ES2278041T3 - Cadenas quimericas codificantes para proteinas inductoras de efectos contra virus. - Google Patents
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Abstract
Obtención de cadenas quiméricas codificantes para proteínas que inducen en el receptor efectos contra virus, las cuales estimulan la producción de una respuesta humoral serotipo especifica y protección frente a la infección por los virus del Dengue, evitándose los efectos de amplificación viral serotipo inespecíficos causantes de las hemorragias y complicaciones clínicas descritas en este tipo de patología. Estas cadenas de ácidos nucleicos están compuestas por la combinación especifica de fragmentos pertenecientes al gen de una proteína mutante con actividad deshidrogenasa de N.meningitidis y fragmentos que codifican para una región de la proteína E de la envoltura de los virus del Dengue, las cuales al insertarse en un vector de expresión, dan como resultado las proteínas quiméricas con características especificas. Las moléculas quiméricas resultantes de esta invención son aplicables a la industria farmacéutica en la obtención de preparados vacunales y diagnósticos de alta especificidad serotípica para uso en humanos.
Description
Cadenas quiméricas codificantes para proteínas
inductoras de efectos contra virus.
La presente invención se relaciona con el campo
de la biotecnología y la industria farmacéutica, en particular con
la obtención de cadenas de nucleótidos quiméricas que, cuando son
introducidas en un vector de expresión, provocan el aumento de
proteínas capaces de provocar una respuesta inmune humoral
específica para el serotipo, y protección contra la infección por
el virus Dengue; citado a partir de ahora como DEN, al evitar los
efectos de la inmuno-amplificación viral, produce
hemorragias y complicaciones clínicas descritas en este tipo de
patolo-
gía.
gía.
El virus Dengue (DEN) es un virus recubierto
cuya membrana lipídica contiene dos de sus tres proteínas
estructurales: la proteína de envoltura (E) y la proteína de
membrana (M). La proteína E cubre una núcleo cápside icosaédrica
compuesta por la tercera proteína estructural, la proteína del
núcleo. Este virus pertenece a la familia Flaviviridae y
existen cuatro serotipos diferentes. Su transmisión al hombre se
realiza por el mosquito Aedes aegypti, que pertenece a la
familia Stegomia. La enfermedad producida por este virus en
humanos se consideró benigna, y fue descrita como Fiebre Dengue
(DF), o Dengue clásico, hasta la aparición de una modalidad más
seria y a veces letal, caracterizada por fiebre hemorrágica y
choque, denominada: Fiebre Hemorrágica del Dengue y Síndrome de
Choque del Dengue (FHD/SCD) (Hammon WMc. New hemorragic fever in
children in the Philippines and Thailand. Trans Assoc Physicians
1960; 73: 140-155). Se han realizado varios estudios
epidemiológicos evidenciando como un factor de riesgo, la infección
secuencial de dos serotipos virales diferentes (Kourí GP, Guzmán MG,
Brave JR. Why dengue hemorragia fever un Cuba) 2. (An integral
analysis. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1987; 72:
821-823). Este fenómeno se explica por la
intensificación de la respuesta inmune, que está basada en un
aumento de la infección viral mediante el incremento de la entrada
del complejo virus-anticuerpo en la célula a través
de los receptores Fc de la célula diana (monocitos) (Halstead SB.
Pathogenesis of dengue: challenges to molecular biology. Science
1988; 239:
476-481).
476-481).
Se han desarrollado distintas tecnologías para
producir vacunas vivas atenuadas, pero actualmente existen
bastantes cuestiones sin resolver, en relación con los posibles
beneficios de esas vacunas, puesto que podrían revertir hacia la
virulencia, la interferencia viral y la recombinación
inter-genómica. Alternativamente, se pueden obtener
antígenos recombinantes como posibles componentes de una subunidad
de vacuna (Feighny, R., Borrous, J. and Putnak, R. Dengue
type-2 virus envelope protein made using recombinant
baculovirus protects mice against virus challenge. Am. J. Trop.
Med. Hyg. 1994. 50(3). 322-328; Deubel, V.,
Starapoli, I., Megret, F., et al.
Affinity-purified dengue-2 virus
envelope glycoprotein induces neutralizing antibodies and
protective immunity in mice. Vaccines. 1997. 15,
1946-1954).
El principal antígeno de los virus es la
proteína de envoltura DENe. Esta proteína es el mayor componente de
la superficie del virus, y se cree que media en el enlace del virus
con el receptor celular (A Heinz, DX, Berge, R, Tuma W et
al. A topological and functional model of epitopes on the
structural glycoprotein of tick-borne encephalitis
virus defined by monoclonal antibodies. Virology. 1983; 126: 525).
Esta proteína tiene homología estructural con la del virus de la
encefalitis transmitida por garrapatas (TBE) (Rey, F.A., Heinz,
F.X., Mandl, C., et al. The envelope glycoprotein from tick
borne encephalitis virus at 2 \ring{A} resolution. Nature 1995;
375: 291-298), y también está conservada
naturalmente entre los serotipos.
Las células de insecto constituyen uno de los
sistemas más utilizados para la expresión de diversos genes
heterólogos, que emplea el sistema de baculovirus como vectores.
Estos vectores han sido usados para la expresión de varias
combinaciones de proteínas estructurales y no estructurales del
virus de la encefalitis japonesa (JEV), del DEN-1,
DEN-2 y DEN-4 (Matsuura Y, Miyamoto
M, Soto T, et al. Characterization of japanses encephalitis
virus envelope protein expressed by recombinant baculoviruses.
Virology 1989; 173: 677-682; Deubel V, Bordier M,
Megret F et al. Processing, secretion and immunoreactivity of
carboxy terminally truncated dengue-2 envelope
proteins expressed in insect cell by recombinant baculoviruses.
Virology 1991; 180: 440-447: Putnak R, Feighny R,
Burrous J et al. Dengue 1 virus envelope glycoprotein gene
expressed in recombinant baculovirus elicit virus neutralization
antibodies in mice and protects them from virus challenge. Am J Trop
Med Hyg 1991; 45: 159-167; Feighny R; Burrous J,
Putnak R. Dengue type 2 virus envelope protein made using
recombinant baculovirus protects mice against virus challenge. Am J
Trop Med Hyg 1994; 50: 322-328). Otro sistema
utilizado han sido las células de Drosophila melanogaster
expresando diferentes variantes de la proteína E (documento
PCT/US96/07627). A pesar de obtener una respuesta funcional
apropiada, el utilizar las proteínas expresadas en estos sistemas,
implican un alto coste para el desarrollo de los procesos de
producción a gran escala; por lo tanto, la expresión en levaduras
ha sido una alternativa para producir proteínas estructurales
recombinantes en flavivirus. Sin embargo, en el caso de la proteína
DENe, expresada en Pichia pastoris (documento PCT/US96/07627;
Sugrue R.J., Fu H., Howe J., Chan Y. Expresión of the Dengue virus
structural proteins in Pichia pastoris leads to the
generation of virus-like particles. J. Virol. 1997.
78, 1861-1866), los niveles de expresión son bajos,
ya sea secretada o intracelularmente, dificultando el proceso de
purifica-
ción.
ción.
En paralelo, se han obtenido varias variantes de
la proteína DENe en bacterias. Una de ellas fue la porción
C-terminal de la proteína E del JEV, fusionada a una
proteína del metabolismo del triptófano (TrpE) de E. coli.
Esta proteína fue producida en forma de cuerpos de inclusión, y se
reconoció mediante la neutralización de anticuerpos monoclonales
(Mab) utilizando técnicas de inmuno-detección. Sin
embargo, las preparaciones puras de esta proteína fueron incapaces
de desarrollar neutralización de los anticuerpos, ni de proteger
contra el reto viral (Mason P.W:, Zogel M.V., Semproni A.R., et
al. The antigenic structure of dengue type 1 virus envelope and
NS1 protein expressed in E. coli. J Gen Virol. 1990.
71:2107-2114). Adicionalmente se hizo otra
construcción (Srivasta A.K., Morita K., Matsuo S., et al.
Japanese encephalitis virus fusion protein with protein A expressed
in E. coli confers protection in mice. Microbiol Immunol.
1991. 35: 863-870), que contiene la proteína A de
Staphylococcus aurius fusionada al fragmento
C-terminal de la proteína E, seguida por el
segmento N-terminal de la proteína no estructural
del JEV, la NS1. En este caso, la proteína fusionada era soluble,
facilitando su purificación mediante cromatografía de afinidad. Tras
la inmunización de ratones con esa proteína pura, se obtuvieron
niveles elevados de anticuerpos neutralizantes, que además
inhibieron la hemaglutinación y protegieron contra el reto viral con
el JEV. Se obtuvieron resultados similares utilizando la región
DENe de la DEN-2 fusionada con la proteína A de
S. aureus (Srivastava A.K., Putnak R.J., Warren R.L., Hoke
C.H. Mice immunized with a dengue type 2 virus E and NS1 fusion
protein made in Escherichia coli are protected against letal
virus infection. Vaccine. 1995. 13: 1251-1258); sin
embargo, no es posible utilizar esas preparaciones en humanos,
debido a la presencia de la proteína A, que ha mostrado una alta
afinidad por la inmunoglobulina G (IgG) humana.
Finalmente, se ha informado sobre una proteína
de fusión que contiene el dominio B de la proteína DENe de la
DEN-2, y la proteína de unión a maltosa (MBP) de
E. coli (Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G.
Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengue
envelope B domain fusion protein against dengue 2 virus infection
in mice. Am J Trop Med Hyg. 1998. 58: 655-662),
denominada MBP-DomB. Esta variante de proteína fue
inmunogénica en ratones, y produjo anticuerpos neutralizantes.
En nuestro caso, el sujeto de esta invención
depende de la obtención de secuencias quiméricas, como por ejemplo,
en el primer caso, la secuencia codificante para una región de la
proteína DENe unida al fragmento N-terminal de una
proteína mutada con actividad deshidrogenasa (MDH) de Neisseria
meningitidis; en el segundo caso, la secuencia codificante para
una región de la proteína DENe unida al gen entero de la proteína
MDH en dos posiciones diferentes; y en el tercer caso, las
secuencias quiméricas están formadas por dos fragmentos de la
proteína DENe a partir de dos serotipos virales distintos fusionados
al mismo gen codificante para la proteína MDH. Cuando se insertan
estas cadenas quiméricas en un vector adecuado, dan lugar a
proteínas quiméricas insolubles en el citoplasma bacteriano. Estas
proteínas son capaces después de producir altos niveles de
anticuerpos neutralizantes contra el DEN, inhibidores de la
hemaglutinación viral, y de proteger a ratones inmunizados contra
el reto viral.
Con respecto a la insolubilidad de las proteínas
anteriormente mencionadas, se consiguió un sencillo proceso in
vitro de plegamiento a gran escala, además que los procesos de
expresión y purificación fueron superiores a los utilizados por
Simmons et al, 1998. Por otro lado, se demuestra la
especificidad de serotipo de los anticuerpos, generada por
inmunización del ratón con esas proteínas, al nivel de
neutralización, inhibición de la hemaglutinación y ELISA,
utilizando dosis menores que las empleadas por Simmons et al,
1998. Este hecho constituye el primer informe sobre la expresión de
las proteínas DENe insolubles en E. coli, incapaces de
estimular una respuesta inmune
funcional.
funcional.
Adicionalmente, considerando los resultados
obtenidos con la variante dimérica, es posible generar anticuerpos
específicos para el serotipo, con la misma molécula para dos
serotipos virales distintos, capaces de neutralizar la infección
viral y de proteger a los ratones contra el reto viral. En lo que
respecta a la proteína MDH, se realizó una investigación sobre la
homología con otras secuencias, en la base de datos EMBL, revelando
que los primeros 110 aminoácidos son altamente similares a la región
del dominio de enlace lipoico y de la bisagra flexible de la
dihidrolipoamida acetiltransferasa (enzima E2 del complejo piruvato
deshidrogenasa y de la \alpha-cetoglutarato
deshidrogenasa), y el resto de la proteína es altamente similar a la
lipoamida deshidrogenasa (LPDH), enzima E3 de dichos complejos
(Stephens, P.E; H.M. Darlinson, and J.R. Guest, 1983. The Pyruvate
dehydrogenase complexo f E. coli. Eur. J. Biochem. 133:
155-162).
Por otra parte, también se descubrió que los
pacientes con Cirrosis Biliar Primaria (CBP) producían
auto-anticuerpos
anti-mitocondriales, específicos para el sitio de
enlace cono ácido lipoico, común entre esas proteínas (Gershwin ME,
Mackay IR, Sturgess A, Coppel RL. Identification and specificity of
a cDNA encoding the 70 KDa mitochondrial antigen recognized in
primary biliary cirrosis. J Immunol 1987;
138:3525-1). Por lo tanto, decidimos mutar esta
región dentro de la proteína, para evitar cualquier respuesta
auto-inmune cuando se inmunizó en humanos en forma
de proteínas quiméricas. La proteína MDH mutada de nuestra invención
se utilizó en un ensayo clínico de Fase I y demostró ser segura e
inmunogénica en humanos, y además no fue reconocida por el suero de
pacientes con PBC (Pérez, A. F. Dickinson, Z. Cinza, A. Ruíz, T.
Serrano, J. Sosa, S. González, Y. Gutiérrez, C. Nazábal, O.
Gutiérrez, D. Guzmán, M. Díaz, M. Delgado, E. Caballero, G.
Sardiñas, A. Alvarez, A. Martín, G. Guillén, R. Silva. Safety and
preliminary immunogenicity of the recombinant outer membrane protein
of Neisseria meningitidis in human volunteers. Biotech.
Appl. Biochem. 34: 121-125). Sin embargo, no se ha
demostrado aún el posible uso de la MBP en humanos (Simmons M.,
Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G. Evaluation of the protective
efficacy of a recombinant dengue envelope B domain fusion protein
against dengue 2 virus infection in mice. Am J Trop Med Hyg. 1998.
58: 655-
662).
662).
En esta invención se describe la obtención de
cadenas quiméricas de nucleótidos, que cuando son introducidas en
un vector de expresión, dan lugar a proteínas quiméricas capaces de
inducir una respuesta inmune humoral específica para serotipos, y
de proteger contra la infección por el virus Dengue; por ejemplo, la
secuencia codificante para una región de la proteína DENe a partir
de cada uno de los serotipos virales del virus Dengue, unida al
fragmento N-terminal de una proteína mutada, con
actividad deshidrogenasa (MDH) a partir de Neisseria
meningitidis; en el segundo caso, la secuencia codificante para
una región de la proteína DENe, unida al gen entero de la proteína
MDH en dos posiciones distintas: en un sitio dentro de la secuencia
codificante para un dominio estructural de la proteína MDH (dominio
de enlace al ácido lipoico), y en el final 3' del gen; y en el
tercer caso, las secuencias quiméricas están formadas por dos
fragmentos de la proteína DENe a partir de dos serotipos virales
diferentes, DEN-2 y DEN-4, en dos
posiciones distintas del gen MDH: una dentro de un sitio particular
de la secuencia codificante para el dominio de unión al ácido
lipoico (serotipo 4) y la otra en el final 3' del gen MDH (serotipo
2). A este se le llamó una construcción dimérica.
Estas proteínas quiméricas se obtuvieron en
forma insoluble a partir de citoplasma bacteriano. Se realizó un
proceso de purificación mediante cromatografía de afinidad a metal
inmovilizado (IMAC), lo que permitió obtener proteínas puras para
estudios de inmunogenicidad.
Cuando se analizaron los resultados de la
antigenicidad, se descubrió un fuerte reconocimiento de todas las
proteínas quiméricas para los líquidos ascíticos hiperinmunes (HMAF)
anti-DEN, siendo mayor en el caso de la fusión con
el gen MDH entero, lo cual evidencia un efecto positivo en el
plegamiento de la región de la proteína DENe, dado por el MDH. En
los casos en los que se usó serotipo 2, todas las proteínas
recombinantes obtenidas fueron reconocidas por un anticuerpo
neutralizante específico para el serotipo (3H5), siendo también
mayor para el caso de la fusión con el gen MDH entero, además de en
la proteína quimérica. También se observó que el reconocimiento del
HMAF a partir del serotipo homólogo, en cada caso fue
significativamente más alto que el reconocimiento del HMAF a partir
de serotipos heterólogos, evidenciando la exposición de los epítopos
específicos para serotipo, y permitiendo de ese modo su uso como
medio de diagnóstico el Dengue y el serotipado.
Cuando todas las proteínas quiméricas
recombinantes fueron inmunizadas en ratón, se obtuvo una respuesta
neutralizante y protectora. Los títulos de neutralización más
elevados se obtuvieron con las secuencias fusionadas al gen
completo del MDH, y con la proteína dimérica, independientemente de
la posición del fragmento de la proteína DENe. Esto demostró un
efecto inmunopotenciador sobre la respuesta inmune mediada por el
MDH, que puede ser explicada por la influencia en el plegamiento de
la proteína DENe, reflejada en los resultados de antigenicidad
obtenidos. También se demostró por primera vez, y de manera
contraria a los conocimientos anteriores, que la insolubilidad de
esas proteínas no afecta a la capacidad de generar una respuesta
inmune apropiada.
La respuesta inmune producida en todos los
casos, fue específica para el serotipo (anticuerpos contra el
serotipo homólogo inmunizado) en la neutralización viral, la
inhibición de la hemoaglutinación, y el ELISA. La generación de
anticuerpos específicos del serotipo significa que no son capaces de
reconocer determinantes antigénicos de los virus de serotipos
heterólogos, que favorecen el fenómeno de
inmuno-refuerzo. Esta característica es muy
importante para el desarrollo de una vacuna candidata contra el
virus Dengue, puesto que el reconocimiento de los serotipos
heterólogos por parte de los anticuerpos, podría ser una de las
causas de la Fiebre Hemorrágica del Dengue
(FHD).
(FHD).
Además, se demostró la inducción de anticuerpos
contra dos serotipos virales después de la inmunización con solo
una de las proteínas quiméricas, lo que permita la formulación de
una vacuna candidata contra los cuatro serotipos, usando solamente
dos de nuestras proteínas quiméricas recombinantes.
La obtención de la proteína MDH mutante
consistió en la eliminación del sitio de unión al ácido lipoico, en
la secuencia ETDKAT, basado en la unión covalente de este ácido
graso con los grupos épsilon-amino de la lisina (K)
(Tuaillon N, Andre C, Brian JP et al. A lipoyl synthetic
octadecapeptide of dihydrolipoamide acetyltransferase specifically
recognized by anti-M2 autoantibodies in Primary
Biliary Cirrosis. J Immunol 1992; 148:445-
50).
50).
La mutagénesis se realizó usando PCR con un par
de cebadores para amplificar la región N-terminal (a
partir del codón de inicio del gen lpdA hasta el sitio de unión al
ácido lipoico, 135 pb) y la región C-terminal de la
proteína (desde el sitio de unión al ácido lipoico, hasta el final
3' del gen); eliminándose de esta manera la posibilidad de generar
reacciones autoinmunes, tal como se demostró en las análisis
clínicos con humanos.
Los plásmidos PLL1, PLL2, PLL3, PLH1, PLH2,
PLH3, PAZ1, PAZ2, PAZ3, PID1, PID2 y PID3, se depositaron de acuerdo
con el Tratado de Budapest en la Colección Coordinada de
Microorganismos Belga (BCCM™), la LMBP-COLLECTION,
y con la fecha y bajo los números de acceso (pendiente).
\newpage
Figura
1
DENe2: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-2.
N-term: secuencia de nucleótidos
que codifica para los primeros 45 aminoácidos de la proteína
MDH.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
DENe2: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-2.
MDH: mutante deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
DENe2: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-2.
MDH: mutante deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
4
DENe1: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-1.
N-term: secuencia de nucleótidos
que codifica para los primeros 45 aminoácidos de la proteína
MDH.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
5
DENe1: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-1.
N-term: secuencia de nucleótidos
que codifica para los primeros 45 aminoácidos de la proteína
MDH.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
6
DENe1: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-1.
MDH: mutante deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
7
DENe3: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-3.
N-term: secuencia de nucleótidos
que codifica para los primeros 45 aminoácidos de la proteína
MDH.
\newpage
Figura
8
DENe3: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-3.
MDH: mutante deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
9
DENe3: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-3.
MDH: mutante deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
10
DENe4: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-4.
N-term: secuencia de nucleótidos
que codifica para los primeros 45 aminoácidos de la proteína
MDH.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
11
DENe4: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-4.
MDH: mutante deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
12
DENe4: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-4.
MDH: mutante deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
13
DENe4: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-4.
DENe2: fragmento de la proteína de envoltura de
DEN-2.
MDH: mutante deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos que codifica para
los aminoácidos del 286 al 426 de la proteína del virus
DEN-2 (Id. Sec. Nº 22), se amplificó con los
oligonucleótidos identificados en la lista de secuencias como
Secuencia nº 2 del virus DEN-2 de la cepa con
genotipo Jamaica (Deubel V., Kinner R.M., Trent D:W. Nucleotide
sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural
proteinas od Dengue type 2 virus, Jamaica genotipe: Comparative
análisis of the full-length genome. Virology 1988.
165:234-244).
El vector se creó mediante digestión del
plásmido pM108 His mediante XbaI/BamHI, que contiene la
secuencia de nucleótidos que codifica para región
N-terminal del MDH y para una secuencia de 6
histidinas (Secuencia Nº 23). Tras el ligamiento, los recombinantes
potenciales se analizaron mediante digestión con enzimas de
restricción, y se secuenciaron los clones positivos para chequear
loas uniones. Las células competentes W3110 (Hill C.W., Harnish
B.W. 1982. Transposition of a chromosomal segment bounded by
redundant rRNA genes in Escherichia coli. J Bacteriology.
149:449-457) se transformaron con el clon
seleccionado, llamado pLL1 (Fig. 1 y Secuencia nº 24). Para el
crecimiento de la colonia en medio Luria Bertani (LB), se realizó un
SDS-PAGE del lisado celular. Como resultado se
obtuvo una banda de 25 kDa, lo que contó para el 10% del total de
las proteínas celulares. El tamaño de la proteína obtenida se
correspondió con la suma de la región N-terminal de
la proteína MDH, y el fragmento de proteína DENe del virus
DEN-2. La proteína fue reconocida en inmunobloting
mediante anticuerpos policlonales (AP)
anti-DEN-2 contenidos en el HMAF.
Está proteína se denominó PLL1 (Secuencia Nº 25).
\vskip1.000000\baselineskip
La biomasa obtenida a partir de la cepa de E.
coli, transformada con pLL1 y cultivada a 37ºC, se rompió
mediante prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo
preponderantemente en forma insoluble asociada al sedimento de la
ruptura celular. Se extrajo la proteína con urea 6 M, a partir del
sedimento, y el sobrenadante, que contenía la proteína PLL1, se
cargó en una columna G-25 para eliminar el agente
caotrópico. La fracción obtenida se cargó entonces en una columna
con sefarosa FF y quelante (Pharmacia, UK), en presencia de iones
Cu^{++}. La proteína se eluyó con Imidazol 50 mM y el volumen
obtenido se cargó en una columna G-25, para obtener
finalmente la proteína en el tampón de formulación NaCl 100 mM,
KCl_{2} 2 mM, Na_{2}HPO_{4} 10 mM, pH 7,2, KH_{2}PO_{4} 1
mM (PBS). Esta preparación se utilizó para estudios
inmunológicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción purificada de PLL1 se caracterizó
tanto por su reconocimiento por distintos anticuerpos monoclonales
de roedor y/o policlonales de suero, como por el suero humano
positivo para el Dengue (tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los reconocimientos más elevados en dot blotting
se obtuvieron a partir del HMAF
anti-DEN-2. Estos resultados
coinciden con el hecho de que las regiones clonadas pertenecen al
serotipo 2. El reconocimiento mediante HMAF contra otros serotipos
fue menor que en el caso del serotipo 2, en orden decreciente:
DEN-1, DEN-3 y
DEN-4. Los anticuerpos generados por otros
flavivirus como el virus de la Fiebre Amarilla y el virus de la
Encefalitis de San Luis, no tuvieron ningún tipo de reconocimiento.
Por otro lado, el anticuerpo Mab 3H5 tuvo buena reactividad. Este
reconocimiento mediante Western Blotting dependió del enlace
disulfuro, puesto que cuando la muestra fue reducida, la señal se
perdió. Finalmente, se midió la reactividad frente a tres sueros
humanos con altos títulos y tres con bajos títulos, contra
DEN-2, consiguiendo una señal sustancial en ambos
casos, mediante Western blotting y dot
blotting.
blotting.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizó intraperitonealmente a un total de
25 ratones Balb/c, con 35 \mug de PLL1 purificada en adyuvante de
Freund; se le sacó sangre a 10 animales tras cuatro dosificaciones,
y se evaluó el anti-DEN mediante ELISA. Se
obtuvieron altos títulos de anticuerpos contra DEN-2
aunque no se obtuvo reactividad contra el resto de los serotipos
(tabla 2 y tabla 5). Adicionalmente, se realizó el ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (HIA), y solo se encontraron
títulos positivos contra DEN-2 (tabla 3 y tabla 5).
Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in vitro,
y se obtuvieron los títulos de neutralización contra
DEN-2 del orden de 1:320. Sin embargo, no se
encontró neutralización de la infección viral contra el resto de los
serotipos (tabla 4 y tabla 5). Estos resultados indican la alta
especificidad por los serotipos de los anticuerpos obtenidos
mediante PLL1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos que codifica para
los aminoácidos desde el 286 hasta el 426 de la proteína de
envoltura del virus DEN-2 (Id. Sec. Nº 22) fue
amplificada con los oligonucleótidos identificados en la lista de
secuencias como Secuencia nº 1 y Secuencia nº 3, a partir del virus
DEN-2 de la cepa con genotipo Jamaica (Deubel V.,
Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid
sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus,
Jamaica genotype: Comparative analisys of the
full-length genome. Virology 1988.
165:234-244).
El vector se creó mediante digestión del
plásmido pM84 His mediante XbaI/EcoRI, que contiene la
secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína MDH, y para
una secuencia de seis histidinas (Secuencia nº 26). Esta digestión
permite la inserción del fragmento amplificado mediante PCR dentro
de la región codificante para un dominio estructural de la proteína
MDH. Tras el ligamiento, se analizaron los recombinantes potenciales
mediante digestión con enzima de restricción, y se secuenciaron
clones positivos para chequear las uniones. Las células competentes
MM294 (Hanahan D. 1983. Studies on transformation of Escherichia
coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166:557-580)
fueron transformadas con el clon seleccionado, llamado pLL2 (Fig. 2
y Secuencia nº 27). Tras el cultivo de la colonia en medio LB, se
realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Como
resultado se obtuvo una banda de 80 kDa, que contó para el 10% de
las proteínas celulares totales. El tamaño de la proteína obtenida
se correspondió con la suma del tamaño de la proteína MDH y del
fragmento de proteína DENe del virus DEN-2. La
proteína se reconoció en Inmunobloting mediante un HMAF
anti-DEN-2, y se denominó PLL2
(Secuencia nº 28).
La biomasa obtenida a partir de la cepa de E.
coli, transformada con pLL2 y cultivada a 37ºC, se rompió
mediante prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo en dos
formas: soluble e insoluble. A partir de la fracción soluble, se
realizó una cromatografía de afinidad a iones metálicos, usando la
columna con sefarosa FF y quelante previamente emparejada con iones
Cu^{++}. La columna se lavó usando Imidazol 15 mM, y la proteína
se eluyó con Imidazol 100 mM. Por otro lado, la roteína asociada con
la fracción insoluble se extrajo utilizando urea 8 M, y el
sobrenadante, que contenía proteína PLL2, se cargó en una columna
G-25 para eliminar el agente caotrópico. La
fracción obtenida se cargó entonces en una columna con sefarosa FF y
quelante (Pharmacia, UK), en presencia de iones Cu^{++}. La
proteína se eluyó con Imidazol 100 mM, la fracción pura de cada
forma de la proteína se cargó en una columna G-25,
para obtener finalmente la proteína en el tampón de formulación
NaCl 100 mM, KCl_{2} 2 mM, Na_{2}HPO_{4} 10 mM, pH 7,2,
KH_{2}PO_{4} 1 mM (PBS). Estas preparaciones se utilizaron para
estudios inmunológicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción purificada de PLL2 se caracterizó
tanto por su reconocimiento por distintos anticuerpos monoclonales
de roedor y/o policlonales de suero, como por el suero humano
positivo para el Dengue (tabla 6).
Los reconocimientos más elevados en dot blotting
se obtuvieron con el HMAF
anti-DEN-2. El reconocimiento
mediante HMAF contra los otros serotipos fue menor que en el caso
del serotipo 2, en orden decreciente: DEN-1,
DEN-3 y DEN-4. Los anticuerpos
generados por otros flavivirus como el virus de la Fiebre Amarilla y
el virus de la Encefalitis de San Luis, no tuvieron ningún tipo de
reconocimiento. No obstante, en relación con el anticuerpo Mab 3H5,
se observó una gran actividad (incluso mayor que la obtenida con la
PLL1), tanto mediante Dot blot como mediante Western blot.
Contrariamente a los resultados con PLL1, el reconocimiento con l
Mab 3H5 fue el mismo cuando están presentes en la muestra los
agentes reductores, indicando una posible diferencia conformacional
entre ambas proteínas. Finalmente, se midió la reactividad frente a
tres sueros humanos con altos títulos y tres con bajos títulos,
contra DEN-2, consiguiendo una señal sustancial en
ambos casos, mediante Western blotting y dot
blotting.
blotting.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizó intraperitonealmente a un total de
25 ratones Balb/c, con 35 \mug de PLL2 purificada en adyuvante de
Freund; se le sacó sangre a 10 animales tras cuatro dosificaciones,
y se evaluó el anti-DEN mediante ELISA. Se
obtuvieron altos títulos de anticuerpos contra DEN-2
aunque no se obtuvo reactividad contra el resto de los serotipos
(tabla 7 y tabla 10). Adicionalmente, se realizó el ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (HIA), y solo se encontraron
títulos positivos contra DEN-2 (tabla 8 y tabla 10).
Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in vitro,
y se obtuvieron los títulos de neutralización contra
DEN-2 del orden de 1:1280. De manera similar a los
resultados obtenidos con PLL1, no se encontró neutralización de la
infección viral contra el resto de los serotipos (tabla 9 y tabla
10). Por otro lado, los resultados obtenidos con ambas variantes de
PLL2 fueron similares, indicando que el estatus de solubilidad de la
proteína no muestra influencia sobre la capacidad de generar
anticuerpos
funcionales.
funcionales.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip0.3cm
La secuencia de nucleótidos que codifica para
los aminoácidos desde el 286 hasta el 426 de la proteína de
envoltura del virus DEN-2 (Id. Sec. Nº 22) fue
amplificada con los oligonucleótidos identificados en la lista de
secuencias como Secuencia nº 4 y Secuencia nº 5, a partir del virus
DEN-2 de la cepa con genotipo Jamaica (Deubel V.,
Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid
sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus,
Jamaica genotype: Comparative analisys of the
full-length genome. Virology 1988.
165:234-244).
El vector se creó mediante digestión del
plásmido pD4 mediante BamHI/BamHI, que contiene la secuencia
de nucleótidos que codifica para la proteína MDH, y para una
secuencia de seis histidinas sin el codón de finalización
(Secuencia nº 29). Esta digestión permite la fusión del fragmento
amplificado mediante PCR, tras la región
C-terminal, para la proteína MDH. Tras el
ligamiento, se analizaron los recombinantes potenciales mediante
digestión con enzima de restricción, y se secuenciaron clones
positivos para chequear las uniones. Las células competentes W3110
fueron transformadas con el clon seleccionado, llamado pLL3 (Fig. 3
y Secuencia nº 30). Tras el cultivo de la colonia en medio LB, se
realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Como
resultado se obtuvo una banda de 80 kDa, que contó para el 20% de
las proteínas celulares totales. El tamaño de la proteína obtenida
se correspondió con la suma del tamaño de la proteína MDH y del
fragmento de proteína DENe del virus DEN-2. La
proteína se reconoció en Inmunobloting mediante un HMAF
anti-DEN-2, y se denominó PLL3
(Secuencia nº 31).
\vskip1.000000\baselineskip
La biomasa obtenida a partir de la cepa de E.
coli, transformada con pLL2 y cultivada a 37ºC, se rompió
mediante prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo en dos
formas: soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la
proteína se extrajo usando urea 6 M, y el sobrenandante, que
contenía la proteína PLL3, se cargó en una columna
G-25 para eliminar el agente caotrópico. La fracción
obtenida se cargó entonces en una columna con sefarosa FF y
quelante (Pharmacia, UK), en presencia de iones Cu^{++}. La
proteína se eluyó con Imidazol 30 mM, y la proteína se eluyó con
Imidazol 100 mM. Finalmente, la fracción pura de la proteína se
cargó en una columna G-25, para obtener la proteína
en el tampón de formulación (PBS). Esta preparación se utilizó para
estudios inmunológicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción purificada de PLL3 se caracterizó
tanto por su reconocimiento por distintos anticuerpos monoclonales
de roedor y/o policlonales de suero, como por el suero humano
positivo para el Dengue (tabla 11).
Los reconocimientos más elevados en dot blotting
se obtuvieron con el HMAF
anti-DEN-2. El reconocimiento
mediante HMAF contra los otros serotipos fue menor que en el caso
del serotipo 2, en orden decreciente: DEN-1,
DEN-3 y DEN-4. Los anticuerpos
generados por otros flavivirus como el virus de la Fiebre Amarilla y
el virus de la Encefalitis de San Luis, no tuvieron ningún tipo de
reconocimiento. No obstante, en relación con el anticuerpo Mab 3H5,
se observó una gran actividad (similar a la obtenida con la PLL2),
tanto mediante Dot blot como mediante Western blot. Contrariamente
a los resultados con PLL1, el reconocimiento con Mab 3H5 fue el
mismo cuando están presentes en la muestra los agentes reductores,
indicando una posible diferencia conformacional entre ambas
proteínas. Finalmente, se midió la reactividad frente a tres sueros
humanos con altos títulos y tres con bajos títulos, contra
DEN-2, consiguiendo una señal sustancial en ambos
casos, mediante Western blotting y dot blotting. Estos resultados
fueron similares a los obtenidos con PLL2.
Se inmunizó intraperitonealmente a un total de
25 ratones Balb/c, con 35 \mug de PLL3 purificada en adyuvante de
Freund; se le sacó sangre a 10 animales tras cuatro dosificaciones,
y se evaluó el anti-DEN mediante ELISA. Se
obtuvieron altos títulos de anticuerpos contra DEN-2
aunque no se obtuvo reactividad contra el resto de los serotipos
(tabla 12 y tabla 15). Adicionalmente, se realizó el ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (HIA), y solo se encontraron
títulos positivos contra DEN-2 (tabla 13 y tabla
15). Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in
vitro, y se obtuvieron los títulos de neutralización contra
DEN-2 del orden de 1:1280 (tabla 14). No se
encontró neutralización de la infección viral contra el resto de los
serotipos (tabla 15). Usando las tres pruebas, se detectaron
altos
niveles de anticuerpos específicos para serotipo, similares a los obtenidos tras la inmunización con la proteína PLL2.
niveles de anticuerpos específicos para serotipo, similares a los obtenidos tras la inmunización con la proteína PLL2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos que codifica para
los aminoácidos desde el 286 hasta el 426 de la proteína de
envoltura del virus DEN-1 (Id. Sec. Nº 32) fue
amplificada con los oligonucleótidos identificados en la lista de
secuencias como Secuencia nº 6 y Secuencia nº 7, a partir del
genotipo de la cepa del virus DEN-1 (Chu M.C.,
O'Rourke E.J., Trent D.W. Genetic relatedness among structural
protein genes of dengue virus 1 strains. J. Gen. Virol. 1989.
70:1201-
1712).
1712).
El vector se creó mediante digestión del
plásmido pM108 His mediante XbaI/BamHI, que contiene la
secuencia de nucleótidos que codifica para la región
N-terminal de la proteína MDH, y para una secuencia
de seis histidinas (Secuencia nº 23). Tras el ligamiento, se
analizaron los recombinantes potenciales mediante digestión con
enzima de restricción, y se secuenciaron clones positivos para
chequear las uniones. Las células competentes W3110 fueron
transformadas con el clon seleccionado, llamado pLH1 (Fig. 3 y
Secuencia nº 33). Tras el cultivo de la colonia en medio Luria
Bertani LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado
celular. Como resultado se obtuvo una banda de 25 kDa, que contó
para el 10% de las proteínas celulares totales. El tamaño de la
proteína obtenida se correspondió con la suma del tamaño de la
región N-terminal de la proteína MDH y del fragmento
de proteína DENe del virus DEN-1. La proteína se
reconoció en Inmunobloting mediante anticuerpos policlonales (AP)
anti-DEN-1 contenidos en HMAF. Esta
proteína se denominó PLH1 (Secuencia nº 34).
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La biomasa obtenida a partir de la cepa de E.
coli, transformada con pLH1 y cultivada a 37ºC, se rompió
mediante prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo
preponderantemente en forma insoluble asociada al sedimento de la
ruptura celular. La proteína se extrajo a partir del sedimento,
usando urea 7 M, y el sobrenandante, que contenía la proteína PLH1,
se cargó en una columna G-25 para eliminar el agente
caotrópico. La fracción obtenida se cargó entonces en una columna
con sefarosa FF y quelante (Pharmacia, UK), en presencia de iones
Cu^{++}. La proteína se eluyó con Imidazol 60 mM, y el volumen
obtenido se cargó en una columna G-25, para obtener
finalmente la proteína en el tampón de formulación (PBS). Esta
preparación se utilizó para estudios inmunológicos.
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La fracción purificada de PLH1 se caracterizó
tanto por su reconocimiento por distintos anticuerpos monoclonales
de roedor y/o policlonales de suero, como por el suero humano
positivo para el Dengue (tabla 16).
Los reconocimientos más elevados en dot blotting
se obtuvieron con el HMAF
anti-DEN-1. El reconocimiento
mediante HMAF contra los otros serotipos fue menor que en el caso
del serotipo 1. Los anticuerpos generados por otros flavivirus como
el virus de la Fiebre Amarilla y el virus de la Encefalitis de San
Luis, no tuvieron ningún tipo de reconocimiento. Finalmente, se
midió la reactividad a tres sueros humanos con altos títulos y tres
con bajos títulos, contra DEN-1, consiguiendo una
señal sustancial en ambos casos, mediante Western blotting y dot
blotting.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se inmunizó intraperitonealmente a un total de
25 ratones Balb/c, con 35 \mug de PLH1 purificada en adyuvante de
Freund; se le sacó sangre a 10 animales tras cuatro dosificaciones,
y se evaluó el anti-DEN mediante ELISA. Se
obtuvieron altos títulos de anticuerpos contra DEN-1
aunque no se obtuvo reactividad contra el resto de los serotipos
(tabla 17 y tabla 20). Adicionalmente, se realizó el ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (HIA), y solo se encontraron
títulos positivos contra DEN-1 (tabla 18 y tabla
20). Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in
vitro, y se obtuvieron los títulos de neutralización contra
DEN-1 del orden de 1:320. Sin embargo, no se
encontró neutralización de la infección viral contra el resto de los
serotipos (tabla 19 y tabla 20). Estos resultados indican la alta
especificidad por serotipos de los anticuerpos obtenidos mediante
PLH1.
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La secuencia de nucleótidos que codifica para
los aminoácidos desde el 286 hasta el 426 de la proteína de
envoltura del virus DEN-1 (Secuencia Nº 32) fue
amplificada con los oligonucleótidos identificados en la lista de
secuencias como Secuencia nº 6 y Secuencia nº 8, a partir de una
cepa del virus DEN-1 (Chu M.C., O'Rourke E.J.,
Trent D.W. Genetic relatedness among structural protein genes of
dengue virus 1 strains. J. Gen. Virol. 1989. 70:1201-
1712).
1712).
El vector se creó mediante digestión del
plásmido pM84 His mediante XbaI/EcoRI, que contiene la
secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína MDH, y para
una secuencia de seis histidinas (Secuencia nº 26). La digestión
permite la inserción del fragmento amplificado mediante PCR dentro
de la región codificante para el dominio estructural de la proteína
MDH. Tras el ligamiento, se analizaron los recombinantes potenciales
mediante restricción por enzimas de digestión, y se secuenciaron
los clones positivos para chequear las uniones. Las células
competentes MM294 fueron transformadas con el clon seleccionado,
llamado pLH2 (Fig. 5 y Secuencia nº 35). Tras el cultivo de la
colonia en medio Luria Bertani LB, se realizó un
SDS-PAGE del lisado celular. Como resultado se
obtuvo una banda de 80 kDa, que contó para el 20% de las proteínas
celulares totales. El tamaño de la proteína obtenida se
correspondió con la suma del tamaño de la proteína MDH y del
fragmento de proteína DENe del virus DEN-1. La
proteína se reconoció en Inmunobloting mediante un HMAF
anti-DEN-1, y se denominó PLH2
(Secuencia nº
36).
36).
La biomasa obtenida a partir de la cepa de E.
coli, transformada con pLH2 y cultivada a 37ºC, se rompió
mediante prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo en dos
formas: soluble e insoluble. La proteína asociada a la fracción
insoluble se extrajo usando urea 7 M, y el sobrenandante, que
contenía la proteína PLH2, se cargó en una columna
G-25 para eliminar el agente caotrópico. La fracción
obtenida se cargó entonces en una columna con sefarosa FF y
quelante (Pharmacia, UK), en presencia de iones Cu^{++}. La
columna se lavó con Imidazol 40 mM y la proteína se eluyó con
Imidazol 100 mM. Finalmente, la fracción pura se cargó en una
columna G-25, para obtener finalmente la proteína en
el tampón de formulación (PBS). Esta preparación se utilizó para
estudios inmunológicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción purificada de PLH2 se caracterizó
tanto por su reconocimiento por distintos anticuerpos monoclonales
de roedor y/o policlonales de suero, como por el suero humano
positivo para el Dengue (tabla 21).
Los reconocimientos más elevados en dot blotting
se obtuvieron con el HMAF anti-DEN-1
(mayores que los obtenidos con PLH1). El reconocimiento mediante
HMAF contra los otros serotipos fue menor que en el caso del
serotipo 1. Los anticuerpos generados por otros flavivirus como el
virus de la Fiebre Amarilla y el virus de la Encefalitis de San
Luis, no tuvieron ningún tipo de reconocimiento. Finalmente, se
midió la reactividad a cinco sueros humanos con altos títulos y
tres con bajos títulos, contra DEN-1, consiguiendo
una señal sustancial en ambos casos, mediante Western blotting y
dot blotting.
Se inmunizó intraperitonealmente a un total de
25 ratones Balb/c, con 20 \mug de PLH2 purificada en adyuvante de
Freund; se le sacó sangre a 10 animales tras cuatro dosificaciones,
y se evaluó el anti-DEN mediante ELISA. Se
obtuvieron altos títulos de anticuerpos contra DEN-1
aunque no se obtuvo reactividad contra el resto de los serotipos
(tabla 22 y tabla 25). Adicionalmente, se realizó el ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (HI), y solo se encontraron
títulos positivos contra DEN-1 (tabla 23 y tabla
25). Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in
vitro, y se obtuvieron los títulos de neutralización contra
DEN-1 del orden de 1:1280 (tabla 24). No se
encontró neutralización de la infección viral contra el resto de los
serotipos (tabla 25).
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La secuencia de nucleótidos que codifica para
los aminoácidos desde el 286 hasta el 426 de la proteína de
envoltura del virus DEN-1 (Id. Sec. Nº 32) fue
amplificada con los oligonucleótidos identificados en la lista de
secuencias como Secuencia nº 9 y Secuencia nº 10, a partir de la
cepa del virus DEN-1 (Chu M.C., O'Rourke E.J.,
Trent D.W. Genetic relatedness among structural protein genes of
dengue virus 1 strains. J. Gen. Virol. 1989. 70:1201-
1712).
1712).
El vector se creó mediante digestión del
plásmido pD4 con BamHI/BamHI, que contiene la secuencia de
nucleótidos que codifica para la proteína MDH, y para una secuencia
de seis histidinas sin codón de finalización (Secuencia nº 29).
Esta digestión permite la fusión del fragmento amplificado mediante
PCR tras la región C-terminal para la proteína MDH.
Tras el ligamiento, se analizaron los recombinantes potenciales
mediante restricción por enzimas de digestión, y se secuenciaron
los clones positivos para chequear las uniones. Las células
competentes W3110 fueron transformadas con el clon seleccionado,
llamado pLH3 (Fig. 6 y Secuencia nº 37). Tras el cultivo de la
colonia en medio LB, se realizó un SDS-PAGE del
lisado celular. Como resultado se obtuvo una banda de 80 kDa, que
contó para el 20% de las proteínas celulares totales. El tamaño de
la proteína obtenida se correspondió con la suma del tamaño de la
proteína MDH y del fragmento de proteína DENe del virus
DEN-1. La proteína se reconoció en Inmunobloting
mediante un HMAF anti-DEN-1, y se
denominó PLH3 (Secuencia nº 38).
\vskip1.000000\baselineskip
La biomasa obtenida a partir de la cepa de E.
coli, transformada con pLH3 y cultivada a 37ºC, se rompió
mediante prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo en dos
formas: soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, se
extrajo la proteína usando urea 6 M, y el sobrenandante, que
contenía la proteína PLH3, se cargó en una columna
G-25 para eliminar el agente caotrópico. La fracción
obtenida se cargó entonces en una columna con sefarosa FF y
quelante (Pharmacia, UK), en presencia de iones Cu^{++}. La
columna se lavó con Imidazol 30 mM y la proteína se eluyó con
Imidazol 250 mM. Finalmente, la fracción pura se cargó en una
columna G-25, para obtener finalmente la proteína en
el tampón de formulación (PBS). Esta preparación se utilizó para
estudios inmunoló-
gicos.
gicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción purificada de PLH2 se caracterizó
tanto por su reconocimiento por distintos anticuerpos monoclonales
de roedor y/o policlonales de suero, como por el suero humano
positivo para el Dengue (tabla 26).
Los reconocimientos más elevados en dot blotting
se obtuvieron con el HMAF
anti-DEN-1. El reconocimiento
mediante HMAF contra los otros serotipos fue menor que en el caso
del serotipo 1. Los anticuerpos generados por otros flavivirus como
el virus de la Fiebre Amarilla y el virus de la Encefalitis de San
Luis, no tuvieron ningún tipo de reconocimiento. Finalmente, se
midió la reactividad contra tres sueros humanos con altos títulos y
tres con bajos títulos, contra DEN-1, consiguiendo
una señal sustancial en ambos casos, mediante Western blotting y
dot
blotting.
blotting.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se inmunizó intraperitonealmente a un total de
25 ratones Balb/c, con 20 \mug de PLH3 purificada en adyuvante de
Freund; se le sacó sangre a 10 animales tras cuatro dosificaciones,
y se evaluó el anti-DEN mediante ELISA. Se
obtuvieron altos títulos de anticuerpos contra DEN-1
aunque no se obtuvo reactividad contra el resto de los serotipos
(tabla 27 y tabla 30). Adicionalmente, se realizó el ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (HI), y solo se encontraron
títulos positivos contra DEN-1 (tabla 28 y tabla
30). Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in
vitro, y se obtuvieron los títulos de neutralización contra
DEN-1 del orden de 1:1280 (tabla 29). No se
encontró neutralización de la infección viral contra el resto de los
serotipos (tabla 30).
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La secuencia de nucleótidos que codifica para
los aminoácidos desde el 286 hasta el 426 de la proteína de
envoltura del virus DEN-3 (Sec. Nº 39) fue
amplificada con los oligonucleótidos identificados en la lista de
secuencias como Secuencia nº 11 y Secuencia nº 12, a partir del
virus DEN-3 del genotipo de la cepa (Osatomi K.,
Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus
genome RNA. Virology. 1990. 176(2):643-
647).
647).
El vector se creó mediante digestión del
plásmido pM108 His mediante XbaI/BamHI, que contiene la
secuencia de nucleótidos que codifica para la región
N-terminal de la proteína MDH, y para una secuencia
de seis histidinas (Secuencia nº 23). Tras el ligamiento, se
analizaron los recombinantes potenciales mediante digestión con
enzima de restricción, y se secuenciaron clones positivos para
chequear las uniones. Las células competentes W31104 fueron
transformadas con el clon seleccionado, llamado pAZ1 (Fig. 7 y
Secuencia nº 40). Tras el cultivo de la colonia en medio Luria
Bertani (LB), se realizó un SDS-PAGE del lisado
celular. Como resultado se obtuvo una banda de 25 kDa, que contó
para el 10% de las proteínas celulares totales. El tamaño de la
proteína obtenida se correspondió con la suma de la región
N-terminal de la proteína MDH y del fragmento de
proteína DENe del virus DEN-3. La proteína se
reconoció en Inmunobloting mediante anticuerpos policlonales (AP)
anti-DEN-3 contenidos en un HMAF.
Esta proteína se denominó PAZ1 (Secuencia nº 41).
\newpage
La biomasa obtenida a partir de la cepa de E.
coli, transformada con pAZ1 y cultivada a 37ºC, se rompió
mediante prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo
preponderantemente en forma insoluble, asociada al sedimento de la
ruptura celular. A partir del sedimento, se extrajo la proteína con
urea 7 M, y se cargó el sobrenandante, que contenía la proteína
PLH1, en una columna G-25 para eliminar el agente
caotrópico. La fracción obtenida se cargó entonces en una columna
con sefarosa FF y quelante (Pharmacia, UK), en presencia de iones
Cu^{++}. La proteína se eluyó con Imidazol 60 mM, y el volumen
obtenido se cargó en una columna G-25, para obtener
finalmente la proteína en el tampón de formulación (PBS). Estas
preparaciones se utilizaron para estudios inmunológicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción purificada de PAZ1 se caracterizó
tanto por su reconocimiento por distintos anticuerpos monoclonales
de roedor y/o policlonales de suero, como por el suero humano
positivo para el Dengue (tabla 31).
Los reconocimientos más elevados en dot blotting
se obtuvieron con el HMAF
anti-DEN-3. El reconocimiento
mediante HMAF contra los otros serotipos fue menor que en el caso
del serotipo 3. Los anticuerpos generados por otros flavivirus como
el virus de la Fiebre Amarilla y el virus de la Encefalitis de San
Luis, no tuvieron ningún tipo de reconocimiento. Finalmente, se
midió la reactividad frente a tres sueros humanos con altos títulos
y tres con bajos títulos, contra DEN-3, consiguiendo
una señal sustancial en ambos casos, mediante Western blotting y
dot blotting.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizó intraperitonealmente a un total de
25 ratones Balb/c, con 35 \mug de PAZ1 purificada en adyuvante de
Freund; se le sacó sangre a 10 animales tras cuatro dosificaciones,
y se evaluó el anti-DEN mediante ELISA. Se
obtuvieron altos títulos de anticuerpos contra DEN-1
aunque no se obtuvo reactividad contra el resto de los serotipos
(tabla 32 y tabla 35). Adicionalmente, se realizó el ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (HIA), y solo se encontraron
títulos positivos contra DEN-3 (tabla 33 y tabla
35). Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in
vitro, y se obtuvieron los títulos de neutralización contra
DEN-3 del orden de 1:320. Sin embargo, no se
encontró neutralización de la infección viral contra el resto de los
serotipos (tabla 34 y tabla 35). Estos resultados indican la alta
especificidad para serotipos, de los anticuerpos producidos por
PAZ1.
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La secuencia de nucleótidos que codifica para
los aminoácidos desde el 286 hasta el 426 de la proteína de
envoltura del virus DEN-3 (Id. Sec. Nº 39) fue
amplificada con los oligonucleótidos identificados en la lista de
secuencias como Secuencia nº 11 y Secuencia nº 13, a partir de una
cepa del virus DEN-3 (Osatomi K., Sumiyoshi H.
Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA.
Virology. 1990. 176(2):643-647).
El vector se creó mediante digestión del
plásmido pM84 His con XbaI/EcoRI, que contiene la secuencia
de nucleótidos que codifica para la proteína MDH, y para una
secuencia de seis histidinas (Secuencia nº 26). Esta digestión
permite la inserción del fragmento amplificado mediante PCR, dentro
de la región codificante para un dominio estructural de la proteína
MDH. Tras el ligamiento, se analizaron los recombinantes potenciales
mediante restricción por enzimas de digestión, y se secuenciaron
los clones positivos para chequear las uniones. Las células
competentes MM294 fueron transformadas con el clon seleccionado,
llamado pAZ2 (Fig. 8 y Secuencia nº 42). Tras el cultivo de la
colonia en medio LB, se realizó un SDS-PAGE del
lisado celular. Como resultado se obtuvo una banda de 80 kDa, que
contó para el 20% de las proteínas celulares totales. El tamaño de
la proteína obtenida se correspondió con la suma del tamaño de la
proteína MDH y del fragmento del virus DEN-3. La
proteína se reconoció en Inmunobloting mediante un HMAF
anti-DEN-3, y se denominó PAZ2
(Secuencia nº 43).
\vskip1.000000\baselineskip
La biomasa obtenida a partir de la cepa de E.
coli, transformada con pAZ2 y cultivada a 37ºC, se rompió
mediante prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo en dos
formas: soluble e insoluble. La proteína asociada con la fracción
insoluble, se extrajo usando urea 7 M, y el sobrenandante, que
contenía la proteína PAZ2, se cargó en una columna
G-25 para eliminar el agente caotrópico. La fracción
obtenida se cargó entonces en una columna con sefarosa FF y
quelante (Pharmacia, UK), en presencia de iones Cu^{++}. La
columna se lavó con Imidazol 40 mM y la proteína se eluyó con
Imidazol 100 mM. Finalmente, la fracción pura se cargó en una
columna G-25, para obtener finalmente la proteína en
el tampón de formulación (PBS). Esta preparación se utilizó para
estudios inmunológi-
cos.
cos.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción purificada de PAZ2 se caracterizó
tanto por su reconocimiento por distintos anticuerpos monoclonales
de roedor y/o policlonales de suero, como por el suero humano
positivo para el Dengue (tabla 36).
Los reconocimientos más elevados en dot blotting
se obtuvieron con el HMAF anti-DEN-3
(mayores que los obtenidos con PAZ1). El reconocimiento mediante
HMAF contra los otros serotipos fue menor que en el caso del
serotipo 3. Los anticuerpos generados por otros flavivirus como el
virus de la Fiebre Amarilla y el virus de la Encefalitis de San
Luis, no tuvieron ningún tipo de reconocimiento. Finalmente, se
midió la reactividad contra cinco sueros humanos con altos títulos
y tres con bajos títulos, contra DEN-3, consiguiendo
una señal sustancial en ambos casos, mediante Western blotting y
dot blotting.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizó intraperitonealmente a un total de
25 ratones Balb/c, con 20 \mug de PAZ2 purificada en adyuvante de
Freund; se le sacó sangre a 10 animales tras cuatro dosificaciones,
y se evaluó el anti-DEN mediante ELISA. Se
obtuvieron altos títulos de anticuerpos contra DEN-3
aunque no se obtuvo reactividad contra el resto de los serotipos
(tabla 37 y tabla 40). Adicionalmente, se realizó el ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (HI), y solo se encontraron
títulos positivos contra DEN-3 (tabla 38 y tabla
40). Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in
vitro, y se obtuvieron los títulos de neutralización contra
DEN-3 del orden de 1:1280 (tabla 39). No se
encontró neutralización de la infección viral contra el resto de los
serotipos (tabla 40).
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La secuencia de nucleótidos que codifica para
los aminoácidos desde el 286 hasta el 426 de la proteína de
envoltura del virus DEN-3 (Id. Sec. Nº 39) fue
amplificada con los oligonucleótidos identificados en la lista de
secuencias como Secuencia nº 14 y Secuencia nº 15, a partir de la
cepa del virus DEN-3 (Osatomi K., Sumiyoshi H.
Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA.
Virology. 1990. 176(2):643-647).
El vector se creó mediante digestión del
plásmido pD4 con BamHI/BamHI, que contiene la secuencia de
nucleótidos que codifica para la proteína MDH, y para una secuencia
de seis histidinas sin codón de finalización (Secuencia nº 29).
Esta digestión permite la fusión del fragmento amplificado mediante
PCR tras la región C-terminal de la proteína MDH.
Tras el ligamiento, se analizaron los recombinantes potenciales
mediante restricción por enzimas de digestión, y se secuenciaron
los clones positivos para chequear las uniones. Las células
competentes W3110 fueron transformadas con el clon seleccionado,
llamado pAZ3 (Fig. 8 y Secuencia nº 42). Tras el cultivo de la
colonia en medio LB, se realizó un SDS-PAGE del
lisado celular. Como resultado se obtuvo una banda de 80 kDa, que
contó para el 20% de las proteínas celulares totales. El tamaño de
la proteína obtenida se correspondió con la suma del tamaño de la
proteína MDH y del fragmento del virus DEN-3. La
proteína se reconoció en Inmunobloting mediante un HMAF
anti-DEN-3, y se denominó PAZ3
(Secuencia nº 45).
La biomasa obtenida a partir de la cepa de E.
coli, transformada con pAZ3 y cultivada a 37ºC, se rompió
mediante prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo en dos
formas: soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, se
extrajo usando urea 7 M, y el sobrenandante, que contenía la
proteína PAZ3, se cargó en una columna G-25 para
eliminar el agente caotrópico. La fracción obtenida se cargó
entonces en una columna con sefarosa FF y quelante (Pharmacia, UK),
en presencia de iones Cu^{++}. La columna se lavó con Imidazol 45
mM y la proteína se eluyó con Imidazol 230 mM. Finalmente, la
fracción pura se cargó en una columna G-25, para
obtener finalmente la proteína en el tampón de formulación (PBS).
Esta preparación se utilizó para estudios inmunológicos.
La fracción purificada de PAZ3 se caracterizó
tanto por su reconocimiento por distintos anticuerpos monoclonales
de roedor y/o policlonales de suero, como por el suero humano
positivo para el Dengue (tabla 26).
Los reconocimientos más elevados en dot blotting
se obtuvieron con el HMAF
anti-DEN-3. El reconocimiento
mediante HMAF contra los otros serotipos fue menor que en el caso
del serotipo 3. Los anticuerpos generados por otros flavivirus como
el virus de la Fiebre Amarilla y el virus de la Encefalitis de San
Luis, no tuvieron ningún tipo de reconocimiento. Finalmente, se
midió la reactividad contra tres sueros humanos con altos títulos y
tres con bajos títulos, contra DEN-3, consiguiendo
una señal sustancial en ambos casos, mediante Western blotting y
dot blotting.
Se inmunizó intraperitonealmente a un total de
25 ratones Balb/c, con 20 \mug de PAZ3 purificada en adyuvante de
Freund; se le sacó sangre a 10 animales tras cuatro dosificaciones,
y se evaluó el anti-DEN mediante ELISA. Se
obtuvieron altos títulos de anticuerpos contra DEN-3
aunque no se obtuvo reactividad contra el resto de los serotipos
(tabla 42 y tabla 45). Adicionalmente, se realizó el ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (HI), y solo se encontraron
títulos positivos contra DEN-3 (tabla 43 y tabla
45). Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in
vitro, y se obtuvieron los títulos de neutralización contra
DEN-3 del orden de 1:1280 (tabla 44). No se
encontró neutralización de la infección viral contra el resto de los
serotipos (tabla 45).
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\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos que codifica para
los aminoácidos desde el 286 hasta el 426 de la proteína de
envoltura del virus DEN-4 (Sec. Nº 46) fue
amplificada con los oligonucleótidos identificados en la lista de
secuencias como Secuencia nº 17 y Secuencia nº 18, a partir del
genotipo de la cepa del virus DEN-4 (Zhao B.,
Mackow E.E., Buckler-White A.J., Markoff L.,
Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning
full-length Dengue type 4 viral DNA sequences:
Análisis of genes coding for structural proteins. Virology 1986.
155:77-88).
El vector se creó mediante digestión del
plásmido pM108 His mediante XbaI/BamHI, que contiene la
secuencia de nucleótidos que codifica para la región
N-terminal de la proteína MDH, y para una secuencia
de seis histidinas (Secuencia nº 23). Tras el ligamiento, se
analizaron los recombinantes potenciales mediante digestión con
enzima de restricción, y se secuenciaron clones positivos para
chequear las uniones. Las células competentes W3110 fueron
transformadas con el clon seleccionado, llamado pID1 (Fig. 10 y
Secuencia nº 47). Tras el cultivo de la colonia en medio Luria
Bertani (LB), se realizó un SDS-PAGE del lisado
celular. Como resultado se obtuvo una banda de 25 kDa, que contó
para el 10% de las proteínas celulares totales. El tamaño de la
proteína obtenida se correspondió con la suma de la región
N-terminal de la proteína MDH y del fragmento de
proteína DENe del virus DEN-4. La proteína se
reconoció en Inmunobloting mediante anticuerpos policlonales (AP)
anti-DEN-3 contenidos en un HMAF.
Esta proteína se denominó PID1 (Secuencia nº 48).
\vskip1.000000\baselineskip
La biomasa obtenida a partir de la cepa de E.
coli, transformada con pID1 y cultivada a 37ºC, se rompió
mediante prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo
preponderantemente en forma insoluble, asociada al sedimento de la
ruptura celular. A partir del sedimento, se extrajo la proteína con
urea 6 M, y se cargó el sobrenandante, que contenía la proteína
PID1, en una columna G-25 para eliminar el agente
caotrópico. La fracción obtenida se cargó entonces en una columna
con sefarosa FF y quelante (Pharmacia, UK), en presencia de iones
Cu^{++}. La proteína se eluyó con Imidazol 60 mM, y el volumen
obtenido se cargó en una columna G-25, para obtener
finalmente la proteína en el tampón de formulación (PBS). Estas
preparaciones se utilizaron para estudios inmunológi-
cos.
cos.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción purificada de PID1 se caracterizó
tanto por su reconocimiento por distintos anticuerpos monoclonales
de roedor y/o policlonales de suero, como por el suero humano
positivo para el Dengue (tabla 46).
Los reconocimientos más elevados en dot blotting
se obtuvieron con el HMAF
anti-DEN-4. El reconocimiento
mediante HMAF contra los otros serotipos fue menor que en el caso
del serotipo 4. Los anticuerpos generados por otros flavivirus como
el virus de la Fiebre Amarilla y el virus de la Encefalitis de San
Luis, no tuvieron ningún tipo de reconocimiento. Finalmente, se
midió la reactividad frente a tres sueros humanos con altos títulos
y tres con bajos títulos, contra DEN-4, consiguiendo
una señal sustancial en ambos casos, mediante Western blotting y
dot
blotting.
blotting.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se inmunizó intraperitonealmente a un total de
25 ratones Balb/c, con 35 \mug de PID1 purificada en adyuvante de
Freund; se le sacó sangre a 10 animales tras cuatro dosificaciones,
y se evaluó el anti-DEN mediante ELISA. Se
obtuvieron altos títulos de anticuerpos contra DEN-1
aunque no se obtuvo reactividad contra el resto de los serotipos
(tabla 47 y tabla 50). Adicionalmente, se realizó el ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (HIA), y solo se encontraron
títulos positivos contra DEN-4 (tabla 48 y tabla
50). Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in
vitro, y se obtuvieron los títulos de neutralización contra
DEN-4 del orden de 1:320. Sin embargo, no se
encontró neutralización de la infección viral contra el resto de los
serotipos (tabla 49 y tabla 50). Estos resultados indican la alta
especificidad para serotipos, de los anticuerpos producidos por
PID1.
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\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos que codifica para
los aminoácidos desde el 286 hasta el 426 de la proteína de
envoltura del virus DEN-4 (Id. Sec. Nº 46) fue
amplificada con los oligonucleótidos identificados en la lista de
secuencias como Secuencia nº 16 y Secuencia nº 18, a partir de la
cepa del virus DEN-4 (Zhao B., Mackow E.E.,
Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai
C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4
viral DNA sequences: Análisis of genes coding for structural
proteins. Virology 1986. 155:77-88).
El vector se creó mediante digestión del
plásmido pM84 His con XbaI/EcoRI, que contiene la secuencia
de nucleótidos que codifica para la proteína MDH, y para una
secuencia de seis histidinas (Secuencia nº 26). Esta digestión
permite la inserción del fragmento amplificado mediante PCR, en la
región codificante para un dominio estructural de la proteína MDH.
Tras el ligamiento, se analizaron los recombinantes potenciales
mediante restricción por enzimas de digestión, y se secuenciaron los
clones positivos para chequear las uniones. Las células competentes
MM294 fueron transformadas con el clon seleccionado, llamado pID2
(Fig. 11 y Secuencia nº 49). Tras el cultivo de la colonia en medio
LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Como
resultado se obtuvo una banda de 80 kDa, que contó para el 20% de
las proteínas celulares totales. El tamaño de la proteína obtenida
se correspondió con la suma del tamaño de la proteína MDH y del
fragmento de proteína DENe del virus DEN-4. La
proteína se reconoció en Inmunobloting mediante un HMAF
anti-DEN-4, y se denominó PD23
(Secuencia nº 50).
\vskip1.000000\baselineskip
La biomasa obtenida a partir de la cepa de E.
coli, transformada con pID2 y cultivada a 37ºC, se rompió
mediante prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo en dos
formas: soluble e insoluble. La proteína asociada a la fracción
insoluble, se extrajo usando urea 6 M, y el sobrenandante, que
contenía la proteína PID2, se cargó en una columna
G-25 para eliminar el agente caotrópico. La fracción
obtenida se cargó entonces en una columna con sefarosa FF y
quelante (Pharmacia, UK), en presencia de iones Cu^{++}. La
columna se lavó con Imidazol 30 mM y la proteína se eluyó con
Imidazol 250 mM. Finalmente, la fracción pura se cargó en una
columna G-25, para obtener finalmente la proteína en
el tampón de formulación (PBS). Esta preparación se utilizó para
estudios inmunológicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción purificada de PID2 se caracterizó
tanto por su reconocimiento por distintos anticuerpos monoclonales
de roedor y/o policlonales de suero, como por el suero humano
positivo para el Dengue (tabla 51).
Los reconocimientos más elevados en dot blotting
se obtuvieron con el HMAF anti-DEN-4
(mayor que los obtenidos con PID1). El reconocimiento mediante HMAF
contra los otros serotipos fue menor que en el caso del serotipo 4.
Los anticuerpos generados por otros flavivirus como el virus de la
Fiebre Amarilla y el virus de la Encefalitis de San Luis, no
tuvieron ningún tipo de reconocimiento. Finalmente, se midió la
reactividad contra cinco sueros humanos con altos títulos y tres
con bajos títulos, contra DEN-3, consiguiendo una
señal sustancial en ambos casos, mediante Western blotting y dot
blotting.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizó intraperitonealmente a un total de
25 ratones Balb/c, con 20 \mug de PID2 purificada en adyuvante de
Freund; se le sacó sangre a 10 animales tras cuatro dosificaciones,
y se evaluó el anti-DEN mediante ELISA. Se
obtuvieron altos títulos de anticuerpos contra DEN-4
aunque no se obtuvo reactividad contra el resto de los serotipos
(tabla 52 y tabla 55). Adicionalmente, se realizó el ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (HI), y solo se encontraron
títulos positivos contra DEN-4 (tabla 53 y tabla
55). Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in
vitro, y se obtuvieron los títulos de neutralización contra
DEN-4 del orden de 1:1280 (tabla 54). No se
encontró neutralización de la infección viral contra el resto de los
serotipos (tabla 55).
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\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos que codifica para
los aminoácidos desde el 286 hasta el 426 de la proteína de
envoltura del virus DEN-4 (Id. Sec. Nº 46) fue
amplificada con los oligonucleótidos identificados en la lista de
secuencias como Secuencia nº 19 y Secuencia nº 20, a partir de la
cepa del virus DEN-4 (Zhao B., Mackow E.E.,
Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai
C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4
viral DNA sequences: Análisis of genes coding for structural
proteins. Virology 1986. 155:77-88).
El vector se creó mediante digestión del
plásmido pD4 con BamHI/BamHI, que contiene la secuencia de
nucleótidos que codifica para la proteína MDH, y para una secuencia
de seis histidinas sin codón de finalización (Secuencia nº 29).
Esta digestión permite la fusión del fragmento amplificado mediante
PCR, tras la región C-terminal de la proteína MDH.
Tras el ligamiento, se analizaron los recombinantes potenciales
mediante restricción por enzimas de digestión, y se secuenciaron
los clones positivos para chequear las uniones. Las células
competentes W3110 fueron transformadas con el clon seleccionado,
llamado pID3 (Fig. 12 y Secuencia nº 51). Tras el cultivo de la
colonia en medio LB, se realizó un SDS-PAGE del
lisado celular. Como resultado se obtuvo una banda de 80 kDa, que
contó para el 20% de las proteínas celulares totales. El tamaño de
la proteína obtenida se correspondió con la suma del tamaño de la
proteína MDH y del fragmento de proteína DENe del virus
DEN-4. La proteína se reconoció en Inmunobloting
mediante un HMAF anti-DEN-4, y se
denominó PID3 (Secuencia nº 52).
\vskip1.000000\baselineskip
La biomasa obtenida a partir de la cepa de E.
coli, transformada con pID3 y cultivada a 37ºC, se rompió
mediante prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo en dos
formas: soluble e insoluble. La proteína asociada a la fracción
insoluble, se extrajo usando urea 6 M, y el sobrenandante, que
contenía la proteína PID3, se cargó en una columna
G-25 para eliminar el agente caotrópico. La fracción
obtenida se cargó entonces en una columna con sefarosa FF y
quelante (Pharmacia, UK), en presencia de iones Cu^{++}. La
columna se lavó con Imidazol 45 mM y la proteína se eluyó con
Imidazol 200 mM. Finalmente, la fracción pura se cargó en una
columna G-25, para obtener finalmente la proteína en
el tampón de formulación (PBS). Esta preparación se utilizó para
estudios inmunológi-
cos.
cos.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción purificada de PID3 se caracterizó
tanto por su reconocimiento por distintos anticuerpos monoclonales
de roedor y/o policlonales de suero, como por el suero humano
positivo para el Dengue (tabla 56).
Los reconocimientos más elevados en dot blotting
se obtuvieron con el HMAF
anti-DEN-4. El reconocimiento
mediante HMAF contra los otros serotipos fue menor que en el caso
del serotipo 4. Los anticuerpos generados por otros flavivirus como
el virus de la Fiebre Amarilla y el virus de la Encefalitis de San
Luis, no tuvieron ningún tipo de reconocimiento. Finalmente, se
midió la reactividad contra tres sueros humanos con altos títulos y
tres con bajos títulos, contra DEN-4, consiguiendo
una señal sustancial en ambos casos, mediante Western blotting y
dot
blotting.
blotting.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se inmunizó intraperitonealmente a un total de
25 ratones Balb/c, con 20 \mug de PID3 purificada en adyuvante de
Freund; se le sacó sangre a 10 animales tras cuatro dosificaciones,
y se evaluó el anti-DEN mediante ELISA. Se
obtuvieron altos títulos de anticuerpos contra DEN-4
aunque no se obtuvo reactividad contra el resto de los serotipos
(tabla 57 y tabla 60). Adicionalmente, se realizó el ensayo de
inhibición de la hemaglutinación (HI), y solo se encontraron
títulos positivos contra DEN-4 (tabla 58 y tabla
60). Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in
vitro, y se obtuvieron los títulos de neutralización contra
DEN-1 del orden de 1:1280 (tabla 59). No se
encontró neutralización de la infección viral contra el resto de los
serotipos (tabla 60).
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.4cm
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos que codifica para
los aminoácidos desde el 286 hasta el 426 de la proteína E del
virus DEN-4 (Sec. Nº 46) fue amplificada con los
oligonucleótidos identificados en la lista de secuencias como
Secuencia nº 16 y Secuencia nº 21, a partir del genotipo de la cepa
del virus DEN-4 (Zhao B., Mackow E.E.,
Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai
C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4
viral DNA sequences: Análisis of genes coding for structural
proteins. Virology 1986. 155:77-88).
El vector se creó mediante digestión del
plásmido pLL3 con XbaI/XbaI, que contiene el gen MDH mas una
secuencia de 6 histidinas en la región 3' del gen, y la secuencia
del fragmento E del DEN-2 en el final 3'. Como
resultado, se obtuvieron dos regiones de la proteína E de los
serotipos 2 y 4, fusionados con el mismo gen MDH. Tras el
ligamiento, se analizaron los recombinantes potenciales mediante
digestión con enzima de restricción, y se secuenciaron clones
positivos para chequear las uniones. Las células competentes MM294
fueron transformadas con el clon seleccionado, llamado pD4D2 (Fig.
13 y Secuencia nº 53). Tras el cultivo de la colonia en medio LB,
se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Como
resultado se obtuvo una banda de 110 kDa, que contó para el 20% de
las proteínas celulares totales. El tamaño de la proteína obtenida
se correspondió con la suma de la proteína MDH y del fragmento de
proteína DENe del virus Dengue. La proteína se reconoció en
Inmunobloting mediante anticuerpos policlonales (AP)
anti-DEN-2 y
anti-DEN-4 contenidos en un HMAF.
Esta proteína se denominó PD4D2 (Secuencia
nº 54).
nº 54).
La biomasa obtenida a partir de la cepa de E.
coli, transformada con pD4D2 y cultivada a 37ºC, se rompió
mediante prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo en
forma insoluble y en forma soluble. A partir del sedimento, se
extrajo la proteína con urea 6 M, y se cargó el sobrenandante, que
contenía la proteína PD2D4, en una columna G-25
para eliminar el agente caotrópico. La fracción obtenida se cargó
entonces en una columna con sefarosa FF y quelante (Pharmacia, UK),
en presencia de iones Cu^{++}. Se realizó un lavado con Imidazol
30 mM, y la proteína se eluyó con Imidazol 250 mM. Finalmente, la
preparación pura se cargó en una columna G-25, para
obtener la proteína en el tampón de formulación (PBS), y se usó en
estudios inmunológicos.
La fracción purificada de PD4D2 se caracterizó
tanto por su reconocimiento por distintos anticuerpos monoclonales
de roedor y/o policlonales de suero, como por el suero humano
positivo para el Dengue (tabla 61).
Los reconocimientos más elevados en dot blotting
se obtuvieron con el HMAF anti-DEN-4
y anti-DEN-2. El reconocimiento de
los otros dos serotipos fue menor que en el caso de los serotipos 2
y 4. Los anticuerpos generados por otros flavivirus como el virus
de la Fiebre Amarilla y el virus de la Encefalitis de San Luis, no
tuvieron ningún tipo de reconocimiento. Por otro lado, el
anticuerpo Mab 3H5 tuvo reactividad, similar a la obtenida para
PLL2 y PLL3. Finalmente, se midió la reactividad frente a sueros
humanos con altos y bajos títulos, contra DEN-2 y
DEN-4, consiguiendo una señal sustancial en ambos
casos, mediante Western blotting y dot blotting.
Se inmunizó intraperitonealmente a un total de
25 ratones Balb/c, con 35 \mug de PD4D2 purificada en adyuvante
de Freund; se le sacó sangre a 10 animales tras cuatro
dosificaciones, y se evaluó el anti-DEN mediante
ELISA. Se obtuvieron altos títulos de anticuerpos contra
DEN-2 y DNE-4, aunque no se obtuvo
reactividad contra el resto de los serotipos (tabla 62 y tabla 65).
Adicionalmente, se realizó el ensayo de inhibición de la
hemaglutinación (HIA), y solo se encontraron títulos positivos
contra DEN-2 y DEN-4 (tabla 63 y
tabla 65). Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización in
vitro, y se obtuvieron los títulos de neutralización contra
DEN-4 del orden de > 1:1280 y contra
DEN-2 del orden de > 1:1280 (tabla 64). Sin
embargo, no se encontró neutralización de la infección viral contra
el resto de los serotipos (tabla 65).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para la evaluación de la protección conferida a
los ratones inmunizados con todas las variantes analizadas en el
enfrentamiento con el DEN homólogo letal, se usaron 15 ratones de
cada grupo. Cada animal recibió una dosis de 100 LD_{50} de DEN
letal, mediante inoculación intracraneal, y se les observó durante
21 días para realizar un estudio sobre el porcentaje de letalidad.
Como controles positivos, se usaron grupos de 15 ratones
inmunizados con las cuatro preparaciones virales
(DEN-1, DEN-2, DEN-3
y DEN-4). Todos los ratones de esos grupos control
sobrevivieron, mientras que los ratones de los grupos control
negativos contrajeron la enfermedad entre 7-11 días
después del enfrentamiento; llegando así al 100% de mortalidad.
Finalmente, los grupos inmunizados con las proteínas de fusión bajo
estudio tuvieron entre 80% y 100% de protección, y en todos los
casos se encontraron diferencias significativas con respecto al
grupo control (tabla 66).
Se sacrificaron animales de distintos grupos
inmunizados con las proteínas quiméricas que contenían el fragmento
E de DEN-2 (PLL1, PLL2 y PLL3), y de un grupo
placebo, 15 días después de la última dosificación. Después, se
extrajo el bazo de los animales, y se estudió la respuesta
linfoproliferativa con los cuatro serotipos del virus Dengue. La
tabla 67 muestra los resultados obtenidos de los índices de
estimulación, lo que demuestra que se alcanzó una respuesta
específica para el serotipo.
<110> CENTRO PARA LA INGENIERÍA GENÉTICA Y
BIOTECNOLOGÍA
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CADENAS QUIMÉRICAS CODIFICANTES PARA
PROTEÍNAS INDUCTORAS DE EFECTOS CONTRA VIRUS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Dengue
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Xba-I para la amplificación del fragmento
DENe-2
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttctagaca ggctgcgcat ggaca
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
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<223> Secuencia del cebador
Bam-HI para la amplificación del fragmento
DENe-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggatcctt accctcccag gcttccaaa
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
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<223> Secuencia del cebador
Eco-RI para la amplificación del fragmento
DENe-2
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgaattcac gcctcccaga gatcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<220>
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<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Bam-HI para la amplificación del fragmento
DENe-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttggatcca ggctgagaat g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Escherichia coli
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Bam-HI para la amplificación del fragmento
DENe-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggatcctt aaccacccag agacccaaaa t
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Xba-I para la amplificación del fragmento
DENe-1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipcttctagaca ggctcaaaat ggata
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Bam-HI para la amplificación del fragmento
DENe-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggatcctt acccgccaat agaaccga
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Eco-RI para la amplificación del fragmento
DENe-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgaattcac ccctcctata gatcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Bam-HI para la amplificación del fragmento
DENe-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaccttgga tccagactaa aaat
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Bam-HI para la amplificación del fragmento
DENe-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggatccgt gaattaccca cctata
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Xba-I para la amplificación del fragmento
DENe-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttctgata gactcaagat ggacaaatt
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Bam-HI para la amplificación del fragmento
DENe-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggatcctt aaccacccac tgaaccaa
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Eco-RI para la amplificación del fragmento
DENe-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagaattcac accacccaca gatcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Bam-HI para la amplificación del fragmento
DENe-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacttaggatc cagactcaag atg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Bam-HI para la amplificación del fragmento
DENe-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggatcctt aaccacccac tgaacc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Xba-I para la amplificación del fragmento
DENe-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcctagaca aagtgcgtat ggagaaattg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Bam-HI para la amplificación del fragmento
DENe-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggatcctt aaccaccaac agaaccaa
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Eco-RI para la amplificación del fragmento
DENe-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgaattcag tccaccaacg ctacc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Bam-HI para la amplificación del fragmento
DENe-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccatctag gatccaaagt gcgtatg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Bam-HI para la amplificación del fragmento
DENe-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggatcctt agccaccaac agaaccaa
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Unión a cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del cebador
Xba-I para la amplificación del fragmento
DENe-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattctagaag accaccaacg gaacca
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 429
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(426)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos codificante
para los aminoácidos 286 a 426 de la proteína de envoltura
DEN-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(168)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucelótidos codificante
para los primeros 45 aminoácidos de la MDH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 603
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(603)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos codificante
para la proteína quimérica en el plásmido pLL1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(195)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
proteína PLL1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1851
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1851)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos de la MDH
en el plásmido pM84 His de la proteína PLL1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2253
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2253)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos de la
proteína quimérica en el plásmido pLL2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 748
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(748)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
PLL2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1821
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1821)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos de la MDH
en el plásmido pD4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2259
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2259)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos
codificantes para la proteína quimérica en el plásmido pLL3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 745
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(745)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de pLL3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 429
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(429)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos
codificantes para los aminoácidos 286 a 426 de la proteína de
envoltura DEN-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 615
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(615)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos
codificantes para la proteína quimérica en el plásmido pLH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(174)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de PLH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2253
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2253)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos
codificantes para la proteína quimérica en el plásmido pLH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 727
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(727)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
pLH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2250
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2250)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos codificante
para la proteína quimérica en el plásmido pLH3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 724
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(724)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de de aminoácidos de
PLH3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 426
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(426)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos codificante
para los aminoácidos 286 a 426 de la proteína de envoltura
DEN-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 615
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(615)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos codificante
para la proteína quimérica en el plásmido pAZ1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(194)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
proteína PAZ1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2253
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2253)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos codificante
para la proteína quimérica en el plásmido pAZ2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 747
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(747)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
PAZ2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2256
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2256)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos codificante
para la proteína quimérica en el plásmido pAZ3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 744
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(744)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
PAZ3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 426
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(426)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos codificante
para los aminoácidos 286 a 426 de la proteína de envuelta
DEN-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 615
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(615)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos codificante
para la proteína quimérica en el plásmido pID1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(192)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
PID1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2241)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos codificante
para la proteína quimérica en el plásmido pID2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 747
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(748)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
PID2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2256
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2256)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos codificante
para la proteína quimérica en el plásmido pID3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 744
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(744)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de PID3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2694
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2694)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos codificante
para la proteína quimérica en el plásmido pD4D2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 891
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(891)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
PD4D2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
Claims (36)
1. Un ácido nucleico quimérico que
comprende al menos una secuencia de nucleótidos codificante para un
fragmento de la proteína E de un Flavivirus, y una secuencia de
nucleótidos con Id. Sec. Nº: 26 o Id. Sec. Nº: 29, codificantes
para una proteína mutante Neisseria meningitidis
Deshidrogenasa (MDH), o una secuencia de nucleótidos con Id. Sec.
Nº: 23 codificante para un fragmento de dicha proteína MDH, en el
que dicho ácido nucleico quimérico codifica para una proteína
quimérica que es capaz de inducir en un receptor, una respuesta
humoral inmune de anticuerpos neutralizantes y protectores contra el
Flavivirus.
2. Un ácido nucleico quimérico de
acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha secuencia de
nucleótidos codificante para un fragmento de la proteína E de un
Flavivirus, es una secuencia de nucleótidos codificante para los
aminoácidos nº 286 a 426 de la proteína E de serotipos 1, 2, 3 y/o 4
del virus Dengue, y en la que dicho ácido nucleico quimérico
codifica para una proteína quimérica que es capaz de inducir en un
receptor, una respuesta inmune humoral específica para el serotipo,
de anticuerpos neutralizantes y protectores contra dicho
serotipo(s) del virus Dengue.
3. Un ácido nucleico quimérico de
acuerdo con las Reivindicaciones 1 y 2, que comprende una secuencia
de nucleótidos codificante para los aminoácidos 286 a 426 de la
proteína E de serotipos 1, 2, 3 y/o 4 del virus Dengue, fusionado
con el final 3' de una secuencia de nucleótidos Id. Sec. Nº: 23
codificante para los primeros 45 aminoácidos de la proteína
MDH.
4. Un ácido nucleico quimérico de
acuerdo con las Reivindicaciones 1 y 2, que comprende una secuencia
de nucleótidos codificante para los aminoácidos 286 a 426 de la
proteína E de serotipos 1, 2, 3 y/o 4 del virus Dengue, insertado
en una región codificante para el aminoácido nº 45, en una secuencia
de nucleótidos con Id. Sec. Nº: 26 codificante para la proteína
MDH.
5. Un ácido nucleico quimérico de
acuerdo con las Reivindicaciones 1 y 2, que comprende una secuencia
de nucleótidos codificante para los aminoácidos 286 a 426 de la
proteína E de serotipos 1, 2, 3 y/o 4 del virus Dengue, fusionado
con el final 3' de una secuencia de nucleótidos con Id. Sec. Nº: 29
codificante para la proteína MDH.
6. Un ácido nucleico quimérico de
acuerdo con las Reivindicaciones 1 y 2, que comprende una secuencia
de nucleótidos codificante para los aminoácidos 286 a 426 de la
proteína E de dos serotipos distintos del virus Dengue, en el que
una de dichas secuencias de nucleótidos se inserta en una región
codificante para el aminoácido nº 45 en una secuencia de
nucleótidos con Id. Sec. Nº: 29 codificante para la proteína MDH,
y la otra secuencia de nucleótidos se fusiona con el final 3' de
dicha secuencia de nucleótidos con Id. Sec. Nº: 29.
7. Una proteína quimérica recombinante
que es el producto de la expresión de un ácido nucleico quimérico
tal como el definido en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a
6, y que es capaz de inducir en un receptor, una respuesta inmune
humoral específica para el serotipo, de anticuerpos neutralizantes y
protectores contra el virus Dengue.
8. Una proteína quimérica recombinante
que es el producto de la expresión de un ácido nucleico quimérico
tal como el definido en la Reivindicación 6, y que es capaz de
inducir en un receptor, una respuesta inmune humoral, de
anticuerpos neutralizantes y protectores contra dos serotipos
específicos del virus Dengue.
9. Un ácido nucleico quimérico con Id.
Sec. Nº: 24, de acuerdo con las Reivindicaciones 1, 2 y 3, que
comprende las secuencias con Id. Sec. Nº: 22 e Id. Sec. Nº: 23, y
que codifica para la proteína quimérica PLL1.
10. Una proteína quimérica PLL1 de acuerdo
con la Reivindicación 7, que tiene la secuencia de aminoácidos con
Id. Sec. Nº: 25, que es el producto de la expresión de la Id. Sec.
Nº: 24, y que es capaz de inducir en un receptor una respuesta
inmune humoral de anticuerpos neutralizantes y protectores contra el
virus Dengue-2.
11. Un ácido nucleico quimérico con Id.
Sec. Nº: 27, de acuerdo con las Reivindicaciones 1, 2 y 4, que
comprende las secuencias con Id. Sec. Nº: 22 e Id. Sec. Nº: 26, y
que codifica para la proteína quimérica PLL2.
12. Una proteína quimérica PLL2 de acuerdo
con la Reivindicación 7, que tiene la secuencia de aminoácidos con
Id. Sec. Nº: 28, que es el producto de la expresión de la Id. Sec.
Nº: 27, y que es capaz de inducir en un receptor una respuesta
inmune humoral de anticuerpos neutralizantes y protectores contra el
virus Dengue-2.
13. Un ácido nucleico quimérico con Id.
Sec. Nº: 30, de acuerdo con las Reivindicaciones 1, 2 y 5, que
comprende las secuencias con Id. Sec. Nº: 22 e Id. Sec. Nº: 29, y
que codifica para la proteína quimérica PLL3.
14. Una proteína quimérica PLL3 de acuerdo
con la Reivindicación 7, que tiene la secuencia de aminoácidos con
Id. Sec. Nº: 31, que es el producto de la expresión de la Id. Sec.
Nº: 30, y que es capaz de inducir en un receptor una respuesta
inmune humoral de anticuerpos neutralizantes y protectores contra el
virus Dengue-2.
15. Un ácido nucleico quimérico con Id.
Sec. Nº: 33, de acuerdo con las Reivindicaciones 1, 2 y 3, que
comprende las secuencias con Id. Sec. Nº: 32 e Id. Sec. Nº: 23, y
que codifica para la proteína quimérica PLH1.
16. Una proteína quimérica PLH1 de acuerdo
con la Reivindicación 7, que tiene la secuencia de aminoácidos con
Id. Sec. Nº: 34, que es el producto de la expresión de la Id. Sec.
Nº: 33, y que es capaz de inducir en un receptor una respuesta
inmune humoral de anticuerpos neutralizantes y protectores contra el
virus Dengue-1.
17. Un ácido nucleico quimérico con Id.
Sec. Nº: 35, de acuerdo con las Reivindicaciones 1, 2 y 4, que
comprende las secuencias con Id. Sec. Nº: 32 e Id. Sec. Nº: 26, y
que codifica para la proteína quimérica PLH2.
18. Una proteína quimérica PLH2 de acuerdo
con la Reivindicación 7, que tiene la secuencia de aminoácidos con
Id. Sec. Nº: 36, que es el producto de la expresión de la Id. Sec.
Nº: 35, y que es capaz de inducir en un receptor una respuesta
inmune humoral de anticuerpos neutralizantes y protectores contra el
virus Dengue-1.
19. Un ácido nucleico quimérico con Id.
Sec. Nº: 37, de acuerdo con las Reivindicaciones 1, 2 y 5, que
comprende las secuencias con Id. Sec. Nº: 32 e Id. Sec. Nº: 29, y
que codifica para la proteína quimérica PLH3.
20. Una proteína quimérica PLH3 de acuerdo
con la Reivindicación 7, que tiene la secuencia de aminoácidos con
Id. Sec. Nº: 38, que es el producto de la expresión de la Id. Sec.
Nº: 37, y que es capaz de inducir en un receptor una respuesta
inmune humoral de anticuerpos neutralizantes y protectores contra el
virus Dengue-1.
21. Un ácido nucleico quimérico con Id.
Sec. Nº: 40, de acuerdo con las Reivindicaciones 1, 2 y 3, que
comprende las secuencias con Id. Sec. Nº: 39 e Id. Sec. Nº: 23, y
que codifica para la proteína quimérica PAZ1.
22. Una proteína quimérica PAZ1 de acuerdo
con la Reivindicación 7, que tiene la secuencia de aminoácidos con
Id. Sec. Nº: 41, que es el producto de la expresión de la Id. Sec.
Nº: 40, y que es capaz de inducir en un receptor una respuesta
inmune humoral de anticuerpos neutralizantes y protectores contra el
virus Dengue-3.
23. Un ácido nucleico quimérico con Id.
Sec. Nº: 42, de acuerdo con las Reivindicaciones 1, 2 y 4, que
comprende las secuencias con Id. Sec. Nº: 39 e Id. Sec. Nº: 26, y
que codifica para la proteína quimérica PAZ2.
24. Una proteína quimérica PAZ2 de acuerdo
con la Reivindicación 7, que tiene la secuencia de aminoácidos con
Id. Sec. Nº: 43, que es el producto de la expresión de la Id. Sec.
Nº: 42, y que es capaz de inducir en un receptor una respuesta
inmune humoral de anticuerpos neutralizantes y protectores contra el
virus Dengue-3.
25. Un ácido nucleico quimérico con Id.
Sec. Nº: 44, de acuerdo con las Reivindicaciones 1, 2 y 5, que
comprende las secuencias con Id. Sec. Nº: 39 e Id. Sec. Nº: 29, y
que codifica para la proteína quimérica PAZ3.
26. Una proteína quimérica PAZ3 de acuerdo
con la Reivindicación 7, que tiene la secuencia de aminoácidos con
Id. Sec. Nº: 45, que es el producto de la expresión de la Id. Sec.
Nº: 44, y que es capaz de inducir en un receptor una respuesta
inmune humoral de anticuerpos neutralizantes y protectores contra el
virus Dengue-3.
27. Un ácido nucleico quimérico con Id.
Sec. Nº: 47, de acuerdo con las Reivindicaciones 1, 2 y 3, que
comprende las secuencias con Id. Sec. Nº: 46 e Id. Sec. Nº: 23, y
que codifica para la proteína quimérica PID1.
28. Una proteína quimérica PID1 de acuerdo
con la Reivindicación 7, que tiene la secuencia de aminoácidos con
Id. Sec. Nº: 48, que es el producto de la expresión de la Id. Sec.
Nº: 47, y que es capaz de inducir en un receptor una respuesta
inmune humoral de anticuerpos neutralizantes y protectores contra el
virus Dengue-4.
29. Un ácido nucleico quimérico con Id.
Sec. Nº: 49, de acuerdo con las Reivindicaciones 1, 2 y 4, que
comprende las secuencias con Id. Sec. Nº: 46 e Id. Sec. Nº: 26, y
que codifica para la proteína quimérica PID2.
30. Una proteína quimérica PID2 de acuerdo
con la Reivindicación 7, que tiene la secuencia de aminoácidos con
Id. Sec. Nº: 50, que es el producto de la expresión de la Id. Sec.
Nº: 49, y que es capaz de inducir en un receptor una respuesta
inmune humoral de anticuerpos neutralizantes y protectores contra el
virus Dengue-4.
31. Un ácido nucleico quimérico con Id.
Sec. Nº: 51, de acuerdo con las Reivindicaciones 1, 2 y 5, que
comprende las secuencias con Id. Sec. Nº: 46 e Id. Sec. Nº: 29, y
que codifica para la proteína quimérica PID3.
32. Una proteína quimérica PID3 de acuerdo
con la Reivindicación 7, que tiene la secuencia de aminoácidos con
Id. Sec. Nº: 52, que es el producto de la expresión de la Id. Sec.
Nº: 51, y que es capaz de inducir en un receptor una respuesta
inmune humoral de anticuerpos neutralizantes y protectores contra el
virus Dengue-4.
33. Una composición farmacéutica capaz de
inducir en un receptor una respuesta inmune protectora específica
contra el virus Dengue, que comprende una proteína quimérica tal
como la definida en las Reivindicaciones 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18,
20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32, y un vehículo farmacéutico.
34. Una composición farmacéutica capaz de
inducir en un receptor una respuesta inmune protectora específica
contra el virus Dengue, que comprende dos o más proteínas quiméricas
tal como las definidas en las Reivindicaciones 7, 8, 10, 12, 14,
16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32, y un vehículo farmacéutico.
35. Una composición farmacéutica de acuerdo
con la Reivindicación 33, que es eficaz como agente preventivo o
terapéutico contra los virus Dengue, para su uso oral,
intramuscular, subcutáneo, intravenoso o por mucosa.
36. Un reactivo de diagnóstico que
comprende una o más proteínas tales como las definidas en las
Reivindicaciones 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y
32, útil para la diagnosis y el serotipado del virus Dengue.
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