JP2006101885A - 植物水からヒドロキシチロソール富化組成物を得る方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】ヒドロキシチロソールの強力な化学防御活性に起因して、高い割合のヒドロキシチロソールを有する水性のオリーブ抽出物を生成する方法を開発すること。
【解決手段】約５：１と約２００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を含有するオリーブの水性抽出物を含有する、栄養補助食品であって、1つの実施形態において、約１０：１と約１００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を有する、補助食品ならびに約３：１と約５０：１との間の、ヒドロキシチロソールとチロソールとの重量比を含有するオリーブの水性抽出物を含有する、栄養補助食品。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、ヒドロキシチロソール（３，４−ジヒドロキシフェニルエタノール）として公知の、オリーブ植物中に存在する化合物の群のフェノール性機能に関する。詳細には、本発明は、少量のオレウロペインおよびチロソールを含むかまたはそれらを実質的には含まない、ヒドロキシチロソールを含有しているオリーブ抽出物、ならびにそれを得るための方法を提供する。
（参考文献）
Figure 2006101885
（発明の背景）
大量の食事による脂肪は、いくつかの疾患の発症に関係している（Ｏｗｅｎら、２０００ｃ）。アテローム性動脈硬化症（Ｋｕｌｌｅｒ、１９９７）および冠状動脈性心臓疾患（Ｇｅｒｂｅｒ、１９９４）、ならびに乳癌（Ｌａ Ｖｅｃｃｈｉａら、１９９８）、前立腺癌（Ｃｈａｎら、１９９８）、卵巣癌（Ｒｉｓｃｈら、１９９４）、および結腸癌（ＡｒｍｓｔｒｏｎｇおよびＤｏｌｌ、１９７５）はそれぞれ、食事による脂肪の増大に関係している。しかし、これが量だけに関係するのではなく、食事による脂肪の型にも関連し、これがいくつかの癌の病因において重要であることを、証拠は示している（Ｂａｒｔｓｃｈら、１９９９）。
地中海料理の主な脂肪成分であるオリーブ油は、冠状動脈性心臓疾患（Ｏｗｅｎら、２０００ｂ；Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙら、１９９０；ＭａｔｔｓｏｎおよびＧｒｕｎｄｙ、１９８５）および特定の癌（ｄ’ＡｍｉｃｉｓおよびＦａｒｃｈｉ、１９９９；Ｂｒａｇａら、１９９８；Ｍａｒｔｉｎ−Ｍｏｒｅｎｏら、１９９４）の低い発病率に関連している。いくつかの研究室が、オリーブ油のフェノール性（ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ）オレウロピンおよび他のファミリーのメンバーの加水分解によって強力な化学防御活性を有する小さいフェノール性成分を誘導することを報告した（Ｏｗｅｎら、２０００ａ；Ｍａｎｎａら、２０００）。詳細には、オリーブ油のフェノール性ヒドロキシチロソールは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化（ＶｉｓｉｏｌｉおよびＧａｌｌｉ、１９９８）、血小板の凝集（Ｐｅｔｒｏｎｉら、１９９５）を妨げ、そして５−リポキシゲナーゼおよび１２−リポキシゲナーゼを阻害する（ｄｅ ｌａ Ｐｕｅｒｔａら、１９９９；Ｋｏｈｙａｍａら、１９９７）。ヒドロキシチロソールはまた、ペルオキシ硝酸塩依存性のＤＮＡ塩基の改変およびチロシンニトロ化に対して阻害作用を発揮することも見出されており（Ｄｅｉａｎａら、１９９９）、そしてこれは種々のヒトの細胞系における反応性酸素種によって誘導される細胞毒性を中和する（Ｍａｎｎａら、２０００）。最後に、複数の研究が、ヒドロキシチロソールが、経口摂取後にヒトにおいて用量依存的に吸収されることを示しており、このことはそのバイオアベイラビリティを示している（Ｖｉｓｉｏｌｉら、２０００）。
従来は、オリーブ油の生成は、分厚いペーストを生じるための、種を除くことを含むオリーブの粉砕を含む。この手順の間、粉砕させられたオリーブは連続的に水で洗浄される。このプロセスは「練和」として公知である。次いで、ペーストは油成分を搾り出すように機械処理される。オリーブ油を提供することに加えて、圧搾によってはまた、ペーストの水成分も搾り出す。このような洗浄工程および圧搾工程によって、「植物水（ｖｅｇｅｔａｔｉｏｎ ｗａｔｅｒ）」と呼ばれる相当量の水が生じる。
オリーブの種および果肉の両方ともが、水溶性のフェノール性化合物を多く含む。このような化合物は、それらの分配係数に従って練和の間にオリーブから抽出され、そして植物水となる。このことは、オリーブの果肉中で生成される種々のフェノール性化合物（例えば、オレウロペインおよびその誘導体）が植物水中に多量に見出され得る理由を説明する。同様に、オリーブの種の中で生成される多数のモノフェノール性化合物（例えば、チロソールおよびその誘導体）もまた、植物水中に多量に存在する。
ヒドロキシチロソールの強力な化学防御活性に起因して、高い割合のヒドロキシチロソールを有する水性のオリーブ抽出物を生成する方法を開発することが所望される。
（項目１） ヒドロキシチロソール富化組成物を生成する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）オリーブから植物水を生成する工程；
（ｂ）約１と約５との間のｐＨを生じるのに有効な量で、該植物水に酸を添加する工程；および、
（ｃ）該植物水中に最初に存在したオレウロペインの少なくとも７５％がヒドロキシチロソールに転換されるまで、少なくとも２ヶ月間、該酸性化させた植物水をインキュベートする工程、
を包含する、方法。
（項目２） 前記インキュベーションが、前記植物水中に最初に存在したオレウロペインの少なくとも９０％がヒドロキシチロソールに転換されるまで、少なくとも９ヶ月間行われる、項目１に記載の方法。
（項目３） 前記植物水が、種を取り除いたオリーブの果肉から生成される、項目１に記載の方法。
（項目４） 前記インキュベーションが、前記植物水が約５：１と約２００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を有するまで行われる、項目３に記載の方法。
（項目５） 前記インキュベーションが、前記植物水が約１０：１と約１００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を有するまで行われる、項目４に記載の方法。
（項目６） 前記インキュベーションが、前記植物水が約３：１と約５０：１との間の、ヒドロキシチロソールとチロソールとの重量比を有するまで行われる、項目３に記載の方法。
（項目７） 前記インキュベーションが、前記植物水が約５：１と約３０：１との間の、ヒドロキシチロソールとチロソールとの重量比を有するまで行われる、項目６に記載の方法。
（項目８） 他の成分からヒドロキシチロソールを分離するために、インキュベートした植物水を分画する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目９） 前記酸が、約２と約４との間のｐＨを生じるのに有効な量で添加される、項目１に記載の方法。
（項目１０） ヒドロキシチロソール富化組成物を生成する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）オリーブから植物水を生成する工程；
（ｂ）必要に応じて、該植物水を乾燥させる工程；
（ｃ）該必要に応じて乾燥させた植物水を、超臨界流体と接触させる工程；および、
（ｄ）該接触させた植物水から該ヒドロキシチロソール富化組成物を回収する工程であり、該ヒドロキシチロソール富化組成物が、少なくとも約９５重量％のヒドロキシチロソールを含有する、工程、
を包含する、方法。
（項目１１） 項目１０に記載の方法であって、ここで前記回収工程が、以下の工程：
（ａ）前記超臨界流体を回収する工程であり、ここで、該超臨界流体が前記ヒドロキシチロソールを含む、工程；および、
（ｂ）前記ヒドロキシチロソール富化組成物を抽出するために、該超臨界流体を蒸発させる工程、
を包含する、方法。
（項目１２） 項目１０に記載の方法であって、ここで前記接触工程が、以下の工程：
（ａ）圧力下のモジュール中に反対側を有する多孔性膜を提供する工程であり、該膜は、液体と濃縮気体との間のバリア界面として作用し、該膜が前記ヒドロキシチロソールについて非選択的である、工程；
（ｂ）前記超臨界流体を該膜の一方の側で該モジュールに提供し、そして該膜の反対側に前記植物水を提供する工程；および、
（ｃ）該植物水と該超臨界流体との間の該ヒドロキシチロソールの濃度勾配によって駆動されるにつれて該膜を通過する、該ヒドロキシチロソールを抽出する工程、
を包含する、方法。
（項目１３） 前記多孔性膜が中空繊維膜である、項目１２に記載の方法。
（項目１４） 前記超臨界流体が二酸化炭素である、項目１０に記載の方法。
（項目１５） 前記ヒドロキシチロソール富化組成物が、少なくとも約９７重量％のヒドロキシチロソールを含有する、項目１０に記載の方法。
（項目１６） 前記ヒドロキシチロソール富化組成物が、少なくとも約９９重量％のヒドロキシチロソールを含有する、項目１０に記載の方法。
（項目１７） 約５：１と約２００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を含有するオリーブの水性抽出物を含有する、栄養補助食品。
（項目１８） 約１０：１と約１００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を有する、項目１７に記載の補助食品。
（項目１９） 約３：１と約５０：１との間の、ヒドロキシチロソールとチロソールとの重量比を含有するオリーブの水性抽出物を含有する、栄養補助食品。
（項目２０） 約５：１と約３０：１との間の、ヒドロキシチロソールとチロソールとの重量比を含有する、項目１９に記載の栄養補助食品。
（項目２１） 前記補助食品が粉末抽出物を提供するように乾燥される、項目１７に記載の栄養補助食品。
（項目２２） 前記抽出物が、錠剤、カプセル剤、丸剤、または糖剤食品添加物の形態である、項目１７に記載の栄養補助食品。
（項目２３） 約５：１と約２００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を含有するオリーブの水性抽出物を含有する、組成物。
（項目２４） 約１０：１と約１００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を有する、項目２３に記載の組成物。
（項目２５） 前記組成物が粉末組成物を提供するように乾燥される、項目２３に記載の組成物。
（項目２６） 前記組成物が、錠剤、カプセル剤、丸剤、または糖剤食品添加物の形態である、項目２３に記載の組成物。
（項目２７） 前記組成物が、滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油）、湿潤剤、および懸濁剤からなる群より選択される薬剤をさらに含有する、項目２３に記載の組成物。
（項目２８） 約３：１と約５０：１との間の、チロソールに対するヒドロキシチロソールの重量比を含有するオリーブの水性抽出物を含有する、組成物。
（項目２９） 約５：１と約３０：１との間の、チロソールに対するヒドロキシチロソールの重量比を有する、項目２８に記載の組成物。
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、ヒドロキシチロソール富化組成物を生成する方法を含む。この方法は、以下の工程を包含する：オリーブ（好ましくは、種を取り除いたオリーブの果肉）から植物水を生成する工程、（ｂ）１〜５（好ましくは２〜４）のｐＨを生じるために有効な量の酸を、植物水に添加する工程、および（ｃ）植物水中に最初に存在したオレウロペインの少なくとも７５％（そして好ましくは、オレウロペインの少なくとも９０％）がヒドロキシチロソールに転換されるまで、少なくとも２ヶ月（典型的には、６〜１２ヶ月）の期間、酸性化させた植物水をインキュベートする工程。
１つの実施形態において、インキュベーションは、植物水が、５：１と２００：１（好ましくは、１０：１と１００：１）との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を有するまで行われる。関連する実施形態において、インキュベーションは、植物水が、３：１と５０：１（典型的には、５：１と３０：１）との間の、ヒドロキシチロソールとチロソールの重量比を有するまで、行われる。
この方法はさらに、他の成分からヒドロキシチロソールを分離するために、インキュベートした植物水を分画する工程、および／または乾燥させた抽出物を生じるように、単離したヒドロキシチロソールの植物水を乾燥させる工程を包含し得る。
別の局面において、本発明は、以下の工程を包含する、ヒドロキシチロソール富化組成物を生成する方法を包含する：（ａ）オリーブから植物水を生成する工程；（ｂ）必要に応じて、植物水を乾燥させる工程；（ｃ）必要に応じて乾燥させた植物水を超臨界流体と接触させる工程；および（ｄ）接触させた植物水からヒドロキシチロソール富化組成物を回収する工程。１つの実施形態において、ヒドロキシチロソール富化組成物は、少なくとも約９５重量％のヒドロキシチロソールを含む。別の実施形態において、ヒドロキシチロソール富化組成物は、少なくとも約９７重量％のヒドロキシチロソールを含む。なお別の実施形態において、ヒドロキシチロソール富化組成物は、少なくとも約９９重量％のヒドロキシチロソールを含む。
１つの実施形態において、上記の回収工程は、以下の工程を包含する：（ａ）超臨界流体を回収する工程であり、ここで、超臨界流体はヒドロキシチロソールを含む、工程；および（ｂ）ヒドロキシチロソール富化組成物を抽出するために、超臨界流体を蒸発させる工程。別の実施形態において、上記の接触工程は、以下の工程を包含する：（ａ）圧力下のモジュール中に反対側を有する多孔性膜を提供する工程であり、この膜は、液体と濃縮気体との間のバリア界面として作用し、上記のヒドロキシチロソールについて非選択的である、工程；（ｂ）超臨界流体を膜の一方の側上のモジュールに提供し、そして膜の反対側で植物水を提供する工程；および（ｃ）植物水と超臨界流体との間のヒドロキシチロソールの濃度勾配によって駆動されるにつれて膜を通過する、ヒドロキシチロソールを抽出する工程。１つの実施形態において、多孔性膜は、中空繊維膜である。別の実施形態において、超臨界流体は二酸化炭素である。
別の局面において、本発明は、オリーブの水性抽出物を含有している栄養補助食品を含む。これは、５：１と２００：１との間、典型的には、１０：１と１００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を含有している。
関連する局面において、本発明は、オリーブの水性抽出物を含有している栄養補助食品を含む。これは、３：１と５０：１との間、典型的には、５：１と３０：１との間のヒドロキシチロソールとチロソールとの重量比を含有している。
上記の補助食品は、粉末抽出物を提供するように乾燥され得る。これは、錠剤、カプセル剤、丸剤、または糖剤食品添加物に処方され得る。
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明が添付の図面および表と組合せて読まれる場合に、より完全に理解される。
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他に指示がなければ、本明細書中で使用される全ての用語は、それらが本発明の分野で習熟されているものと同じ意味を有する。本発明が、これらが変化し得るように、記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬には限定されないことが理解されるべきである。
「オレウロペイン」によって、セコイリドイドグルコシドオレウロペイン（図１の構造ＩＩ）が意図される。
「チロソール」によって、４−ヒドロキシフェネチルアルコール（図１の構造ＶＩＩ）が意図される。
「ヒドロキシチロソール」によって、３，４−ジヒドロキシフェネチルアルコール（図１の構造ＶＩＩＩ）が意図される。
（ＩＩ．発明の方法）
本発明は、１つの局面において、オリーブから得られる植物水からヒドロキシチロソール富化組成物を提供する。以下に記載するような特定の条件下で、ヒドロキシチロソールがオリーブの植物水から得られ得ることが発見されている。本発明の実行の工程を、以下に検討する。
（Ａ．植物水の生成）
本発明の方法は、成植物のような便利でありそして市販されている供給源から得ることができるオリーブを使用する。好ましくは、植物水は、種を取り除かれたオリーブから得られる。本明細書中で開示される方法にしたがって処理されたオリーブは、任意の適切な手段によって種を取り除かれ得る。オリーブの種は、植物水中の所望されない成分であり、そして以下に記載される酸処理によってはあまり分解されない場合があるチロソールを含む。種は、果肉から手作業で、または以下に記載されるように自動化された様式で分離され得る。好ましくは、このような手段は、それを傷つけることなく種を分離することが可能でなければならず、そうでなければ、植物水中でより高濃度のチロソールを生じ得る。別の実施形態において、ヒドロキシチロソールは、種を取り除かれていないオリーブから得られる植物水から抽出される。
植物水を生成するために、オリーブに由来するオリーブの果肉は、最初に、オリーブ油、植物水、および固形物である副生成物を含む液体相混合物を得るために圧搾される。その後、植物水は、液体相の混合物の残りから分離され、そして回収される。植物水を得る例示的な方法は、両方ともＲ．Ｃｒｅａに対する、共有に係る米国特許出願番号第６，１６５，４７５号および同第６，１９７，３０８号に記載されている。これらのそれぞれが、それらの全体において本明細書中で広く参考として援用されている。
商業的生産の目的のために、本発明の種々の局面を自動化することが所望され得る。これに関しては、１つの実施形態は、米国特許第４，４５２，７４４号、同第４，５２２，１１９号、および同第４，３７０，２７４号（それぞれ、Ｆｉｎｃｈらに対するものであり、そしてそれぞれが本明細書中で広く参考として援用されている）に開示されている装置の使用を意図する。簡潔には、Ｆｉｎｃｈらは、オリーブからオリーブ油を回収するための装置を教示する。最初に、オリーブは、種のないオリーブの果肉を得るために、オリーブからオリーブの種を分離する果肉採取器に送られる。次いで、果肉は、抽出スクリューによって拾い上げられる。抽出スクリューは、油、水、および主要ではない割合のオリーブの果肉を含有している液体相を引き出すために十分な抽出圧に果肉を供する。液体相がビンの中に回収され、次いでオリーブ油および植物水を含有している混合物を得るために液体相から果肉を分離する、浄化遠心分離に送られる。次いで、浄化遠心分離によって、植物水を実質的に含まないオリーブ油（これはタンクに回収される）を得るために、混合物から植物水および少ない割合の固形物を分離する。Ｆｉｎｃｈらに従うと、水は、下水道のような処理手段に送られる。本発明は、ちょうど対照的に、ヒドロキシチロソールを抽出するための植物水の回収、保存、および使用を提供する。
本発明の実施において使用され得るさらなるデバイスは、イタリア特許第１２７６５７６号および同第１２７８０２５号に開示されている。これらのそれぞれが、本明細書中で広く援用されている。上記のように、これらのデバイスは、粉砕したオリーブの果肉の、油、水、および固形の残渣への処理の前に種から果肉を分離するために使用され得る。
（Ｂ．オレウロペインのヒドロキシチロソールへの転換）
本発明の１つの局面においては、植物水中に含まれるオレウロペインはヒドロキシチロソールに転換される。植物水のｐＨは、酸の添加によって低下させられ得、そして植物水は本発明の発見に従って、オレウロペインのヒドロキシチロソールへの酸加水分解を促進する条件下でインキュベートされ得る。次いでサンプルは、他の化合物からヒドロキシチロソールを分離するように分画され得る。
好ましい実施形態においては、添加される酸はクエン酸である。酸は、ｐＨを１〜５（好ましくは、２〜４）に調製するように植物水に添加される。固体のクエン酸が、約１０００リットルの植物水あたり好ましくは約２５から５０ポンドの酸の量で、持続的に攪拌しながら添加され得る。得られる溶液のｐＨがモニターされ得、そして所望されるｐＨに到達させるために、酸のさらなる添加が必要とされる場合がある。クエン酸の添加後のヒドロキシチロソールへのオレウロペインの転換を示す例示的な方法は、実施例１および２に提供される。
酸はまた、クエン酸以外の有機酸または無機酸でもあり得る。本発明で使用され得る例示的な酸として、鉱酸−−硫酸、硝酸、塩酸、およびリン酸−−のような公知の無機物質、ならびにカルボン酸、スルホン酸、およびフェノール類に属する有機化合物が挙げられる。植物水への酸の添加は、いくつかの目的を果たす：（ｉ）これによって植物水を安定化させる；（ｉｉ）これによって植物水の醗酵を防ぐ；および（ｉｉｉ）実施例１および２に示されるように、これによってオレウロペインをゆっくりと加水分解し、これをヒドロキシチロソールに転換する。実施例１および２の表１および２はそれぞれ、植物水の２つのサンプルによるデータ、およびクエン酸の添加後の、経時的なサンプル中の種々の成分のそれぞれの組成物の割合を含む。１つの実施形態においては、混合物は、ヒドロキシチロソールが、チロソールとヒドロキシチロソールとの組合せ全体の７５〜９０％であり、そしてもとの混合物中のオレウロペインが実質的に残らなくなるまでインキュベートされる。
（Ｃ．ヒドロキシチロソールの精製）
ヒドロキシチロソールへのオレウロペインの転換後、インキュベートされた植物水は、当該分野で公知の多数の方法によって分画され得る。あるいは、植物水は、酸での処理の前に分画され得る。例示的な分画方法として、有機溶媒、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または超臨界流体での分配が挙げられる。
上記のように得られた植物水は、低分子量ポリフェノール（特に、ヒドロキシチロソールおよび少量のチロソール）を多く含む溶液を提供する。処理された水の中でのヒドロキシチロソールの濃度は、オリーブ油の抽出の間の稀釈度に依存して、１リットルあたり４〜５グラムから１リットルあたり１０〜１５グラムの範囲であり得る。１つの実施形態においては、本発明は、汚染物質を添加せずにヒドロキシチロソールの含有量を選択的に富化させる、抽出または精製の方法を提供する。従って、主要なポリフェノール性成分であるヒドロキシチロソールは、ポリフェノールファミリーの他のメンバー、不純物、懸濁された固形物、タンニン、および植物水中に含まれる他の分子から単離される。従って、ヒドロキシチロソールは、現在の合成または本来の抽出方法によっては容易には得ることができない純度および量で産生され得る。
超臨界流体とは、その臨界温度より高温および臨界圧力より高圧で、極めて高濃度になる、気体である。その特性は、気体と液体の特性の間にあり、それによって化合物を溶解させる能力の増大を生じる。その比較的高い密度、高い拡散率、および低い粘性によって、それが従来の液体溶媒よりも速く化合物を抽出することを可能にする。二酸化炭素は、食品および食品成分の超臨界流体処理に最も広く使用される気体である。なぜなら、これは、天然のものであり、無毒であり、不燃性であり、かつ比較的不活性であり、そして抽出された産物中に残留物を残さないからである。典型的な超臨界二酸化炭素での液体抽出は、通常は、大きな接触カラムまたは塔中の他の相に１つの相を分散させることによって行われる。ここでは、溶質を含有している流体（例えば、果汁）が重力によって下降させられ、そして超臨界二酸化炭素が上向きに流れる。質量輸送は、２つの相の間の界面で生じる。
あるいは、液体および懸濁物の連続的な抽出は、超臨界流体（例えば、二酸化炭素）、および接触カラムの代わりの多孔性膜を使用して達成され得る。相の分散の代わりに、液体は、中空繊維束または螺旋状に巻き付けられたシートのように構成された多孔性ポリプロピレン膜を通じて連続して送られる。液体は、加圧されたモジュールの中の多孔性膜を通過し、その間、超臨界二酸化炭素が膜の他の側から逆流する。モジュール内の圧力は、本質的には同じであり、その結果、抽出は、流体と超臨界二酸化炭素との間の濃度勾配によって駆動される。抽出物は、再利用のために二酸化炭素を蒸発させることによって回収され得る。超臨界二酸化炭素および多孔性膜を使用する例示的な抽出方法は、米国特許第５，４９０，８８４号に記載されている。これは、その全体において本明細書中で広く援用されている。
二酸化炭素の代わりまたはそれと組合せられる他の超臨界流体。これらの液体として、メタン、エタン、プロパン、ブタン、イソブタン、エテン、プロペン、ヒドロフルオロカーボン、テトラフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、二酸化炭素、一酸化二窒素、六フッ化イオウ、アンモニア、および塩化メチルが挙げられる。
実施例３は、本発明を支持する小規模の実験を記載する。ここでは、ヒドロキシチロソールは、超臨界二酸化炭素および多孔性膜を使用して植物水から単離された。単離されたヒドロキシチロソールのＨＰＬＣおよび質量スペクトル分析は、サンプルが９７〜９９％の純度のヒドロキシチロソールであることを示す。従って、本発明は、少なくとも約８０％のヒドロキシチロソール、好ましくは、少なくとも約９０％のヒドロキシチロソール、より好ましくは、少なくとも約９５％のヒドロキシチロソール、なおより好ましくは、少なくとも約９７％のヒドロキシチロソール、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９９％のヒドロキシチロソールを含有している、ヒドロキシチロソールを多く含む組成物を提供する。
超臨界流体での抽出の前に、植物水は、当該分野で公知のキャリア（例えば、マルトデキストラン、および／またはポリプロピレンビーズ）を溶液に添加され得；そして／または溶液は乾燥させられ得る。乾燥工程は、好ましくは、少なくとも約９０％、より好ましくは、少なくとも約９５％、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９８％の水を、植物水から除去する。
膜反応の重要な特徴は、接触表面の界面積が、液体の粘性とは無関係に加えられ得るという事実である。従って、本発明は、抽出に使用される膜の外膜面積が少なくとも約１００平方ヤード、好ましくは、少なくとも約３００平方ヤード、そしてなおより好ましくは、少なくとも約６００平方ヤードである大規模なユニットを、大量の植物水からのヒドロキシチロソールの分離を可能にするために意図する。従って、本発明の膜システムは、１つの局面においては、１分あたり１〜２０リットル、好ましくは、１分あたり５〜１０リットルの間の流速に適応することが可能である。
さらなる精製方法もまた、上記の本発明に従って使用され得る。ヒドロキシチロシンのＨＰＬＣ単離は、Ｆｉｃａｒｒａら、１９９１；Ｒｏｍａｎｉら、１９９９；およびＴｓｉｍｉｄｏｕ、１９９２に記載されている。これらのそれぞれは、本明細書中で参考として広く援用されている。
（ＩＩＩ．ヒドロキシチロソールを多く含む栄養補助食品）
上記の方法によって産生されたヒドロキシチロソールが、種々の適用のために使用され得ることが理解されるはずである。例えば、本発明の方法によって得られたヒドロキシチロソールは、以下のように使用され得る：（ｉ）天然の殺菌剤、抗ウイルス薬、ならびに／または農業用および／もしくは害虫の制御への適用のための殺真菌性物質として、ならびに（ｉｉ）種々の健康目的のための治療薬および／または抗酸化剤として。１つの例示的な実施形態においては、ヒドロキシチロソールは、哺乳動物の被験体（例えば、ヒドロキシチロソールに付随する１つ以上の利点を要求する個体）に投与される。
本発明の方法によって得られたヒドロキシチロソールは、経口でまたは非経口的に投与され得る。経口の投与量形態は、固体または液体の形態であり得る。このような投与量形態は、精製されたヒドロキシチロソールから処方され得るか、またはこれらは、水性抽出物もしくは水−アルコール性抽出物から処方され得る。後者に関して、水性抽出物または水−アルコール性（例えば、水−メタノールまたは水−エタノール）抽出物は、他の薬学的に受容可能なキャリアとともに経口投与量形態に処方され得る乾燥粉末を提供するように、噴霧乾燥させられ得る。水性抽出物または水−アルコール性抽出物は、５：１と２００：１との間、好ましくは、約１０：１と約１００：１との間の、種々の重量比のオレウロペインに対するヒドロキシチロソールを含むように処方され得る。抽出物はまた、約３：１と約５０：１との間、好ましくは、約５：１と約３０：１との間の、種々の重量比のヒドロキシチロソールとチロソールとを含むように処方され得る。
本発明に従う固形の経口投与量形態の組成物は、薬学的分野で周知の様式で調製され、そして少なくとも１つの薬学的に受容可能なキャリアと組合せてヒドロキシチロソールを含む。このような組成物の作製においては、ヒドロキシチロソールを多く含む組成物（実質的に純粋な形態、または未処理の留出物もしくは抽出物の成分のいずれかとして）が、通常は、キャリアと混合されるか、キャリアで稀釈されるか、またはキャリアで封入される。キャリアは、固体形態、半固体、または液体物質であり得、これは、有効成分についてビヒクル、キャリア、または媒体として作用する。あるいは、キャリアは、経口投与を容易にするためのカプセルまたは他の容器の形態であり得る。従って、本発明に従う投与のための固体の経口投与量形態は、錠剤、丸剤、散剤、または軟ゼラチンもしくは硬ゼラチンのカプセルの形態であり得る。
あるいは、経口投与のための本発明に従って得られたヒドロキシチロソールは、液体形態であり得、ここでは薬学的に受容可能なキャリアは、水または水−アルコール溶媒質である。
本発明の投与のための組成物はまた、他の一般的な薬学的に授与可能な賦形剤（ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、ガム、珪酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、水、アルコールなどを含む）とともに処方され得る。処方物は、さらに、滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油）、湿潤剤、乳化剤、および沈殿防止剤、保存料（例えば、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピル）、甘味料または香料を含有し得る。さらに、本発明の組成物は、被験体への投与後の有効成分の迅速な放出、徐放、または遅延させられた放出を提供するように、処方され得る。
本発明に従う使用のための非経口用の処方物は、当該分野の標準的な技術を使用して調製される。これらは、一般的には、非経口的に受容可能なキャリア（例えば、等張生理食塩水）を使用して滅菌の注射可能薬物溶液として、または被験体への投与前の滅菌緩衝液もしくは等張生理食塩水での再構成のために調製された滅菌のパッケージされた散剤として、調製される。
上記から、本発明のいかに種々の目的および特徴が満たされるかがわかる。当業者は、本発明の広範囲の教示が種々の形態で意図され得ることを、上記の記載からここで理解することができる。従って、本発明は、特定の実施形態およびその実施例と組合せて記載されているが、本発明の真の範囲はそのようには限定されるべきではない。種々の変更および改変が、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の範囲を逸脱することなく行われ得る。
以下の実施例は、本発明に従うヒドロキシチロソールを多く含む組成物の産生方法を説明する。実施例は、本発明を説明するように意図され、決して本発明の範囲を限定するようには意図されない。
（実施例１）
（約２５ポンドのクエン酸／１０００リットルの添加後の、オレウロペインからヒドロキシチロソールへの転換）
表１は、１０００リットルの植物水あたり約２５ポンドのクエン酸の添加後の、経時的なオレウロペインからヒドロキシチロソールへの転換を示す。表１中の割合は、溶液中の全フェノール化合物の重量割合として示す。表１に示すように、ヒドロキシチロソールは、１２ヶ月後に溶液中のフェノール化合物の８０％より多くを構成する。
Figure 2006101885
（実施例２）
（約５０ポンドの酸／１０００リットルの添加後の、オレウロペインからヒドロキシチロソールへの転換）
表２は、１０００リットルの植物水あたり約５０ポンドのクエン酸の添加後の、経時的なオレウロペインからヒドロキシチロソールへの転換を示す。表２中の割合は、溶液中の全フェノール化合物の重量割合として示す。明らかに、表２に示すように、ヒドロキシチロソールは、２ヶ月後に溶液中のフェノール化合物の４５％より多くを構成する。
Figure 2006101885
（実施例３）
（植物水からのヒドロキシチロソールの抽出）
約４０ｍｇの乾燥固体（マルトデキストラン）を含有している植物水のアリコート（０．５ｍｌ）をポリプロピレン多孔性ビーズと混合し、そして乾燥させた。乾燥混合物を、張臨界二酸化炭素（ＰｏｒｏＣｒｉｔ、ＬＬＣ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）での抽出に使用した。回収したサンプル（約２．０ｍｇ）をＨＰＬＣによって分析した。サンプルのプロフィールを図２に示し、そして表３は、主要ピーク下の面積が９７％であることを示す。合成のヒドロキシチロソールをサンプルに添加しそしてＨＰＬＣによって分析した場合には、図３に示すような１つの主要なピークが現れ、これはサンプルの主生成物がヒドロキシチロソールであることを示している（表４）。
図４に示すサンプルの質量スペクトル分析によって、主生成物がヒドロキシチロソールであることを確認した。サンプルを、１ミリリットルあたり２６マイクログラムの最終濃度になるようにメタノールで稀釈し、そしてＥＳＩプローブを取り付けたＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ上で陰イオン化モードで分析した。注入は、内蔵シリンジポンプを使用して１分あたり３マイクロリットルであった。温度は２７℃、針電圧は＋４．２Ｖ、シースガス（ｓｈｅａｔｈ ｇａｓ）は４５ユニット、そして補助ガスは１０ユニットであった。ヒドロキシチロソールの断片化経路を図５に示す。図４に見られ得るように、ヒドロキシチロソール（質量／電荷 １５３．１）およびその断片化産物（１２３．１および１０５．１質量／電荷）が、多段スペクトルにおける豊富な産物の大部分を構成した。
Figure 2006101885
Figure 2006101885
図１は、オリーブ油中で検出されるフェノール性化合物およびそれらの前駆体の構造を示す：リグストロシド（ｌｉｇｓｔｒｏｓｉｄｅ）（Ｉ）；オレウロペイングルコシド（ＩＩ）；リグストロシドのアグリコン（ＩＩＩ）；オレウロペイングルコシドのアグリコン（ＩＶ）；カルボキシメチル基を欠失したリグストロシドアグリコンのジアルデヒド形態（Ｖ）；カルボキシメチル基を欠失したオレウロペイングルコシドアグリコンのジアルデヒド形態（ＶＩ）；チロソール（ＶＩＩ）；ヒドロキシチロソール（ＶＩＩＩ）。 図２は、植物水からの超臨界二酸化炭素抽出後の、本発明のヒドロキシチロソール富化組成物のＨＰＬＣ分析を示す。 図３は、合成のヒドロキシチロソールとともに、超臨界二酸化炭素抽出後の本発明のヒドロキシチロソール富化組成物のＨＰＬＣ分析を示す。 図４は、本発明のヒドロキシチロソール富化組成物の質量スペクトルを示す。 図５は、ヒドロキシチロソールの断片化経路を説明する。

Claims (13)

  1. 約５：１と約２００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を含有するオリーブの水性抽出物を含有する、栄養補助食品。
  2. 約１０：１と約１００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を有する、請求項１に記載の補助食品。
  3. 約３：１と約５０：１との間の、ヒドロキシチロソールとチロソールとの重量比を含有するオリーブの水性抽出物を含有する、栄養補助食品。
  4. 約５：１と約３０：１との間の、ヒドロキシチロソールとチロソールとの重量比を含有する、請求項３に記載の栄養補助食品。
  5. 前記補助食品が粉末抽出物を提供するように乾燥される、請求項１に記載の栄養補助食品。
  6. 前記抽出物が、錠剤、カプセル剤、丸剤、または糖剤食品添加物の形態である、請求項１に記載の栄養補助食品。
  7. 約５：１と約２００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を含有するオリーブの水性抽出物を含有する、組成物。
  8. 約１０：１と約１００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を有する、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記組成物が粉末組成物を提供するように乾燥される、請求項７に記載の組成物。
  10. 前記組成物が、錠剤、カプセル剤、丸剤、または糖剤食品添加物の形態である、請求項７に記載の組成物。
  11. 前記組成物が、滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油）、湿潤剤、および懸濁剤からなる群より選択される薬剤をさらに含有する、請求項７に記載の組成物。
  12. 約３：１と約５０：１との間の、チロソールに対するヒドロキシチロソールの重量比を含有するオリーブの水性抽出物を含有する、組成物。
  13. 約５：１と約３０：１との間の、チロソールに対するヒドロキシチロソールの重量比を有する、請求項１２に記載の組成物。
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