WO2003008571A9 - Cadenas quiméricas codificantes para proteínas inductoras de efectos contra virus - Google Patents

Cadenas quiméricas codificantes para proteínas inductoras de efectos contra virus

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Cruz Lisset Hermida
Diaz Rayner Rodriguez
Vazquez Laura Lazo
Morales Aida Zulueta
Abarrategui Carlos Lopez
Prado Iris Valdes
Rodriguez Ricardo De La Silva
Santiago Glay Chinea
Nieto Gerardo Enrique Guillen
Tirado Maria Guadalupe Guzman
Vazquez Beatriz De La C Sierra
Perez Raul Rafael Espinosa
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Ct Ingenieria Genetica Biotech
Inst De Medicina Tropical Pedr
Cruz Lisset Hermida
Diaz Rayner Rodriguez
Vazquez Laura Lazo
Morales Aida Zulueta
Abarrategui Carlos Lopez
Prado Iris Valdes
Rodriguez Ricardo De La Silva
Santiago Glay Chinea
Nieto Gerardo Enrique Guillen
Tirado Maria Guadalupe Guzman
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Perez Raul Rafael Espinosa
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Definitions

  • the present invention is related to the field of biotechnology and the pharmaceutical industry, in particular with the obtaining of chimeric nucleotide chains which, when introduced into an expression vector, result in proteins capable of inducing serotype humoral response.
  • specific and protection against infection with the Dengue virus, hereinafter referred to as DEN avoiding the effects of non-specific serotype viral amplification causing the hemorrhages and clinical complications described in this type of pathology.
  • Dengue virus is an enveloped virus whose lipid membrane contains two of its three structural proteins: the envelope protein and the membrane protein. This protein envelope surrounds an icosahedral nucleocapsid composed of the third of its structural proteins, the capsid protein. This virus belongs to the family Flavivir ⁇ dae and there are four different serotypes. Its transmission to man is done through the Aedes aegypti mosquito, which belongs to the Stegomia family.
  • the disease produced in humans by this virus was considered benign and was described as Dengue Fever or Classic Dengue (FD) until the appearance of a more serious and sometimes lethal modality characterized by hemorrhagic fever and shock, called: Dengue Hemorrhagic Fever and Dengue Shock Syndrome (FHD / SCD) (Hammon WMc. New haemorragic fever in children in the Philippines and Thailand. Trans Assoc Physicians 1960; 73: 140-155).
  • FHD / SCD Dengue Hemorrhagic Fever and Dengue Shock Syndrome
  • Several epidemiological studies have been carried out, showing as a risk factor the sequential infection by two different viral serotypes (Kour ⁇ GP, Guzmán MG, Bravo JR. Why dengue hemorrhagic fever in Cuba? 2. An integral analysis.
  • recombinant antigens have been obtained as possible components of a subunit vaccine (Feighny, R., Borrous, J. and Putnak R. Dengue type-2 virus envelope protein made using recombinant baculovirus proteets mice against virus challenge. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1994. 50 (3). 322-328; Deubel, V., Staropoli, I., Megret, F., et al. Affinity-purified dengue-2 virus envelope glycoprotein induces neutralizing antibodies and protective mmunity in mice. Vaccine 1997. 15, 1946-1954).
  • the main antigen is the DENe protein in the virus envelope.
  • This protein is the major component of the virion surface and it is proposed that it mediates the binding of the virus to the cellular receptor (A Heinz FX, Berge R, Turna W et al. A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick- bome encephalitis virus defined by monoclonal antibodies. Virology. 1983; 126: 525).
  • This protein has structural homology with that of the tick-mediated encephalitis virus (TBE) (Rey, FA, Heinz, FX, Mandl, O, et al. The envelope glycoprotein from tick borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature 1995 ; 375: 291-298) and among the serotypes it is structurally preserved.
  • Insect cells constitute one of the systems used for the expression of various foreign genes that use baculoviruses as vectors. These vectors have been used for the expression of different combinations of structural and non-structural proteins of the Japanese Encephalitis virus (JEV), DEN-1, DEN-2 and DEN-4, (Matsuura Y, Miyamoto M, Soto T et al. Characterization of Japanese encephalitis virus envelope protein expressed by recombinant baculoviruses. Virology 1989; 173: 677-682; Deubel V, Bordier M, Megret F et al.
  • JEV Japanese Encephalitis virus
  • DEN-1 DEN-1
  • DEN-2 DEN-4
  • MBP-DomB MBP-DomB
  • the object of this invention is about obtaining chimeric sequences, such as the first one formed by the sequence that codes for a region of the DENe protein linked to the sequence that codes for the N-terminal fragment of a mutant protein with dehydrogenase activity (MDH) of N.meningitidis, the second, by the sequence that codes for the region the DENe protein, linked to the complete gene of the MDH protein in two different positions and the third of the chimeric sequences is formed by two fragments of the DENe protein from two different viral serotypes fused in the same protein gene MDH
  • MDH dehydrogenase activity
  • the MDH protein As for the MDH protein, a homology search was carried out with other sequences in the EMBL database and revealed that the first 110 amino acids are highly similar to the region of the lipoic acid binding domain and the flexible arm of the dihydrolipoamide acetyltransferase (enzyme E2 of the pyruvate dehydrogenase and ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase complexes), and the rest of the protein was highly similar to lipoamide dehydrogenase (LPDH), enzyme E3 of said complexes (Stephens, P.
  • LPDH lipoamide dehydrogenase
  • the muieie MDH proiein used in our invention has been used in phase I clinical trials in humans demonstrating the absence of reactogenicity and therefore its feasibility of use, in addition to not being recognized by the serum of patients with primary biliary cirrhosis (Pérez, A., F. Dickinson, Z. Cinza, A. Ru ⁇ z, T. Serrano, J. Sosa, S. González, Y. Gutiérrez, O Nazábal, O. Gutiérrez, D. Guzmán, M. D ⁇ az, M. Delgado, AND. Caballero, G. Sardinas, A. Alvarez, A. Mart ⁇ n, G. Guillen, R. Silva.
  • This invention describes the obtaining of chimeric nucleotide chains which, when introduced into an expression vector, result in chimeric proteins capable of inducing a specific serotype humoral response and protection against Dengue virus infection, such as
  • the first of these chains is formed by a sequence that codes for a fragment of the protein E (DENe) of each of the Dengue viral serotypes (DEN), linked to the sequence that codes for the N-terminal of a mutant protein with dehydrogenase (MDH) activity of N.
  • the sequence that codes for the DENe protein fragment of each viral serootype was fused to the complete MDH protein gene in two different positions: in a site within of a sequence coding for a strucfural domain of the MDH proiein (the lipoic acid binding domain and at the 3 'end of the gene), and e
  • the sequences corresponding to fragments of the DENe protein from two different serotypes, DEN-2 and DEN-4 are inserted in two different positions of the MDH gene: at a site within the coding sequence for binding domain lipoic acid (the serofipo 4) and the ex ⁇ remo 3 'of the gene (the sero ⁇ ipo 2), the dimeric named.
  • the chimeric proteins were insolubly removed in the cytoplasm of the bacteria.
  • An easily scalable purification process was developed by metal chelation chromatography (IMAC) that allowed obtaining pure proteins for the study of immunogenicity.
  • IMAC metal chelation chromatography
  • LAHI an ⁇ i-DEN hyperimmune ascites fluids
  • mice When immunizing with all recombinant chimeric proteins, neutron and protective response was obtained in mice. The greatest neuralizing chiefs were obtained with the sequences fused to the complete MDH gene and with the dimeric one, regardless of the position of the fragment belonging to the DENe protein. This demonstrated a potentiating effect of the MDH-mediated immune response that can be explained by the influence on the folding of the DENe protein fragment reflected in the results of anigenicity. It was also demonstrated for the first time, and contrary to what was described in the prior art, that the insolubility of these proteins does not influence the ability to generate an adequate immune response.
  • serofipo-specific antibodies implies that they are not able to recognize determinants. amphotenics, originating from heirologous seropype viruses, that favor the immunopofenciation phenomenon.This characterization is of great importance for a vaccine candidate against Dengue since the recognition of heterologous serotypes can be one of the causes of Hemorrhagic Dengue (DHF).
  • DHF Hemorrhagic Dengue
  • the induction of antibodies conirates two viral seroipopes after immunization with only one of the chimeric proieins, which makes it possible to formulate a vaccine against the four seroipyres, using only two of our recombinant chimeric proteins.
  • the mutant protein MDH was the elimination of the lipoic acid binding site in the ETDKAT sequence, which consisted in the covalency of this fatty acid with the amino-epsilon groups of lysine (K) (Tuaillon N, Andre C, Briand JP e ⁇ to the.
  • Plasmids PLL1, PLL2, PLL3, PLH1, PLH2, PLH3, PAZ1, PAZ2, PAZ3, PID1, PID2 and PID3 were deposited according to the Budapest Treaty in the Belgian Coordina ⁇ ed collection of Microorganism - BCCM TM, LMBP-COLLECTION, with date and under pending access numbers respectfully
  • N- ⁇ erm Nucleoidic sequence that codes for the region of the first 45 amino acids of the MDH.
  • DENe2 Fragment of the prolein of the DEN-2 envelope.
  • DENe2 Fragment of the protein from the DEN-2 envelope.
  • MDH idrogenase mutant
  • DENel Fragment of the protein in the envelope of DEN-1.
  • N-term Nucleotide sequence that codes for the region of the first 45 amino acids of the MDH.
  • DENel Fragment of the protein in the envelope of DEN-1.
  • DENe3 Fragment of the envelope protein of DEN-3.
  • N-term Nucleotide sequence that codes for the region of the first 45 amino acids of the MDH Figure 8. Cloning strategy of the E3 fragment to obtain PAZ2.
  • DENe3 Fragment of the protein in the envelope of DEN-3.
  • MDH mutanle dehydrogenase
  • DENe3 Fragment of the protein from the DEN-3 envelope.
  • MDH Muiele dehydrogenase.
  • DENe4 Fragment of the envelope protein of DEN-4.
  • N-term Nucleotide sequence that codes for the region of the first 45 amino acids of the MDH
  • DENe4 Fragment of the DEN-4 envelope protein.
  • MDH dehydrogenase mutant.
  • DENe4 Fragment of the protein from the DEN-4 envelope.
  • DENe4 Fragment of the protein from the DEN-4 envelope.
  • MDH dehydrogenase mutant.
  • the nucleophidic sequence encoding amino acids 286 to 426 of the DEN-2 virus envelope protein was amplified with the identifiable oligonucleophiles in the sequence listing as Sequence No. 1 and Sequence No. .2 from the viral strain of DEN-2 genoipo Jamaica (Deubel V., Kinney RM, Tren ⁇ DW Nucleofide sequence and deduced amino acid sequence of the nons ⁇ ruc ⁇ ural proieins of Dengue ⁇ ype 2 virus, Jamaica geno ⁇ ype: Compara ⁇ ive analysis of ⁇ he full- lengfh genome.Virology 1988.165: 234-244)
  • the vector was generated by Xba l / Bam Hl digestion of the PM108 His plasmid, which contains the nucleoid sequence coding for the N-ferminal region of the MDH and for a sequence of 6 hisfidines (Sequence No.23). After the ligamariao process, the possible recombinants were analyzed by res ⁇ ricconstru and the posilivos were sequenced to check the unions.
  • the competent W3110 cells Hill CW, Harnish BW 1982. Transposition of a chromosomal segmenf bounded by redundan ⁇ rRNA genes in Escherichia coli. J Bacferiology.
  • the biomass obtained from the strain transformed with pLL1 and grown at 37 ° C was broken in the French press.
  • the recombinant protein was obtained mostly insolubly associated with the precipitate of cell rupture.
  • an excision was performed with 6M urea and the supernatant, containing the PLL1 protein, was applied on a G-25 column to remove the choroiropic agent.
  • the fraction obtained was applied on a Bana ⁇ ing sepharose FF column (Pharmacia, UK, in the presence of Cu ++ ions.
  • the purified fraction of PLL1 was characterized as an ianium by recognition with different murine polyclonal and monoclonal sera as well as by human sera positive to
  • Luis NT Neutralizing specific serotype Luis NT Neutralizing specific serotype.
  • mice 25 Balb / c mice were immunized with 35 ug i.p of the purified PLL1 preparation using Freud's adjuvant. A part of these animals (10 mice) were bled at the fourth dose and the anti-DEN antibodies were determined by ELISA. High titers against DEN-2 were obtained while, in the face of serofype resistance, no reactivity was obtained (Table 2 and Table 5). At the same time, the Hemaglufination Inhibition (IHA) test was performed, obtaining positive titillates only to DEN-2 (Table 3 and Table 5).
  • IHA Hemaglufination Inhibition
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units. Table 4. Viral duralization assay with sera from animals immunized with PLL1.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • the nucleotide sequence encoding amino acids 286 to 426 of the envelope protein of the DEN-2 virus was amplified with the oligonucleotides identified in the cripple of sequences such as Sequence No.1 and Sequence No.3 from the viral strain of DEN-2 genotype Jamaica (Deubel V., Kinney RM, Trent DW Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstrucfural proieins of Dengue fype 2 virus, Jamaica genolype: compara ⁇ ive analysls of fhe full-leng ⁇ h genome.Virology 1988.165: 234-244).
  • the vector was generated by Xba // Eco R1 digestion of the PM84 His plasmid, which contains the nucleotide sequence of the MDH plus the encoder for a 6 histidine tail (Sequence No.26). This digestion allows the insertion of the fragment amplified by PCR into the coding region for an eshidrucural domain of the MDH. After the ligation process, the possible recombinants were analyzed by restriction and the positives were sequenced to check the junctions.
  • the MM294 competent cells (Hanahan D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli wifh plasmids. J. Mol. Biol.
  • EXAMPLE 6 Purification of the PLL2 protein
  • the biomass obtained from the strain transformed with pLL2 and grown at 37 ° C was broken in the French press.
  • the recombinant protein was obtained insolubly.
  • affinity chromatography was performed by metal chelates.
  • the matrix used was Banating Sepharose FF previously coupled with Cu ++ ions.
  • a wash with 15 mM Imidazole was performed and then elution was performed with 100 mM midazole.
  • the insoluble fraction of the recombinant protein was excreted with 8 M urea.
  • the purified fraction of PLL2 was characterized both by recognition with different murine polyclonal and monoclonal sera, as well as by human sera positive for Dengue (iabla 6).
  • the highest awards for Dot blotting were obtained with the LAHI anfi-DEN-2.
  • the recognition by LAHI con ⁇ ra the other sero ⁇ ipos was lower, in descending order: DEN-1 and DEN-3 and finally DEN-4, which was practically imperceptible.
  • the antibodies generated by other flaviviruses such as Yellow Fever, and Encephali of San Luis did not receive any recognition.
  • great reactivity greater than that obtained with PLL1 was observed both by Dot blotting and Western blotting.
  • EEE Equine Encephalitis virus
  • YFV Yellow Fever Virus
  • SLV San Luis Encephalitis Virus
  • NT Neutralizing specific serotype.
  • mice were immunized with 20 ug ip of the purified preparation of both soluble and insoluble PLL2, using Freud's Adjuvant. A part of the animals (10 mice) were bled after the fourth dose and the anti-DEN antibodies were determined by ELISA. High titers were obtained with DEN-2, whereas, compared to the rest of the serotypes, no reactivity was obtained (Table 7 and Table 10). At the same time, the IHA test was performed, obtaining positive positives only to DEN-2 (Table 8 and Table 10). Finally, the in vitro duralization test was performed, reaching 1/1280 items with DEN-2. Similar to that obtained with PLL1, there were no neutralization of the seroipolar ios (table 9 and table 10). The results of both PLL2 varianies were similar, indicating that the protein solubility status does not influence the ability to induce functional antibodies.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • the nucleotide sequence encoding amino acids 286 to 426 of the DEN-2 virus envelope protein (Sequence No.22) was amplified with the oligonucleotides identified in the sequence of sequences such as Sequence No.4 and Sequence No.5 a from the viral strain of DEN-2 genoipo Jamaica (Deubel V., Kinney RM, Trent DW Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica geno ⁇ ype: Comparability analysis of the full-length genome. Virology 1988.165: 234-244).
  • the vector was generated by Bam Hl / Bam Hl digestion of plasmid pD4, which contains the MDH gene with a sequence of 6 hisidides without stop codon (Sequence No.9). This allows fusion of the protein fragment sequence of the DEN envelope to the MDH C-terminal sequence. After the ligation process, the possible recombinants were analyzed by restriction and the positives were sequenced to check the junctions.
  • the competent W3110 cells were transformed with the selected clone called pLL3 (Fig. 3 and Sequence No.10). After the growth of the colony in LB liquid medium, an SDS-PAGE of the cell lysate was performed. A band of approximately 80 kDa corresponding to 20% of total proteins in the cell was obtained.
  • the failure obtained corresponds to the sum of the MDH and the DENe protein fragment of DEN-2. This band was recognized with anfi-DEN-2 AcP antibodies contained in a LAHI.
  • the protein was called PLL3 (Sequence No.11).
  • EXAMPLE 10 Purification of the PLL3 protein.
  • the purified fraction of PLL3 was characterized both by recognition with different murine polyclonal and monoclonal sera, as well as by Dengue positive human sera (table 11).
  • the highest recognitions for Dot blotting were obtained with the LAHI anti-DEN-2.
  • the recognition by LAHI con ⁇ ra the other serophypes was lower, in descending order: DEN-1 and DEN-3 and finally DEN-4, which was practically imperceptible.
  • no recognition was obtained.
  • great reactivity similar to that obtained with PLL2 was observed both by Dot blotting and Western blotting.
  • EEE Equine Encephalitis virus
  • YFV Yellow Fever Virus
  • SLV San Encephalitis Virus
  • Luis. NT Neutralizing specific serotype.
  • mice 25 Balb / c mice were immunized with 20 ug ip of the purified PLL3 preparation using Freund's Adjuvant. A part of the animals (10 mice) were bled after the fourth dose and the ani-DEN antibodies were determined by ELISA. High splints were obtained with DEN-2, while no reactivity was obtained against the rest of the serotypes (Table 12 and Table 15). At the same time, the Hemagglutination Inhibition test was performed, with positive spindles being obtained only to DEN-2 (Table 13 and Table 15). Finally, the in vitro neutralization test was carried out, reaching hasia filings 1/1280 with DEN-2 (table 14).
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • nucleotide sequence encoding amino acids 286 to 426 of the envelope protein of the DEN-1 virus was amplified with the olygonucleotides identified in the sequence listing as Sequence No. 6 and Sequence No. 7 a split of the viral strain of DEN-1 (Chu MC, O'Rourke EJ, Trent DWGeneic relatedness among structuring profein genes of dengue 1 virus sfrains.J. Gen. Virol. 1989. 70: 1701-1712).
  • the vector was generated by Xba l / Bam Hl digestion of PM108 His plasmid, which contains the nucleoid sequence that codes for the N-terminal region of the MDH and for a sequence of 6 histidines (Sequence No.23). After the ligation process, the possible recombinants were analyzed by restriction and the positives were sequenced to check the junctions.
  • the competent W3110 cells were transformed with the selected clone called pLH1 (Fig. 4 and Sequence No.33). After the growth of the colony in LB liquid medium, an SDS-PAGE of the cell lysate was performed. A band of approximately 25 kDa corresponding to 10% of total proteins in the cell was obtained.
  • the size obtained corresponds to the sum of the N-terminal region of the DH and the DENe protein fragment of DEN-1. This band was recognized with anti-DEN-1 AcP contained in a LAHI.
  • the protein was called PLH1 (Sequence No.34).
  • EXAMPLE 14 Purification of the PLH1 protein
  • the biomass obtained from the strain transformed with pLH1 was broken in the French press.
  • the recombinant protein was obtained mostly insolubly associated with the precipitate of cell rupture.
  • an extraction with 7 M urea was performed and the supernatant, containing the PLL1 protein, was applied on a G-25 column to remove the choroiropic agent.
  • the fraction obtained was applied on a Banating sepharose FF column (Pharmacia, UK, in the presence of Cu ++ ions and equilibrated with 10 mM Tris pH 8.0.
  • Elution was performed with 60 mM Imidazole and the volume obtained was applied on a column of G-25 to obtain the protein in the formulation buffer (PBS)
  • PBS formulation buffer
  • the purified fraction of PLH1 was characterized both by recognition with different murine polyclonal and monoclonal sera as well as by Dengue positive human sera (Table 16). The highest recognitions for Dot blotting were obtained with the anti-DEN-1 hyperimmune ascites fluid. The recognition by LAHI against the other seroipopes was lower. In the case of the antibodies generated by other flavivirus such as Yellow Fever and San Luis Encephalitis, no recognition was obtained. Finally, the reactivity was analyzed against three human sera of al ⁇ ⁇ ulo and three of low t ⁇ ulo to DEN-1, obtaining a considerable signal in both cases by Western blotting. Table 16. Reactivity of PLH1 protein against monoclonal and polyclonal antibodies. Acs * Specificity * PLH1
  • EEE Equine Encephalitis virus
  • YFV Yellow Fever Virus
  • SLV San Encephalitis Virus
  • Luis. NT Neutralizing specific serotype.
  • mice 25 Balb / c mice were immunized with 35 ug i.p of the purified PLH1 preparation using Freund's Adjuvant. A portion of these animals (10 mice) were bled at the fourth dose and the ani-DEN antibodies were determined by ELISA. High titers against DEN-1 were obtained while, compared to the rest of the serotypes, no reactivity was obtained (Table 17 and Table 20). In parallel, the test of
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • nucleotide sequence encoding amino acids 286 to 426 of the DEN-1 virus envelope protein (Sequence No.12) was amplified with the oligonucleotides identified in the sequence listing as Sequence No.6 and Sequence No.8 from of the viral strain of DEN-1 (Chu MC, O'Rourke EJ, Trent DW Genetic relatedness among structual protein genes of dengue 1 strains.J virus. Gen. Virol. 1989. 70: 1701-1712).
  • the vector was generated by Xba I / Eco Rl digestion of the PM84 His plasmid, which contains the nucleotide sequence of the MDH plus the encoder for a 6 histidine tail (Sequence No.26). This digestion allows the insertion of the PCR amplified fragment into the coding region for a structural domain of the MDH. After the ligation process, the possible recombinans were analyzed by restriction and the positives were sequenced to check the joints. The MM294 competent cells were transformed with the selected clone called pLH2 (Fig. 5 and Sequence No.35). After the growth of the colony in LB liquid medium, an SDS-PAGE of the cell lysate was performed.
  • the biomass obtained from the strain transformed with pLH2 was broken in the French press.
  • the recombinant protein was obtained in a soluble and insoluble way. From the insoluble fraction, the protein was excreted with Urea 7M and then a Fampon change was made for G-25.
  • affinity chromatography was performed by metal chelates. The matrix used was Banating Sepharose FF previously coupled with Cu ++ ions. A wash with 40 mM Imidazole was performed and then elution was performed with 200 mM imidazole. Finally, the pure preparation was applied in a column of G-25 to obtain it in the formulation buffer (PBS) and perform immunological studies.
  • PBS formulation buffer
  • the purified fraction of PLH2 was characterized both by recognition with different murine polyclonal and monoclonal sera, as well as by Dengue positive human sera (Table 21).
  • EEE Equine Encephalitis virus
  • YFV Yellow Fever Virus
  • SLV San Luis Encephalitis Virus
  • NT Neutralizing specific serotype.
  • EXAMPLE 20 Characterization of the antibody response generated by PLH2 25 Balb / c mice were immunized with 20 ug ip of the purified preparation of PLH2, using Freund's adjuvant. A portion of the animals (10 mice) were bled at the fourth dose and the anti-DEN antibodies were determined by ELISA. High levels against DEN-1 were obtained while, in relation to the rest of the serotypes, no reactivity was obtained (Table 22 and Table 25). In parallel, the IHA test was performed obtaining positive titles only to DEN-1 (table 23 and table 25). Finally, the in vitro neutralization test was performed, reaching 121280 titers against DEN-1 (fable 24). No diveralizani items were obtained against the seropype rejection (table 25).
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • the nucleotide sequence encoding amino acids 286 to 426 of the envelope protein of the DEN-1 virus was amplified with the oligonucleotides identified in the sequence listing as Sequence No. 9 and Sequence No. 10 to from the viral strain of DEN-1 (Chu MC, O'Rourke EJ, Tren ⁇ DWGenetic relatedness among syrucfual protein genes of dengue 1 strains.J virus. Gen. Virol. 1989. 70: 1701-1712).
  • the vector was generated by Bam Hl / Bam Hl digestion of plasmid pD4, which contains the MDH gene with a sequence of 6 histidines without stop codon (Sequence No.29). This allows the fusion of the sequence of the fragment of the E to the 3 ' end of the MDH gene. After the ligation process, the possible recombinants will be analyzed by res ⁇ ric Terms and the posi ⁇ ivos were sequenced to check the unions.
  • the competent W3110 cells were transformed with the selected clone called pLH3 (Fig. 6 and Sequence No.37). After the growth of the colony in LB liquid medium, an SDS-PAGE of the cell lysate was performed.
  • a band of approximately 80 kDa corresponding to 20% of total proteins in the cell was obtained.
  • the obfenide size corresponds to the sum of the MDH and the DENe protein fragment of DEN-2. This band was recognized with AcP an ⁇ i-DEN-1 contained in a LAHI.
  • the protein was called PLH3 (Sequence No.38).
  • EXAMPLE 22 Purification of the PLH3 protein.
  • the biomass obtained from the strain fransformed with pLH3 was broken in the French press.
  • the recombinant protein was obtained in a soluble and insoluble manner. From the insoluble fraction, the recombinant protein was extracted with Urea 6M and then a Fampon change was made for G-25. From affinity in 10mM Tris, affinity chromatography was performed by metal chelates. The matrix used was Banating Sepharose FF previously coupled with Cu ++ ions. A wash with 30 mM Imidazole was performed and then elution was performed with 250 mM imidazole. Finally, the pure preparation was applied on a G-25 column to obtain it in the formulation buffer (PBS) and perform the immunological studies.
  • PBS formulation buffer
  • the purified fraction of PLH3 was characterized both by recognition with different murine polyclonal and monoclonal sera, as well as by Dengue positive human sera (Table 26).
  • the highest recognitions for Dot blotting were obtained with the LAHI anti-DEN-1 while the recognition with LAHI against the other serotypes was lower.
  • no recognition was obtained.
  • the reactivity to three human sera of al ⁇ t ⁇ ulo and fres of low titre to DEN-1 was analyzed, obtaining a considerable signal in both cases by Dot blotting and Western blotting.
  • LAHI DEN-1 LAHI DEN-2
  • EEE Equine Encephalitis virus
  • YFV Yellow Fever Virus
  • SLV San Encephalitis Virus
  • Luis. NT Neutralizing specific serotype.
  • EXAMPLE 24 Characterization of the antibody response generated by PLH3 25 Balb / c raffons were immunized with 20 ug i.p of the purified preparation of PLH3 using Freund's Adjuvant. A part of the animals (10 mice) were bled after the fourth dose and the anti-DEN antibodies were determined by ELISA. High titers against DEN-1 were obtained while, compared to the rest of the serotypes, no reactivity was obtained (Table 27 and Table 30). In parallel, the IHA test was performed, obtaining positive titers only for DEN-1 (Table 28 and Table 30). Finally, the in vitro neutralization test was performed, reaching 1/1280 titers against DEN-1 (Table 29). No neutralizing titles were obtained against the rest of the serotypes (table 30). Table 27. Antibody titers with DEN-1 of the sera obtained will be immunization with PLH3.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutlon of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • nucleophidic sequence encoding amino acids 286 to 426 of the DEN-3 virus envelope protein (Sequence No. 19) was amplified with the oligonucleotides identified in the sequence listing as Sequence No. 11 and Sequence No. 12 to from the viral strain of DEN-3 (Osa ⁇ omi K., Sumiyoshi H. Complete nucleoid sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology. 1990. 176 (2): 643-647).
  • the vector was generated by digestion Xba l / Bam Hl of plasmid PM108 His, which contains the nucleotide sequence encoding the N-terminal region of the MDH and for a sequence of 6 histidines (Sequence No.23). After the ligation process, the possible recombinants were analyzed by restriction and the positives were sequenced to check the junctions.
  • the competent W3110 cells were transformed with the selected clone called pAZ1 (Fig. 7 and Sequence No.40). After the growth of the colony in LB liquid medium, an SDS-PAGE of the cell lysate was performed. A band of approximately 25 kDa corresponding to 10% of total proteins in the cell was obtained.
  • the size obtained corresponds to the sum of the N-terminal region of the MDH and the DENe protein fragment of DEN-3. This band was recognized with anti-DEN-3 AcP contained in a LAHI.
  • the prophein was called PEACE1 (Sequence No.41).
  • EXAMPLE 26 Purification of the PAZ1 protein.
  • the biomass obtained from the strain transformed with pAZ1 was broken in the French press.
  • the recombinant protein was mainly obtained in an insoluble way associated with the precipitate of cell rupture.
  • an extraction with 6 M urea was performed and the supernatant, containing the PAZ1 protein, was applied on a G-25 column to remove the caophropic agent.
  • the fraction obtained was applied on a Banating sepharose FF column (Pharmacia, UK), in the presence of previously balanced Cu ++ ions in 10 mM Tris pH 8.0.
  • Elution was performed with 60 mM Imidazole and the volume obtained was applied on a G-25 column to obtain the protein in the PBS formulation buffer. This preparation was used for immunological studies.
  • EXAMPLE 27 PAZ1 antigenic characterization
  • the purified fraction of PAZ1 was characterized both by recognition with different murine polyclonal and monoclonal sera as well as by Dengue positive human sera (table 31).
  • the highest awards for Dot blotting were obtained with the LAHI anfi-DEN-3. This result is consistent with the fact that the cloned region belongs to serotype 3.
  • the recognition by LAHI against the other serotypes was lower. In the case of the antibodies generated by other flavivirus such as Yellow Fever and San Luis Encephalitis, no recognition was obtained.
  • the reactivity was analyzed against four human sera of al ⁇ t ⁇ ulo and fres de l ⁇ ulo to DEN-3, obtaining a considerable signal in both cases by Western blotting and Dot blotting. Table 31. PAZ1 frenfe protein reactivity to monoclonal and polyclonal antibodies.
  • mice 25 Balb / c mice were immunized with 35 ug ip of the purified PAZ1 preparation using Freund's adjuvant. A part of these animals (10 mice) were bled after the fourth dose and the anti-DEN antibodies were determined by ELISA. High titers against DEN-3 were obtained while, compared to the rest of the seroipopes, no reactivity was obtained (labia 32 and iabla 35). In parallel, the IHA test was performed, obtaining positive titers only for DEN-3 (Table 33 and Table 35).
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • the nucleotide sequence encoding amino acids 286 to 426 of the DEN-3 virus envelope protein (Sequence No.29) was amplified with the identified oligonucleotides in the sequence listing as Sequence No.11 and Sequence No.13 a from the viral strain of DEN-3 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology. 1990. 176 (2): 643-647).
  • the vector was generated by Xba l / Eco Rl digestion of the PM84 His plasmid, which contains the nucleotide sequence of the MDH plus the encoder for a 6 histidine tail (Sequence No. 26).
  • the biomass obfenida of the strain fransformed with pAZ2 was broken in the French press.
  • the recombinant protein was obtained in a soluble and insoluble way. From the insoluble fraction, the recombinant protein was extracted with Urea 6M and then a buffer change was made for G-25. From affinity in 10mM Tris, affinity chromatography was performed by metal chelates. The u ⁇ ilizada ma ⁇ riz was Pavating Sepharose FF previously coupled with Cu ++ ions. A wash with 50 mM Imidazole was performed and then elution was performed with 150 mM imidazole. Finally, the pure preparation was applied on a G-25 column to obtain it in the formulation buffer (PBS) and perform the immunological studies.
  • PBS formulation buffer
  • the purified fraction of PAZ2 was characterized both by recognition with different murine polyclonal and monoclonal sera, as well as by Dengue positive human sera (Table 36).
  • the highest awards for Dot blotting were obtained with the LAHI an ⁇ i-DEN-3.
  • the recognition by LAHI against the other serotypes was lower.
  • no recognition was obtained.
  • the reactivity was analyzed against three human sera of alio ⁇ estre and fres of low t ⁇ fulo to DEN-3, obtaining a considerable signal in both cases by Dot blotting and Western blotting.
  • EEE Equine Encephalitis virus
  • YFV Yellow Fever Virus
  • SLV San Encephalitis Virus
  • Luis. NT Neutralizing specific serotype.
  • mice were immunized with 20 ug i.p of the purified PAZ2 preparation using Freund's Adjuvant. A part of the animals (10 raffons) were bled after the fourth dose and the ani-DEN antibodies were determined by ELISA. High titers against DEN-3 were obtained while, compared to the rest of the serotypes, no reactivity was obtained (iabla 37 and iabla 40). In parallel, the I HA test was performed, obtaining positive items only for DEN-3 (Table 38 and Table 40). Finally, the neutralization test was carried out in vitro, reaching 121280 t ⁇ fulos against DEN-3 (table 39). Neutralizing titers were not obtained against the seroipolar resistance (iabla 40).
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest serum dilution where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • EXAMPLE 33 Obtaining pAZ3
  • the nucleoid sequence encoding amino acids 286 to 426 of the envelope protein of the DEN-3 virus (Sequence No.39) was amplified with the oligonucleotides identified in the sequence listing as Sequence No.14 and Sequence No.15 from the viral strain of DEN-3 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology. 1990. 176 (2): 643-647).
  • the vector was generated by Bam Hl / Bam Hl digestion of plasmid pD4, which contains the MDH gene with a sequence of 6 histidines without stop codon (Sequence No.26).
  • Competent W3110 cells were fransformed with the selected clone called pAZ3 (Fig. 9 and Sequence No.44).
  • pAZ3 Fig. 9 and Sequence No.44
  • SDS-PAGE of the cell lysate was performed.
  • a band of approximately 80 kDa corresponding to 20% of total proteins in the cell was obtained.
  • the size obtained corresponds to the sum of the MDH and the DENe protein fragment of DEN-3. This band was recognized with AcP anti-DEN-3 contained in a LAHI.
  • the protein was called PAZ3 (Sequence No.45).
  • the biomass obtained from the strain transformed with pAZ3 was broken in the French press.
  • the recombinant protein was obtained in a soluble and insoluble manner. From the insoluble fraction, the protein was extracted with Urea 7M and then a buffer change was made for G-25. From the sample in 10mM Tris, affinity chromatography was performed by metal chelates. The matrix used was Banating Sepharose FF previously coupled with Cu ++ ions. A 45 mM Imidazole wash was performed and then elution was performed with 230 mM midazole. Finally, the pure preparation was applied on a G-25 column to obtain it in the formulation buffer (PBS) and perform the immunological studies.
  • PBS formulation buffer
  • the purified fraction of PAZ3 was characterized both by recognition with different murine polyclonal and monoclonal sera, as well as by human sera positive to Dengue (table 41).
  • the highest recognition for Dot blotting was obtained with the LAHI anti-DEN-3.
  • the recognition by LAHI against the other serotypes was lower.
  • no recognition was obtained.
  • the reactivity against three human sera of high title and three of low title to DEN-3 obtaining a considerable signal in both cases by Western blotting and Dot blotting.
  • EEE Equine Encephalitis virus
  • YFV Yellow Fever Virus
  • SLV San Encephalitis Virus
  • Luis. NT Neutralizing specific serotype.
  • EXAMPLE 36 Characterization of the antibody response generated by PAZ3 25 Balb / c mice were immunized with 20 ug i.p of the purified PAZ3 preparation using Freund's adjuvant. A part of the animals (10 mice) were bled after the fourth dose and the anti-DEN antibodies were determined by ELISA. High titers were obtained with DEN-3 while, in the face of serophyping, no reactivity was obtained (Table 42 and Table 45). At the same time, the IHA test was performed, obtaining positive spindles only to DEN-3 (Table 43 and Table 45). Finally, the in vitro neutralization test was performed, reaching 1: 1280 icons with DEN-3 (iabla 44). No neutralizing t ⁇ fulos were obtained against the rest of the serotypes (table 45).
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • the nucleoid sequence encoding amino acids 286 to 426 of the DEN-4 virus envelope protein (Sequence No.46) was amplified with the oligonucleotides identified in the cripple of sequences such as Sequence No.17 and Sequence No.18 a from the viral strain of DEN-4. (Zhao B., Mackow ER, Buckler-White AJ, Markoff L., Chancock RM, Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue fype 4 viral DNA sequences: Analysis of genes coding for strucfural proteins. Virology 1986. 155: 77-88).
  • the vector was generated by digestion Xba l / Bam Hl of the PM108 His plasmid, which contains the nucleotide sequence that codes for the N-terminal region of the MDH and for a sequence of 6 histidines (Sequence No.23). After the ligation process, the possible recombinants were analyzed by restriction and the positives were sequenced to check the junctions.
  • the competent W3110 cells were transformed with the selected clone called plD1 (Fig. 10 and Sequence No.47). After the growth of the colony in liquid medium LB, an SDS-PAGE of the cellular used was made. A band of approximately 25 kDa corresponding to 10% of total proteins in the cell was obtained.
  • the size obtained corresponds to the sum of the N-terminal region of the MDH and the DENe protein fragment of DEN-1. This band was recognized with anti-DEN-4 AcP contained in a LAHI.
  • the protein was called PID1 (Sequence No.48).
  • the purified fraction of PID1 was characterized both by recognition with different murine polyclonal and monoclonal sera as well as by human sera positive for Dengue (Table 46).
  • the highest recognition for Dot blotting was obtained with the LAHI anti-DEN-4.
  • the recognition by LAHI against the other serotypes was lower.
  • no recognition was obtained.
  • the reactivity to three human sera of high titer and low t ⁇ fulo fres to DEN-4 was analyzed, obtaining a considerable signal in both cases by Western blotting and Dot blotting.
  • LAHI SLV cM 3H5 NT * 10 ⁇ g of the purified protein PID1 was applied.
  • the intensity of the signal obtained was evaluated from + to +++.
  • EEE Equine Encephalitis virus
  • YFV Yellow Fever Virus
  • SLV San Encephalitis Virus
  • Luis. NT Neutralizing specific serotype.
  • mice 25 Balb / c mice were immunized with 35 ug i.p of the purified preparation of PID1 using Freund's Adjuvant. A portion of these animals (10 mice) were bled at the fourth dose and the ani-DEN antibodies were determined by ELISA. High titers were obtained from DEN-4 while, in the face of seroipolar resistance, no reactivity was observed (Table 47 and Table 50). In parallel, the IHA test was performed, obtaining positive titers only for DEN-4 (Table 48 and Table 50). Finally, the in vitro neutralization test was performed, showing neutralizing titres (1: 320) against DEN-4 while there was no neutralization of viral infectivity against the rest of the serotypes (table 49 and table 50). These results indicate the great seroipod-specificity of the antibodies generated by PID1.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • the nucleotide sequence encoding amino acids 286 to 426 of the envelope protein of the DEN-4 virus was amplified with the oligonucleotides identified in the sequence listing as Sequence No. 16 and Sequence No. 18 to from the viral strain of DEN-4 (Zhao B., Mackow ER, Buckler-Whi ⁇ e AJ, Markoff L, Chancock RM, Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Analysis of genes coding for structural proteins Virology 1986.
  • the vector was generated by Xba l / Eco Rl digestion of the PM84 His plasmid, which contains the nucleophidic sequence of the MDH plus the coding agent for a tail of 6 hisididines ( Sequence No.26) This digestion allows the insertion of the PCR-amplified fragment within the coding region for a structural domain of the MDH.
  • the possible recombinans were analyzed by restriction and the positive ones were sequenced for check.
  • r junctions MM294 competent cells were transformed with the selected clone called plD2 (Fig. 11 and Sequence No.49). After the growth of the colony in LB liquid medium, an SDS-PAGE of the cell lysate was performed.
  • the biomass obtained from the strain transformed with plD2 and grown at 37 ° C was broken in the French press.
  • the recombinant protein was obtained in a soluble and insoluble manner. From the insoluble fraction, the protein was extracted with Urea 6M and then an iampon exchange was performed for G-25. From the notch in 10mM Tris, affinity chromatography was performed by metal chelates. The u ⁇ ilizada ma ⁇ riz was Banating Sepharose FF previously coupled with Cu ++ ions. A wash with 30 mM Imidazole was performed and then elution was performed with 250 mM imidazole. Finally the preparation pure, was applied on a G-25 column to obtain it in the formulation buffer (PBS) and perform the immunological studies EXAMPLE 43. Antigenic characterization of PID2
  • the purified fraction of PID2 was characterized both by recognition with different murine polyclonal and monoclonal sera, as well as by Dengue positive human sera (table 51).
  • Luis. NT Neutralizing specific serotype.
  • mice 25 Balb / c mice were immunized with 20 ug ip of the purified PID2 preparation using Freund's adjuvant. A part of the animals (10 raines) were bled after the fourth dose and the ANI-DEN antibodies were determined by ELISA. High clusters were obtained with DEN-4 while, in relation to the rest of the serofypes, no reactivity was obtained (Table 52 and Table 55). At the same time, the IHA test was performed, obtaining positive titles only to DEN-4 (table 53 and table 55). Finally I know performed the in vitro neutralization test reaching 1/1280 titers against DEN-4
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • the nucleoidic sequence encoding amino acids 286 to 426 of the DEN-4 virus envelope protein (Sequence No. 46) was amplified with the oligonucleotides identified in the sequence listing as Sequence No. 19 and Sequence No. 20 to from the viral strain of DEN-4 (Zhao B., Mackow ER, Buckler-White AJ, Markoff L, Chancock RM, Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-tongue Dengue lype 4 viral DNA sequences: Analysis of genes coding for strucural proieins. Virology 1986. 155: 77-88).
  • the vector was generated by Bam Hl / Bam Hl digestion of plasmid pD4, which confers the MDH gene with a sequence of 6 hisidides without stop codon (Sequence No.29). After the ligation process, the possible recombinants were analyzed by restriction and the positives were sequenced to check the joints.
  • the competent W3110 cells were transformed with the selected clone called plD3 (Fig. 12 and Sequence No.51). After the growth of the colony in Louria Ber ⁇ ani (LB) liquid medium, an SDS-PAGE of the cell lysate was performed. A band of approximately 80 kDa corresponding to 20% of total proteins in the cell was obtained. The size obtained corresponds to the sum of the MDH and the DENe protein fragment of DEN-4. This band was recognized by AcP anti-DEN-4 contained in a LAHI. The protein was called PID3 (Sequence No.52).
  • EXAMPLE 46 Purification of the PID3 protein.
  • the biomass obtained from the strain transformed with plD3 was broken in the French press.
  • the recombinant protein was obtained in a soluble and insoluble manner. From the insoluble fraction, the recombinant protein was extracted with Urea 6M and then an iampon exchange was performed for G-25. From the sample in 10mM Tris, affinity chromatography was performed by metal chelates. The matrix used was Banating Sepharose FF previously coupled with Cu ++ ions. A wash with 40 mM Imidazole was performed and then elution was performed with 200 mM imidazole. Finally, the pure preparation was applied on a G-25 column to obtain it in the formulation buffer (PBS) and perform the immunological stages EXAMPLE 47. Antigenic characterization of PID3
  • the purified fraction of PID3 was characterized both by recognition with different murine polyclonal and monoclonal sera, as well as by Dengue positive human sera (Table 56).
  • the highest awards for Dot blotting were obtained with the LAHI anti-DEN-4.
  • the recognition by LAHI against the other serotypes was lower.
  • no recognition was obtained.
  • the reactivity was analyzed against three human sera of high titer and three of low icle to DEN-4, obtaining a considerable signal in both cases by Western blotting and Dot blotting. Table 56.
  • PID3 protein reactivity slows down to monoclonal and polyclonal antibodies.
  • EEE Equine Encephalitis virus
  • YFV Yellow Fever Virus
  • SLV San Encephalitis Virus
  • Luis. NT Neutralizing specific serotype.
  • EXAMPLE 48 Characterization of the antibody response generated by PID3 25 Balb / c mice were immunized with 20 ug i.p of the purified PAZ3 preparation using Freund's adjuvant. A portion of the animals (10 mice) were bled at the fourth dose and the anti-DEN antibodies were determined by ELISA. High titers against DEN-4 were obtained while, compared to the rest of the serotypes, no reactivity was obtained (Table 57 and Table 60). At the same time, the IHA test was performed, obtaining positive items only to DEN-4 (Table 58 and Table 60). Finally, the in vitro neutralization test was performed, reaching high titers against DEN-4 (1: 1280) (iabla 59). No neutralizing t ⁇ fulos were obtained against the rest of the serotypes (table 60).
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • the nucleoidic sequence encoding amino acids 286 to 426 of the DEN-4 virus envelope protein (Sequence No. 46) was amplified with the oligonucleotides identified in the sequence listing as Sequence No. 16 and Sequence No. 21 a from the viral strain of DEN-4 (Zhao B., Mackow ER, Buckler-White AJ, Markoff L, Chancock RM, Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue ype 4 viral DNA sequences: Anaiysis of genes coding for strucural proteins, Virology 1986. 155: 77-88).
  • the vector was generated by Xba / Xba I digestion of plasmid pLL3, which contains the MDH gene with a sequence of 6 hisfidines in the 3 'region of the gene and the sequence of the DEN-2 E fragment at the end 3'. This allows obtaining two regions of the E of serotypes 4 and 2 fused in the same MDH gene.
  • the possible recombiners were analyzed by restriction and the positives were sequenced to check the junctions.
  • Competent MM294 cells were transformed with the selected clone called pD4D2 (Fig. 13 and Sequence No. 53). After colony growth in LB medium, an SDS-PAGE of the cell lysate was performed.
  • a band of approximately 110 kDa corresponding to 20% of total proteins in the cell was obtained.
  • the size obtained corresponds to the sum of the MDH and the two fragments of the DENe protein of the DEN.
  • This band was recognized with AcP anfi-DEN-2 and anti DEN-4 contained in a LAHI.
  • the protein was called PD4D2 (Sequence No.54).
  • EXAMPLE 50 Purification of PD4D2 protein.
  • the obfenide biomass of the strain transformed with pD4D2 was broken in the French press.
  • the recombinant protein was obtained in a soluble and insoluble way. From the insoluble fraction, the recombinant protein was excreted with Urea 6M and then an iampon exchange was performed for G-25. From the sample in 10mM Tris, chromatography was performed of affinity for metal chelates. The matrix used was Banating Sepharose FF previously coupled with Cu ++ ions. A wash with 30 mM Imidazole was performed and then elution was performed with 250 mM imidazole. Finally, the pure preparation was applied on a G-25 column to obtain it in the formulation buffer (PBS) and perform immunological studies.
  • PBS formulation buffer
  • the purified fraction of PD4D2 was characterized both by recognition with different murine polyclonal and monoclonal sera, as well as by Dengue positive human sera (Table 61).
  • the highest recognitions for Dot blotting were obtained with the LAHI anti-DEN-2 and an ⁇ i-DEN-4.
  • the recognition by LAHI against the other serotypes was lower.
  • recognition by the 3H5 monoclonal antibody similar to that obtained with PLL2 and PLL3 was maintained.
  • the reactivity was analyzed against human sera of alio and under thymus confer DEN-2 and DEN-4, obtaining a considerable signal in both cases by Western blotting and Dot blotting.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • Table 65 Cross-reactivity assay, against all viral serotypes by ELISA, IHA and viral neutralization, with sera from animals immunized with PD4D2.
  • IHA titers were defined as the highest dilution capable of inhibiting the hemagglutination of goose erythrocytes against 8 viral hemagglutinating units.
  • Neutralizing titers were defined as the highest dilution of serum where a 50% reduction in the number of viral plaques was obtained.
  • mice For the evaluation of the protection conferred on the mice before the challenge with homologous lethal DEN by immunization with all the varianies tested, raffons that were not bled from each group (15 rails) were used. Each of the animals received a dose of 100 LD 50 of lethal DEN by intracranial inoculation and were observed for 21 days to obtain the lethality percentages. They were used as controls Positive groups of 15 rains immunized with the four viral preparations (DEN-1, DEN-2, DEN-3 and DEN-4). All the rains of these groups survived while the rains of the control group (-) became ill within 7-11 days after the challenge, obtaining 100% mortality. Finally, the groups immunized with the fusion proteins tested showed 80% and 100% proection, with significant differences in all cases compared to the control group (Table 66).
  • mice immunized pD4D2 15 were challenged with DEN-4 and 15 with DEN-2.
  • Example 54 Lymphoproliferative Response
  • Stimulation index quotient of the counts per minute of the samples between the counts per minute of the spontaneous DNA synthesis control.

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Abstract

Obtención de cadenas quiméricas codificantes para proteínas que inducen en el receptor efectos contra virus, las cuales estimulan la producción de una respuesta humoral serotipo especifica y protección frente a la infección por los virus del Dengue, evitándose los efectos de amplificación viral serotipo inespecíficos causantes de las hemorragias y complicaciones clínicas descritas en este tipo de patología. Estas cadenas de ácidos nucleicos están compuestas por la combinación especifica de fragmentos pertenecientes al gen de una proteína mutante con actividad deshidrogenasa de N.meningitidis y fragmentos que codifican para una región de la proteína E de la envoltura de los virus del Dengue, las cuales al insertarse en un vector de expresión, dan como resultado las proteínas quiméricas con características especificas. Las moléculas quiméricas resultantes de esta invención son aplicables a la industria farmacéutica en la obtención de preparados vacunales y diagnósticos de alta especificidad serotípica para uso en humanos.

Description

CADENAS QUIMÉRICAS CODIFICANTES PARA PROTEÍNAS INDUCTORAS DE
EFECTOS CONTRA VIRUS.
Campo de la Técnica La presente invención esta relacionada con el campo de la biotecnología y la industria farmacéutica, en particular con la obtención de cadenas nucleotídicas quiméricas las cuales al ser introducidas en un vector de expresión, dan como resultado proteínas capaces de inducir respuesta humoral serotipo específica y protección frente a la infección por el virus del Dengue, nombrado en lo adelante DEN, evitándose los efectos de amplificación viral serotipo inespecíficos causantes de las hemorragias y complicaciones clínicas descritas en este tipo de patología. Arte Previo
El virus del Dengue (DEN), es un virus envuelto cuya membrana lipídica contiene dos de sus tres proteínas estructurales: la proteína de la envoltura y la proteína de la membrana. Esta envoltura proteica rodea a una nucleocápsida icosaédrica compuesta por la tercera de sus proteínas estructurales, la proteína de la cápsida. Este virus pertenece a la familia Flavivirídae y existen cuatro serotipos diferentes. Su transmisión al hombre se realiza a través del mosquito Aedes aegypti, que pertenece a la familia Stegomia. La enfermedad producida en el humano por este virus fue considerada como benigna y se describió como Fiebre del Dengue o Dengue Clásico (FD) hasta la aparición de una modalidad más grave y a veces letal caracterizada por fiebre hemorrágica y choque, denominada: Fiebre Hemorrágica del Dengue y Síndrome de Choque por Dengue (FHD/SCD) (Hammon WMc. New haemorragic fever in children in the Philippines and Thailand. Trans Assoc Physicians 1960; 73: 140-155). Se han realizado varios estudios epidemiológicos evidenciándose como factor de riesgo la infección secuencial por dos serotipos virales diferentes (Kourí GP, Guzmán MG, Bravo JR. Why dengue hemorrhagic fever in Cuba? 2. An integral analysis. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1987; 72: 821-823). Este fenómeno se explica por la potenciación inmunológica, la cual se basa en un aumento de la infectividad viral por incremento en la entrada del complejo virus-anticuerpo a la célula a través de los receptores Fe de la célula diana (monocitos)(Halstead SB. Pathogenesis of dengue: challenges to molecular biology. Science 1988; 239: 476-481). Se han desarrollado tecnologías basadas en la generación de vacunas vivas atenuadas pero en la actualidad existen múltiples incógnitas sobre los posibles beneficios de estas ya que pueden revertir a la virulencia, interferencia viral y recombinaciones intergenómicas. Alternativamente, se han obtenido antígenos recombinantes como posibles componentes de una vacuna por subunidades (Feighny, R., Borrous, J. and Putnak R. Dengue type-2 virus envelope protein made using recombinant baculovirus proteets mice against virus challenge. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1994. 50(3). 322-328; Deubel, V., Staropoli, I., Megret, F., et al. Affinity-purified dengue-2 virus envelope glycoprotein induces neutralising antibodies and protective ¡mmunity in mice. Vaccine. 1997. 15, 1946-1954). El principal antígeno lo constituye la proteína DENe de la envoltura del virus. Dicha proteína es el mayor componente de la superficie del virión y se plantea que media la unión del virus al receptor celular (A Heinz FX, Berge R, Turna W et al. A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-bome encephalitis virus defined by monoclonal antibodies. Virology. 1983; 126: 525). Esta proteína presenta homología estructural con la del virus de la encefalitis mediada por garrapatas (TBE) (Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, O, et al. The envelope glycoprotein from tick borne encephalitis virus at 2 A° resolution. Nature 1995; 375: 291-298) y entre los serotipos es estructuralmente conservada.
Las células de insectos constituyen uno de los sistemas utilizados para la expresión de diversos genes foráneos que emplean los baculovirus como vectores. Estos vectores se han utilizado para la expresión de diferentes combinaciones de proteínas estructurales y no estructurales del virus de la Encefalitis japonesa (JEV), del DEN-1 , del DEN-2 y del DEN-4, (Matsuura Y, Miyamoto M, Soto T et al. Characterization of japanese encephalitis virus envelope protein expressed by recombinant baculoviruses. Virology 1989; 173: 677- 682; Deubel V, Bordier M, Megret F et al. Processing, secretion and immunoreactivity of carboxy terminally truncated dengue-2 envelope proteins expressed in insect cell by recombinant baculoviruses. Virology 1991 ; 180: 440-447; Putnak R, Feighny R, Burrous J et al. Dengue 1 virus envelope glycoprotein gene expressed in recombinant baculovirus elicit virus neutralizatíon antibodies in mice and protects them from virus challenge. Am J Trop Med Hyg 1991 ; 45: 159-167; Feighny R, Burrous J, Putnak R. Dengue type 2 virus envelope protein made using recombinant baculovirus protects mice against virus challenge. Am J Trop Med Hyg 1994; 50: 322-328). Otro sistema utilizado ha sido las células de Drosophila melanogaster con diferentes variantes de proteína E recombinante (PCT/US96/07627). A pesar de obtenerse una respuesta funcional adecuada, al utilizar las proteínas expresadas en estos sistemas, ellos implican un alto costo para el desarrollo de procesos de producción a gran escala, por lo que la expresión en levaduras ha sido una alternativa para producir proteínas recombinantes estructurales de flavivirus. Sin embargo, en el caso de la proteína DENe, expresada en Pichia pastoris (PCT/US96/07627; Sugrue R.J., Fu H., Howe J., Chan Y. Expression of the Dengue virus structural proteins in Pichia pastoris leads to the generation of virus-like partióles. J Virol. 1997. 78, 1861-1866) los niveles de expresión son bajos, tanto de forma secretada como intracelularmente, dificultándose así el proceso de purificación.
Paralelamente, se han obtenido diferentes variantes de la proteína DENe en bacterias. Una de ellas fue la porción carboxilo-terminal de la proteína E del JEV fusionada a una proteína del metabolismo del Triptofano (TrpE) de E. coli. Ésta fue reconocida por anticuerpos monoclonales (AcM) neutralizantes en técnicas de inmuno-identificación y es producida de forma intracelular en cuerpos de inclusión; sin embargo, los preparados puros de esta proteína no fueron capaces de desarrollar en los animales receptores anticuerpos (Acs) neutralizantes, ni hubo protección durante el reto viral. (Masón P.W., Zogel M.V., Semproni A.R., et al. The antigenic structure of dengue type 1 virus envelope and NS1 protein expressed in E. coli. J Gen Virol. 1990. 71 : 2107-2114). Adicionalmente, se desarrolló otra construcción (Srivastava A.K., Morita K., Matsuo S., et al. Japanese encephalitis virus fusión protein with protein A expressed in E. coli confers protection in mice. Microbiol Immunol. 1991. 35: 863-870), que contiene la proteína A de Staphylococus aurios fusionada al fragmento carboxílo-terminal de la proteína E, seguida del segmento amino-terminal de la proteína no estructural del JEV, la NS1. En este caso la proteína de fusión fue producida de forma soluble facilitando su purificación por cromatografía de afinidad. Al inmunizar ratones con esta proteína pura se desarrollaron altos títulos de anticuerpos neutralizantes e inhibidores de la hemaglutinación, y se logró protección ante el reto viral con el JEV. Resultados similares se obtuvieron empleando la región de la proteína DENe del DEN-2 fusionada a la proteína A de S. áureos (Srivastava A. K., Putnak R. J., Warren R. L, Hoke C. H. Mice ¡mmunized with a dengue type 2 virus E and NS1 fusión protein made in Escherichia coli are protected against lethal dengue virus infection. Vaccine.1995. 13: 1251-1258), sin embargo, no es posible utilizar estas preparaciones en humanos debido a la presencia de la proteína A, la cual se ha demostrado que tiene una gran afinidad por la inmunoglobulina G humana. Finalmente, se ha reportado la obtención de una proteína de fusión que comprende el Dominio B de la proteína DENe del DEN-2 y la proteína de unión a maltosa (MBP) de E. coli (Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G. Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengue envelope B domain fusión protein against dengue 2 virus infection in mice. Am J Trop Med Hyg. 1998. 58: 655-662) llamada MBP-DomB. Esta variante proteica fue inmunogénica en ratones e indujo Acs neutralizantes. En nuestro caso, el objeto de esta invención trata sobre la obtención de secuencias quiméricas, como por ejemplo la primera de ellas formada por la secuencia que codifica para una región de la proteína DENe unida a la secuencia que codifica para el fragmento N-terminal de una proteína muíante con actividad deshidrogenasa (MDH) de N.meningitidis, la segunda, por la secuencia que codifica para la región la proteína DENe, unida al gen completo de la proteína MDH en dos posiciones diferentes y la tercera de las secuencias quiméricas esta formada por dos fragmentos de la proteína DENe de dos serotipos virales diferentes fusionados en el mismo gen de la proteína MDH. Estas cadenas quiméricas al ser insertadas cada una en un vector apropiado, dan como resultado proteínas quiméricas obtenidas de forma insoluble en el citoplasma de la bacteria capaces de provocar una alta respuesta de anticuerpos neutralizantes contra DEN, inhibidores de la hemaglutinación viral y de proteger frente al reto viral en ratones inmunizados con dichas proteínas recombinantes.
Teniendo en cuenta la insolubilidad de dichas proteínas, se logró un proceso de plegamiento in vitro fácilmente escalable así como los procesos de expresión y purificación, superando a los utilizados por Simmons et al, 1998. Por otra parte, se demuestra la especificidad serotípica de los anticuerpos, generados por la inmunización con dichas proteínas en ratones, al nivel de neutralización, inhibición de la hemaglutinación y ELISA, empleándose dosis más bajas que las reportadas por Simmons et al, 1998. Este constituye el primer reporte de proteínas insolubles en E. coli conteniendo regiones de la proteína DENe del virus dengue capaces de generar una respuesta inmune funcional. Adicionalmente, teniendo en cuenta los resultados obtenidos con la variante dimérica, es posible generar con una misma molécula anticuerpos serotipo específicos para dos serotipos de virus diferentes capaces de neutralizar la infectividad viral y proteger frente al reto con DEN en ratones. En cuanto a la proteína MDH, se ha realizado una búsqueda de homología con otras secuencias de la base de datos del EMBL y reveló que los primeros 110 aminoácidos son altamente similares a la región del dominio de unión al ácido lipóico y al brazo flexible de la dihidrolipoamida acetiltransferasa (enzima E2 de los complejos piruvato dehidrogenasa y α-cetoglutarato dehidrogenasa), y el resto de la proteína era altamente similar a la lipoamida dehidrogenasa (LPDH), enzima E3 de dichos complejos (Stephens, P. E; H. M. Darlinson, y J. R. Guest.,1983. The Pyruvate. Se encontró además que en los enfermos de cirrosis biliar primaria se generaban autoanticuerpos antimitocondriales, específicos contra el sitio de unión al ácido lipóico, común entre estas proteínas (Gershwin ME, Mackay IR, Sturgess A, Coppel RL. Identification and specificity of a cDNA encoding the 70 KDa mitochondrial antigen recognized in primary biliary cirrhosis. J Immunol 1987;138:3525-31). Por lo tanto, muíamos esta región de la proteína, previendo que al ser utilizada la misma como parte de nuesíros aníígenos vacunales quiméricos, esía pudiera generar reacciones auíoinmunes. La proíeína muíaníe MDH ufilizada en nuestra invención, ha sido utilizada en ensayos clínicos de fase I en humanos demostrándose la ausencia de reactogenicidad y por consiguiente su factibilidad de uso, además de no ser reconocida por el suero de enfermos con cirrosis biliar primaria (Pérez, A., F. Dickinson, Z. Cinza, A. Ruíz, T. Serrano, J. Sosa, S. González, Y. Gutiérrez, O Nazábal, O. Gutiérrez, D. Guzmán, M. Díaz, M. Delgado, E. Caballero, G. Sardinas, A. Alvarez, A. Martín, G. Guillen, R. Silva. Safety and preliminary immunogenicity of the recombinant outer membrane protein of Neisseria meningitidis in human volunteers. Vaccine (enviada). Sin embargo la posibilidad del uso de la mencionada proteína MBP en humanos no ha sido demostrada. (Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G. Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengue envelope B domain fusión protein against dengue 2 virus infection in mice. Am J Trop Med Hyg. 1998. 58: 655-662). Descripción detallada de la invención. En esta invención se describe la obtención de cadenas nucleotídica quiméricas las cuales al ser introducidas en un vector de expresión, dan como resultado proteínas quiméricas capaces de inducir una respuesta humoral serotipo específica y protección frente a la infección por el virus del Dengue, como por ejemplo la primera de estas cadenas esta formada por una secuencia que codifica para un fragmento de la proteína E (DENe) de cada uno de los serotipos virales de Dengue (DEN), unida a la secuencia que codifica para el N-terminal de una proteína muíante con actividad deshidrogenase (MDH) de N.meningitidis, en una segunda cadena quimérica la secuencia que codifica para el fragmento de la proíeína DENe de cada seroíipo viral, se fusionó al gen completo de la proíeína MDH en dos posiciones diferenfes: en un siíio dentro de una secuencia que codifica para un dominio estrucfural de la proíeína MDH (el dominio de unión a ácido lipoico y en el exfremo 3' del gen), y en la torcera cadena quimérica se insertan las secuencias correspondieníes a fragmentos de la proíeína DENe de dos seroíipos de virus diferenfes, el DEN-2 y el DEN-4, en dos posiciones diferentes del gen MDH: en un sitio dentro de la secuencia que codifica para el dominio de unión a ácido lipoico (el serofipo 4) y en el exíremo 3' del gen (el seroíipo 2), la nombramos dimérica. Las proteínas quiméricas se obfuvieron de forma insoluble en el citoplasma de la bacteria. Se desarrolló un proceso de purificación fácilmente escalable por cromatografía de quelaíos mefálicos (IMAC) que permitió la obtención de las proteínas puras para el estudio de inmunogenicidad. Al analizar los resulíados de aníigenicidad se demosíró un fuerte reconocimiento de todas las proteínas quiméricas recombinantes por los líquidos ascííicos hiperinmunes (LAHI) aníi-DEN, siendo mayor los obtenidos en los casos de fusión al gen completo de la MDH, lo cual evidencia un efecto posiíivo en la conformación de la región proveniente de la proteína DENe dado por la MDH. En los casos donde se uíilizó el seroíipo 2, todas las proteínas recombinanfes obtenidas son reconocidas por un anficuerpo neuíralizante serotipo-específico (3H5), siendo fambién mayor en los casos de fusión al gen completo de la MDH, así como en la dimérica. Se observó además, que el reconocimiento por los líquidos ascííicos hiperinmunes (LAHI) del seroíipo homólogo en cada caso superaba ostensiblemente el reconocimiento por los LAHI de serotipos heterólogos, demosfrándose la exposición de epilopos seroíipo específicos y permiíiendo así su uso como diagnósíico de dengue y serofipaje.
Al inmunizar con todas las proteínas quiméricas recombinaníes se obfuvo respuesía neuíralizanfe y protectora en ratones. Los mayores íífulos neuíralizanfes se obíuvieron con las secuencias fusionadas al gen completo de la MDH y con la dimérica, independientemente de la posición del fragmento perteneciente la proíeína DENe. Esto demosíró un efecto potenciador de la respuesfa inmune mediado por la MDH que puede ser explicado por la influencia en el plegamienfo del fragmento de la proteína DENe reflejado en ios resulfados de aníigenicidad. Se demosíró además por primera vez, y contrario a lo descrito en el arte previo, que la insolubilidad de esfas proteínas no influye en la capacidad de generar una adecuada respuesía inmune.
La respuesfa inmune generada "en iodos los casos fue seroíipo específica (aníicuerpos confra el seroíipo homólogo inmunizado), en la neuíralización viral, la inhibición de la hemagluíinación y ELISA. La generación de aníicuerpos serofipo-específicos implica que no sean capaces de reconocer a determinantes anfigénicos, provenientes de virus de serofipos heíerólogos, que favorezcan el fenómeno de inmunopofenciación. Esía caracferísfica es de gran importancia para un candidato vacunal contra el Dengue ya que el reconocimiento de aníicuerpos a serofipos heíerólogos puede ser una de las causas del Dengue Hemorrágico (DHF). Se demosfró además, la inducción de aníicuerpos coníra dos seroíipos virales después de la inmunización con una sola de las proíeinas quiméricas, lo cual posibilite la formulación de una vacuna coníra los cuaíro seroíipos, uíilizando sólo dos de nuesfras proteínas quiméricas recombinaníes. La obtención de la proíeína muíante MDH, consistió en la eliminación del sitio de unión al ácido lipóico en la secuencia ETDKAT, que consisíe en la unión covaleníe de este ácido graso con los grupos amino-epsilon de la lisina (K) (Tuaillon N, Andre C, Briand JP eí al. A lipoyl syníhefic ocíadecapepíide of dihydrolipoamide aceíylfransferase specifically recognized by aníi-M2 auíoanfibodies in Primary Biliary Cirrhosis. J Immunol 1992;148:445-50). La mufagénesis se realizó empleando la técnica de PCR, uíilizándose dos pares de cebadores para amplificar la región N-íerminal (desde el inicio del gen IpdA hasía el siíio de unión a ácido lipóico, 135 pb) y el C-íerminal de la proíeína (a partir del siíio de unión a ácido lipóico y hasía el exíremo 3' del gen), quedando eliminada la posibilidad de generar reacciones auíoinmunes, como se demosfró en los esíudios clínicos en humanos. Depósito de material biológico
Los plásmidos PLL1 , PLL2, PLL3, PLH1 , PLH2, PLH3, PAZ1 , PAZ2, PAZ3, PID1 , PID2 y PID3 fueron depositados según el Tratado de Budapest en el Belgian Coordinaíed collecíion of Microorganism - BCCM™ , LMBP-COLLECTION, con fecha y bajo los números de acceso pendientes respecíivamenfe
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Esfrafegia de clonación del fragmento de E2 para la obtención de PLL1. DENe2: Fragmento de la proteína de la envolíura del DEN-2.
N-íerm: Secuencia nucleoíídica que codifica para la región de los primeros 45 aminoácidos de la MDH.
Figura 2. Esfraíegia de clonación del fragmento de E2 para la obtención de PLL2.
DENe2: Fragmento de la proleína de la envoltura del DEN-2.
MDH: mulante de deshidrogenase. Figura 3. Estrategia de clonación del fragmento de E2 para la obtención de PLL3.
DENe2: Fragmento de la proíeína de la envolíura del DEN-2.
MDH: muíante de des idrogenasa.
Figura 4. Estrategia de clonación del fragmento de E1 para la obtención de PLH1.
DENel : Fragmento de la proíeína de la envoltura del DEN-1. N-term: Secuencia nucleotídica que codifica para la región de los primeros 45 aminoácidos de la MDH.
Figura 5. Estrategia de clonación del fragmento de E1 para la obtención de PLH2.
DENel : Fragmento de la proíeína de la envoltura del DEN-1.
MDH: muíante de deshidrogenasa.
Figura 6. Estrategia de clonación del fragmento de E1 para la obtención de PLH3. DENel : Fragmento de la proíeína de la envoltura del DEN-1.
MDH: muíante de deshidrogenasa.
Figura 7. Estrategia de clonación del fragmento de E3 para la obtención de PAZ1.
DENe3: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-3.
N-term: Secuencia nucleotídica que codifica para la región de los primeros 45 aminoácidos de la MDH Figura 8. Estrategia de clonación del fragmento de E3 para la obtención de PAZ2.
DENe3: Fragmento de la proíeína de la envoltura del DEN-3.
MDH: mutanle de deshidrogenasa.
Figura 9. Esfraíegia de clonación del fragmento de E3 para la obtención de PAZ3.
DENe3: Fragmento de la proíeína de la envolíura del DEN-3. MDH: muíanle de deshidrogenasa.
Figura 10. Eslraíegia de clonación del fragmento de E4 para la obtención de PID1.
DENe4: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-4.
N-term: Secuencia nucleotídica que codifica para la región de los primeros 45 aminoácidos de la MDH
Figura 11. Estrategia de clonación del fragmento de E4 para la obtención de PID2. DENe4: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-4.
MDH: muíante de deshidrogenasa.
Figura 12. Estrategia de clonación del fragmento de E4 para la obtención de PID3.
DENe4: Fragmento de la proteína de la envolíura del DEN-4. MDH: muíante de deshidrogenasa.
Figura 13. Esíraíegia de clonación para la obtención de PD4D2. DENe4: Fragmento de la proíeína de la envolíura del DEN-4. DENe4: Fragmento de la proíeína de la envolíura del DEN-4. MDH: muíante de deshidrogenasa.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
EJEMPLO 1. Obtención de PLL1
La secuencia nucleofídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proíeína de la envolfura del virus DEN-2 (Sec. Id. No. 22) se amplificó con los oligonucleófidos ideníificados en el listado de secuencias como Secuencia No.1 y Secuencia No.2 a partir de la cepa viral de DEN-2 genoíipo Jamaica (Deubel V., Kinney R.M., Trení D.W. Nucleofide sequence and deduced amino acid sequence of the nonsírucíural proíeins of Dengue íype 2 virus, Jamaica genoíype: Comparaíive analysis of íhe full-lengfh genome.Virology 1988.165:234-244)
El vector se generó por digestión Xba l/Bam Hl del plasmidio PM108 His, el cual coníiene la secuencia nucleoíídica que codifica para la región N-ferminal de la MDH y para una secuencia de 6 hisfidinas (Secuencia No.23). Después del proceso de ligamienío, los posibles recombinantes se analizaron por resíricción y los posilivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W3110 (Hill C.W., Harnish B.W. 1982. Transposiíion of a chromosomal segmenf bounded by redundaní rRNA genes in Escherichia coli. J Bacferiology. 149:449-457) se fransformaron con el clon seleccionado llamado pLL1 (Fig.1 y Secuencia No.24). Luego del crecimienío de la colonia en medio líquido Louria Bertani (LB), se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obíuvo una banda de aproximadamente 25 kDa correspondiente al 10 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la región N-terminal de la MDH y el fragmento de la proíeína DENe del DEN-2. Esta banda fue reconocida con aníicuerpos policlonales (AcP) aníi-DEN-2 contenidos en un líquido ascííico hiperinmune (LAHI). La proíeína se denominó PLL1 (Secuencia No.25). EJEMPLO 2. Purificación de la proteína PLL1.
La biomasa obtenida de la cepa íransformada con pLL1 y crecida a 37 °C se rompió en prensa francesa. La proíeína recombinanfe se obíuvo mayoriíariameníe de forma insoluble asociada al precipitado de rupíura celular. A partir del precipitado, se realizó una exíracción con urea 6 M y el sobrenadante, conteniendo la proteína PLL1 , se aplicó en una columna de G-25 para eliminar el agente caoírópico. La fracción obtenida se aplicó en una columna de Quelaíing sepharose FF (Pharmacia, UK , en presencia de iones Cu++. La elución se realizó con Imidazol 50 mM y el volumen obtenido se aplicó en una columna de G-25 para obtener la profeína en el fampón de formulación NaCI 100 mM, KCI2 2 mM, Na2HPO4 10 mM, pH 7.2, KH2PO 1 mM (PBS). Esta preparación se utilizó para los esfudios inmunológicos.
EJEMPLO 3. Caracterización antigénica de PLL1
La fracción purificada de PLL1 se caracíerizó íanío por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos así como por sueros humanos positivos a
Dengue (tabla 1).
Tabla 1. Reacíividad de la profeína PLL1 frente a aníicuerpos monoclonales y policlonales.
Acs** Especificidad*** PLL1*
LAHI DEN-1
LAHl DEN-2 ++
LAHI DEN-3
LAHI DEN-4
LAHI EEE
LAHI YFV
LAHI SLV
AcM 3H5 NT +
* Se aplicaron 10 μg de las proteínas purificada PLL1 La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta ++
** Los líquidos ascíticos hipeπnmunes se utilizaron 1 100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 1000 *** EEE virus de la Encefalitis Equina, YFV Virus de la Fiebre Amarilla, SLV Virus de la Encefalitis de San
Luis NT Neutralizante serotipo específico.
Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obíuvieron con el líquido ascííico hiperinmune anfι-DEN-2. Este resultado es coincidenfe con el hecho de que la región clonada pertenece al seroíipo 2. El reconocimiento por LAHI contra los oíros seroíipos fue menor, en orden decreciente: DEN-1 y DEN-3 y por último DEN-4 que fue prácticamente imperceptible. En el caso de los anficuerpos generados por oíros flavivirus como Fiebre Amarilla y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Por otra parte, también se observó reacíividad con el monoclonal 3H5. Dicho reconocimienío por Western blotting fue dependieníe de puente disulfuro ya que al reducir la muesíra se perdía la señal. Por último se analizó la reactividad frente a fres sueros humanos de alio fííulo y tres de bajo tííulo a DEN-2, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting. EJEMPLO 4. Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PLL1
Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 35 ug i.p de la preparación purificada de PLL1 uíilizando el adyuvante de Freud. Una parte de estos animales (10 ratones) se sangraron iras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos tííulos contra DEN-2 mientras que, frente al resío de los serofipos, no se obíuvo reacíividad alguna (tabla 2 y tabla 5). Paralelamente se realizó el ensayo de Inhibición de la hemaglufinación (IHA) obteniéndose tífulos positivos solamente al DEN-2 (tabla 3 y tabla 5). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro evidenciándose tííulos neutralizantes (1 :320) contra DEN-2 mientras que contra el resío de los serofipos no exisíió neufralización de la infecíividad viral (tabla 4 y tabla 5). Esíos resultados indican la gran serofipo-especificidad de los aníicuerpos generados por PLL1. Tabla 2. Tífulos de anficuerpos coníra DEN-2 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PLL1.
Figure imgf000012_0001
Tabla 3. Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PLL1.
Figure imgf000012_0002
*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales. Tabla 4. Ensayo de neufralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PLL1.
Figure imgf000013_0001
* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
Tabla 5. Ensayo de reacíividad cruzada, contra todos los seroíipos virales por ELISA, IHA y neuíralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PLL1.
Figure imgf000013_0002
Figure imgf000013_0003
Figure imgf000013_0004
* Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros.
** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinacíón de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
*** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
EJEMPLO 5. Obtención de PLL2.
La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-2 (Secuencia No.22), se amplificó con los oligonucleótidos ideníificados en el lisiado de secuencias como Secuencia No.1 y Secuencia No.3 a partir de la cepa viral de DEN-2 genotipo Jamaica (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstrucfural proíeins of Dengue fype 2 virus, Jamaica genolype: Comparaíive analysls of fhe full-lengíh genome.Virology 1988.165:234-244).
El vector se generó por digesíión Xba //Eco Rl del plasmidio PM84 His, que contiene la secuencia nucleotídica de la MDH más la codificante para una cola de 6 histidinas (Secuencia No.26). Esta digestión permite la inserción del fragmento amplificado por PCR dentro de la región codificante para un dominio esírucíural de la MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes MM294 (Hanahan D. 1983. Studies on fransformaíion of Escherichia coli wifh plasmids. J. Mol. Biol. 166:557-580) se íransformaron con el clon seleccionado llamado pLL2 (Fig. 2 y Secuencia No. 27). Luego del crecimienío de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obíuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 10% de las proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la talla de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-2. Esta banda fue reconocida por un LAHI aníi-DEN2 y se denominó PLL2 (Secuencia No.28).
EJEMPLO 6. Purificación de la proteína PLL2 La biomasa obtenida de la cepa íransformada con pLL2 y crecida a 37 °C se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo de forma insoluble. A partir de la fracción soluble se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos meíálicos. La matriz utilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 15 mM y luego la elución se realizó con ¡midazol 100 mM. Por oíra parte, la fracción insoluble de la proteína recombinante se exfrajo con urea 8 M. Posteriormente se eliminó el ageníe caoírópico con una columna de G-25 y el eluaío se aplicó en una columna de Quelating Sepharose FF (Pharmacia, UK) en presencia de iones Cu++. La elución se llevó a cabo con Imidazol 100 mM. Finalmente, la preparación pura de las dos proteínas, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerlas en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estadios inmunológicos. EJEMPLO 7. Caracterización antigénica de PLL2
La fracción purificada de PLL2 se caracíerizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos posiíivos a Dengue (íabla 6). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obíuvieron con el LAHI anfi-DEN-2. El reconocimienío por LAHI coníra los oíros seroíipos fue menor, en orden decreciente: DEN-1 y DEN-3 y por último DEN-4, que fue prácticamente impercepíible. En el caso de los aníicuerpos generados por oíros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefaliíis de San Luis no se obíuvo reconocimiento alguno. Sin embargo, al analizar el reconocimiento por el monoclonal 3H5, se observó una gran reactividad (mayor que la obtenida con PLL1) tanto por Dot blotting como por Western blotting. Conírariameníe a lo obtenido con PLL1 , el reconocimiento del monoclonal se mantiene aún en presencia de agentes reductores en la muestra, lo cual indica una diferencia conformacional entre ambas proteínas. Finalmente se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto tífulo y fres de bajo íííulo a DEN-2, obíeniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting .
Tabla 6. Reacíividad de la proíeína PLL2 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales.
Acs**
Especificidad*** PLL2 sol, ins*
LAHI DEN-1 ++
LAHI DEN-2 +++
LAHI DEN-3 -
LAHI DEN-4 -
LAHI EEE -
LAHI YFV -
LAHI SLV -
AcM 3H5 NT +++
* Se aplicaron 10 μg de la proteína purificada PLL2 soluble e insoluble (sol, ins). La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++. ** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000.
*** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.
EJEMPLO 8. Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PLL2.
Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PLL2 tanto soluble como insoluble, utilizando el Adyuvante de Freud. Una parte de los animales (10 ratones) se sangraron iras la cuarta dosis y los anficuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos tííulos coníra DEN-2 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obíuvo reacíividad alguna (íabla 7 y tabla 10). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obíeniéndose íífulos posiíivos solamente al DEN-2 (íabla 8 y tabla 10). Finalmente se realizó el ensayo de neufralización in vitro alcanzándose íítulos de 1/1280 coníra DEN-2. Similar a lo obtenido con PLL1 , no se obtuvieron íííulos neuíralizaníes confra el resío de ios seroíipos (tabla 9 y tabla 10). Los resultados de ambas varianíes de PLL2 fueron similares, indicando que no influye el estado de solubilidad de la proteína en la capacidad de inducir anficuerpos funcionales.
Tabla 7. Títulos de anticuerpos contra DEN-2 de los sueros obtenidos iras la inmunización con PLL2 soluble e insoluble.
Figure imgf000016_0001
Tabla 8. Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PLL2 soluble e insoluble.
Figure imgf000016_0002
*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
Tabla 9. Ensayo de neuíralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PLL2 soluble e insoluble.
Figure imgf000017_0001
* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
Tabla 10. Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neuíralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PLL2 soluble e insoluble.
Figure imgf000017_0002
Figure imgf000017_0003
Figure imgf000017_0004
* Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros.
** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
*** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales. EJEMPLO 9. Obtención de pLL3.
La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-2 (Secuencia No.22) se amplificó con los oligonucleótidos ideníificados en el lisiado de secuencias como Secuencia No.4 y Secuencia No.5 a partir de la cepa viral de DEN-2 genoíipo Jamaica (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genoíype: Comparaíive analysis of the full-length genome. Virology 1988.165:234-244). El vector se generó por digestión Bam Hl/Bam Hl del plasmidio pD4, el cual contiene el gen de la MDH con una secuencia de 6 hisíidinas sin codón de parada (Secuencia No.9). Esto permite la fusión de la secuencia del fragmento de la proteína de la envoltura de DEN a la secuencia del C-terminal de MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W3110 se íransformaron con el clon seleccionado llamado pLL3 (fig. 3 y Secuencia No.10). Luego del crecimienío de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obíuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 20 % de proteínas totales en la célula. La falla obtenida se corresponde con la suma de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-2. Esta banda fue reconocida con anticuerpos AcP anfi-DEN-2 contenidos en un LAHI. La proteína se denominó PLL3 (Secuencia No.11). EJEMPLO 10. Purificación de la proteína PLL3.
La biomasa obtenida de la cepa íransformada con pLL3 y crecida a 37 °C se rompió en prensa francesa. La profeína recombinaníe se obfuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la profeína recombinaníe se exírajo con Urea 6M y luego se realizó una cambio de íampón por G-25. A partir de la muesfra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La mafriz uíilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 30 mM y luego la elución se realizó con imidazol 250 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos. EJEMPLO 11. Caracterización antigénica de PLL3
La fracción purificada de PLL3 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (tabla 11). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-2. El reconocimiento por LAHI coníra los oíros serofipos fue menor, en orden decreciente: DEN-1 y DEN-3 y por último DEN-4, que fue prácticamente impercepíible. En el caso de los anticuerpos generados por oíros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Sin embargo, al analizar el reconocimienío por el monoclonal 3H5, se observó una gran reactividad (similar a la obtenida con PLL2) tanto por Dot blotting como por Western blotting. Contrariamente a lo obtenido con PLL1 , el reconocimienío del monoclonal se maníiene aún en presencia de agentes reductores en la muestra, lo cual indica una diferencia conformacional entre ambas proteínas. Finalmente se analizó la reactividad frenfe a fres sueros humanos de alio tííulo y fres de bajo título a DEN-2, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting . Estos resultados fueron similares a los obtenidos con PLL2. Tabla 11. Reactividad de la proteína PLL3 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales.
Acs**
Especificidad*** PLL3*
LAHI DEN-1
LAHI DEN-2 +++
LAHI DEN-3
LAHI DEN-4
LAHI EEE
LAHI YFV
LAHI SLV
AcM 3H5 NT +++
* Se aplicaron 10 μg de la proteína purificada PLL3. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.
** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1:1000.
*** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San
Luís. NT: Neutralizante serotipo específico.
EJEMPLO 12. Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PLL3
Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PLL3 utilizando el Adyuvante de Freund. Una parte de los animales (10 ratones), se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos aníi-DEN se determinaron por ELISA. Se obíuvieron altos fííulos confra DEN-2 mienfras que, frente al resto de los serotipos no se obtuvo reactividad alguna (tabla 12 y íabla 15). Paralelamente se realizó el ensayo de Inhibición de la hemaglutinación obíeniéndose fííulos positivos solamente al DEN-2 (tabla 13 y tabla 15). Finalmente se realizó el ensayo de neuíralización in vitro alcanzándose fífulos de hasía 1/1280 coníra DEN-2 (tabla 14). No se obtuvieron íítulos neuíralizaníes coníra el resto de los serotipos (íabla 15). En las tres técnicas ensayadas se observó una gran especificidad de seroíipo en los anficuerpos generados similar a la obtenida con la inmunización con PLL2.
Tabla 12. Títulos de anficuerpos coníra DEN-2 de los sueros obíenidos iras la inmunización con PLL3.
Figure imgf000020_0001
Tabla 13. Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PLL3.
Figure imgf000020_0002
*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinacion de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales
Tabla 14. Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PLL3.
Figure imgf000021_0001
* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
Tabla 15. Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PLL3.
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000021_0003
Figure imgf000021_0004
* Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros.
** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
*** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
EJEMPLO 13. Obtención de pLH1.
La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-1 (Secuencia No.32) se amplificó con los olígonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.6 y Secuencia No.7 a partir de la cepa viral de DEN-1 (Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.Geneíic relatedness among structual profein genes of dengue 1 virus sfrains.J. Gen. Virol.1989. 70:1701- 1712).
El vector se generó por digestión Xba l/Bam Hl del plasmidio PM108 His, el cual contiene la secuencia nucleoíídica que codifica para la región N-terminal de la MDH y para una secuencia de 6 histidinas (Secuencia No.23). Después del proceso de ligamienío, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W3110 se transformaron con el clon seleccionado llamado pLH1 (Fig. 4 y Secuencia No.33). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 25 kDa correspondiente al 10 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la región N-terminal de la DH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-1. Esta banda fue reconocida con AcP anti- DEN-1 contenidos en un LAHI. La proíeína se denominó PLH1 (Secuencia No.34). EJEMPLO 14. Purificación de la proteína PLH1
La biomasa obtenida de la cepa íransformada con pLH1 se rompió en prensa francesa. La proíeína recombinaníe se obfuvo mayorifariamente de forma insoluble asociada al precipitado de ruptura celular. A partir del precipitado, se realizó una extracción con urea 7 M y el sobrenadante, conteniendo la proteína PLL1 , se aplicó en una columna de G-25 para eliminar el agente caoírópico. La fracción obtenida se aplicó en una columna de Quelating sepharose FF (Pharmacia, UK , en presencia de iones Cu++ y equilibrada con Tris 10 mM pH 8.0. La elución se realizó con Imidazol 60 mM y el volumen obtenido se aplicó en una columna de G-25 para obtener la proteína en el tampón de formulación (PBS). Esta preparación se utilizó para los estudios inmunológicos. EJEMPLO 15. Caracterización antigénica de PLH1
Las fracción purificada de PLH1 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos así como por sueros humanos positivos a Dengue (tabla 16). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obfuvieron con el líquido ascííico hiperinmune anti-DEN-1. El reconocimiento por LAHI contra los otros seroíipos fue menor. En el caso de los anficuerpos generados por oíros flavivirus como Fiebre Amarilla y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Por último se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alio íííulo y tres de bajo tííulo a DEN-1 , obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting . Tabla 16. Reactividad de la proteína PLH1 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales. Acs* Especificidad* PLH1
LAHI DEN-1
LAHI DEN-2
LAHI DEN-3
LAHI DEN-4
LAHI EEE
LAHI YFV
LAHI SLV
AcM 3H5 NT
* Se aplicaron 10 μg de la proteína purificada PLH1. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.
** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000.
*** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San
Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.
EJEMPLO 16. Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PLH1
Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 35 ug i.p de la preparación purificada de PLH1 utilizando el Adyuvante de Freund. Una parte de estos animales (10 ratones) se sangraron iras la cuarta dosis y los aníicuerpos aníi-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos tííulos contra DEN-1 mientras que, frente al resto de los serotipos, no se obfuvo reacíividad alguna (tabla 17 y tabla 20). Paralelamente se realizó el ensayo de
I HA obteniéndose fífulos posiíivos solamente al DEN-1 (tabla 18 y tabla 20). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro evidenciándose tííulos neuíralizantes
(1 :320) coníra DEN-1 mieníras que contra el resto de los seroíipos no exisíió neuíralización de la infecíividad viral (tabla 19 y tabla 20). Estos resultados indican la gran serotipo-especificidad de los anticuerpos generados por PLH1.
Tabla 17. Títulos de aníicuerpos coníra DEN-1 de los sueros obtenidos iras la inmunización con PLL1.
Figure imgf000023_0001
Tabla 18. Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PLH1.
Figure imgf000024_0001
*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
Tabla 19. Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PLH1.
Figure imgf000024_0002
* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
Tabla 20. Ensayo de reacíividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PLH1.
Figure imgf000024_0003
Figure imgf000025_0001
* Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros.
** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
*** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
EJEMPLO 17. Obtención de pLH2
La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína déla envoltura del virus DEN-1 (Secuencia No.12) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.6 y Secuencia No.8 a partir de la cepa viral de DEN-1 (Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.Genetic relatedness among structual protein genes of dengue 1 virus strains.J. Gen. Virol.1989. 70:1701- 1712).
El vector se generó por digestión Xba I/Eco Rl del plasmidio PM84 His , que contiene la secuencia nucleotídica de la MDH más la codificante para una cola de 6 histidinas (Secuencia No.26) . Esta digestión permite la inserción del fragmento amplificado por PCR dentro de la región codificante para un dominio estructural de la MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinaníes se analizaron por resíricción y los posifivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes MM294 se transformaron con el clon seleccionado llamado pLH2 (Fig. 5 y Secuencia No.35). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 10% de las proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la falla de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-1. Esta banda fue reconocida por un LAHI anti-DEN-1 y se denominó PLH2 (Secuencia No.36). EJEMPLO 18. Purificación de la proteína PLH2
La biomasa obtenida de la cepa transformada con pLH2 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la proteína se exírajo con Urea 7M y luego se realizó una cambio de fampón por G-25. A partir de la muesfra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz utilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 40 mM y luego la elución se realizó con imidazol 200 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos.
EJEMPLO 19. Caracterización antigénica de PLH2
La fracción purificada de PLH2 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (tabla 21).
Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obíuvieron con el LAHI aníi-DEN-1 (mayor que la obtenida con PLH1). El reconocimiento por LAHI contra los oíros seroíipos fue menor. En el caso de los aníicuerpos generados por oíros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefaliíis de San Luis no se obíuvo reconocimiento alguno. Finalmente se analizó la reactividad frente a cinco sueros humanos de alto título y tres de bajo título a DEN-1 , obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting .
Tabla 21. Reactividad de la profeína PLH2 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales.
Acs**
Especificidad*** PLH2
LAHI DEN-1
LAHI DEN-2
LAHI DEN-3
LAHI DEN-4
LAHI EEE
LAHI YFV
LAH1 SLV
AcM 3H5 NT
* Se aplicaron 10 μg de la proteína purificada PLH2. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.
** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000.
*** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.
EJEMPLO 20. Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PLH2 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PLH2, utilizando el adyuvante de Freund. Una parte de los animales (10 ratones) se sangraron iras la cuarta dosis y los aníicuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obíuvieron altos íífulos contra DEN-1 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obfuvo reactividad alguna (tabla 22 y íabla 25). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose tííulos posiíivos solamente al DEN-1 (tabla 23 y tabla 25). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro alcanzándose tííulos de 1/1280 contra DEN-1 (fabla 24). No se obíuvieron íítulos neufralizaníes coníra el resío de los serofipos (tabla 25).
Tabla 22. Títulos de anticuerpos coníra DEN-1 de los sueros obtenidos iras la inmunización con PLH2.
Figure imgf000027_0001
Tabla 23. Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PLH2.
Figure imgf000027_0002
*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
Tabla 24 . Ensayo de neuíralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PLH2.
Figure imgf000028_0001
* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
Tabla 25. Ensayo de reacfividad cruzada, contra todos los serofipos virales por ELISA, IHA y neuíralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PLH2.
Figure imgf000028_0002
Figure imgf000028_0003
Figure imgf000028_0004
* Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros.
** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
*** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
EJEMPLO 21. Obtención de pLH3
La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-1 (Secuencia No.32) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.9 y Secuencia No.10 a partir de la cepa viral de DEN-1 (Chu M.C., O'Rourke E.J., Trení D.W.Genetic relatedness among sírucfual protein genes of dengue 1 virus strains.J. Gen. Virol.1989. 70:1701-1712).
El vector se generó por digestión Bam Hl/Bam Hl del plasmidio pD4, el cual contiene el gen de la MDH con una secuencia de 6 histidinas sin codón de parada (Secuencia No.29). Esto permite la fusión de la secuencia del fragmento de la E al extremo 3'del del gen de la MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por resíricción y los posiíivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W3110 se transformaron con el clon seleccionado llamado pLH3 (Fig. 6 y Secuencia No.37). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 20 % de proteínas totales en la célula. La talla obfenida se corresponde con la suma de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-2. Esta banda fue reconocida con AcP aníi-DEN-1 contenidos en un LAHI. La proteína se denominó PLH3 (Secuencia No.38).
EJEMPLO 22. Purificación de la proteína PLH3.
La biomasa obtenida de la cepa fransformada con pLH3 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obfuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la proteína recombinante se extrajo con Urea 6M y luego se realizó una cambio de fampón por G-25. A partir de la muesíra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz utilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 30 mM y luego la elución se realizó con imidazol 250 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos.
EJEMPLO 23. Caracterización antigénica de PLH3
La fracción purificada de PLH3 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (tabla 26). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obíuvieron con el LAHI anti-DEN-1 mieníras que el reconocimiento con LAHI contra los otros serotípos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Finalmente se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alio tííulo y fres de bajo título a DEN-1 , obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Dot blotting y Western blotting .
Tabla 26. Reactividad de la proteína PLH3 frente a anticuerpos monocionales y policlonales.
Acs** Especificidad*** PLH3
LAHI DEN-1 LAHI DEN-2 LAHI DEN-3
LAHI DEN-4
LAHI EEE
LAHI YFV
LAHI SLV
AcM 3H5 NT
* Se aplicaron 10 μg de la proteína purificada PLH3. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.
** Los líquidos ascíticos hlperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000.
*** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San
Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.
EJEMPLO 24. Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PLH3 Se inmunizaron 25 rafones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PLH3 utilizando el Adyuvante de Freund. Una parte de los animales (10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obíuvieron altos títulos contra DEN-1 mieníras que, frente al resto de los serotipos no se obtuvo reactividad alguna (tabla 27 y tabla 30). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-1 (tabla 28 y tabla 30). Finalmente se realizó el ensayo de neuíralización in vitro alcanzándose fítulos de 1/1280 contra DEN-1 (tabla 29). No se obtuvieron fítulos neutralizantes contra el resto de los serotipos (tabla 30). Tabla 27. Títulos de aníicuerpos coníra DEN-1 de los sueros obíenidos iras la inmunización con PLH3.
Figure imgf000030_0001
Tabla 28 . Tííulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PLH3.
Figure imgf000031_0001
*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutlnaclón de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinanteε virales
Tabla 29. Ensayo de neuíralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PLH3.
Figure imgf000031_0002
* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
Tabla 30. Ensayo de reacíividad cruzada, coníra iodos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PLH3.
Figure imgf000031_0003
Figure imgf000032_0001
* Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros. ** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
*** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
EJEMPLO 25. Obtención de pAZ1
La secuencia nucleofídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-3 (Secuencia No.19) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.11 y Secuencia No.12 a partir de la cepa viral de DEN-3 (Osaíomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleoíide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology.1990. 176 (2): 643-647).
El vector se generó por digesíión Xba l/Bam Hl del plasmídio PM108 His, el cual contiene la secuencia nucleotídica que codifica para la región N-terminal de la MDH y para una secuencia de 6 histidinas (Secuencia No.23). Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por resíricción y los posifivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W3110 se transformaron con el clon seleccionado llamado pAZ1 (Fig. 7 y Secuencia No.40). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 25 kDa correspondiente al 10 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la región N-íerminal de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-3. Esta banda fue reconocida con AcP anti- DEN-3 contenidos en un LAHI. La profeína se denominó PAZ1 (Secuencia No.41). EJEMPLO 26. Purificación de la proteína PAZ1.
La biomasa obtenida de la cepa transformada con pAZ1 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo mayoritariamente de forma insoluble asociada al precipitado de ruptura celular. A partir del precipiíado, se realizó una extracción con urea 6 M y el sobrenadante, conteniendo la proteína PAZ1 , se aplicó en una columna de G- 25 para eliminar el agente caofrópico. La fracción obtenida se aplicó en una columna de Quelating sepharose FF (Pharmacia, UK), en presencia de iones Cu++ previamente equilibrada en Tris 10 mM pH 8.0. La elución se realizó con Imidazol 60 mM y el volumen obtenido se aplicó en una columna de G-25 para obtener la proteína en el tampón de formulación PBS. Esta preparación se utilizó para los estudios inmunológicos. EJEMPLO 27. Caracterización antigénica de PAZ1
La fracción purificada de PAZ1 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos así como por sueros humanos positivos a Dengue (tabla 31). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obíuvieron con el LAHI anfi-DEN-3. Este resultado es coincidente con el hecho de que la región clonada pertenece al serotipo 3. El reconocimiento por LAHI contra los otros serotipos fue menor. En el caso de los anficuerpos generados por oíros flavivirus como Fiebre Amarilla y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimienío alguno. Por úlfimo se analizó la reacfividad frente a cuatro sueros humanos de alio tííulo y fres de bajo íííulo a DEN-3, obíeniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting y Dot blotting. Tabla 31. Reactividad de la proteína PAZ1 frenfe a anticuerpos monoclonales y policlonales.
Acs** Especificidad*** . PAZ1
LAHI DEN-1
LAHI DEN-2
LAHI DEN-3
LAHI DEN-4
LAHI EEE
LAHI YFV
LAHI SLV
AcM 3H5 NT * Se aplicaron 10 μg de la proteína purificada PAZ1. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.
** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1:1000. *** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.
EJEMPLO 28. Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PAZ1
Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 35 ug i.p de la preparación purificada de PAZ1 utilizando el adyuvante de Freund. Una parte de estos animales (10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los aníicuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obíuvieron altos tííulos contra DEN-3 mientras que, frente al resto de los seroíipos, no se obtuvo reactividad alguna (labia 32 y íabla 35). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-3 (tabla 33 y tabla 35). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro evidenciándose fííulos neufralizaníes (1 :320) coníra DEN-3 mieniras que contra el resto de los serotipos no exisíió neutralización de la infectividad viral (tabla 34 y íabla 35). Estos resultados indican la gran seroíipo-especificidad de los anticuerpos generados por PAZ1. Tabla 32. Títulos de aníicuerpos contra DEN-3 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PAZ1.
Figure imgf000034_0001
Tabla 33. Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proíeína PAZ1.
Figure imgf000034_0002
*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales
Tabla 34. Ensayo de neuíralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PAZ3.
Figure imgf000034_0003
Figure imgf000035_0001
* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
Tabla 35. Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PAZ1.
Figure imgf000035_0002
Figure imgf000035_0003
Figure imgf000035_0004
* Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros.
** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
*** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
EJEMPLO 29. Obtención de pAZ2
La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-3 (Secuencia No.29) se amplificó con los oligonucleótidos idenfificados en el listado de secuencias como Secuencia No.11 y Secuencia No.13 a partir de la cepa viral de DEN-3 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology.1990. 176 (2): 643-647). El vector se generó por digestión Xba l/Eco Rl del plasmidio PM84 His, que contiene la secuencia nucleotídica de la MDH más la codificante para una cola de 6 histidinas (Secuencia No. 26). Esta digestión permite la inserción del fragmento amplificado por PCR dentro de la región codificante para un dominio estructural de la MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los posifivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes MM294 se transformaron con el clon seleccionado llamado pAZ2 (Fig. 8 y Secuencia No.42). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 10% de las proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la talla de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-3. Esta banda fue reconocida por un LAHI anfi-DEN-3 y se denominó PAZ2 (Secuencia No.43). EJEMPLO 30. Purificación de la proteína PAZ2
La biomasa obfenida de la cepa fransformada con pAZ2 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la proteína recombinanfe se extrajo con Urea 6M y luego se realizó una cambio de tampón por G-25. A partir de la muesíra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La maíriz uíilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 50 mM y luego la elución se realizó con imidazol 150 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos.
EJEMPLO 31. Caracterización antigénica de PAZ2
La fracción purificada de PAZ2 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (tabla 36). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obfuvieron con el LAHI aníi-DEN-3. El reconocimienío por LAHI contra los otros serofipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefaliíis de San Luis no se obíuvo reconocimiento alguno. Finalmente se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alio íítulo y fres de bajo tífulo a DEN-3, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Dot blotting y Western blotting.
Tabla 36. Reactividad de la proteína PAZ2 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales.
Acs** Especificidad*** PAZ2
LAHI DEN-1
LAHI DEN-2
LAHI DEN-3
LAHI DEN-4
LAHI EEE
LAHl YFV
LAHI SLV
:M 3H5 NT * Se aplicaron 10 μg de la proteína purificada PAZ2. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.
** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1:1000.
*** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San
Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.
EJEMPLO 32. Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PAZ2
Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PAZ2 utilizando el Adyuvante de Freund. Una parte de los animales(10 rafones) se sangraron tras la cuarta dosis y los aníicuerpos aníi-DEN se determinaron por ELISA. Se obíuvieron altos tííulos contra DEN-3 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obíuvo reaclividad alguna (íabla 37 y íabla 40). Paralelamente se realizó el ensayo de I HA obteniéndose íítulos posiíivos solamente al DEN-3 (tabla 38 y tabla 40). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro alcanzándose tífulos de 1/1280 contra DEN-3 (tabla 39). No se obtuvieron tííulos neuíralizantes coníra el resío de los seroíipos (íabla 40).
Tabla 37. Tííulos de anficuerpos coníra DEN-3 de los sueros obíenidos iras la inmunización con PAZ2.
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Tabla 38. Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PAZ2.
Figure imgf000037_0002
Figure imgf000038_0001
*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
Tabla 39. Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PAZ2.
Figure imgf000038_0002
* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
Tabla 40. Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serofipos virales por ELISA, IHA y neuíralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PAZ2.
Figure imgf000038_0003
Figure imgf000038_0004
Figure imgf000038_0005
* Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros.
** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutlnación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales. *** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales
EJEMPLO 33. Obtención de pAZ3 La secuencia nucleoíídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN- 3 (Secuencia No.39) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.14 y Secuencia No.15 a partir de la cepa viral de DEN-3 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology.1990. 176(2):643-647). El vector se generó por digestión Bam Hl/Bam Hl del plasmidio pD4, el cual contiene el gen de la MDH con una secuencia de 6 histidinas sin codón de parada (Secuencia No.26). Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W3110 se fransformaron con el clon seleccionado llamado pAZ3 (Fig. 9 y Secuencia No.44). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 20 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-3. Esta banda fue reconocida con AcP anti-DEN-3 contenidos en un LAHI. La proteína se denominó PAZ3 (Secuencia No.45).
EJEMPLO 34. Purificación de la proteína PAZ3.
La biomasa obtenida de la cepa transformada con pAZ3 se rompió en prensa francesa. La proíeína recombinaníe se obtuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la proteína se extrajo con Urea 7M y luego se realizó una cambio de tampón por G-25. A partir de la muestra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz utilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 45 mM y luego la elución se realizó con ¡midazol 230 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos.
EJEMPLO 35. Caracterización antigénica de PAZ3
La fracción purificada de PAZ3 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos posiíivos a Dengue (tabla 41). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-3. El reconocimienío por LAHI contra los otros serotipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Finalmente se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto título y tres de bajo título a DEN-3, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting y Dot blotting.
Tabla 41. Reactividad de la proteína PAZ3 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales.
Acs** Especificidad*** PAZ3
LAHI DEN-1
LAHI DEN-2
LAHI DEN-3
LAHI DEN-4
LAHI EEE
LAHI YFV
LAHI SLV
AcM 3H5 NT
* Se aplicaron 10 μg de la proteína purificada PAZ3. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.
** Los líquidos ascítlcos hiperinmunes se utilizaron 1:100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000.
*** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San
Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.
EJEMPLO 36. Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PAZ3 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PAZ3 utilizando el adyuvante de Freund. Una parte de los animales (10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los aníicuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos íítulos coníra DEN-3 mieníras que, frenfe al resío de los serofipos no se obtuvo reactividad alguna (tabla 42 y tabla 45). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obíeniéndose fííulos positivos solamente al DEN-3 (tabla 43 y tabla 45). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro alcanzándose íííulos de 1 : 1280 coníra DEN-3 (íabla 44). No se obíuvieron tífulos neutralizantes contra el resto de los serotipos (tabla 45).
Tabla 42. Tífulos de anticuerpos contra DEN-3 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PAZ3.
Figure imgf000041_0001
Tabla 43. Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PAZ3.
Figure imgf000041_0002
*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
Tabla 44. Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PAZ3.
Figure imgf000041_0003
Figure imgf000042_0001
* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
Tabla 45. Ensayo de reacíividad cruzada, confra todos los seroíipos virales por ELISA, IHA y neufralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PAZ3.
Figure imgf000042_0002
Figure imgf000042_0003
Figure imgf000042_0004
* Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros.
** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
*** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
EJEMPLO 37. Obtención de plD1
La secuencia nucleoíídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-4 (Secuencia No.46) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el lisiado de secuencias como Secuencia No.17 y Secuencia No.18 a partir de la cepa viral de DEN-4. (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue fype 4 viral DNA sequences: Analysis of genes coding for strucfural proteins. Virology 1986. 155:77-88). El vector se generó por digesfión Xba l/Bam Hl del plasmidio PM108 His, el cual contiene la secuencia nucleotídica que codifica para la región N-terminal de la MDH y para una secuencia de 6 histidinas (Secuencia No.23). Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W3110 se transformaron con el clon seleccionado llamado plD1 (Fig.10 y Secuencia No.47). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del usado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 25 kDa correspondiente al 10 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la región N-terminal de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-1. Esta banda fue reconocida con AcP anti- DEN-4 contenidos en un LAHI. La proteína se denominó PID1 (Secuencia No.48). EJEMPLO 38. Purificación de la proteína PID1
La biomasa obtenida de la cepa transformada con plD1 y crecida a 37 °C se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo mayoritariamenfe de forma insoluble asociada al precipitado de rupíura celular. A partir del precipiíado, se realizó una exfracción con urea 6 M y el sobrenadante, coníeniendo la proíeína PLL1 , se aplicó en una columna de G-25 para eliminar el agente caotrópico. La fracción obtenida se aplicó en una columna de Quelating sepharose FF (Pharmacia, UK), en presencia de iones Cu++. La elución se realizó con Imidazol 60 mM y el volumen obtenido se aplicó en una columna de G-25 para obtener la profeína en el tampón de formulación (PBS). Esta preparación se utilizó para los estudios inmunológicos. EJEMPLO 39. Caracterización antigénica de PID1.
Las fracción purificada de PID1 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferenfes sueros policlonales y monoclonales murinos así como por sueros humanos posifivos a Dengue (tabla 46). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-4. El reconocimiento por LAHI contra los oíros serotipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Por último, se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto íítulo y fres de bajo tífulo a DEN-4, obíeniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting y Dot blotting.
Tabla 46. Reacíividad de la proíeína P1D1 frente a aníicuerpos monoclonales y policlonales.
Acs** Especificidad*** PID1
LAHI DEN-1
LAHI DEN-2
LAHI DEN-3
LAHI DEN-4
LAHI EEE
LAHI YFV
LAHI SLV cM 3H5 NT * Se aplicaron 10 μg de la proteína purificada PID1. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.
** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000.
*** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San
Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.
EJEMPLO 40. Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PID1
Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 35 ug i.p de la preparación purificada de PID1 utilizando el Adyuvante de Freund. Una parte de estos animales (10 ratones) se sangraron iras la cuarta dosis y los aníicuerpos aníi-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos tííulos confra DEN-4 mieníras que, frente al resío de los seroíipos, no se obluvo reacíividad alguna (tabla 47 y tabla 50). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose tííulos positivos solamente al DEN-4 (tabla 48 y íabla 50). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro evidenciándose fítulos neutralizantes (1 :320) contra DEN-4 mieníras que contra el resto de los serotipos no existió neuíralización de la infecíividad viral (tabla 49 y tabla 50). Esíos resultados indican la gran seroíipo-especificidad de los anficuerpos generados por PID1.
Tabla 47. Tííulos de anticuerpos contra DEN-4 de los sueros obíenidos iras la inmunización con PID1.
Figure imgf000044_0001
Tabla 48. Tííulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PID1.
Figure imgf000045_0001
*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutlnantes virales.
Tabla 49. Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PID1.
Figure imgf000045_0002
* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
Tabla 50. Ensayo de reacíividad cruzada, contra todos los seroíipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PID1.
Figure imgf000045_0003
Figure imgf000046_0001
* Cada mezcla se formó por ia unión de tres sueros.
** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
*** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
EJEMPLO 41. Obtención de plD2.
La secuencia nucleotídíca que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN- 4 (Secuencia No.46) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.16 y Secuencia No.18 a partir de la cepa viral de DEN-4 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-Whiíe A.J., Markoff L, Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Analysis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155:77-88. El vector se generó por dígesíión Xba l/Eco Rl del plasmidio PM84 His , que conliene la secuencia nucleofídica de la MDH más la codificante para una cola de 6 hisíidinas (Secuencia No.26) . Esta digestión permite la inserción del fragmenío amplificado por PCR denfro de la región codificante para un dominio estructural de la MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinaníes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes MM294 se fransformaron con el clon seleccionado llamado plD2 (Fig. 11 y Secuencia No.49). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 10% de las proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la talla de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-4. Esta banda fue reconocida por un LAHI aníi-DEN-4 y se denominó PID2 (Secuencia No.50). EJEMPLO 42. Purificación de la proteína PID2
La biomasa obtenida de la cepa íransformada con plD2 y crecida a 37 °C se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obíuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la proteína se extrajo con Urea 6M y luego se realizó una cambio de íampón por G-25. A partir de la muesíra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos meíálicos. La maíriz uíilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 30 mM y luego la elución se realizó con imidazol 250 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos EJEMPLO 43. Caracterización antigénica de PID2
La fracción purificada de PID2 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (tabla 51).
Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-4. El reconocimiento por LAHI contra los otros serotipόs fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Finalmente se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto título y tres de bajo título a DEN-4, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting y Dot blotting. Tabla 51. Reacfividad de la proíeína PID2 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales.
Acs** Especificidad*** PID2
LAHI DEN-1
LAHI DEN-2
LAHI DEN-3
LAHI DEN-4
LAHI EEE
LAHI YFV
LAHI SLV
AcM 3H5 NT
* Se aplicaron 10 μg de la proteína purificada PID2. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.
** Los líquidos escíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000. *** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San
Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.
EJEMPLO 44. Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PID2
Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PID2 utilizando el adyuvante de Freund. Una parte de los animales(10 raíones) se sangraron iras la cuarta dosis y los anficuerpos aníi-DEN se deíerminaron por ELISA. Se obtuvieron altos íííulos coníra DEN-4 mientras que, frente al resto de los serofipos no se obíuvo reactividad alguna (tabla 52 y tabla 55). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obíeniéndose fítulos positivos solamente al DEN-4 (íabla 53 y tabla 55). Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in vitro alcanzándose títulos de 1/1280 contra DEN-4
(tabla 54). No se obtuvieron tííulos neufralizaníes contra el resto de los seroíipos (íabla
55).
Tabla 52. Títulos de anticuerpos coníra DEN-4 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PID2.
Figure imgf000048_0001
Tabla 53. Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PID2.
Figure imgf000048_0002
*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
Tabla 54. Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PID2.
Figure imgf000048_0003
Figure imgf000049_0001
* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
Tabla 55. Ensayo de reacíividad cruzada, conlra iodos los serofipos virales por ELISA, IHA y neuíralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PID2.
Figure imgf000049_0002
Figure imgf000049_0003
Figure imgf000049_0004
* Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros.
** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
*** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
EJEMPLO 45. Obtención de plD3
La secuencia nucleoíídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN- 4 (Secuencia No.46) se amplificó con los oligonucleóíidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.19 y Secuencia No.20 a partir de la cepa viral de DEN-4 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L, Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-lengíh Dengue lype 4 viral DNA sequences: Analysis of genes coding for strucíural proíeins. Virology 1986. 155:77-88). El vector se generó por digesíión Bam Hl/Bam Hl del plasmidio pD4, el cual confiene el gen de la MDH con una secuencia de 6 hisíidinas sin codón de parada (Secuencia No.29). Después del proceso de ligamienío, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W3110 se transformaron con el clon seleccionado llamado plD3 (fig. 12 y Secuencia No.51). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido Louria Beríani (LB), se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obfuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 20 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-4. Esta banda fue reconocida por AcP anti-DEN-4 contenidos en un LAHI. La proteína se denominó PID3 (Secuencia No.52).
EJEMPLO 46. Purificación de la proteína PID3.
La biomasa obtenida de la cepa íransformada con plD3 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obíuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la proteína recombinante se extrajo con Urea 6M y luego se realizó una cambio de íampón por G-25. A partir de la muesfra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz utilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 40 mM y luego la elución se realizó con imidazol 200 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el íampón de formulación (PBS) y realizar los estadios inmunológicos EJEMPLO 47. Caracterización antigénica de PID3
La fracción purificada de PID3 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (tabla 56). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obíuvieron con el LAHI anti-DEN-4. El reconocimiento por LAHI contra los oíros serotipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefalitis de San Luis no se obíuvo reconocimiento alguno. Finalmente se analizó la reacíividad frente a tres sueros humanos de alto título y tres de bajo íííulo a DEN-4, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting y Dot blotting. Tabla 56. Reactividad de la proteína PID3 freníe a aníicuerpos monoclonales y policlonales.
Acs** Especificidad*** PID3
LAHI DEN-1
LAHI DEN-2
LAHI DEN-3
LAHI DEN-4 LAHI EEE
LAHI YFV
LAHI SLV
AcM 3H5 NT
* Se aplicaron 10 μg de la proteína purificada PID3. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.
** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000.
*** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San
Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.
EJEMPLO 48. Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PID3 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PAZ3 utilizando el adyuvante de Freund. Una parte de los animales (10 ratones) se sangraron iras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-4 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obtuvo reactividad alguna (tabla 57 y tabla 60). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obíeniéndose íítulos posiíivos solamente al DEN-4 (tabla 58 y íabla 60). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro alcanzándose altos títulos contra DEN-4 (1 :1280) (íabla 59). No se obtuvieron tífulos neutralizantes contra el resto de los serotipos (tabla 60).
Tabla 57. Títulos de anticuerpos contra DEN-1 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PLH2.
Figure imgf000051_0001
Tabla 58. Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PID3.
Figure imgf000052_0001
*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de Inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
Tabla 59. Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PID3.
Figure imgf000052_0002
* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
Tabla 60. Ensayo de reactividad cruzada, coníra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PID3.
Figure imgf000052_0003
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000053_0002
* Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros. ** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
*** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
EJEMPLO 49. Obtención de pD4D2
La secuencia nucleoíídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-4 (Secuencia No.46) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.16 y Secuencia No.21 a partir de la cepa viral de DEN-4 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L, Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue íype 4 viral DNA sequences: Anaiysis of genes coding for strucíural proteins. Virology 1986. 155:77-88). El vector se generó por digestión Xba /Xba I del plasmidio pLL3, el cual contiene el gen de la MDH con una secuencia de 6 hisfidinas en la región 3' del gen y la secuencia del fragmento de la E de DEN-2 en el extremo 3'. Esto permite la obtención de dos regiones de la E de los serotipos 4 y 2 fusionados en el mismo gen de la MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinanfes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes MM294 se transformaron con el clon seleccionado llamado pD4D2 (Fig.13 y Secuencia No.53). Luego del crecimiento de la colonia en medio LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obfuvo una banda de aproximadameníe 110 kDa correspondieníe al 20 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la MDH y los dos fragmentos de la proteína DENe del DEN. Esta banda fue reconocida con AcP anfi-DEN-2 y anti DEN-4 contenidos en un LAHI. La proteína se denominó PD4D2 (Secuencia No.54). EJEMPLO 50. Purificación de la proteína PD4D2.
La biomasa obfenida de la cepa transformada con pD4D2 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la proteína recombinante se exfrajo con Urea 6M y luego se realizó una cambio de íampón por G-25. A partir de la muesfra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz uíilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 30 mM y luego la elución se realizó con imidazol 250 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el fampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos
EJEMPLO 51. Caracterización antigénica de PID3
La fracción purificada de PD4D2 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (tabla 61). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obfuvieron con el LAHI anti-DEN-2 y aníi-DEN-4. El reconocimiento por LAHI contra los otros serofipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Por otra parte, se mantuvo el reconocimiento por el aníicuerpo monoclonal 3H5 similar al obtenido con PLL2 y PLL3. Finalmente se analizó la reacíividad frente a sueros humanos de alio y bajo tífulo confra DEN-2 y DEN-4, obíeniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting y Dot blotting.
Tabla 61. Reactividad de la proteína PD4D2 freníe a aníicuerpos monoclonales y policlonales.
Acs** Especificidad*** PD4D2
LAHI DEN-1
LAHI DEN-2
LAHI DEN-3
LAHI DEN-4
LAHI EEE
LAHI YFV
LAHI SLV
AcM 3H5 NT * Se aplicaron 10 μg de la proteína purificada PD4D2 La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++
** Los líquidos ascíticos hipeπnmunes se utilizaron 1 100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 1000 *** EEE virus de la Encefalitis Equina, YFV Virus de la Fiebre Amarilla, SLV Virus de la Encefalitis de San Luis NT Neutralizante serotipo específico
EJEMPLO 52. Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PD4D2
Se inmunizaron 25 raíones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PAZ3 uíilizando el adyuvante de Freund. Una parte de los animales (10 raíones) se sangraron tras la cuarta dosis y los aníicuerpos aníi-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-2 y DEN-4 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obtuvo reactividad alguna (tabla 62 y tabla 65). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-2 y DEN-4 (tabla 63 y tabla 65). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro alcanzándose altos tííulos contra DEN-2 (>1 :1280) y DEN-4 (>1 : 1280) (tabla 64). No se obíuvieron tííulos neutralizantes contra el resto de los seroíipos (tabla 65).
Tabla 62. Títulos de anticuerpos contra DEN-4 y DEN-2 de los sueros obíenidos tras la inmunización con PD4D2.
Figure imgf000055_0001
Tabla 63. Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PD4D2.
Figure imgf000055_0002
*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
Tabla 64. Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PD4D2.
Figure imgf000056_0001
* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
Tabla 65. Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PD4D2.
Figure imgf000056_0002
Figure imgf000056_0003
Figure imgf000056_0004
* Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros.
** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.
*** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.
EJEMPLO 53. Ensayo de protección.
Para la evaluación de la protección conferida a los ratones ante el reto con DEN letal homólogo por la inmunización con todas las varianíes ensayadas, se uíilizaron los rafones que no fueron sangrados de cada grupo (15 raíones). Cada uno de los animales recibió una dosis de 100 LD50 de DEN letal por inoculación intracraneal y se observaron durante 21 días para obtener los porcentajes de letalidad. Se utilizaron como controles positivos grupos de 15 raíones inmunizados con las cuafro preparaciones virales (DEN-1 , DEN-2, DEN-3 y DEN-4). Todos los raíones de estos grupos sobrevivieron mieníras que los raíones del grupo control (-), enfermaron en los 7-11 días posteriores al reto obteniéndose un 100% de mortalidad. Finalmeníe, los grupos inmunizados con las proteínas de fusión ensayadas presentaron eníre un 80% y 100% de proíección obíeniéndose en iodos los casos diferencias significativas respecto al grupo control (tabla 66)
Tabla 66. Porcentajes de sobrevida en ratones inmunizados con las variantes de proteínas ensayadas frente al reto con virus DEN homólogo letal.
Figure imgf000057_0001
* Se calculó: (# de ratones sobrevivientes)/ (# total de ratones). Los datos de sobrevivientes se toman 21 después del reto. En el caso de los ratones inmunizados pD4D2, 15 se retaron con DEN-4 y 15 con DEN-2.
Ejemplo 54. Respuesta Linfoproliferativa Los animales de los diferentes grupos inmunizados con las proteínas quiméricas que presentan el fragmenío de la E de DEN-2 (PLL1 , PLL2 y PLL3), y un grupo placebo conírol, fueron sacrificados 15 días después de la última dosis. Posteriormente, se les extrajeron los bazos y se estudió la respuesta linfoproliferativa frente a los cuatro serofipos del virus Dengue. Los resultados de la íabla 66 reflejan los índices de estimulación obtenidos, evidenciándose una respuesta serofipo específica.
Tabla 67. índices de estimulación frente a los cuaíro serotipos virales de los linfocitos de los rafones inmunizados con PLL1 , PLL2 y PLL3.
Figure imgf000058_0001
* ndice de estimulación: cociente de los conteos por minuto de las muestras entre los conteos por minuto del control de síntesis espontánea de ADN.
** mitógeno Phytohemaglutinina

Claims

REIVINDICACIONES
1. Cadenas nucleofídicas quiméricas caracíerizadas por ser la combinación específica de secuencias correspondientes a fragmentos de la proteína E de los Flavivirus, con secuencias correspondientes al gen codificante para la proíeína muíante MDH ideníificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.26, Secuencia No.29 o con el fragmento de estas identificado como Secuencia No.23, las cuales codifican para proteínas quiméricas capaces de inducir en el organismo receptor una respuesta inmune de anticuerpos neutralizantes y protectora, contra los Flavivirus, cuando estas proteínas se encueníran presentes en una preparación farmacéutica.
2. Cadenas nucleotídicas quiméricas de acuerdo con la reivindicación 1 , caracíerizadas por ser la combinación específica de una o varias de las secuencias que codifican para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína E de los virus del Dengue con la secuencia nucleotídica de la proteina MDH, donde dichas secuencias se encueníren insertadas y/o fusionadas con las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.26, Secuencia No.29, o Secuencia No.23, las cuales codifican para proteínas quiméricas capaces de inducir en el organismo receptor una respuesta inmune humoral, neutralizante y protectora serotipo específica contra cada serotipo del virus Dengue.
3. Cadenas nucleotídicas quiméricas de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas por estar formadas por las secuencias que codifican para los aminoácidos del 286 al 426 de la proteína E de cada serotipo 1 , 2, 3 y 4 de los virus Dengue, fusionada al extremo 3' de la región que codifica para los primeros 45 aminoácidos de la proteína MDH identificada como Secuencia No.23.
4. Cadenas nucleofídicas quiméricas de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, caracíerizadas por estar formadas por las secuencias que codifican para los aminoácidos del 286 al 426 de la proteína E de cada serotipo 1 , 2, 3 y 4 de los virus Dengue, insertada en la región que codifica para el aminoácido 45 en la secuencia nucleoíídica de la MDH idenfificada como Secuencia No. 26.
5. Cadenas nucleotídicas quiméricas de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas por estar formadas por las secuencias que codifican para los aminoácidos del 286 al 426 de la proteína E de cada serotipos 1 , 2, 3 y 4 de los virus Dengue fusionada al extremo 3' de la secuencia que codifica para la proteína MDH identificada como secuencia No. 29.
6. Cadenas nucleotídicas quiméricas de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas por ser la combinación de las secuencias nucleotídicas que codifican para los aminoácidos del 286 al 426 de la proteína E de dos serotipos diferentes del virus Dengue con la secuencia de la MDH, donde una de las secuencias correspondientes a la proteina E está insertada en la región que codifica para el aminoácido 45 de la MDH y la oíra esta fusionada en la región 3' de la secuencia de la misma MDH identificada como secuencia No. 29.
7. Proteínas quiméricas recombinantes caracíerizadas por ser el producto de expresión de las cadenas nucleoíídicas de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5 y 6, y ser capaces de inducir en el organismo receptor una respuesta inmune humoral, neutralizante y protectora serotipo específica únicamente coníra cada serofipo homólogo del virus Dengue, cuando esta proíeinas se encueníra presente en una preparación farmacéuíica.
8. Proteínas quiméricas recombinantes caracterizadas por ser el producto de expresión de las cadenas nucleotídicas de las reivindicaciones 1 y 6, y ser capaces de inducir en el organismo receptor una respuesía inmune humoral, neuíralizante y protectora específica contra los dos serotipos homólogos del virus Dengue.
9. Cadena nucleotídica quimérica, ideníificada esencialmente por la Secuencia No.24, de acuerdo con la reivindicación 1 , 2 y 3 caracterizada por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.22 y
Secuencia No.23, la cual codifica para la proteína quimérica PLL1.
10. Proteína quimérica PLL1 , de acuerdo con las reivindicaciones 1 ,2 y 7 caracterizada por tener esencialmente la secuencia aminoacídica idenfificada en el listado de secuencias como Secuencia No.25, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 24 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesía humoral, neuíralizaníe y protectora específica coníra el virus del Dengue-2 cuando PLL1 se encueníra presente en una preparación farmacéuíica.
11. Cadena nucleoíídica quimérica de acuerdo con la reivindicaciones 1 , 2 y 4 identificada esencialmente como Secuencia No.27, caracterizada por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.22 y Secuencia No.26, la cual codifica para la proteína quimérica PLL2.
12. Profeína quimérica PLL2, de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada por tener esencialmente la secuencia aminoacídica idenfificada en el lisiado de secuencias como Secuencia No.28, ser el producío de expresión de la Secuencia No. 27 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neufralizaníe y protectora específica contra el virus del Dengue-2 cuando PLL2 se encuentra presente en una preparación farmacéutica.
13. Cadena nucleotídica quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 , 2 y 5 ideníificada esencialmente como Secuencia No.30, caracterizada por ser la combinación de las secuencias ideníificadas en el lisiado de secuencias como Secuencia No.22 y Secuencia No.29, la cual codifica para la proteína quimérica PLL3.
14. Proteína quimérica PLL3, de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracíerizada por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el lisiado de secuencias como Secuencia No.31 , ser el producto de expresión de la Secuencia
No. 30 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesía humoral, neufralizaníe y protectora específica contra el virus del Dengue-2 cuando PLL3 se encuentra presente en una preparación farmacéutica.
15. Cadena nucleotídica quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 , 2 y 3 identificada esencialmente como Secuencia No.33, caracterizada por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.23 y Secuencia No.32, la cual codifica para la proteína quimérica PLH1.
16. Proíeína quimérica PLH1 , de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.34, ser el producto de expresión de la
Secuencia No. 33 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neuíralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-1 cuando PLH1 se encuentra presente en una preparación farmacéutica.
17. Cadena nucleotídica quimérica de acuerdo con la reivindicación 1, 2 y 4 identificada esencialmente como Secuencia No.35, caracterizada por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.26 y Secuencia No.32, la cual codifica para la proteína quimérica PLH2.
18. Proíeína quimérica PLH2, de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracíerizada por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el lisiado de secuencias como Secuencia No.36, ser el producto de expresión de la Secuencia
No. 35 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-1 cuando PLH2 se encuentra presente en una preparación farmacéutica.
19. Cadena nucleotídica quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 , 2 y 5 identificada esencialmente como Secuencia No.37, caracterizada por ser la combinación de las secuencias ideníificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.29 y Secuencia No.32, la cual codifica para la proteína quimérica PLH3.
20. Proíeína quimérica PLH3, de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada por tener esencialmente la secuencia aminoacídica, identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.38, ser el producto de expresión de la Secuencia
No. 37 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neuíralizaníe y protectora específica contra el virus del Dengue-1 cuando PLH3 se encuentra presente en una preparación farmacéutica.
21. Cadena nucleotídica quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 , 2 y 3 identificada esencialmente como Secuencia No.40, caracterizada por ser la combinación de las secuencias ideníificadas en el lisiado de secuencias como Secuencia No.23 y
Secuencia No.39, la cual codifica para la proteína quimérica PAZ1.
22. Proteína quimérica PAZ1 , de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.41 , ser el producto de expresión de la Secuencia No. 40 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesía humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-3 cuando PAZ1 se encuentra presente en una preparación farmacéutica.
23. Cadena nucleotídica quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 , 2 y 4 ideníificada esencialmente como Secuencia No.42, caracíerizada por ser la combinación de las secuencias ideníificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.26 y
Secuencia No.39, la cual codifica para la proteína quimérica PAZ2.
24. Proteína quimérica PAZ2, de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada por tener esencialmeníe la secuencia aminoacídica ideníificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.43, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 42 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-3 cuando PAZ2 se encuentra presente en una preparación farmacéufica.
25. Cadena nucleotídica quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 , 2 y 5, identificada esencialmente como Secuencia No.44, caracterizada por ser la combinación de las secuencias ideníificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.29 y
Secuencia No.39, la cual codifica para la proteína quimérica PAZ3.
26. Proíeína quimérica PAZ3, de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada por tener esencialmente la secuencia aminoacídica ideníificada en el lisiado de secuencias como Secuencia No.45, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 44 y ser capaz de inducir en el organismo receptor, una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-3 cuando PAZ3 se encuentra presente en una preparación farmacéutica.
27. Cadena nucleotídica quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 , 2 y 3 identificada esencialmente como Secuencia No.47, caracterizada por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.23 y
Secuencia No.46, la cual codifica para la proteína quimérica PID1.
28. Proteína quimérica PID1 , de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.48, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 47 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-4 cuando PID1 se encuentra presente en una preparación farmacéutica.
29. Cadena nucleotídica quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 , 2 y 4 identificada esencialmente como Secuencia No.49, caracterizada por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.26 y Secuencia No.46, la cual codifica para la proteína quimérica PID2.
30. Proteína quimérica PID2, de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.50, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 49 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesía humoral, neuíralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-4 cuando PID2 se encuentra presente en una preparación farmacéutica.
31. Cadena nucleotídica quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 , 2 y 5, identificada esencialmente como Secuencia No.51 , caracterizada por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.29 y Secuencia No.46, la cual codifica para la proteína quimérica PID3.
32. Proteína quimérica PID3, de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.52, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 51 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus Dengue-4 cuando PID3 se encuentra presente en una preparación farmacéutica.
33. Una preparación farmacéutica capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta inmune protectora específica contra los virus del Dengue de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada por contener dos o más de las proteínas quiméricas descritas en las reivindicaciones 1 , 2, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,
26, 28, 30 y 32 y un vehículo farmacológico.
34. Una preparación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 33 caracterizada, por ser un ageníe preventivo o terapéuíico contra los virus del Dengue, para uso oral, intramuscular, subcutáneo, mucosal o iníravenoso.
35. Un método diagnóstico caracterizado por contener una o varias de las proteínas descritas en las reivindicaciones 1 , 2, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32 úíil para el diagnosíico o el serotipaje de los virus del Dengue.
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