬で使用される注射剤、カプセル、丸薬、錠剤、噴霧剤、内服薬、パッチ、座薬、マイクロカプセル及びマイクロボールの形態に製造されることを特徴とする。
より詳細には、前記した医薬組成物は、粉針剤と溶液注射剤などのような注射剤；糖衣錠、口含錠、フィルムコーティング錠などのような錠剤と；普通及びマイクロ型カプセルなどのようなカプセル剤と；噴霧剤と；肛門や陰道座薬などのような座薬剤と；口粘膜パッチ剤と；噛んで飲む丸薬と；シロップ剤及びその他内服液などに応用可能である。
一方、後述する実験例を介して得られた研究結果、本発明で製造して得られた医薬組成物は、痴呆に対する治療作用があり、また抗うつと興奮中枢及び末梢循環の改善作用も備えていることを確認することができた。
医学上痴呆とは、精神神経機能性障害の範疇に属するもので、言い換えると脳部気質性疾病による知能（知覚、記憶、思惟、推理と判断、感情など）障害と呼ばれ、その発病原因は、神経細胞の変成または死滅にあると知られている。
しかし、今まで公知された抗痴呆薬物としては、神経伝達物質、つまりアセチルコリン（acetylcholine）の作用を増加させて、若干の症状を改善することはできるが、その発病原因である神経細胞の変成及び死滅を防止することはできなかった。従って、痴呆初期はアセチルコリン性神経細胞が損傷されるだけでなく、グルタミン酸性神経細胞も損傷されるため、アセチルコリンの活性を増強させるのは、痴呆初期の患者に一時的な効果が得られるだけであった。
一方、グルタミン酸は、脳に最も多く存在する神経伝達物質で、もしグルタミン酸活性剤が開発されたら、その効果はアセチルコリン活性剤より更に優れるだろうと予測されているが、ただグルタミン酸活性剤も神経細胞の損傷を防ぐのではなく、神経細胞の損傷が起こった後に残っている神経細胞間の作用を増進させる役割だけを遂行するもので、もし過量投与時は、神経細胞の損傷を招くだけでなく、細胞死滅が原因である痴呆の根本的な治療方法だと言えない。
近来の研究では、不溶性ベータアミロイドによる神経細胞損傷が知能障害をまねく根本源だと言われており、従って神経伝達物質の作用を増進させると同時に、神経細胞の変成及び死滅を防止するのが痴呆治療の要である。
また、憂鬱症は、臨床的によく見られる精神異常性疾病で、これやはり精神障害性感情総合症状であり、その発病原因は、正確に明かされていないが、脳内モノアミン（mono amine）類神経伝達物質の合成が減少されるのと関連があると知られている。
既に公知の抗うつ薬であるイミフラミン（imipramine）は、シナプス間隔（Synaptic cleft）のノルアドレナリン（NA）と5-ヒドロキシトリプタミン（5-HT）の濃度を増加させるものであり、若干のモノアミン酸化酵素（Monoamine oxidase）抑制剤も、脳内のモノアミン類神経伝達物質を増加させている。
現在憂鬱症動物モデルは、モノアミン伝達物質学説の基礎の上に立てられたもので、従って脳内のモノアミン類神経伝達物質を調節することが、精神異常性疾病または精神障害を治療する重要な要となっている。
そこで、本発明の抽出方法で得た人参サポニンRg2を後述する動物実験に適用した結果、優れた痴呆症治療作用を現し、不溶性β-アミロイドタンパク質または多発性脳梗塞による記憶障害に全て著しい改善効果と、脳神経細胞の自滅を調節することができ、自滅関連遺伝子タンパク質の発現を抑制し、神経細胞体の消失及び死滅を防止すると同時に、グルタミン酸と興奮性アミノ酸が起こす相関神経細胞損傷を抑制することができた。
その他の動物実験でも、脳内のモノアミン類神経伝達物質を著しく増加させ、優れた抗うつ効果を現し、ペントバルビタールソジウム（Pentobarbital Sodium）による睡眠時間を著しく短縮させ、大脳皮質を興奮させる作用を備えているということが明かされた。
以下では、本発明を下記の実施例を介してより詳細に説明するが、これは本発明の理解を深めるために提示されただけで、本発明が下記の実施例にだけ限定されるのではない。
＜実施例１＞
−人参の葉からの人参サポニンRg2の抽出−
まず、１００ｋｇの人参の葉を１６倍量の水に入れて３時間加熱して煮る。前記過程を３回繰り返して得られた液体を全て合わせて濾過器で濾過した後、前記濾過液を濃縮機で概略１００ｋｇになるまで濃縮した。前記濃縮液にその３倍量に該当する９５％エタノールを添加して撹拌し、異物質を沈殿させた後、再び濾過処理して沈殿された異物質を除去し、分離された上澄み液は活性炭を利用して脱色した後、溶媒に使用したエタノールを回収した。
−人参の葉からの人参サポニンRg2の抽出−
まず、１００ｋｇの人参の葉を１６倍量の水に入れて３時間加熱して煮る。前記過程を３回繰り返して得られた液体を全て合わせて濾過器で濾過した後、前記濾過液を濃縮機で概略１００ｋｇになるまで濃縮した。前記濃縮液にその３倍量に該当する９５％エタノールを添加して撹拌し、異物質を沈殿させた後、再び濾過処理して沈殿された異物質を除去し、分離された上澄み液は活性炭を利用して脱色した後、溶媒に使用したエタノールを回収した。
前記エタノールの除去された溶液を１０倍量の水に溶解させた後、高純度の硫酸アンモニウムを溶液の濃度が飽和状態に至るように添加し、８時間のあいだ沈殿させた。前記のように得られた沈殿物をもって２０倍量の水に再溶解させた後、再び高純度の硫酸アンモニウムを連続的に投入しながら、グラジエント塩析法を行い、溶液内の硫酸アンモニウムの濃度が５％、１０％、１５％、２０％、３０％になるたびに各々析出された沈殿物を別途に分離して収集した。
前記のように各々塩析剤の濃度によって収集された沈殿物たちを少量ずつ取って薄層クロマトグラフィ分析を行い、人参サポニンRg2集中部分（１５％と２０％硫酸アンモニウム濃度時の沈殿物）と、その他の人参サポニンRg2非集中部分（５％、１０％、３０％硫酸アンモニウム濃度時の沈殿物）とに分けた後、前記人参サポニンRg2集中部分の沈殿物だけを取って、その１０倍量の９５％エタノールに溶解させ、濾過して得られた濾過液を１倍の蒸留水で希釈し、イオン交換樹脂を通して脱塩及び脱色した後、１０００mlになるまで濃縮させた。
このような濃縮液を再び９５％のエタノールに添加しながら、溶液内のエタノール濃度が５０％以上になった時から結晶体で析出される人参サポニンRg2粗製品(Crude product)を得て、前記のように析出された人参サポニンRg2粗製品を高速液体クロマトグラフィ（ＨＬＰＣ）を利用して２０３nm下でその純度を測定し、下記の表１と図１に示した。
前記表１と図１のデータのように、人参サポニン粗製品の純度は、保留時間（Retention time）が１８〜２２のあいだのピーク（Peak）である２０と２１で測定された面積％（Area%）を合算した結果、７５．８１％と現れた。
また、前記のように得られた人参サポニンRg2粗製品を７０％エタノールに溶解させ、常温で１２時間のあいだ放置して、単一型Ｃ-２０(Ｒ)人参サポニンRg2を結晶体で析出し、その上澄み液を取ってエタノールの濃度を８０％に調節し、４℃で２４時間再結晶して結晶体を析出した後、前記結晶体を再び９０％エタノールに投入して８０℃まで加熱して溶解させた後、１０℃で２４時間放置して、混合構造型Ｃ-２０(ＳＲ)人参サポニンRg2を結晶体で析出し、その上澄み液を再び-２０℃で１２時間放置して、単一型Ｃ-２０(Ｓ)人参サポニンRg2を結晶体で析出した。
前記各構造型人参サポニンRg2結晶体を最終精製して減圧濾過した後、常温で２４時間自然乾燥した結果、各々単一構造体Ｃ-２０(Ｓ)型人参サポニンRg2２０gと、混合構造型Ｃ-２０(ＳＲ)人参サポニンRg2２３８gと、単一構造型Ｃ-２０(Ｒ)型人参サポニンRg2３０gとを順番に獲得した。付加的に、人参サポニンRg2非集中部分では人参サポニン２１００gを獲得した。
前記のように得られた各構造型人参サポニンRg2を各々重量法（原料に使用された人参の葉１００ｋｇに対する抽出分離された人参サポニンRg2の質量を百分率で示す）で測定した結果、Ｃ-２０（ＳＲ）人参サポニンRg2収得率は０．２４％で、Ｃ-２０（Ｓ）型人参サポニンRg2収得率は０．０２％であり、Ｃ-２０（Ｒ）型人参サポニンRg2の収得率は０．０３％であった。
また、各構造型人参サポニンRg2を液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を利用して２０３nm下でその純度を測定し、表２乃至４と図２乃至４に示した。
前記の表２と図２のデータのように、混合構造型Ｃ-２０（ＳＲ）人参サポニンRg2の純度は、保留時間(Retention time)が１８〜２２のあいだのピーク(Peak)である２５と２６で測定された面積％（Area%）を合算した結果、９６．８０％と現れた。
前記表３と図３のデータのように、単一構造型Ｃ-２０（Ｓ）人参サポニンRg2の純度は、保留時間(Retention time)が１８〜２２のあいだのピーク(Peak)である２０と２１で測定された面積％（Area%）を合算した結果、７５．２５％と現れた。
前記表４と図４のデータのように、単一構造型Ｃ-２０（Ｒ）人参サポニンRg2の純度は、保留時間(Retention time)が１８〜２２のあいだのピーク(Peak)である２０と２１で測定された面積％（Area%）を合算した結果９８．０５％と現れた。
＜実施例２＞
−洋参の葉からの人参サポニンRg2の抽出−
洋参の葉５０ｋｇを原料にして、実施例１と同一な方法で混合構造型Ｃ-２０（ＳＲ）人参サポニンRg2７５gを獲得し、実施例１と同一な方法で収得率と純度を測定した結果、収得率は０．１５％、純度は表５と図５のデータのように９７．４１％と現れた。
−洋参の葉からの人参サポニンRg2の抽出−
洋参の葉５０ｋｇを原料にして、実施例１と同一な方法で混合構造型Ｃ-２０（ＳＲ）人参サポニンRg2７５gを獲得し、実施例１と同一な方法で収得率と純度を測定した結果、収得率は０．１５％、純度は表５と図５のデータのように９７．４１％と現れた。
＜実施例３＞
−人参の実からの人参サポニンRg2の抽出−
人参の実５０ｋｇを取って少量の水を添加した後、果肉をつぶして種を取り除いた後、濃縮してシロップを作り、前記シロップから実施例１と同一な方法で混合構造型Ｃ-２０（ＳＲ）人参サポニンRg2１２５gを獲得し、実施例１と同一な方法で収得率と純度を測定した結果、収得率は０．２５％で、純度は表６と図６のデータのように９８．５５％と現れた。
−人参の実からの人参サポニンRg2の抽出−
人参の実５０ｋｇを取って少量の水を添加した後、果肉をつぶして種を取り除いた後、濃縮してシロップを作り、前記シロップから実施例１と同一な方法で混合構造型Ｃ-２０（ＳＲ）人参サポニンRg2１２５gを獲得し、実施例１と同一な方法で収得率と純度を測定した結果、収得率は０．２５％で、純度は表６と図６のデータのように９８．５５％と現れた。
以下では、実施例１乃至３によって抽出された人参サポニンRg2を利用して痴呆の治療効果をはじめとする、抗憂鬱と興奮中枢及び末梢循環の改善作用に対する実験を実施した。
＜実験例１＞
−ベータアミロイド（Aβ1-40）性痴呆症に対する人参サポニンRg2の治療効果−
実験はアルツハイマー痴呆（ＡＤ）モデルを採択した。白ネズミ（Rat）７０匹を各１０匹ずつ計７グループに分け、抱水クロラール（Chloralhydrate）で麻酔させた後、仮施術グループ以外の残りのグループには、海馬ＣＡ１区域内にベータアミロイド（Aβ1-40）４とイボテン酸（Ibotenic acid;IBA）１μｇを注射して痴呆モデルを作った。この時、仮施術グループには、ベータアミロイド及びイボテン酸の代わりに、同一量の生理食塩水を注入した。
−ベータアミロイド（Aβ1-40）性痴呆症に対する人参サポニンRg2の治療効果−
実験はアルツハイマー痴呆（ＡＤ）モデルを採択した。白ネズミ（Rat）７０匹を各１０匹ずつ計７グループに分け、抱水クロラール（Chloralhydrate）で麻酔させた後、仮施術グループ以外の残りのグループには、海馬ＣＡ１区域内にベータアミロイド（Aβ1-40）４とイボテン酸（Ibotenic acid;IBA）１μｇを注射して痴呆モデルを作った。この時、仮施術グループには、ベータアミロイド及びイボテン酸の代わりに、同一量の生理食塩水を注入した。
前記痴呆モデルグループを、再び生理食塩水の投与される対照群と、人参サポニンRg2の投与される実験群及び医学的痴呆治療剤であるニモジピン（nimodipine）の投与される比較群とに分け、各々下記の表７に記載された投与剤量によって毎日１回ずつ、総７日間静脈内注射（intravenous injection）した。この時、実験群に投与される試薬物は、単一異性体であるＣ-２０（Ｓ）人参サポニンRg2とＣ-２０（Ｒ）人参サポニンRg2及び混合型であるＣ-２０（ＳＲ）人参サポニンRg2（以下、表では各々Ｓ，Ｒ、ＳＲと略称する）である。
このように、各々試薬物を投与してから６日目にＹ型電子迷路検測を実施して、白ネズミの学習記憶能力を次のような方法で測定した。まず、白ネズミが連続的に９/１０回正確に反応するのに必要な刺激回数を学習次数にし、２４時間過ぎた次の日、連続的に９/１０回正確に反応するのに必要な刺激回数を記憶次数に記録して、その結果でグループ間（ｔ）の検測を行い、下記の表７に示した。
前記表７に示したとおり、脳内にベータアミロイド（Aβ1-40）とイボテン酸（ＩＢＡ）を注射した白ネズミの学習記憶能力検測結果、典型的なベータアミロイド性痴呆症状を有する対照群と比較して、各構造型人参サポニンRg2を投与した実験群は、その学習記憶能力が著しく改善されることが分かった。
また、前記のように学習記憶能力を検測して２４時間後、海馬ＣＡ１区域の注射した部位前後を連続的に切ってニッスル（Nissl）染色、ＨＥ染色、免疫組織とTUNEL(Terminal decoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling)に対する化学検測を進行して、海馬神経元細胞帯の変形、怪死、細胞消失の程度、細胞死滅数、Bax/Bcl-2とC-fos遺伝子発現程度を観察し、下記表８乃至表１１に示した。
前記表８に示したとおり、ニッスル染色結果、脳内にAβ1-40とIBAを注射したら、対照群のように広範囲な神経細胞体の遺失を招いたが、各構造型人参サポニンRg2を投与した実験群では、神経細胞体遺失に対する明らかな抑制結果が現れることが分かった。
前記表９に示したとおり、TUNEL検測結果、海馬内にAβ1-40とIBAを注射すると、対照群のように神経細胞の死滅が誘発されるが、各構造型人参サポニンRg2を投与した実験群では、神経細胞体死滅数が著しく軽減されることを確認することができた。
前記表１０と表１１に示したとおり、死滅促進調節子（Bax）及び死滅抑制調節子（Bcl-2）、転写調節因子（C-fos）の発現結果、ベータアミロイド（Aβ1-40）性痴呆症状を有する対照群では、Baxの発現は増加され、Bcl-2の発現は低下されたが、各構造型人参サポニンRg2を投与した実験群では、Baxの発現は低下され、Bcl-2及びC-fosの発現は増進されていることが分かった。これは、各構造型人参サポニンRg2が異常BaxとBcl-2の遺伝子発現に対して調節作用があることを説明してくれるものである。
また、ＨＥ染色結果、仮施術グループの海馬神経細胞体（neurone）損傷が少なく、針道周囲に軽微な損傷があり、少量のグリア細胞（gliocyte）が浸潤されているだけで、錐体細胞帯は完全であり、損傷がなかった。
一方、ベータアミロイド性痴呆症状を見せる対照群は、大量のグリア細胞浸潤と、著しい海馬神経細胞体の消失があり、消失部位は、注射点付近のＣＡ１から遠距離区域まで拡張され、大変長い錐体顆粒細胞帯が消失されているのが観察され、高倍率顕微鏡では神経元細胞膜破裂、細胞萎縮、細胞核縮小、死滅小体がはっきりと観察された。
反面、各構造型人参サポニンRg2の投与された実験群は、局部的なグリア細胞の浸潤、錐体細胞帯と顆粒細胞帯の混乱さ、希薄さ、細胞帯消失などが目立たず、高倍率顕微鏡では、細胞膜が完全で、死滅小体はＣＡ１より遠い部位に大変稀に或いは大変軽微に現れ、病理学的変化も大変軽微に現れた。
結論的に、ベータアミロイド（Aβ1-40）とイボテン酸（IBA）混合液を白ネズミ（Rat）脳内海馬区域内に注射してＡＤ行為と病理学的変化が生じた痴呆モデルに対して、各構造型人参サポニンRg2は、抗痴呆治療薬物であるニモジピンのようにＡＤネズミの学習と記憶能力を著しく改善させることもでき、神経細胞体の遺失を防止し、脳内C-fosとbcl-2の発現を増加させる反面、baxの発現は抑制させることになる。これによって、神経細胞体を保護し、神経細胞の死滅を防止することになる。
＜実験例２＞
−多発梗塞性痴呆症に対する人参サポニンRg2の治療効果−
本実験では、多発梗塞性痴呆症（Multiple Infact Dementia:MID）モデルを採択した。白ネズミ（Rat）５６匹を各８匹ずつ計７グループに分け、１０％の抱水クロラール麻酔下で、仮施術グループ以外の残りのグループには、各々複合血栓誘導体０.１３ml/１００gを頸動脈内に注入した後、解剖構造を復帰させ、層に沿って皮膚を縫合した痴呆モデルをつくった。この時、仮施術グループには複合血栓誘導体の代わりに同一量の生理食塩水だけを注入した。
−多発梗塞性痴呆症に対する人参サポニンRg2の治療効果−
本実験では、多発梗塞性痴呆症（Multiple Infact Dementia:MID）モデルを採択した。白ネズミ（Rat）５６匹を各８匹ずつ計７グループに分け、１０％の抱水クロラール麻酔下で、仮施術グループ以外の残りのグループには、各々複合血栓誘導体０.１３ml/１００gを頸動脈内に注入した後、解剖構造を復帰させ、層に沿って皮膚を縫合した痴呆モデルをつくった。この時、仮施術グループには複合血栓誘導体の代わりに同一量の生理食塩水だけを注入した。
前記痴呆モデルグループを、再び生理食塩水の投与される対照群と人参サポニンRg2の投与される実験群及び医学的痴呆治療剤であるニモジピン（nimodipine）の投与される比較群とに分け、各々下記表１２に記載された投与剤量によって毎日１回ずつ、総７日間静脈内注射（intravenous injection）した。この時、実験群に投与される試薬物は、単一異性体であるＣ-２０（Ｓ）人参サポニンRg2とＣ-２０（Ｒ）人参サポニンRg2及び混合型であるＣ-２０（ＳＲ）人参サポニンRg2（以下、実験では各々Ｓ，Ｒ，ＳＲと略称する）である。
このように各々試薬物を投与してから６日目に実験例１と同一な方法で白ネズミの学習記憶能力を測定して下記表１２に示した。
前記表１２に示したとおり、学習記憶能力検測結果、典型的な多発梗塞性痴呆症（ＭＩＤ）痴呆症状を見せる対照群では、学習次数と記憶次数が増加されているが、各構造型人参サポニンRg2を投与した実験群では、各学習次数と記憶次数が著しく減少されていることが確認できるが、これは各構造型人参サポニンRg2が多発梗塞性痴呆症に著しい改善作用があることを明らかにするものである。
また、前記のように学習記憶能力を測定してから２４時間後、白ネズミの頭部を解剖して脳のブリグマ（bregma）を各々前と後に２Ｘ５mmを切断し、４％のパラホルムアルデヒド（Paraformaldehyde）で固定した後、パラフィンで覆い、パラフィン切片器で厚さ７μｍの大きさの切片をつくり、前記切片を取って各々ニッスル染色して免疫グループのＣＰＵ区域内Glutamate（Glu）と死滅促進調節子（Bax）、細胞消滅誘導体であるCaspase-3、タンパク質分解酵素であるCalpainII陽性神経細胞体に対する化学検測を行い、その結果を下記の表１３と表１４に各々示した。
前記表１３と表１４に示したとおり、免疫グループに対する化学検測結果、典型的なＭＩＤ痴呆症状を有する対照群と比較して、各構造型人参サポニンRg2を投与した実験群の白ネズミは、ＣＰＵ区域のGlu、Bax、Caspase-3、CalpainII陽性神経源発現数が全て著しく減少されていることを確認することができ、これは前記異常遺伝子発現に対して調節作用があるということが分かる。
結論的に、複合血栓誘導体を白ネズミ（Rat）に注射し、ＭＩＤの行為と病理学的変化が生じた痴呆モデルに対して、各構造型人参サポニンRg2は、抗痴呆治療剤であるニモジピンのように学習と記憶能力を著しく改善させることができ、その作用は、タンパク質死滅に関わるGlu、CalpainII、Caspase-3、Baxの発現低下と関わりがあることを確認することができる。
＜実験例３＞
−ＰＣ１２細胞損傷後、ＭＴＴ代謝に対する人参サポニンRg2の治療効果−
１０５個/mlの密度を有するＰＣ１２培養細胞を９６孔プレートに各孔ごとに１００μｌずつ接種し、ＰＣ１２細胞が壁に付着されるのを待った後、前記孔を計六グループに分け、各グループごとに６孔ずつ割り当てた。
−ＰＣ１２細胞損傷後、ＭＴＴ代謝に対する人参サポニンRg2の治療効果−
１０５個/mlの密度を有するＰＣ１２培養細胞を９６孔プレートに各孔ごとに１００μｌずつ接種し、ＰＣ１２細胞が壁に付着されるのを待った後、前記孔を計六グループに分け、各グループごとに６孔ずつ割り当てた。
前記グループのうち、無処理群には無血清培地を添加し、対照群にはグルタミン酸の含有された無血清培地１mmol/lと同等体積の２０％の１．２ポリエチレングリコールを添加し、実験群にはグルタミン酸の含有された無血清培地１mmol/lと各構造型人参サポニンRg2０．１mmol/lを、比較群には人参サポニンRg2の代わりにニモジピンを５pmol添加した後、持続的に３７℃で２０時間増殖させた。
前記各グループの孔にＭＴＴ（５g/l）２０μｌを添加して３７℃で継続して４時間増殖させた後、源培地を吸出し、各孔に０．１mlのジメチルスルホキシド（DMSO:Dimethyl Sulfoxide）を添加して赤色顆粒を溶解させた後、酵素標識検測器で４９０nm部位の光密度（ＯＤ）を測定してグループ間（ｔ）検測を実施し、その結果を下記表１５に示した。
前記表１５に示したとおり、対照群ではＭＴＴ代謝が著しく低下されたが、これはグルタミン酸が部分的なＰＣ１２細胞を損傷させたためであることが確認される。その反面、前記対照群と比較して、各構造型人参サポニンRg2及びニモジピンの投与された実験群及び比較群では、全てＰＣ１２細胞のＭＴＴ代謝が著しく増加されたことを確認することができ、これは、全ての各構造型人参サポニンRg2が、グルタミン酸がＰＣ１２細胞に及ぼす損傷を抑制することができることを説明してくれるものである。
＜実験例４＞
−憂鬱症に対する人参サポニンRg2の治療効果−
憂鬱症の一般的なモデルは薬物またはストレス性刺激法を採択するが、本発明では虚血／再潅流（ischemia/reperfusion）法を採択し、脳組織のＮＥ，ＤＡ，５-ＨＴ含量を低め憂鬱症モデルを採択した。
−憂鬱症に対する人参サポニンRg2の治療効果−
憂鬱症の一般的なモデルは薬物またはストレス性刺激法を採択するが、本発明では虚血／再潅流（ischemia/reperfusion）法を採択し、脳組織のＮＥ，ＤＡ，５-ＨＴ含量を低め憂鬱症モデルを採択した。
白ネズミ（Rat）４８匹を各々８匹ずつ計６グループに分け、１０％抱水クロラールで麻酔させた状態で、仮施術グループを除いたその他のグループに対して、各々の白ネズミに左側頸外動脈からナイロン線を頸内動脈に入れ、大脳中動脈（ＭＣＡ）を塞いだ後、血流遮断開始から時間を計って３０分が経過した後、ナイロン線を抜き取り再潅流させて憂鬱症モデルをつくった。
前記憂鬱症モデルのうち対照群には７．５ｍｇ・ｋｇ-1の溶媒を、実験群には下記表１６に記載された投与剤量によって各構造型人参サポニンRg2を毎日１回連続５日間静脈内注射した。
前記のように、各々試薬物を投与してから４８時間後に、実験例１と同一な方法で白ネズミに対して学習記憶能力を測定し、下記表１６に示した。
また、前記のように学習記憶能力を測定して６日経過した後、白ネズミの頭部を解剖して脳を摘出し均一に流体になるようにした後、脳組織の神経伝達物質であるNorpinephrine（NE）、Dopamine（DA）、5-Hydroxytryptamine（5-HT）の含量を測定してグループ間の（ｔ）検測を行い、その結果を下記表１７に示した。
前記表１６と表１７に示したとおり、対照群の学習記憶能力と脳内ＮＥ，ＤＡの含量が著しく低下された反面、各構造型人参サポニンRg2を投与した実験群では、全て学習記憶能力とＮＥ，ＤＡと５-ＨＴ含量が著しく増加されていることを見せている。
これは、モノアミン類の理論によると、各構造型人参サポニンRg2は、憂鬱症または中枢神経興奮／抑制混乱性疾病に著しい改善作用があるということが確認された。
＜実施例５＞
−ペントバルビタールソジウム（Pentobarbital Sodium）睡眠時間に対する人参サポニンRg2の治療効果−
雄ハツカネズミ（mouse）３８匹をもって、表１８に記載されたとおり、三つのグループに分け、実験群には混合型人参サポニンRg2を各々１０，２０ｍｇ・ｋｇ-1ずつ静脈内に投与した後、同時に５０ｍｇ・ｋｇ-1のペントバルビタールソジウム（Pentobarbital Sodium）を再度静脈内注射し、その反面対照群には人参サポニンRg2の代わりに２０％の１．２ポリエチレングリコール１０ｍｇ・ｋｇ-1を静脈内注射した後、ライティングレフレックス（Lighting reflex）消失を指標にして各グループに属したハツカネズミの睡眠時間を記録し、グループ間（ｔ）検測を行い、その結果を表１８に示した。
−ペントバルビタールソジウム（Pentobarbital Sodium）睡眠時間に対する人参サポニンRg2の治療効果−
雄ハツカネズミ（mouse）３８匹をもって、表１８に記載されたとおり、三つのグループに分け、実験群には混合型人参サポニンRg2を各々１０，２０ｍｇ・ｋｇ-1ずつ静脈内に投与した後、同時に５０ｍｇ・ｋｇ-1のペントバルビタールソジウム（Pentobarbital Sodium）を再度静脈内注射し、その反面対照群には人参サポニンRg2の代わりに２０％の１．２ポリエチレングリコール１０ｍｇ・ｋｇ-1を静脈内注射した後、ライティングレフレックス（Lighting reflex）消失を指標にして各グループに属したハツカネズミの睡眠時間を記録し、グループ間（ｔ）検測を行い、その結果を表１８に示した。
前記表１８に示したとおり、混合形態の人参サポニンRg2を投与した実験群では、対照群に比べ全てペントバルビタールソジウムによるハツカネズミ（mouse）の睡眠時間を著しく短縮させており、これは人参サポニンRg2が中枢神経系統に興奮作用があることを説明してくれるものである。
＜実験例６＞
−耳殻末梢循環障害に対する人参サポニンRg2の治療効果−
雄ハツカネズミ（mouse）６８匹を表１９のように６グループに分け、ウレタン（Urethane）で麻酔させた後、顕微鏡下で耳殻の一筋の微静脈（Ｖ）と微動脈（Ａ）とを探して各々その血管の直径を測定し、その流動形態を観察記録した。
−耳殻末梢循環障害に対する人参サポニンRg2の治療効果−
雄ハツカネズミ（mouse）６８匹を表１９のように６グループに分け、ウレタン（Urethane）で麻酔させた後、顕微鏡下で耳殻の一筋の微静脈（Ｖ）と微動脈（Ａ）とを探して各々その血管の直径を測定し、その流動形態を観察記録した。
前記グループたちに対して対照群には食塩水を、比較群には紅参と麦門冬の混合され生薬が０．２g/ml含有された参麦注射剤を、実験群には各構造型人参サポニンRg2を各々下記表１９に記載された投与剤量によって静脈内注射し、５分が経過した後、再びアドレナリン０．０１ｍｇ・ｋｇ-1を投与した後、毎時間ごとの血管直径、流動形態及び血管網交点数を測定した。
前記測定血管を基に、アドレナリンの前、後変化を百分率で計算してそのグループ間（ｔ）検測を行い、その結果を下記表１９、表２０及び表２１に示した。
前記表１９乃至表２１に示されているように、各構造型人参サポニンRg2の投与された実験群では、対照群に比べアドレナリンによるハツカネズミ（mouse）耳殻の微動脈及び微静脈の血管直径が縮小される現象と血管網交点数が減少される現象とが著しく抑制されていることが分かる。
また、参麦注射された比較群と比較しても、時間が経過するにつれ、各血管の直径の縮小と血管網交点数の減少程度が格段減っている。特に、その中でも、微静脈血管直径が縮小されるのを抑制する作用が微動脈より格段強く現れた。
＜実験例７＞
−ウサギの耳潅流量に対する人参サポニンRg2の治療効果−
大耳白ウサギ３３匹を下記表２２のように４グループに分け、ペントバルビタールソジウムの麻酔下で耳根動脈を剥離してチューブを挿入した後、Locke溶液で残留血液を洗浄し、ウサギの耳を切断した後、潅流を行った。
−ウサギの耳潅流量に対する人参サポニンRg2の治療効果−
大耳白ウサギ３３匹を下記表２２のように４グループに分け、ペントバルビタールソジウムの麻酔下で耳根動脈を剥離してチューブを挿入した後、Locke溶液で残留血液を洗浄し、ウサギの耳を切断した後、潅流を行った。
前記グループに対して、対照群には食塩水を、比較群には紅参と麦門冬の混合された生薬が０．２g/ml含有された参麦注射剤を、実験群には混合型人参サポニンRg2を各々下記表２２に記載された投与剤量によってチューブを介して投与し、各試薬物の投与前と投与後３分間隔で潅流点滴数変化値を末梢血管拡張程度で表示してグループ間（ｔ）検測を行い、その結果を下記表２２に示した。
前記表２２に示されたとおり、混合構造型人参サポニンRg2の投与された実験群では、投与後比較群に比べ潅流点滴数が著しく増加されていることを見せており、これは末梢血管に対して拡張作用があることを説明するものである。
上述したように、本発明の人参サポニンRg2抽出方法は、グラジエント塩析法を利用して、従来のシリカゲルカラムクロマトグラフィ分離法を代替することによって、操作が簡便かつ容易で、企業的規模の大量生産に適しており、高価な混合有機溶剤の代わりに比較的低価な低級アルケンアルコールを使用しても、高純度の完製品を抽出することができ、原価が低廉であり、人体に無害でありながら安全であるだけでなく、残余物質からその他の人参サポニンを回収することにも影響を与えなという効果をもたらす。
また、本発明の各構造型人参サポニンRg2が不溶性βアミロイドタンパク質及び多発性脳梗塞による痴呆動物の記憶障害に著しい改善作用があり、また脳神経細胞の死滅／抗死滅と関わる遺伝子タンパク質の発現を調節することができ、神経元の消失及び死滅を防止し、並びにグルタミン酸がＰＣ１２細胞を損傷させるのを抑制する効果をもたらすことを明らかにしている。
また、本発明は、各構造型人参サポニンRg2が脳欠血再潅流ネズミ（Rat）脳内ＮＥ，５-ＨＴ，ＤＡなどモノアミン類神経伝達物質を著しく増加させ、モノアミン学説によって、人参サポニンRg2が確かなる抗うつ作用を持っていることを確認し、この他にも人参サポニンRg2がペントバルビタールソジウムによる睡眠時間を著しく短縮させる効果があり、これは人参サポニンRg2が大脳皮質に対して興奮作用を起こすことを説明してくれる。
また、本発明は、各構造型人参サポニンRg2がハツカネズミ（mouse）の耳殻末梢循環障害に著しい改善作用をもたらし、並びにウサギの耳の潅流量を増加させる効果があり、これは末梢血管に対して拡張作用があることを説明してくれる。
Claims (9)
- たらの木科人参属原料から人参サポニンRg2を抽出する方法において、
原料を水で熱水抽出し、濃縮して得られた濃縮液を、低級アルコールを加えて沈殿された異物質を除去した後、残った上澄み液を脱色処理し、添加された低級アルコールを回収した後、塩析剤を投与して飽和濃度下で得られた沈殿物を水に再溶解させ、再びグラジエント塩析法を施行し、各自異なる塩析剤の濃度ごとに差等沈殿物を得た後、前記沈殿物を分析して人参サポニンRg2集中部分と非集中部分とに区分し、このうち人参サポニンRg2集中部分だけを取って脱塩剤で脱塩及び脱色し、濃縮した後、再び低級アルコールで精製して再結晶化することを特徴とする人参サポニンRg2の抽出方法。 - 前記原料は、たらの木科人参属植物の人参の葉、洋参の葉、人参の実の中から選択されることを特徴とする請求項１に記載の人参サポニンRg2の抽出方法。
- 前記熱水抽出は、たらの木科人参属の原料を、その１６倍量の水に入れて３時間の間加熱抽出する過程を３回繰り返すことを特徴とする請求項２に記載の人参サポニンRg2の抽出方法。
- 前記低級アルコールは、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アミルアルコールの中から選択されることを特徴とする請求項３に記載の人参サポニンRg2の抽出方法。
- 前記塩析剤は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、その他無毒性無機塩の中から選択されることを特徴とする請求項４に記載の人参サポニンRg2の抽出方法。
- 前記沈殿物から人参サポニンRg2集中部分と非集中部分とを区分する方法は、薄層クロマトグラフィ分析を介してなされることを特徴とする請求項５に記載の人参サポニンRg2の抽出方法。
- 前記脱塩剤は、陰陽イオン交換樹脂または吸着樹脂、充填剤の中から選択された一つであることを特徴とする請求項６に記載の人参サポニンRg2の抽出方法。
- 前記再結晶化過程は、人参サポニンRg2濃縮液に９５％のアルコールを投与しながら、溶液内のアルコール濃度が５０％以上になる時から析出される結晶体を獲得する１次析出過程と、前記結晶体を再び各自異なるアルコールの濃度下で溶解度の差による再結晶を行い、各々の結晶体を収得する２次析出過程とからなることを特徴とする請求項７に記載の人参サポニンRg2の抽出方法。
- 前記２次析出過程は、１次析出された結晶体を７０％アルコールに溶解させ、常温で１２時間のあいだ放置して、単一型Ｃ-２０(Ｒ)人参サポニンRg2を析出し、その上澄み液を取ってアルコール濃度を８０％に調節し、４℃で２４時間再結晶させて結晶体を析出した後、前記結晶体を再び９０％アルコールに投入して８０℃まで加熱して溶解させた後、１０℃で２４時間のあいだ放置して、混合構造型Ｃ-２０（ＳＲ）人参サポニンRg2を析出し、その上澄み液を再び-２０℃で１２時間のあいだ放置して、単一型Ｃ-２０（Ｓ）人参サポニンRg2を析出することを特徴とする請求項８に記載の人参サポニンRg2の抽出方法。
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