JP2006304806A - 顕微鏡スライド加熱システム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 複数のスライドの各々に対する熱出力を発生させる加熱装置;加熱装置を支持するための円形コンベアー;複数のスライドの各々のための温度感知器;温度感知器と連絡しているプロセッサー;およびプロセッサーと連絡している、複数のスライドの各々のための加熱装置の熱出力を変更するための手段を含んでなる、複数の顕微鏡スライドに関して異なる標的温度を維持するための顕微鏡スライド加熱システム。
【選択図】 図10
Description
全体にわたり同様な部品は同様な参照番号により示されている図面を次に詳細に参照すると、図1には一般的に参照番号10により示されている本発明に従う分子病理学装置の透視図が示されている。装置10は顕微鏡スライド上に載せた組織を核酸プローブ、抗体および/またはそれらに関連する試薬を所望する順序、時間および温度で自動的に染色するかまたは別の方法で処理するように設計されている。このようにして染色または処理された組織切片を次に顕微鏡下で、患者診断、予後、または処置選択の目的でスライドを読み取る医師により観察する。
図6−10を参照すると、熱台50は2つの構成部品、すなわち加熱器/感知器装置58、および加熱器/感知器装置58を円形コンベアー34に取り外しできるように据え付け且つスライド37を支持するためのハウジング70、を含んでなる。
そしてスライドが隣接する加熱器により発生する熱から熱的に単離または絶縁する種々の流体から離す。
源におけるこの非−均一性は黄銅板の他の面では見られない。スライドの温度の均一性は、加熱トレースを非−均一方法で熱を生ずるようにそれらを変えることによっても得られる。熱はスライド37の端部および黄銅板60の端部を含む全ての表面で周囲空気中に逃げる。しかし、熱は加熱器64中では黄銅板の底表面上でのみ発生する。熱発生が加熱器の領域全体にわたり均一であるため黄銅板の底に一定の流束がある場合には、ガラススライドの頂部の中心は熱がより急速に散逸できる端部よりかなり熱くなるであろう。この現象は加熱器流束が中心でより少ない場合に適用できるため、ガラススライドの頂部における温度均一性を増加させることができる。有限部品熱伝達プログラムであるパラメトリック・テクノロジーズ(Parametric Technologies)(マサチュセッツ州、ワルサム(Waltham,
MA))によるメカニカ(Mechanica)を使用してシステム中の熱流をモデル化することができる。加熱器流束は好ましくは図12に示されているように設定され、そこでは中心領域63が全体の40%を占めておりそして合計エネルギーの8.3%を発生し、外側区域領域61が残りを発生する。従って、中心領域はより少ない熱を受けるため、中心領域のすぐ上にあるスライド上の温度は横長のリングのすぐ上にあるスライドの温度よりわずかに冷たい。加熱器が記載されているような輪郭である時には、ガラススライドの有効領域(その組織を置く領域、それは一般的にはスライドの最先端は除く)上の温度変動は約0.2℃である。ガラススライドの中心からガラススライドの有効領域の端部までの温度勾配は以下の通りである:徐々に0.2℃上昇し、次に徐々に.2℃低下する。幅が1インチであり且つ長さが3インチである湿ったガラススライドの頂部表面が、幅が0.75インチで、長さが1.6インチであり且つ標識の反対端部から0.25インチで出発するスライドの幅に集中する領域として定義されるその有効領域全体にわたり特定の温度均一性を維持する。均一性目標は設定温度を有効領域全体にわたり37℃から95℃のいずれの設定温度に関しても±2℃以内に維持することである。
図13に示されたブロック図を参照すると、調節電子装置52は温度設定情報を染色装置マイクロプロセッサー44から連続的デジタルプロトコール57を介して受けそしてこの情報を用いて各加熱器64をその設定点に保つのに必要な構成部品を有する環状印刷回路板からなる。当業者により容易に理解される含まれるべき構成部品(例えば、抵抗器、コンデンサー、など)は図示されていない。加熱器の調節は種々の方法で行うことができる。好ましい態様では、加熱器は加熱器電流をオンオフにスイッチ切り替え可能な一体化回路励振器または個々のトランジスター53により個別に調節することができる。それ故、プロセッサーは、以下で記載されているように、加熱器のデューティーサイクルを調節することができる。別の態様では、加熱器への動力量をプロセッサー55により加熱器が全能力のある割合(例えば最大加熱動力の50%)で操業されるように調節することができる。好ましい態様では、アレグロ・マイクロシステムズ(Allegro Microsystems)(マサチューセッツ州、ワースター(Worcester, MA))から入手できる一体化回路(UDQ2559)である。マイクロプロセッサー44との(スリップリング組立品56を介する)順次伝達器57は好ましくはオランダ、アインドホーベン(Eindhoven, The Netherlands)のフィリップス・ラブス(Philips Labs)により開発されたI2C(インター・インテグレーテッド・サーキット(Inter Integrated Circuit)順次母線プロトコールを使用する。例えばRS232D、RS422などの別のプロトコールを使用することもできた。調節電子装置52は感知器68を監視し且つ加熱器64を調節するための両方で機能する。調節電子装置52の中心は、I2C順次母線を介して染色装置マイクロプロセッサー44と連結し、加熱器温度感知器68を監視し且つスライド温度を特定時間に上昇させることが必要な時に加熱器64を動かすのに充分な能力のマイクロプロセッサー55(それはメモリー51と連結されている)または他のデジタル回路である。そのようなマイクロプロセッサーの例は、アリゾナ州、チャンドラー(Chandler, AZ)のマイクロチップ・テクノロジー・インコーポレーテッド(Microchip Technology Inc.)から入手できるPIC16C64Aである。プログラムは、染色システムマイクロコントラローラーにより与えられる設定温度(または標的温度)と比べた時に、各加熱器を加熱器温度感知器に応答して各加熱器を調節すべきである。(図14参照)。マイクロプロセッサー55は、メモリー51中の設定点温度47のルックアップ表を基準にして、どのように加熱器を調節するかを決める。ルックアップ加熱器47中の設定点温度をマイクロプロセッサー44との順次伝達器57から受ける。マイクロプロセッサー55は感知器68から実際の温度を得て、そしてその後に実際の温度および設定点温度における差を基準にして加熱器64の調節を変える。加熱器のこの調節は厳密にオンオフしてよく(すなわち、感知器温度が設定点より低い場合には加熱器を入れ、そしてその感知器温度が設定点より上である場合には加熱器を切る)、或いはそれはよりたくさん調節された正確な応答を与えるための比例、積分、および/または導関数調節システムアルゴリズムを使用してもよい。
スリップリング組立品56は、回転する銀リングおよび銀グラファイトブラシを使用する技術を用いる。スリップリングは、I2Cデジタル調節信号を運び(2つの回路)、論理に動力を与え(2つの回路)、そして加熱器に動力を与える(2つの回路)のに充分な寸法(約3インチ直径)および容量(1回路当たり約10アンペア)でなければならない。この用途に適するスリップリングは、カリフォルニア州、サウスE1モンテ(South E1 Monte CA)のファブリカスト・インコーポレーテッド(Fabricast, Inc.)、ニュージャージー州、ベイヨンネ(Bayonne, New Jersey)のエアーフライト・エレクトロニクス(Airflyte
Electronics)、バージニア州、ブラックスブルグ(Blacksburg, VA)のリットン・ポリ−サイエンティフィック(Litton Poly-Scientific)などから入手できる。ケーブル57がスリップリング回転子を調節電子装置52に操作できる状態で連結する(図11)。固定子を装置10に小ねじなどを用いて据え付けるために(据え付けは示されていない)固定子ブラケット59が装備される。図16を参照すると、スリップリング組立品56の縦方向断面図が、図5および16に示されているデータ、論理動力および加熱器動力を伝達するリード線49と共に、示されている。
下記の用語はここで使用される際に下記の意味を有するであろう。
操作においては、装置10を使用してin-situハイブリダイゼーション(ISH)、in-situ PCR、免疫組織化学(IHC)、並びに種々の化学的な(非−生物学的な)組織染色技術を行うことができる。さらに、ここではこの発明性のある加熱システムによりそれらの異なる温度条件にもかかわらず2種もしくはそれ以上の上記の技術を1回の実施中に使用することもできる。
要とする。熱台の使用が例えばキシレンの如き有害化学物質の使用を排除し、個々のスライドの正確に調節された加熱により組織中に包埋されたパラフィンを溶かしそしてそこで水溶液中に浮かせ、それを洗い流すことができる。水より密度が小さいパラフィンは、液化されると組織サンプル上の水性緩衝液を通って上昇しそしてこの流体の上部に浮かぶ。液体または気体状のいずれかの流体流を液体パラフィン上に通すことにより、液体パラフィンを次に顕微鏡スライドから除去しそして組織サンプルから離すことができる。この工程の詳細は引用することにより本発明の内容となる1998年9月3日に出願された米国特許出願番号60/099,018号に示されている。同様な技術を使用してパラフィン以外の包埋材料、例えばプラスチック、を除去できるが、エッチング試薬の添加が必要となるかもしれない。
1)サンプルと共に使用されるin-situハイブリダイゼーション、in-situ PCR免疫組織化学、組織化学、または酵素組織化学方法を指示するバーコードをスライドに適用することによりスライドを製造する。
2)スライドのバッチを装置中に挿入して各スライドをスライド支持体の中に載せる。
3)装置を閉めそして処理工程を開始する。
4)スライドが装置中で予備処理として脱パラフィン化される場合には、各スライドは60℃より上の温度に乾燥加熱されるであろう。乾燥加熱後に、スライドを約7mlのDI水で洗浄すると、約300μLの残存水量が残る。スライドを次に約600μlの蒸発抑制液で被覆する。スライドを60℃より上の温度にさらに6分間保ちそして次に約7mlのDI水で再びすすぎそして600μlの蒸発抑制液で被覆する。温度を37℃に下げる。スライドを脱パラフィン化すると、指示された工程の次の段階の準備がなされている。
5)細胞条件づけしようとするスライドを約7mlのDI水ですすぐ。装置内の減量用固定液が残存量を約300μlから約100μlに下げるであろう。装置中で量調節用固定液を用いて、200μlの細胞条件づけ溶液をスライドに加える。スライドは次に約600μlの蒸発抑制液を受容する。スライド温度を37℃〜100℃の範囲内の指示された温度に上昇させ、そして流体循環を開始しそして6−8分間毎に2時間までの期間にわたりプロトコールに示された通りに繰り返す。スライドを37℃に冷却しそして〜7mlのAPK洗浄溶液ですすぐ。この時点で、スライドは指示された方法の次の段階の準備がなされている。
6)各スライドが試薬適用区域中で止まるにつれて、適切な試薬容器を試薬円形コンベアーにより試薬適用台に動かす。計量された量の試薬をスライドに適用する。標的液は蒸発抑制液層中を下にある液体層まで通過する。
7)スライド円形コンベアーが次に進んで、スライドを渦混合台の前に直接動かす。渦合器噴射がスライド表面上の試薬を蒸発抑制液層の下で撹拌する。
8a)in-situハイブリダイゼーション用
工程が蛋白質消化を必要とする場合には、スライドを〜7mlのAPK洗浄溶液ですすぐと、〜300μlの残存量の緩衝液が残る。スライドは次に〜600μLの蒸発抑制液を受容する。段階6および7に記載されているような段階を消化酵素適用のために繰り返す。選択できるインキュベーション時間は37℃における2分間から32分間の範囲である。スライドを〜7mlの2×SSC緩衝液ですすぐと、〜300μLの残存量の緩衝液が残る。減量用固定液を使用して量を〜300μLから〜100μLに移す。6および7に記載されたような段階をプローブ適用のために繰り返す。スライドは次に〜600μLの蒸発抑制液を受容する。それぞれ標的および/またはプローブの変性(denaturization)または変性(unfolding)のためにスライド温度を37℃〜95℃の範囲内の特定温度に上昇させる。
選択できるインキュベーション時間は2分間から18時間の範囲である。
2×、1×、0.5×、0.1×SSCの選択できる塩濃度および37℃〜75℃の温度範囲を包含する使用者の選択できる厳密性を用いるハイブリダイゼーション後にすすぎが行われる。
プローブ段階後に、スライドを1×APK洗浄緩衝液で洗浄し、そして次に〜600μLの蒸発抑制液を受容する。プローブは、FISH中のように一部の標識プローブの場合のように直接的に、そして適当な検出技術に従う抗ハプテン抗体を用いるISHに関しては間接的に検出される。
清掃が望まれる場合には、プローブの検出段階後に、スライドをDI水ですすぎそして洗剤を適用して蒸発抑制液のスライドをきれいにする。
再びスライドをDI水ですすぎそして残存量を減量用固定液を用いて除去する。
スライドを37℃もしくはそれより上の温度で、全ての水性物質が組織、細胞または塗抹から蒸発するまで、乾燥加熱する。
8b)in-situ PCR用
工程が蛋白質消化を必要とする場合には、スライドを〜7mlのAPK洗浄溶液ですすぐと、〜300μLの残存量の緩衝液が残る。スライドは次に〜600μLの蒸発抑制液を受容する。段階6および7に記載されているような段階を消化酵素適用のために繰り返す。選択できるインキュベーション時間は37℃において2分間から32分間の範囲である。
スライドを〜7mlのDI水ですすぐと、〜300μLの残存量の緩衝液が残る。減量用固定液を使用して量を〜300μLから〜100μLに移す。段階7に記載されているような段階を増殖試薬適用のために繰り返す。増殖試薬は分配用に37℃もしくはそれより上の温度において100μLの残存スライド量に調合される。スライドは次に〜600μLの蒸発抑制液を受容する。スライド温度を37℃〜95℃の範囲内の特定温度に2分間より長く上昇させてPCR反応を開始させる。30回までのサイクルの熱循環は1.5分間にわたる55℃から始まり45秒間にわたる89℃である。
in-situ PCR後に、スライドは項に記載されているようなin-situハイブリダイゼーションにかけられる。
8c)IHC、HC、EHCプロトコールのためには、スライドを〜7mlの1×APK洗浄液または適当な緩衝液ですすぐと、〜300μLの残存量の緩衝液が残る。量を〜300μLから〜100μLに移すために、減量用固定液を使用してもよくまたは使用しなくてもよい。スライドは次に〜600μLの蒸発抑制液を受容する。段階7に記載されているような段階を抗体または他の試薬適用に関して繰り返す。
選択できるインキュベーション時間は2分間から32分間の範囲である。
選択できるインキュベーション温度は、細胞条件づけまたは脱パラフィン化が必要かどうかにより、37℃〜95℃の範囲である。
工程全体にわたり、スライドを1×APK洗浄液または適当な緩衝液で洗浄し、そして次に〜600μLの蒸発抑制液を受容する。蛋白質、炭水化物、および酵素は、蛍光中のように直接的に標識づけされるか、または適当な検出技術を用いて間接的に標識づけされる。
指定された染色工程の最後に、スライドを自動化清掃工程を用いるカバースリップ操作用に準備し、カバースリップ操作を受け、そしてDNA/RNA、蛋白質、炭水化物、または酵素の適切な染色工程に関して顕微鏡により観察する。
自動化in-situハイブリダイゼーションを用いるヒト・パパロマ・ウイルス(Human Papaloma Virus)(HPV)の高危険性菌株の検出
通常はパパニコラウ(Papanicolau)ステイン(Pap塗抹標本)により染色されるであろう、例えば細胞ブラシ(cytobrush)の如き標準的収集装置によりまたはシンプレップ(ThinPrep)TMスライド方法(サイテック・インコーポレーテッド(Cytec, Inc.))により採集された頸塗抹標本を高危険性HPVタイプに特異的なプローブセットを用いてin-situハイブリダイゼーションにかける。検体スライドを本発明に従う装置(以下では「染色装置」と称する)のスライドホルダー中に充填する。システムをHPVインシトゥプログラムを実施するように設定する。このプログラムは、プログラムが開始されたら、インシトゥ反応の全段階を使用者からの必要な相互作用なしで実施する。
Kベンタナ(Ventana)P/N250−042)によるすすぎおよびカバースリップ(Coverslip)TM適用、を行い、次に4分間にわたる37℃におけるプロテアーゼ1を用いるプロテアーゼ消化を行い、引き続き2×SSC中ですすぎ段階を行う。2×SSCすすぎ後に、残存スライド量を約300マイクロリットルから約100マイクロリットルに減じそしてカバースリップTMを適用する。ハイブリダイゼーション溶液と予備混合されたFITC−標識DNAプローブカクテルをベンタナ(Ventana)限定可能分配器からスライドに適用する。検体およびスライドを72℃に4分間加熱してプローブおよび検体DNAの両者を変性させる。染色装置が次に、スライドの温度を37℃に下方に勾配をつけそしてハイブリダイゼーションを37℃で2時間にわたり行う。染色装置が、プローブ混合物およびカバースリップTMをスライドから除去しそしてハイブリダイゼーション後洗浄を行う。ハイブリダイゼーション後洗浄溶液(2×SSC)およびカバースリップをスライドに加えそして器具がスライドを45℃に10分間加熱する。染色装置がハイブリダイゼーション後洗浄溶液を除去しそして検出段階を開始する。最初に、染色装置がスライドを1×APKですすぎそしてカバースリップを適用する。次に、抗−FITC(セロテック(serotec)P/N MCA1320)抗体を分配器からスライドに適用しそしてスライドを37℃に加熱しながらスライドを20分間にわたりインキュベーションし、引き続きAPKすすぎおよびカバースリップ適用を行う。次に、ビオチン標識二次抗体を加えそして37℃で8分間にわたりインキュベーションし、引き続きAPKすすぎおよびカバースリップ適用を行う。ストレプタビジン(Streptavidin)−アルカリ性ホスフェート共役体をスライド上に置きそして染色装置がスライドを37℃で30分間にわたりインキュベーションする。APKすすぎ後に、ベンタナ・ブルー検出試薬をスライドに加えそして室温で20分間にわたりインキュベーションする。ベンタナ・ブルー・キット(P/N760−060)はビオチン標識二次抗体、ストレプタビジン−アルカリ性ホスフェートおよびNBT/BCIP基質を含んでなる。スライドをDI水ですすぎ、そしてスライドを器具により熱乾燥する。この時点で、ヌクレアー・ファスト・レッド対比染料をスライドに適用し、室温で5分間にわたりインキュベーションし、そしてスライドを水ですすぐ。
自動化in-situハイブリダイゼーションを用いるパラフィン包埋組織中のエプスチエン・バル・ウイルス(Epstien Barr Virus)(EBER)のmRNAの検出
5ミクロン切片を脾臓#EBV37Aから切開しそしてサパー・フロスト・ガラス(supper frost glass)染色スライドの上に置く。検体スライドを本発明に従う装置(以下では「染色装置」と称する)のスライドホルダー中に充填する。染色装置をEBERインシトゥプログラムを実施するようにプログラミングする。このプログラムは、プログラムが開始されたら、インシトゥ反応の全段階を使用者からの必要な相互作用なしで実施する。
Claims (2)
- 複数のスライドの各々に対する熱出力を発生させる加熱装置;
加熱装置を支持するための円形コンベアー;
複数のスライドの各々のための温度感知器;
温度感知器と連絡しているプロセッサー;および
プロセッサーと連絡している、複数のスライドの各々のための加熱装置の熱出力を変更するための手段
を含んでなる、複数の顕微鏡スライドに関して異なる標的温度を維持するための顕微鏡スライド加熱システム。 - 熱を変更するための手段が加熱装置のデューティーサイクルを変更するための手段を包含する請求項1に記載の顕微鏡スライド加熱システム。
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