CN104483437B - 一种抗肿瘤中药组合物的质量检测方法 - Google Patents

一种抗肿瘤中药组合物的质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，该方法包括佛手，西洋参的薄层鉴定，西洋参和蟾酥的高效液相色谱法含量测定方法，及其中药组合物的指纹图谱检测方法。本发明提供的检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价抗肿瘤中药组合物的质量，为保证临床疗效具有重要意义。

Description

一种抗肿瘤中药组合物的质量检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药组合物的质量检测方法，具体涉及一种具有抗肿瘤作用的中药组合物的质量检测方法。
背景技术
天佛参口服液系用现代先进工艺提炼精制而成的一种纯天然中药制剂，由常熟雷允上制药有限公司生产，具有养阴益气，解毒散结的功效，与抗肿瘤化学药品合用，用于非小细胞肺癌属气阴两虚证，可减轻化疗所致的恶心、呕吐、便秘、脱发等现象，临床上得到的广泛的应用，疗效确切可靠。其中天佛参口服液由西洋参、蟾酥、天门冬、土贝母、倒卵叶五加、猕猴桃根、沙棘果、佛手8味药材组成。其中倒卵叶五加、猕猴桃根、沙棘果为水提工艺提取，西洋参、天门冬、土贝母为醇提工艺，总提取物中所含化合物极性涵盖强极性和中等极性范围，现有技术的检测方法，并不能全面、客观的检测和评价天佛参口服液的质量。
发明内容
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种具有抗肿瘤中药组合物(天佛参口服液)的质量检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价抗肿瘤中药组合物(天佛参口服液)的质量，对控制该抗肿瘤中药组合物(天佛参口服液)的质量与保证临床疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现以上技术目的，本发明采取的技术方案为：
一种抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，按重量份数计，所述的中药组合物由西洋参40～60份、蟾酥0.22～0.30份、天冬160～180份、土贝母190～210份、倒卵叶五加560～620份、猕猴桃根900～1100份、沙棘果320～340份、佛手190～210份制成口服液制剂，所述检测方法包括佛手和西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
佛手的薄层鉴定，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取中药组合物20～60ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15～45ml，合并醋酸乙酯提取液，水浴上浓缩至约2～4ml，即得；
(2)制备对照品溶液：取佛手对照药材粉末1～5g，加体积浓度60％～80％乙醇20～60ml，水浴上回流提取1～3小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，残留物加醋酸乙酯溶解，取上清液，即得；
(3)测定：吸取步骤(1)供试品溶液和步骤(2)对照品溶液各2～5μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取中药组合物20～60ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15～45ml，合并醋酸乙酯提取液，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每次10～15ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10～15ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
(2)制备对照品溶液：取西洋参对照药材1～2g，加体积浓度70％乙醇30～60ml，水浴上回液提取1～2小时，滤过，滤液蒸干，残留物加水溶解，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3～5次，每次10ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
(3)测定：吸取上述两种溶液各1～3μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，喷以5％硫酸溶液显色，自然光下检视，供试品溶液与西洋参对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
作为优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述的中药组合物由西洋参50份、蟾酥0.25份、天冬167份、土贝母200份、倒卵叶五加599份、猕猴桃根1000份、沙棘果333份、佛手167份制成口服液制剂，所述检测方法包括佛手和西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
佛手的薄层鉴定，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取中药组合物20ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15ml，合并醋酸乙酯提取液，水浴上浓缩至约2ml，即得；
(2)制备对照品溶液：取佛手对照药材粉末1g，加体积浓度80％乙醇20ml，水浴上回流提取1小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，残留物加醋酸乙酯溶解，取上清液，即得；
(3)测定：吸取步骤(1)供试品溶液和步骤(2)对照品溶液各2～5μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取中药组合物20ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15ml，合并醋酸乙酯提取液，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
(2)制备对照品溶液：取西洋参对照药材1g，加体积浓度70％乙醇30ml，水浴上回液提取1小时，滤过，滤液蒸干，残留物加水溶解，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
(3)测定：吸取上述两种溶液各1～3μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，喷以5％硫酸溶液显色，自然光下检视，供试品溶液与西洋参对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
作为优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述检测方法还包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中西洋参的含量，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取人参皂甙Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液作为对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密量取中药组合物10～30ml，置分液漏斗中，用乙醚提取4次，每次15～45ml，分取水层用水饱和的正丁醇提取3～5次，每次20～30ml，合并正丁醇液，置水浴上蒸干；加水溶解并置已处理好填有D101大孔吸附树脂柱内，用水洗脱，流速1ml/min，弃去水洗液，用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解并定量转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即得；
(3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定；其中所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为70∶30甲醇-磷酸二氢钠溶液为流动相，其中磷酸二氢钠浓度为0.03mol/L，并用磷酸调节pH值为4.5，检测波长为207nm。
作为优选方案，所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述中药组合物中含西洋参以人参皂甙Rb1计，不得少于35mg/100ml。
作为优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述检测方法还包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中蟾酥的含量，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷减压干燥24小时的华蟾酥毒基对照品、酯蟾毒配基对照品适量，加甲醇配制成每1ml含华蟾酥毒基10μg和酯蟾毒配基50μg的混合溶液，作为对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密量取中药组合物制成的口服制剂25ml，置分液漏斗中，加水50ml，混匀，依次加30ml，30ml，30ml，20ml，20ml的三氯甲烷提取5次，合并三氯甲烷提取液，用氢氧化钠溶液洗涤，弃去氢氧化钠液，再用水洗涤，弃去水液，取三氯甲烷液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解并转移至10ml容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)测定：分别精密吸取步骤(1)对照品溶液与步骤(2)供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定；其中所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为38:62的乙腈和0.5％磷酸二氢钾为流动相，并用磷酸调pH2.5，检测波长为296nm，柱温40℃。
作为优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述中药组合物中含蟾酥按华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的总量计，应为0.50mg～2.50mg/100ml。
作为优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述检测方法还包括中药组合物指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取中药组合物，经适当方法处理后制成供试品溶液；
(2)高效液相色谱法测定对照指纹图谱：取10批以上中药组合物供试品在适当的色谱条件下进样，测得各批次供试品的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为本品的对照指纹图谱；
(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)供试品溶液按步骤(2)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；
(4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价。
作为优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的指纹图谱检测方法，步骤(1)中供试品溶液制备方法为：用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液；或10000rpm离心10min，取上清液即得；
步骤(2)中，所述的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以体积浓度为0.05～0.1﹪甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为35～40℃；流速为每分钟0.8～1.0ml；检测波长：270～280nm；
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
0～12.0 0→7 100→93
12.0～30.0 7 93
30.0～60.0 7→19 93→81
60.0～100.0 19→37 81→63
100.0～120.0 37→57 63→43
120.0～121.0 57→100 43→0
121.0～130.0 100 0
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
130.0～131.0 100→0 0→100
131.0～141.0 0 100
作为优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的指纹图谱检测方法，步骤(1)中供试品溶液制备方法为：用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液；或10000rpm离心10min，取上清液即得；
步骤(2)中，所述的色谱条件为：色谱柱：WatersAtiantisT3，250mm×4.6mmi.d.，5μm；以甲醇为流动相A，以体积浓度为0.05﹪甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；流速为每分钟0.8ml；检测波长：270nm；
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
0～12.0 0→7 100→93
12.0～30.0 7 93
30.0～60.0 7→19 93→81
60.0～100.0 19→37 81→63
100.0～120.0 37→57 63→43
120.0～121.0 57→100 43→0
121.0～130.0 100 0
130.0～131.0 100→0 0→100
131.0～141.0 0 100
以上指纹图谱的色谱条件优化实验：
色谱柱选择
本发明分别考察了TigerkinC18柱(250mm×4.6mmi.d.，5μm)、WatersAtiantisT3(250mm×4.6mmi.d.，5μm)色谱柱对中药组合物的分离效果。结果表明，WatersAtiantisT3柱对极性化合物有很好的保留，能完全兼容纯水相流动相，且中药组合物中各成分在T3柱上分离较好，故选择WatersAtiantisT3柱为抗肿瘤中药组合物指纹图谱分析用色谱柱。
检测波长选择
中药组合物中处方药材倒卵叶五加、猕猴桃根、沙棘果中主要成分紫外吸收波长在258nm～310nm之间，在波长为270nm时获取的指纹图谱色谱峰较多，信息量大，故选择270nm作为指纹图谱的检测波长。
流动相体系选择
本发明分别考察了甲醇-水、甲醇-0.05﹪甲酸溶液、甲醇-0.1﹪甲酸、甲醇-0.05﹪磷酸、甲醇-0.1﹪磷酸溶液对分离的影响，结果表明甲酸浓度≥0.05﹪时色谱峰峰型对称、分离良好，故选择甲醇-0.05﹪甲酸溶液(V/V)为中药组合物指纹图谱色谱分离用流动相体系。
柱温选择
本发明分别考察了30℃、35℃和40℃柱温条件下对分离的影响，结果：柱温在35℃时，各成分分离度较好。色谱分析柱温选择35℃。
流速的选择
考察了0.7ml/min、0.8ml/min和0.9ml/min的流速对分离的影响，结果：以0.8ml/min的流速分离效果较佳。
流动相梯度选择
采用WatersAtiantisT3(250mm×4.6mmi.d.，5μm)色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.05﹪甲酸溶液(V/V)为流动相B，柱温为35℃；流速为每分钟0.8ml；检测波长：270nm。考察了不同梯度洗脱条件对分离的影响，结果以下述优选的流动相梯度为佳，故选定该梯度为中药组合物指纹图谱分析的色谱条件。
通过以上筛选，优选的指纹图谱的色谱条件为：色谱柱：WatersAtiantisT3，250mm×4.6mmi.d.，5μm；以甲醇为流动相A，以体积浓度为0.05﹪甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；流速为每分钟0.8ml；检测波长：270nm；
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
0～12.0 0→7 100→93
12.0～30.0 7 93
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
30.0～60.0 7→19 93→81
60.0～100.0 19→37 81→63
100.0～120.0 37→57 63→43
120.0～121.0 57→100 43→0
121.0～130.0 100 0
130.0～131.0 100→0 0→100
131.0～141.0 0 100
以上指纹图谱的方法学验证
仪器精密度试验
取同一批中药组合物供试品溶液，按上述优选的色谱条件连续进样6次，如表1和表2。结果各峰保留时间RSD小于0.9％，单峰面积大于总峰面积5％的峰峰面积RSD均小于3.6％。以第一次分析所得指纹图谱为对照，其他5次分析所得色谱图与对照图谱比较，相似度为：1.000、0.999、0.999、0.998、0.998、0.998，仪器精密度良好。
表1仪器精密度试验结果(保留时间)
峰号 tR-1 tR-2 tR-3 tR-4 tR-5 tR-6 平均值 RSD(％)
1 9.0 8.8 9.0 8.9 9.0 9.0 9.0 0.82
2 10.7 10.5 10.6 10.6 10.6 10.6 10.6 0.51
3 13.6 13.5 13.5 13.5 13.6 13.6 13.5 0.32
4 17.3 17.1 17.2 17.2 17.2 17.2 17.2 0.24
5 17.9 17.8 17.9 17.9 17.9 17.9 17.9 0.21
6 18.5 18.4 18.4 18.4 18.4 18.4 18.4 0.24
7 24.4 24.2 24.3 24.3 24.4 24.3 24.3 0.20
8 29.2 29.0 29.0 29.1 29.1 29.0 29.1 0.30
9 31.9 31.7 31.7 31.8 31.9 31.8 31.8 0.25
10 33.6 33.3 33.3 33.5 33.5 33.4 33.4 0.25
11 42.7 42.5 42.3 42.6 42.6 42.5 42.6 0.30
12 48.4 48.2 48.1 48.3 48.4 48.3 48.3 0.25
峰号 tR-1 tR-2 tR-3 tR-4 tR-5 tR-6 平均值 RSD(％)
13 50.8 50.6 50.5 50.7 50.7 50.7 50.7 0.20
14 54.2 54.0 53.9 54.1 54.1 54.0 54.0 0.18
15 66.0 65.7 65.7 65.8 65.8 65.8 65.8 0.15
16 67.4 67.2 67.2 67.3 67.3 67.3 67.3 0.13
17 68.6 68.4 68.4 68.5 68.5 68.4 68.5 0.12
18 69.5 69.2 69.3 69.3 69.3 69.3 69.3 0.12
19 71.1 70.9 70.9 71.0 71.0 70.9 71.0 0.13
20 72.5 72.3 72.3 72.4 72.4 72.4 72.4 0.12
21 74.1 73.8 73.9 73.9 73.9 73.8 73.9 0.13
22 76.0 75.7 75.7 75.8 75.8 75.7 75.8 0.14
23 86.0 85.7 85.8 85.9 85.9 85.8 85.8 0.12
24 86.8 86.5 86.6 86.6 86.6 86.5 86.6 0.12
25 95.5 95.2 95.3 95.3 95.3 95.1 95.3 0.13
26 111.7 111.4 111.5 111.5 111.5 111.4 111.5 0.09
27 113.5 113.2 113.3 113.3 113.3 113.2 113.3 0.08
28 116.4 116.2 116.3 116.3 116.3 116.2 116.3 0.07
表2仪器精密度试验结果(峰面积)
峰号 A-1 A-2 A-3 A-4 A-5 A-6 平均值 RSD(％)
3 2135 2187 2147 2002 2023 2069 2093.6 3.526 -->
5 1352 1384 1373 1378 1380 1371 1373.0 0.83
6 1994 2033 2040 2045 2073 2088 2045.5 1.60
8 1611 1580 1580 1574 1572 1573 1581.6 0.93
10 4017 4043 4051 4060 4069 4062 4050.3 0.46
15 1462 1479 1475 1480 1483 1482 1476.9 0.52
方法重复性试验
取同一批次(批号为1305111)中药组合物6份，按上述优选的方法测定供试品溶液，结果见表3和表4。结果各峰保留时间RSD小于1.1％，单峰面积大于总峰面积5％的峰峰面积RSD小于2.5％。以其中一色谱图为对照图谱，其他色谱图与该图谱比较，相似度分别为1.000、0.998、0.998、0.999、0.998、0.998，表明该方法具良好重复性。
表3重复性试验结果(保留时间)
峰号 tR-1 tR-2 tR-3 tR-4 tR-5 tR-6 平均值 RSD(％)
1 8.8 8.9 8.7 9.0 8.8 8.9 8.9 1.01
2 10.5 10.6 10.5 10.7 10.6 10.6 10.6 0.65
3 13.5 13.5 13.4 13.6 13.5 13.5 13.5 0.49
4 17.1 17.2 17.1 17.2 17.2 17.2 17.2 0.34
5 17.8 17.8 17.7 17.9 17.8 17.8 17.8 0.22
6 18.4 18.4 18.3 18.4 18.4 18.4 18.4 0.28
7 24.2 24.3 24.2 24.3 24.3 24.3 24.3 0.23
8 29.0 28.9 28.8 29.0 29.0 29.0 29.0 0.28
9 31.7 31.6 31.6 31.8 31.7 31.7 31.7 0.22
10 33.3 33.3 33.2 33.4 33.3 33.3 33.3 0.22
11 42.5 42.3 42.2 42.5 42.4 42.4 42.4 0.23
12 48.2 48.1 48.0 48.3 48.2 48.2 48.2 0.18
13 50.6 50.5 50.4 50.6 50.6 50.5 50.5 0.16
14 54.0 53.9 53.8 54.0 54.0 53.9 53.9 0.16
15 65.7 65.6 65.6 65.7 65.7 65.6 65.7 0.10
16 67.2 67.2 67.1 67.3 67.2 67.2 67.2 0.08
17 68.4 68.4 68.3 68.5 68.4 68.4 68.4 0.08
18 69.2 69.2 69.2 69.3 69.2 69.2 69.2 0.06
19 70.9 70.9 70.8 71.0 70.9 70.9 70.9 0.06
20 72.3 72.3 72.3 72.4 72.4 72.3 72.3 0.08
21 73.8 73.8 73.8 73.9 73.8 73.8 73.8 0.05
22 75.7 75.7 75.6 75.8 75.7 75.7 75.7 0.06
23 85.7 85.7 85.7 85.8 85.8 85.7 85.7 0.06
24 86.5 86.5 86.5 86.6 86.5 86.5 86.5 0.04
25 95.2 95.1 95.1 95.2 95.2 95.2 95.2 0.04
26 111.4 111.4 111.4 111.4 111.5 111.4 111.4 0.027 -->
27 113.2 113.2 113.2 113.2 113.3 113.2 113.2 0.02
28 116.2 116.2 116.3 116.2 116.3 116.2 116.2 0.02
表4重复性试验结果(峰面积)
峰号 A-1 A-2 A-3 A-4 A-5 A-6 平均值 RSD(％)
3 2187 2149 2193 2168 2181 2196 2178.8 0.81
5 1384 1339 1317 1358 1345 1317 1343.4 1.90
6 2033 2092 2087 2119 2112 2086 2088.1 1.45
8 1580 1599 1617 1577 1589 1506 1578.2 2.42
10 4043 4062 4060 4080 4073 4024 4056.9 0.51
15 1479 1462 1438 1457 1449 1404 1448.2 1.77
样品稳定性试验
取同一天制备得到的中药组合物的供试品溶液，按上述优选的色谱条件分别在室温放置0、5、10、15、20、25h后进样分析，结果见表5和表6。结果表明各峰保留时间RSD小于0.7％，单峰面积大于总峰面积5％的峰峰面积RSD小于2.4％。以0h分析所得图谱为对照，其他时间分析所得色谱图与该图谱比较，相似度分别为1.000、0.999、0.998、0.999、0.999、0.999，表明天佛参口服液供试品溶液在室温25h内样品稳定性良好。
表5样品稳定性试验结果(保留时间)
峰号 tR-0h tR-5h tR-10h tR-15h tR-20h tR-25h 平均值 RSD(％)
1 9.0 9.0 9.0 8.9 8.9 8.9 9.0 0.62
2 10.7 10.6 10.6 10.6 10.6 10.5 10.6 0.41
3 13.6 13.5 13.6 13.5 13.5 13.5 13.5 0.32
4 17.3 17.2 17.2 17.2 17.2 17.1 17.2 0.25
5 17.9 17.9 17.9 17.8 17.8 17.8 17.8 0.30
6 18.5 18.4 18.4 18.4 18.4 18.4 18.4 0.26
7 24.4 24.3 24.4 24.3 24.3 24.2 24.3 0.20
8 29.2 29.0 29.1 29.0 29.0 28.9 29.1 0.37
9 31.9 31.7 31.9 31.7 31.7 31.6 31.8 0.38
10 33.6 33.3 33.5 33.4 33.4 33.2 33.4 0.33
11 42.7 42.3 42.6 42.5 42.5 42.3 42.5 0.37
12 48.4 48.1 48.4 48.2 48.2 48.0 48.2 0.30
13 50.8 50.5 50.7 50.6 50.5 50.4 50.6 0.29
14 54.2 53.9 54.1 54.0 54.0 53.8 54.0 0.25
15 66.0 65.7 65.8 65.7 65.7 65.6 65.7 0.21
16 67.4 67.2 67.3 67.2 67.3 67.1 67.3 0.16
峰号 tR-0h tR-5h tR-10h tR-15h tR-20h tR-25h 平均值 RSD(％)
17 68.6 68.4 68.5 68.4 68.4 68.3 68.4 0.158 -->
18 69.5 69.3 69.3 69.2 69.3 69.2 69.3 0.14
19 71.1 70.9 71.0 70.9 70.9 70.9 71.0 0.14
20 72.5 72.3 72.4 72.3 72.4 72.3 72.4 0.13
21 74.1 73.9 73.9 73.8 73.9 73.8 73.9 0.14
22 76.0 75.7 75.8 75.7 75.7 75.6 75.8 0.17
23 86.0 85.8 85.9 85.7 85.7 85.6 85.8 0.16
24 86.8 86.6 86.6 86.5 86.5 86.4 86.6 0.13
25 95.5 95.3 95.3 95.2 95.2 95.0 95.2 0.15
26 111.7 111.5 111.5 111.4 111.4 111.5 111.5 0.08
27 113.5 113.3 113.3 113.2 113.2 113.3 113.3 0.08
28 116.4 116.3 116.3 116.2 116.2 116.3 116.3 0.07
表6样品稳定性试验结果(峰面积)
峰号 A-0h A-5h A-10h A-15h A-20h A-25h 平均值 RSD(％)
3 2135 2147 2023 2091 2115 2153 2110.6 2.30
5 1352 1373 1380 1354 1366 1333 1359.6 1.26
6 1994 2040 2073 2062 2104 2050 2054.0 1.78
8 1611 1580 1572 1570 1573 1511 1569.5 2.06
10 4017 4051 4069 4072 4065 4006 4046.6 0.70
15 1462 1475 1483 1466 1430 1442 1459.7 1.38
作为另一优选方案，上述的抗肿瘤中药组合物的指纹图谱检测方法，步骤(1)中供试品溶液制备方法为：精密吸取本中药组合物5.0ml上样于经预处理的C18固相萃取柱中(YMCC18填料1g，加5ml甲醇活化，再加纯水5ml平衡)，加纯水洗脱，弃去洗脱液，再加体积浓度20％甲醇溶液洗脱，弃去洗脱液，加甲醇洗脱，洗脱液收集于量瓶中，10000rpm离心10～15min，取上清液即得；
步骤(2)中，所述的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.05％甲酸的乙腈为流动相A，以体积浓度为0.05﹪甲酸溶液为流动相B，并按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30～35℃；流速为每分钟0.8～10ml；检测波长：203～210nm：
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
0～47.0 17→34 83→66
47.0～63.0 34→60 66→40
63.0～80.0 60→90 40→10
80.0～90.0 90 10
90.0～91.0 90→17 10→83
91.0～101.0 17 83
作为更加优选方案，以上所述的抗肿瘤中药组合物的指纹图谱检测方法，步骤(1)中供试品溶液制备方法为：精密吸取本中药组合物5.0ml上样于经预处理的C18固相萃取柱中(YMCC18填料1g，加5ml甲醇活化，再加纯水5ml平衡)，加纯水洗脱，弃去洗脱液，再加体积浓度20％甲醇溶液洗脱，弃去洗脱液，加甲醇洗脱，洗脱液收集于量瓶中，10000rpm离心10min，取上清液即得；
步骤(2)中，所述的色谱条件为：色谱柱AgilentZorbaxSB-C18，规格为250mm×4.6mmi.d.，5μm；以含0.05％甲酸的乙腈为流动相A，以体积浓度为0.05﹪甲酸溶液为流动相B，并按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.8ml；检测波长：203nm：
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
0～47.0 17→34 83→66
47.0～63.0 34→60 66→40
63.0～80.0 60→90 40→10
80.0～90.0 90 10
90.0～91.0 90→17 10→83
91.0～101.0 17 83
以上指纹图谱检测方法的色谱条件优化实验
色谱柱选择
本发明分别考察了TigerkinC18柱(250mm×4.6mmi.d.，5μm)、WatersAtiantisT3(250mm×4.6mmi.d.，5μm)和AgilentZorbaxSB-C18(250mm×4.6mmi.d.，5μm)色谱柱对中药组合物的分离效果。结果表明，AgilentZorbaxSB-C18柱对化合物分离较好，故选择AgilentZorbaxSB-C18柱为中药组合物指纹图谱分析用色谱柱。
检测波长选择
中药组合物中处方药材西洋参、天冬、土贝母中主要成分多为只有末端吸收的皂苷类成分，故选择203nm作为指纹图谱的检测波长。
流动相体系选择
本发明分别考察了乙腈-水、0.05﹪甲酸乙腈-0.05﹪甲酸溶液、0.1﹪甲酸乙腈-0.1﹪甲酸、0.05﹪甲酸乙腈-0.05﹪磷酸酸溶液、0.1﹪甲酸乙腈-0.1﹪磷酸溶液对分离的影响，结果表明甲酸添加剂对分离影响不大，考虑到后续进行质谱定性鉴定的需要，选择0.05﹪甲酸乙腈-0.05﹪甲酸溶液(V/V)为中药组合物指纹图谱色谱分离用流动相体系。
柱温选择
本发明分别考察了25℃、30℃和35℃柱温条件下对分离的影响，结果：柱温在30℃时，各成分分离度较好。色谱分析柱温选择30℃。
流速的选择
本发明考察了0.7ml/min、0.8ml/min和0.9ml/min的流速对分离的影响，结果：以0.8ml/min的流速分离效果较佳。
流动相梯度选择
本发明采用AgilentZorbaxSB-C18(250mm×4.6mmi.d.，5μm)色谱柱；以0.05％甲酸-乙腈(V/V)为流动相A，以0.05﹪甲酸溶液(V/V)为流动相B，柱温为30℃；流速为每分钟0.8ml；检测波长：203nm，进样量：20μL。考察了不同梯度洗脱条件对分离的影响，结果以表3-1流动相梯度为佳，故选定该梯度为中药组合物指纹图谱分析的色谱条件。
通过以上各色谱条件筛选，本发明提供的指纹图谱检测方法的另一种最优色谱条件为：色谱柱AgilentZorbaxSB-C18(250mm×4.6mmi.d.，5μm)；以含0.05％甲酸的乙腈为流动相A，以体积浓度为0.05﹪甲酸溶液为流动相B，并按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.8ml；检测波长：203nm：
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
0～47.0 17→34 83→66
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
47.0～63.0 34→60 66→40
63.0～80.0 60→90 40→10
80.0～90.0 90 10
90.0～91.0 90→17 10→83
91.0～101.0 17 83
以上中药组合物指纹图谱方法学验证
仪器精密度试验
取同一天中药组合物供试品溶液，按上述筛选最佳的色谱条件连续进样6次，结果见表7、表8。结果各峰保留时间RSD小于0.5％，单峰面积大于总峰面积5％的峰峰面积RSD均小于0.7％。以第一次分析所得指纹图谱为对照，其他5次分析所得色谱图与对照图谱比较，相似度为：1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000，仪器精密度良好。
表7仪器精密度试验结果(保留时间)
峰号 tR-1 tR-2 tR-3 tR-4 tR-5 tR-6 平均值 RSD(％)
1 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 0.22
2 6.4 6.4 6.4 6.4 6.4 6.4 6.4 0.31
3 7.2 7.3 7.3 7.2 7.3 7.2 7.2 0.41
4 9.4 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5 0.19
5 11.6 11.7 11.7 11.7 11.7 11.7 11.7 0.28
6 12.7 12.7 12.7 12.7 12.7 12.7 12.7 0.24
7 13.5 13.6 13.6 13.6 13.6 13.6 13.6 0.22
8 16.0 16.1 16.1 16.1 16.1 16.1 16.1 0.28
9 18.6 18.7 18.7 18.6 18.7 18.7 18.7 0.26
10 24.8 24.9 24.9 24.9 24.9 24.9 24.9 0.22
11 26.0 26.2 26.2 26.1 26.1 26.1 26.1 0.18
12 32.9 33.1 33.0 33.0 33.0 33.0 33.0 0.16
13 35.8 36.0 36.0 35.9 35.9 36.0 35.9 0.17
14 40.9 41.1 41.0 40.9 41.0 41.0 41.0 0.22
峰号 tR-1 tR-2 tR-3 tR-4 tR-5 tR-6 平均值 RSD(％)
15 47.3 47.5 47.3 47.4 47.4 47.4 47.4 0.13
16 47.9 48.1 48.0 48.0 48.0 48.0 48.0 0.13
17 52.2 52.3 52.3 52.2 52.3 52.3 52.3 0.10
18 54.4 54.5 54.4 54.5 54.5 54.5 54.5 0.08
19 65.9 66.0 65.9 65.9 65.9 65.9 65.9 0.05
20 83.6 83.6 83.6 83.6 83.7 83.6 83.6 0.02
21 87.3 87.3 87.3 87.3 87.4 87.3 87.3 0.04
表8仪器精密度试验结果(峰面积)
峰号 A-1 A-2 A-3 A-4 A-5 A-6 平均值 RSD(％)
2 3690 3685 3701 3726 3702 3684 3698.0 0.43
5 9164 9183 9248 9185 9208 9187 9195.7 0.32
11 3733 3703 3699 3684 3704 3708 3705.2 0.43
13 3700 3715 3739 3705 3671 3718 3707.9 0.61
17 14087 14050 14124 14096 13952 13926 14039.3 0.58
21 3755 3727 3715 3743 3718 3721 3729.7 0.42
方法重复性试验
取同一批次(批号为1305111)中药组合物6份，分别按上述筛选得到的最优色谱条件进样分析，结果见表9和表10。结果各峰保留时间RSD小于0.5％，单峰面积大于总峰面积5％的峰峰面积RSD小于1.5％。以其中一色谱图为对照图谱，其他色谱图与该图谱比较，相
似度分别为1.000、1.000、1.000、0.999、0.999、0.999，表明该方法具良好重复性。
表9重复性试验结果(保留时间)
峰号 tR-1 tR-2 tR-3 tR-4 tR-5 tR-6 平均值 RSD(％)
1 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 0.30
2 6.4 6.4 6.4 6.4 6.4 6.4 6.4 0.35
3 7.2 7.3 7.2 7.3 7.2 7.2 7.2 0.40
4 9.4 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5 0.18
5 11.6 11.7 11.6 11.6 11.6 11.6 11.6 0.27
6 12.7 12.7 12.7 12.7 12.7 12.7 12.7 0.24
7 13.5 13.6 13.6 13.6 13.5 13.6 13.6 0.22
峰号 tR-1 tR-2 tR-3 tR-4 tR-5 tR-6 平均值 RSD(％)
8 16.0 16.1 16.1 16.0 16.0 16.0 16.1 0.29
9 18.6 18.7 18.6 18.6 18.6 18.6 18.6 0.29
10 24.8 24.9 24.8 24.8 24.8 24.7 24.8 0.29
11 26.0 26.2 26.1 26.1 26.0 26.1 26.1 0.2112 -->
12 32.9 33.1 33.0 32.9 32.9 32.9 33.0 0.18
13 35.8 36.0 35.9 35.9 35.9 35.9 35.9 0.16
14 40.9 41.0 40.9 40.9 40.8 40.8 40.9 0.20
15 47.3 47.4 47.3 47.3 47.2 47.1 47.2 0.18
16 47.9 48.0 47.9 47.9 47.8 47.8 47.9 0.16
17 52.2 52.3 52.2 52.2 52.2 52.3 52.2 0.09
18 54.4 54.4 54.4 54.4 54.4 54.3 54.4 0.08
19 65.9 65.9 65.9 65.9 65.9 65.9 65.9 0.03
20 83.6 83.6 83.6 83.6 83.7 83.7 83.6 0.05
21 87.3 87.2 87.2 87.2 87.4 87.4 87.3 0.11
表10重复性试验结果(峰面积)
峰号 A-1 A-2 A-3 A-4 A-5 A-6 平均值 RSD(％)
2 3690 3694 3636 3744 3703 3710 3696.1 0.95
5 9164 9198 9077 9140 9168 9200 9157.8 0.50
11 3733 3650 3615 3648 3686 3644 3662.9 1.13
13 3700 3639 3647 3645 3650 3639 3653.4 0.64
17 14087 13920 13661 13929 14015 14049 13943.4 1.10
21 3755 3740 3679 3808 3764 3830 3762.4 1.41
样品稳定性试验
取中药组合物供试品溶液，按上述优选的色谱条件分别在室温放置0、4、8、12、18、24h后进样分析，结果见表11、表12。结果各峰保留时间RSD小于0.7％，单峰面积大于总峰面积5％的峰峰面积RSD小于1.6％。以0h分析所得图谱为对照，其他时间分析所得色谱图与该图谱比较，相似度分别为1.000、1.000、1.000、1.000、0.999、0.998，表明中药组合物供试品溶液在室温24h内样品稳定性良好。
表11样品稳定性试验结果(保留时间)
峰号 tR-0h tR-4h tR-8h tR-12h tR-18h tR-24h 平均值 RSD(％)
1 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 0.38
2 6.4 6.4 6.4 6.4 6.4 6.4 6.4 0.43
3 7.2 7.3 7.3 7.3 7.3 7.2 7.2 0.61
4 9.4 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5 0.23
5 11.6 11.7 11.7 11.7 11.7 11.6 11.7 0.40
6 12.7 12.7 12.7 12.7 12.7 12.6 12.7 0.34
7 13.5 13.6 13.6 13.6 13.6 13.5 13.6 0.29
8 16.0 16.1 16.1 16.1 16.1 16.0 16.1 0.37
9 18.6 18.7 18.7 18.7 18.6 18.6 18.6 0.34
10 24.8 24.9 24.9 24.9 24.8 24.7 24.8 0.33
11 26.0 26.2 26.1 26.2 26.1 26.0 26.1 0.2313 -->
12 32.9 33.0 33.0 33.1 33.0 32.9 33.0 0.18
13 35.8 36.0 35.9 36.0 35.9 35.9 35.9 0.14
14 40.9 41.0 41.0 41.0 40.9 40.9 40.9 0.15
15 47.3 47.3 47.4 47.4 47.3 47.3 47.3 0.12
16 47.9 48.0 48.0 48.0 47.9 47.9 48.0 0.11
17 52.2 52.3 52.3 52.3 52.2 52.3 52.3 0.11
18 54.4 54.4 54.5 54.5 54.4 54.4 54.4 0.05
19 65.9 65.9 65.9 65.9 65.9 65.9 65.9 0.03
20 83.6 83.6 83.7 83.6 83.6 83.7 83.6 0.02
21 87.3 87.3 87.4 87.2 87.3 87.3 87.3 0.05
表12样品稳定性试验结果(峰面积)
峰号 A-0h A-4h A-8h A-12h A-18h A-24h 平均值 RSD(％)
2 3690 3701 3702 3712 3706 3740 3708.3 0.46
5 9164 9248 9208 9232 9243 9190 9214.0 0.36
11 3733 3699 3704 3666 3654 3571 3671.2 1.54
13 3700 3739 3684 3748 3678 3708 3709.6 0.77
17 14087 14124 14080 14050 14424 14090 14142.5 0.99
21 3755 3715 3711 3760 3796 3755 3748.6 0.84
本发明将供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算机相似度评价软件(选用中国药典委推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件2004A版”)计算，获得指纹图谱相似度数值，依据相似度数值，应用于抗肿瘤中药组合物(天佛参口服液)的质量控制，以指纹图谱相似度应大于0.90为检验质控标准。本发明提供的抗肿瘤中药组合物(天佛参口服液)的指纹图谱检测方法用于生产检验质量控制，所得产品具有较高的质量稳定性，可确保产品安全有效。
本发明提供的抗肿瘤中药组合物(天佛参口服液)指纹图谱检测方法的最佳条件筛选过程：
由于本发明抗肿瘤中药组合物(天佛参口服液)含有8味药材构成，提取物中含有强极性，中等极性等活性成分，现有技术的色谱分离条件还不能全面反映其内在质量，本发明通过大量实验筛选能客观反映和评价该中药组合物的指纹图谱检测方法，优选得到最佳的色谱条件，包括最佳流动相的组成和最佳的梯度洗脱程序，检测波长，流速，色谱柱和柱温等。采用本发明优选得到的色谱条件，可以对中药组合物中极性差异较大的各成分在色谱柱上实现很好的分离，且保留时间适宜，达到指纹图谱信息最大化原则，且重现性和稳定性优，可以建立稳定的指纹图谱。在二个优选的色谱条件下，制定得到指纹图谱Ⅰ和指纹图谱Ⅱ二种指纹图谱方法，其中指纹图谱Ⅰ可全面主要反映抗肿瘤中药组合物中倒卵叶五加、猕猴桃根、沙棘果药材中的化学信息，指纹图谱Ⅱ可全面反映抗肿瘤中药组合物中西洋参、蟾酥、天门冬、土贝母、佛手药材中的化学信息。
本发明对制定得到的指纹图谱进行了精密度与稳定性考察
取同一抗肿瘤中药组合物供试品溶液，在24小时内进样6次，以第一次分析所得指纹图谱为对照，其余5次分析所得指纹图谱的相似度计算结果分别为：1.000、1.000、0.999、1.000、1.000、0.999，采用以上优选的色谱条件分析，制备得到的指纹图谱的精密度与稳定性优。
重现性考察
取同一批抗肿瘤中药组合物，采用优选的色谱条件分析，以其中一次分析所得指纹图谱为对照，则其它5次分析所得指纹图谱与其相似度分别为：0.995，0.996，0.998，0.997，0.995；表明采用本发明优选得到的色谱条件的指纹图谱分析方法，具有良好的重现性。
有益效果：本发明提供的中药抗肿瘤中药组合物的质量检测方法具有以下优点：
1、本发明针对现有技术检测方法的诸多不足，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的检测方法，可建立良好的指纹图谱。采用本发明提供的中药抗肿瘤中药组合物指纹图谱检测方法，可以同时检测中药抗肿瘤中药组合物中极性差异较大的多种活性成分，从而可以全面、客观、准确的检测和评价抗肿瘤中药组合物的质量，为保证临床疗效具有重要意义。
2、本发明通过优选色谱条件，提供抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，包括佛手、西洋参的薄层鉴别方法和西洋参及其蟾酥含量含量测定方法，能够更加准确测定和评价各中药组合物的质量，为抗肿瘤中药组合物制剂制定出安全，有效，可控的质量标准检测方法，具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明抗肿瘤中药组合物的对照指纹图谱I。
图2为本发明抗肿瘤中药组合物的对照指纹图谱Ⅱ。
图3为10个批次抗肿瘤中药组合物的对照指纹图谱I。
图4为10个批次抗肿瘤中药组合物的对照指纹图谱Ⅱ。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
一种抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述的中药组合物由西洋参50份、蟾酥0.25份、天冬167份、土贝母200份、倒卵叶五加599份、猕猴桃根1000份、沙棘果333份、佛手167份制成口服液制剂，其特征在于，所述检测方法包括佛手和西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
佛手的薄层鉴定，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取中药组合物20ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15ml，合并醋酸乙酯提取液，水浴上浓缩至约2ml，即得；
(2)制备对照品溶液：取佛手对照药材粉末1g，加体积浓度80％乙醇20ml，水浴上回流提取1小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，残留物加醋酸乙酯溶解，取上清液，即得；
(3)测定：吸取步骤(1)供试品溶液和步骤(2)对照品溶液各2～5μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取中药组合物20ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15ml，合并醋酸乙酯提取液，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
(2)制备对照品溶液：取西洋参对照药材1g，加体积浓度70％乙醇30ml，水浴上回液提取1小时，滤过，滤液蒸干，残留物加水溶解，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
(3)测定：吸取上述两种溶液各1～3μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，喷以5％硫酸溶液显色，自然光下检视，供试品溶液与西洋参对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
以上所述检测方法还包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中西洋参的含量，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取人参皂甙Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液作为对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密量取中药组合物10ml，置分液漏斗中，用乙醚提取4次，每次15l，分取水层用水饱和的正丁醇提取3，每次20ml，合并正丁醇液，置水浴上蒸干；加水溶解并置已处理好填有D101大孔吸附树脂柱内，用水洗脱，流速1ml/min，弃去水洗液，用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解并定量转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即得；
(3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定；其中所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为70∶30甲醇-磷酸二氢钠溶液为流动相，其中磷酸二氢钠浓度为0.03mol/L，并用磷酸调节pH值为4.5，检测波长为207nm。所述中药组合物中含西洋参以人参皂甙Rb1计，不得少于35mg/100ml。
以上所述检测方法还包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中蟾酥的含量，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷减压干燥24小时的华蟾酥毒基对照品、酯蟾毒配基对照品适量，加甲醇配制成每1ml含华蟾酥毒基10μg和酯蟾毒配基50μg的混合溶液，作为对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密量取中药组合物制成的口服制剂25ml，置分液漏斗中，加水25ml，混匀，依次加30ml，30ml，30ml，20ml，20ml的三氯甲烷提取5次，合并三氯甲烷提取液，用氢氧化钠溶液洗涤，弃去氢氧化钠液，再用水洗涤，弃去水液，取三氯甲烷液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解并转移至10ml容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)测定：分别精密吸取步骤(1)对照品溶液与步骤(2)供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定；其中所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为38:62的乙腈和0.5％磷酸二氢钾为流动相，并用磷酸调pH2.5，检测波长为296nm，柱温40℃。所述中药组合物中含蟾酥按华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的总量计，应为0.50mg～2.50mg/100ml。
以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，还包括中药组合物指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取中药组合物，经适当方法处理后制成供试品溶液；
(2)高效液相色谱法测定对照指纹图谱：取10批以上中药组合物供试品在适当的色谱条件下进样，测得各批次供试品的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为本品的对照指纹图谱，如图1所示；
(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)供试品溶液按步骤(2)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱如图3所示；
(4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价。
步骤(1)中供试品溶液制备方法为：用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液；或10000rpm离心10min，取上清液即得；
步骤(2)中，所述的色谱条件为：色谱柱：WatersAtiantisT3，250mm×4.6mmi.d.，5μm，配phenomenex在线过滤柱；以甲醇为流动相A，以体积浓度为0.05﹪甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；流速为每分钟0.8ml；检测波长：270nm；
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
0～12.0 0→7 100→93
12.0～30.0 7 93
30.0～60.0 7→19 93→81
60.0～100.0 19→37 81→63
100.0～120.0 37→57 63→43
120.0～121.0 57→100 43→0
121.0～130.0 100 0
130.0～131.0 100→0 0→100
131.0～141.0 0 100
以上指纹图谱I相似度评价实验：
取16个批次中药复方口服液样品，上述步骤方法制备得到供试品溶液，按步骤e色谱条件分析，获取16批次中药复方口服液HPLC指纹图谱，结果见图3，以该16个批次天佛参口服液平均指纹图谱为对照指纹图谱，分别计算各批次天佛参口服液指纹图谱与对照指纹图谱比较的相似度，结果见表13，各批次天佛参口服液指纹图谱I相似度均大于0.90。
表13天佛参口服液指纹图谱相似度评价结果
批号 相似度 批号 相似度
1402211 0.957 1409201 0.901
1409111 0.947 1404021 0.934
1406271 0.967 1405311 0.913
1406261 0.961 1405251 0.915
1406241 0.962 1405161 0.919
1402051 0.933 1405241 0.931
1412211 0.926 1405111 0.910
1411031 0.908 1405051 0.901
以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，还包括另一种指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取中药组合物，经适当方法处理后制成供试品溶液；
(2)高效液相色谱法测定对照指纹图谱：取10批以上中药组合物供试品在适当的色谱条件下进样，测得各批次供试品的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为本品的对照指纹图谱，如图3所示；
(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)供试品溶液按步骤(2)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱，如图4所示；
(4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价。
步骤(1)中供试品溶液制备方法为：精密吸取本中药组合物5.0ml上样于经预处理的C18固相萃取柱中，加纯水洗脱，弃去洗脱液，再加体积浓度20％甲醇溶液洗脱，弃去洗脱液，加甲醇洗脱，洗脱液收集于量瓶中，10000rpm离心10min，取上清液即得；
步骤(2)中，所述的色谱条件为：色谱柱AgilentZorbaxSB-C18，规格为250mm×4.6mmi.d.，5μm，配江苏汉邦C18预柱；以含0.05％甲酸的乙腈为流动相A，以体积浓度为0.05﹪甲酸溶液为流动相B，并按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.8ml；检测波长：203nm；
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
0～47.0 17→34 83→66
47.0～63.0 34→60 66→40
63.0～80.0 60→90 40→10
80.0～90.0 90 10
90.0～91.0 90→17 10→83
91.0～101.0 17 83
中药组合物指纹图谱相似度评价实验：
取11个批次天佛参口服液样品，按上述供试品溶液制备方法制成供试品溶液，并按上述色谱条件分析，获取11批次中药组合物口服液HPLC指纹图谱，结果见图4所示，以该11个批次中药组合物口服液平均指纹图谱为对照指纹图谱，分别计算各批次中药组合物口服液指纹图谱与对照指纹图谱比较的相似度，结果见表14所示，结果表明，各批次中药组合物口服液指纹图谱Ⅱ相似度均大于0.92。
表14天佛参口服液指纹图谱Ⅱ相似度评价结果
批号 相似度 批号 相似度
1005111 0.941 1211031 0.980
1105161 0.970 1302051 0.942
1105241 0.980 1305051 0.944
1105251 0.982 1209201 0.927
1105311 0.965 1212211 0.930
1204021 0.969
实施例2
1、一种抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，按重量份数计，所述的中药组合物由西洋参40份、蟾酥0.22份、天冬160份、土贝母190份、倒卵叶五加560份、猕猴桃根900份、沙棘果320份、佛手190份制成口服液制剂，其特征在于，所述检测方法包括佛手和西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
佛手的薄层鉴定，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取中药组合物60ml，加醋酸乙酯提取三次，每次45ml，合并醋酸乙酯提取液，水浴上浓缩至约4ml，即得；
(2)制备对照品溶液：取佛手对照药材粉末5g，加体积浓度80％乙醇60ml，水浴上回流提取3小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，残留物加醋酸乙酯溶解，取上清液，即得；
(3)测定：吸取步骤(1)供试品溶液和步骤(2)对照品溶液各5μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取中药组合物60ml，加醋酸乙酯提取三次，每次45ml，合并醋酸乙酯提取液，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次15ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
(2)制备对照品溶液：取西洋参对照药材2g，加体积浓度70％乙醇60ml，水浴上回液提取2小时，滤过，滤液蒸干，残留物加水溶解，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取5次，每次10ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
(3)测定：吸取上述两种溶液各3μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，喷以5％硫酸溶液显色，自然光下检视，供试品溶液与西洋参对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述检测方法还包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中西洋参的含量，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取人参皂甙Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液作为对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密量取中药组合物30ml，置分液漏斗中，用乙醚提取4次，每次45ml，分取水层用水饱和的正丁醇提取5次，每次30ml，合并正丁醇液，置水浴上蒸干；加水溶解并置已处理好填有D101大孔吸附树脂柱内，用水洗脱，流速1ml/min，弃去水洗液，用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解并定量转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即得；
(3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定；其中所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为70∶30甲醇-磷酸二氢钠溶液为流动相，其中磷酸二氢钠浓度为0.03mol/L，并用磷酸调节pH值为4.5，检测波长为207nm。所述中药组合物中含西洋参以人参皂甙Rb1计，不得少于35mg/100ml。
以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，还包括采用高效液相色谱法检测中药组合物中蟾酥的含量，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷减压干燥24小时的华蟾酥毒基对照品、酯蟾毒配基对照品适量，加甲醇配制成每1ml含华蟾酥毒基10μg和酯蟾毒配基50μg的混合溶液，作为对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密量取中药组合物制成的口服制剂25ml，置分液漏斗中，加水25～50ml，混匀，依次加30ml，30ml，30ml，20ml，20ml的三氯甲烷提取5次，合并三氯甲烷提取液，用氢氧化钠溶液洗涤，弃去氢氧化钠液，再用水洗涤，弃去水液，取三氯甲烷液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解并转移至10ml容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)测定：分别精密吸取步骤(1)对照品溶液与步骤(2)供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定；其中所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为38:62的乙腈和0.5％磷酸二氢钾为流动相，并用磷酸调pH2.5，检测波长为296nm，柱温40℃。所述中药组合物中含蟾酥按华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的总量计，应为0.50mg～2.50mg/100ml。
以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述检测方法还包括中药组合物指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取中药组合物，经适当方法处理后制成供试品溶液；
(2)高效液相色谱法测定对照指纹图谱：取10批以上中药组合物供试品在适当的色谱条件下进样，测得各批次供试品的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为本品的对照指纹图谱；
(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)供试品溶液按步骤(2)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；
(4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价。
步骤(1)中供试品溶液制备方法为：用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液；或10000rpm离心10min，取上清液即得；
步骤(2)中，所述的色谱条件为：色谱柱：WatersAtiantisT3，250mm×4.6mmi.d.，5μm，配phenomenex在线过滤柱；以甲醇为流动相A，以体积浓度为0.1﹪甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长：280nm；
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
0～12.0 0→7 100→93
12.0～30.0 7 93
30.0～60.0 7→19 93→81
60.0～100.0 19→37 81→63
100.0～120.0 37→57 63→43
120.0～121.0 57→100 43→0
121.0～130.0 100 0
130.0～131.0 100→0 0→100
131.0～141.0 0 100
以上所述的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，所述检测方法还包括另一种指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取中药组合物，经适当方法处理后制成供试品溶液；
(2)高效液相色谱法测定对照指纹图谱：取10批以上中药组合物供试品在适当的色谱条件下进样，测得各批次供试品的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为本品的对照指纹图谱；
(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)供试品溶液按步骤(2)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；
(4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价。
步骤(1)中供试品溶液制备方法为：精密吸取本中药组合物5.0ml上样于经预处理的C18固相萃取柱中，加纯水洗脱，弃去洗脱液，再加体积浓度20％甲醇溶液洗脱，弃去洗脱液，加甲醇洗脱，洗脱液收集于量瓶中，10000rpm离心15min，取上清液即得；
步骤(2)中，所述的色谱条件为：色谱柱AgilentZorbaxSB-C18，规格为250mm×4.6mmi.d.，5μm，配江苏汉邦C18预柱；以含0.1％甲酸的乙腈为流动相A，以体积浓度为0.05﹪甲酸溶液为流动相B，并按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长：210nm；
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
0～47.0 17→34 83→66
时间(分钟) 流动相A(﹪) 流动相B(﹪)
47.0～63.0 34→60 66→40
63.0～80.0 60→90 40→1021 -->
80.0～90.0 90 10
90.0～91.0 90→17 10→83
91.0～101.0 17 83
通过以上实验结果表明，本发明提供的抗肿瘤中药组合物的质量检测方法，不仅可以鉴别组合物中佛手，西洋参，并且还能多西洋参和蟾酥进行含量测定，同时本发明还通过大量实验优选出中药组合物的二种指纹图谱检测方法。本发明提供的质量检测方法，可以客观，全面，有针对性的分析和评价抗肿瘤中药组合物的质量，对保证临床疗效具有重要意义。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种抗肿瘤中药组合物的检测方法，按重量份数计，所述的中药组合物由西洋参40～60份、蟾酥0.22～0.30份、天冬160～180份、土贝母190～210份、倒卵叶五加560～620份、猕猴桃根900～1100份、沙棘果320～340份、佛手190～210份制成口服液制剂，其特征在于，所述检测方法包括佛手和西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
佛手的薄层鉴定，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取中药组合物20～60ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15～45ml，合并醋酸乙酯提取液，水浴上浓缩至2～4ml，即得；
(2)制备对照品溶液：取佛手对照药材粉末1～5g，加体积浓度60％～80％乙醇20～60ml，水浴上回流提取1～3小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，残留物加醋酸乙酯溶解，取上清液，即得；
(3)测定：吸取步骤(1)供试品溶液和步骤(2)对照品溶液各2～5μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取中药组合物20～60ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15～45ml，合并醋酸乙酯提取液，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每次10～15ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10～15ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
(2)制备对照品溶液：取西洋参对照药材1～2g，加体积浓度70％乙醇30～60ml，水浴上回液提取1～2小时，滤过，滤液蒸干，残留物加水溶解，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3～5次，每次10ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
(3)测定：吸取供试品溶液和对照品溶液各1～3μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，喷以5％硫酸溶液显色，自然光下检视，供试品溶液与西洋参对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
所述检测方法还包括中药组合物指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取中药组合物，经适当方法处理后制成供试品溶液；
(2)高效液相色谱法测定对照指纹图谱：取10批以上中药组合物供试品在适当的色谱条件下进样，测得各批次供试品的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为本品的对照指纹图谱；
(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)供试品溶液按步骤(2)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；
(4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价；
步骤(1)中供试品溶液制备方法为：用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液；或10000rpm离心10min，取上清液即得；
步骤(2)中，所述的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以体积浓度为0.05～0.1﹪甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为35～40℃；流速为每分钟0.8～1.0ml；检测波长：270～280nm；
时间/分钟 流动相A﹪ 流动相B﹪ 0～12.0 0→7 100→93 12.0～30.0 7 93 30.0～60.0 7→19 93→81 60.0～100.0 19→37 81→63 100.0～120.0 37→57 63→43 120.0～121.0 57→100 43→0 121.0～130.0 100 0 130.0～131.0 100→0 0→100 131.0～141.0 0 100
；
或者步骤(1)中供试品溶液制备方法为：精密吸取本中药组合物5.0ml上样于经预处理的C18固相萃取柱中，加纯水洗脱，弃去洗脱液，再加体积浓度20％甲醇溶液洗脱，弃去洗脱液，加甲醇洗脱，洗脱液收集于量瓶中，10000rpm离心10～15min，取上清液即得；
步骤(2)中，所述的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.05～0.1％甲酸的乙腈为流动相A，以体积浓度为0.05﹪甲酸溶液为流动相B，并按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30～40℃；流速为每分钟0.8～1.0ml；检测波长：203～210nm；
时间/分钟 流动相A﹪ 流动相B﹪ 0～47.0 17→34 83→66 47.0～63.0 34→60 66→40 63.0～80.0 60→90 40→10 80.0～90.0 90 10 90.0～91.0 90→17 10→83 91.0～101.0 17 83
。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤中药组合物的检测方法，其特征在于，
步骤(1)中供试品溶液制备方法为：用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液；或10000rpm离心10min，取上清液即得；
步骤(2)中，所述的色谱条件为：色谱柱：WatersAtiantisT3，250mm×4.6mmi.d.，5μm；以甲醇为流动相A，以体积浓度为0.05﹪甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；流速为每分钟0.8ml；检测波长：270nm；
时间/分钟 流动相A﹪ 流动相B﹪ 0～12.0 0→7 100→93 12.0～30.0 7 93 30.0～60.0 7→19 93→81 60.0～100.0 19→37 81→63 100.0～120.0 37→57 63→43 120.0～121.0 57→100 43→0 121.0～130.0 100 02 --> 130.0～131.0 100→0 0→100 131.0～141.0 0 100
；
或者步骤(1)中供试品溶液制备方法为：精密吸取本中药组合物5.0ml上样于经预处理的C18固相萃取柱中，加纯水洗脱，弃去洗脱液，再加体积浓度20％甲醇溶液洗脱，弃去洗脱液，加甲醇洗脱，洗脱液收集于量瓶中，10000rpm离心10min，取上清液即得；
步骤(2)中，所述的色谱条件为：色谱柱AgilentZorbaxSB-C18，规格为250mm×4.6mmi.d.，5μm；以含0.05％甲酸的乙腈为流动相A，以体积浓度为0.05﹪甲酸溶液为流动相B，并按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.8ml；检测波长：203nm；
时间/分钟 流动相A﹪ 流动相B﹪ 0～47.0 17→34 83→66 47.0～63.0 34→60 66→40 63.0～80.0 60→90 40→10 80.0～90.0 90 10 90.0～91.0 90→17 10→83 91.0～101.0 17 83
。
3.根据权利要求1或2所述的抗肿瘤中药组合物的检测方法，其特征在于，所述的中药组合物由西洋参50份、蟾酥0.25份、天冬167份、土贝母200份、倒卵叶五加599份、猕猴桃根1000份、沙棘果333份、佛手167份制成口服液制剂，所述检测方法包括佛手和西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
佛手的薄层鉴定，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取中药组合物20ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15ml，合并醋酸乙酯提取液，水浴上浓缩至2ml，即得；
(2)制备对照品溶液：取佛手对照药材粉末1g，加体积浓度80％乙醇20ml，水浴上回流提取1小时，滤过，滤液置水浴上蒸干，残留物加醋酸乙酯溶解，取上清液，即得；
(3)测定：吸取步骤(1)供试品溶液和步骤(2)对照品溶液各2～5μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
西洋参的薄层鉴定，包括以下步骤：
(1)制备供试品溶液：取中药组合物20ml，加醋酸乙酯提取三次，每次15ml，合并醋酸乙酯提取液，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
(2)制备对照品溶液：取西洋参对照药材1g，加体积浓度70％乙醇30ml，水浴上回液提取1小时，滤过，滤液蒸干，残留物加水溶解，加氢氧化钠试液，用水饱和正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，加水洗涤两次，每次10ml，弃去洗液，正丁醇液置水浴上减压蒸干，残留物加乙醇溶解，即得；
(3)测定：吸取供试品溶液和对照品溶液各1～3μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，展开，喷以5％硫酸溶液显色，自然光下检视，供试品溶液与西洋参对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
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