ES2392706T3

ES2392706T3 - Procedimiento para la obtención de una composición rica en hidroxitirosol a partir de agua de vegetación

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Publication number: ES2392706T3
Application number: ES01968325T
Authority: ES
Inventors: Roberto Crea
Original assignee: Creagri Inc
Current assignee: Creagri Inc
Priority date: 2000-09-01
Filing date: 2001-08-31
Publication date: 2012-12-13
Anticipated expiration: 2021-08-31
Also published as: AU2001288580B2; EP1315691B2; PT1315691E; AU8858001A; US7261909B2; US6416808B1; CA2420893A1; EP1315691B1; US20080090000A1; JP2004523468A; CA2420893C; US20020058078A1; WO2002018310A1; ES2392706T5; US20020198415A1; US8263142B2; JP3820218B2; EP1315691A1; JP2006101885A

Abstract

Procedimiento para la producción de una composición que es rica en hidroxitirosol, el cual comprende:(a) Producir un agua de vegetación a partir de aceitunas;(b) Añadir una cantidad suficiente de ácido al agua de vegetación para obtener un valor pH entre 1 y 5; así como(c) Incubar el agua de vegetación acidificada durante un período de por lo menos dos meses hasta que por lomenos el 75 % de la oleuropeína, primitivamente presente en el agua de vegetación, se haya convertido en elhidroxitirosol.

Description

Procedimiento para la obtención de una composición rica en hidroxitirosol a partir de agua de vegetación

5 (0001) La presente invención se refiere a una fracción fenólica de un grupo de componentes, presentes en plantas del olivo, conocido como hidroxitirosol (3,4-dihidroxi- feniletanol). Más concretamente, la invención proporciona tanto un extracto de aceituna - que contiene el hidroxitirosol, con reducidas cantidades de oleuropeína y de tirosol, ó que está sustancialmente exento de éstos - como asimismo proporciona un procedimiento para la obtención de este extracto.

Armstrong, B. K. y Doll, R. Revista Internacional del Cáncer No.15, 617-631 (1975); Bartsch, H. y otros, Revista Carcinogénesis No. 20, 2209-2218 (1999); Braga, C. y otros, Revista Cáncer No. 82, 448-453 (1998); Chan, J. M. y otros, Seminarios de Biología del Cáncer No. 8, 263-273 (1998);

15 d´Amicis, A. y Farchi, S. en Avances en Nutrición y Cáncer No. 2 (Zappia V. y otros Eds.) 67-72 Academia Kluwer/Editorial Plenum, Nueva York (1999); Deiana, M. y otros, Revista Medicina Biología de Radicales Libres No. 26, 762-769 (1999); de la Puerta, R. y otros, Revista Bioquímica Farmacológica No. 57, 445-449 (1999); Ficarra, P. y otros, Revista Fármacos No. 46, 803-815 (1991); Gerber, M. Epidemiología de Dieta y Cáncer, Editorial M. J. Hill, 263-275 (1994); Kohyama, N. y otros, Revista Ciencias Biológicas, Biotecnología, Bioquímica No. 61, 347-350 (1997); Kuller, L. H., Revista de Asociación Dietética Americana No. 97, 9-15 (1997); La Vecchia, C. y otros, Revista Europea de Prevención de Cáncer No. 7, 461-464 (1998); Manna C. y otros, Cartas F.E.B.S. No. 470,341-344 (2000);

25 Martín-Moreno, J. M. y otros, Revista Internacional del Cáncer No. 58, 774-780 (1994); Mattson, F. H. y Grundy, S. M. Revista Investigación sobre Lípido ( J. Lipid Res.) No. 26, 194-202 (1985); Owen, R. W. y otros, Revista Canadiense Investigación Clínica Oncológica No. 125, 31 (2000a); Owen, R. W. y otros, Revista Europea del Cáncer No. 36, 1235-1247 (2000b); Owen, R. W. y otros, Revista Alimentación, Química, Toxicología No.38, 647-659 (2000c); Parthasarathy, S. y otros, Publicación Academia Nacional de Ciencias USA No. 87, 3894-3898 (1990); Petroni A. y otros, Revista Investigación sobre Trombosis No. 78, 151-160 (1995); Risch, H. y otros, Revista del Instituto Nacional del Cáncer No. 86, 1409-1415 (1994); Romani A. y otros, Revista Agricultura, Alimentación, Química No. 47, 964-967 (1999); Tsimidou, M. y otros, Revista Química de Alimentación No. 44, 53-60 (1992);

35 Visioli, F. y otros, Cartas F.E.B.S. No. 468, 159-160 (2000); Visioli, F. y Galli, C., Revista Nutrición No. 56, 142-147 (1998).

(0002) Se ha descubierto que una elevada cantidad de grasa alimenticia está implicada en el desarrollo de varias enfermedades (Owen y otros, 2000c). La arteriosclerosis (Kuller, 1997), las enfermedades coronarias (Gerber, 1994), el cáncer de mama (La Vecchia y otros, 1998), el cáncer de próstata (Chan y otros, 1999), el cáncer de ovarios (Risch y otros, 1994) y el cáncer de colon (Armstrong y Doll, 1975) han sido relacionados todos con una elevada cantidad en grasas dietéticas. La evidencia pone de manifiesto, sin embargo, que no es solamente la cantidad, sino también el tipo de la grasa alimenticia que es importante en la etiología de algunos cánceres ( Bartsch y otros, 1999).

(0003) El aceite de oliva, principal componente de grasa en la dieta mediterránea, ha sido relacionado con una menor incidencia en las enfermedades coronarias (Owen y otros, 2000b; Parthasarathy y otros, 1990; Mattson y Grundy, 1985) y en ciertos tipos de cáncer (d´Amicis y Farchi, 1999; Braga y otros, 1998; Martín-Moreno y otros, 1994). Varios laboratorios han informado que la hidrólisis de la oleuropeína fenólica del aceite de oliva, y de otros elementos de esta familia, conduce a unos pequeños componentes fenólicos con una acusada actividad protectora química (Owen y otros, 2000a; Manna y otros, 2000). Especialmente el hidroxitirosol fenólico del aceite de oliva previene una oxidación de lipoproteína de baja densidad (LDL) (Visioli y Galli, 1998), la agregación de plaquetas (Petroni y otros, 1995) e inhibe 5- y 12-lipoxigénesis (de la Puerta y otros, 1999; Kohyama y otros, 1997). También ha sido descubierto que el hidroxitirosol ejerce un efecto inhibidor sobre la nitración de la tirosina y sobre la 55 modificación básica del ADN dependiente del peroxinitrito (Deiana y otros, 1999) así como actúa contra la citotoxicidad, inducida por especies de oxígeno reactivo en distintos sistemas celulares humanos (Manna y otros, 2000). Finalmente, unos estudios han demostrado que el hidroxitirosol es absorbido - en función de la dosificación

-: en las personas después de su ingestión, indicando así su disponibilidad biológica (Visioli y otros, 2000).

(0004) La producción de aceite de oliva implica, por regla general, la trituración de las aceitunas, incluidos los huesos, para producir una pasta viscosa. Durante este proceso, las aceitunas trituradas son continuamente lavadas con agua, un proceso que es conocido como “malaxación”. A continuación, la pasta es prensada mecánicamente para exprimir el contenido en aceite. Aparte de proporcionar el aceite de oliva, este prensado también exprime el contenido de la pasta en agua. Estas fases del lavado y prensado producen una considerable

65 cantidad de agua que es conocida como “agua de vegetación”.

(0005) Tanto el hueso como la pulpa de las aceitunas son ricos en combinaciones fenólicas, que son solubles en agua. Estas combinaciones son extraídas de las aceitunas durante la malaxación, en función de sus coeficientes de sus partes proporcionales, y las mismas terminan dentro del agua de vegetación. Esto explica porque distintas combinaciones fenólicas - como, por ejemplo, la oleuropeína y sus derivados, producidos en la pulpa de la aceituna - pueden ser encontradas de forma abundante en las aguas de vegetación. De manera similar, también se encuentran con abundancia en las aguas de vegetación unas combinaciones monofenólicas como, por ejemplo,

5 el tirosol y sus derivados, producidos por los huecos de las aceitunas.

(0006) Debido a la acusada actividad protectora química del hidroxitirosol, es deseable desarrollar un procedimiento que produzca de la aceituna un extracto acuoso con un elevado porcentaje de hidroxitirosol.

(0007) Por un lado, la presente invención abarca un procedimiento para producir una composición rica en hidroxitirosol. Este procedimiento comprende las fases de: (a) Producir el agua de vegetación de las aceitunas, preferentemente de la carne de unas aceitunas deshuesadas; (b) Añadir al agua de vegetación un ácido, en una cantidad suficiente para obtener un valor pH entre 1 y 5, de forma preferente entre 2 y 4; y (c) Incubar el agua de vegetación acidificada durante un período de por lo menos dos meses, normalmente de 6 hasta 12 meses, hasta

15 que por lo menos un 75 %, de forma preferente por lo menos un 90 % de la oleuropeína, primitivamente presente en el agua de vegetación, se haya sido convertido en el hidroxitirosol.

(0008) Según una forma de realización es así que la incubación es llevada a efecto hasta que el agua de vegetación tenga una relación entre el peso del hidroxitirosol y el peso de la oleuropeína de 5 :1 hasta 200 :1, preferentemente entre 10 : 1 hasta 100 : 1. Según una forma de realización similar, esta incubación es llevada a efecto hasta que el agua de vegetación tenga una relación de peso entre el hidroxitirosol y el tirosol de 3 : 1 hasta 50 :1, preferentemente de 5 :1 hasta 30 :1.

(0009) El procedimiento puede incluir, además, el fraccionamiento del agua de vegetación incubada para separar

25 el hidroxitirosol de los otros componente y/ó para secar el agua de vegetación del aislado hidroxitirosol, esto con el fin de producir un extracto seco; procedimiento éste en el que el referido fraccionamiento comprende, después de la mencionada incubación, poner el agua de vegetación acidificada en contacto con un fluido supercrítico así como recuperar la composición, rica en hidroxitirosol, del contactada agua de vegetación, con lo cual la composición, rica en hidroxitirosol, comprende por lo menos un 95 % de peso de hidroxitirosol. Según otra forma para la realización resulta que la composición, rica en hidroxitirosol, comprende por lo menos un 97 % de peso, aproximadamente, del hidroxitirosol. Según todavía otra forma de realización es así que la composición, rica en hidroxitirosol, comprende por lo menos un 99 por ciento de peso, aproximadamente, del hidroxitirosol.

(0010) Según una forma de realización resulta que la fase de recuperación, anteriormente descrita, comprende los

35 pasos (a) de recuperar el fluido supercrítico, conteniendo este fluido supercrítico el hidroxitirosol, y (b) de evaporizar este fluido supercrítico con el fin de extraer la composición rica en hidroxitirosol. Según otra forma de realización es así que la fase de la puesta en contacto, anteriormente descrita, comprende los pasos (a) de prever una membrana porosa, cuyos lados entre si opuestos se encuentran dentro de un elemento modular bajo presión, sirviendo la membrana como superficie límite de barrera entre un fluido y un gas denso, y no actuando la misma como selector para el referido hidroxitirosol; (b) de poner el fluido supercrítico dentro del módulo por un lado de la membrana y el agua de vegetación por el lado opuesto de la membrana; y (c) de extraer el hidroxitirosol por la membrana, impulsada por un gradiente de concentración del hidroxitirosol entre el agua de vegetación y el fluido supercrítico. Según otra forma de realización resulta que la membrana porosa es una membrana hueca de fibras. Según todavía otra forma de realización es así que el fluido supercrítico es el dióxido de carbono.

45 (0011) Conforme a otro aspecto, resulta que la presente invención comprende un suplemento dietético que consiste en un extracto acuoso de aceitunas, con una relación entre el peso del hidroxitirosol y el peso de la oleuropeína de 5 :1 hasta 200 : 1, preferentemente de 10 : 1 hasta 100 : 1.

(0012) Según otro aspecto, relacionado con ello, es así que la presente invención comprende un suplemento dietético que consiste en un extracto acuoso de aceitunas, con una relación entre el peso del hidroxitirosol y el peso del tirosol de 3 : 1 hasta 50 : 1, preferentemente de 5 :1 hasta 30 : 1.

(0013) El suplemento arriba mencionado puede ser secado para proporcionar un extracto polvoriento que puede

55 ser conformado luego como una tableta, cápsula, píldora ó como un aditivo alimenticio dulce. (0014) Estos así como otros objetos y aspectos de la presente invención podrán ser apreciados por completo en la detallada descripción, relacionada a continuación, en conjunto con las correspondientes Figuras y Tablas.

Breve descripción de las Figuras

(0015)

La Figura 1 muestra las estructuras de las combinaciones fenólicas y de sus precursores, detectados en el aceite de oliva: Ligstrósidos (I); glucósidos de oleuropeína (II); agliconas de ligstrósidos (III); agliconas de glucósidos de

65 oleuropeína (IV); una forma dialdehídica de agliconas de ligstrósidos a falta de un grupo carboximetilo (V); una forma dialdehídica de agliconas de glucósidos de oleuropeína a falta de un grupo carboximetilo (VI); tirosol (VII); hidroxitirosol (VIII). La Figura 2 indica el análisis HPLC (High Pressure Liquid Chromatography ó cromatografía líquida a alta presión)

de una composición, rica en hidroxitirosol, según la invención después de extraerse del agua de vegetación el supercrítico dióxido de carbono. La Figura 3 muestra el análisis HPLC de una composición, rica en hidroxitirosol, de la invención después de la extracción del supercrítico dióxido de carbono con hidroxitirosol sintético.

5 La Figura 4 indica el espectro de masa de una composición, rica en hidroxitirosol, según la invención. La Figura 5 muestra la trayectoria de fragmentación del hidroxitirosol.

I. Definiciones

(0016) Si no se indica nada en contra, todos los términos aquí empleados tienen el mismo significado para una persona familiarizada con el campo técnico de la presente invención. Ha de tenerse en cuenta que esta invención no se encuentra limitada a la metodología, a los protocolos ni a los reactivos particulares aquí descritos, habida cuenta de que los mismos pueden variar.

15 (0017) Por “oleuropeína” ha de ser entendida una oleuropeína de glucósidos secoiridoides (estructura II en la Figura 1).

(0018) Por “tirosol” ha de ser entendido un 4-hidroxifenetilalcohol (estructura VII en la Figura 1).

(0019) Por “hidroxitirosol” ha de ser entendido un 3,4-dihidroxifenetilalcohol (estructura VIII en la Figura 1).

II. Procedimiento de la invención

(0020) La presente invención proporciona, por un lado, una composición, rica en hidroxi- tirosol, producida a partir

25 de agua de vegetación que es derivada de aceitunas. Se ha descubierto que, bajo unas condiciones específicas como las descritas a continuación, el hidroxitirosol puede ser obtenido del agua de vegetación de aceitunas. Más abajo se consideran los pasos a tomar con el fin de llegar a realizar la presente invención.

A. Producir el agua de vegetación

(0021) El procedimiento de la presente invención emplea las aceitunas que pueden ser obtenidas de unas fuentes convencionales y comercialmente disponibles como, por ejemplo, de los oleicultores. El agua de vegetación es obtenida, preferentemente, de aceitunas deshuesadas. Las aceitunas, procesadas según el procedimiento aquí descrito, pueden ser deshuesadas con cualquier medio apropiado. Los huesos dentro de las aceitunas contienen el

35 tirosol que representa un indeseable componente para el agua de vegetación, y los mismos no pueden ser apreciadamente destruidos por el tratamiento con ácido, descrito a continuación. Los huesos pueden ser separados de la pulpa de forma manual ó de una manera automática, como la descrita más abajo. De forma preferente, estos medios deben ser capaces de sacar los huesos sin romperlos; de no ser así, se producirían unas más elevadas concentraciones de tirosol dentro del agua de vegetación. Según otra forma de realización es así que el hidroxitirosol es extraído de un agua de vegetación que es obtenida de unas aceitunas que no han sido deshuesadas.

(0022) Para producir el agua de vegetación, la pulpa procedente de las aceitunas es prensada, en primer lugar, para conseguir una mezcla de fase líquida que comprende aceite de oliva, agua de vegetación y unos

45 subproductos sólidos. A continuación, el agua de vegetación es separada del resto de la mezcla de la fase líquida para ser recogida. Ejemplos de procedimientos para la obtención de agua de vegetación están descritos en las Patentes Núms. 6 165 475 y 6 197 308 de los Estados Unidos, ambas del mismo Titular de la presente Solicitud de Patente y concedidas a R. Crea.

(0023) Para los fines de una producción a escala comercial, puede ser conveniente automatizar distintos aspectos de la presente invención. En relación con ello, una forma de realización contempla el empleo de un aparato, tal como el que está revelado en las Patentes Núms. 4 452 744, 4 522 119 y 4 370 274 de los Estados Unidos, todas concedidas a Finch y otros. Brevemente, Finch y otros presentan un aparato para recuperar el aceite de oliva de las aceitunas. Inicialmente, las aceitunas son aportadas a un triturador que separa los huecos de las aceitunas

55 para obtener una carne de aceituna sin hueso. Esta carne de aceituna es recogida después por un tornillo de extracción que somete la carne a una presión de extracción, lo suficientemente elevada para poder retirar una fase líquida que comprende aceite, agua y una menor parte proporcional de pulpa de aceituna. La fase líquida es recogida dentro de una tolva para luego ser enviada hacia una centrífuga de clarificación que separa la pula de la fase líquida para obtener una mezcla que comprende aceite de oliva y agua de vegetación. A continuación, una centrífuga de purificación separa de la mezcla el agua de vegetación y una pequeña parte proporcional de sustancias sólidas para conseguir un aceite de oliva que está principalmente exento del agua de vegetación y el cual es recogido dentro de un depósito. Según Finch y otros, el agua es llevada hacia un medio para abandonarla como, por ejemplo, hacia una alcantarilla. En un claro contraste, la presente invención tiene prevista la recogida del agua de vegetación para salvarla y usarla a los efectos de extraer el hidroxitirosol.

65 (0024) Otros dispositivos adicionales, que pueden ser empleados para la realización de la presente invención, están revelados en las Patentes Italianas Núms. 1 276 576 y 1 287 025. Tal como anteriormente mencionado, también estos dispositivos pueden ser empleados para separar la pulpa de los huesos, antes de procesarse la triturada pulpa de aceituna para conseguir el aceite, el agua y los residuos sólidos.

B. Conversión de la oleuropeína en el hidroxitirosol

5 (0025) Por el otro lado, la presente invención tiene previsto que la oleuropeína contenida en el agua de vegetación sea convertida en el hidroxitirosol. El valor pH del agua de vegetación puede ser reducido mediante la adición de ácido, lo cual permite que el agua de vegetación sea incubada a unas condiciones que, conforme al descubrimiento de la presente invención, fomentan la hidrólisis del ácido de la oleuropeína al hidroxitirosol. A continuación, la muestra puede ser fraccionada con el fin de separar el hidroxitirosol de otras combinaciones.

(0026) Según una preferida forma de realización, el ácido añadido es el ácido cítrico. Este ácido es añadido al agua de vegetación para ajustar el valor pH a 1 hasta 5, de forma preferente a 2 hasta 4. Un ácido cítrico sólido puede ser añadido durante una agitación continua y con una cantidad de preferentemente 11,34 hasta 22,68 kgs. (25 hasta 50 libras) del ácido cítrico para aproximadamente 3.785 litros (1.000 galonas) de agua de vegetación. El

15 valor pH de la solución resultante puede ser controlado, y otra adición de ácido puede, en su caso, ser necesaria para conseguir el deseado valor pH. Unos ejemplos de procesos, los cuales se refieren a la conversión de la oleuropeína dentro del hidroxitirosol después de la adición del ácido cítrico, están representados en los Ejemplos Núms. 1 y 2.

(0027) En lugar del ácido cítrico, como ácido también puede ser empleado otro ácido orgánico ó inorgánico. Los ácidos, que a título de ejemplo pueden ser empleados para la presente invención, comprenden unas sustancias inorgánicas, conocidas como ácidos minerales - ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido clorhídrico y ácido fosfórico así como las combinaciones orgánicas, pertenecientes al ácido carboxílico, al ácido sulfónico y a los grupos fenólicos. La adición del ácido al agua de vegetación sirve para varias finalidades, es decir para: (i) Estabilizar el

25 agua de vegetación; (ii) prevenir la fermentación del agua de vegetación, y (iii) hidrolizar la oleuropeína lentamente, convirtiendo la misma en el hidroxitirosol, tal como indicado en los Ejemplos Núms. 1 y 2. Las Tablas 1 y 2 en estos Ejemplos Núms. 1 y 2, respectivamente, contienen los datos de dos muestras de agua de vegetación y del respectivo porcentaje de la composición de distintos componentes, formados en las muestras durante cierto tiempo después de la adición del ácido cítrico. Según un forma de realización, se permite que la mezcla sea incubada hasta que el hidroxitirosol sea del 75 hasta el 90 % de la combinación total de tirosol y de hidroxitirosol, y que en la mezcla de partida no se encuentre sustancialmente nada de la oleuropeína.

C. Purificación del hidroxitirosol

35 (0028) Después de la conversión de la oleuropeína al hidroxitirosol, el incubada agua de vegetación puede ser fraccionada por una serie de procedimientos, ya conocidos en este ramo técnico. Como alternativa, el agua de vegetación también puede ser fraccionada previo a su tratamiento con el ácido. A título de ejemplo, algunos procedimientos de fraccionamiento comprenden la separación mediante un disolvente orgánico, por una cromatografía líquida a alta presión (HPLC) ó con unos fluidos supercríticos.

(0029) El agua de vegetación, obtenida en la manera anteriormente descrita, proporciona una solución que es rica en polifenoles de un reducido peso molecular, particularmente en el hidroxitirosol, así como en una pequeña cantidad de tirosol. La concentración del hidroxitirosol dentro del agua procesada puede variar entre 4 - 5 gramos por litro hasta 10 -15 gramos por litro, en función del grado de dilución durante la extracción del aceite de oliva.

45 Según una forma de realización, resulta que la presente invención proporciona un procedimiento para la extracción ó purificación, el cual enriquece de forma selectiva el contenido en hidroxitirosol y sin la adición de contaminantes. De este modo, el mayor componente polifenólico , ó sea, el hidroxitirosol, queda aislado de otras sustancias de la familia de los polifenoles, de impurezas, de materias sólidas en suspensión, de taninos así como aislado de otras moléculas, contenidas en el agua de vegetación. Por consiguiente, el hidroxitirosol puede ser producido en una pureza y con una cantidad que no pueden ser conseguidas fácilmente por los actuales procedimientos de extracción, sean éstos sintéticos ó naturales.

(0030) Un fluido supercrítico es un gas que se hace muy denso a partir de su temperatura y presión críticas. Las propiedades del mismo están entre las propiedades de un gas y de un líquido, por lo cual se presenta una

55 incrementada capacidad para disolver las combinaciones. Este fluido es de una densidad relativamente elevada; la alta difusividad y la reducida viscosidad le permiten extraer las combinaciones con mayor rapidez que los disolventes líquidos convencionales. El dióxido de carbono es el gas más ampliamente empleado para un procesamiento de alimentos y de ingredientes para alimentos con el fluido supercrítico, habida cuenta de que el mismo es natural, no es tóxico ni inflamable, aparte de ser relativamente inerte y no dejar ningún residuo en el producto extraído. Por regla general, la extracción líquida con el supercrítico dióxido de carbono es llevada a efecto por dispersarse una fase dentro de otra fase dentro de grandes columnas ó torres de contacto; en este caso, el fluido con contenido en sustancias disueltas -como, por ejemplo, con jugos - fluye por gravedad hacia abajo, mientras que el supercrítico dióxido de carbono fluye hacia arriba. En la intersección de las dos fases, concretamente, tiene lugar una transferencia de masas.

65 (0031) Como alternativa, la extracción continua de líquidos y de suspensiones también puede ser conseguida por el empleo de unos fluidos supercríticos - como, por ejemplo, el dióxido de carbono - y de unas membranas porosas, en lugar de las columnas ó torres de contacto; el líquido se hace pasar continuamente a través de unas

porosas membranas de polipropileno que están configuradas como unas haces de fibras huecas ó como unas láminas dobladas en espiral. El líquido pasa por las membranas porosas, dispuestas dentro de un módulo, mientras que el supercrítico dióxido de carbono fluye en contra- corriente por el otro lado de la membrana. La presión dentro del módulo es principalmente la misma, de tal manera que la extracción está siendo impulsada por el gradiente de concentración entre el fluido y el supercrítico dióxido de carbono. El extracto puede ser recuperado por la evaporización del dióxido de carbono a efectos de un reciclaje. Un procedimiento para la extracción, empleando el supercrítico dióxido de carbono y unas membranas porosas, está descrito, por ejemplo, en la Patente Núm. 5 490 884 de los Estados Unidos.

(0032) Emplear otros fluidos supercríticos, en lugar del dióxido de carbono ó bien en combinación con el mismo. Estos fluidos comprenden el metano, el etano, el propano, el butano, el isobutano, el eteno, el propeno, los hidroflúorcarbonos, el tetraflúormetano, el clorodiflúormetano, el dióxido de carbono, el monóxido dinitrogenado, los hexafluoruros sulfurosos, el amoníaco y el cloruro metílico.

(0033) El Ejemplo Núm. 3 describe, a una escala más reducida, un experimento como soporte de la presente invención; en este caso, el hidroxitirosol ha sido aislado del agua de vegetación, empleando para ello el supercrítico dióxido de carbono y las membranas porosas. El análisis HPLC y la espectrometría de masa del hidroxitirosol extraído indican que la muestra contiene un 97 hasta un 99 % de hidroxitirosol puro. Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición rica en hidroxitirosol, la cual contiene por lo menos un 80 %, aproximadamente, del hidroxitirosol, de forma preferente por lo menos un 90 %, aproximadamente, de hidroxitirosol y, de forma especialmente preferente, por lo menos un 95 %, aproximadamente, de hidroxitirosol así como, con mayor preferencia aún, la misma contiene por lo menos un 99 %, aproximadamente, de hidroxitirosol.

(0034) Previo a la extracción con un fluido supercrítico, el agua de vegetación puede contener unos agentes portadores, que son conocidos a las personas familiarizadas con este ramo técnico y como pueden ser, por ejemplo, la maltodextrina ó unas perlas de polipropileno, añadidos a la solución, y/ó la solución puede ser secada. La fase del secado elimina del agua de vegetación preferentemente por lo menos un 90 %, aproximadamente, de agua; con mayor preferencia por lo menos un 95 %, aproximadamente de agua; y, con mayor preferencia aún, la misma elimina por lo menos un 98 %, aproximadamente, de agua.

(0035) Un aspecto importante de estos reactores de membrana consiste en el hecho de que la zona de la superficie de contacto entre las caras puede ser arrimada con independencia de la velocidad de los flujos. Por consiguiente, la presente invención contempla una unidad a gran escala en la que la zona de la superficie de la membrana, empleada para la extracción, es por lo menos de aproximadamente 83,61 m2 (100 yardas cuadradas); de forma preferente es por lo menos de aproximadamente 250,83 m2 (300 yardas cuadradas); y de forma especialmente preferente es por lo menos de aproximadamente 501,66 m2 (600 yardas cuadradas), con el fin de permitir la separación del hidroxitirosol de grandes volúmenes de agua de vegetación. De este modo, el sistema de membranas de la presente invención podría, en un aspecto, ser capaz de acomodar una velocidad de flujo de entre 1 y 20 litros por minuto, preferentemente entre 5 y 10 litros por minuto.

(0036) En conformidad con la presente invención, y tal como anteriormente indicado, también pueden ser empleados unos adicionales procedimientos de purificación. El aislamiento de la hidroxitirosina mediante la cromatografía HPLC está descrito en las publicaciones de Ficarra y otros, 1991; de Romani y otros, 1999; y de Tsimidou, 1992.

III. Suplemento dietario rico en hidroxitirosol

(0037) Ha de tenerse en cuenta que el hidroxitirosol, producido mediante el procedimiento arriba descrito, puede ser empleado para toda una serie de aplicaciones. A título de ejemplo, el hidroxitirosol, obtenido según el procedimiento de la presente invención, puede ser empleado: (i) Como un producto natural anti-bacteriano, antiviral y/ó fungicidal para las aplicaciones en la agricultura y/ó en el control de plagas y (ii) como un producto terapéutico y/ó como un anti-oxidante para una gran variedad de finalidades relacionadas con la salud. Según un ejemplo de realización es así que el hidroxitirosol es administrado a un sujeto de mamífero como, por ejemplo, a una persona deseosa de experimentar uno ó varios de los efectos beneficiosos relacionados con el hidroxitirosol.

(0038) El hidroxitirosol, obtenido por el procedimiento de la presente invención, puede ser administrado de forma oral ó parenteral. Las formas de dosificación oral pueden ser de tipo sólido ó líquido. Estas formas de dosificación pueden ser formuladas a partir de un hidroxitirosol purificado ó las mismas pueden ser establecidas en base a unos extractos acuosos ó acuosos/alcohólicos. Con respecto a estos últimos, los extractos acuosos ó acuosos/alcohólicos (como, por ejemplo, de agua/metanol ó de agua/etanol) pueden ser secados por una atomización con el fin de proporcionar un polvo seco que puede ser formulado en las formas de dosificación oral juntamente con otras sustancias portadoras farmacológicamente aceptables. Los extractos acuosos ó acuosos/alcohólicos pueden ser formulados para composiciones que contienen distintas relaciones entre el peso del hidroxitirosol y el peso de la oleuropeína, es decir, entre 5 :1 y 200 :1, preferentemente entre 10 :1 y 100 :1. Estos extractos también pueden ser formulados para contener distintas relaciones entre el peso del hidroxitirosol y el peso del tirosol, es decir, entre 3 :1 y 50 :1, preferentemente entre 5 :1 y 30 :1.

(0039) Las composiciones sólidas, en forma de dosificaciones orales de acuerdo con la presente invención, son

preparadas de una manera bien conocida en las técnicas farmacéuticas, y las mismas comprenden el hidroxitirosol en combinación con por lo menos una sustancia portadora que sea farmacológicamente aceptable. Al fabricarse estas dosificaciones, una composición rica en hidroxitirosol -en una forma principalmente pura ó como el componente de un destilado ó de un extracto en bruto - es normalmente mezclada, diluida ó bien es envuelta en 5 una sustancia portadora. Esta sustancia portadora puede ser de forma sólida ó puede ser de tipo semi-sólido ó líquido que actúa como un vehículo, como un portador ó como un medio auxiliar para el ingrediente activo. Como alternativa, la sustancia portadora también puede tener la forma de una cápsula ó de un receptáculo para facilitar la administración oral. De esta manera, las formas de dosificación sólida de administración oral según la presente invención pueden tener la configuración de tabletas, de píldoras, de polvo ó de cápsulas de gelatina, blandas ó

10 duras.

(0040) Como alternativa, el hidroxitirosol - obtenido conforme a la presente invención y previsto para una administración oral - también puede ser de forma líquida; en este caso, la sustancia portadora, farmacológicamente aceptable, puede ser el agua ó un medio acuoso/alcohólico.

15 (0041) Las composiciones para una administración oral según la presente invención también pueden ser formuladas con otros excipientes comunes y farmacológicamente aceptables, incluyendo la lactosa, la dextrosa, la sucrosa, el sorbitol, el manitol, el almidón, los cauchos, el silicato de calcio, una celulosa micro-cristalina, las pirrolidonas de polivinilo, la celulosa metílica, el agua, el alcohol y otras sustancias similares. Las fórmulas pueden

20 incluir, adicionalmente, unos agentes de lubricación como, por ejemplo, el talco, el estearato de magnesio y un aceite mineral; agentes humectantes; agentes para la emulsión y suspensión; unos agentes preservantes como por ejemplo, los hidroxi- benzoatos de metilo y propilo; así como unos agentes edulcorantes y gustativos. Además, las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas con el fin de proporcionar una liberación rápida, sostenida ó retrasada del ingrediente activo, después de su administración a un sujeto.

25 (0042) Las fórmulas parenterales, para su aplicación de acuerdo con la presente invención, son preparadas aplicando para ello las técnicas normales del ramo. Las mismas son preparadas, por regla general, en forma de unas soluciones estériles inyectables - empleando unas sustancias portadoras parenteralmente aceptables como, por ejemplo, una solución salina isotónica - ó en forma de un polvo empaquetado de forma estéril y preparado para

30 su reconstitución con un tampón estéril ó con una solución salina isotónica, previo a su administración a un sujeto. (0043) Los ejemplos, relacionados a continuación, describen los procedimientos para producir unas composiciones ricas en hidroxitirosol conforme a la presente invención. Los ejemplos están previstos para describir el alcance de la presente invención, pero de ninguna manera para limitarlo.

35 Ejemplos

Ejemplo Núm. 1

Conversión de oleuropeína a hidroxitirosol después de la adición de aproximadamente 11,34 kgs (25 libras) de 40 ácido cítrico a 3.785 litros (1.000 galonas) de agua de vegetación

(0044) La Tabla 1 representa la conversión de oleuropeína en hidroxitirosol durante cierto tiempo después de la adición de aproximadamente 11,34 kgs (25 libras) de ácido cítrico a 3.785 litros (1.000 galonas) de agua de vegetación. Los porcentajes de la Tabla 1 están indicados como porcentajes del peso de la totalidad de

45 combinaciones fenólicas dentro de la solución. Según pone de manifiesto la Tabla 1, el hidroxitirosol comprende, después de 12 meses, más del 80 % de las combinaciones fenólicas dentro de la solución.

Tabla 1

Conversión de oleuropeína en hidroxitirosol después de la adición de aproximadamente 11,34 kgs (25 libras) de ácido cítrico a 3.785 litros (1.000 galonas) de agua de vegetación

Componente: Composición a T = 2 meses Composición a T = 3 meses Composición a T = 4,5 meses Composición a T = 12 meses

Hidroxitirosol: 30.4% 32% 48.4% 80.2%

Tirosol: 2.5% 5% 2.2% 3.6%

Oleuropeína: 41% 36.6% 25.1% 1.2%

Aglicona de oleuropeína: 4.2% 4.6% 2.7% 3.7%

Ejemplo Núm. 2

Conversión de oleuropeína a hidroxitirosol después de la adición de aproximadamente 22,68 kgs (50 libras) de ácido cítrico a 3.785 litros (1.000 galonas) de agua de vegetación

55 (0045) La Tabla 2 representa la conversión de oleuropeína en hidroxitirosol durante cierto tiempo después de la adición de aproximadamente 22,68 kgs (50 libras) de ácido cítrico a 3.785 litros (1.000 galonas) de agua de vegetación. Los porcentajes de la Tabla 2 están indicados como porcentajes del peso de la totalidad de combinaciones fenólicas dentro de la solución. De una manera significativa, y tal como puesto de manifiesto en la Tabla 2, el hidroxitirosol comprende, después de dos meses, más del 45 % de las combinaciones fenólicas dentro de la solución.

Tabla 2

Conversión de oleuropeína en hidroxitirosol después de la adición de aproximadamente 22,68 kgs (50 libras) de ácido cítrico a 3.785 litros (1.000 galonas) de agua de vegetación

Componente: Composición a T = 2 meses Composición a T = 12 meses

Hidroxitirosol: 45.7% 78.5%

Tirosol: 2.9% 3.3%

Oleuropeína: 28.7% 1.5%

Aglicona de oleuropeína: 4.1% 3.5%

Ejemplo Núm. 3

Extracción de hidroxitirosol del agua de vegetación

(0046) Una parte alícuota (0.5 mililitro) de agua de vegetación, que contiene aproximadamente 40 mgrs. de una sustancia sólida seca (maltodextrina), ha sido mezclada con unas perlas de polipropileno poroso y la misma es 15 secada. La mezcla seca ha sido empleada para la extracción con un dióxido de carbono supercrítico ( Empresa PoroCrit, LLC, Berkeley, California). La muestra recogida (aproximadamente 2.0 mgrs.) ha sido analizada mediante HPLC. El perfil de la muestra está indicado en la Figura 2, mientras que la Tabla 3 indica la zona por debajo la mayor cresta, la cual es del 97 %. Al ser añadido un hidroxitirosol sintético a la muestra, que es analizada por HPLC, aparecía una mayor cresta que indica, tal como representado en la Figura 3, que la mayor parte del

20 producto es el hidroxitirosol (Tabla 4).

(0047) El análisis de la muestra mediante una espectrometría de masa confirma, tal como indicado en la Figura 4, que la mayor parte del producto consiste en hidroxitirosol. La muestra ha sido diluida con metanol hasta una concentración final de 26 microgramos por mililitro y ha sido analizada al modo de una ionización negativa con una 25 dispositivo Finnigan LCQ, provisto de probetas ESI. La infusión ha sido de 3 microlitos por minuto, empleando una bomba con jeringa incorporada. La temperatura ha sido de 27 º C.; la tensión de la aguja de + 4.2 V.; gas de envoltura de 45 unidades; y el gas auxiliar de 10 unidades. La trayectoria de la fragmentación del hidroxitirosol está indicada en la Figura 5. Tal como puede ser apreciado en la Figura 4, el hidroxitirosol (masa / carga 153.1) y sus productos de fragmentación (123.1 y 105.1 masa / carga) representan la mayor parte de la totalidad de productos

30 dentro del espectros de fases múltiples.

Tabla 3

Análisis de cresta de los resultados de HPLC de la Figura 2

Cresta No.: Tiempo Altura (NV) Zona (NV-seg.) Zona (%)

1: 5.935 215542 6687705 97.476

2: 11.433 5686 173104 2.523

Tabla 4

Análisis de cresta de los resultados de HPLC de la Figura 3

Cresta No.: Tiempo Altura (NV) Zona (NV-seg.) Area (%)

1: 2.875 1345 13895 0.26

2: 3.278 1076 14140 0.265

3: 6.641 211204 5241105 98.240

4: 11.961 2587 65811 1.233

TRADUCCION DE LAS LEYENDAS DE LOS DIBUJOS FIGURA 2:

5 Altura Tiempo

FIGURA 3:

Altura Tiempo

FIGURA 4:

Absorción relativa

Claims

REIVINDICACIONES

1ª.-Procedimiento para la producción de una composición que es rica en hidroxitirosol, el cual comprende:

5 (a) Producir un agua de vegetación a partir de aceitunas;

(b)

Añadir una cantidad suficiente de ácido al agua de vegetación para obtener un valor pH entre 1 y 5; así como

(c)

Incubar el agua de vegetación acidificada durante un período de por lo menos dos meses hasta que por lo menos el 75 % de la oleuropeína, primitivamente presente en el agua de vegetación, se haya convertido en el hidroxitirosol.

2ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 1), en el cual la referida incubación es llevada a efecto durante un período de por lo menos 9 meses y hasta que por lo menos el 90 % de la oleuropeína, primitivamente presente en el agua de vegetación, se haya convertido en el hidroxitirosol.

15 3ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 1), en el cual el agua de vegetación es producida a partir de la carne de aceitunas deshuesadas.

4ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 3), en el cual la incubación es llevada a efecto hasta que el agua de vegetación tenga una relación entre el peso del hidroxitirosol y el peso de la oleuropeína de 5 : 1 y 200 : 1.

5ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 4), en el cual la incubación es llevada a efecto hasta que el agua de vegetación tenga una relación entre el peso del hidroxitirosol y el peso de la oleuropeína de 10 :1 y 100 : 1.

6ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 3), en el cual la incubación es llevada a efecto hasta que el agua 25 de vegetación tenga una relación entre el peso del hidroxitirosol y el peso de la oleuropeína de 3 : 1 y 50 : 1.

7ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 6), en el cual la incubación es llevada a efecto hasta que el agua de vegetación tenga una relación entre el peso del hidroxitirosol y el peso de la oleuropeína de 5 : 1 hasta 30 : 1.

8ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 1) el cual comprende, además, el fraccionamiento del incubada agua de vegetación con el fin de separar el hidroxitirosol de otros componentes.

9ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 1), en el cual el referido ácido es añadido en una cantidad suficiente para producir un valor pH entre 2 y 4.

35 10ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 8), en el cual el referido fraccionamiento comprende - después de la mencionada incubación - la puesta del agua de vegetación referida en contacto con un fluido supercrítico así como la recuperación de la mencionada composición, rica en hidroxitirosol, del agua de vegetación contactada; en este caso, la referida composición, rica en hidroxitirosol, comprende por lo menos un 95 % de su peso en hidroxitirosol.

11ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 10), en el cual la referida recuperación comprende las fases siguientes:

45 (a) Recuperación del mencionado fluido supercrítico, conteniendo este fluido supercrítico el referido hidroxitirosol; así como

(b)

Evaporización del mencionado fluido supercrítico con el fin de extraer la referida composición que es rica en hidroxitirosol.

12ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 10), en el cual la referida puesta en contacto comprende las fases siguientes:

(a)

Prever una membrana porosa que tiene sus lados, entre si opuestos, dentro de un módulo que se encuentra

bajo presión; en este caso, la referida membrana sirve como una superficie límite de barrera entre un fluido y un 55 gas denso, y la misma no actúa como un selector para el mencionado hidroxitirosol;

(b)

Prever el referido fluido supercrítico dentro del mencionado módulo y por un lado de la referida membrana y prever el agua de vegetación mencionada por el lado opuesto de la referida membrana; así como

(c)

Extraer el referido hidroxitirosol a través de toda la mencionada membrana, siendo el mismo impulsado por un gradiente de concentración del referido hidroxitirosol entre el agua de vegetación mencionada y el referido fluido supercrítico.

13ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 12), en el cual la referida membrana es una membrana de haces de fibras huecas.

65 14ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 10), en el cual el mencionado fluido supercrítico es el dióxido de carbono.

15ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 10), en el cual la referida composición, rica en hidroxitirosol,

comprende por lo menos un 95 % de su peso en hidroxitirosol.

16ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 10), en el cual la referida composición, rica en hidroxitirosol, comprende por lo menos un 99 % de su peso en hidroxitirosol.

17ª.- Suplemento dietético que comprende un extracto acuoso de aceitunas que tiene una relación entre el peso del hidroxitirosol y el peso de la oleuropeína de 5 :1 y 200 : 1.

18ª.- Suplemento dietético conforme a la reivindicación 17), en el cual la relación entre el peso del hidroxitirosol y el 10 peso de la oleuropeína es de 10 : 1 y 100 : 1.

19ª.- Suplemento dietético que comprende un extracto acuoso de aceitunas que tiene una relación entre el peso del hidroxitirosol y el peso de la oleuropeína de 3 :1 y 50 : 1.

15 20ª.- Suplemento dietético conforme a la reivindicación 18, el cual tiene una relación entre el peso del hidroxitirosol y el peso de la oleuropeína de 5:1 y 30 : 1.

21ª.- Suplemento dietético conforme a la reivindicación 17), siendo el referido suplemento secado con el fin de producir un extracto polvoriento.

22ª.- Suplemento dietético conforme a la reivindicación 17), teniendo el referido suplemento la forma de una tableta, de una cápsula, de una píldora ó de un aditivo alimenticio dulce.

23ª.- Composición que comprende un extracto acuoso de aceitunas que tiene una relación entre el peso del 25 hidroxitirosol y el peso de la oleuropeína de 5 :1 hasta 200 : 1.

24ª.- Composición conforme a la reivindicación 23), el cual tiene un relación entre el peso del hidroxitirosol y el peso de la oleuropeína de 10 : 1 hasta 100 : 1.

30 25ª.- Composición conforme a la reivindicación 23), el cual tiene la forma de polvo seco.

26ª.- Composición conforme a la reivindicación 23), el cual tiene la forma de una tableta, de una cápsula, de una píldora ó de un aditivo alimenticio dulce.

35 27ª.- Composición conforme a la reivindicación 23) el cual comprende, además, un agente seleccionado del grupo que consiste en agentes lubrificantes como, por ejemplo, el talco, el estearato de magnesio y el aceite mineral; agentes humectantes y agentes para la suspensión.

28ª.- Composición que comprende un extracto acuoso de aceitunas que tiene una relación entre el peso del 40 hidroxitirosol y el peso del tirosol de 3 :1 hasta 50 : 1.

29ª.- Composición conforme a la reivindicación 28), el cual tiene una relación entre el peso del hidroxitirosol y el peso del tirosol de 5 :1 hasta 30 : 1.

45 30ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 1) según el cual, y como resultado de la referida incubación, el porcentaje del peso del hidroxitirosol con respecto al porcentaje del peso de la totalidad de las combinaciones fenólicas dentro de la mencionada composición es mayor del 45 %.

31ª.- Procedimiento conforme a la reivindicación 1) según el cual el ácido, que es añadido en la fase (b), es el 50 ácido cítrico ó el ácido clorhídrico.