KR100472380B1

KR100472380B1 - 인삼 진세노사이드를 함유하는 카이네이트에 의한 해마씨추체신경세포의 사멸 또는 손상의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100472380B1
Application number: KR10-2001-0080347A
Authority: KR
Inventors: 나승열
Original assignee: 나승열
Priority date: 2001-12-18
Filing date: 2001-12-18
Publication date: 2005-03-08
Also published as: KR20030049984A

Abstract

본 발명은 인삼 진세노사이드를 함유하는 카이네이트에 의한 해마씨(hippocampus) 추체신경세포(pyramidal cells)의 사멸 또는 손상의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 카이네이트에 의한 해마씨(hippocampus)의 CA1과 CA3 부위에 존재하는 추체신경 세포 사멸을 억제하고, 카이네이트에 의한 신경세포 손상을 억제하므로 학습능력 감퇴, 인지능력 감퇴, 측두엽 간질, 경련성 질병 및 발작에 유용한 치료제로 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

인삼 진세노사이드를 함유하는 카이네이트에 의한 해마씨 추체신경세포의 사멸 또는 손상의 예방 및 치료용 조성물{Preventive and therapeutic composition against kainic acid-induced neurotoxicity in hippocampus containing ginsenosides}

본 발명은 진세노사이드를 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 카이네이트에 의한 해마씨(hippocampus) 추체 신경세포(pyramidal cells)의 사멸 또는 손상의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인삼 진세노사이드를 유효성분으로 함유하는 카이네이트에 의한 해마씨(hippocampus)의 CA1과 CA3 부위에 존재하는 추체신경세포의 사멸 또는 신경세포 손상을 예방 및 치료하는 조성물에 관한 것이다.

카이네이트는 흥분성 신경 전달 물질의 하나로서 non-NMDA 수용체의 일종인 카이네이트 또는 AMPA (.alpha.-amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazole-4-propionate) 수용체에 결합(카이네이트 수용체에 대한 친화도가 더 높음)하여 이온 채널을 열어 나트륨이나 칼슘과 같은 양이온을 유입시켜 신경세포막간의 분극현상을 유발시킴으로써 신경세포를 흥분시키는 것으로 알려져 있다.

상기 카이네이트(Kainate) 처리에 의한 흥분성 독성(excitotoxicity)은 뇌의 내인성으로 존재하는 글루타메이트(glutamate)나 다른 흥분성 신경전달물질들이 한번에 많이 방출되도록 자극함으로써 이루어지고, 이와 같이 과도하게 방출된 흥분성 신경전달물질이 신경조직 손상(neuronal injury)에 이은 신경병 발생(neuropathogenesis)과 연관이 있는 것으로 알려져 있다 (Choi et al, Ann. Rev. Neurosci. 13, 171-182, 1990).

특이적인 것은 카이네이트(kainate)을 투여하면 특징적으로 해마씨(hippocampus)의 CA1과 CA3 부위에 존재하는 추체신경세포(pyramidal neurons)을 선택적으로 죽여 변연계의 발작(limbic seizures) 또는 경련(convulsion)을 유발시키 것으로 알려져 있다. 이와 같이 카이네이트(kainate)에 의한 해마씨의 선택적 신경독성 때문에, 해마씨에 대한 카이네이트(kainate)의 신경독성을 막아주는 약물을 개발하는데 하나의 모델 시스템으로 널리 이용되고 있다 (Arias, et al, Neurochem. Res. 15, 641-646, 1990).

따라서 상기 카이네이트(kainate)는 시험용 동물에서 측두엽 간질(temporal lobe epilepsy)을 유도하는 약물로서 이용되어 왔다(Lassman et al, Neuroscience 13, 691-704, 1984; Ben-Ari, Neuroscience 14, 375-403, 1985). 또한 카이네이트(kainate)를 투여하게 되면(systemic treatment) 전반적인 경련(convulsion)이 유도되어, 중추신경 흥분 작용, 흥분성 신경 독성(excitotoxicity) 및 급성 신경세포의 사멸(acute neuronal cell death)과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다(Ben-Ari, Neuroscience 14, 375-403, 1985).

한편, 열충격 단백질(heat shock protein-70, HSP-70)의 유도(induction)는 뇌의 저산소증(hypoxia), 발작(seizures) 혹은 뇌의 외상이 가해질 때와 같이 뇌에 광범위한 손상이 가해질 때 신경세포가 이러한 insults에 반응하여 생성되는 것으로 알려져 있다. 이 단백질은 뇌 단백질의 변성(denaturation)에 대한 반응으로서 나타나고 이 변성된 단백질들이 HSP-70 생성을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Lowenstein, et al, J. of Neurosci. 12, 4846-4853, 1992; Sperk, Prog. Neurobiol. 42, 1-31, 1994; Vass, et al, Acta Neuropathol. 60, 81-91, 1983). 따라서 이 단백질의 발현은 신경세포 손상(neuronal injury)의 지표(sign)로서 이용되고 있다 (Vass, et al, Acta Neuropathol. 60, 81-91, 1983; Lee, et al, Neurosci. Lett. 286, 179-182, 2001).

한편, 인삼 진세노사이드는 실험실에서 배양된 신경세포에 여러 종류의 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Nah, Korean J. Ginseng Sci. 21, 1-12, 1997). 즉, 배양된 신경세포에 존재하는 칼슘 채널 혹은 소디움 채널을 억제하는 것으로 보고되고 있다 (Nah, et al, PNAS, 92, 8739-8743, 1995; Kim et al, Brain Res. Bull., 46, 245-251, 1998; Liu et al, Eur. J. Pharmacol. 413, 47-54, 2001). 인삼 진세노사이드는 시험관내 배양한 대뇌 신경세포에서 글루타메이트에 의하여 유도되는 신경세포 손상을 감소시키는 것으로 보고되고 있고, 또 진세노사이드는 배양한 성상글리아 세포(astrocytes)에서 글루타메이트 처리에 의한 종창(cell swelling)을 감소시키는 것으로 보고되고 있다 (Kim, et al, J. Neurosci. Res. 53, 426-432, 1998; Seong et al, Biol. Pharm. Bull. 18, 1776-1778, 1998).

상기한 바와 같이, 종래에 인삼 진세노사이드가 in vitro로 배양된 신경 세포에 존재하는 이온 채널이나 다른 약물들의 작용을 억제 혹은 감소시킨다는 보고들이 있지만, in vivo 연구를 통하여 특히 해마씨에 선택적으로 작용하여 해마씨에 존재하는 추체세포를 죽이는 것으로 알려진 카이네이트(kainate)의 신경독성 작용을 막아주는 약물에 대한 것은 보고된 바 없다.

본 발명자들은 카이네이트에 의해 유도되는 해마씨의 CA1과 CA3 부위에 존재하는 추체 신경세포를 사멸하거나 신경세포 손상의 지표중 하나인 HSP-70 생성이 유도되는 것을 인삼 진세노사이드가 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인삼으로부터 분리한 진세노사이드를 유효성분으로 하는 카이네이트(kainate)에 의한 해마씨(hippocampus) 추체 신경세포의 사멸 또는 손상 예방 및 치료용 조성물을 제공함에 있다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

본 발명에서 카이네이트에 의한 해마씨 신경세포 사멸 또는 손상 억제에 관련된 인삼으로부터 분리한 진세노사이드의 신규 용도를 제공한다.

본 발명에 의한 인삼 진세노사이드는 카이네이트에 의해 해마씨의 CA1과 CA3 부위에 존재하는 추체 신경세포가 사멸 또는 손상됨으로써 발생되는 학습능력 감퇴, 인지능력 감퇴, 측두엽 간질, 경련성 질병 및 발작에 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.

그리고 인삼은 오랫동안 생약 및 식용으로 쓰여왔던 약재로서 이들로부터 추출 분리된 본 발명의 화합물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없을 것임을 예상할 수 있다.

본 발명의 인삼 진세노사이드는 통상적인 방법에 의하여 정제, 캅셀제, 과립제, 현탁제, 유제와 같은 단위투여형 또는 수회투여형 제제로 제형화하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 분리 정제된 화합물들을 함유하는 조성물들은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 본 발명에 의한 진세노사이드는 체중 1kg당 50∼150 mg, 바람직하게는 50∼100 mg의 량을 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 특정환자에 대한 투여용량수준은 성별, 연령, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 그리고 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 다음과 같은 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이것들 만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 인삼 진세노사이드가 카이네이트에 의한 해마씨 신경세포 사멸에 미치는 영향

10∼12 주령의 수컷 스프라그 다울리(Sprague-Dawley) 백서(250-300g)(대한실험동물센터)를 본 실험에 이용하였다. 백서 다섯 마리를 한 그룹으로 하여 사양하였고, 12시간을 주기로 밤과 낮을 구분하여 자동으로 전등이 작동되도록 하였고 음식은 자유롭게 먹도록 하였다.

인삼 진세노사이드는 한국 인삼연초 연구원으로부터 분양 받았고, 이 성분중에는 진세노사이드Rb1이 18.26%, Rb2가 9.07 %, Rc가 9.65 %, Rd가 8.24 %, Re가 9.28 %, Rf가 3.48 %, Rg1이 6.42 %, Rg2가 3.62 %, Rg3가 4.7 %, Ro가 3.82 %, Ra가 2.91 %, 그리고 다른 소수의 진세노사이드가 20.55 % 포함되어 있다.

진세노사이드는 생리적 식염수에 녹여서 복강내로 체중 100g당 1 ml의 양을 0, 50, 100, 300 mg/kg되게 투여하였다. 진세노사이드는 7일 동안 매일 아침 10시에 투여하였고, 카이네이트(kainate) (Sigma, USA)는 마지막 진세노사이드 투여 후 2시간 뒤에 복강으로 10 mg/kg이 되게 투여하였다.

카이네이트(kainate) 투여 24시간 후에 백서들을 펜토발비탈 소디윰(pentobarbital sodium)으로 마취시킨 뒤 헤파린이 들어 있는 생리적 식염수를 이용하여 심장을 통하여 관류(perfusison)하였다. 식염수로 관류시킨 뒤 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)(in 0.1 M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer), pH 7.4)로 고정하였다. 뇌를 제거한 뒤 같은 고정액에서 16시간(4℃)동안 더 고정하였다. 카이네이트에 의해 유도되는 흥분성 독성(excitoxicity)에 대한 인삼 진세노사이드의 억제효과를 측정하기 위하여 브레그마(bregma) 뒤쪽으로 1.20∼1.23mm 수준에서 얻어진 6개의 연속적인 절편에서 해마씨의 CA1와 CA3에서 살아있는 신경세포는 이미지 어날라이저(image analyzer)로 측정하였다. 해마씨(hippocampus) 부위는 파라핀(parafin)에 함몰(embedded)시킨 다음 3 ㎛ 두께로 자른 뒤 액시드 푹신(acid fuchsin, AF) 염색법 (Auer et al, Acta Neuropathol. 64, 177-191, 1984)으로 염색을 하여 현미경(Leica)을 이용하여 100배 확대하여 사진을 찍어 도 1에 나타내었다. 액시드 푹신(acid fuchin) 염색법은 세포가 살아 있거나 죽어 있는가를 구별하는데 사용되는 염색법이다.

모든 데이터는 평균 ±SEM 으로 나타내었고, 통계분석은 다중비교를 위한 스튜던트-뉴맨-케울스 방법(Student-Newman-Keuks test)으로 하였다.

도 1의 CTL(control, 대조군)은 인삼 진세노사이드와 카이네이트를 처리하지 않았을 때 나타나는 백서 해마씨(hippocampus)의 CA1과 CA3 부위를 액시드 푹신(acid fuchsin) 염색 방법을 이용하여 염색한 후 찍은 사진이다. 도 1에 나타낸 바와 같이 이 부위의 신경세포들이 살아있으므로 둥그런 원형질의 형태의 세포들과 세포안에 핵(nucleus)이 잘 보이나, 흥분성 신경전달물질인 카이네이트(kainate) (V+KA)로 처리된 백서의 CA1과 CA3 부위의 세포들은 죽거나 죽어가는 과정에 있으므로 대부분의 세포들이 대조군에서 처럼 둥근 원형질의 모양을 띠지 못하고 과립의 형태로 있음을 알수 있다. 인삼 진세노사이드(GS+KA)를 전처리한 다음 카이네이트(kainate)를 처리할 경우 대조군 처럼 세포들이 완전하지는 않으나 카이네이트(kainate)를 단독으로 처리한 백서의 CA1 및 CA3에서 나타나는 세포들의 죽음을 막아 주는 것으로 나타났다.

대조구의 백서에게서는 발작이 관찰되지 않았으나, 카이네이트를 처리한 백서에게서 4∼5 시간 동안 발작이 지속되었으며, 인삼 진세노사이드로 전처리한 후 카이네이트를 처리한 군에서는 발작이 지속되는 시간이 단축됨을 관찰 할 수 있었다(데이타로 나타내지는 않음).

도 2는 백서 대조군, 카이네이트 처리군, 진세노사이드(50, 100, 300mg/kg)를 전처리한 다음 카이네이트(kainate)를 처리한 군들의 해마씨 CA1과 CA3 부위에서 액시드 푹신(acid fuchsin) (AF) 염색법을 이용하여 살아있는 세포들을 카운팅(counting)후 이를 히스토그램(histograms)으로 나타낸 것이다. CA1 부위(region)에서 인삼 진세노사이드를 전처리할 경우 50 과 100 mg/kg에서 유의성 (*p < 0.05, **p < 0.01) 있게 카이네이트(kainate) 단독으로 처리한 그룹에 비하여 신경세포의 사멸을 막아주는 것으로 나타났다. 그러나 300 mg/kg에서는 신경세포 보호 효과가 없는 것으로 나타났다. 또한 CA3 부위(region)에서 인삼 진세노사이드를 전처리할 경우 50 과 100 mg/kg에서 유의성 (*p < 0.05, **p < 0.01) 있게 카이네이트(kainate) 단독으로 처리한 그룹에 비하여 신경세포의 사멸을 막아주는 것으로 나타났다. 그러나 300 mg/kg에서는 신경세포 보호 효과가 없는 것으로 나타났다.

데이터로 나타내지는 않았지만 진세노사이드를 50mg/kg 보다 작은 양을 투여한 경우에는 신경세포 손상 또는 사멸을 억제하는 효과가 없었다.

또한 진세노사이드를 50 ∼100 mg/kg으로 처리한 경우에는 실험백서의 체중이 감소되지 않았으나, 300mg/kg을 처리한 경우에는 체중이 감소됨을 관찰 할 수 있었다(데이타로 나타내지는 않음). 따라서 인삼 진세노사이드를 과다하게(300mg/kg 이상) 투여하는 것은 신경세포의 보호효과 이외에 부작용을 유발하여 바람직하지 않은 것으로 나타났다.

실시예 2 : 인삼 진세노사이드가 카이네이트에 의한 해마씨 신경세포 손상에 미치는 영향

상기 실시예 1의 방법과 동일하게 동물 실험을 하고, 신경세포 손상여부는 신경세포 손상의 중요 지표인 HSP-70의 발현정도를 면역학적 방법으로 측정하였다.

면역화학(immunohistochemistry) 실험을 위하여 뇌는 브레그마(bregma) 뒤쪽으로 1.0-1.2mm 수준에서 30 ㎛ 두께로 잘랐다. 해마씨(hippocampus) 부위는 파라핀(parafin)에 함몰(embedded)시킨 뒤 3 ㎛ 두께로 자른 뒤 면역 화학염색법을 실시한 후 헤마토크실린(hematoxylin)으로 염색을 하였다.

면역 화학 염색법은 다음과 같다. 먼저 앞에서 자른 해마씨 조직 절편을 HSP-70 항혈청(antiserum from rabbit, 캐나다 Stressgen사, 1:1000희석)과 0.3% Triton-X 100, 0.5 mg/ml 소 혈청 알부민(bovine serum albumin) 및 1.5% 정상 염소 혈청(normal goat serum)을 포함하고 있는 인산염 버퍼(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4)에 36 시간동안 4℃에서 배양(incubation)시킨다. 이어서 2시간동안 이 조직 절편들을 고우트 안티-랫비(goat anti-rabbit) IgG (Vector사 1:200 희석)에서 배양(incubation)시키고, 이어서 1시간 동안 실온에서 아비딘-바이오틴 컨쥬게이티드 퍼옥시다제 복합체(avidin-biotin conjugated peroxidase complex, Vector 1:200 희석)에서 배양(incubation)한 후 0.05% 3,3-디아미노벤지딘-HCl(3,3-diaminobenzidine-4HCl, DAB)와 0.01% H₂O₂로 10분 동안 발색시킨 다음 헤마토크실린(hematoxylin)으로 염색한 다음 그 결과를 현미경(Leica)으로 관찰한 후 사진을 찍어 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도3에서는 인삼 진세노사이드이 전처리가 카이네이트(kainate)에 처리에 의하여 유도되는 세포 손상(cell injury)의 한 지표인 열쇼크 단백질-70(heat shock protein-70, HSP-70)에 대한 면역반응 (immunoreactivity)를 해마씨 CA1과 CA3 부위에서 감소시킨다는 것을 보여주고 있다. 즉 카이네이트(kainate)를 처리하지 않은 대조군(CTL)에서는 세포손상(cell injury)이 없으므로 HSP-70 단백질의 발현이 되지 않으나, 카이네이트(kainate)를 처리한 그룹(V+KA)에서는 많은 죽은 신경 세포들, 죽어가는 신경 세포들의 세포질 및 엑손(axon)에서 HSP-70 단백질이 발현되고 있음을 보여주고 있다. 그러나, 인삼 진세노사이드를 전처리한 다음 카이네이트(kainate)를 처리한 그룹(GS-KA)에서는 많은 신경 세포들이 살아 있을 뿐만 아니라 HSP-70의 발현 정도가 카이네이트(kainate) 단독 처리 그룹에서보다 작은 것으로 나타났다.

상기 실시예에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 인삼 진세노사이드가 해마씨의 CA1과 CA3 부위에 존재하는 추체 신경세포가 카이네이트에 의해 사멸 또는 손상되는 것을 억제하는 효과가 입증되었다. 그러므로 카이네이트에 의한 해마씨의 추체신경세포가 사멸 또는 손상되어 발생되는 학습능력 감퇴, 인지능력 감퇴, 측두엽 간질, 경련성 질병 및 발작 등에 유용한 예방 및 치료제로 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 진세노사이드가 카이네이트(kainate)에 의해 유도되는 해마씨의 CA1과 CA3 부위의 추체신경세포 사멸을 억제하는 지를 관찰하기 위하여 해마씨(hippocampus)의 CA1과 CA3를 액시드 푹신 염색법으로 염색한 후 찍은 사진이다.

(CTL : 대조군, 카이네이트(kainate) 처리군 : V+KA, GS+KA : 인삼 진세노사이드로 전처리한 다음 카이네이트(kainate)를 처리한 군)

도 2는 해마씨(hippocampus)의 CA1과 CA3를 액시드 푹신 염색법으로 염색한 후 살아있는 신경세포를 카운팅한 후 이를 히스토그램(histogram)으로 나타낸 것이다.

도 3은 인삼 진세노사이드의 전처리가 카이네이트(kainate)에 처리에 의하여 유도되는 세포 손상(cell injury)의 한 지표인 열쇼크 단백질-70(heat shock protein-70, HSP-70)에 대한 면역반응(immunoreactivity)을 해마씨 CA1과 CA3 부위에서 감소시킨다는 것을 나타낸 사진이다.

Claims

인삼 진세노사이드 50~200mg/kg을 함유하는 것을 특징으로 하는, 카이네이트에 의한 해마씨(hippocampus) 추체신경세포(pyramidal cells)의 사멸 또는 손상에 의해 발생하는 측두엽 간질, 경련성 질병 또는 발작 중에서 선택된 어느 하나의 예방 및 치료용 조성물.
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