JP2004537306A - ウイルスに対する作用を誘導するタンパク質をコードするキメラ鎖 - Google Patents

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Abstract

本発明は、受容体において、デング熱ウイルスによる感染に対する、血清型特異的および防御性体液性免疫応答を誘導することができ、こうして出血およびこの種の病理について記載されている臨床的合併症を引き起こす血清型非特異的ウイルス免疫増強の作用を排除することができるタンパク質をコードする、キメラ鎖の入手に関する。これらの核酸のキメラ鎖は、脱水素酵素活性を有する髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)からの変異タンパク質の遺伝子に属する断片と、デング熱ウイルスからのエンベロープ(E)タンパク質の領域をコードする断片との特定の組合せからなり、これは、発現ベクター中に挿入されると、特定の性質を有するキメラタンパク質を生じる。本発明から生じたキメラ分子は、ヒトで使用される血清型特異性の高いワクチン調製物と診断手段の入手のために、医薬品産業に適用される。

Description

【技術分野】
【0001】
(発明の分野)
本発明は、バイオテクノロジーと医薬品産業の分野に関し、特に発現ベクター中に導入された時、デング熱ウイルス(Dengue virus)(以後DENと呼ぶ)感染に対する血清型特異的(serotype-specific)体液性免疫応答と防御とを誘発し、このタイプの病理で言及される出血と臨床的合併症を引き起こす血清型特異的ウイルス免疫増幅の影響を避けることができるタンパク質を生成する、キメラヌクレオチド鎖を得ることに関する。
【0002】
先行技術
デング熱ウイルス(DEN)は、その脂質膜が3つの構造タンパク質のうちの2つ(エンベロープタンパク質(E)と膜タンパク質(M))を含有する被覆されたウイルスである。Eタンパク質は、第3の構造タンパク質(コアタンパク質)からなるイコサエドリック(icosaedric)ヌクレオカプシドをカバーする。このウイルスは、フラビウイルス(Flaviviridae)科に属し、4つの異なる血清型が存在する。ヒトへの伝搬は、ステゴミア(Stegomia)科に属する蚊ネッタイシマカ(Aedes aegypti)により行われる。このウイルスについてヒトで発生する疾患は、出血熱とショックを特徴とするより重症の、時に致死的な疾患(出血性デング熱とデングショック症候群(HDF/DSS)と呼ぶ)(Hammon WMc、フィリピンとタイにおける小児の新しい出血熱、Trans Assoc Physicians 1960:73:140-155)が出現するまでは、良性であると考えられ、デング熱または古典的デング(DF)と言われた。いくつかの疫学的研究が行われ、危険因子として、2つの異なるウイルス血清型の連続的感染を証明している(Kouri GP、Guzman MG、Brave JR、なぜキューバでデング出血熱:完全な分析。Tans Roy Soc Trop Med Hyg 1987;72:821-823)。この現象は、免疫増強により説明され、これは、標的細胞(単球)のFc 受容体を介する細胞へのウイルス−抗体複合体の侵入を増加させることによる、ウイルス感染の増加に基づく(halstead SB、デングの病理:分子生物学の課題、Science 1988;239:476-481)。
【0003】
生きた弱毒化ワクチンを製造するために種々の方法が開発されているが、これらのワクチンは病原性、ウイルス干渉、およびゲノム間組換えに戻ることがあるため、現在これらのワクチンの効果については多くの未解決の問題がある。また、組換え抗原は、サブユニットワクチンの可能な成分として得ることができる(Feighny, R., Borrous, J. および Putnak R.、 ウイルスの抗原刺激に対してマウスを防御する組換えバキュロウイルスを使用して作成したデング2型ウイルスエンベロープ、Am. J. Trop. Med. Hyg. 1994, 50(3). 322-328; Deubel, V., Staropoli, I., Megret, F.ら、アフィニティ精製したデング−2ウイルスエンベロープ糖タンパク質はマウス中で中和抗体と防御性免疫を誘導する、Vaccine. 1997. 15, 1946-1954)。
【0004】
ウイルスの主要な抗原は、エンベロープタンパク質DENeである。このタンパク質は、ウイルス表面の主要な成分であり、細胞受容体へのウイルスの結合を仲介すると考えられている(A Heinz FX, Bergee R, Tuma Wら、モノクローナル抗体により規定されるダニ由来脳炎ウイルスの構造性糖タンパク質上のエピトープの位相的および機能的モデル、Virology. 1983; 126:525)。このタンパク質は、ダニ由来脳炎ウイルス(TBE)と構造的相同性を有し(Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, C.ら、2Å分解能でのダニ由来脳炎ウイルスからのエンベロープ糖タンパク質、Nature 1995;375:29i1-298)、血清型間で構造的に保存されている。
【0005】
昆虫細胞は、ベクターとしてバキュロウイルスを使用する多様な異種遺伝子の発現のために最もよく使用されている系の1つである。これらのベクターは、日本脳炎ウイルス(JEV)、DEN−1、DEN−2およびDEN−4の構造および非構造タンパク質のいくつかの組合せの発現のために使用されている(Matsuura, Y. Miyamoto M, Soto Tら、組換えバキュロウイルスにより発現される日本脳炎ウイルスエンベロープタンパク質の性状解析、Virology 1989;173:677-682; Deubel V, Bordier M, Megret Fら、組換えバキュロウイルスにより昆虫細胞中で発現されるカルボキシ末端切断型デング−2エンベロープタンパク質のプロセシング、分泌および免疫反応性、Virology 1991;180:440-447; Putnak R, Feighny R, Burrous J ら、組換えバキュロウイルス中で発現されるデング1ウイルスエンベロープ糖タンパク質遺伝子はマウスでウイルス中和抗体を誘発し、これらをウイルス抗原刺激から防御する、Am J Trop Med Hyg 1991;45:159-167; Feighny R, Burrous J, Putnak R. 組換えバキュロウイルスを使用して作成されたデング2型ウイルスエンベロープタンパク質はウイルス抗原刺激に対してマウスを防御する、Am J Trop Med Hyg 1994;50:322-328)。使用される他の系は、Eタンパク質の異なる変種を発現するドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)の細胞である(PCT/US96/07627)。これらの系で発現されるタンパク質を使用して適切な機能性応答を得られるにもかかわらず、これらはスケールアップ製造法の開発にはコストが高く、従って酵母での発現が、フラビウイルスの組換え構造タンパク質を製造するための別の方法となっている。しかし、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)中で発現されるDNEeタンパク質(PCT/US96/07627;Sugrue R.J., Fu H., Howe J., Chan Y.、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)でのデング熱ウイルス構造タンパク質の発現はウイルス様粒子の生成を引き起こす、J Virol. 1997. 78, 1861-1866)の場合、発現レベルは低く、分泌されるかまたは細胞内であり、精製プロセスを妨害する。
【0006】
平行して、細菌でいくつかの変種DENeタンパク質が得られている。これらの1つは、大腸菌(E. coli)のトリプトファン代謝のタンパク質に融合したJEVのEタンパク質(TrpE)のC末端部分であった。このタンパク質は、封入体として産生され、免疫検出法を使用して中和モノクローナル抗体(Mabs)により認識された。しかしこのタンパク質の純粋な調製物は中和抗体を開発することができず、ウイルス抗原刺激に対して防御することができない(Mason P.W., Zogel M.V., Semproni A.R.ら、大腸菌(E. coli)で発現されるデング1型ウイルスエンベロープとNS1タンパク質の抗原構造、J Gen Virol. 1990. 71:2107-2114)。さらに、Eタンパク質のC末端断片に融合した黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のプロテインAを含有し、続いてJEVの非構造タンパク質のN末端セグメント(NS1)を含有する、別の構築体を作成した(Srivastava A.K., Morita K., Matsuo S.ら、大腸菌(E. coli)中で発現されるプロテインAの日本脳炎ウイルスの融合タンパク質はマウスで防御能を付与する、Microbiol Immunol. 1991. 35:863-870)。この場合、融合したタンパク質は可溶性であり、親和性クロマトグラフィーによる精製を促進する。マウスをこの純粋なタンパク質で免疫すると、高中和性抗体力価が得られ、これはまた、血球凝集を阻害し、JEVによるウイルス抗原刺激に対して防御した。黄色ブドウ球菌(S. aureus)のプロテインAに融合したDEN−2のDENe領域を使用して、同様の結果が得られた(Srivastava A.K., Putnak R.J., Warren R.L., Hoke C.H.、大腸菌(Escherichia coli)中で作成したデング2型ウイルスEとNS1の融合タンパク質を用いて免疫したマウスは、致死的デングウイルス感染に対して防御される。Vaccine. 1995. 13:1251-1258);しかし、プロテインAの存在のためにヒトでこれらの調製物を使用することが不可能であり、これはヒト免疫グロブリンG(IgG)に対する高親和性を示した。最後に、DEN−2のDENeタンパク質のBドメインと大腸菌(E. coli)のマルトース結合タンパク質(MBP)とを含有する融合タンパク質(Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G.、マウスでのデング2ウイルス感染に対する組換えデングエンベロープBドメイン融合タンパク質の防御効果の評価、Am J Trop Med Hyg. 1998. 58:655-662)(MBP−DomBと呼ぶ)が報告された。このタンパク質変種はマウスで免疫原性であり、中和抗体を誘発した。
【0007】
我々のケースでは本発明の主題はキメラ配列を得ることに依存し、例えば第1のケースでは、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)からの脱水素酵素活性を有する変異タンパク質(MDH)のN末端断片に連結したDENeタンパク質の領域をコードする配列;第2のケースでは、2つの異なる位置でMDHタンパク質の全遺伝子に連結したDENeタンパク質の領域をコードする配列;第3のケースでは、キメラ配列は、MDHタンパク質をコードする同じ遺伝子に融合した2つの異なるウイルス血清型からのDENeタンパク質の2つの断片により形成される。これらのキメラ鎖は、適当なベクター中に挿入されると、細菌の細胞質内に不溶性のキメラタンパク質が生じる。次にこれらのタンパク質は、DENに対する高レベルの中和抗体、ウイルス血球凝集のインヒビターを誘発し、ウイルス抗原刺激に対して免疫マウスを防御することができる。
【0008】
前記タンパク質の不溶性に関して、簡単なスケールアップ折り畳みプロセスと、ならびに Simmonsら、1998が使用したものより優れた発現と精製プロセスが、インビトロで行われた。一方、これらのタンパク質を用いてマウスを免疫することにより得られる抗体の血清型特異的が、Simmonsら、1998が使用したものより低い用量を使用して、中和、血球凝集の阻害およびELISAのレベルで証明される。この事実は、機能性免疫応答を刺激することができる大腸菌(E. coli)中の不溶性DENeタンパク質の発現についての最初の報告である。
【0009】
さらに、ダイマー変種で得られた結果を考慮すると、ウイルス感染を中和しウイルス抗原刺激に対して防御することができる、2つの異なるウイルス血清型について同じ分子を用いて血清型特異的抗体を作成することができる。MDHタンパク質について、EMBLデータベースで他の配列との相同性の検索が行われ、最初の110アミノ酸が、リポ結合ドメイン領域とジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ(ピルビン酸脱水素酵素複合体とα−セトグルタレート脱水素酵素のE2酵素)の可とう性ヒンジに非常によく似ており、タンパク質の残りの部分は、リポアミド脱水素酵素(LPDH)(該複合体の酵素E3)に非常によく似ていることが明らかになった(Stephens, P.E; H.M. Darlinson および J.R. Guest., 1983、大腸菌(E. coli)のピルビン酸脱水素酵素複合体、Eur. J. Biochem. 133:155-162)。
【0010】
一方、原発性胆汁性肝硬変(PBC)の患者は、これらのタンパク質に共通のリポ酸結合部位に特異的な抗ミトコンドリア自己抗体を産生することもわかった(Gershwin ME, Mackay IR, Sturgess A, Coppel RL、原発性胆汁性肝硬変で認識される70kDa ミトコンドリア抗原をコードするcDNAの同定と特異性、J. Immunol. 1987:138:3525-31)。従って我々は、キメラタンパク質としてヒトで免疫した時自己免疫応答を避けるように、このタンパク質内の領域を変異させることにした。我々の発明の変異したMDHタンパク質が第1相臨床試験で使用され、ヒトで安全であり免疫原性ではないことが証明され、またPBC患者の血清により認識されなかった(Perez, A., F. Dickinson, Z. Cinza, A. Rutz, T. Serrano, J. Sosa, S. Gonzalez, Y. Gutierrez, C. Nazabal, O. Gutierrez, D. Guzman, M. Diaz, M. Delgado, E. Caballero, G. Sardinas, A. Alvarez, A. Martin, G. Guillen, R. Silva、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)の組換え外膜のヒトボランティアでの安全性と予備的免疫原性、Biotech. Appl. Biochem. 34:121-125)。しかし、ヒトでのMBPの使用可能性はまだ証明されていない(Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G.、マウスでのデング2ウイルス感染に対する組換えデングエンベロープBドメイン融合タンパク質の防御効果の評価、Am J Trop Med Hyg、1998, 58:655-662)。
【0011】
発明の詳細な説明
発現ベクター中に導入された時、血清型特異的体液性免疫応答を誘導することができ、かつデング熱ウイルスによる感染に対して防御することができるキメラヌクレオチド鎖を得ることが本発明に記載され、例えば髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)からの脱水素酵素活性を有する変異タンパク質(MDH)のN末端断片に連結したデング熱ウイルスのウイルス血清型の各1つからのDENeタンパク質の領域をコードする配列;第2のケースでは、2つの異なる位置でMDHタンパク質の全遺伝子に連結したDENeタンパク質の領域をコードする配列;MDHタンパク質の構造ドメインをコードする配列の1つの部位(リポ酸結合ドメインと遺伝子の3’末端)内、および第3のケースでは、キメラ配列は、MDH遺伝子の2つの異なる位置の2つの異なるウイルス血清型(DEN−2とDEN−4)からのDENeタンパク質の2つの断片により形成される:1つは、リポ酸結合ドメインをコードする配列の特定の部位内(血清型4)、そして他の1つはMDH遺伝子の3’末端内(血清型2)。これをダイマー構築体と呼んだ。
【0012】
これらのキメラタンパク質は、細菌の細胞質内で不溶性で得られた。固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)による精製操作を行って、免疫原性試験のための純粋なタンパク質が得られた。
抗原性結果を分析すると、超免疫腹水液(HMAF)抗DENに対するすべての組換えキメラタンパク質の強い認識が証明され、全MDH遺伝子への融合の場合に高く、これは、MDHにより与えられるDENeタンパク質からの領域の折り畳みへの陽性の作用を証明している。血清型2を使用した場合には、得られたすべての組換えタンパク質は、血清型特異的中和抗体(3H5)により認識され、これも全MDH遺伝子への融合ならびにダイマータンパク質の場合に高かった。また、各場合に同種血清型からのHMAFに対する認識は、異種血清型からのHMAFに対する認識より有意に高く、血清型特異的エピトープの暴露を証明し、従ってデングの診断手段および血清型判定としての使用を可能にする。
【0013】
すべての組換えキメラタンパク質をマウスで免疫すると、中和性かつ防御性の応答が得られた。最も高い中和力価は、DENeタンパク質からの断片の位置には無関係に、MDHの全遺伝子に融合した配列とダイマータンパク質とで得られた。これは、得られた抗原性結果に反映されるDENeタンパク質の折り畳みへの影響により説明される、MDHにより仲介される免疫応答の免疫増強作用を示した。これはまた、先行技術とは異なり、これらのタンパク質の不溶性が、適当な免疫応答を生成する能力に影響を与えないことを初めて証明した。
【0014】
すべての場合で生じた免疫応答は、ウイルス中和、血球凝集阻害およびELISAにおいて、血清型特異的(免疫した同種の血清型に対する抗体)であった。血清型特異的抗体の生成は、これらが、免疫増強現象を促進する異種血清型のウイルスからの抗原決定基を認識できないことを意味する。異種血清型に対する抗体の認識は、出血性デング熱(HDF)の原因の1つである可能性があるため、この特徴は、ワクチン候補の開発にとって非常に重要である。
さらに、キメラタンパク質の1つのみで免疫した後の2つのウイルス血清型に対する抗体の誘導が証明され、これは、我々の利用可能な組換えキメラタンパク質の2つのみを使用して、4つの血清型に対するワクチン候補の調製を可能にする。
【0015】
変異MDHタンパク質の入手は、リジン残基(K)のイプシロンアミン残基を用いる脂肪酸の共有結合に基づく、配列ETDKAT中のリポ酸結合部位の除去からなる(Tuaillon N, Andre C, Briand JP ら、原発性胆汁性肝硬変における抗M2自己抗体により特異的に認識されるジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼのリポリル合成オクタデカペプチド、J. Immunol. 1992; 148:445-50)。
一対のプライマーを用いるPCRによりタンパク質のN末端領域(lpdA遺伝子の開始コドンからリポ酸結合部位まで、135bp)およびC末端(リポ酸結合部位から遺伝子の3’末端まで)を増幅して、突然変異誘発を行い、こうしてヒトの臨床治験で証明されるように、自己免疫反応が生じる可能性を排除した。
【0016】
生物学的物質の寄託
プラスミドPLL1、PLL2、PLL3、PLH1、PLH2、PLH3、PAZ1、PAZ2、PAZ3、PlD1、PlD2、およびPlD3を、ブダペスト条約に従って、ベルギーの微生物保存機関(Belgian Coordinated collection of Microorganism − BCCM(登録商標)、LMBP−COLLECTION)に、日付と受け入れ番号(未決定)で寄託した。
【0017】
結果の例
実施例1.PLL1の入手
DEN−2ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号22)を、DEN−2ウイルス株遺伝子型ジャマイカ(Jamaica)(Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W.、デング2型ウイルス、ジャマイカ遺伝子型の非構造タンパク質のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列:完全長ゲノムの比較分析、Virology 1988, 165:234-244)からの配列1と配列2として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM108 HisプラスミドをXbaI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHのN末端領域と6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列23)。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分(junction)をチェックした。選択したクローン(pLL1と呼ぶ、図1と配列番号24)を用いて、コンピタントな細胞W3110(Hill C.W., Harnish B.W. 1982、大腸菌(E. coli)における重複rRNA遺伝子により結合した染色体セグメントの転位、J. Bacteriol. 149:449-457)を形質転換した。ルリアベルタニ(Luria Bertani)(LB)培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果25kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の10%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質のN末端領域とDEN−2ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAFに含有されるポリクローナル抗体(PA)抗DEN−2による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をPLL1と命名した(配列番号25)。
【0018】
実施例2.PLL1タンパク質の精製
PLL1で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、6M尿素でタンパク質を抽出し、上清(PLL1タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。50mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をG−25カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液(100mM NaCl、2mM KCl2、10mM Na2HPO4、pH7.2、1mM KH2PO4)(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【0019】
実施例3.PLL1の抗原性解析
PLL1の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表1)。
【0020】
Figure 2004537306
* 全部で10μgの精製PLL1を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
【0021】
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−2で得られた。この結果は、クローン化した領域が血清型2に属するという事実に一致する。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型2の場合より、低下する順序で小さかった:DEN−1、DEN−3およびDEN−4。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。一方、Mab 3H5は確かに反応性を有した。試料を還元するとシグナルが失われたため、ウェスタンブロッティングによるこの認識は、ジスルフィド結合に依存した。最後に、DEN−2に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【0022】
実施例4.PLL1が生成する抗体応答の性状解析
全部で25匹のBalb/cマウスを、35μgのフロイントアジュバント中の精製PLL1で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−2に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表2と表5)。さらに、血球凝集阻害測定(HIA)を行い、陽性力価はDEN−2に対してのみ見いだされた(表3と表5)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−2に対して中和力価1:320が得られた。しかし、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表4と表5)。これらの結果は、PLL1に誘発された抗体の高い血清型特異性を示す。
【0023】
Figure 2004537306
【0024】
Figure 2004537306
* HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【0025】
Figure 2004537306
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0026】
Figure 2004537306
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0027】
実施例5.PLL2の入手
DEN−2ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号22)を、DEN−2ウイルス株遺伝子型ジャマイカ(Jamaica)(Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W.、デング2型ウイルス、ジャマイカ遺伝子型の非構造タンパク質のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列:完全長ゲノムの比較分析、Virology 1988, 165:234-244)からの配列1と配列3として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
【0028】
pM84 HisプラスミドをXbaI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHタンパク質と6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列26)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pLL2と呼ぶ、図2と配列番号27)を用いて、コンピタントな細胞MM294(Hanahan D. 1983, プラスミドによる大腸菌(Escherichia coli)の形質転換に関する研究、J. Mol. Biol. 166:557-580)を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の10%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−2ウイルスからのDENeタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、HMAF 抗DEN−2による免疫ブロッティングで認識され、PLL2と命名した(配列番号28)。
【0029】
実施例6.PLL2タンパク質の精製
PLL2で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。可溶性画分から、あらかじめCu++イオンを結合させたキレート−セファロースFFカラムを使用して、金属イオン親和性クロマトグラフィーを行った。15mMイミダゾールでカラムを洗浄し、100mM イミダゾールでタンパク質を抽出した。一方、不溶性画分に結合したタンパク質は、8M尿素を使用して抽出し、上清(PLL2タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。100mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、各型のタンパク質の純粋な画分をG−25カラムにのせて、調製緩衝液(100mM NaCl、2mM KCl2、10mM Na2HPO4、pH7.2、1mM KH2PO4)(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【0030】
実施例7.PLL2の抗原性解析
PLL2の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表6)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−2で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型2の場合より、低下する順序で小さかった:DEN−1、DEN−3およびDEN−4。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。しかし、Mab 3H5に関連して、ドットブロットおよびウェスタンブロットにより大きな反応性が観察された(PLL1で得られたものより大きい)。PLL1の結果とは反対に、還元剤が試料中に存在する時Mab 3H5による認識は同じであり、両方のタンパク質間のコンフォメーションの差の可能性を示している。最後に、DEN−2に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【0031】
Figure 2004537306
* 全部で10μgの精製PLL2を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
【0032】
実施例8.PLL2が生成する抗体応答の性状解析
全部で25匹のBalb/cマウスを、35μgのフロイントアジュバント中の精製PLL2で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−2に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表7と表10)。さらに、血球凝集阻害測定(HIA)を行い、陽性力価はDEN−2に対してのみ見いだされた(表8と表10)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−2に対して中和力価1:1280が得られた。PLL1を用いて得られた結果と同様に、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表9と表10)。一方、両方のPLL2変種で得られた結果は同様であり、タンパク質の溶解性状態は、機能性抗体を生成する能力に影響を与えないことを示す。
【0033】
Figure 2004537306
【0034】
Figure 2004537306
* HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【0035】
Figure 2004537306
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0036】
Figure 2004537306
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0037】
実施例9.pLL3の入手
DEN−2ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号22)を、DEN−2ウイルス株遺伝子型ジャマイカ(Jamaica)(Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W.、デング2型ウイルス、ジャマイカ遺伝子型の非構造タンパク質のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列:完全長ゲノムの比較分析、Virology 1988, 165:234-244)からの配列4と配列5として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pD4プラスミドをBamHI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHタンパク質と停止コドンの無い6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列29)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質のC末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pLL3と呼ぶ、図3と配列番号30)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−2ウイルスからのDENeタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、HMAF1 抗DEN−2による免疫ブロッティングで認識され、PLL3と命名した(配列番号31)。
【0038】
実施例10.PLL3タンパク質の精製
PLL2で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分から、6M尿素を使用してタンパク質を抽出し、上清(PLL3タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。30mMイミダゾールで洗浄し、タンパク質を100mMイミダゾールで溶出した。最後に、タンパク質の純粋な画分をG−25カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【0039】
実施例11.PLL3の抗原性解析
PLL3の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表11)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−2で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型2の場合より、低下する順序で小さかった:DEN−1、DEN−3およびDEN−4。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。しかし、Mab 3H5に関連して、ドットブロットおよびウェスタンブロットにより大きな反応性が観察された(PLL2で得られたものより大きい)。PLL1の結果とは反対に、還元剤が試料中に存在する時Mab 3H5による認識は同じであり、両方のタンパク質間のコンフォメーションの差の可能性を示している。最後に、DEN−2に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。これらの結果は、PLL2で得られたものと同様であった。
【0040】
Figure 2004537306
* 全部で10μgの精製PLL3を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
【0041】
実施例12.PLL3が生成する抗体応答の性状解析
全部で25匹のBalb/cマウスを、35μgのフロイントアジュバント中の精製PLL3で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−2に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表12と表15)。さらに、血球凝集阻害(HI)測定を行い、陽性力価はDEN−2に対してのみ見いだされた(表13と表15)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−2に対して中和力価1:1280が得られた(表14)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表15)。3つの試験を使用して、高レベルの血清型特異的抗体が検出され、PLL2タンパク質で免疫した後に得られたものと同様であった。
【0042】
Figure 2004537306
【0043】
Figure 2004537306
* HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【0044】
Figure 2004537306
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0045】
Figure 2004537306
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0046】
実施例13.pLH1の入手
DEN−1ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号32)を、DEN−1ウイルス株遺伝子型(Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.、デング1ウイルス株の構造タンパク質遺伝子間の遺伝的関連性、J. Gen. Virol. 1989, 70:1701-1712)からの配列6と配列7として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM108プラスミドをXbaI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHのN末端領域と6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列23)。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pLH1と呼ぶ、図4と配列番号33)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。ルリアベルタニ(Luria Bertani)(LB)培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果25kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の10%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質のN末端領域とDEN−1ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAFに含有されるポリクローナル抗体(PA)抗DEN−1による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をPLH1と命名した(配列番号34)。
【0047】
実施例14.PLH1タンパク質の精製
pLH1で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、7M尿素でタンパク質を抽出し、上清(PLH1タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。60mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をG−25カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【0048】
実施例15.PLH1の抗原性解析
PLH1の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表16)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−1で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型1の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−1に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【0049】
Figure 2004537306
* 全部で10μgの精製PLH1を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
【0050】
実施例16.PLH1が生成する抗体応答の性状解析
全部で25匹のBalb/cマウスを、35μgのフロイントアジュバント中の精製PLL1で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−1に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表17と表20)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−1に対してのみ見いだされた(表18と表20)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−1に対して中和力価1:320が得られた。しかし、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表19と表20)。これらの結果は、PLL1に誘発された抗体の高い血清型特異性を示す。
【0051】
Figure 2004537306
Figure 2004537306
* HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【0052】
Figure 2004537306
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0053】
Figure 2004537306
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0054】
実施例17.pLH2の入手
DEN−1ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号32)を、DEN−1ウイルス株(Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.、デング1ウイルス株の構造タンパク質遺伝子間の遺伝的関連性、J. Gen. Virol. 1989, 70:1701-1712)からの配列6と配列8として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM84 HisプラスミドをXbaI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHのN末端領域と6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列26)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pLH2と呼ぶ、図5と配列番号35)を用いて、コンピタントな細胞MM294を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−1ウイルスからのDENeタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、HMAF抗DEN−1による免疫ブロッティングで認識され、このタンパク質をPLH2と命名した(配列番号36)。
【0055】
実施例18.PLH2タンパク質の精製
PLL2で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分に結合したタンパク質を、7M尿素を使用して抽出し、上清(PLH2タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。40mMイミダゾールでカラムを洗浄し、100mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をG−25カラムにのせて、調製物を調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【0056】
実施例19.PLH2の抗原性解析
PLH2の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表21)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−1で得られた(PLH1で得られたものより高い)。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型1の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−1に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【0057】
Figure 2004537306
* 全部で10μgの精製PLH2を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
【0058】
実施例20.PLH2が生成する抗体応答の性状解析
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PLH2で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−1に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表22と表25)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−1に対してのみ見いだされた(表23と表25)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−1に対して中和力価1:1280が得られた(表24)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表25)。
【0059】
Figure 2004537306
【0060】
Figure 2004537306
* HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【0061】
Figure 2004537306
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0062】
Figure 2004537306
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0063】
実施例21.pLH3の入手
DEN−1ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号32)を、DEN−1ウイルス株(Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.、デング1ウイルス株の構造タンパク質遺伝子間の遺伝的関連性、J. Gen. Virol. 1989, 70:1701-1712)からの配列9と配列10として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pD4プラスミドをBamHI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHタンパク質をコードするヌクレオチド配列と停止コドンの無い6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列29)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質のC末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pLH3と呼ぶ、図6と配列番号37)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−1ウイルスからのDENeタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、HMAF 抗DEN−1による免疫ブロッティングで認識され、PLH3と命名した(配列番号38)。
【0064】
実施例22.PLH3タンパク質の精製
pLH3で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分から、6M尿素を使用してタンパク質を抽出し、上清(PLH3タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。30mMイミダゾールで洗浄し、タンパク質を250mMイミダゾールで溶出した。最後に、タンパク質の純粋な画分をG−25カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【0065】
実施例23.PLH3の抗原性解析
PLH3の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表26)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−1で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型1の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−1に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【0066】
Figure 2004537306
* 全部で10μgの精製PLH3を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
【0067】
実施例24.PLH3が生成する抗体応答の性状解析
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PLH3で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−1に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表27と表30)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−1に対してのみ見いだされた(表28と表30)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−1に対して中和力価1:1280が得られた(表29)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表30)。
【0068】
Figure 2004537306
【0069】
Figure 2004537306
* HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【0070】
Figure 2004537306
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0071】
Figure 2004537306
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0072】
実施例25.pAZ1の入手
DEN−3ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号39)を、DEN−3ウイルス株遺伝子型(Osatomi K., Sumiyoshi H. デング3型ウイルスゲノムRNAの完全なヌクレオチド配列、Virology 1990, 176(2):643-647)からの配列11と配列12として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM108 HisプラスミドをXbaI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHのN末端領域と6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列23)。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pAZ1と呼ぶ、図7と配列番号40)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。ルリアベルタニ(Luria Bertani)(LB)培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果25kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の10%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質のN末端領域とDEN−3ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAFに含有されるポリクローナル抗体(PA)抗DEN−3による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をPAZ1と命名した(配列番号41)。
【0073】
実施例26.PAZ1タンパク質の精製
pAZ1で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、7M尿素でタンパク質を抽出し、上清(PLH1タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。60mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をG−25カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【0074】
実施例27.PAZ1の抗原性解析
PAZ1の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表31)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−3で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型3の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−3に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【0075】
Figure 2004537306
* 全部で10μgの精製PAZ1を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
【0076】
実施例28.PAZ1が生成する抗体応答の性状解析
全部で25匹のBalb/cマウスを、35μgのフロイントアジュバント中の精製PAZ1で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−1に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表32と表35)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−3に対してのみ見いだされた(表33と表35)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−3に対して中和力価1:320が得られた。しかし、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表34と表35)。これらの結果は、PAZ1に誘発された抗体の高い血清型特異性を示す。
【0077】
Figure 2004537306
【0078】
Figure 2004537306
* HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【0079】
Figure 2004537306
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0080】
Figure 2004537306
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0081】
実施例29.PAZ2の入手
DEN−3ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号39)を、DEN−3ウイルス株遺伝子型(Osatomi K., Sumiyoshi H. デング3型ウイルスゲノムRNAの完全なヌクレオチド配列、Virology 1990, 176(2):643-647)からの配列11と配列13として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM84 HisプラスミドをXbaI/EcoRIで消化してベクターを作成し、これは、MDHタンパク質をコードするヌクレオチド配列と6つのヒスチジンの配列をコードするヌクレオチド配列とを含有する(配列26)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pAZ2と呼ぶ、図8と配列番号42)を用いて、コンピタントな細胞MM294を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−3ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAF抗DEN−3による免疫ブロッティングで認識され、PAZ2と命名した(配列番号43)。
【0082】
実施例30.PAZ2タンパク質の精製
PAZ2で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分に結合したタンパク質を、7M尿素を使用して抽出し、上清(PAZ2タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。カラムを40mMイミダゾールで洗浄し、100mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をG−25カラムにのせて、調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【0083】
実施例31.PAZ2の抗原性解析
PAZ2の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表36)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−3で得られた(PAZ1で得られたものより高い)。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型3の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−3に対する高力価の5つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【0084】
Figure 2004537306
* 全部で10μgの精製PAZ2を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
【0085】
実施例32.PAZ2が生成する抗体応答の性状解析
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PAZ2で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−3に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表37と表40)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−3に対してのみ見いだされた(表38と表40)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−3に対して中和力価1:1280が得られた(表39)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表40)。
【0086】
Figure 2004537306
【0087】
Figure 2004537306
* HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【0088】
Figure 2004537306
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0089】
Figure 2004537306
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0090】
実施例33.pAZ3の入手
DEN−3ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号39)を、DEN−3ウイルス株(Osatomi K., Sumiyoshi H. デング3型ウイルスゲノムRNAの完全なヌクレオチド配列、Virology 1990, 176(2):643-647)からの配列14と配列15として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pD4プラスミドをBamHI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHタンパク質をコードするヌクレオチド配列と停止コドンの無い6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列29)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質のC末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pAZ3と呼ぶ、図9と配列番号44)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−3ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAF抗DEN−3による免疫ブロッティングで認識され、PAZ3と命名した(配列番号45)。
【0091】
実施例34.PAZ3タンパク質の精製
PAZ3で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分から、タンパク質を7M尿素を使用して抽出し、上清(PAZ3タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。カラムを45mMイミダゾールで洗浄し、230mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、タンパク質の純粋な画分をG−25カラムにのせて、調製緩衝液(PBS)中のタンパク質を得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【0092】
実施例35.PAZ3の抗原性解析
PAZ3の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表26)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−3で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型3の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−3に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【0093】
Figure 2004537306
* 全部で10μgの精製PAZ3を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
【0094】
実施例36.PAZ3が生成する抗体応答の性状解析
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PAZ3で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−3に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表42と表45)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−3に対してのみ見いだされた(表43と表45)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−3に対して中和力価1:1280が得られた(表44)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表45)。
【0095】
Figure 2004537306
【0096】
Figure 2004537306
* HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【0097】
Figure 2004537306
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0098】
Figure 2004537306
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0099】
実施例37.plD1の入手
DEN−4ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号46)を、DEN−4ウイルス株遺伝子型(Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング4型ウイルスDNA配列のクローニング:構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88)からの配列17と配列18として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM108 His プラスミドをXbaI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHのN末端領域と6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列23)。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(plD1と呼ぶ、図10と配列番号47)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。ルリアベルタニ(LB)培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果25kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の10%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−4ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAF中に含有されるポリクローナル抗体(PA)抗DEN−4による免疫ブロッティングで認識され、plD1と命名した(配列番号48)。
【0100】
実施例38.PlD1タンパク質の精製
plD1で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、6M尿素でタンパク質を抽出し、上清(PlD1タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。60mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をG−25カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【0101】
実施例39.PlD1の抗原性解析
PlD1の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表46)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−4で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型4の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−4に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【0102】
Figure 2004537306
* 全部で10μgの精製PlD1を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
【0103】
実施例40.PlD1が生成する抗体応答の性状解析
全部で25匹のBalb/cマウスを、35μgのフロイントアジュバント中の精製PlD1で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−1に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表47と表50)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−4に対してのみ見いだされた(表48と表50)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−4に対して中和力価1:320が得られた。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表49と表50)。これらの結果は、PlD1により誘発される抗体の高い血清型特異性を示す。
【0104】
Figure 2004537306
【0105】
Figure 2004537306
* HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【0106】
Figure 2004537306
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0107】
Figure 2004537306
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0108】
実施例41.plD2の入手
DEN−4ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号46)を、DEN−4ウイルス株(Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング4型ウイルスDNA配列のクローニング:構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88)からの配列16と配列18として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM84 HisプラスミドをXbaI/EcoRIで消化してベクターを作成し、これは、MDHタンパク質をコードするヌクレオチド配列と6つのヒスチジンの配列をコードするヌクレオチド配列とを含有する(配列26)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(plD2と呼ぶ、図11と配列番号49)を用いて、コンピタントな細胞MM294を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−4ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAF抗DEN−4による免疫ブロッティングで認識され、PlD2と命名した(配列番号50)。
【0109】
実施例42.PlD2タンパク質の精製
plD2で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分に結合したタンパク質を6M尿素を使用して抽出し、上清(PlD2タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。カラムを30mMイミダゾールで洗浄し、250mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をG−25カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【0110】
実施例43.PlD2の抗原性解析
PlD2の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表51)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−4で得られた(PlD1で得られたものより高い)。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型4の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−3に対する高力価の5つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【0111】
Figure 2004537306
* 全部で10μgの精製PlD2を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
【0112】
実施例44.PlD2が生成する抗体応答の性状解析
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PlD2で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−4に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表52と表55)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−4に対してのみ見いだされた(表53と表55)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−4に対して中和力価1:1280が得られた(表54)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表55)。
【0113】
Figure 2004537306
【0114】
Figure 2004537306
* HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【0115】
Figure 2004537306
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0116】
Figure 2004537306
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0117】
実施例45.plD3の入手
DEN−4ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号46)を、DEN−4ウイルス株(Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング4型ウイルスDNA配列のクローニング:構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88)からの配列19と配列20として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pD4プラスミドをBamHI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHタンパク質をコードするヌクレオチド配列と6つのヒスチジンの配列をコードするヌクレオチド配列とを含有する(配列29)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質のC末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(plD3と呼ぶ、図12と配列番号51)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−4ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAF抗DEN−4による免疫ブロッティングで認識され、PlD3と命名した(配列番号52)。
【0118】
実施例46.PlD3タンパク質の精製
plD3で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分から、タンパク質を6M尿素を使用して抽出し、上清(PlD3タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。カラムを45mMイミダゾールで洗浄し、200mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をG−25カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【0119】
実施例47.PlD3の抗原性解析
PlD3の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表56)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−4で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型4の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−4に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【0120】
Figure 2004537306
* 全部で10μgの精製PlD3を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
【0121】
実施例48.PlD3が生成する抗体応答の性状解析
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PAZ3で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−4に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表57と表60)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−4に対してのみ見いだされた(表58と表60)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−4に対して中和力価1:1280が得られた(表59)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表60)。
【0122】
Figure 2004537306
【0123】
Figure 2004537306
* HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【0124】
Figure 2004537306
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0125】
Figure 2004537306
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0126】
実施例49.pD4D2の入手
DEN−4ウイルスからのEタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号46)を、DEN−4ウイルス株(Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング4型ウイルスDNA配列のクローニング:構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88)からの配列16と配列21として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pLL3プラスミドをXbaI/XbaIで消化してベクターを作成し、これは、MDH遺伝子と、この遺伝子の3’領域の6つのヒスチジンの配列および3’末端中のDEN−2からのE断片の配列とを含有する。その結果、同じMDH遺伝子に融合した、血清型2と4からEタンパク質の2つの領域が得られた。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pD4D2と呼ぶ、図13と配列番号53)を用いて、コンピタントな細胞MM294を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果110kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とデング熱ウイルスからのDENeタンパク質の2つの断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAFに含有されるポリクローナル抗体抗DEN−2と抗DEN−4による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をPD4D2と命名した(配列番号54)。
【0127】
実施例50.PD4D2タンパク質の精製
pD4D2で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が可溶性または不溶性で得られた。ペレットからタンパク質を6M尿素を使用して抽出し、上清(PD4D2タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。30mMイミダゾールで洗浄工程を行い、250mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をG−25カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液中に得て、これを免疫学的試験に使用した。
【0128】
実施例51.PD4D2の抗原性解析
PD4D2の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表61)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−2と抗DEN−4で得られた。他の2つの血清型の認識は、血清型2と4の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。一方、PLL2とPLL3について得られたものと同様に、Mab 3H5は確かに反応性を有した。最後に、DEN−2とDEN−4に対する高力価と低力価のヒト血清に対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【0129】
Figure 2004537306
* 全部で10μgの精製P4D2を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
【0130】
実施例52.PD4D2が生成する抗体応答の性状解析
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PD4D2で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−2とDEN−4に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表62と表65)。さらに、血球凝集阻害測定(HI)を行い、陽性力価はDEN−2とDEN−4に対してのみ見いだされた(表63と表65)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−2に対して中和力価>1:1280およびDEN−4に対して>1:1280が得られた(表64)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表65)。
【0131】
Figure 2004537306
【0132】
Figure 2004537306
* HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【0133】
Figure 2004537306
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0134】
Figure 2004537306
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
【0135】
実施例53.防御測定法
同種の致死的DENで抗原刺激したすべての測定した変種で免疫したマウスに付与される防御の評価のために、各群15匹のマウスを使用した。各動物に、致死的DENの100 LD50を1回頭蓋内接種し、21日間観察して致死率を調べた。陽性対照として、4つのウイルス調製物(DEN−1、DEN−2、DEN−3およびDEN−4)で免疫した15匹のマウスの群を使用した。これらの対照群のすべてのマウスは生き残ったが、陰性対照群からのマウスは、抗原刺激の7〜11日後に病気になり、死亡率100%であった。最後に、被験融合タンパク質は、80%〜100%の防御率であり、すべての場合に、対照群と比較して大きな差があった(表66)。
【0136】
Figure 2004537306
* 計算:(生存マウスの数)/(マウスの総数)。生存したもののデータは、抗原刺激後21に取った。pD4D2で免疫したマウスの場合、15匹はDEN−4で抗原刺激し、15匹はDEN−2で抗原刺激した。
【0137】
実施例54.リンパ増殖性応答
DEN−2からのE断片を含有するキメラタンパク質(PLL1、PLL2、およびPLL3)で免疫した異なる群からの動物、およびプラセボ群を、最後の投与の15日後に屠殺した。次に、動物の脾臓を採取し、4つの血清型のデング熱ウイルスに対するリンパ増殖性応答を調べた。表67は、得られた刺激指数の結果を示し、これは、血清型特異的応答が得られたことを示す。
【0138】
Figure 2004537306
* 刺激指数:対照のDNA自発的合成の1分当たりのカウントに対する試料の1分当たりのカウント。
** 分裂促進因子:植物性血球凝集素。
【図面の簡単な説明】
【0139】
【図1】PLL1を得るためのE2断片のクローニング法。 DENe2:DEN−2のエンベロープタンパク質の断片。 N−term:MDHタンパク質の最初の45アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図2】PLL2を得るためのE2断片のクローニング法。 DENe2:DEN−2のエンベロープタンパク質の断片。 MDH:脱水素酵素変異体。
【図3】PLL3を得るためのE2断片のクローニング法。 DENe2:DEN−2のエンベロープタンパク質の断片。 MDH:脱水素酵素変異体。
【図4】PLH1を得るためのE1断片のクローニング法。 DENe1:DEN−1のエンベロープタンパク質の断片。 N−term:MDHタンパク質の最初の45アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図5】PLH2を得るためのE1断片のクローニング法。 DENe1:DEN−1のエンベロープタンパク質の断片。 N−term:MDHタンパク質の最初の45アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図6】PLH3を得るためのE1断片のクローニング法。 DENe1:DEN−1のエンベロープタンパク質の断片。 MDH:脱水素酵素変異体。
【図7】PAZ1を得るためのE3断片のクローニング法。 DENe3:DEN−3のエンベロープタンパク質の断片。 N−term:MDHタンパク質の最初の45アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図8】PAZ2を得るためのE3断片のクローニング法。 DENe3:DEN−3のエンベロープタンパク質の断片。 MDH:脱水素酵素変異体。
【図9】PAZ3を得るためのE3断片のクローニング法。 DENe3:DEN−3のエンベロープタンパク質の断片。 MDH:脱水素酵素変異体。
【図10】PlD1を得るためのE4断片のクローニング法。 DENe4:DEN−4のエンベロープタンパク質の断片。 N−term:MDHタンパク質の最初の45アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図11】PlD2を得るためのE4断片のクローニング法。 DENe4:DEN−4のエンベロープタンパク質の断片。 MDH:脱水素酵素変異体。
【図12】PlD3を得るためのE4断片のクローニング法。 DENe4:DEN−4のエンベロープタンパク質の断片。 MDH:脱水素酵素変異体。
【図13】PD4D2を得るためのクローニング法。 DENe4:DEN−4のエンベロープタンパク質の断片。 DENe2:DEN−2のエンベロープタンパク質の断片。 MDH:脱水素酵素変異体。
【0140】
Figure 2004537306
Figure 2004537306
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Claims (35)

  1. フラビウイルスからのEタンパク質の断片に対応する配列と、配列番号26、配列番号29として配列リストで特定される変異MDHタンパク質のコード遺伝子に対応する配列との、または配列番号23として特定されるこれらの断片との、特定の組合せを特徴とするキメラヌクレオチド鎖であって、これらのタンパク質が医薬調製物中に存在すると、フラビウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるキメラタンパク質をコードする、上記キメラヌクレオチド鎖。
  2. デング熱ウイルスからのEタンパク質のアミノ酸286〜426をコードする1つまたは数個の配列と、MDHタンパク質のヌクレオチド配列との特定の組合せであることを特徴とする、請求項1のキメラヌクレオチド鎖であって、これらの配列は、配列番号26、配列番号29または配列番号23として配列リストで特定される配列に、挿入および/または融合され、フラビウイルスの各血清型に対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるキメラタンパク質をコードする、上記キメラヌクレオチド鎖。
  3. 請求項1および2のキメラヌクレオチド鎖であって、配列番号23として特定される、MDHタンパク質の最初の45アミノ酸をコードする3’末端領域に融合した、デング熱ウイルスの各血清型1、2、3および4からのEタンパク質のアミノ酸286〜426のコード配列により形成されることを特徴とする、上記キメラヌクレオチド鎖。
  4. 請求項1および2のキメラヌクレオチド鎖であって、配列番号26として特定される、MDHタンパク質の45アミノ酸をコードする3’末端領域に融合した、デング熱ウイルスの各血清型1、2、3および4からのEタンパク質のアミノ酸286〜426のコード配列により形成されることを特徴とする、上記キメラヌクレオチド鎖。
  5. 請求項1および2のキメラヌクレオチド鎖であって、配列番号29として特定される、MDHタンパク質の3’末端領域に融合した、デング熱ウイルスの各血清型1、2、3および4からのEタンパク質のアミノ酸286〜426のコード配列により形成されることを特徴とする、上記キメラヌクレオチド鎖。
  6. デング熱ウイルスの2つの異なる血清型からのEタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列と、MDHの配列との組合せであることを特徴とする、請求項1および2のキメラヌクレオチド鎖であって、ここで、Eタンパク質に対応する配列の1つは、MDHタンパク質のアミノ酸45をコードする領域に挿入され、他の1つは、配列番号29として特定される、同じMDH配列の3’領域に融合されることを特徴とする、上記キメラヌクレオチド鎖。
  7. 請求項1、2、3、4、5および6のヌクレオチド鎖の発現産物であり、かつこれらのタンパク質が医薬調製物中に存在すると、デング熱ウイルスの各血清型に対して血清型特異的な中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を、受容体中で誘導できることを特徴とする、組換えキメラタンパク質。
  8. 請求項1および6のヌクレオチド鎖の発現産物であり、かつデング熱ウイルスの2つの同種の血清型に対して特異的な中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を、受容体中で誘導できることを特徴とする、キメラ組換えタンパク質。
  9. 配列番号22と配列番号23として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、請求項1、2および3の、基本的に配列番号24により特定される、キメラタンパク質PLL1をコードするキメラヌクレオチド鎖。
  10. 配列番号25として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号24の発現産物であり、かつPLL1が医薬調製物中に存在すると、デング−2ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項1、2および7のキメラタンパク質PLL1。
  11. 配列番号22と配列番号26として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号27として特定される、キメラタンパク質PLL2をコードする、請求項1、2および4のキメラヌクレオチド鎖。
  12. 配列番号28として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号27の発現産物であり、かつPLL2が医薬調製物中に存在すると、デング−2ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項1、2および7のキメラタンパク質PLL2。
  13. 配列番号22と配列番号29として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号30として特定される、キメラタンパク質PLL3をコードする、請求項1、2および5のキメラヌクレオチド鎖。
  14. 配列番号31として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号30の発現産物であり、かつPLL3が医薬調製物中に存在すると、デング−2ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項1、2および7のキメラタンパク質PLL3。
  15. 配列番号23と配列番号32として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号33として特定される、キメラタンパク質PLH1をコードする、請求項1、2および3のキメラヌクレオチド鎖。
  16. 配列番号34として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号33の発現産物であり、かつPLH1が医薬調製物中に存在すると、デング−1ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項1、2および7のキメラタンパク質PLH1。
  17. 配列番号26と配列番号32として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号35として特定される、キメラタンパク質PLH2をコードする、請求項1、2および4のキメラヌクレオチド鎖。
  18. 配列番号36として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号35の発現産物であり、かつPLH2が医薬調製物中に存在すると、デング−1ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項1、2および7のキメラタンパク質PLH2。
  19. 配列番号29と配列番号32として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号37として特定される、キメラタンパク質PLH3をコードする、請求項1、2および5のキメラヌクレオチド鎖。
  20. 配列番号38として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号37の発現産物であり、かつPLH3が医薬調製物中に存在すると、デング−1ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項1、2および7のキメラタンパク質PLH3。
  21. 配列番号23と配列番号39として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号40として特定される、キメラタンパク質PAZ1をコードする、請求項1、2および3のキメラヌクレオチド鎖。
  22. 配列番号41として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号40の発現産物であり、かつPAZ1が医薬調製物中に存在すると、デング−1ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項1、2および7のキメラタンパク質PAZ1。
  23. 配列番号26と配列番号39として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号42として特定される、キメラタンパク質PAZ2をコードする、請求項1、2および4のキメラヌクレオチド鎖。
  24. 配列番号43として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号42の発現産物であり、かつPAZ2が医薬調製物中に存在すると、デング−3ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項1、2および7のキメラタンパク質PAZ2。
  25. 配列番号29と配列番号39として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号44として特定される、キメラタンパク質PAZ3をコードする、請求項1、2および5のキメラヌクレオチド鎖。
  26. 配列番号45として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号44の発現産物であり、かつPAZ3が医薬調製物中に存在すると、デング−3ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項1、2および7のキメラタンパク質PLAZ3。
  27. 配列番号23と配列番号46として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号47として特定される、キメラタンパク質P1D1をコードする、請求項1、2および3のキメラヌクレオチド鎖。
  28. 配列番号48として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号47の発現産物であり、かつP1D1が医薬調製物中に存在すると、デング−4ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項1、2および7のキメラタンパク質P1D1。
  29. 配列番号26と配列番号46として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号49として特定される、キメラタンパク質PID2をコードする、請求項1、2および4のキメラヌクレオチド鎖。
  30. 配列番号50として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号49の発現産物であり、かつPID2が医薬調製物中に存在すると、デング−4ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項1、2および7のキメラタンパク質PID2。
  31. 配列番号29と配列番号46として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号51として特定される、キメラタンパク質PID3をコードする、請求項1、2および5のキメラヌクレオチド鎖。
  32. 配列番号52として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号51の発現産物であり、かつPID3が医薬調製物中に存在すると、デング−4ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項1、2および7のキメラタンパク質PID3。
  33. 請求項1、2、7、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30および32に記載のキメラタンパク質の2つ以上と、薬剤ビヒクルとを有することを特徴とする、請求項1の、デング熱ウイルスに対して特異的な防御性免疫応答を受容体で誘導することができる医薬調製物。
  34. 経口、筋肉内、皮下、粘膜または静脈内使用のための、デング熱ウイルスに対する予防または治療薬であることを特徴とする、請求項33の医薬調製物。
  35. デング熱ウイルスの診断と血清型判定に有用な、請求項1、2、7、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30および32に記載のタンパク質の1つまたは数個を有することを特徴とする診断手段。
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