JP2004537306A - ウイルスに対する作用を誘導するタンパク質をコードするキメラ鎖 - Google Patents
ウイルスに対する作用を誘導するタンパク質をコードするキメラ鎖 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004537306A JP2004537306A JP2003514888A JP2003514888A JP2004537306A JP 2004537306 A JP2004537306 A JP 2004537306A JP 2003514888 A JP2003514888 A JP 2003514888A JP 2003514888 A JP2003514888 A JP 2003514888A JP 2004537306 A JP2004537306 A JP 2004537306A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- protein
- chimeric
- identified
- chimeric protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 168
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 154
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title abstract description 107
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 56
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims abstract description 24
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 69
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 69
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 63
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 30
- 101100350613 Arabidopsis thaliana PLL1 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 101100082028 Arabidopsis thaliana PLL2 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 23
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 19
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 101100350628 Arabidopsis thaliana PLL3 gene Proteins 0.000 claims description 16
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims description 16
- 101100436387 Komagataella pastoris ATG8 gene Proteins 0.000 claims description 16
- 101100150245 Hordeum vulgare PAZ1 gene Proteins 0.000 claims description 15
- 101100217528 Komagataella pastoris ATG1 gene Proteins 0.000 claims description 15
- 101100243068 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) plh1 gene Proteins 0.000 claims description 15
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims description 13
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 claims description 13
- 101150109471 PID2 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 101100190466 Caenorhabditis elegans pid-3 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 6
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 2
- 241000710872 Dengue virus 3 Species 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 31
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 5
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 abstract description 4
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 148
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 69
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 65
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 65
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 40
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 40
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 40
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 40
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 39
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 38
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 36
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 34
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 31
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 29
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 29
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 29
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 26
- 241000710888 St. Louis encephalitis virus Species 0.000 description 26
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 26
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 26
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 26
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 18
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 17
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 17
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 15
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 14
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 14
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 14
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 14
- 208000000832 Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 13
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 13
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 13
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 13
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 13
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 13
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 13
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 13
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 13
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 11
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 10
- 101000609957 Homo sapiens PTB-containing, cubilin and LRP1-interacting protein Proteins 0.000 description 9
- 102100039157 PTB-containing, cubilin and LRP1-interacting protein Human genes 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 101150058595 MDH gene Proteins 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 6
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 6
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 5
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 5
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 5
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 208000009714 Severe Dengue Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 102000028526 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010028127 Dihydrolipoamide Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000009093 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010073112 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- 102000012751 Pyruvate Dehydrogenase Complex Human genes 0.000 description 2
- 108010090051 Pyruvate Dehydrogenase Complex Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 2
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108700016947 Bos taurus structural-GP Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000710815 Dengue virus 2 Species 0.000 description 1
- 101900058538 Dengue virus type 2 Envelope protein E Proteins 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000032456 Hemorrhagic Shock Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 101710175243 Major antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- -1 PAZ3 Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010049771 Shock haemorrhagic Diseases 0.000 description 1
- 101000582398 Staphylococcus aureus Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002529 anti-mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 201000002950 dengue hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 201000009892 dengue shock syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003977 lipoyl group Chemical group S1SC(C([H])([H])C(C(C(C(=O)[*])([H])[H])([H])[H])([H])[H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101150003321 lpdA gene Proteins 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108091011138 protein binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、受容体において、デング熱ウイルスによる感染に対する、血清型特異的および防御性体液性免疫応答を誘導することができ、こうして出血およびこの種の病理について記載されている臨床的合併症を引き起こす血清型非特異的ウイルス免疫増強の作用を排除することができるタンパク質をコードする、キメラ鎖の入手に関する。これらの核酸のキメラ鎖は、脱水素酵素活性を有する髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）からの変異タンパク質の遺伝子に属する断片と、デング熱ウイルスからのエンベロープ（Ｅ）タンパク質の領域をコードする断片との特定の組合せからなり、これは、発現ベクター中に挿入されると、特定の性質を有するキメラタンパク質を生じる。本発明から生じたキメラ分子は、ヒトで使用される血清型特異性の高いワクチン調製物と診断手段の入手のために、医薬品産業に適用される。
Description
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、バイオテクノロジーと医薬品産業の分野に関し、特に発現ベクター中に導入された時、デング熱ウイルス（Dengue virus）（以後ＤＥＮと呼ぶ）感染に対する血清型特異的（serotype-specific）体液性免疫応答と防御とを誘発し、このタイプの病理で言及される出血と臨床的合併症を引き起こす血清型特異的ウイルス免疫増幅の影響を避けることができるタンパク質を生成する、キメラヌクレオチド鎖を得ることに関する。
【０００２】
先行技術
デング熱ウイルス（ＤＥＮ）は、その脂質膜が３つの構造タンパク質のうちの２つ（エンベロープタンパク質（Ｅ）と膜タンパク質（Ｍ））を含有する被覆されたウイルスである。Ｅタンパク質は、第３の構造タンパク質（コアタンパク質）からなるイコサエドリック（icosaedric）ヌクレオカプシドをカバーする。このウイルスは、フラビウイルス（Flaviviridae）科に属し、４つの異なる血清型が存在する。ヒトへの伝搬は、ステゴミア（Stegomia）科に属する蚊ネッタイシマカ（Aedes aegypti）により行われる。このウイルスについてヒトで発生する疾患は、出血熱とショックを特徴とするより重症の、時に致死的な疾患（出血性デング熱とデングショック症候群（ＨＤＦ／ＤＳＳ）と呼ぶ）（Hammon WMc、フィリピンとタイにおける小児の新しい出血熱、Trans Assoc Physicians 1960:73:140-155）が出現するまでは、良性であると考えられ、デング熱または古典的デング（ＤＦ）と言われた。いくつかの疫学的研究が行われ、危険因子として、２つの異なるウイルス血清型の連続的感染を証明している（Kouri GP、Guzman MG、Brave JR、なぜキューバでデング出血熱：完全な分析。Tans Roy Soc Trop Med Hyg 1987;72:821-823）。この現象は、免疫増強により説明され、これは、標的細胞（単球）のＦc 受容体を介する細胞へのウイルス−抗体複合体の侵入を増加させることによる、ウイルス感染の増加に基づく（halstead SB、デングの病理：分子生物学の課題、Science 1988；239:476-481）。
【０００３】
生きた弱毒化ワクチンを製造するために種々の方法が開発されているが、これらのワクチンは病原性、ウイルス干渉、およびゲノム間組換えに戻ることがあるため、現在これらのワクチンの効果については多くの未解決の問題がある。また、組換え抗原は、サブユニットワクチンの可能な成分として得ることができる（Feighny, R., Borrous, J. および Putnak R.、 ウイルスの抗原刺激に対してマウスを防御する組換えバキュロウイルスを使用して作成したデング２型ウイルスエンベロープ、Am. J. Trop. Med. Hyg. 1994, 50(3). 322-328; Deubel, V., Staropoli, I., Megret, F.ら、アフィニティ精製したデング−２ウイルスエンベロープ糖タンパク質はマウス中で中和抗体と防御性免疫を誘導する、Vaccine. 1997. 15, 1946-1954）。
【０００４】
ウイルスの主要な抗原は、エンベロープタンパク質ＤＥＮｅである。このタンパク質は、ウイルス表面の主要な成分であり、細胞受容体へのウイルスの結合を仲介すると考えられている（A Heinz FX, Bergee R, Tuma Wら、モノクローナル抗体により規定されるダニ由来脳炎ウイルスの構造性糖タンパク質上のエピトープの位相的および機能的モデル、Virology. 1983; 126:525）。このタンパク質は、ダニ由来脳炎ウイルス（ＴＢＥ）と構造的相同性を有し（Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, C.ら、２Å分解能でのダニ由来脳炎ウイルスからのエンベロープ糖タンパク質、Nature 1995;375:29i1-298）、血清型間で構造的に保存されている。
【０００５】
昆虫細胞は、ベクターとしてバキュロウイルスを使用する多様な異種遺伝子の発現のために最もよく使用されている系の１つである。これらのベクターは、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２およびＤＥＮ−４の構造および非構造タンパク質のいくつかの組合せの発現のために使用されている（Matsuura, Y. Miyamoto M, Soto Tら、組換えバキュロウイルスにより発現される日本脳炎ウイルスエンベロープタンパク質の性状解析、Virology 1989;173:677-682; Deubel V, Bordier M, Megret Fら、組換えバキュロウイルスにより昆虫細胞中で発現されるカルボキシ末端切断型デング−２エンベロープタンパク質のプロセシング、分泌および免疫反応性、Virology 1991;180:440-447; Putnak R, Feighny R, Burrous J ら、組換えバキュロウイルス中で発現されるデング１ウイルスエンベロープ糖タンパク質遺伝子はマウスでウイルス中和抗体を誘発し、これらをウイルス抗原刺激から防御する、Am J Trop Med Hyg 1991;45:159-167; Feighny R, Burrous J, Putnak R. 組換えバキュロウイルスを使用して作成されたデング２型ウイルスエンベロープタンパク質はウイルス抗原刺激に対してマウスを防御する、Am J Trop Med Hyg 1994;50:322-328）。使用される他の系は、Ｅタンパク質の異なる変種を発現するドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）の細胞である（PCT/US96/07627）。これらの系で発現されるタンパク質を使用して適切な機能性応答を得られるにもかかわらず、これらはスケールアップ製造法の開発にはコストが高く、従って酵母での発現が、フラビウイルスの組換え構造タンパク質を製造するための別の方法となっている。しかし、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中で発現されるＤＮＥｅタンパク質（PCT/US96/07627；Sugrue R.J., Fu H., Howe J., Chan Y.、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）でのデング熱ウイルス構造タンパク質の発現はウイルス様粒子の生成を引き起こす、J Virol. 1997. 78, 1861-1866）の場合、発現レベルは低く、分泌されるかまたは細胞内であり、精製プロセスを妨害する。
【０００６】
平行して、細菌でいくつかの変種ＤＥＮｅタンパク質が得られている。これらの１つは、大腸菌（E. coli）のトリプトファン代謝のタンパク質に融合したＪＥＶのＥタンパク質（ＴｒｐＥ）のＣ末端部分であった。このタンパク質は、封入体として産生され、免疫検出法を使用して中和モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）により認識された。しかしこのタンパク質の純粋な調製物は中和抗体を開発することができず、ウイルス抗原刺激に対して防御することができない（Mason P.W., Zogel M.V., Semproni A.R.ら、大腸菌（E. coli）で発現されるデング１型ウイルスエンベロープとＮＳ１タンパク質の抗原構造、J Gen Virol. 1990. 71:2107-2114）。さらに、Ｅタンパク質のＣ末端断片に融合した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインＡを含有し、続いてＪＥＶの非構造タンパク質のＮ末端セグメント（ＮＳ１）を含有する、別の構築体を作成した（Srivastava A.K., Morita K., Matsuo S.ら、大腸菌（E. coli）中で発現されるプロテインＡの日本脳炎ウイルスの融合タンパク質はマウスで防御能を付与する、Microbiol Immunol. 1991. 35:863-870）。この場合、融合したタンパク質は可溶性であり、親和性クロマトグラフィーによる精製を促進する。マウスをこの純粋なタンパク質で免疫すると、高中和性抗体力価が得られ、これはまた、血球凝集を阻害し、ＪＥＶによるウイルス抗原刺激に対して防御した。黄色ブドウ球菌（S. aureus）のプロテインＡに融合したＤＥＮ−２のＤＥＮｅ領域を使用して、同様の結果が得られた（Srivastava A.K., Putnak R.J., Warren R.L., Hoke C.H.、大腸菌（Escherichia coli）中で作成したデング２型ウイルスＥとＮＳ１の融合タンパク質を用いて免疫したマウスは、致死的デングウイルス感染に対して防御される。Vaccine. 1995. 13:1251-1258）；しかし、プロテインＡの存在のためにヒトでこれらの調製物を使用することが不可能であり、これはヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する高親和性を示した。最後に、ＤＥＮ−２のＤＥＮｅタンパク質のＢドメインと大腸菌（E. coli）のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とを含有する融合タンパク質（Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G.、マウスでのデング２ウイルス感染に対する組換えデングエンベロープＢドメイン融合タンパク質の防御効果の評価、Am J Trop Med Hyg. 1998. 58:655-662）（ＭＢＰ−ＤｏｍＢと呼ぶ）が報告された。このタンパク質変種はマウスで免疫原性であり、中和抗体を誘発した。
【０００７】
我々のケースでは本発明の主題はキメラ配列を得ることに依存し、例えば第１のケースでは、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）からの脱水素酵素活性を有する変異タンパク質（ＭＤＨ）のＮ末端断片に連結したＤＥＮｅタンパク質の領域をコードする配列；第２のケースでは、２つの異なる位置でＭＤＨタンパク質の全遺伝子に連結したＤＥＮｅタンパク質の領域をコードする配列；第３のケースでは、キメラ配列は、ＭＤＨタンパク質をコードする同じ遺伝子に融合した２つの異なるウイルス血清型からのＤＥＮｅタンパク質の２つの断片により形成される。これらのキメラ鎖は、適当なベクター中に挿入されると、細菌の細胞質内に不溶性のキメラタンパク質が生じる。次にこれらのタンパク質は、ＤＥＮに対する高レベルの中和抗体、ウイルス血球凝集のインヒビターを誘発し、ウイルス抗原刺激に対して免疫マウスを防御することができる。
【０００８】
前記タンパク質の不溶性に関して、簡単なスケールアップ折り畳みプロセスと、ならびに Simmonsら、1998が使用したものより優れた発現と精製プロセスが、インビトロで行われた。一方、これらのタンパク質を用いてマウスを免疫することにより得られる抗体の血清型特異的が、Simmonsら、1998が使用したものより低い用量を使用して、中和、血球凝集の阻害およびＥＬＩＳＡのレベルで証明される。この事実は、機能性免疫応答を刺激することができる大腸菌（E. coli）中の不溶性ＤＥＮｅタンパク質の発現についての最初の報告である。
【０００９】
さらに、ダイマー変種で得られた結果を考慮すると、ウイルス感染を中和しウイルス抗原刺激に対して防御することができる、２つの異なるウイルス血清型について同じ分子を用いて血清型特異的抗体を作成することができる。ＭＤＨタンパク質について、ＥＭＢＬデータベースで他の配列との相同性の検索が行われ、最初の１１０アミノ酸が、リポ結合ドメイン領域とジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸脱水素酵素複合体とα−セトグルタレート脱水素酵素のＥ２酵素）の可とう性ヒンジに非常によく似ており、タンパク質の残りの部分は、リポアミド脱水素酵素（ＬＰＤＨ）（該複合体の酵素Ｅ３）に非常によく似ていることが明らかになった（Stephens, P.E; H.M. Darlinson および J.R. Guest., 1983、大腸菌（E. coli）のピルビン酸脱水素酵素複合体、Eur. J. Biochem. 133:155-162）。
【００１０】
一方、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の患者は、これらのタンパク質に共通のリポ酸結合部位に特異的な抗ミトコンドリア自己抗体を産生することもわかった（Gershwin ME, Mackay IR, Sturgess A, Coppel RL、原発性胆汁性肝硬変で認識される７０kDa ミトコンドリア抗原をコードするｃＤＮＡの同定と特異性、J. Immunol. 1987:138:3525-31）。従って我々は、キメラタンパク質としてヒトで免疫した時自己免疫応答を避けるように、このタンパク質内の領域を変異させることにした。我々の発明の変異したＭＤＨタンパク質が第１相臨床試験で使用され、ヒトで安全であり免疫原性ではないことが証明され、またＰＢＣ患者の血清により認識されなかった（Perez, A., F. Dickinson, Z. Cinza, A. Rutz, T. Serrano, J. Sosa, S. Gonzalez, Y. Gutierrez, C. Nazabal, O. Gutierrez, D. Guzman, M. Diaz, M. Delgado, E. Caballero, G. Sardinas, A. Alvarez, A. Martin, G. Guillen, R. Silva、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）の組換え外膜のヒトボランティアでの安全性と予備的免疫原性、Biotech. Appl. Biochem. 34:121-125）。しかし、ヒトでのＭＢＰの使用可能性はまだ証明されていない（Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G.、マウスでのデング２ウイルス感染に対する組換えデングエンベロープＢドメイン融合タンパク質の防御効果の評価、Am J Trop Med Hyg、1998, 58:655-662）。
【００１１】
発明の詳細な説明
発現ベクター中に導入された時、血清型特異的体液性免疫応答を誘導することができ、かつデング熱ウイルスによる感染に対して防御することができるキメラヌクレオチド鎖を得ることが本発明に記載され、例えば髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）からの脱水素酵素活性を有する変異タンパク質（ＭＤＨ）のＮ末端断片に連結したデング熱ウイルスのウイルス血清型の各１つからのＤＥＮｅタンパク質の領域をコードする配列；第２のケースでは、２つの異なる位置でＭＤＨタンパク質の全遺伝子に連結したＤＥＮｅタンパク質の領域をコードする配列；ＭＤＨタンパク質の構造ドメインをコードする配列の１つの部位（リポ酸結合ドメインと遺伝子の３’末端）内、および第３のケースでは、キメラ配列は、ＭＤＨ遺伝子の２つの異なる位置の２つの異なるウイルス血清型（ＤＥＮ−２とＤＥＮ−４）からのＤＥＮｅタンパク質の２つの断片により形成される：１つは、リポ酸結合ドメインをコードする配列の特定の部位内（血清型４）、そして他の１つはＭＤＨ遺伝子の３’末端内（血清型２）。これをダイマー構築体と呼んだ。
【００１２】
これらのキメラタンパク質は、細菌の細胞質内で不溶性で得られた。固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製操作を行って、免疫原性試験のための純粋なタンパク質が得られた。
抗原性結果を分析すると、超免疫腹水液（ＨＭＡＦ）抗ＤＥＮに対するすべての組換えキメラタンパク質の強い認識が証明され、全ＭＤＨ遺伝子への融合の場合に高く、これは、ＭＤＨにより与えられるＤＥＮｅタンパク質からの領域の折り畳みへの陽性の作用を証明している。血清型２を使用した場合には、得られたすべての組換えタンパク質は、血清型特異的中和抗体（３Ｈ５）により認識され、これも全ＭＤＨ遺伝子への融合ならびにダイマータンパク質の場合に高かった。また、各場合に同種血清型からのＨＭＡＦに対する認識は、異種血清型からのＨＭＡＦに対する認識より有意に高く、血清型特異的エピトープの暴露を証明し、従ってデングの診断手段および血清型判定としての使用を可能にする。
【００１３】
すべての組換えキメラタンパク質をマウスで免疫すると、中和性かつ防御性の応答が得られた。最も高い中和力価は、ＤＥＮｅタンパク質からの断片の位置には無関係に、ＭＤＨの全遺伝子に融合した配列とダイマータンパク質とで得られた。これは、得られた抗原性結果に反映されるＤＥＮｅタンパク質の折り畳みへの影響により説明される、ＭＤＨにより仲介される免疫応答の免疫増強作用を示した。これはまた、先行技術とは異なり、これらのタンパク質の不溶性が、適当な免疫応答を生成する能力に影響を与えないことを初めて証明した。
【００１４】
すべての場合で生じた免疫応答は、ウイルス中和、血球凝集阻害およびＥＬＩＳＡにおいて、血清型特異的（免疫した同種の血清型に対する抗体）であった。血清型特異的抗体の生成は、これらが、免疫増強現象を促進する異種血清型のウイルスからの抗原決定基を認識できないことを意味する。異種血清型に対する抗体の認識は、出血性デング熱（ＨＤＦ）の原因の１つである可能性があるため、この特徴は、ワクチン候補の開発にとって非常に重要である。
さらに、キメラタンパク質の１つのみで免疫した後の２つのウイルス血清型に対する抗体の誘導が証明され、これは、我々の利用可能な組換えキメラタンパク質の２つのみを使用して、４つの血清型に対するワクチン候補の調製を可能にする。
【００１５】
変異ＭＤＨタンパク質の入手は、リジン残基（Ｋ）のイプシロンアミン残基を用いる脂肪酸の共有結合に基づく、配列ＥＴＤＫＡＴ中のリポ酸結合部位の除去からなる（Tuaillon N, Andre C, Briand JP ら、原発性胆汁性肝硬変における抗Ｍ２自己抗体により特異的に認識されるジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼのリポリル合成オクタデカペプチド、J. Immunol. 1992; 148:445-50）。
一対のプライマーを用いるＰＣＲによりタンパク質のＮ末端領域（ｌｐｄＡ遺伝子の開始コドンからリポ酸結合部位まで、１３５bp）およびＣ末端（リポ酸結合部位から遺伝子の３’末端まで）を増幅して、突然変異誘発を行い、こうしてヒトの臨床治験で証明されるように、自己免疫反応が生じる可能性を排除した。
【００１６】
生物学的物質の寄託
プラスミドＰＬＬ１、ＰＬＬ２、ＰＬＬ３、ＰＬＨ１、ＰＬＨ２、ＰＬＨ３、ＰＡＺ１、ＰＡＺ２、ＰＡＺ３、ＰｌＤ１、ＰｌＤ２、およびＰｌＤ３を、ブダペスト条約に従って、ベルギーの微生物保存機関（Belgian Coordinated collection of Microorganism − ＢＣＣＭ（登録商標）、ＬＭＢＰ−ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ）に、日付と受け入れ番号（未決定）で寄託した。
【００１７】
結果の例
実施例１．ＰＬＬ１の入手
ＤＥＮ−２ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号２２）を、ＤＥＮ−２ウイルス株遺伝子型ジャマイカ（Jamaica）（Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W.、デング２型ウイルス、ジャマイカ遺伝子型の非構造タンパク質のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列：完全長ゲノムの比較分析、Virology 1988, 165:234-244）からの配列１と配列２として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ１０８ ＨｉｓプラスミドをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨのＮ末端領域と６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２３）。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分（junction）をチェックした。選択したクローン（ｐＬＬ１と呼ぶ、図１と配列番号２４）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０（Hill C.W., Harnish B.W. 1982、大腸菌（E. coli）における重複ｒＲＮＡ遺伝子により結合した染色体セグメントの転位、J. Bacteriol. 149:449-457）を形質転換した。ルリアベルタニ（Luria Bertani）（ＬＢ）培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果２５kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の１０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質のＮ末端領域とＤＥＮ−２ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦに含有されるポリクローナル抗体（ＰＡ）抗ＤＥＮ−２による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をＰＬＬ１と命名した（配列番号２５）。
【００１８】
実施例２．ＰＬＬ１タンパク質の精製
ＰＬＬ１で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、６Ｍ尿素でタンパク質を抽出し、上清（ＰＬＬ１タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。５０mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をＧ−２５カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液（１００mM ＮａＣｌ、２mM ＫＣｌ2、１０mM Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．２、１mM ＫＨ2ＰＯ4）（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００１９】
実施例３．ＰＬＬ１の抗原性解析
ＰＬＬ１の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表１）。
【００２０】
* 全部で１０μgの精製ＰＬＬ１を使用した。得られたシグナルの強度を＋から++まで評価した。
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００２１】
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−２で得られた。この結果は、クローン化した領域が血清型２に属するという事実に一致する。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型２の場合より、低下する順序で小さかった：ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。一方、Ｍａｂ ３Ｈ５は確かに反応性を有した。試料を還元するとシグナルが失われたため、ウェスタンブロッティングによるこの認識は、ジスルフィド結合に依存した。最後に、ＤＥＮ−２に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００２２】
実施例４．ＰＬＬ１が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、３５μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＬＬ１で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−２に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表２と表５）。さらに、血球凝集阻害測定（ＨＩＡ）を行い、陽性力価はＤＥＮ−２に対してのみ見いだされた（表３と表５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−２に対して中和力価１：３２０が得られた。しかし、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表４と表５）。これらの結果は、ＰＬＬ１に誘発された抗体の高い血清型特異性を示す。
【００２３】
【００２４】
* ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【００２５】
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００２６】
* 各混合物は３つの血清により作成した。
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００２７】
実施例５．ＰＬＬ２の入手
ＤＥＮ−２ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号２２）を、ＤＥＮ−２ウイルス株遺伝子型ジャマイカ（Jamaica）（Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W.、デング２型ウイルス、ジャマイカ遺伝子型の非構造タンパク質のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列：完全長ゲノムの比較分析、Virology 1988, 165:234-244）からの配列１と配列３として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
【００２８】
ｐＭ８４ ＨｉｓプラスミドをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質と６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２６）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＬＬ２と呼ぶ、図２と配列番号２７）を用いて、コンピタントな細胞ＭＭ２９４（Hanahan D. 1983, プラスミドによる大腸菌（Escherichia coli）の形質転換に関する研究、J. Mol. Biol. 166:557-580）を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の１０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−２ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ 抗ＤＥＮ−２による免疫ブロッティングで認識され、ＰＬＬ２と命名した（配列番号２８）。
【００２９】
実施例６．ＰＬＬ２タンパク質の精製
ＰＬＬ２で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。可溶性画分から、あらかじめＣｕ++イオンを結合させたキレート−セファロースＦＦカラムを使用して、金属イオン親和性クロマトグラフィーを行った。１５mMイミダゾールでカラムを洗浄し、１００mM イミダゾールでタンパク質を抽出した。一方、不溶性画分に結合したタンパク質は、８Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰＬＬ２タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。１００mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、各型のタンパク質の純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、調製緩衝液（１００mM ＮａＣｌ、２mM ＫＣｌ2、１０mM Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．２、１mM ＫＨ2ＰＯ4）（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００３０】
実施例７．ＰＬＬ２の抗原性解析
ＰＬＬ２の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−２で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型２の場合より、低下する順序で小さかった：ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。しかし、Ｍａｂ ３Ｈ５に関連して、ドットブロットおよびウェスタンブロットにより大きな反応性が観察された（ＰＬＬ１で得られたものより大きい）。ＰＬＬ１の結果とは反対に、還元剤が試料中に存在する時Ｍａｂ ３Ｈ５による認識は同じであり、両方のタンパク質間のコンフォメーションの差の可能性を示している。最後に、ＤＥＮ−２に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００３１】
* 全部で１０μgの精製ＰＬＬ２を使用した。得られたシグナルの強度を＋から++まで評価した。
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００３２】
実施例８．ＰＬＬ２が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、３５μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＬＬ２で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−２に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表７と表１０）。さらに、血球凝集阻害測定（ＨＩＡ）を行い、陽性力価はＤＥＮ−２に対してのみ見いだされた（表８と表１０）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−２に対して中和力価１：１２８０が得られた。ＰＬＬ１を用いて得られた結果と同様に、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表９と表１０）。一方、両方のＰＬＬ２変種で得られた結果は同様であり、タンパク質の溶解性状態は、機能性抗体を生成する能力に影響を与えないことを示す。
【００３３】
【００３４】
* ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【００３５】
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００３６】
* 各混合物は３つの血清により作成した。
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００３７】
実施例９．ｐＬＬ３の入手
ＤＥＮ−２ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号２２）を、ＤＥＮ−２ウイルス株遺伝子型ジャマイカ（Jamaica）（Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W.、デング２型ウイルス、ジャマイカ遺伝子型の非構造タンパク質のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列：完全長ゲノムの比較分析、Virology 1988, 165:234-244）からの配列４と配列５として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＤ４プラスミドをＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質と停止コドンの無い６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２９）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質のＣ末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＬＬ３と呼ぶ、図３と配列番号３０）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−２ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ１ 抗ＤＥＮ−２による免疫ブロッティングで認識され、ＰＬＬ３と命名した（配列番号３１）。
【００３８】
実施例１０．ＰＬＬ３タンパク質の精製
ＰＬＬ２で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分から、６Ｍ尿素を使用してタンパク質を抽出し、上清（ＰＬＬ３タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。３０mMイミダゾールで洗浄し、タンパク質を１００mMイミダゾールで溶出した。最後に、タンパク質の純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００３９】
実施例１１．ＰＬＬ３の抗原性解析
ＰＬＬ３の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表１１）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−２で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型２の場合より、低下する順序で小さかった：ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。しかし、Ｍａｂ ３Ｈ５に関連して、ドットブロットおよびウェスタンブロットにより大きな反応性が観察された（ＰＬＬ２で得られたものより大きい）。ＰＬＬ１の結果とは反対に、還元剤が試料中に存在する時Ｍａｂ ３Ｈ５による認識は同じであり、両方のタンパク質間のコンフォメーションの差の可能性を示している。最後に、ＤＥＮ−２に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。これらの結果は、ＰＬＬ２で得られたものと同様であった。
【００４０】
* 全部で１０μgの精製ＰＬＬ３を使用した。得られたシグナルの強度を＋から++まで評価した。
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００４１】
実施例１２．ＰＬＬ３が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、３５μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＬＬ３で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−２に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表１２と表１５）。さらに、血球凝集阻害（ＨＩ）測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−２に対してのみ見いだされた（表１３と表１５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−２に対して中和力価１：１２８０が得られた（表１４）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表１５）。３つの試験を使用して、高レベルの血清型特異的抗体が検出され、ＰＬＬ２タンパク質で免疫した後に得られたものと同様であった。
【００４２】
【００４３】
* ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【００４４】
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００４５】
* 各混合物は３つの血清により作成した。
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００４６】
実施例１３．ｐＬＨ１の入手
ＤＥＮ−１ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号３２）を、ＤＥＮ−１ウイルス株遺伝子型（Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.、デング１ウイルス株の構造タンパク質遺伝子間の遺伝的関連性、J. Gen. Virol. 1989, 70:1701-1712）からの配列６と配列７として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ１０８プラスミドをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨのＮ末端領域と６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２３）。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＬＨ１と呼ぶ、図４と配列番号３３）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ルリアベルタニ（Luria Bertani）（ＬＢ）培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果２５kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の１０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質のＮ末端領域とＤＥＮ−１ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦに含有されるポリクローナル抗体（ＰＡ）抗ＤＥＮ−１による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をＰＬＨ１と命名した（配列番号３４）。
【００４７】
実施例１４．ＰＬＨ１タンパク質の精製
ｐＬＨ１で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、７Ｍ尿素でタンパク質を抽出し、上清（ＰＬＨ１タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。６０mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をＧ−２５カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００４８】
実施例１５．ＰＬＨ１の抗原性解析
ＰＬＨ１の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表１６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−１で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型１の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−１に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００４９】
* 全部で１０μgの精製ＰＬＨ１を使用した。得られたシグナルの強度を＋から++まで評価した。
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００５０】
実施例１６．ＰＬＨ１が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、３５μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＬＬ１で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−１に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表１７と表２０）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−１に対してのみ見いだされた（表１８と表２０）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−１に対して中和力価１：３２０が得られた。しかし、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表１９と表２０）。これらの結果は、ＰＬＬ１に誘発された抗体の高い血清型特異性を示す。
【００５１】
* ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【００５２】
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００５３】
* 各混合物は３つの血清により作成した。
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００５４】
実施例１７．ｐＬＨ２の入手
ＤＥＮ−１ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号３２）を、ＤＥＮ−１ウイルス株（Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.、デング１ウイルス株の構造タンパク質遺伝子間の遺伝的関連性、J. Gen. Virol. 1989, 70:1701-1712）からの配列６と配列８として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ８４ ＨｉｓプラスミドをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨのＮ末端領域と６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２６）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＬＨ２と呼ぶ、図５と配列番号３５）を用いて、コンピタントな細胞ＭＭ２９４を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−１ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−１による免疫ブロッティングで認識され、このタンパク質をＰＬＨ２と命名した（配列番号３６）。
【００５５】
実施例１８．ＰＬＨ２タンパク質の精製
ＰＬＬ２で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分に結合したタンパク質を、７Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰＬＨ２タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。４０mMイミダゾールでカラムを洗浄し、１００mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、調製物を調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００５６】
実施例１９．ＰＬＨ２の抗原性解析
ＰＬＨ２の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表２１）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−１で得られた（ＰＬＨ１で得られたものより高い）。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型１の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−１に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００５７】
* 全部で１０μgの精製ＰＬＨ２を使用した。得られたシグナルの強度を＋から++まで評価した。
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００５８】
実施例２０．ＰＬＨ２が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＬＨ２で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−１に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表２２と表２５）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−１に対してのみ見いだされた（表２３と表２５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−１に対して中和力価１：１２８０が得られた（表２４）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表２５）。
【００５９】
【００６０】
* ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【００６１】
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００６２】
* 各混合物は３つの血清により作成した。
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００６３】
実施例２１．ｐＬＨ３の入手
ＤＥＮ−１ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号３２）を、ＤＥＮ−１ウイルス株（Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.、デング１ウイルス株の構造タンパク質遺伝子間の遺伝的関連性、J. Gen. Virol. 1989, 70:1701-1712）からの配列９と配列１０として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＤ４プラスミドをＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質をコードするヌクレオチド配列と停止コドンの無い６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２９）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質のＣ末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＬＨ３と呼ぶ、図６と配列番号３７）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−１ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ 抗ＤＥＮ−１による免疫ブロッティングで認識され、ＰＬＨ３と命名した（配列番号３８）。
【００６４】
実施例２２．ＰＬＨ３タンパク質の精製
ｐＬＨ３で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分から、６Ｍ尿素を使用してタンパク質を抽出し、上清（ＰＬＨ３タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。３０mMイミダゾールで洗浄し、タンパク質を２５０mMイミダゾールで溶出した。最後に、タンパク質の純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００６５】
実施例２３．ＰＬＨ３の抗原性解析
ＰＬＨ３の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表２６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−１で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型１の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−１に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００６６】
* 全部で１０μgの精製ＰＬＨ３を使用した。得られたシグナルの強度を＋から++まで評価した。
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００６７】
実施例２４．ＰＬＨ３が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＬＨ３で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−１に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表２７と表３０）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−１に対してのみ見いだされた（表２８と表３０）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−１に対して中和力価１：１２８０が得られた（表２９）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表３０）。
【００６８】
【００６９】
* ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【００７０】
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００７１】
* 各混合物は３つの血清により作成した。
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００７２】
実施例２５．ｐＡＺ１の入手
ＤＥＮ−３ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号３９）を、ＤＥＮ−３ウイルス株遺伝子型（Osatomi K., Sumiyoshi H. デング３型ウイルスゲノムＲＮＡの完全なヌクレオチド配列、Virology 1990, 176(2):643-647）からの配列１１と配列１２として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ１０８ ＨｉｓプラスミドをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨのＮ末端領域と６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２３）。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＡＺ１と呼ぶ、図７と配列番号４０）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ルリアベルタニ（Luria Bertani）（ＬＢ）培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果２５kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の１０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質のＮ末端領域とＤＥＮ−３ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦに含有されるポリクローナル抗体（ＰＡ）抗ＤＥＮ−３による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をＰＡＺ１と命名した（配列番号４１）。
【００７３】
実施例２６．ＰＡＺ１タンパク質の精製
ｐＡＺ１で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、７Ｍ尿素でタンパク質を抽出し、上清（ＰＬＨ１タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。６０mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をＧ−２５カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００７４】
実施例２７．ＰＡＺ１の抗原性解析
ＰＡＺ１の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表３１）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−３で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型３の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−３に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００７５】
* 全部で１０μgの精製ＰＡＺ１を使用した。得られたシグナルの強度を＋から++まで評価した。
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００７６】
実施例２８．ＰＡＺ１が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、３５μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＡＺ１で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−１に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表３２と表３５）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−３に対してのみ見いだされた（表３３と表３５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−３に対して中和力価１：３２０が得られた。しかし、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表３４と表３５）。これらの結果は、ＰＡＺ１に誘発された抗体の高い血清型特異性を示す。
【００７７】
【００７８】
* ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【００７９】
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００８０】
* 各混合物は３つの血清により作成した。
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００８１】
実施例２９．ＰＡＺ２の入手
ＤＥＮ−３ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号３９）を、ＤＥＮ−３ウイルス株遺伝子型（Osatomi K., Sumiyoshi H. デング３型ウイルスゲノムＲＮＡの完全なヌクレオチド配列、Virology 1990, 176(2):643-647）からの配列１１と配列１３として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ８４ ＨｉｓプラスミドをＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質をコードするヌクレオチド配列と６つのヒスチジンの配列をコードするヌクレオチド配列とを含有する（配列２６）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＡＺ２と呼ぶ、図８と配列番号４２）を用いて、コンピタントな細胞ＭＭ２９４を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−３ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−３による免疫ブロッティングで認識され、ＰＡＺ２と命名した（配列番号４３）。
【００８２】
実施例３０．ＰＡＺ２タンパク質の精製
ＰＡＺ２で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分に結合したタンパク質を、７Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰＡＺ２タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。カラムを４０mMイミダゾールで洗浄し、１００mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００８３】
実施例３１．ＰＡＺ２の抗原性解析
ＰＡＺ２の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表３６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−３で得られた（ＰＡＺ１で得られたものより高い）。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型３の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−３に対する高力価の５つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００８４】
* 全部で１０μgの精製ＰＡＺ２を使用した。得られたシグナルの強度を＋から++まで評価した。
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００８５】
実施例３２．ＰＡＺ２が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＡＺ２で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−３に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表３７と表４０）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−３に対してのみ見いだされた（表３８と表４０）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−３に対して中和力価１：１２８０が得られた（表３９）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表４０）。
【００８６】
【００８７】
* ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【００８８】
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００８９】
* 各混合物は３つの血清により作成した。
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００９０】
実施例３３．ｐＡＺ３の入手
ＤＥＮ−３ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号３９）を、ＤＥＮ−３ウイルス株（Osatomi K., Sumiyoshi H. デング３型ウイルスゲノムＲＮＡの完全なヌクレオチド配列、Virology 1990, 176(2):643-647）からの配列１４と配列１５として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＤ４プラスミドをＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質をコードするヌクレオチド配列と停止コドンの無い６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２９）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質のＣ末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＡＺ３と呼ぶ、図９と配列番号４４）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−３ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−３による免疫ブロッティングで認識され、ＰＡＺ３と命名した（配列番号４５）。
【００９１】
実施例３４．ＰＡＺ３タンパク質の精製
ＰＡＺ３で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分から、タンパク質を７Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰＡＺ３タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。カラムを４５mMイミダゾールで洗浄し、２３０mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、タンパク質の純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、調製緩衝液（ＰＢＳ）中のタンパク質を得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００９２】
実施例３５．ＰＡＺ３の抗原性解析
ＰＡＺ３の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表２６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−３で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型３の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−３に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００９３】
* 全部で１０μgの精製ＰＡＺ３を使用した。得られたシグナルの強度を＋から++まで評価した。
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００９４】
実施例３６．ＰＡＺ３が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＡＺ３で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−３に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表４２と表４５）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−３に対してのみ見いだされた（表４３と表４５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−３に対して中和力価１：１２８０が得られた（表４４）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表４５）。
【００９５】
【００９６】
* ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【００９７】
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００９８】
* 各混合物は３つの血清により作成した。
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００９９】
実施例３７．ｐｌＤ１の入手
ＤＥＮ−４ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）を、ＤＥＮ−４ウイルス株遺伝子型（Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング４型ウイルスＤＮＡ配列のクローニング：構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88）からの配列１７と配列１８として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ１０８ Ｈｉｓ プラスミドをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨのＮ末端領域と６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２３）。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐｌＤ１と呼ぶ、図１０と配列番号４７）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ルリアベルタニ（ＬＢ）培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果２５kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の１０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−４ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ中に含有されるポリクローナル抗体（ＰＡ）抗ＤＥＮ−４による免疫ブロッティングで認識され、ｐｌＤ１と命名した（配列番号４８）。
【０１００】
実施例３８．ＰｌＤ１タンパク質の精製
ｐｌＤ１で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、６Ｍ尿素でタンパク質を抽出し、上清（ＰｌＤ１タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。６０mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をＧ−２５カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【０１０１】
実施例３９．ＰｌＤ１の抗原性解析
ＰｌＤ１の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表４６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−４で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型４の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−４に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【０１０２】
* 全部で１０μgの精製ＰｌＤ１を使用した。得られたシグナルの強度を＋から++まで評価した。
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【０１０３】
実施例４０．ＰｌＤ１が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、３５μgのフロイントアジュバント中の精製ＰｌＤ１で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−１に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表４７と表５０）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−４に対してのみ見いだされた（表４８と表５０）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−４に対して中和力価１：３２０が得られた。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表４９と表５０）。これらの結果は、ＰｌＤ１により誘発される抗体の高い血清型特異性を示す。
【０１０４】
【０１０５】
* ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【０１０６】
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【０１０７】
* 各混合物は３つの血清により作成した。
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【０１０８】
実施例４１．ｐｌＤ２の入手
ＤＥＮ−４ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）を、ＤＥＮ−４ウイルス株（Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング４型ウイルスＤＮＡ配列のクローニング：構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88）からの配列１６と配列１８として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ８４ ＨｉｓプラスミドをＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質をコードするヌクレオチド配列と６つのヒスチジンの配列をコードするヌクレオチド配列とを含有する（配列２６）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐｌＤ２と呼ぶ、図１１と配列番号４９）を用いて、コンピタントな細胞ＭＭ２９４を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−４ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−４による免疫ブロッティングで認識され、ＰｌＤ２と命名した（配列番号５０）。
【０１０９】
実施例４２．ＰｌＤ２タンパク質の精製
ｐｌＤ２で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分に結合したタンパク質を６Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰｌＤ２タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。カラムを３０mMイミダゾールで洗浄し、２５０mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【０１１０】
実施例４３．ＰｌＤ２の抗原性解析
ＰｌＤ２の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表５１）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−４で得られた（ＰｌＤ１で得られたものより高い）。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型４の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−３に対する高力価の５つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【０１１１】
* 全部で１０μgの精製ＰｌＤ２を使用した。得られたシグナルの強度を＋から++まで評価した。
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【０１１２】
実施例４４．ＰｌＤ２が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰｌＤ２で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−４に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表５２と表５５）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−４に対してのみ見いだされた（表５３と表５５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−４に対して中和力価１：１２８０が得られた（表５４）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表５５）。
【０１１３】
【０１１４】
* ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【０１１５】
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【０１１６】
* 各混合物は３つの血清により作成した。
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【０１１７】
実施例４５．ｐｌＤ３の入手
ＤＥＮ−４ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）を、ＤＥＮ−４ウイルス株（Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング４型ウイルスＤＮＡ配列のクローニング：構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88）からの配列１９と配列２０として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＤ４プラスミドをＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質をコードするヌクレオチド配列と６つのヒスチジンの配列をコードするヌクレオチド配列とを含有する（配列２９）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質のＣ末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐｌＤ３と呼ぶ、図１２と配列番号５１）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−４ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−４による免疫ブロッティングで認識され、ＰｌＤ３と命名した（配列番号５２）。
【０１１８】
実施例４６．ＰｌＤ３タンパク質の精製
ｐｌＤ３で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分から、タンパク質を６Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰｌＤ３タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。カラムを４５mMイミダゾールで洗浄し、２００mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【０１１９】
実施例４７．ＰｌＤ３の抗原性解析
ＰｌＤ３の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表５６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−４で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型４の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−４に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【０１２０】
* 全部で１０μgの精製ＰｌＤ３を使用した。得られたシグナルの強度を＋から++まで評価した。
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【０１２１】
実施例４８．ＰｌＤ３が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＡＺ３で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−４に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表５７と表６０）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−４に対してのみ見いだされた（表５８と表６０）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−４に対して中和力価１：１２８０が得られた（表５９）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表６０）。
【０１２２】
【０１２３】
* ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【０１２４】
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【０１２５】
* 各混合物は３つの血清により作成した。
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【０１２６】
実施例４９．ｐＤ４Ｄ２の入手
ＤＥＮ−４ウイルスからのＥタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）を、ＤＥＮ−４ウイルス株（Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング４型ウイルスＤＮＡ配列のクローニング：構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88）からの配列１６と配列２１として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＬＬ３プラスミドをＸｂａＩ／ＸｂａＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨ遺伝子と、この遺伝子の３’領域の６つのヒスチジンの配列および３’末端中のＤＥＮ−２からのＥ断片の配列とを含有する。その結果、同じＭＤＨ遺伝子に融合した、血清型２と４からＥタンパク質の２つの領域が得られた。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＤ４Ｄ２と呼ぶ、図１３と配列番号５３）を用いて、コンピタントな細胞ＭＭ２９４を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果１１０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とデング熱ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質の２つの断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦに含有されるポリクローナル抗体抗ＤＥＮ−２と抗ＤＥＮ−４による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をＰＤ４Ｄ２と命名した（配列番号５４）。
【０１２７】
実施例５０．ＰＤ４Ｄ２タンパク質の精製
ｐＤ４Ｄ２で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が可溶性または不溶性で得られた。ペレットからタンパク質を６Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰＤ４Ｄ２タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。３０mMイミダゾールで洗浄工程を行い、２５０mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液中に得て、これを免疫学的試験に使用した。
【０１２８】
実施例５１．ＰＤ４Ｄ２の抗原性解析
ＰＤ４Ｄ２の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表６１）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−２と抗ＤＥＮ−４で得られた。他の２つの血清型の認識は、血清型２と４の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。一方、ＰＬＬ２とＰＬＬ３について得られたものと同様に、Ｍａｂ ３Ｈ５は確かに反応性を有した。最後に、ＤＥＮ−２とＤＥＮ−４に対する高力価と低力価のヒト血清に対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【０１２９】
* 全部で１０μgの精製Ｐ４Ｄ２を使用した。得られたシグナルの強度を＋から++まで評価した。
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【０１３０】
実施例５２．ＰＤ４Ｄ２が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＤ４Ｄ２で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−２とＤＥＮ−４に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表６２と表６５）。さらに、血球凝集阻害測定（ＨＩ）を行い、陽性力価はＤＥＮ−２とＤＥＮ−４に対してのみ見いだされた（表６３と表６５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−２に対して中和力価＞１：１２８０およびＤＥＮ−４に対して＞１：１２８０が得られた（表６４）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表６５）。
【０１３１】
【０１３２】
* ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
【０１３３】
* 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【０１３４】
* 各混合物は３つの血清により作成した。
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【０１３５】
実施例５３．防御測定法
同種の致死的ＤＥＮで抗原刺激したすべての測定した変種で免疫したマウスに付与される防御の評価のために、各群１５匹のマウスを使用した。各動物に、致死的ＤＥＮの１００ ＬＤ50を１回頭蓋内接種し、２１日間観察して致死率を調べた。陽性対照として、４つのウイルス調製物（ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４）で免疫した１５匹のマウスの群を使用した。これらの対照群のすべてのマウスは生き残ったが、陰性対照群からのマウスは、抗原刺激の７〜１１日後に病気になり、死亡率１００％であった。最後に、被験融合タンパク質は、８０％〜１００％の防御率であり、すべての場合に、対照群と比較して大きな差があった（表６６）。
【０１３６】
* 計算：（生存マウスの数）／（マウスの総数）。生存したもののデータは、抗原刺激後２１に取った。ｐＤ４Ｄ２で免疫したマウスの場合、１５匹はＤＥＮ−４で抗原刺激し、１５匹はＤＥＮ−２で抗原刺激した。
【０１３７】
実施例５４．リンパ増殖性応答
ＤＥＮ−２からのＥ断片を含有するキメラタンパク質（ＰＬＬ１、ＰＬＬ２、およびＰＬＬ３）で免疫した異なる群からの動物、およびプラセボ群を、最後の投与の１５日後に屠殺した。次に、動物の脾臓を採取し、４つの血清型のデング熱ウイルスに対するリンパ増殖性応答を調べた。表６７は、得られた刺激指数の結果を示し、これは、血清型特異的応答が得られたことを示す。
【０１３８】
* 刺激指数：対照のＤＮＡ自発的合成の１分当たりのカウントに対する試料の１分当たりのカウント。
** 分裂促進因子：植物性血球凝集素。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ＰＬＬ１を得るためのＥ２断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ２：ＤＥＮ−２のエンベロープタンパク質の断片。 Ｎ−ｔｅｒｍ：ＭＤＨタンパク質の最初の４５アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図２】ＰＬＬ２を得るためのＥ２断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ２：ＤＥＮ−２のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図３】ＰＬＬ３を得るためのＥ２断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ２：ＤＥＮ−２のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図４】ＰＬＨ１を得るためのＥ１断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ１：ＤＥＮ−１のエンベロープタンパク質の断片。 Ｎ−ｔｅｒｍ：ＭＤＨタンパク質の最初の４５アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図５】ＰＬＨ２を得るためのＥ１断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ１：ＤＥＮ−１のエンベロープタンパク質の断片。 Ｎ−ｔｅｒｍ：ＭＤＨタンパク質の最初の４５アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図６】ＰＬＨ３を得るためのＥ１断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ１：ＤＥＮ−１のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図７】ＰＡＺ１を得るためのＥ３断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ３：ＤＥＮ−３のエンベロープタンパク質の断片。 Ｎ−ｔｅｒｍ：ＭＤＨタンパク質の最初の４５アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図８】ＰＡＺ２を得るためのＥ３断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ３：ＤＥＮ−３のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図９】ＰＡＺ３を得るためのＥ３断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ３：ＤＥＮ−３のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図１０】ＰｌＤ１を得るためのＥ４断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ４：ＤＥＮ−４のエンベロープタンパク質の断片。 Ｎ−ｔｅｒｍ：ＭＤＨタンパク質の最初の４５アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図１１】ＰｌＤ２を得るためのＥ４断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ４：ＤＥＮ−４のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図１２】ＰｌＤ３を得るためのＥ４断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ４：ＤＥＮ−４のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図１３】ＰＤ４Ｄ２を得るためのクローニング法。 ＤＥＮｅ４：ＤＥＮ−４のエンベロープタンパク質の断片。 ＤＥＮｅ２：ＤＥＮ−２のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【０１４０】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、バイオテクノロジーと医薬品産業の分野に関し、特に発現ベクター中に導入された時、デング熱ウイルス（Dengue virus）（以後ＤＥＮと呼ぶ）感染に対する血清型特異的（serotype-specific）体液性免疫応答と防御とを誘発し、このタイプの病理で言及される出血と臨床的合併症を引き起こす血清型特異的ウイルス免疫増幅の影響を避けることができるタンパク質を生成する、キメラヌクレオチド鎖を得ることに関する。
【０００２】
先行技術
デング熱ウイルス（ＤＥＮ）は、その脂質膜が３つの構造タンパク質のうちの２つ（エンベロープタンパク質（Ｅ）と膜タンパク質（Ｍ））を含有する被覆されたウイルスである。Ｅタンパク質は、第３の構造タンパク質（コアタンパク質）からなるイコサエドリック（icosaedric）ヌクレオカプシドをカバーする。このウイルスは、フラビウイルス（Flaviviridae）科に属し、４つの異なる血清型が存在する。ヒトへの伝搬は、ステゴミア（Stegomia）科に属する蚊ネッタイシマカ（Aedes aegypti）により行われる。このウイルスについてヒトで発生する疾患は、出血熱とショックを特徴とするより重症の、時に致死的な疾患（出血性デング熱とデングショック症候群（ＨＤＦ／ＤＳＳ）と呼ぶ）（Hammon WMc、フィリピンとタイにおける小児の新しい出血熱、Trans Assoc Physicians 1960:73:140-155）が出現するまでは、良性であると考えられ、デング熱または古典的デング（ＤＦ）と言われた。いくつかの疫学的研究が行われ、危険因子として、２つの異なるウイルス血清型の連続的感染を証明している（Kouri GP、Guzman MG、Brave JR、なぜキューバでデング出血熱：完全な分析。Tans Roy Soc Trop Med Hyg 1987;72:821-823）。この現象は、免疫増強により説明され、これは、標的細胞（単球）のＦc 受容体を介する細胞へのウイルス−抗体複合体の侵入を増加させることによる、ウイルス感染の増加に基づく（halstead SB、デングの病理：分子生物学の課題、Science 1988；239:476-481）。
【０００３】
生きた弱毒化ワクチンを製造するために種々の方法が開発されているが、これらのワクチンは病原性、ウイルス干渉、およびゲノム間組換えに戻ることがあるため、現在これらのワクチンの効果については多くの未解決の問題がある。また、組換え抗原は、サブユニットワクチンの可能な成分として得ることができる（Feighny, R., Borrous, J. および Putnak R.、 ウイルスの抗原刺激に対してマウスを防御する組換えバキュロウイルスを使用して作成したデング２型ウイルスエンベロープ、Am. J. Trop. Med. Hyg. 1994, 50(3). 322-328; Deubel, V., Staropoli, I., Megret, F.ら、アフィニティ精製したデング−２ウイルスエンベロープ糖タンパク質はマウス中で中和抗体と防御性免疫を誘導する、Vaccine. 1997. 15, 1946-1954）。
【０００４】
ウイルスの主要な抗原は、エンベロープタンパク質ＤＥＮｅである。このタンパク質は、ウイルス表面の主要な成分であり、細胞受容体へのウイルスの結合を仲介すると考えられている（A Heinz FX, Bergee R, Tuma Wら、モノクローナル抗体により規定されるダニ由来脳炎ウイルスの構造性糖タンパク質上のエピトープの位相的および機能的モデル、Virology. 1983; 126:525）。このタンパク質は、ダニ由来脳炎ウイルス（ＴＢＥ）と構造的相同性を有し（Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, C.ら、２Å分解能でのダニ由来脳炎ウイルスからのエンベロープ糖タンパク質、Nature 1995;375:29i1-298）、血清型間で構造的に保存されている。
【０００５】
昆虫細胞は、ベクターとしてバキュロウイルスを使用する多様な異種遺伝子の発現のために最もよく使用されている系の１つである。これらのベクターは、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２およびＤＥＮ−４の構造および非構造タンパク質のいくつかの組合せの発現のために使用されている（Matsuura, Y. Miyamoto M, Soto Tら、組換えバキュロウイルスにより発現される日本脳炎ウイルスエンベロープタンパク質の性状解析、Virology 1989;173:677-682; Deubel V, Bordier M, Megret Fら、組換えバキュロウイルスにより昆虫細胞中で発現されるカルボキシ末端切断型デング−２エンベロープタンパク質のプロセシング、分泌および免疫反応性、Virology 1991;180:440-447; Putnak R, Feighny R, Burrous J ら、組換えバキュロウイルス中で発現されるデング１ウイルスエンベロープ糖タンパク質遺伝子はマウスでウイルス中和抗体を誘発し、これらをウイルス抗原刺激から防御する、Am J Trop Med Hyg 1991;45:159-167; Feighny R, Burrous J, Putnak R. 組換えバキュロウイルスを使用して作成されたデング２型ウイルスエンベロープタンパク質はウイルス抗原刺激に対してマウスを防御する、Am J Trop Med Hyg 1994;50:322-328）。使用される他の系は、Ｅタンパク質の異なる変種を発現するドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）の細胞である（PCT/US96/07627）。これらの系で発現されるタンパク質を使用して適切な機能性応答を得られるにもかかわらず、これらはスケールアップ製造法の開発にはコストが高く、従って酵母での発現が、フラビウイルスの組換え構造タンパク質を製造するための別の方法となっている。しかし、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中で発現されるＤＮＥｅタンパク質（PCT/US96/07627；Sugrue R.J., Fu H., Howe J., Chan Y.、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）でのデング熱ウイルス構造タンパク質の発現はウイルス様粒子の生成を引き起こす、J Virol. 1997. 78, 1861-1866）の場合、発現レベルは低く、分泌されるかまたは細胞内であり、精製プロセスを妨害する。
【０００６】
平行して、細菌でいくつかの変種ＤＥＮｅタンパク質が得られている。これらの１つは、大腸菌（E. coli）のトリプトファン代謝のタンパク質に融合したＪＥＶのＥタンパク質（ＴｒｐＥ）のＣ末端部分であった。このタンパク質は、封入体として産生され、免疫検出法を使用して中和モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）により認識された。しかしこのタンパク質の純粋な調製物は中和抗体を開発することができず、ウイルス抗原刺激に対して防御することができない（Mason P.W., Zogel M.V., Semproni A.R.ら、大腸菌（E. coli）で発現されるデング１型ウイルスエンベロープとＮＳ１タンパク質の抗原構造、J Gen Virol. 1990. 71:2107-2114）。さらに、Ｅタンパク質のＣ末端断片に融合した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインＡを含有し、続いてＪＥＶの非構造タンパク質のＮ末端セグメント（ＮＳ１）を含有する、別の構築体を作成した（Srivastava A.K., Morita K., Matsuo S.ら、大腸菌（E. coli）中で発現されるプロテインＡの日本脳炎ウイルスの融合タンパク質はマウスで防御能を付与する、Microbiol Immunol. 1991. 35:863-870）。この場合、融合したタンパク質は可溶性であり、親和性クロマトグラフィーによる精製を促進する。マウスをこの純粋なタンパク質で免疫すると、高中和性抗体力価が得られ、これはまた、血球凝集を阻害し、ＪＥＶによるウイルス抗原刺激に対して防御した。黄色ブドウ球菌（S. aureus）のプロテインＡに融合したＤＥＮ−２のＤＥＮｅ領域を使用して、同様の結果が得られた（Srivastava A.K., Putnak R.J., Warren R.L., Hoke C.H.、大腸菌（Escherichia coli）中で作成したデング２型ウイルスＥとＮＳ１の融合タンパク質を用いて免疫したマウスは、致死的デングウイルス感染に対して防御される。Vaccine. 1995. 13:1251-1258）；しかし、プロテインＡの存在のためにヒトでこれらの調製物を使用することが不可能であり、これはヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する高親和性を示した。最後に、ＤＥＮ−２のＤＥＮｅタンパク質のＢドメインと大腸菌（E. coli）のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とを含有する融合タンパク質（Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G.、マウスでのデング２ウイルス感染に対する組換えデングエンベロープＢドメイン融合タンパク質の防御効果の評価、Am J Trop Med Hyg. 1998. 58:655-662）（ＭＢＰ−ＤｏｍＢと呼ぶ）が報告された。このタンパク質変種はマウスで免疫原性であり、中和抗体を誘発した。
【０００７】
我々のケースでは本発明の主題はキメラ配列を得ることに依存し、例えば第１のケースでは、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）からの脱水素酵素活性を有する変異タンパク質（ＭＤＨ）のＮ末端断片に連結したＤＥＮｅタンパク質の領域をコードする配列；第２のケースでは、２つの異なる位置でＭＤＨタンパク質の全遺伝子に連結したＤＥＮｅタンパク質の領域をコードする配列；第３のケースでは、キメラ配列は、ＭＤＨタンパク質をコードする同じ遺伝子に融合した２つの異なるウイルス血清型からのＤＥＮｅタンパク質の２つの断片により形成される。これらのキメラ鎖は、適当なベクター中に挿入されると、細菌の細胞質内に不溶性のキメラタンパク質が生じる。次にこれらのタンパク質は、ＤＥＮに対する高レベルの中和抗体、ウイルス血球凝集のインヒビターを誘発し、ウイルス抗原刺激に対して免疫マウスを防御することができる。
【０００８】
前記タンパク質の不溶性に関して、簡単なスケールアップ折り畳みプロセスと、ならびに Simmonsら、1998が使用したものより優れた発現と精製プロセスが、インビトロで行われた。一方、これらのタンパク質を用いてマウスを免疫することにより得られる抗体の血清型特異的が、Simmonsら、1998が使用したものより低い用量を使用して、中和、血球凝集の阻害およびＥＬＩＳＡのレベルで証明される。この事実は、機能性免疫応答を刺激することができる大腸菌（E. coli）中の不溶性ＤＥＮｅタンパク質の発現についての最初の報告である。
【０００９】
さらに、ダイマー変種で得られた結果を考慮すると、ウイルス感染を中和しウイルス抗原刺激に対して防御することができる、２つの異なるウイルス血清型について同じ分子を用いて血清型特異的抗体を作成することができる。ＭＤＨタンパク質について、ＥＭＢＬデータベースで他の配列との相同性の検索が行われ、最初の１１０アミノ酸が、リポ結合ドメイン領域とジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸脱水素酵素複合体とα−セトグルタレート脱水素酵素のＥ２酵素）の可とう性ヒンジに非常によく似ており、タンパク質の残りの部分は、リポアミド脱水素酵素（ＬＰＤＨ）（該複合体の酵素Ｅ３）に非常によく似ていることが明らかになった（Stephens, P.E; H.M. Darlinson および J.R. Guest., 1983、大腸菌（E. coli）のピルビン酸脱水素酵素複合体、Eur. J. Biochem. 133:155-162）。
【００１０】
一方、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の患者は、これらのタンパク質に共通のリポ酸結合部位に特異的な抗ミトコンドリア自己抗体を産生することもわかった（Gershwin ME, Mackay IR, Sturgess A, Coppel RL、原発性胆汁性肝硬変で認識される７０kDa ミトコンドリア抗原をコードするｃＤＮＡの同定と特異性、J. Immunol. 1987:138:3525-31）。従って我々は、キメラタンパク質としてヒトで免疫した時自己免疫応答を避けるように、このタンパク質内の領域を変異させることにした。我々の発明の変異したＭＤＨタンパク質が第１相臨床試験で使用され、ヒトで安全であり免疫原性ではないことが証明され、またＰＢＣ患者の血清により認識されなかった（Perez, A., F. Dickinson, Z. Cinza, A. Rutz, T. Serrano, J. Sosa, S. Gonzalez, Y. Gutierrez, C. Nazabal, O. Gutierrez, D. Guzman, M. Diaz, M. Delgado, E. Caballero, G. Sardinas, A. Alvarez, A. Martin, G. Guillen, R. Silva、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）の組換え外膜のヒトボランティアでの安全性と予備的免疫原性、Biotech. Appl. Biochem. 34:121-125）。しかし、ヒトでのＭＢＰの使用可能性はまだ証明されていない（Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G.、マウスでのデング２ウイルス感染に対する組換えデングエンベロープＢドメイン融合タンパク質の防御効果の評価、Am J Trop Med Hyg、1998, 58:655-662）。
【００１１】
発明の詳細な説明
発現ベクター中に導入された時、血清型特異的体液性免疫応答を誘導することができ、かつデング熱ウイルスによる感染に対して防御することができるキメラヌクレオチド鎖を得ることが本発明に記載され、例えば髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）からの脱水素酵素活性を有する変異タンパク質（ＭＤＨ）のＮ末端断片に連結したデング熱ウイルスのウイルス血清型の各１つからのＤＥＮｅタンパク質の領域をコードする配列；第２のケースでは、２つの異なる位置でＭＤＨタンパク質の全遺伝子に連結したＤＥＮｅタンパク質の領域をコードする配列；ＭＤＨタンパク質の構造ドメインをコードする配列の１つの部位（リポ酸結合ドメインと遺伝子の３’末端）内、および第３のケースでは、キメラ配列は、ＭＤＨ遺伝子の２つの異なる位置の２つの異なるウイルス血清型（ＤＥＮ−２とＤＥＮ−４）からのＤＥＮｅタンパク質の２つの断片により形成される：１つは、リポ酸結合ドメインをコードする配列の特定の部位内（血清型４）、そして他の１つはＭＤＨ遺伝子の３’末端内（血清型２）。これをダイマー構築体と呼んだ。
【００１２】
これらのキメラタンパク質は、細菌の細胞質内で不溶性で得られた。固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製操作を行って、免疫原性試験のための純粋なタンパク質が得られた。
抗原性結果を分析すると、超免疫腹水液（ＨＭＡＦ）抗ＤＥＮに対するすべての組換えキメラタンパク質の強い認識が証明され、全ＭＤＨ遺伝子への融合の場合に高く、これは、ＭＤＨにより与えられるＤＥＮｅタンパク質からの領域の折り畳みへの陽性の作用を証明している。血清型２を使用した場合には、得られたすべての組換えタンパク質は、血清型特異的中和抗体（３Ｈ５）により認識され、これも全ＭＤＨ遺伝子への融合ならびにダイマータンパク質の場合に高かった。また、各場合に同種血清型からのＨＭＡＦに対する認識は、異種血清型からのＨＭＡＦに対する認識より有意に高く、血清型特異的エピトープの暴露を証明し、従ってデングの診断手段および血清型判定としての使用を可能にする。
【００１３】
すべての組換えキメラタンパク質をマウスで免疫すると、中和性かつ防御性の応答が得られた。最も高い中和力価は、ＤＥＮｅタンパク質からの断片の位置には無関係に、ＭＤＨの全遺伝子に融合した配列とダイマータンパク質とで得られた。これは、得られた抗原性結果に反映されるＤＥＮｅタンパク質の折り畳みへの影響により説明される、ＭＤＨにより仲介される免疫応答の免疫増強作用を示した。これはまた、先行技術とは異なり、これらのタンパク質の不溶性が、適当な免疫応答を生成する能力に影響を与えないことを初めて証明した。
【００１４】
すべての場合で生じた免疫応答は、ウイルス中和、血球凝集阻害およびＥＬＩＳＡにおいて、血清型特異的（免疫した同種の血清型に対する抗体）であった。血清型特異的抗体の生成は、これらが、免疫増強現象を促進する異種血清型のウイルスからの抗原決定基を認識できないことを意味する。異種血清型に対する抗体の認識は、出血性デング熱（ＨＤＦ）の原因の１つである可能性があるため、この特徴は、ワクチン候補の開発にとって非常に重要である。
さらに、キメラタンパク質の１つのみで免疫した後の２つのウイルス血清型に対する抗体の誘導が証明され、これは、我々の利用可能な組換えキメラタンパク質の２つのみを使用して、４つの血清型に対するワクチン候補の調製を可能にする。
【００１５】
変異ＭＤＨタンパク質の入手は、リジン残基（Ｋ）のイプシロンアミン残基を用いる脂肪酸の共有結合に基づく、配列ＥＴＤＫＡＴ中のリポ酸結合部位の除去からなる（Tuaillon N, Andre C, Briand JP ら、原発性胆汁性肝硬変における抗Ｍ２自己抗体により特異的に認識されるジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼのリポリル合成オクタデカペプチド、J. Immunol. 1992; 148:445-50）。
一対のプライマーを用いるＰＣＲによりタンパク質のＮ末端領域（ｌｐｄＡ遺伝子の開始コドンからリポ酸結合部位まで、１３５bp）およびＣ末端（リポ酸結合部位から遺伝子の３’末端まで）を増幅して、突然変異誘発を行い、こうしてヒトの臨床治験で証明されるように、自己免疫反応が生じる可能性を排除した。
【００１６】
生物学的物質の寄託
プラスミドＰＬＬ１、ＰＬＬ２、ＰＬＬ３、ＰＬＨ１、ＰＬＨ２、ＰＬＨ３、ＰＡＺ１、ＰＡＺ２、ＰＡＺ３、ＰｌＤ１、ＰｌＤ２、およびＰｌＤ３を、ブダペスト条約に従って、ベルギーの微生物保存機関（Belgian Coordinated collection of Microorganism − ＢＣＣＭ（登録商標）、ＬＭＢＰ−ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ）に、日付と受け入れ番号（未決定）で寄託した。
【００１７】
結果の例
実施例１．ＰＬＬ１の入手
ＤＥＮ−２ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号２２）を、ＤＥＮ−２ウイルス株遺伝子型ジャマイカ（Jamaica）（Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W.、デング２型ウイルス、ジャマイカ遺伝子型の非構造タンパク質のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列：完全長ゲノムの比較分析、Virology 1988, 165:234-244）からの配列１と配列２として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ１０８ ＨｉｓプラスミドをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨのＮ末端領域と６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２３）。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分（junction）をチェックした。選択したクローン（ｐＬＬ１と呼ぶ、図１と配列番号２４）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０（Hill C.W., Harnish B.W. 1982、大腸菌（E. coli）における重複ｒＲＮＡ遺伝子により結合した染色体セグメントの転位、J. Bacteriol. 149:449-457）を形質転換した。ルリアベルタニ（Luria Bertani）（ＬＢ）培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果２５kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の１０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質のＮ末端領域とＤＥＮ−２ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦに含有されるポリクローナル抗体（ＰＡ）抗ＤＥＮ−２による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をＰＬＬ１と命名した（配列番号２５）。
【００１８】
実施例２．ＰＬＬ１タンパク質の精製
ＰＬＬ１で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、６Ｍ尿素でタンパク質を抽出し、上清（ＰＬＬ１タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。５０mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をＧ−２５カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液（１００mM ＮａＣｌ、２mM ＫＣｌ2、１０mM Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．２、１mM ＫＨ2ＰＯ4）（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００１９】
実施例３．ＰＬＬ１の抗原性解析
ＰＬＬ１の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表１）。
【００２０】
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００２１】
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−２で得られた。この結果は、クローン化した領域が血清型２に属するという事実に一致する。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型２の場合より、低下する順序で小さかった：ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。一方、Ｍａｂ ３Ｈ５は確かに反応性を有した。試料を還元するとシグナルが失われたため、ウェスタンブロッティングによるこの認識は、ジスルフィド結合に依存した。最後に、ＤＥＮ−２に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００２２】
実施例４．ＰＬＬ１が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、３５μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＬＬ１で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−２に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表２と表５）。さらに、血球凝集阻害測定（ＨＩＡ）を行い、陽性力価はＤＥＮ−２に対してのみ見いだされた（表３と表５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−２に対して中和力価１：３２０が得られた。しかし、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表４と表５）。これらの結果は、ＰＬＬ１に誘発された抗体の高い血清型特異性を示す。
【００２３】
【００２５】
【００２６】
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００２７】
実施例５．ＰＬＬ２の入手
ＤＥＮ−２ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号２２）を、ＤＥＮ−２ウイルス株遺伝子型ジャマイカ（Jamaica）（Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W.、デング２型ウイルス、ジャマイカ遺伝子型の非構造タンパク質のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列：完全長ゲノムの比較分析、Virology 1988, 165:234-244）からの配列１と配列３として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
【００２８】
ｐＭ８４ ＨｉｓプラスミドをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質と６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２６）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＬＬ２と呼ぶ、図２と配列番号２７）を用いて、コンピタントな細胞ＭＭ２９４（Hanahan D. 1983, プラスミドによる大腸菌（Escherichia coli）の形質転換に関する研究、J. Mol. Biol. 166:557-580）を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の１０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−２ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ 抗ＤＥＮ−２による免疫ブロッティングで認識され、ＰＬＬ２と命名した（配列番号２８）。
【００２９】
実施例６．ＰＬＬ２タンパク質の精製
ＰＬＬ２で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。可溶性画分から、あらかじめＣｕ++イオンを結合させたキレート−セファロースＦＦカラムを使用して、金属イオン親和性クロマトグラフィーを行った。１５mMイミダゾールでカラムを洗浄し、１００mM イミダゾールでタンパク質を抽出した。一方、不溶性画分に結合したタンパク質は、８Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰＬＬ２タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。１００mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、各型のタンパク質の純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、調製緩衝液（１００mM ＮａＣｌ、２mM ＫＣｌ2、１０mM Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．２、１mM ＫＨ2ＰＯ4）（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００３０】
実施例７．ＰＬＬ２の抗原性解析
ＰＬＬ２の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−２で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型２の場合より、低下する順序で小さかった：ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。しかし、Ｍａｂ ３Ｈ５に関連して、ドットブロットおよびウェスタンブロットにより大きな反応性が観察された（ＰＬＬ１で得られたものより大きい）。ＰＬＬ１の結果とは反対に、還元剤が試料中に存在する時Ｍａｂ ３Ｈ５による認識は同じであり、両方のタンパク質間のコンフォメーションの差の可能性を示している。最後に、ＤＥＮ−２に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００３１】
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００３２】
実施例８．ＰＬＬ２が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、３５μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＬＬ２で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−２に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表７と表１０）。さらに、血球凝集阻害測定（ＨＩＡ）を行い、陽性力価はＤＥＮ−２に対してのみ見いだされた（表８と表１０）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−２に対して中和力価１：１２８０が得られた。ＰＬＬ１を用いて得られた結果と同様に、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表９と表１０）。一方、両方のＰＬＬ２変種で得られた結果は同様であり、タンパク質の溶解性状態は、機能性抗体を生成する能力に影響を与えないことを示す。
【００３３】
【００３５】
【００３６】
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００３７】
実施例９．ｐＬＬ３の入手
ＤＥＮ−２ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号２２）を、ＤＥＮ−２ウイルス株遺伝子型ジャマイカ（Jamaica）（Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W.、デング２型ウイルス、ジャマイカ遺伝子型の非構造タンパク質のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列：完全長ゲノムの比較分析、Virology 1988, 165:234-244）からの配列４と配列５として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＤ４プラスミドをＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質と停止コドンの無い６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２９）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質のＣ末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＬＬ３と呼ぶ、図３と配列番号３０）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−２ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ１ 抗ＤＥＮ−２による免疫ブロッティングで認識され、ＰＬＬ３と命名した（配列番号３１）。
【００３８】
実施例１０．ＰＬＬ３タンパク質の精製
ＰＬＬ２で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分から、６Ｍ尿素を使用してタンパク質を抽出し、上清（ＰＬＬ３タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。３０mMイミダゾールで洗浄し、タンパク質を１００mMイミダゾールで溶出した。最後に、タンパク質の純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００３９】
実施例１１．ＰＬＬ３の抗原性解析
ＰＬＬ３の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表１１）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−２で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型２の場合より、低下する順序で小さかった：ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。しかし、Ｍａｂ ３Ｈ５に関連して、ドットブロットおよびウェスタンブロットにより大きな反応性が観察された（ＰＬＬ２で得られたものより大きい）。ＰＬＬ１の結果とは反対に、還元剤が試料中に存在する時Ｍａｂ ３Ｈ５による認識は同じであり、両方のタンパク質間のコンフォメーションの差の可能性を示している。最後に、ＤＥＮ−２に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。これらの結果は、ＰＬＬ２で得られたものと同様であった。
【００４０】
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００４１】
実施例１２．ＰＬＬ３が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、３５μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＬＬ３で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−２に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表１２と表１５）。さらに、血球凝集阻害（ＨＩ）測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−２に対してのみ見いだされた（表１３と表１５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−２に対して中和力価１：１２８０が得られた（表１４）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表１５）。３つの試験を使用して、高レベルの血清型特異的抗体が検出され、ＰＬＬ２タンパク質で免疫した後に得られたものと同様であった。
【００４２】
【００４４】
【００４５】
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００４６】
実施例１３．ｐＬＨ１の入手
ＤＥＮ−１ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号３２）を、ＤＥＮ−１ウイルス株遺伝子型（Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.、デング１ウイルス株の構造タンパク質遺伝子間の遺伝的関連性、J. Gen. Virol. 1989, 70:1701-1712）からの配列６と配列７として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ１０８プラスミドをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨのＮ末端領域と６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２３）。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＬＨ１と呼ぶ、図４と配列番号３３）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ルリアベルタニ（Luria Bertani）（ＬＢ）培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果２５kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の１０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質のＮ末端領域とＤＥＮ−１ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦに含有されるポリクローナル抗体（ＰＡ）抗ＤＥＮ−１による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をＰＬＨ１と命名した（配列番号３４）。
【００４７】
実施例１４．ＰＬＨ１タンパク質の精製
ｐＬＨ１で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、７Ｍ尿素でタンパク質を抽出し、上清（ＰＬＨ１タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。６０mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をＧ−２５カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００４８】
実施例１５．ＰＬＨ１の抗原性解析
ＰＬＨ１の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表１６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−１で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型１の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−１に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００４９】
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００５０】
実施例１６．ＰＬＨ１が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、３５μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＬＬ１で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−１に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表１７と表２０）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−１に対してのみ見いだされた（表１８と表２０）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−１に対して中和力価１：３２０が得られた。しかし、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表１９と表２０）。これらの結果は、ＰＬＬ１に誘発された抗体の高い血清型特異性を示す。
【００５１】
【００５２】
【００５３】
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００５４】
実施例１７．ｐＬＨ２の入手
ＤＥＮ−１ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号３２）を、ＤＥＮ−１ウイルス株（Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.、デング１ウイルス株の構造タンパク質遺伝子間の遺伝的関連性、J. Gen. Virol. 1989, 70:1701-1712）からの配列６と配列８として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ８４ ＨｉｓプラスミドをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨのＮ末端領域と６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２６）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＬＨ２と呼ぶ、図５と配列番号３５）を用いて、コンピタントな細胞ＭＭ２９４を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−１ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−１による免疫ブロッティングで認識され、このタンパク質をＰＬＨ２と命名した（配列番号３６）。
【００５５】
実施例１８．ＰＬＨ２タンパク質の精製
ＰＬＬ２で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分に結合したタンパク質を、７Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰＬＨ２タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。４０mMイミダゾールでカラムを洗浄し、１００mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、調製物を調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００５６】
実施例１９．ＰＬＨ２の抗原性解析
ＰＬＨ２の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表２１）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−１で得られた（ＰＬＨ１で得られたものより高い）。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型１の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−１に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００５７】
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００５８】
実施例２０．ＰＬＨ２が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＬＨ２で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−１に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表２２と表２５）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−１に対してのみ見いだされた（表２３と表２５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−１に対して中和力価１：１２８０が得られた（表２４）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表２５）。
【００５９】
【００６１】
【００６２】
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００６３】
実施例２１．ｐＬＨ３の入手
ＤＥＮ−１ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号３２）を、ＤＥＮ−１ウイルス株（Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.、デング１ウイルス株の構造タンパク質遺伝子間の遺伝的関連性、J. Gen. Virol. 1989, 70:1701-1712）からの配列９と配列１０として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＤ４プラスミドをＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質をコードするヌクレオチド配列と停止コドンの無い６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２９）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質のＣ末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＬＨ３と呼ぶ、図６と配列番号３７）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−１ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ 抗ＤＥＮ−１による免疫ブロッティングで認識され、ＰＬＨ３と命名した（配列番号３８）。
【００６４】
実施例２２．ＰＬＨ３タンパク質の精製
ｐＬＨ３で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分から、６Ｍ尿素を使用してタンパク質を抽出し、上清（ＰＬＨ３タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。３０mMイミダゾールで洗浄し、タンパク質を２５０mMイミダゾールで溶出した。最後に、タンパク質の純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００６５】
実施例２３．ＰＬＨ３の抗原性解析
ＰＬＨ３の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表２６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−１で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型１の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−１に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００６６】
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００６７】
実施例２４．ＰＬＨ３が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＬＨ３で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−１に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表２７と表３０）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−１に対してのみ見いだされた（表２８と表３０）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−１に対して中和力価１：１２８０が得られた（表２９）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表３０）。
【００６８】
【００７０】
【００７１】
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００７２】
実施例２５．ｐＡＺ１の入手
ＤＥＮ−３ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号３９）を、ＤＥＮ−３ウイルス株遺伝子型（Osatomi K., Sumiyoshi H. デング３型ウイルスゲノムＲＮＡの完全なヌクレオチド配列、Virology 1990, 176(2):643-647）からの配列１１と配列１２として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ１０８ ＨｉｓプラスミドをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨのＮ末端領域と６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２３）。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＡＺ１と呼ぶ、図７と配列番号４０）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ルリアベルタニ（Luria Bertani）（ＬＢ）培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果２５kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の１０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質のＮ末端領域とＤＥＮ−３ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦに含有されるポリクローナル抗体（ＰＡ）抗ＤＥＮ−３による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をＰＡＺ１と命名した（配列番号４１）。
【００７３】
実施例２６．ＰＡＺ１タンパク質の精製
ｐＡＺ１で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、７Ｍ尿素でタンパク質を抽出し、上清（ＰＬＨ１タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。６０mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をＧ−２５カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００７４】
実施例２７．ＰＡＺ１の抗原性解析
ＰＡＺ１の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表３１）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−３で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型３の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−３に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００７５】
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００７６】
実施例２８．ＰＡＺ１が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、３５μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＡＺ１で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−１に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表３２と表３５）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−３に対してのみ見いだされた（表３３と表３５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−３に対して中和力価１：３２０が得られた。しかし、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表３４と表３５）。これらの結果は、ＰＡＺ１に誘発された抗体の高い血清型特異性を示す。
【００７７】
【００７９】
【００８０】
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００８１】
実施例２９．ＰＡＺ２の入手
ＤＥＮ−３ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号３９）を、ＤＥＮ−３ウイルス株遺伝子型（Osatomi K., Sumiyoshi H. デング３型ウイルスゲノムＲＮＡの完全なヌクレオチド配列、Virology 1990, 176(2):643-647）からの配列１１と配列１３として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ８４ ＨｉｓプラスミドをＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質をコードするヌクレオチド配列と６つのヒスチジンの配列をコードするヌクレオチド配列とを含有する（配列２６）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＡＺ２と呼ぶ、図８と配列番号４２）を用いて、コンピタントな細胞ＭＭ２９４を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−３ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−３による免疫ブロッティングで認識され、ＰＡＺ２と命名した（配列番号４３）。
【００８２】
実施例３０．ＰＡＺ２タンパク質の精製
ＰＡＺ２で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分に結合したタンパク質を、７Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰＡＺ２タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。カラムを４０mMイミダゾールで洗浄し、１００mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００８３】
実施例３１．ＰＡＺ２の抗原性解析
ＰＡＺ２の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表３６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−３で得られた（ＰＡＺ１で得られたものより高い）。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型３の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−３に対する高力価の５つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００８４】
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００８５】
実施例３２．ＰＡＺ２が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＡＺ２で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−３に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表３７と表４０）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−３に対してのみ見いだされた（表３８と表４０）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−３に対して中和力価１：１２８０が得られた（表３９）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表４０）。
【００８６】
【００８８】
【００８９】
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００９０】
実施例３３．ｐＡＺ３の入手
ＤＥＮ−３ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号３９）を、ＤＥＮ−３ウイルス株（Osatomi K., Sumiyoshi H. デング３型ウイルスゲノムＲＮＡの完全なヌクレオチド配列、Virology 1990, 176(2):643-647）からの配列１４と配列１５として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＤ４プラスミドをＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質をコードするヌクレオチド配列と停止コドンの無い６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２９）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質のＣ末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＡＺ３と呼ぶ、図９と配列番号４４）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−３ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−３による免疫ブロッティングで認識され、ＰＡＺ３と命名した（配列番号４５）。
【００９１】
実施例３４．ＰＡＺ３タンパク質の精製
ＰＡＺ３で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分から、タンパク質を７Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰＡＺ３タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。カラムを４５mMイミダゾールで洗浄し、２３０mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、タンパク質の純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、調製緩衝液（ＰＢＳ）中のタンパク質を得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【００９２】
実施例３５．ＰＡＺ３の抗原性解析
ＰＡＺ３の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表２６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−３で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型３の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−３に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【００９３】
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【００９４】
実施例３６．ＰＡＺ３が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＡＺ３で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−３に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表４２と表４５）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−３に対してのみ見いだされた（表４３と表４５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−３に対して中和力価１：１２８０が得られた（表４４）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表４５）。
【００９５】
【００９７】
【００９８】
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【００９９】
実施例３７．ｐｌＤ１の入手
ＤＥＮ−４ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）を、ＤＥＮ−４ウイルス株遺伝子型（Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング４型ウイルスＤＮＡ配列のクローニング：構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88）からの配列１７と配列１８として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ１０８ Ｈｉｓ プラスミドをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨのＮ末端領域と６つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する（配列２３）。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐｌＤ１と呼ぶ、図１０と配列番号４７）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ルリアベルタニ（ＬＢ）培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果２５kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の１０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−４ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ中に含有されるポリクローナル抗体（ＰＡ）抗ＤＥＮ−４による免疫ブロッティングで認識され、ｐｌＤ１と命名した（配列番号４８）。
【０１００】
実施例３８．ＰｌＤ１タンパク質の精製
ｐｌＤ１で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、６Ｍ尿素でタンパク質を抽出し、上清（ＰｌＤ１タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。６０mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をＧ−２５カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【０１０１】
実施例３９．ＰｌＤ１の抗原性解析
ＰｌＤ１の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表４６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−４で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型４の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−４に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【０１０２】
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【０１０３】
実施例４０．ＰｌＤ１が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、３５μgのフロイントアジュバント中の精製ＰｌＤ１で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−１に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表４７と表５０）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−４に対してのみ見いだされた（表４８と表５０）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−４に対して中和力価１：３２０が得られた。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表４９と表５０）。これらの結果は、ＰｌＤ１により誘発される抗体の高い血清型特異性を示す。
【０１０４】
【０１０６】
【０１０７】
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【０１０８】
実施例４１．ｐｌＤ２の入手
ＤＥＮ−４ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）を、ＤＥＮ−４ウイルス株（Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング４型ウイルスＤＮＡ配列のクローニング：構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88）からの配列１６と配列１８として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＭ８４ ＨｉｓプラスミドをＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質をコードするヌクレオチド配列と６つのヒスチジンの配列をコードするヌクレオチド配列とを含有する（配列２６）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐｌＤ２と呼ぶ、図１１と配列番号４９）を用いて、コンピタントな細胞ＭＭ２９４を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−４ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−４による免疫ブロッティングで認識され、ＰｌＤ２と命名した（配列番号５０）。
【０１０９】
実施例４２．ＰｌＤ２タンパク質の精製
ｐｌＤ２で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分に結合したタンパク質を６Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰｌＤ２タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。カラムを３０mMイミダゾールで洗浄し、２５０mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【０１１０】
実施例４３．ＰｌＤ２の抗原性解析
ＰｌＤ２の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表５１）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−４で得られた（ＰｌＤ１で得られたものより高い）。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型４の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−３に対する高力価の５つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【０１１１】
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【０１１２】
実施例４４．ＰｌＤ２が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰｌＤ２で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−４に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表５２と表５５）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−４に対してのみ見いだされた（表５３と表５５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−４に対して中和力価１：１２８０が得られた（表５４）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表５５）。
【０１１３】
【０１１５】
【０１１６】
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【０１１７】
実施例４５．ｐｌＤ３の入手
ＤＥＮ−４ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）を、ＤＥＮ−４ウイルス株（Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング４型ウイルスＤＮＡ配列のクローニング：構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88）からの配列１９と配列２０として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＤ４プラスミドをＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨタンパク質をコードするヌクレオチド配列と６つのヒスチジンの配列をコードするヌクレオチド配列とを含有する（配列２９）。この消化により、ＰＣＲにより増幅した断片を、ＭＤＨタンパク質のＣ末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐｌＤ３と呼ぶ、図１２と配列番号５１）を用いて、コンピタントな細胞Ｗ３１１０を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果８０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とＤＥＮ−４ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−４による免疫ブロッティングで認識され、ＰｌＤ３と命名した（配列番号５２）。
【０１１８】
実施例４６．ＰｌＤ３タンパク質の精製
ｐｌＤ３で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型（可溶性と不溶性）で得られた。不溶性画分から、タンパク質を６Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰｌＤ３タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。カラムを４５mMイミダゾールで洗浄し、２００mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液（ＰＢＳ）中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
【０１１９】
実施例４７．ＰｌＤ３の抗原性解析
ＰｌＤ３の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表５６）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−４で得られた。他の血清型に対するＨＭＡＦによる認識は、血清型４の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、ＤＥＮ−４に対する高力価の３つのヒト血清と低力価の３つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【０１２０】
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【０１２１】
実施例４８．ＰｌＤ３が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＡＺ３で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−４に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表５７と表６０）。さらに、ＨＩ測定を行い、陽性力価はＤＥＮ−４に対してのみ見いだされた（表５８と表６０）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−４に対して中和力価１：１２８０が得られた（表５９）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表６０）。
【０１２２】
【０１２４】
【０１２５】
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【０１２６】
実施例４９．ｐＤ４Ｄ２の入手
ＤＥＮ−４ウイルスからのＥタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）を、ＤＥＮ−４ウイルス株（Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング４型ウイルスＤＮＡ配列のクローニング：構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88）からの配列１６と配列２１として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
ｐＬＬ３プラスミドをＸｂａＩ／ＸｂａＩで消化してベクターを作成し、これは、ＭＤＨ遺伝子と、この遺伝子の３’領域の６つのヒスチジンの配列および３’末端中のＤＥＮ−２からのＥ断片の配列とを含有する。その結果、同じＭＤＨ遺伝子に融合した、血清型２と４からＥタンパク質の２つの領域が得られた。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン（ｐＤ４Ｄ２と呼ぶ、図１３と配列番号５３）を用いて、コンピタントな細胞ＭＭ２９４を形質転換した。ＬＢ培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果１１０kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の２０％を占めた。得られたタンパク質のサイズは、ＭＤＨタンパク質とデング熱ウイルスからのＤＥＮｅタンパク質の２つの断片の合計に対応した。このタンパク質は、ＨＭＡＦに含有されるポリクローナル抗体抗ＤＥＮ−２と抗ＤＥＮ−４による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をＰＤ４Ｄ２と命名した（配列番号５４）。
【０１２７】
実施例５０．ＰＤ４Ｄ２タンパク質の精製
ｐＤ４Ｄ２で形質転換し３７℃で培養した大腸菌（E. coli）株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が可溶性または不溶性で得られた。ペレットからタンパク質を６Ｍ尿素を使用して抽出し、上清（ＰＤ４Ｄ２タンパク質を含有）をＧ−２５カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Ｃｕ++イオンの存在下でキレート−セファロースＦＦカラム（ファルマシア（Pharmacia）、英国）にのせた。３０mMイミダゾールで洗浄工程を行い、２５０mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をＧ−２５カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液中に得て、これを免疫学的試験に使用した。
【０１２８】
実施例５１．ＰＤ４Ｄ２の抗原性解析
ＰＤ４Ｄ２の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および／またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した（表６１）。
ドットブロッティングの最も高い認識は、ＨＭＡＦ抗ＤＥＮ−２と抗ＤＥＮ−４で得られた。他の２つの血清型の認識は、血清型２と４の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。一方、ＰＬＬ２とＰＬＬ３について得られたものと同様に、Ｍａｂ ３Ｈ５は確かに反応性を有した。最後に、ＤＥＮ−２とＤＥＮ−４に対する高力価と低力価のヒト血清に対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
【０１２９】
** ＨＭＡＦは１：１００で使用し、Ｍａｂ ３Ｈ５は１：１０００希釈で使用した。
*** ＥＥＥ：ウマ脳炎ウイルス。ＹＦＶ：黄熱病ウイルス。ＳＬＶ：セントルイス脳炎ウイルス。ＮＴ：中和性特異的血清型。
【０１３０】
実施例５２．ＰＤ４Ｄ２が生成する抗体応答の性状解析
全部で２５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μgのフロイントアジュバント中の精製ＰＤ４Ｄ２で腹腔内免疫し、４回投与後に１０匹の動物を放血させ、抗ＤＥＮ抗体をＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＥＮ−２とＤＥＮ−４に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった（表６２と表６５）。さらに、血球凝集阻害測定（ＨＩ）を行い、陽性力価はＤＥＮ−２とＤＥＮ−４に対してのみ見いだされた（表６３と表６５）。最後に、インビトロ中和測定を行い、ＤＥＮ−２に対して中和力価＞１：１２８０およびＤＥＮ−４に対して＞１：１２８０が得られた（表６４）。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった（表６５）。
【０１３１】
【０１３３】
【０１３４】
** ＨＩ力価は、８血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が５０％低下する血清の最大希釈率として定義した。
【０１３５】
実施例５３．防御測定法
同種の致死的ＤＥＮで抗原刺激したすべての測定した変種で免疫したマウスに付与される防御の評価のために、各群１５匹のマウスを使用した。各動物に、致死的ＤＥＮの１００ ＬＤ50を１回頭蓋内接種し、２１日間観察して致死率を調べた。陽性対照として、４つのウイルス調製物（ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４）で免疫した１５匹のマウスの群を使用した。これらの対照群のすべてのマウスは生き残ったが、陰性対照群からのマウスは、抗原刺激の７〜１１日後に病気になり、死亡率１００％であった。最後に、被験融合タンパク質は、８０％〜１００％の防御率であり、すべての場合に、対照群と比較して大きな差があった（表６６）。
【０１３６】
【０１３７】
実施例５４．リンパ増殖性応答
ＤＥＮ−２からのＥ断片を含有するキメラタンパク質（ＰＬＬ１、ＰＬＬ２、およびＰＬＬ３）で免疫した異なる群からの動物、およびプラセボ群を、最後の投与の１５日後に屠殺した。次に、動物の脾臓を採取し、４つの血清型のデング熱ウイルスに対するリンパ増殖性応答を調べた。表６７は、得られた刺激指数の結果を示し、これは、血清型特異的応答が得られたことを示す。
【０１３８】
** 分裂促進因子：植物性血球凝集素。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ＰＬＬ１を得るためのＥ２断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ２：ＤＥＮ−２のエンベロープタンパク質の断片。 Ｎ−ｔｅｒｍ：ＭＤＨタンパク質の最初の４５アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図２】ＰＬＬ２を得るためのＥ２断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ２：ＤＥＮ−２のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図３】ＰＬＬ３を得るためのＥ２断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ２：ＤＥＮ−２のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図４】ＰＬＨ１を得るためのＥ１断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ１：ＤＥＮ−１のエンベロープタンパク質の断片。 Ｎ−ｔｅｒｍ：ＭＤＨタンパク質の最初の４５アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図５】ＰＬＨ２を得るためのＥ１断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ１：ＤＥＮ−１のエンベロープタンパク質の断片。 Ｎ−ｔｅｒｍ：ＭＤＨタンパク質の最初の４５アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図６】ＰＬＨ３を得るためのＥ１断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ１：ＤＥＮ−１のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図７】ＰＡＺ１を得るためのＥ３断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ３：ＤＥＮ−３のエンベロープタンパク質の断片。 Ｎ−ｔｅｒｍ：ＭＤＨタンパク質の最初の４５アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図８】ＰＡＺ２を得るためのＥ３断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ３：ＤＥＮ−３のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図９】ＰＡＺ３を得るためのＥ３断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ３：ＤＥＮ−３のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図１０】ＰｌＤ１を得るためのＥ４断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ４：ＤＥＮ−４のエンベロープタンパク質の断片。 Ｎ−ｔｅｒｍ：ＭＤＨタンパク質の最初の４５アミノ酸をコードするヌクレオチド配列。
【図１１】ＰｌＤ２を得るためのＥ４断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ４：ＤＥＮ−４のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図１２】ＰｌＤ３を得るためのＥ４断片のクローニング法。 ＤＥＮｅ４：ＤＥＮ−４のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【図１３】ＰＤ４Ｄ２を得るためのクローニング法。 ＤＥＮｅ４：ＤＥＮ−４のエンベロープタンパク質の断片。 ＤＥＮｅ２：ＤＥＮ−２のエンベロープタンパク質の断片。 ＭＤＨ：脱水素酵素変異体。
【０１４０】
Claims (35)
- フラビウイルスからのＥタンパク質の断片に対応する配列と、配列番号２６、配列番号２９として配列リストで特定される変異ＭＤＨタンパク質のコード遺伝子に対応する配列との、または配列番号２３として特定されるこれらの断片との、特定の組合せを特徴とするキメラヌクレオチド鎖であって、これらのタンパク質が医薬調製物中に存在すると、フラビウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるキメラタンパク質をコードする、上記キメラヌクレオチド鎖。
- デング熱ウイルスからのＥタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードする１つまたは数個の配列と、ＭＤＨタンパク質のヌクレオチド配列との特定の組合せであることを特徴とする、請求項１のキメラヌクレオチド鎖であって、これらの配列は、配列番号２６、配列番号２９または配列番号２３として配列リストで特定される配列に、挿入および／または融合され、フラビウイルスの各血清型に対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるキメラタンパク質をコードする、上記キメラヌクレオチド鎖。
- 請求項１および２のキメラヌクレオチド鎖であって、配列番号２３として特定される、ＭＤＨタンパク質の最初の４５アミノ酸をコードする３’末端領域に融合した、デング熱ウイルスの各血清型１、２、３および４からのＥタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６のコード配列により形成されることを特徴とする、上記キメラヌクレオチド鎖。
- 請求項１および２のキメラヌクレオチド鎖であって、配列番号２６として特定される、ＭＤＨタンパク質の４５アミノ酸をコードする３’末端領域に融合した、デング熱ウイルスの各血清型１、２、３および４からのＥタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６のコード配列により形成されることを特徴とする、上記キメラヌクレオチド鎖。
- 請求項１および２のキメラヌクレオチド鎖であって、配列番号２９として特定される、ＭＤＨタンパク質の３’末端領域に融合した、デング熱ウイルスの各血清型１、２、３および４からのＥタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６のコード配列により形成されることを特徴とする、上記キメラヌクレオチド鎖。
- デング熱ウイルスの２つの異なる血清型からのＥタンパク質のアミノ酸２８６〜４２６をコードするヌクレオチド配列と、ＭＤＨの配列との組合せであることを特徴とする、請求項１および２のキメラヌクレオチド鎖であって、ここで、Ｅタンパク質に対応する配列の１つは、ＭＤＨタンパク質のアミノ酸４５をコードする領域に挿入され、他の１つは、配列番号２９として特定される、同じＭＤＨ配列の３’領域に融合されることを特徴とする、上記キメラヌクレオチド鎖。
- 請求項１、２、３、４、５および６のヌクレオチド鎖の発現産物であり、かつこれらのタンパク質が医薬調製物中に存在すると、デング熱ウイルスの各血清型に対して血清型特異的な中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を、受容体中で誘導できることを特徴とする、組換えキメラタンパク質。
- 請求項１および６のヌクレオチド鎖の発現産物であり、かつデング熱ウイルスの２つの同種の血清型に対して特異的な中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を、受容体中で誘導できることを特徴とする、キメラ組換えタンパク質。
- 配列番号２２と配列番号２３として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、請求項１、２および３の、基本的に配列番号２４により特定される、キメラタンパク質ＰＬＬ１をコードするキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号２５として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号２４の発現産物であり、かつＰＬＬ１が医薬調製物中に存在すると、デング−２ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項１、２および７のキメラタンパク質ＰＬＬ１。
- 配列番号２２と配列番号２６として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号２７として特定される、キメラタンパク質ＰＬＬ２をコードする、請求項１、２および４のキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号２８として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号２７の発現産物であり、かつＰＬＬ２が医薬調製物中に存在すると、デング−２ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項１、２および７のキメラタンパク質ＰＬＬ２。
- 配列番号２２と配列番号２９として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号３０として特定される、キメラタンパク質ＰＬＬ３をコードする、請求項１、２および５のキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号３１として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号３０の発現産物であり、かつＰＬＬ３が医薬調製物中に存在すると、デング−２ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項１、２および７のキメラタンパク質ＰＬＬ３。
- 配列番号２３と配列番号３２として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号３３として特定される、キメラタンパク質ＰＬＨ１をコードする、請求項１、２および３のキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号３４として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号３３の発現産物であり、かつＰＬＨ１が医薬調製物中に存在すると、デング−１ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項１、２および７のキメラタンパク質ＰＬＨ１。
- 配列番号２６と配列番号３２として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号３５として特定される、キメラタンパク質ＰＬＨ２をコードする、請求項１、２および４のキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号３６として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号３５の発現産物であり、かつＰＬＨ２が医薬調製物中に存在すると、デング−１ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項１、２および７のキメラタンパク質ＰＬＨ２。
- 配列番号２９と配列番号３２として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号３７として特定される、キメラタンパク質ＰＬＨ３をコードする、請求項１、２および５のキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号３８として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号３７の発現産物であり、かつＰＬＨ３が医薬調製物中に存在すると、デング−１ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項１、２および７のキメラタンパク質ＰＬＨ３。
- 配列番号２３と配列番号３９として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号４０として特定される、キメラタンパク質ＰＡＺ１をコードする、請求項１、２および３のキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号４１として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号４０の発現産物であり、かつＰＡＺ１が医薬調製物中に存在すると、デング−１ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項１、２および７のキメラタンパク質ＰＡＺ１。
- 配列番号２６と配列番号３９として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号４２として特定される、キメラタンパク質ＰＡＺ２をコードする、請求項１、２および４のキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号４３として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号４２の発現産物であり、かつＰＡＺ２が医薬調製物中に存在すると、デング−３ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項１、２および７のキメラタンパク質ＰＡＺ２。
- 配列番号２９と配列番号３９として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号４４として特定される、キメラタンパク質ＰＡＺ３をコードする、請求項１、２および５のキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号４５として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号４４の発現産物であり、かつＰＡＺ３が医薬調製物中に存在すると、デング−３ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項１、２および７のキメラタンパク質ＰＬＡＺ３。
- 配列番号２３と配列番号４６として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号４７として特定される、キメラタンパク質Ｐ１Ｄ１をコードする、請求項１、２および３のキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号４８として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号４７の発現産物であり、かつＰ１Ｄ１が医薬調製物中に存在すると、デング−４ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項１、２および７のキメラタンパク質Ｐ１Ｄ１。
- 配列番号２６と配列番号４６として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号４９として特定される、キメラタンパク質ＰＩＤ２をコードする、請求項１、２および４のキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号５０として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号４９の発現産物であり、かつＰＩＤ２が医薬調製物中に存在すると、デング−４ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項１、２および７のキメラタンパク質ＰＩＤ２。
- 配列番号２９と配列番号４６として配列リストで特定される配列の組合せであることを特徴とする、基本的に配列番号５１として特定される、キメラタンパク質ＰＩＤ３をコードする、請求項１、２および５のキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号５２として配列リストで特定されるアミノ酸配列を基本的に有し、配列番号５１の発現産物であり、かつＰＩＤ３が医薬調製物中に存在すると、デング−４ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できることを特徴とする、請求項１、２および７のキメラタンパク質ＰＩＤ３。
- 請求項１、２、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２に記載のキメラタンパク質の２つ以上と、薬剤ビヒクルとを有することを特徴とする、請求項１の、デング熱ウイルスに対して特異的な防御性免疫応答を受容体で誘導することができる医薬調製物。
- 経口、筋肉内、皮下、粘膜または静脈内使用のための、デング熱ウイルスに対する予防または治療薬であることを特徴とする、請求項３３の医薬調製物。
- デング熱ウイルスの診断と血清型判定に有用な、請求項１、２、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０および３２に記載のタンパク質の１つまたは数個を有することを特徴とする診断手段。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU20010172A CU23245A1 (es) | 2001-07-16 | 2001-07-16 | CADENAS QUIMéRICAS CODIFICANTES PARA PROTEINAS INDUCTORAS DE EFECTOS CONTRA VIRUS. PREPARADOS UTILIZANDO PROTEINAS QUIMéRICAS |
| PCT/CU2002/000006 WO2003008571A2 (es) | 2001-07-16 | 2002-07-12 | Cadenas quiméricas codificantes para proteínas inductoras de efectos contra virus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004537306A true JP2004537306A (ja) | 2004-12-16 |
| JP4417712B2 JP4417712B2 (ja) | 2010-02-17 |
Family
ID=40091633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003514888A Expired - Fee Related JP4417712B2 (ja) | 2001-07-16 | 2002-07-12 | ウイルスに対する作用を誘導するタンパク質をコードするキメラ鎖 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7279164B2 (ja) |
| EP (1) | EP1418180B1 (ja) |
| JP (1) | JP4417712B2 (ja) |
| KR (1) | KR100991717B1 (ja) |
| CN (1) | CN100378123C (ja) |
| AT (1) | ATE349466T1 (ja) |
| BR (1) | BR0211178A (ja) |
| CA (1) | CA2453300C (ja) |
| CU (1) | CU23245A1 (ja) |
| DE (1) | DE60217129T2 (ja) |
| DK (1) | DK1418180T3 (ja) |
| ES (1) | ES2278041T3 (ja) |
| GT (1) | GT200200150A (ja) |
| MX (1) | MXPA04000486A (ja) |
| MY (1) | MY138482A (ja) |
| PT (1) | PT1418180E (ja) |
| WO (1) | WO2003008571A2 (ja) |
| ZA (1) | ZA200400289B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009507864A (ja) * | 2005-09-16 | 2009-02-26 | セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア | デングウイルスのカプシドタンパク質を有する、デングウイルスに対する防御反応を誘導することができる医薬品組成物 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CU23245A1 (es) * | 2001-07-16 | 2007-10-17 | Inst De Medicina Tropical Pedr | CADENAS QUIMéRICAS CODIFICANTES PARA PROTEINAS INDUCTORAS DE EFECTOS CONTRA VIRUS. PREPARADOS UTILIZANDO PROTEINAS QUIMéRICAS |
| CU23586A1 (es) | 2005-11-22 | 2010-10-30 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Métodos y proteínas para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de los cuatro serotipos del virus de dengue y otros flavivirus |
| CU23630A1 (es) * | 2006-10-30 | 2011-02-24 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Moléculas peptídicas quiméricas con propiedades antivirales contra los virus de la familia flaviviridae |
| CU20080028A6 (es) | 2008-02-29 | 2011-02-24 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Compuestos químicos obtenidos in silico para la preparación de composiciones farmacéuticas para atenuar o inhibir la infección por virus dengue y otros flavivirus |
| EP2632485A4 (en) * | 2010-10-29 | 2014-05-28 | Merck Sharp & Dohme | RECOMBINANT SUBUNIT VACCINE AGAINST DENGUE VIRUS |
| CU24188B1 (es) * | 2012-12-27 | 2016-07-29 | Ct De Ingeniería Genética Y Biotecnología | Composición vacunal contra el virus dengue |
| ITRM20130458A1 (it) * | 2013-08-05 | 2015-02-05 | Internat Ct For Genetic En Gineering And | Vaccino genetico anti-dengue virus basato sugli ectodomini della proteina envelope |
| CN113583117B (zh) * | 2018-04-04 | 2022-04-15 | 中国科学院微生物研究所 | 一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CU22302A1 (es) | 1990-09-07 | 1995-01-31 | Cigb | Secuencia nucleotidica codificante para una proteina de la membrana externa de neisseria meningitidis y uso de dicha proteina en preparados vacunales |
| ATE310824T1 (de) | 1991-09-19 | 2005-12-15 | Chimäre und/oder wachstumsgehemmte flaviviren | |
| DK0836482T3 (da) * | 1995-05-24 | 2003-02-17 | Hawaii Biotech Group | Subunitvaccine rettet imod flavivirusinfektion |
| CU22559A1 (es) | 1996-01-17 | 1999-05-03 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Sistema de expresión de antígenos heterologos en e. coli como proteínas de fusión |
| EP0907659A1 (en) | 1996-05-10 | 1999-04-14 | Schering Corporation | Synthetic inhibitors of hepatitis c virus ns3 protease |
| CU22666A1 (es) | 1996-11-25 | 2001-04-27 | Inst De Medicina Tropical Pedro Kouri | Procedimiento para la expresión de genes de los virus del dengue en la levadura pichia pastoris, adns recombinantes y microorganismos transformados |
| CU22683A1 (es) * | 1997-01-15 | 2001-07-20 | Inst De Medicina Tropical Pedro Kouri | Epítopes de la proteína pre-m/m del virus del dengue, péptidos sintéticos, proteínas quiméricas y sus usos |
| IL134232A0 (en) | 1997-08-11 | 2001-04-30 | Boehringer Ingelheim Ca Ltd | Hepatitis c inhibitor peptides |
| AU9794198A (en) | 1997-10-08 | 1999-04-27 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Chimeric vaccine against tick-borne encephalitis virus |
| CN1359426A (zh) | 1999-04-30 | 2002-07-17 | 希龙公司 | 奈瑟球菌基因组序列及其用法 |
| CU23245A1 (es) | 2001-07-16 | 2007-10-17 | Inst De Medicina Tropical Pedr | CADENAS QUIMéRICAS CODIFICANTES PARA PROTEINAS INDUCTORAS DE EFECTOS CONTRA VIRUS. PREPARADOS UTILIZANDO PROTEINAS QUIMéRICAS |
| AU2003239932A1 (en) | 2002-05-31 | 2003-12-19 | Acambis, Inc. | Tetravalent dengue vaccines |
| US20040213808A1 (en) | 2002-12-11 | 2004-10-28 | Michael Lieberman | Recombinant vaccine against flavivirus infection |
| EP1454988A1 (en) | 2003-03-03 | 2004-09-08 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Infectious flavivirus pseudo-particles containing functional prM-E envelope proteins |
| WO2005002501A2 (en) | 2003-04-22 | 2005-01-13 | Children's Medical Center Corporation | Novel druggable regions in the dengue virus envelope glycoprotein and methods of using the same |
| BRPI0606479A (pt) | 2005-01-19 | 2008-03-11 | Vaxinnate Corp | composições; proteìnas de fusão; polipepitìdeos; e métodos para estimular uma resposta imune em um indivìduo |
| CA2508266A1 (fr) | 2005-06-20 | 2006-12-20 | Institut Pasteur | Polypeptides chimeriques et leurs applications therapeutiques contre une infection a flaviviridae |
| CU23632A1 (es) | 2006-04-28 | 2011-02-24 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Métodos para la identificación de candidatos terapéuticos contra enfermedades causadas por flavivirus y moléculas antivirales. |
-
2001
- 2001-07-16 CU CU20010172A patent/CU23245A1/es unknown
-
2002
- 2002-07-10 MY MYPI20022623A patent/MY138482A/en unknown
- 2002-07-12 BR BR0211178-0A patent/BR0211178A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-07-12 KR KR1020047000610A patent/KR100991717B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-07-12 CA CA2453300A patent/CA2453300C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-12 DE DE60217129T patent/DE60217129T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-12 PT PT02760073T patent/PT1418180E/pt unknown
- 2002-07-12 ES ES02760073T patent/ES2278041T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-12 EP EP02760073A patent/EP1418180B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-12 CN CNB028143507A patent/CN100378123C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-12 JP JP2003514888A patent/JP4417712B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-12 US US10/484,114 patent/US7279164B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-12 MX MXPA04000486A patent/MXPA04000486A/es active IP Right Grant
- 2002-07-12 AT AT02760073T patent/ATE349466T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-07-12 GT GT200200150A patent/GT200200150A/es unknown
- 2002-07-12 DK DK02760073T patent/DK1418180T3/da active
- 2002-07-12 WO PCT/CU2002/000006 patent/WO2003008571A2/es active IP Right Grant
-
2004
- 2004-01-14 ZA ZA200400289A patent/ZA200400289B/xx unknown
-
2007
- 2007-02-13 US US11/705,696 patent/US7566457B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-06-12 US US12/483,607 patent/US7947281B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-04-26 US US13/094,287 patent/US8105606B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009507864A (ja) * | 2005-09-16 | 2009-02-26 | セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア | デングウイルスのカプシドタンパク質を有する、デングウイルスに対する防御反応を誘導することができる医薬品組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7279164B2 (en) | 2007-10-09 |
| ZA200400289B (en) | 2004-09-12 |
| CN100378123C (zh) | 2008-04-02 |
| US20040234951A1 (en) | 2004-11-25 |
| DE60217129T2 (de) | 2007-10-31 |
| CN1531548A (zh) | 2004-09-22 |
| US7947281B2 (en) | 2011-05-24 |
| PT1418180E (pt) | 2007-04-30 |
| US8105606B2 (en) | 2012-01-31 |
| EP1418180A2 (en) | 2004-05-12 |
| DE60217129D1 (de) | 2007-02-08 |
| EP1418180B1 (en) | 2006-12-27 |
| WO2003008571A9 (es) | 2004-04-15 |
| CA2453300C (en) | 2012-03-20 |
| MXPA04000486A (es) | 2005-03-07 |
| ATE349466T1 (de) | 2007-01-15 |
| US20110200628A1 (en) | 2011-08-18 |
| ES2278041T3 (es) | 2007-08-01 |
| DK1418180T3 (da) | 2007-05-07 |
| CU23245A1 (es) | 2007-10-17 |
| GT200200150A (es) | 2003-06-19 |
| KR20040030056A (ko) | 2004-04-08 |
| MY138482A (en) | 2009-06-30 |
| JP4417712B2 (ja) | 2010-02-17 |
| WO2003008571A3 (es) | 2004-03-04 |
| CA2453300A1 (en) | 2003-01-30 |
| US20090274718A1 (en) | 2009-11-05 |
| BR0211178A (pt) | 2004-08-10 |
| US20070141081A1 (en) | 2007-06-21 |
| KR100991717B1 (ko) | 2010-11-03 |
| WO2003008571A2 (es) | 2003-01-30 |
| US7566457B2 (en) | 2009-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fahimi et al. | Dengue viruses and promising envelope protein domain III-based vaccines | |
| US8105606B2 (en) | Chimeric proteins that induce effects directed against viruses | |
| US8105609B2 (en) | Flavivirus immunogens comprising extracellular viral particles composed of the premembrane (prM) and envelope (E) antigens | |
| Megret et al. | Use of recombinant fusion proteins and monoclonal antibodies to define linear and discontinuous antigenic sites on the dengue virus envelope glycoprotein | |
| EP1005363B1 (en) | Recombinant dimeric envelope vaccine against flaviviral infection | |
| JP2009524581A (ja) | デング熱ウイルスの４種の血清型及び他のフラビウイルス属の予防的処置及び／又は治療的処置のための方法及びタンパク質 | |
| Hermida et al. | A dengue-2 Envelope fragment inserted within the structure of the P64k meningococcal protein carrier enables a functional immune response against the virus in mice | |
| JP2002325593A (ja) | キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス | |
| EP1944038B1 (en) | Dengue virus capsid protein which induces a protective response and pharmaceutical composition | |
| JP2016504315A (ja) | 三価デングウイルス製剤に関する組成物、投与方法および使用 | |
| Zulueta et al. | Amino acid changes in the recombinant Dengue 3 Envelope domain III determine its antigenicity and immunogenicity in mice | |
| EP4378475A1 (en) | Recombinant antigen for inducing an immune response against the zika virus | |
| Vrati | Immunogenicity and protective eYcacy of the E. coli-expressed domain III of Japanese encephalitis virus envelope protein in mice |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050214 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080108 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080408 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090424 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090821 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090824 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20090917 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091013 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091126 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121204 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121204 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131204 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |