KR20040030056A - 바이러스에 대한 효과를 유도하는 단백질을 코딩하는키메라 사슬 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 수용자에게서 뎅기 바이러스에 의한 감염에 대한 혈청형 특이적인 방어 체액성 면역반응을 유도함으로써 출혈 및 이러한 유형의 병리학에서 공지된 임상적 합병증을 야기하는 혈청형 비특이적 바이러스 면역향상 효과를 제거할 수 있는 단백질을 코딩하는 키메라 사슬을 수득하는 것에 관한 것이다. 이러한 키메라 핵산 사슬은 데히드로게나제 활성을 지닌 나이세리아 메닌지티디스로부터의 돌연변이 단백질의 유전자에 속하는 단편 및 발현 벡터에 삽입되는 경우에 특정한 특성을 지닌 키메라 단백질을 생성시키는 뎅기 바이러스로부터의 외피 (E) 단백질의 영역을 코딩하는 단편의 특정 조합으로 구성된다. 본 발명에 따라 생성된 키메라 분자는 높은 혈청형 특이성을 지닌 인간용 백신 제제 및 진단 수단을 수득하기 위해 제약 산업에 적용될 수 있다.
Description
뎅기 바이러스 (DEN)는 지질막이 이의 3개의 구성 단백질 중 2개, 즉, 외피 단백질 (E) 및 막 단백질 (M)을 함유하는 피막 바이러스이다. E 단백질은 구성 단백질 중 3번째 단백질인 코어 단백질로 구성된 이코사에드릭 (icosaedric) 누클레오캡시드를 포함한다. 상기 바이러스는 플라비비리대 (Flaviviridae)과에 속하며, 4가지 상이한 혈청형이 존재한다. 상기 바이러스의 인간으로의 전달은 스테고미아 (Stegomia)과에 속하는 모기인 아에데스 애집티 (Aedes aegypti)를 통해 수행된다. 상기 바이러스로 인해 인간에게서 나타나는 질병은 양성인 것으로 간주되었고, 출혈성 뎅기열 및 뎅기 쇽 증후군 (HDF/DSS)로 일컬어지는 출혈열 및 출혈성 쇽을 특징으로 하는 보다 심각한, 때때로 치명적인 종류가 출현할 때까지 뎅기열 또는 전형적 뎅기 (DF)로서 알려져 있었다 (Hammon WMc. New hemorrhagic fever in children in the Philippines and Thailand. Trans Assoc Physicians 1960; 73: 140-155). 두 가지 상이한 바이러스 혈청형의 순차적 감염이 위험 인자임을 입증하는 다수의 역학 조사가 수행되었다 (Kouri GP, Guzman MG, Brave JR. Why dengue hemorrhagic fever in Cuba) 2. An integral analysis. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1987;72: 821-823). 이러한 현상은 표적 세포 (단핵구)의 Fc 수용체를 통한 바이러스-항체 복합체의 세포로의 유입을 증가시킴으로써 바이러스 감염이 증가한다는 것을 기초로 하는 면역향상에 의해 설명된다 (halstead SB. Pathogenesis of dengue: challenges to molecular biology. Science 1988; 239; 476-481).
약독된 생백신을 제조하기 위해 다양한 기술이 개발되어 왔지만, 현재 이들 백신의 가능한 이점에 관해 다수의 문제가 해결되어 있지 않은데, 이는 이들 백신이 독성, 바이러스 간섭 및 게놈간 재조합으로 복귀할 수 있기 때문이다. 또한, 재조합 항원이 서브유닛 백신의 가능한 성분으로서 수득될 수 있다 (Feighny, R., Borrous, J. and Putnak R. Dengue type-2 virus envelope protein made using recombinant baculovirus protects mice against virus challenge. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1994. 50(3). 322-328; Deubel, V., Staropoli, I., Megret, F., et al. Affinity-purified dengue-2 virus envelope glycoprotein induces neutralizing antibodies and protective immunity in mice. Vaccine. 1997. 15, 1946-1954).
상기 바이러스의 주요 항원은 외피 단백질 DENe 이다. 이러한 단백질은 바이러스 표면의 주성분이며, 바이러스가 세포 수용체에 결합하는 것을 매개하는 것으로 여겨진다 (A Heinz FX, Berge R, Tuma W et al. A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies. Virology. 1983; 126:525). 이러한 단백질은 진드기 매개 뇌염 바이러스 (TBE)의 단백질과 구조적 상동성을 지니며 (Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, C., et al. The envelope glycoprotein from tick borne encephalitis virus at 2 A˚resolution. Nature 1995; 375: 291-298), 이는 혈청형 사이에서 또한 구조적으로 보존된다.
곤충 세포는 바쿨로바이러스 시스템을 벡터로서 사용하는 다양한 이종 유전자의 발현용으로 주로 사용되는 시스템 중의 하나를 구성한다. 이러한 벡터는 일본 뇌염 바이러스 (JEV)의 구성 단백질 및 비구성 단백질, DEN-1, DEN-2 및 DEN-4의 여러 조합물을 발현시키기 위해 사용되어 왔다 (Matsuura Y, Miyamoto M, Soto T et al. Characterization of japanese encephalitis virus envelope protein expressed by recombinant baculoviruses. Virology 1989; 173: 677-682; Deubel V, Bordier M, Megret F et al. Processing, secretion and immunoreactivity of carboxy terminally truncated dengue-2 envelope proteins expressed in insect cell by recombinant baculoviruses. Virology 1991; 180: 440-447; Putnak R, Feighny R, Burrous J et al. Dengue 1 virus envelope glycoprotein gene expressed in recombinant baculovirus elicit virus neutralization antibodies in mice and protects them from virus challenge. Am J Trop Med Hyg 1991; 45: 159-167; Feighny R, Burrous J, Putnak R. Dengue type 2 virus envelope proteinmade using recombinant baculovirus protects mice against virus challenge. Am J Trop Med Hyg 1994; 50: 322-328). 사용되는 또 다른 시스템은 E 단백질의 다수의 변이체를 발현하는 드로소필라 멜라노개스터 (Drosophila melanogaster)의 세포였다 (PCT/US96/07627). 적당한 기능적 반응을 수득함에도 불구하고, 이러한 시스템에서 발현된 단백질을 사용하는 경우, 이러한 단백질은 스케일-업 생산 공정의 개발을 위한 고비용을 암시하는데; 따라서, 효모에서 발현시키는 것이 플라비바이러스의 재조합 구성 단백질을 제조하는 대안이었다. 그러나, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 발현된 DENe 단백질의 경우 (PCT/US96/07627; Sugrue R.J., Fu H., Howe J., Chan Y. Expression of the Dengue virus structural proteins inPichia pastorisleads to the generation of virus-like particles. J Virol. 1997. 78, 1861-1866), 발현 수준이 낮고, 분비되거나 세포내에 존재하여, 정제 공정을 방해한다.
동시에, DENe 단백질의 다수의 변이체가 세균에서 수득되었다. 이러한 변이체 중의 하나는 대장균의 트립토판 대사의 단백질에 융합된 JEV의 E 단백질의 C-말단 부분 (TrpE)이었다. 이러한 단백질은 봉입체로서 생성되었고, 면역검출 기술을 이용하여 중화 모노클로날 항체 (Mab)에 의해 인식되었다. 그러나, 이러한 단백질의 순수한 제제는 중화 항체를 생성시키지 못하여 바이러스 공격을 방어할 수 없다 (Mason P.W., Zogel M.V., Semproni A.R., et al. The antigenic structure of dengue type 1 virus envelope and NS1 protein expressed inE. coli. J Gen Virol. 1990. 71: 2107-2114). 또한, E 단백질의 C-말단 단편에 융합된 스태필로코커스 아우리우스 (Staphylococcus aurius)의 단백질 A에 이어서 JEV의 비구성 단백질의 N-말단 세그먼트인 NS1를 함유하는 또 다른 작제물이 제조되었다 (Srivastava A.K., Morita K., Matsuo S., et al. Japanese encephalitis virus fusion protein with protein A expressed inE. coliconfers protection in mice. Microbiol Immunol. 1991. 35: 863-870). 이 경우, 융합 단백질은 가용성이어서, 친화성 크로마토그래피에 의한 이의 정제를 용이하게 한다. 마우스를 이러한 순수한 단백질로 면역시킨 경우, 높은 중화 항체 역가가 수득되었으며, 이는 또한 혈구응집을 억제하고 JEV에 의한 바이러스 공격을 방어하였다. 스태필로코커스 아우리우스의 단백질 A에 융합된 DEN-2의 DENe 영역을 사용한 경우에 유사한 결과가 수득되었지만 (Srivastava A. K., Putnak R. J., Warren R. L., Hoke C. H. Mice immunized with a dengue type 2 virus E and NS1 fusion protein made inEscherichia coliare protected against lethal dengue virus infection. Vaccine. 1995. 13: 1251-1258); 인간 면역글로불린 G (IgG)에 대해 고친화성을 나타내는 단백질 A의 존재로 인해 이러한 제제를 인간에 사용하는 것은 가능하지 않다.
최종적으로, MBP-DomB로 일컬어지는 DEN-2의 DENe 단백질의 B 도메인 및 대장균의 말토오스 결합 단백질 (MBP)을 함유하는 융합 단백질이 보고되었다 (Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G. Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengue envelope B domain fusion protein against dengue 2 virus infection in mice. Am J Trop Med Hyg. 1998. 58: 655-662). 이러한 단백질 변이체는 마우스에서 면역원성이었고, 중화 항체를 유도해내었다.
본원에 있어서, 본 발명은 키메라 서열을 수득하는 것에 관한 것인데, 예를 들어, 첫 번째 양태는 나이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis)로부터의 데히드로게나제 활성을 지닌 돌연변이 단백질 (MDH)의 N-말단 단편에 결합된 DENe 단백질의 영역을 코딩하는 서열이고; 두 번째 양태는 두 개의 상이한 위치에서 MDH 단백질의 전체 유전자에 결합된 DENe 단백질의 영역을 코딩하는 서열이고, 세 번째 양태에서 키메라 서열은 MDH 단백질을 코딩하는 동일한 유전자에 융합된 두 가지 상이한 바이러스 혈청형으로부터의 DENe 단백질의 두 개의 단편에 의해 형성된다. 이러한 키메라 사슬은 적당한 벡터내로 삽입되는 경우에 세균의 세포질내에서 불용성 키메라 단백질을 생성시킨다. 그 후, 이러한 단백질은 바이러스 혈구응집의 억제제인 DEN에 대한 중화 항체를 고수준으로 유도해낼 수 있고, 면역된 마우스를 바이러스 공격으로부터 방어할 수 있다.
상기 언급된 단백질의 불용성과 관련하여, 용이한 스케일-업 폴딩 공정 뿐만 아니라 사이먼즈 (Simmons) 등 (1998)에 의해 사용된 공정 보다 우수한 발현 및 정제 공정이 시험관내에서 달성되었다. 다른 한편, 마우스를 이러한 단백질로 면역시킴으로써 생성된 항체의 혈청형 특이성은, 중화, 혈구응집의 억제 및 ELISA 수준에서 사이먼즈 등 (1998)에 의해 사용된 용량 보다 적은 용량을 사용하여 입증된다. 이러한 사실은 기능적 면역반응을 자극할 수 있는 대장균에서의 불용성 DENe 단백질의 발현에 관한 첫 번째 보고를 구성한다.
또한, 이량체 변이체로 수득된 결과를 고려해 볼때, 두 가지 상이한 바이러스 혈청형에 대한 동일한 분자를 사용하여, 바이러스 감염을 중화시킬 수 있고 마우스를 바이러스 공격으로부터 방어할 수 있는 혈청형-특이적 항체를 생성시키는 것이 가능하다. MDH 단백질에 관해, 다른 서열과의 상동성 검색을 EMBL 데이터 베이스에서 수행한 결과, 최초 110개의 아미노산은 디히드로리포아미드 아세틸트랜스퍼라제의 리포익 (lipoic) 결합 도메인 영역 및 플렉시블 힌지와 매우 유사하고 (피루베이트 데히드로게나제 복합체의 E2 효소 및 α-세토글루타레이트 데히드로게나제), 단백질의 나머지 부분은 상기 복합체의 효소 E3인 리포아미드 데히드로게나제 (LPDH)와 매우 유사한 것으로 밝혀졌다 (Stephens, P. E; H. M. Darlinson, and J. R. Guest., 1983. The Pyruvate dehydrogenase complex ofE. coli. Eur. J. Biochem. 133:155-162).
다른 한편, 원발성 담즙성 간경변 (PBC)에 걸린 환자는 이들 단백질 사이에서 공통적인 리포산 결합 부위에 eogo 특이적인 항미토콘드리아 자가항체를 생성시키는 것으로 또한 밝혀졌다 (Gershwin ME, Mackay IR, Sturgess A, Coppel RL. Identification and specificity of a cDNA encoding the 70 KDa mitochondrial antigen recognized in primary biliary cirrhosis. J Immunol 1987;138:3525-31). 따라서, 본 발명자들은 키메라 단백질로서 인간에게 면역된 경우에 임의의 자기면역반응을 회피하기 위해 상기 단백질 중 이러한 영역을 돌연변이시키기로 결정하였다. 본 발명의 돌연변이 MDH 단백질을 I상 임상 실험에 사용한 결과, 인간에서 안전하고 면역원성인 것으로 밝혀졌고, 또한 PBC에 걸린 환자의 혈청에 의해 인식되지 않았다 (Perez, A., F. Dickinson, Z. Cinza, A. Ruiz, T. Serrano, J. Sosa,S. Gonzalez, Y. Gutierrez, C. Nazabal, O. Gutierrez, D. Guzman, M. Diaz, M. Delgado, E. Caballero, G. Sardinas, A. Alvarez, A. Martin, G. Guillen, R. Silva. Safety and preliminary immunogenicity of the recombinant outer membrane protein ofNeisseria meningitidisin human volunteers. Biotech. Appl. Biochem. 34: 121-125). 그러나, MBP를 인간에 사용하는 것이 가능한 지는 아직 입증되지 않았다 (Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G. Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengue envelope B domain fusion protein against dengue 2 virus infection in mice. Am J Trop Med Hyg. 1998. 58:655-662).
본 발명은 생명공학 및 제약 산업 분야, 특히 발현 벡터내로 도입된 경우에 뎅기 바이러스 감염에 대한 혈청형 특이적 체액성 면역반응 및 방어를 유도해낼 수 있는 단백질을 생성하는 키메라 누클레오티드 사슬을 수득하는 것에 관한 것이며, 이하 DEN으로 인용되는 뎅기 바이러스는 혈청형 특이적 바이러스 면역증폭 효과를 회피하여 출혈 및 이러한 유형의 병리학에서 공지된 임상적 합병증을 야기한다.
도 1. PLL1을 수득하기 위한 E2 단편의 클로닝 전략.
DENe2: DEN-2의 외피 단백질의 단편.
N-말단: MDH 단백질의 최초 45개 아미노산을 코딩하는 누클레오티드 서열.
도 2. PLL2을 수득하기 위한 E2 단편의 클로닝 전략.
DENe2: DEN-2의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 3. PLL3를 수득하기 위한 E2 단편의 클로닝 전략.
DENe2: DEN-2의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 4. PLH1을 수득하기 위한 E1 단편의 클로닝 전략.
DENe1: DEN-1의 외피 단백질의 단편.
N-말단: MDH 단백질의 최초 45개 아미노산을 코딩하는 누클레오티드 서열.
도 5. PLH2를 수득하기 위한 E1 단편의 클로닝 전략.
DENe1: DEN-1의 외피 단백질의 단편.
N-말단: MDH 단백질의 최초 45개 아미노산을 코딩하는 누클레오티드 서열.
도 6. PLH3를 수득하기 위한 E1 단편의 클로닝 전략.
DENe1: DEN-1의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 7. PAZ1을 수득하기 위한 E3 단편의 클로닝 전략.
DENe3: DEN-3의 외피 단백질의 단편.
N-말단: MDH 단백질의 최초 45개 아미노산을 코딩하는 누클레오티드 서열.
도 8. PAZ2를 수득하기 위한 E3 단편의 클로닝 전략.
DENe3: DEN-3의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 9. PAZ3를 수득하기 위한 E3 단편의 클로닝 전략.
DENe3: DEN-3의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 10. PID1을 수득하기 위한 E4 단편의 클로닝 전략.
DENe4: DEN-4의 외피 단백질의 단편.
N-말단: MDH 단백질의 최초 45개 아미노산을 코딩하는 누클레오티드 서열.
도 11. PID2를 수득하기 위한 E4 단편의 클로닝 전략.
DENe4: DEN-4의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 12. PID3를 수득하기 위한 E4 단편의 클로닝 전략.
DENe4: DEN-4의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 13. PD4D2를 수득하기 위한 클로닝 전략.
DENe4: DEN-4의 외피 단백질의 단편.
DENe2: DEN-2의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
본 발명에는 발현 벡터내로 도입되는 경우에 혈청형-특이적 체액성 면역반응을 유도하여 뎅기 바이러스에 의한 감염을 방어할 수 있는 키메라 단백질을 생성시키는 키메라 누클레오티드 사슬을 수득하는 것이 기재되어 있는데, 예를 들어 나이세리아 메닌지티디스로부터의 데히드로게나제 활성을 지닌 돌연변이 단백질 (MDH)의 N-말단 단편에 결합된 뎅기 바이러스의 바이러스 혈청형 각각으로부터의 DENe 단백질의 영역을 코딩하는 서열; 두 번째 양태에서, 두 가지 상이한 위치: MDH 단백질의 구성 도메인을 코딩하는 서열의 하나의 부위내 (리포산 결합 도메인 및 유전자의 3' 단부)에서 MDH 단백질의 전체 유전자에 결합된 DENe 단백질의 영역을 코딩하는 서열, 세 번째 양태에서, 키메라 서열은 MDH 유전자의 두 가지 상이한 위치에서 두 가지 상이한 바이러스 혈청형인 DEN-2 및 DEN-4로부터의 DENe 단백질의 두개의 단편에 의해 형성된다 (하나는 리포산 결합 도메인을 코딩하는 서열의 특정 부위내에 존재하고 (혈청형 4), 나머지 하나는 MDH gen의 3' 단부에 존재한다 (혈청형 2)). 이는 이량체 작제물로 일컬어진다.
이러한 키메라 단백질은 세균의 세포질내에서 불용성 형태로 수득되었다. 고정 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의한 정제 공정을 수행하여, 면역원성 실험을 위한 순수한 단백질을 수득하였다.
항원성 결과를 분석한 경우, 고도면역 복수액 (HMAF) 항-DEN에 대한 모든 재조합 키메라 단백질의 강력한 인식이 입증되었고 전체 MDH 유전자에 융합된 경우에 보다 높았는데, 이는 MDH에 의해 제공되는 DENe 단백질로부터의 영역의 폴딩에 대한 포지티브 효과를 증명해준다. 혈청형 2가 사용된 경우, 수득된 모든 재조합 단백질은 혈청형-특이적 중화 항체 (3H5)에 의해 인식되었고, 또한 전체 MDH 유전자에 융합된 경우 뿐만 아니라 이량체 단백질에서 보다 높았다. 각각의 경우에 동종 혈청형으로부터의 HMAF에 대한 인식은 이종 혈청형으로부터의 HMAF에 대한 인식 보다 현저히 높은 것으로 또한 관찰되었는데, 이는 혈청형-특이적 에피토프의 노출을 증명하므로 뎅기 및 혈청형판별 (serotyping)을 위한 진단 수단으로서 사용될 수 있게 해준다.
마우스가 모든 재조합 키메라 단백질로 면역된 경우, 중화 및 방어 반응이 수득되었다. 최고 중화 역가는 DENe 단백질로부터의 단편의 위치와 무관하게 MDH의 전체 유전자에 융합된 서열 및 이량체 단백질로 수득되었다. 이는 수득된 항원성 결과에서 반영된 DENe 단백질의 폴딩의 영향에 의해 설명될 수 있는 MDH에 의해매개된 면역반응의 면역증강 효과를 나타내었다. 이러한 단백질의 불용성이 적당한 면역반응을 생성시키는 능력에 영향을 주지 않는다는 것이 또한 최초로 입증되었는데, 이는 종래 기술과 대조적인 것이다.
모든 경우에 생성된 면역반응은 바이러스 중화, 혈구응집 억제 및 ELISA에서 혈청형-특이적이었다 (면역된 동종 혈청형에 대한 항체). 혈청형-특이적 항체의 생성은 이러한 항체가 면역향상 현상을 유리하게 하는 이종 혈청형의 바이러스로부터의 항원 결정기를 인식할 수 없다는 것을 의미한다. 이러한 특징은 뎅기 바이러스에 대한 백신 후보체의 개발에 매우 중요한데, 이는 이종 혈청형에 대한 항체의 인식이 출혈성 뎅기열 (HDF)에 대한 원인 중 하나일 수 있기 때문이다.
게다가, 키메라 단백질 중의 하나만으로 면역시킨 후에 두 가지 바이러스 혈청형에 대한 항체가 유도된 것으로 나타났는데, 이는 본 발명의 이용가능한 재조합 키메라 단백질 중 두 가지만을 사용하여 네 가지 혈청형에 대한 백신 후보체의 포뮬레이션을 가능하게 한다.
돌연변이 MDH 단백질을 수득하는 것은 리포산 결합 부위를 서열 ETDKAT에서 제거하는 것으로 이루어지는데, 이는 상기 지방산과 리신 (K)의 엡실론-아민기와의 공유결합을 기초로 한다 (Tuaillon N, Andre C, Briand JP et al. A lipoyl synthetic octadecapeptide of dihydrolipoamide acetyltransferase specifically recognized by anti-M2 autoantibodies in Primary Biliary Cirrhosis. J Immunol 1992; 148:445-50).
돌연변이유발은 단백질의 N-말단 영역 (IpdA 유전자의 개시 코돈에서 유전자의 3' 단부까지) 및 C-말단 (리포산 결합 부위에서 유전자의 3' 단부까지)을 증폭시키는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 수행하였고; 이로써 인간 임상 실험에서 입증된 바와 같이 자기면역반응을 생성시킬 가능성은 배제된다.
생물학적 물질의 기탁
플라스미드 PLL1, PLL2, PLL3, PLH1, PLH2, PLH3, PAZ1, PAZ2, PAZ3, PID1, PID2 및 PID3를 부다페스트 조약에 따라 벨지안 코디네이티드 컬렉션 오브 마이크로오가니즘 (Belgian Coordinated Collection of Microorganism - BCCMTM, LMBP-COLLECTION)에 수탁번호 (미지정)로 기탁하였다.
실시예 1. PLL1의 수득
DEN-2 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID NO.22)을 DEN-2 바이러스 균주 유전자형 자마이카 (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative analysis of the full-length genome. Virology 1988. 165:234-244)로부터의 SEQ ID No.1 및 SEQ ID No.2로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH의 N-말단 영역 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열(SEQ ID No.23)을 함유하는 벡터는 pM108 His 플라스미드를Xba I/Bam HI으로 분해함으로써 제조하였다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 (competent) 세포 W3110 (Hill C.W., Harnish B.W. 1982. Transposition of a chromosomal segment bounded by redundant rRNA genes inEscherichia coli. J Bacteriology. 149:449-457)을 pLL1 (도 1 및 SEQ ID No.24)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 루리아 버타니 (LB) 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 25kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 10%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질로부터의 N-말단 영역과 DEN-2 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF에 함유된 폴리클로날 항체 (PA) 항-DEN-2에 의해 인식되었다. 상기 단백질을 PLL1 (SEQ ID No.25)로 명명하였다.
실시예 2. PLL1 단백질의 정제
pLL1로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스 (biomass)를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 주로 세포 파괴물의 펠레트에 결합된 불용성 형태로서 수득하였다. 단백질은 우레아 6M을 사용하여 펠레트로부터 추출하고, PLL1 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 단백질을 이미다졸 50mM로 용리하고, 수득된 부피를 G-25 컬럼상에 로딩하여 최종적으로 포뮬레이션 완충액 NaCl 100mM, KCl22mM, Na2HPO410mM, pH 7.2, KH2PO41mM (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 3. PLL1의 항원성 특징화
PLL1의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의해 특징화하였다 (표 1).
표 1. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PLL1 단백질의 반응성.
Abs** | 특이성*** | PLL1* |
HMAF | DEN-1 | + |
HMAF | DEN-2 | ++ |
HMAF | DEN-3 | - |
HMAF | DEN-4 | - |
HMAF | EEE | - |
HMAF | YFV | - |
HMAF | SLV | - |
Mab 3H5 | NT | + |
* 정제된 PLL1의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
도트 블로팅 (Dot blotting)에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-2로 수득되었다. 이러한 결과는 클로닝된 영역이 혈청형 2에 속한다는 사실과 일치한다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 2의 경우 보다 낮았는데, DEN-1, DEN-3 및 DEN-4의 순서로 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 다른 한편, Mab 3H5는 실제로 반응성을 나타냈다. 웨스턴 블로팅에 의한 이러한 인식은 이황화물 결합에 의존했는데, 이는 샘플이 환원된 경우에 신호가 소실되었기 때문이다. 최종적으로, DEN-2에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
실시예 4. PLL1에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PLL1로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-2에 대한 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 2 및 표 5). 또한, 혈구응집 억제 검정 (HIA)을 수행한 결과, DEN-2에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 3 및 표 5). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-2에 대해 1:320의 중화 역가가 수득되었다. 그러나, 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 4 및 표 5). 이러한 결과는 PLL1에 의해 유도된 항체의 높은 혈청형-특이성을 나타낸다.
표 2.PLL1에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-2에 대한 항체 역가
마우스 | 역가 항-DEN-2 PLL1 | 역가 항-DEN-2 PBS 대조군 (-) |
1 | 1/128000 | <1:100 |
2 | 1/64000 | <1:100 |
3 | 1/64000 | <1:100 |
4 | 1/128000 | <1:100 |
5 | 1/32000 | <1:100 |
6 | 1/32000 | <1:100 |
7 | 1/64000 | <1:100 |
8 | 1/32000 | <1:100 |
9 | 1/128000 | <1:100 |
10 | 1/512000 | <1:100 |
표 3.PLL1에 의해 면역된 동물 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 | HI* 항-DEN-2 PLL1에 의한 역가 | HI 항-DEN-2 PBS C(-)에 의한 역가 |
1 | <1:5 | <1:5 |
2 | >1:640 | <1:5 |
3 | 1:320 | <1:5 |
4 | 1:320 | <1:5 |
5 | >1:640 | <1:5 |
6 | >1:640 | <1:5 |
7 | >1:640 | <1:5 |
8 | 1:320 | <1:5 |
9 | >1:640 | <1:5 |
10 | <1:5 | <1:5 |
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 4.PLL1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 | 중화 역가* 항-DEN-2 PLL1 | 중화 역가 항-DEN-2 PBS C(-) |
1 | 1:320 | <1:5 |
2 | 1:320 | <1:5 |
3 | 1:320 | <1:5 |
4 | 1:320 | <1:5 |
5 | 1:80 | <1:5 |
6 | 1:160 | <1:5 |
7 | 1:320 | <1:5 |
8 | 1:40 | <1:5 |
9 | 1:160 | <1:5 |
10 | 1:320 | <1:5 |
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 5.PLL1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* | ELISA (항-DEN-1) | ELISA (항-DEN-2) | ELISA (항-DEN-3) | ELISA (항-DEN-4) |
1 (PLL1) | <1/100 | >1:128000 | <1/100 | <1/100 |
2 (PLL1) | <1/100 | 1:128000 | <1/100 | <1/100 |
혈청의 혼합물* | HI** 항-DEN-1 | HI 항-DEN-2 | HI 항-DEN-3 | HI 항-DEN-4 |
PLL1 | <1/5 | >1/320 | <1/5 | <1/5 |
혈청의 혼합물* | 중화 역가*** 항-DEN-1 | 중화 역가 항-DEN-2 | 중화 역가 항-DEN-3 | 중화 역가 항-DEN-4 |
1 (PLL1) | <1:5 | 1:320 | <1:5 | <1:5 |
2 (PLL1) | <1:5 | 1:160 | <1:5 | <1:5 |
* 각각의 혼합물은 3개의 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 5. PLL2의 수득
DEN-2 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.22)을 DEN-2 바이러스 균주 유전자형 자마이카 (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative analysis of the full-length genome. Virology 1988. 165:234-244)로부터의 SEQ ID No.1 및 SEQ ID No.3으로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.26)을 함유하는 벡터는 pM84 His 플라스미드를Xba I/Eco RI으로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질의 구성 도메인에 대한 코딩 영역내에 삽입시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 (competent) 세포 MM294 (Hanahan D. 1983. Studies on transformation ofEscherichia coliwith plasmids. J. Mol. Biol. 166:557-580)을 pLL2 (도 2 및 SEQ ID No.27)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 10%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-2 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-2에 의해 인식되었으며, 이를 PLL2 (SEQ ID No.28)로 명명하였다.
실시예 6. PLL2 단백질의 정제
pLL2로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 수용성 및 불용성 둘 모두의 형태로서 수득하였다. 가용성 분획으로부터, Cu++이온과 미리 커플링시킨 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼을 이용하여 금속 이온-친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 컬럼을 이마다졸 15mM를 사용하여 세척하고, 단백질을 이미다졸 100mM로 용리하였다. 다른 한편, 불용성 분획에 결합된 단백질을 우레아 8M을 사용하여 추출하고, PLL2 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 단백질을 이미다졸 100mM로 용리하였다. 최종적으로, 각각의 형태의 단백질의 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 완충액 NaCl 100mM, KCl22mM, Na2HPO410mM, pH 7.2, KH2PO41mM (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 7. PLL2의 항원성 특징화
PLL2의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의해 특징화하였다 (표 6).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-2로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 2의 경우 보다 낮았는데, DEN-1, DEN-3 및 DEN-4의 순서로 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 그럼에도 불구하고, Mab 3H5에 관해, 도트 블롯 및 웨스턴 블롯에 의해 커다란 반응성이 관찰되었다 (PLL1로 수득된 반응성 보다도 크다). PLL1 결과와 대조적으로, Mab 3H5에 의한 인식은 환원제가 샘플에 존재하는 경우에 동일하였는데, 이는 둘 모두의 단백질 간의 가능한 입체형태 차이를 나타낸다. 최종적으로, DEN-2에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 6. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PLL2 단백질의 반응성.
Abs** | 특이성*** | PLL2 가용성,불용성* |
HMAF | DEN-1 | ++ |
HMAF | DEN-2 | +++ |
HMAF | DEN-3 | - |
HMAF | DEN-4 | - |
HMAF | EEE | - |
HMAF | YFV | - |
HMAF | SLV | - |
Mab 3H5 | NT | +++ |
* 정제된 PLL2의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 8. PLL2에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PLL2로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-2에 대한 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 7 및 표 10). 또한, 혈구응집 억제 검정 (HI)을 수행한 결과, DEN-2에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 8 및 표 10). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-2에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다. PLL1로 수득된 결과와 유사하게, 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 9 및 표 10). 다른 한편, PLL2의 둘 모두의 변이체로 수득된 결과는 유사하였는데, 이는 단백질의 가용화 상태가 기능적 항체를 생성시키는 능력에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
표 7.가용성 및 불용성 PLL2에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-2에 대한 항체 역가
마우스 | 역가 항-DEN-2 (PLL2) | 역가 항-DEN-2 PBS C(-) | |
PLL2 가용성 | PLL2 불용성 | ||
1 | >1:128000 | 1:64000 | <1:100 |
2 | 1:128000 | >1:128000 | <1:100 |
3 | >1:128000 | 1:128000 | <1:100 |
4 | >1:128000 | >1:128000 | <1:100 |
5 | 1:64000 | >1:128000 | <1:100 |
6 | >1:128000 | 1:128000 | <1:100 |
7 | 1:64000 | >1:128000 | <1:100 |
8 | >1:128000 | 1:64000 | <1:100 |
9 | >1:128000 | 1:64000 | <1:100 |
10 | 1:128000 | >1:128000 | <1:100 |
표 8.가용성 및 불용성 PLL2로 면역시킨 동물 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 | HI*에 의한 역가 항-DEN-2 (PLL2) | HI에 의한 역가 항-DEN-2 PBS C(-) | |
PLL2 가용성 | PLL2 불용성 | ||
1 | >1:640 | >1:640 | <1:5 |
2 | >1:640 | >1:640 | <1:5 |
3 | 1:320 | >1:640 | <1:5 |
4 | >1:640 | 1:320 | <1:5 |
5 | 1:320 | <1:5 | <1:5 |
6 | >1:640 | >1:640 | <1:5 |
7 | >1:640 | 1:320 | <1:5 |
8 | <1:5 | 1:320 | <1:5 |
9 | 1:320 | >1:640 | <1:5 |
10 | >1:640 | >1:640 | <1:5 |
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 9.가용성 및 불용성 PLL2로 면역시킨 동물 혈청을 사용한 바이러스 중화검정
마우스 | 중화 역가 항-DEN-2 (PLL2) | 중화 역가 항-DEN-2 PBS C(-) | |
PLL2 가용성 | PLL2 불용성 | ||
1 | >1:1280 | >1:1280 | >1:1280 |
2 | >1:1280 | >1:1280 | <1:5 |
3 | >1:1280 | 1:640 | <1:5 |
4 | 1:640 | >1:1280 | <1:5 |
5 | 1:640 | 1:640 | <1:5 |
6 | >1:1280 | >1:1280 | <1:5 |
7 | >1:1280 | >1:1280 | <1:5 |
8 | >1:1280 | >1:1280 | <1:5 |
9 | >1:1280 | >1:1280 | <1:5 |
10 | >1:1280 | >1:1280 | <1:5 |
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 10.가용성 및 불용성 PLL2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* | ELISA (항-DEN-1) | ELISA (항-DEN-2) | ELISA (항-DEN-3) | ELISA (항-DEN-4) |
1 (PLL2 가용성) | <1/100 | >1:128000 | <1/100 | <1/100 |
2 (PLL2 가용성) | <1/100 | 1:64000 | <1/100 | <1/100 |
1 (PLL2 불용성) | <1/100 | 1:64000 | <1/100 | <1/100 |
2 (PLL2 불용성) | <1/100 | >1:128000 | <1/100 | <1/100 |
혈청의 혼합물* | HI** 항-DEN-1 | HI 항-DEN-2 | HI 항-DEN-3 | HI 항-DEN-4 |
PLL2 가용성 | <1/5 | >1/320 | <1/5 | <1/5 |
PLL2 불용성 | <1/5 | >1/320 | <1/5 | <1/5 |
혈청의 혼합물* | 중화 역가*** 항-DEN-1 | 중화 역가 항-DEN-2 | 중화 역가 항-DEN-3 | 중화 역가 항-DEN-4 |
1 (PLL2) | <1:5 | 1:320 | <1:5 | <1:5 |
2 (PLL2) | <1:5 | 1:160 | <1:5 | <1:5 |
* 각각의 혼합물은 3개의 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 9. pLL3의 수득
DEN-2 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.22)을 DEN-2 바이러스 균주 유전자형 자마이카 (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative analysis of the full-length genome. Virology 1988. 165:234-244)로부터의 SEQ ID No.4 및 SEQ ID No.5로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 정지 코돈이 없는 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.29)을 함유하는 벡터는 pD4 플라스미드를Bam HI/Bam HI으로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질의 C-말단 영역 다음에 융합시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pLL3 (도 3 및 SEQ ID No.30)으로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-2 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAFI 항-DEN-2에 의해 인식되었으며, 이를 PLL3 (SEQ ID No.31)으로 명명하였다.
실시예 10. PLL3 단백질의 정제
pLL2로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로서 수득하였다. 불용성 분획으로부터, 단백질을 우레아 6M을 사용하여 추출하고, PLL3 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 30mM로 세척하고, 단백질을 이미다졸 100mM로 용리하였다. 최종적으로, 단백질의 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 11. PLL3의 항원성 특징화
PLL3의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의해 특징화하였다 (표 11).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-2로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 2의 경우 보다 낮았는데, DEN-1, DEN-3 및 DEN-4의 순서로 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 그럼에도 불구하고, Mab 3H5에 관해, 도트 블롯 및 웨스턴 블롯에 의해 커다란 반응성이관찰되었다 (PLL2로 수득된 반응성과 유사하다). PLL1 결과와 대조적으로, Mab 3H5에 의한 인식은 환원제가 샘플에 존재하는 경우에 동일하였는데, 이는 둘 모두의 단백질 간의 가능한 입체형태 차이를 나타낸다. 최종적으로, DEN-2에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다. 이러한 결과는 PLL2로 수득된 결과와 유사하였다.
표 11. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PLL3 단백질의 반응성.
Abs** | 특이성*** | PLL3* |
HMAF | DEN-1 | ++ |
HMAF | DEN-2 | +++ |
HMAF | DEN-3 | - |
HMAF | DEN-4 | - |
HMAF | EEE | - |
HMAF | YFV | - |
HMAF | SLV | - |
Mab 3H5 | NT | +++ |
* 정제된 PLL3의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 12. PLL3에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PLL3으로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-2에 대한 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 12 및 표 15). 또한, 혈구응집 억제 (HI) 검정을 수행한 결과, DEN-2에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 13 및 표 15). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-2에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 14). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 15). 3회의 시험을 사용한 경우, 고수준의 혈청형-특이적 항체가 검출되었으며, 이는 PLL2 단백질을 사용하여 면역시킨 후에 수득된 결과와 유사하였다.
표 12.PLL3에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-2에 대한 항체 역가
마우스 | 역가 항-DEN-2 (PLL3) | 역가 항-DEN-2 PBS C(-) |
1 | 1:128000 | <1:100 |
2 | >1:128000 | <1:100 |
3 | >1:128000 | <1:100 |
4 | 1:64000 | <1:100 |
5 | >1:128000 | <1:100 |
6 | 1:64000 | <1:100 |
7 | >1:128000 | <1:100 |
8 | >1:128000 | <1:100 |
9 | 1:128000 | <1:100 |
10 | >1:128000 | <1:100 |
표 13.PLL3으로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 | HI*에 의한 역가 항-DEN-2 (PLL3) | HI에 의한 역가 항-DEN-2 PBS C(-) |
1 | >1:640 | <1:5 |
2 | 1:320 | <1:5 |
3 | 1:320 | <1:5 |
4 | >1:640 | <1:5 |
5 | 1:320 | <1:5 |
6 | >1:640 | <1:5 |
7 | >1:640 | <1:5 |
8 | >1:640 | <1:5 |
9 | 1:320 | <1:5 |
10 | >1:640 | <1:5 |
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 14.PLL3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 | 중화 역가 항-DEN-2 PLL3 | 중화 역가 항-DEN-2 PBS C(-) |
1 | >1:1280 | <1:5 |
2 | >1:1280 | <1:5 |
3 | >1:1280 | <1:5 |
4 | 1:640 | <1:5 |
5 | >1:1280 | <1:5 |
6 | >1:1280 | <1:5 |
7 | >1:1280 | <1:5 |
8 | >1:1280 | <1:5 |
9 | 1:640 | <1:5 |
10 | >1:1280 | <1:5 |
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 15.PLL3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* | ELISA (항-DEN-1) | ELISA (항-DEN-2) | ELISA (항-DEN-3) | ELISA (항-DEN-4) |
1 (PLL3) | <1/100 | >1:128000 | <1/100 | <1/100 |
2 (PLL3) | <1/100 | >1:128000 | <1/100 | <1/100 |
혈청의 혼합물* | HI** 항-DEN-1 | HI 항-DEN-2 | HI 항-DEN-3 | HI 항-DEN-4 |
PLL3 | <1/5 | >1/320 | <1/5 | <1/5 |
혈청의 혼합물* | 중화 역가*** 항-DEN-1 | 중화 역가*** 항-DEN-2 | 중화 역가*** 항-DEN-3 | 중화 역가*** 항-DEN-4 |
1 (PLL3) | <1:5 | >1:1280 | <1:5 | <1:5 |
2 (PLL3) | <1:5 | >1:1280 | <1:5 | <1:5 |
* 각각의 혼합물은 3개의 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 13. pLH1의 수득
DEN-1 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.32)을 DEN-1 바이러스 균주 유전자형 (Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.Genetic relateness among structural protein genes of dengue 1 virus strains.J. Gen. Virol.1989. 70:1701-1712)으로부터의 SEQ ID No.6 및 SEQ ID No.7로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH의 N-말단 영역 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.23)을 함유하는 벡터는 pM108 His 플라스미드를Xba I/Bam HI으로 분해함으로써 제조하였다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pLH1 (도 4 및 SEQ ID No.33)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 루리아 버타니 (LB) 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 25kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 10%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질로부터의 N-말단 영역과 DEN-1 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF에 함유된 폴리클로날 항체 (PA) 항-DEN-1에 의해 인식되었다. 상기 단백질을 PLH1 (SEQ ID No.34)으로 명명하였다.
실시예 14. PLH1 단백질의 정제
pLH1로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 주로 세포 파괴물의 펠레트에 결합된 불용성 형태로서 수득하였다. 펠레트로부터, 단백질을 우레아 7M로 추출하고, PLH1 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 단백질을 이미다졸 60mM로 용리하고, 수득된 부피를 G-25 컬럼상에 로딩하여 최종적으로 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 15. PLH1의 항원성 특징화
PLH1의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의해 특징화하였다 (표 16).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-1로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 1의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-1에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 16. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PLH1 단백질의 반응성.
Abs** | 특이성*** | PLH1 |
HMAF | DEN-1 | ++ |
HMAF | DEN-2 | + |
HMAF | DEN-3 | - |
HMAF | DEN-4 | - |
HMAF | EEE | - |
HMAF | YFV | - |
HMAF | SLV | - |
Mab 3H5 | NT | - |
* 정제된 PLH1의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 16. PLH1에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PLH1로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-1에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 17 및 표 20). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-1에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 18 및 표 20). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-1에 대해 1:320의 중화 역가가 수득되었다. 그러나, 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 19 및 표 20). 이러한 결과는 PLH1에 의해 유도된 항체의 높은 혈청형-특이성을 나타낸다.
표 17.PLH1에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-1에 대한 항체 역가
마우스 | 역가 항-DEN-1 (PLH1) | 역가 항-DEN-1 PBS C(-) |
1 | 1/64000 | <1:100 |
2 | 1/128000 | <1:100 |
3 | 1/64000 | <1:100 |
4 | 1/32000 | <1:100 |
5 | 1/32000 | <1:100 |
6 | 1/64000 | <1:100 |
7 | 1/128000 | <1:100 |
8 | 1/64000 | <1:100 |
9 | 1/128000 | <1:100 |
10 | 1/128000 | <1:100 |
표 18.PLH1로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 | HI*에 의한 역가 항-DEN-1 (PLH1) | HI*에 의한 역가 항-DEN-1 PBS C(-) |
1 | >1:640 | <1:5 |
2 | 1:320 | <1:5 |
3 | >1:640 | <1:5 |
4 | >1:640 | <1:5 |
5 | >1:640 | <1:5 |
6 | 1:320 | <1:5 |
7 | 1:40 | <1:5 |
8 | 1:320 | <1:5 |
9 | >1:640 | <1:5 |
10 | <1:5 | <1:5 |
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 19.PLH1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 | 중화 역가* 항-DEN-1 (PLH1) | 중화 역가* 항-DEN-1 PBS C(-) |
1 | 1:80 | <1:5 |
2 | 1:320 | <1:5 |
3 | 1:40 | <1:5 |
4 | 1:320 | <1:5 |
5 | 1:80 | <1:5 |
6 | 1:160 | <1:5 |
7 | 1:320 | <1:5 |
8 | 1:320 | <1:5 |
9 | 1:320 | <1:5 |
10 | 1:320 | <1:5 |
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 20.PLH1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* | ELISA (항-DEN-1) | ELISA (항-DEN-2) | ELISA (항-DEN-3) | ELISA (항-DEN-4) |
1 (PLH1) | 1:128000 | <1/100 | <1/100 | <1/100 |
2 (PLH1) | >1:128000 | <1/100 | <1/100 | <1/100 |
혈청의 혼합물* | HI** 항-DEN-1 | HI 항-DEN-2 | HI 항-DEN-3 | HI 항-DEN-4 |
PLH1 | >1:320 | <1/5 | <1/5 | <1/5 |
혈청의 혼합물* | 중화 역가*** 항-DEN-1 | 중화 역가*** 항-DEN-2 | 중화 역가*** 항-DEN-3 | 중화 역가*** 항-DEN-4 |
1 (PLH1) | 1:160 | <1:5 | <1:5 | <1:5 |
2 (PLH1) | 1:320 | <1:5 | <1:5 | <1:5 |
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 17. pLH2의 수득
DEN-1 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.32)을 DEN-1 바이러스 균주 (Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.Genetic relateness among structural protein genes of dengue 1 virus strains.J. Gen. Virol.1989. 70:1701-1712)으로부터의 SEQ ID No.6 및 SEQ ID No.8로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.26)을 함유하는 벡터는 pM84 His 플라스미드를Xba I/Eco RI로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질의 구성 도메인에 대한 코딩 영역내에 삽입시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 MM294를 pLH2 (도 5 및 SEQ ID No.35)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-1 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-1에 의해 인식되었으며, 이를 PLH2 (SEQ ID No.36)로 명명하였다.
실시예 18. PLH2 단백질의 정제
PLH2로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로 수득하였다. 불용성 분획에 결합된 단백질을 우레아 7M을 사용하여 추출하고, PLH2 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 40mM로 세척하고, 단백질을 이미다졸 100mM로 용리하였다. 최종적으로, 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 19. PLH2의 항원성 특징화
PLH2의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 21).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-1로 수득되었다 (PLH1로 수득된 인식 보다 높다). 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 1의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-1에 대한 5가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 21. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PLH2 단백질의 반응성.
Abs** | 특이성*** | PLH2 |
HMAF | DEN-1 | +++ |
HMAF | DEN-2 | + |
HMAF | DEN-3 | - |
HMAF | DEN-4 | - |
HMAF | EEE | - |
HMAF | YFV | - |
HMAF | SLV | - |
Mab 3H5 | NT | - |
* 정제된 PLH2의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 20. PLH2에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PLH2로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-1에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 22 및 표 25). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-1에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 23 및 표 25). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-1에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 24). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 25).
표 22.PLH2에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-1에 대한 항체 역가
마우스 | 역가 항-DEN-1 (PLH2) | 역가 항-DEN-1 PBS C(-) |
1 | 1:128000 | <1:100 |
2 | >1:128000 | <1:100 |
3 | 1:64000 | <1:100 |
4 | >1:128000 | <1:100 |
5 | 1:128000 | <1:100 |
6 | 1:64000 | <1:100 |
7 | >1:128000 | <1:100 |
8 | 1:128000 | <1:100 |
9 | >1:128000 | <1:100 |
10 | >1:128000 | <1:100 |
표 23.PLH2로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 | HI*에 의한 역가 항-DEN-1 (PLH2) | HI*에 의한 역가 항-DEN-1 PBS C(-) |
1 | <1:5 | <1:5 |
2 | >1:640 | <1:5 |
3 | 1:320 | <1:5 |
4 | 1:320 | <1:5 |
5 | >1:640 | <1:5 |
6 | >1:640 | <1:5 |
7 | >1:640 | <1:5 |
8 | 1:320 | <1:5 |
9 | >1:640 | <1:5 |
10 | <1:5 | <1:5 |
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 24.PLH2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 | 중화 역가* 항-DEN-1 (PLH2) | 중화 역가* 항-DEN-1. C(-) |
1 | >1:1280 | <1:5 |
2 | >1:1280 | <1:5 |
3 | >1:1280 | <1:5 |
4 | >1:1280 | <1:5 |
5 | >1:1280 | <1:5 |
6 | >1:1280 | <1:5 |
7 | >1:1280 | <1:5 |
8 | >1:1280 | <1:5 |
9 | 1:640 | <1:5 |
10 | >1:1280 | <1:5 |
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 25.PLH2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* | ELISA (항-DEN-1) | ELISA (항-DEN-2) | ELISA (항-DEN-3) | ELISA (항-DEN-4) |
1 (PLH2) | 1:64000 | <1/100 | <1/100 | <1/100 |
2 (PLH2) | >1:128000 | <1/100 | <1/100 | <1/100 |
혈청의 혼합물* | HI** 항-DEN-1 | HI 항-DEN-2 | HI 항-DEN-3 | HI 항-DEN-4 |
PLH2 | >1/320 | >1/5 | <1/5 | <1/5 |
혈청의 혼합물* | 중화 역가*** 항-DEN-1 | 중화 역가 항-DEN-2 | 중화 역가 항-DEN-3 | 중화 역가 항-DEN-4 |
1 (PLH2) | >1:1280 | <1:5 | <1:5 | <1:5 |
2 (PLH2) | >1:1280 | <1:5 | <1:5 | <1:5 |
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 21. pLH3의 수득
DEN-1 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.32)을 DEN-1 바이러스 균주 (Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.Genetic relateness among structural protein genes of dengue 1 virus strains.J. Gen. Virol.1989. 70:1701-1712)으로부터의 SEQ ID No.9 및 SEQ ID No.10으로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 정지 코돈이 없는 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.29)을 함유하는 벡터는 pD4 플라스미드를Bam HI/Bam HI로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질에 대한 C-말단 영역 다음에 융합시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pLH3 (도 6 및 SEQ ID No.37)으로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-1 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-1에 의해 인식되었으며, 이를 PLH3 (SEQ ID No.38)으로 명명하였다.
실시예 22. PLH3 단백질의 정제
pLH3으로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로 수득하였다. 불용성 분획으로부터, 단백질을 우레아 6M을 사용하여 추출하고, PLH3 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 30mM로 세척하고, 단백질을 이미다졸 250mM로 용리하였다. 최종적으로, 단백질의 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 23. PLH3의 항원성 특징화
PLH3의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 26).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-1로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 1의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-1에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 26. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PLH3 단백질의 반응성.
Abs** | 특이성*** | PLH3 |
HMAF | DEN-1 | +++ |
HMAF | DEN-2 | + |
HMAF | DEN-3 | - |
HMAF | DEN-4 | - |
HMAF | EEE | - |
HMAF | YFV | - |
HMAF | SLV | - |
Mab 3H5 | NT | - |
* 정제된 PLH3의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 24. PLH3에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 20ug의 정제된 PLH2로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-1에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 27 및 표 30). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-1에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 28 및 표 30). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-1에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 29). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 30).
표 27.PLH3에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-1에 대한 항체 역가
마우스 | 역가 항-DEN-1 PLH3 | 역가 항-DEN-1 PBS 대조군(-) |
1 | 1:64000 | <1:100 |
2 | >1:128000 | <1:100 |
3 | 1:64000 | <1:100 |
4 | >1:128000 | <1:100 |
5 | 1:128000 | <1:100 |
6 | 1:128000 | <1:100 |
7 | 1:128000 | <1:100 |
8 | >1:128000 | <1:100 |
9 | 1:64000 | <1:100 |
10 | >1:128000 | <1:100 |
표 28.PLH3으로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 | HI*에 의한 역가 항-DEN-1 PLH3 | HI*에 의한 역가 항-DEN-1 PBS C(-) |
1 | 1:320 | <1:5 |
2 | >1:640 | <1:5 |
3 | >1:640 | <1:5 |
4 | 1:320 | <1:5 |
5 | 1:320 | <1:5 |
6 | >1:640 | <1:5 |
7 | 1:320 | <1:5 |
8 | <1:5 | <1:5 |
9 | >1:640 | <1:5 |
10 | >1:640 | <1:5 |
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 29.PLH3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 | 중화 역가* 항-DEN-1 (PLH2) | 중화 역가* 항-DEN-1 PBS C(-) |
1 | >1:1280 | <1:5 |
2 | >1:1280 | <1:5 |
3 | >1:1280 | <1:5 |
4 | 1:640 | <1:5 |
5 | 1:640 | <1:5 |
6 | >1:1280 | <1:5 |
7 | >1:1280 | <1:5 |
8 | >1:1280 | <1:5 |
9 | >1:1280 | <1:5 |
10 | >1:1280 | <1:5 |
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 30.PLH3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* | ELISA (항-DEN-1) | ELISA (항-DEN-2) | ELISA (항-DEN-3) | ELISA (항-DEN-4) |
1 (PLH3) | 1:128000 | <1/100 | <1/100 | <1/100 |
2 (PLH3) | >1:128000 | <1/100 | <1/100 | <1/100 |
혈청의 혼합물* | HI** 항-DEN-1 | HI 항-DEN-2 | HI 항-DEN-3 | HI 항-DEN-4 |
PLH3 | >1/320 | <1/5 | <1/5 | <1/5 |
혈청의 혼합물* | 중화 역가*** 항-DEN-1 | 중화 역가 항-DEN-2 | 중화 역가 항-DEN-3 | 중화 역가 항-DEN-4 |
1 (PLH3) | >1:1280 | <1:5 | <1:5 | <1:5 |
2 (PLH3) | >1:1280 | <1:5 | <1:5 | <1:5 |
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 25. pAZ1의 수득
DEN-3 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.39)을 DEN-3 바이러스 균주 유전자형 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology.1990. 176(2):643-647)로부터의 SEQ ID No.11 및 SEQ ID No.12로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH의 N-말단 영역 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.23)을 함유하는 벡터는 pM108 His 플라스미드를Xba I/Bam HI로 분해함으로써 제조하였다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pAZ1 (도 7 및 SEQ ID No.40)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 루리아 버타니 (LB) 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 25kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 10%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질로부터의 N-말단 영역과 DEN-3 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF에 함유된 폴리클로날 항체 (PA) 항-DEN-3에 의해 인식되었다. 상기 단백질을 PAZ1 (SEQ ID No.41)로 명명하였다.
실시예 26. PAZ1 단백질의 정제
pAZ1로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 주로 세포 파괴물의 펠레트에 결합된 불용성 형태로서 수득하였다. 펠레트로부터, 단백질을 우레아 7M을 사용하여 추출하고, PLH1 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 단백질을 이미다졸 60mM로 용리하고, 수득된 부피를 G-25 컬럼상에 로딩하여 최종적으로 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 27. PAZ1의 항원성 특징화
PAZ1의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 31).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-3으로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 3의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-3에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 31. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PAZ1 단백질의 반응성.
Abs** | 특이성*** | PLH3 |
HMAF | DEN-1 | - |
HMAF | DEN-2 | + |
HMAF | DEN-3 | ++ |
HMAF | DEN-4 | + |
HMAF | EEE | - |
HMAF | YFV | - |
HMAF | SLV | - |
Mab 3H5 | NT | - |
* 정제된 PAZ1의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 28. PAZ1에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PAZ1로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-1에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 32 및 표 35). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-3에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 33 및 표 35). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-3에 대해 1:320의 중화 역가가 수득되었다. 그러나, 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 34 및 표 35). 이러한 결과는 PAZ1에 의해 유도된 항체의 높은 혈청형-특이성을 나타낸다.
표 32.PAZ1에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-3에 대한 항체 역가
마우스 | 역가 항-DEN-3 PAZ1 | 역가 항-DEN-3 PBS 대조군(-) |
1 | 1/64000 | <1:100 |
2 | 1/128000 | <1:100 |
3 | 1/32000 | <1:100 |
4 | 1/64000 | <1:100 |
5 | 1/64000 | <1:100 |
6 | 1/128000 | <1:100 |
7 | 1/64000 | <1:100 |
8 | 1/64000 | <1:100 |
9 | 1/128000 | <1:100 |
10 | 1/128000 | <1:100 |
표 33.PAZ1로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 | HI*에 의한 역가 항-DEN-3 PAZ1 | HI에 의한 역가 항-DEN-3 PBS C(-) |
1 | >1:640 | <1:5 |
2 | 1:320 | <1:5 |
3 | 1:320 | <1:5 |
4 | 1:640 | <1:5 |
5 | <1/5 | <1:5 |
6 | 1:320 | <1:5 |
7 | <1/5 | <1:5 |
8 | 1:320 | <1:5 |
9 | >1:640 | <1:5 |
10 | >1:640 | <1:5 |
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 34.PAZ1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 | 중화 역가 항-DEN-3 PAZ1 | 중화 역가 항-DEN-3 PBS C(-) |
1 | 1:160 | <1:5 |
2 | 1:320 | <1:5 |
3 | 1:320 | <1:5 |
4 | 1:320 | <1:5 |
5 | 1:40 | <1:5 |
6 | 1:40 | <1:5 |
7 | 1:320 | <1:5 |
8 | 1:320 | <1:5 |
9 | 1:160 | <1:5 |
10 | 1:320 | <1:5 |
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 35.PAZ1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* | ELISA (항-DEN-1) | ELISA (항-DEN-2) | ELISA (항-DEN-3) | ELISA (항-DEN-4) |
1 (PAZ1) | <1/100 | <1/100 | 1:64000 | <1/100 |
2 (PAZ1) | <1/100 | <1/100 | >1:128000 | <1/100 |
혈청의 혼합물* | HI** 항-DEN-1 | HI 항-DEN-2 | HI 항-DEN-3 | HI 항-DEN-4 |
PAZ1 | <1/5 | <1/5 | >1:320 | <1/5 |
혈청의 혼합물* | 중화 역가*** 항-DEN-1 | 중화 역가 항-DEN-2 | 중화 역가 항-DEN-3 | 중화 역가 항-DEN-4 |
1 (PAZ1) | <1:5 | <1:5 | 1:320 | <1:5 |
2 (PAZ1) | <1:5 | <1:5 | 1:320 | <1:5 |
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 29. pAZ2의 수득
DEN-3 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.39)을 DEN-3 바이러스 균주 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology.1990. 176(2):643-647)로부터의 SEQ ID No.11 및 SEQ ID No.13으로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.26)을 함유하는 벡터는 pM84 His 플라스미드를Xba I/Eco RI로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질의 구성 도메인에 대한 코딩 영역내에 삽입시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 MM294를 pAZ2 (도 8 및 SEQ ID No.42)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-3 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-3에 의해 인식되었고, 이를 PAZ2 (SEQ ID No.43)로 명명하였다.
실시예 30. PAZ2 단백질의 정제
pAZ2로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로 수득하였다. 불용성 분획에 결합된 단백질을 우레아 7M을 사용하여 추출하고, PAZ2 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 40mM로 세척하고, 단백질을 이미다졸 100mM로 용리하였다. 최종적으로, 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 31. PAZ2의 항원성 특징화
PAZ2의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 36).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-3으로 수득되었다 (PAZ1로 수득된 인식 보다 높다). 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 3의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-3에 대한 5가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 36. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PAZ2 단백질의 반응성.
Abs** | 특이성*** | PAZ2 |
HMAF | DEN-1 | - |
HMAF | DEN-2 | - |
HMAF | DEN-3 | +++ |
HMAF | DEN-4 | + |
HMAF | EEE | - |
HMAF | YFV | - |
HMAF | SLV | - |
Mab 3H5 | NT | - |
* 정제된 PAZ2의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 32. PAZ2에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 20ug의 정제된 PAZ2로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-3에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 37 및 표 40). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-3에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 38 및 표 40). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-3에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 39). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 40).
표 37.PAZ2에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-3에 대한 항체 역가
마우스 | 역가 항-DEN-3 PAZ2 | 역가 항-DEN-3 PBS 대조군(-) |
1 | >1:128000 | <1:100 |
2 | 1:128000 | <1:100 |
3 | >1:128000 | <1:100 |
4 | >1:128000 | <1:100 |
5 | 1:128000 | <1:100 |
6 | >1:128000 | <1:100 |
7 | 1:64000 | <1:100 |
8 | >1:128000 | <1:100 |
9 | 1:64000 | <1:100 |
10 | >1:128000 | <1:100 |
표 38.PAZ2로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 | HI*에 의한 역가 항-DEN-3 PAZ2 | HI에 의한 역가 항-DEN-3 PBS C(-) |
1 | >1:640 | <1:5 |
2 | 1:320 | <1:5 |
3 | >1:640 | <1:5 |
4 | >1:640 | <1:5 |
5 | >1:640 | <1:5 |
6 | 1:320 | <1:5 |
7 | <1:5 | <1:5 |
8 | 1:320 | <1:5 |
9 | >1:640 | <1:5 |
10 | >1:640 | <1:5 |
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 39.PAZ2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 | 중화 역가 항-DEN-3 PAZ2 | 중화 역가 항-DEN-3 PBS C(-) |
1 | >1:1280 | <1:5 |
2 | >1:1280 | <1:5 |
3 | >1:1280 | <1:5 |
4 | >1:1280 | <1:5 |
5 | >1:1280 | <1:5 |
6 | 1:640 | <1:5 |
7 | >1:1280 | <1:5 |
8 | 1:640 | <1:5 |
9 | >1:1280 | <1:5 |
10 | 1:640 | <1:5 |
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 40.PAZ2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* | ELISA (항-DEN-1) | ELISA (항-DEN-2) | ELISA (항-DEN-3) | ELISA (항-DEN-4) |
1 (PAZ2) | <1/100 | <1/100 | >1:128000 | <1/100 |
2 (PAZ2) | <1/100 | <1/100 | >1:128000 | <1/100 |
혈청의 혼합물* | HI** 항-DEN-1 | HI 항-DEN-2 | HI 항-DEN-3 | HI 항-DEN-4 |
PAZ2 | <1/5 | <1/5 | >1/320 | <1/5 |
혈청의 혼합물* | 중화 역가*** 항-DEN-1 | 중화 역가 항-DEN-2 | 중화 역가 항-DEN-3 | 중화 역가 항-DEN-4 |
1 (PAZ2) | <1:5 | <1:5 | >1:1280 | <1:5 |
2 (PAZ2) | <1:5 | <1:5 | >1:1280 | <1:5 |
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 33. pAZ3의 수득
DEN-3 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.39)을 DEN-3 바이러스 균주 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology.1990. 176(2):643-647)로부터의 SEQ ID No.14 및 SEQ ID No.15로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 정지 코돈이 없는 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.29)을 함유하는 벡터는 pD4 플라스미드를Bam HI/Bam HI로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질의 C-말단 영역 다음에 융합시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pAZ3 (도 9 및 SEQ ID No.44)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-3 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-3에 의해 인식되었으며, 이를 PAZ3 (SEQ ID No.45)로 명명하였다.
실시예 34. PAZ3 단백질의 정제
pAZ3으로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로 수득하였다. 불용성 분획으로부터, 단백질을 우레아 7M을 사용하여 추출하고, PAZ3 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 45mM로 세척하고, 단백질을 이미다졸 230mM로 용리하였다. 최종적으로, 단백질의 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 35. PAZ3의 항원성 특징화
PAZ3의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 26).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-3으로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 3의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-3에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 41. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PAZ3 단백질의 반응성.
Abs** | 특이성*** | PAZ3 |
HMAF | DEN-1 | - |
HMAF | DEN-2 | - |
HMAF | DEN-3 | +++ |
HMAF | DEN-4 | + |
HMAF | EEE | - |
HMAF | YFV | - |
HMAF | SLV | - |
Mab 3H5 | NT | - |
* 정제된 PAZ3의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 36. PAZ3에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 20ug의 정제된 PAZ3으로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-3에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 42 및 표 45). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-3에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 43 및 표 45). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-3에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 44). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 45).
표 42.PAZ3에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-3에 대한 항체 역가
마우스 | 역가 항-DEN-3 PAZ3 | 역가 항-DEN-3 PBS 대조군(-) |
1 | >1:128000 | <1:100 |
2 | 1:128000 | <1:100 |
3 | >1:128000 | <1:100 |
4 | 1:128000 | <1:100 |
5 | 1:128000 | <1:100 |
6 | >1:128000 | <1:100 |
7 | >1:128000 | <1:100 |
8 | 1:128000 | <1:100 |
9 | 1:128000 | <1:100 |
10 | >1:128000 | <1:100 |
표 43.PAZ3으로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 | HI*에 의한 역가 항-DEN-3 PAZ3 | HI에 의한 역가 항-DEN-3 PBS C(-) |
1 | >1:640 | <1:5 |
2 | >1:640 | <1:5 |
3 | 1:320 | <1:5 |
4 | <1:5 | <1:5 |
5 | >1:640 | <1:5 |
6 | <1:5 | <1:5 |
7 | 1:320 | <1:5 |
8 | >1:640 | <1:5 |
9 | >1:640 | <1:5 |
10 | 1:320 | <1:5 |
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 44.PAZ3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 | 중화 역가 항-DEN-3 PAZ3 | 중화 역가 항-DEN-3 PBS C(-) |
1 | >1:1280 | <1:5 |
2 | 1:640 | <1:5 |
3 | >1:1280 | <1:5 |
4 | >1:1280 | <1:5 |
5 | >1:1280 | <1:5 |
6 | >1:1280 | <1:5 |
7 | >1:1280 | <1:5 |
8 | >1:1280 | <1:5 |
9 | >1:1280 | <1:5 |
10 | >1:1280 | <1:5 |
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 45.PAZ3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* | ELISA (항-DEN-1) | ELISA (항-DEN-2) | ELISA (항-DEN-3) | ELISA (항-DEN-4) |
1 (PAZ3) | <1/100 | <1/100 | >1:128000 | <1/100 |
2 (PAZ3) | <1/100 | <1/100 | 1:128000 | <1/100 |
혈청의 혼합물* | HI** 항-DEN-1 | HI 항-DEN-2 | HI 항-DEN-3 | HI 항-DEN-4 |
PAZ3 | <1/5 | <1/5 | >1/320 | <1/5 |
혈청의 혼합물* | 중화 역가*** 항-DEN-1 | 중화 역가 항-DEN-2 | 중화 역가 항-DEN-3 | 중화 역가 항-DEN-4 |
1 (PAZ3) | <1:5 | <1:5 | >1:1280 | <1:5 |
2 (PAZ3) | <1:5 | <1:5 | >1:1280 | <1:5 |
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 37. pID1의 수득
DEN-4 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.46)을 DEN-4 바이러스 균주 유전자형 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Anaylsis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155:77-88)로부터의 SEQ ID No.17 및 SEQ ID No.18로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질의 N-말단 영역 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.23)을 함유하는 벡터는 pM108 His 플라스미드를Xba I/Bam HI로 분해함으로써 제조하였다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pID1 (도 10 및 SEQ ID No.47)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 루리아 버타니 (LB) 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 25kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 10%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질로부터의 N-말단 영역과 DEN-4 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF에 함유된 폴리클로날 항체 (PA) 항-DEN-4에 의해 인식되었다. 상기 단백질을 PID1 (SEQ ID No.48)로 명명하였다.
실시예 38. PID1 단백질의 정제
pID1로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 주로 세포 파괴물의 펠레트에 결합된 불용성 형태로서 수득하였다. 펠레트로부터, 단백질을 우레아 6M로 추출하고, PID1 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 단백질을 이미다졸 60mM로 용리하고, 수득된 부피를 G-25 컬럼상에 로딩하여 최종적으로 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 39. PID1의 항원성 특징화
PID1의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 46).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-4로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 4의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-4에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 46. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PID1 단백질의 반응성.
Abs** | 특이성*** | PID1 |
HMAF | DEN-1 | - |
HMAF | DEN-2 | - |
HMAF | DEN-3 | + |
HMAF | DEN-4 | ++ |
HMAF | EEE | - |
HMAF | YFV | - |
HMAF | SLV | - |
Mab 3H5 | NT | - |
* 정제된 PID1의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 40. PID1에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PID1로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-1에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 47 및 표 50). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-4에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 48 및 표 50). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-4에 대해 1:320의 중화 역가가 수득되었다. 그러나, 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 49 및 표 50). 이러한 결과는 PID1에 의해 유도된 항체의 높은 혈청형-특이성을 나타낸다.
표 47.PID1에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-4에 대한 항체 역가
마우스 | 역가 항-DEN-4 PID1 | 역가 항-DEN-4 PBS 대조군(-) |
1 | 1/128000 | <1:100 |
2 | 1/128000 | <1:100 |
3 | 1/64000 | <1:100 |
4 | 1/64000 | <1:100 |
5 | 1/128000 | <1:100 |
6 | 1/32000 | <1:100 |
7 | 1/128000 | <1:100 |
8 | 1/32000 | <1:100 |
9 | 1/128000 | <1:100 |
10 | 1/128000 | <1:100 |
표 48.PID1로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 | HI*에 의한 역가 항-DEN-4 PID1 | HI에 의한 역가 항-DEN-4 PBS C(-) |
1 | 1:320 | <1:5 |
2 | 1:320 | <1:5 |
3 | 1:640 | <1:5 |
4 | 1:40 | <1:5 |
5 | <1/5 | <1:5 |
6 | 1:320 | <1:5 |
7 | 1:640 | <1:5 |
8 | 1:640 | <1:5 |
9 | 1:40 | <1:5 |
10 | 1:320 | <1:5 |
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 49.PID1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 | 중화 역가 항-DEN-4 PID1 | 중화 역가 항-DEN-4 PBS C(-) |
1 | 1:320 | <1:5 |
2 | 1:80 | <1:5 |
3 | 1:320 | <1:5 |
4 | 1:320 | <1:5 |
5 | 1:160 | <1:5 |
6 | 1:320 | <1:5 |
7 | 1:320 | <1:5 |
8 | 1:320 | <1:5 |
9 | 1:160 | <1:5 |
10 | 1:40 | <1:5 |
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 50.PID1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* | ELISA (항-DEN-1) | ELISA (항-DEN-2) | ELISA (항-DEN-3) | ELISA (항-DEN-4) |
1 (PID1) | <1/100 | <1/100 | <1/100 | 1:64000 |
2 (PID1) | <1/100 | <1/100 | <1/100 | >1:128000 |
혈청의 혼합물* | HI** 항-DEN-1 | HI 항-DEN-2 | HI 항-DEN-3 | HI 항-DEN-4 |
PID1 | <1/5 | <1/5 | <1/5 | >1:320 |
혈청의 혼합물* | 중화 역가*** 항-DEN-1 | 중화 역가 항-DEN-2 | 중화 역가 항-DEN-3 | 중화 역가 항-DEN-4 |
1 (PID1) | <1:5 | <1:5 | <1:5 | 1:160 |
2 (PID1) | <1:5 | <1:5 | <1:5 | 1:320 |
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 41. pID2의 수득
DEN-4 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.46)을 DEN-4 바이러스 균주 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Anaylsis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155:77-88)로부터의 SEQ IDNo.16 및 SEQ ID No.18로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.26)을 함유하는 벡터는 pM84 His 플라스미드를Xba I/Eco RI로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질의 구성 도메인에 대한 코딩 영역내에 삽입시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 MM294를 pID2 (도 11 및 SEQ ID No.49)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-4 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-4에 의해 인식되었고, 이를 PID2 (SEQ ID No.50)로 명명하였다.
실시예 42. PID2 단백질의 정제
pID2로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로 수득하였다. 불용성 분획에 결합된 단백질을 우레아 6M을 사용하여 추출하고, PID2 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 30mM로 용리하고, 단백질을 이미다졸 250mM로 용리하였다. 최종적으로, 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 43. PID2의 항원성 특징화
PID2의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 51).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-4로 수득되었다 (PID1로 수득된 인식 보다 높다). 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 4의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-3에 대한 5가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 51. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PID2 단백질의 반응성.
Abs** | 특이성*** | PID2 |
HMAF | DEN-1 | - |
HMAF | DEN-2 | - |
HMAF | DEN-3 | + |
HMAF | DEN-4 | +++ |
HMAF | EEE | - |
HMAF | YFV | - |
HMAF | SLV | - |
Mab 3H5 | NT | - |
* 정제된 PID2의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 44. PID2에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 20ug의 정제된 PID2로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-4에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 52 및 표 55). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-4에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 53 및 표 55). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-4에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 54). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 55).
표 52.PID2에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-4에 대한 항체 역가
마우스 | 역가 항-DEN-4 PID2 | 역가 항-DEN-4 PBS 대조군(-) |
1 | 1:64000 | <1:100 |
2 | >1:128000 | <1:100 |
3 | 1:128000 | <1:100 |
4 | >1:128000 | <1:100 |
5 | 1:64000 | <1:100 |
6 | >1:128000 | <1:100 |
7 | >1:128000 | <1:100 |
8 | >1:128000 | <1:100 |
9 | >1:128000 | <1:100 |
10 | 1:128000 | <1:100 |
표 53.PID2로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 | HI*에 의한 역가 항-DEN-4 (PID2) | HI에 의한 역가 항-DEN-4 PBS C(-) |
1 | 1:320 | <1:5 |
2 | 1:320 | <1:5 |
3 | 1:640 | <1:5 |
4 | 1:40 | <1:5 |
5 | <1/5 | <1:5 |
6 | 1:320 | <1:5 |
7 | 1:640 | <1:5 |
8 | 1:640 | <1:5 |
9 | 1:40 | <1:5 |
10 | 1:320 | <1:5 |
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 54.PID2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 | 중화 역가 항-DEN-4 PID2 | 중화 역가 항-DEN-4 PBS C(-) |
1 | >1:1280 | <1:5 |
2 | >1:1280 | <1:5 |
3 | >1:1280 | <1:5 |
4 | >1:1280 | <1:5 |
5 | 1:640 | <1:5 |
6 | >1:1280 | <1:5 |
7 | >1:1280 | <1:5 |
8 | >1:1280 | <1:5 |
9 | 1:640 | <1:5 |
10 | >1:1280 | <1:5 |
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 55.PID2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* | ELISA (항-DEN-1) | ELISA (항-DEN-2) | ELISA (항-DEN-3) | ELISA (항-DEN-4) |
1 (PID2) | <1/100 | <1/100 | <1/100 | >1:128000 |
2 (PID2) | <1/100 | <1/100 | <1/100 | 1:64000 |
혈청의 혼합물* | HI** 항-DEN-1 | HI 항-DEN-2 | HI 항-DEN-3 | HI 항-DEN-4 |
PID2 | <1/5 | <1/5 | <1/5 | >1/320 |
혈청의 혼합물* | 중화 역가*** 항-DEN-1 | 중화 역가 항-DEN-2 | 중화 역가 항-DEN-3 | 중화 역가 항-DEN-4 |
1 (PID2) | <1:5 | <1:5 | <1:5 | >1:1280 |
2 (PID2) | <1:5 | <1:5 | <1:5 | >1:1280 |
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 45. pID3의 수득
DEN-4 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.46)을 DEN-4 바이러스 균주 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Anaylsis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155:77-88)로부터의 SEQ ID No.19 및 SEQ ID No.20으로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 정지 코돈이 없는 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.29)을 함유하는 벡터는 pD4 플라스미드를Bam HI/Bam HI로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질에 대한 C-말단 영역 다음에 융합시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pID3 (도 12 및 SEQ ID No.51)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-4 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-4에 의해 인식되었고, 이를 PID3 (SEQ ID No.52)로 명명하였다.
실시예 46. PID3 단백질의 정제
pID3으로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로 수득하였다. 불용성 분획으로부터, 단백질을 우레아 6M을 사용하여 추출하고, PID3 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 45mM로 용리하고, 단백질을 이미다졸 200mM로 용리하였다. 최종적으로, 단백질의 순수한 분획을G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 47. PID3의 항원성 특징화
PID3의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 56).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-4로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 4의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-4에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 56. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PID3 단백질의 반응성.
Abs** | 특이성*** | PID3 |
HMAF | DEN-1 | - |
HMAF | DEN-2 | - |
HMAF | DEN-3 | + |
HMAF | DEN-4 | +++ |
HMAF | EEE | - |
HMAF | YFV | - |
HMAF | SLV | - |
Mab 3H5 | NT | - |
* 정제된 PID3의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 48. PID3에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 20ug의 정제된 PAZ3으로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-4에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 57 및 표 60). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-4에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 58 및 표 60). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-4에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 59). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 60).
표 57.PID3에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-4에 대한 항체 역가
마우스 | 역가 항-DEN-4 (PID3) | 역가 항-DEN-4 PBS 대조군(-) |
1 | >1:128000 | <1:100 |
2 | >1:128000 | <1:100 |
3 | >1:128000 | <1:100 |
4 | 1:64000 | <1:100 |
5 | 1:64000 | <1:100 |
6 | >1:128000 | <1:100 |
7 | 1:128000 | <1:100 |
8 | >1:128000 | <1:100 |
9 | 1:128000 | <1:100 |
10 | >1:128000 | <1:100 |
표 58.PID3으로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 | HI*에 의한 역가 항-DEN-4 PID3 | HI에 의한 역가 항-DEN-4 PBS C(-) |
1 | >1:640 | <1:5 |
2 | 1:320 | <1:5 |
3 | >1:640 | <1:5 |
4 | >1:640 | <1:5 |
5 | <1:5 | <1:5 |
6 | >1:640 | <1:5 |
7 | 1:320 | <1:5 |
8 | >1:640 | <1:5 |
9 | 1:320 | <1:5 |
10 | >1:640 | <1:5 |
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 59.PID3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 | 중화 역가* 항-DEN-4 PID3 | 중화 역가 항-DEN-4 PBS C(-) |
1 | >1:1280 | <1:5 |
2 | >1:1280 | <1:5 |
3 | >1:1280 | <1:5 |
4 | >1:1280 | <1:5 |
5 | >1:1280 | <1:5 |
6 | >1:1280 | <1:5 |
7 | >1:1280 | <1:5 |
8 | 1:640 | <1:5 |
9 | >1:1280 | <1:5 |
10 | >1:1280 | <1:5 |
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 60.PID3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* | ELISA (항-DEN-1) | ELISA (항-DEN-2) | ELISA (항-DEN-3) | ELISA (항-DEN-4) |
1 (PID3) | <1/100 | <1/100 | <1/100 | >1:128000 |
2 (PID3) | <1/100 | <1/100 | <1/100 | 1:128000 |
혈청의 혼합물* | HI** 항-DEN-1 | HI 항-DEN-2 | HI 항-DEN-3 | HI 항-DEN-4 |
PID3 | <1/5 | <1/5 | <1/5 | >1/320 |
혈청의 혼합물* | 중화 역가*** 항-DEN-1 | 중화 역가 항-DEN-2 | 중화 역가 항-DEN-3 | 중화 역가 항-DEN-4 |
1 (PID3) | <1:5 | <1:5 | <1:5 | >1:1280 |
2 (PID3) | <1:5 | <1:5 | <1:5 | >1/1280 |
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 49. pD4D2의 수득
DEN-4 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.46)을 DEN-4의 바이러스 균주 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Anaylsis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155:77-88)로부터의 SEQ ID No.16 및 SEQ ID No.21로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 유전자 + 유전자의 3' 영역에 있는 6개의 히스티딘 서열 및 3' 단부에 있는 DEN-2로부터의 E 단편의 서열을 함유하는 벡터는 pLL3 플라스미드의Xba /Xba I분해에 의해 제조하였다. 그 결과, 동일한 MDH 유전자에 융합된, 혈청형 2 및 4로부터의 E 단백질의 2개의 영역이 수득되었다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 MM294를 pD4D2 (도 13 및 SEQ ID No.53)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 110kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 뎅기 바이러스로부터의 DENe 단백질의 2개의 단편의 합에 해당하였다. 상기 단백질은 HMAF에 함유된 폴리클로날 항체 항-DEN-2 및 항-DEN-4에 의해 인식되었다. 이러한 단백질을 PD4D2 (SEQ ID No.54)로 명명하였다.
실시예 50. PD4D2 단백질의 정제
pD4D2로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 또는 불용성 형태로 수득하였다. 펠레트로부터, 단백질을 우레아 6M로 추출하고, PD4D2 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 세척 단계를 이미다졸 30mM로 수행하고, 단백질을 이미다졸 250mM로 용리하였다. 최종적으로, 순수한 제제를 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 완충액 중의 단백질을 수득하고, 이를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 51. PD4D2의 항원성 특징화
PD4D2의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 61).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-2 및 항-DEN-4로 수득되었다. 나머지 2가지 혈청형의 인식은 혈청형 2 및 4의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 다른 한편, Mab 3H5는 실제로 PLL2 및 PLL3에 대해 수득된 반응성과 유사한 반응성을 지녔다. 최종적으로, DEN-2 및 DEN-4에 대한 고역가 및 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 61. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PD4D2 단백질의 반응성.
Abs** | 특이성*** | PID3 |
HMAF | DEN-1 | - |
HMAF | DEN-2 | +++ |
HMAF | DEN-3 | - |
HMAF | DEN-4 | +++ |
HMAF | EEE | - |
HMAF | YFV | - |
HMAF | SLV | - |
Mab 3H5 | NT | - |
* 정제된 PD4D2의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형.
실시예 52. PD4D2에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 20ug의 정제된 PD4D2로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-2 및 DEN-4에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 62 및 표 65). 또한, 혈구응집 억제 검정 (HI)을 수행한 결과, DEN-2 및 DEN-4에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 63 및 표 65). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-2에 대해 >1:1280 및 DEN-4에 대해 >1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 64). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 65).
표 62.PD4D2에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-2 및 DEN-4에 대한 항체 역가
마우스 | ELISA에 의한 역가 (PD4D2) | ELISA에 의한 역가 PBS C(-) | ||
항-DEN-4 | 항-DEN-2 | 항-DEN-4 | 항-DEN-2 | |
1 | >1:128000 | >1:128000 | <1:100 | <1:100 |
2 | 1:128000 | 1:128000 | <1:100 | <1:100 |
3 | >1:128000 | >1:128000 | <1:100 | <1:100 |
4 | >1:128000 | >1:128000 | <1:100 | <1:100 |
5 | 1:64000 | >1:128000 | <1:100 | <1:100 |
6 | >1:128000 | 1:128000 | <1:100 | <1:100 |
7 | 1:64000 | >1:128000 | <1:100 | <1:100 |
8 | >1:128000 | >1:128000 | <1:100 | <1:100 |
9 | >1:128000 | 1:128000 | <1:100 | <1:100 |
10 | 1:128000 | >1:128000 | <1:100 | <1:100 |
표 63.PD4D2로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 | HI에 의한 역가 (PD4D2) | HI에 의한 역가 PBS C(-) | ||
항-DEN-4 | 항-DEN-2 | 항-DEN-4 | 항-DEN-2 | |
1 | >1:640 | >1:640 | <1:5 | <1:5 |
2 | >1:640 | >1:640 | <1:5 | <1:5 |
3 | >1:640 | 1:320 | <1:5 | <1:5 |
4 | >1:640 | >1:640 | <1:5 | <1:5 |
5 | 1:320 | 1:640 | <1:5 | <1:5 |
6 | >1:640 | >1:640 | <1:5 | <1:5 |
7 | >1:640 | >1:640 | <1:5 | <1:5 |
8 | 1:320 | 1:320 | <1:5 | <1:5 |
9 | 1:320 | 1:320 | <1:5 | <1:5 |
10 | >1:640 | >1:640 | <1:5 | <1:5 |
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 64.PD4D2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 | 중화 역가* (PD4D2) | 중화 역가 PBS C(-) | ||
항-DEN-4 | 항-DEN-2 | 항-DEN-4 | 항-DEN-2 | |
1 | >1:1280 | >1:1280 | <1:5 | <1:5 |
2 | >1:1280 | >1:1280 | <1:5 | <1:5 |
3 | 1:1280 | 1:1280 | <1:5 | <1:5 |
4 | >1:1280 | >1:1280 | <1:5 | <1:5 |
5 | 1:640 | 1:1280 | <1:5 | <1:5 |
6 | >1:1280 | >1:1280 | <1:5 | <1:5 |
7 | >1:1280 | >1:1280 | <1:5 | <1:5 |
8 | 1:640 | >1:1280 | <1:5 | <1:5 |
9 | >1:1280 | >1:1280 | <1:5 | <1:5 |
10 | >1:1280 | >1:1280 | <1:5 | <1:5 |
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 65.PD4D2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* | ELISA (항-DEN-1) | ELISA (항-DEN-2) | ELISA (항-DEN-3) | ELISA (항-DEN-4) |
1 (PD4D2) | <1/100 | >1:128000 | <1/100 | 1:64000 |
2 (PD4D2) | <1/100 | >1:128000 | <1/100 | >1:128000 |
혈청의 혼합물* | HI** 항-DEN-1 | HI 항-DEN-2 | HI 항-DEN-3 | HI 항-DEN-4 |
PD4D2 | <1:5 | >1:320 | <1:5 | >1:320 |
혈청의 혼합물* | 중화 역가*** 항-DEN-1 | 중화 역가 항-DEN-2 | 중화 역가 항-DEN-3 | 중화 역가 항-DEN-4 |
1 (PD4D2) | <1:5 | >1:1280 | <1:5 | >1:1280 |
2 (PD4D2) | <1:5 | >1:1280 | <1:5 | >1:1280 |
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 53. 방어 검정
동종 치사 DEN에 의한 공격시에 모든 검정된 변이체로 면역된 마우스에 부여되는 방어를 평가하기 위해, 각각의 군 당 15마리의 마우스를 사용하였다. 각각의 동물에 두개내 접종에 의해 100 LD50의 치사 DEN의 1회 용량을 투여하고, 21일 동안 관찰하여 치사율을 조사하였다. 포지티브 대조군으로서, 4가지 바이러스 제제 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4)로 면역시킨 15마리의 마우스의 그룹을 사용하였다. 이러한 대조군 중의 모든 마우스가 생존한 반면, 네거티브 대조 그룹의 마우스는 공격 후 7 내지 11일 사이에 병이 들었고, 이로써 100%의 치사율을 달성하였다. 최종적으로, 실험에서 융합 단백질로 면역된 그룹은 80% 내지 100%의 방어를 나타냈으며, 모든 경우에 대조 그룹과 비교하여 현저한 차이가 발견되었다 (표 66).
표 66.동종 치사 뎅기 바이러스에 의한 공격시에 검정된 단백질 변이체로 면역된 마우스의 생존율
면역원 | 생존율* |
PBS | 0 |
DEN-1 | 100 |
DEN-2 | 100 |
DEN-3 | 100 |
DEN-4 | 100 |
PLL1 | 86 |
PLL2 | 100 |
PLL3 | 100 |
PLH1 | 80 |
PLH2 | 100 |
PLH3 | 100 |
PAZ1 | 80 |
PAZ2 | 100 |
PAZ3 | 100 |
PID1 | 86 |
PID2 | 100 |
PID3 | 100 |
PD4D2 | 100 (DEN-4)100 (DEN-2) |
* (생존 마우스 수)/(전체 마우스 수)가 계산되었다. 생존 마우스의 데이터는 공격 후 21일째에 수집하였다. PD4D2로 면역된 마우스의 경우, 15마리는 DEN-4로 공격하고, 15마리는 DEN-2로 공격하였다.
실시예 54. 림프구증식 반응
DEN-2로부터의 E 단편을 함유하는 키메라 단백질 (PLL1, PLL2 및 PLL3)로 면역시킨 다양한 그룹 및 플라세보 그룹의 동물들을 최종 투여 후 15일째에 치사시켰다. 그 후, 동물들의 비장을 수거하여 뎅기 바이러스의 4가지 혈청형에 대한 림프구증식 반응을 조사하였다. 표 67은 수득된 자극 지수의 결과를 나타내는데, 이는 혈청형 특이적 반응이 달성되었음을 입증해준다.
표 67. PLL1, PLL2 및 PLL3으로 면역시킨 마우스로부터의 림프구의 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 자극 지수.
PLL1 | PLL2 | PLL3 | C(-) | |
DEN-1 | 1.3* | 1.0 | 0.8 | 1.2 |
DEN-2 | 12.5 | 10.3 | 8.9 | 1.4 |
DEN-3 | 1.0 | 1.6 | 1.8 | 1.4 |
DEN-4 | 1.7 | 1.5 | 1.7 | 1.1 |
대조 항원 | 1.1 | 1.0 | 1.3 | 0.9 |
PHA** | 13.3 | 16.5 | 11.1 | 12.0 |
* 자극 지수: DNA의 자발적 합성에 대한 샘플의 분 당 카운트 대 대조군의 분 당 카운트의 비
** 마이토젠: 피토헤마글루티닌
Claims (35)
- 플라비바이러스로부터의 E 단백질의 단편에 상응하는 서열과, 서열목록에서 SEQ ID No.26, SEQ ID No.29로 확인되는 돌연변이 MDH 단백질에 대한 코딩 유전자에 상응하는 서열 또는 SEQ ID No.23으로 확인되는 이들 서열의 단편의 특정 조합을 특징으로 하며, 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 플라비바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있는 키메라 단백질을 코딩하는 키메라 누클레오티드 사슬.
- 제1항에 있어서, 뎅기 바이러스로부터의 E 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 하나 이상의 서열과 MDH 단백질의 누클레오티드 서열의 특정 조합으로서, 상기 하나 이상의 서열이 서열목록에서 SEQ ID No.26, SEQ ID No.29 또는 SEQ ID No.23으로 확인되는 서열에 삽입되고/되거나 융합되어 있으며, 뎅기 바이러스의 각각의 혈청형에 대해 혈청형 특이적 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있는 키메라 단백질을 코딩함을 특징으로 하는 키메라 누클레오티드 사슬.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, SEQ ID No.23으로 확인되는 MDH 단백질의 최초 45개 아미노산을 코딩하는 3' 단부 영역에 융합된, 뎅기 바이러스의 각각의 혈청형 1, 2, 3 및 4로부터의 E 단백질의 아미노산 286번 내지 426번에 대한 코딩 서열에의해 형성됨을 특징으로 하는 키메라 누클레오티드 사슬.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, SEQ ID No.26으로 확인되는 MDH 단백질의 45개 아미노산을 코딩하는 3' 단부 영역에 융합된, 뎅기 바이러스의 각각의 혈청형 1, 2, 3 및 4로부터의 E 단백질의 아미노산 286번 내지 426번에 대한 코딩 서열에 의해 형성됨을 특징으로 하는 키메라 누클레오티드 사슬.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, SEQ ID No.29로 확인되는 MDH 단백질을 코딩하는 3' 단부 영역에 융합된, 뎅기 바이러스의 각각의 혈청형 1, 2, 3 및 4로부터의 E 단백질의 아미노산 286번 내지 426번에 대한 코딩 서열에 의해 형성됨을 특징으로 하는 키메라 누클레오티드 사슬.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 뎅기 바이러스의 두 가지 상이한 혈청형으로부터의 E 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열과 MDH 의 서열의 조합으로서, E 단백질에 상응하는 서열 중 하나가 MDH 단백질의 45개 아미노산을 코딩하는 영역에 삽입되어 있고 나머지 하나가 SEQ ID No.29로 확인되는 동일한 MDH 서열의 3' 영역에 융합되어 있음을 특징으로 하는 키메라 누클레오티드 사슬.
- 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 누클레오티드사슬의 발현 생성물이며, 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기 바이러스의 각각의 혈청형에 대해 혈청형 특이적인 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 재조합 키메라 단백질.
- 제1항 또는 제6항의 누클레오티드 사슬의 발현 생성물이며, 수용자에게서 뎅기 바이러스의 두 가지 동종의 혈청형에 대해 특이적인 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 재조합 키메라 단백질.
- 제1항, 제2항 및 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열목록에서 SEQ ID No.22 및 SEQ ID No.23으로 확인되는 서열의 조합이며, 키메라 단백질 PLL1을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.24로 확인되는 키메라 누클레오티드 서열.
- 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.25로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.24의 발현 생성물이며, 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-2 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 따른 키메라 단백질 PLL1.
- 서열목록에서 SEQ ID No.22 및 SEQ ID No.26으로 확인되는 서열의 조합이며, 키메라 단백질 PLL2를 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.27로 확인되는 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
- 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.28로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.27의 발현 생성물이며, 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-2 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 따른 키메라 단백질 PLL2.
- 서열목록에서 SEQ ID No.22 및 SEQ ID No.29로 확인되는 서열의 조합이며, 키메라 단백질 PLL3를 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.30으로 확인되는 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
- 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.31로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.30의 발현 생성물이며, 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-2 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 따른 키메라 단백질 PLL3.
- 서열목록에서 SEQ ID No.23 및 SEQ ID No.32로 확인되는 서열의 조합이며, 키메라 단백질 PLH1을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.33으로 확인되는 제1항, 제2항 및 제3항 중 어느 한 항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
- 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.34로 확인되는 아미노산 서열을 지니고,SEQ ID No.33의 발현 생성물이며, 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-1 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 따른 키메라 단백질 PLH1.
- 서열목록에서 SEQ ID No.26 및 SEQ ID No.32로 확인되는 서열의 조합이며, 키메라 단백질 PLH2를 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.35로 확인되는 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
- 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.36으로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.35의 발현 생성물이며, 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-1 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 따른 키메라 단백질 PLH2.
- 서열목록에서 SEQ ID No.29 및 SEQ ID No.32로 확인되는 서열의 조합이며, 키메라 단백질 PLH3을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.37로 확인되는 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
- 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.38로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.37의 발현 생성물이며, 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서뎅기-1 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 따른 키메라 단백질 PLH3.
- 서열목록에서 SEQ ID No.23 및 SEQ ID No.39로 확인되는 서열의 조합이며, 키메라 단백질 PAZ1을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.40으로 확인되는 제1항, 제2항 및 제3항 중 어느 한 항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
- 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.41로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.40의 발현 생성물이며, 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-3 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 따른 키메라 단백질 PAZ1.
- 서열목록에서 SEQ ID No.26 및 SEQ ID No.39로 확인되는 서열의 조합이며, 키메라 단백질 PAZ2를 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.42로 확인되는 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
- 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.43으로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.42의 발현 생성물이며, 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-3 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 따른 키메라 단백질PAZ2.
- 서열목록에서 SEQ ID No.26 및 SEQ ID No.39로 확인되는 서열의 조합이며, 키메라 단백질 PAZ3을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.44로 확인되는 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
- 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.45로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.44의 발현 생성물이며, 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-3 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 따른 키메라 단백질 PAZ3.
- 서열목록에서 SEQ ID No.23 및 SEQ ID No.46으로 확인되는 서열의 조합이며, 키메라 단백질 PID1을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.47로 확인되는 제1항, 제2항 및 제3항 중 어느 한 항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
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- 제1항, 제2항, 제7항, 제8항, 제10항, 제12항, 제14항, 제16항, 제18항,제20항, 제22항, 제24항, 제26항, 제28항, 제30항 및 제32항에 기재된 둘 이상의 키메라 단백질 및 약제학적 비히클을 지님을 특징으로 하는, 제1항에 따라 뎅기 바이러스에 대해 특이적인 방어 면역반응을 유도할 수 있는 약제학적 제제.
- 제33항에 있어서, 경구, 근내, 피하, 점막 또는 정맥내 투여용의 뎅기 바이러스에 대한 예방제 또는 치료제임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
- 제1항, 제2항, 제7항, 제8항, 제10항, 제12항, 제14항, 제16항, 제18항, 제20항, 제22항, 제24항, 제26항, 제28항, 제30항 및 제32항에 기재된 하나 이상의 단백질을 지님을 특징으로 하는 진단 수단.
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