JP4417712B2 - ウイルスに対する作用を誘導するタンパク質をコードするキメラ鎖 - Google Patents
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Description
本発明は、バイオテクノロジーと医薬品産業の分野に関し、特に発現ベクター中に導入された時、デング熱ウイルス(Dengue virus)(以後DENと呼ぶ)感染に対する血清型特異的(serotype-specific)体液性免疫応答と防御とを誘発し、このタイプの病理で言及される出血と臨床的合併症を引き起こす血清型特異的ウイルス免疫増幅の影響を避けることができるタンパク質を生成する、キメラヌクレオチド鎖を得ることに関する。
デング熱ウイルス(DEN)は、その脂質膜が3つの構造タンパク質のうちの2つ(エンベロープタンパク質(E)と膜タンパク質(M))を含有する被覆されたウイルスである。Eタンパク質は、第3の構造タンパク質(コアタンパク質)からなるイコサエドリック(icosaedric)ヌクレオカプシドをカバーする。このウイルスは、フラビウイルス(Flaviviridae)科に属し、4つの異なる血清型が存在する。ヒトへの伝搬は、ステゴミア(Stegomia)科に属する蚊ネッタイシマカ(Aedes aegypti)により行われる。このウイルスについてヒトで発生する疾患は、出血熱とショックを特徴とするより重症の、時に致死的な疾患(出血性デング熱とデングショック症候群(HDF/DSS)と呼ぶ)(Hammon WMc、フィリピンとタイにおける小児の新しい出血熱、Trans Assoc Physicians 1960:73:140-155)が出現するまでは、良性であると考えられ、デング熱または古典的デング(DF)と言われた。いくつかの疫学的研究が行われ、危険因子として、2つの異なるウイルス血清型の連続的感染を証明している(Kouri GP、Guzman MG、Brave JR、なぜキューバでデング出血熱:完全な分析。Tans Roy Soc Trop Med Hyg 1987;72:821-823)。この現象は、免疫増強により説明され、これは、標的細胞(単球)のFc 受容体を介する細胞へのウイルス−抗体複合体の侵入を増加させることによる、ウイルス感染の増加に基づく(halstead SB、デングの病理:分子生物学の課題、Science 1988;239:476-481)。
発現ベクター中に導入された時、血清型特異的体液性免疫応答を誘導することができ、かつデング熱ウイルスによる感染に対して防御することができるキメラヌクレオチド鎖を得ることが本発明に記載され、例えば髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)からの脱水素酵素活性を有する変異タンパク質(MDH)のN末端断片に連結したデング熱ウイルスのウイルス血清型の各1つからのDENeタンパク質の領域をコードする配列;第2のケースでは、2つの異なる位置でMDHタンパク質の全遺伝子に連結したDENeタンパク質の領域をコードする配列;MDHタンパク質の構造ドメインをコードする配列の1つの部位(リポ酸結合ドメインと遺伝子の3’末端)内、および第3のケースでは、キメラ配列は、MDH遺伝子の2つの異なる位置の2つの異なるウイルス血清型(DEN−2とDEN−4)からのDENeタンパク質の2つの断片により形成される:1つは、リポ酸結合ドメインをコードする配列の特定の部位内(血清型4)、そして他の1つはMDH遺伝子の3’末端内(血清型2)。これをダイマー構築体と呼んだ。
抗原性結果を分析すると、超免疫腹水液(HMAF)抗DENに対するすべての組換えキメラタンパク質の強い認識が証明され、全MDH遺伝子への融合の場合に高く、これは、MDHにより与えられるDENeタンパク質からの領域の折り畳みへの陽性の作用を証明している。血清型2を使用した場合には、得られたすべての組換えタンパク質は、血清型特異的中和抗体(3H5)により認識され、これも全MDH遺伝子への融合ならびにダイマータンパク質の場合に高かった。また、各場合に同種血清型からのHMAFに対する認識は、異種血清型からのHMAFに対する認識より有意に高く、血清型特異的エピトープの暴露を証明し、従ってデングの診断手段および血清型判定としての使用を可能にする。
さらに、キメラタンパク質の1つのみで免疫した後の2つのウイルス血清型に対する抗体の誘導が証明され、これは、我々の利用可能な組換えキメラタンパク質の2つのみを使用して、4つの血清型に対するワクチン候補の調製を可能にする。
一対のプライマーを用いるPCRによりタンパク質のN末端領域(lpdA遺伝子の開始コドンからリポ酸結合部位まで、135bp)およびC末端(リポ酸結合部位から遺伝子の3’末端まで)を増幅して、突然変異誘発を行い、こうしてヒトの臨床治験で証明されるように、自己免疫反応が生じる可能性を排除した。
プラスミドPLL1、PLL2、PLL3、PLH1、PLH2、PLH3、PAZ1、PAZ2、PAZ3、PlD1、PlD2、およびPlD3を、ブダペスト条約に従って、ベルギーの微生物保存機関(Belgian Coordinated collection of Microorganism − BCCM(登録商標)、LMBP−COLLECTION)に、日付と受け入れ番号(未決定)で寄託した。
実施例1.PLL1の入手
DEN−2ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号22)を、DEN−2ウイルス株遺伝子型ジャマイカ(Jamaica)(Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W.、デング2型ウイルス、ジャマイカ遺伝子型の非構造タンパク質のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列:完全長ゲノムの比較分析、Virology 1988, 165:234-244)からの配列1と配列2として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM108 HisプラスミドをXbaI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHのN末端領域と6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列23)。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分(junction)をチェックした。選択したクローン(pLL1と呼ぶ、図1と配列番号24)を用いて、コンピタントな細胞W3110(Hill C.W., Harnish B.W. 1982、大腸菌(E. coli)における重複rRNA遺伝子により結合した染色体セグメントの転位、J. Bacteriol. 149:449-457)を形質転換した。ルリアベルタニ(Luria Bertani)(LB)培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果25kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の10%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質のN末端領域とDEN−2ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAFに含有されるポリクローナル抗体(PA)抗DEN−2による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をPLL1と命名した(配列番号25)。
PLL1で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、6M尿素でタンパク質を抽出し、上清(PLL1タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。50mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をG−25カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液(100mM NaCl、2mM KCl2、10mM Na2HPO4、pH7.2、1mM KH2PO4)(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
PLL1の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表1)。
* 全部で10μgの精製PLL1を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
全部で25匹のBalb/cマウスを、35μgのフロイントアジュバント中の精製PLL1で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−2に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表2と表5)。さらに、血球凝集阻害測定(HIA)を行い、陽性力価はDEN−2に対してのみ見いだされた(表3と表5)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−2に対して中和力価1:320が得られた。しかし、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表4と表5)。これらの結果は、PLL1に誘発された抗体の高い血清型特異性を示す。
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
DEN−2ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号22)を、DEN−2ウイルス株遺伝子型ジャマイカ(Jamaica)(Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W.、デング2型ウイルス、ジャマイカ遺伝子型の非構造タンパク質のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列:完全長ゲノムの比較分析、Virology 1988, 165:234-244)からの配列1と配列3として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
PLL2で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。可溶性画分から、あらかじめCu++イオンを結合させたキレート−セファロースFFカラムを使用して、金属イオン親和性クロマトグラフィーを行った。15mMイミダゾールでカラムを洗浄し、100mM イミダゾールでタンパク質を抽出した。一方、不溶性画分に結合したタンパク質は、8M尿素を使用して抽出し、上清(PLL2タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。100mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、各型のタンパク質の純粋な画分をG−25カラムにのせて、調製緩衝液(100mM NaCl、2mM KCl2、10mM Na2HPO4、pH7.2、1mM KH2PO4)(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
PLL2の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表6)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−2で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型2の場合より、低下する順序で小さかった:DEN−1、DEN−3およびDEN−4。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。しかし、Mab 3H5に関連して、ドットブロットおよびウェスタンブロットにより大きな反応性が観察された(PLL1で得られたものより大きい)。PLL1の結果とは反対に、還元剤が試料中に存在する時Mab 3H5による認識は同じであり、両方のタンパク質間のコンフォメーションの差の可能性を示している。最後に、DEN−2に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
* 全部で10μgの精製PLL2を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
全部で25匹のBalb/cマウスを、35μgのフロイントアジュバント中の精製PLL2で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−2に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表7と表10)。さらに、血球凝集阻害測定(HIA)を行い、陽性力価はDEN−2に対してのみ見いだされた(表8と表10)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−2に対して中和力価1:1280が得られた。PLL1を用いて得られた結果と同様に、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表9と表10)。一方、両方のPLL2変種で得られた結果は同様であり、タンパク質の溶解性状態は、機能性抗体を生成する能力に影響を与えないことを示す。
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
DEN−2ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号22)を、DEN−2ウイルス株遺伝子型ジャマイカ(Jamaica)(Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W.、デング2型ウイルス、ジャマイカ遺伝子型の非構造タンパク質のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列:完全長ゲノムの比較分析、Virology 1988, 165:234-244)からの配列4と配列5として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pD4プラスミドをBamHI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHタンパク質と停止コドンの無い6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列29)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質のC末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pLL3と呼ぶ、図3と配列番号30)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−2ウイルスからのDENeタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、HMAF1 抗DEN−2による免疫ブロッティングで認識され、PLL3と命名した(配列番号31)。
PLL2で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分から、6M尿素を使用してタンパク質を抽出し、上清(PLL3タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。30mMイミダゾールで洗浄し、タンパク質を100mMイミダゾールで溶出した。最後に、タンパク質の純粋な画分をG−25カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
PLL3の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表11)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−2で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型2の場合より、低下する順序で小さかった:DEN−1、DEN−3およびDEN−4。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。しかし、Mab 3H5に関連して、ドットブロットおよびウェスタンブロットにより大きな反応性が観察された(PLL2で得られたものより大きい)。PLL1の結果とは反対に、還元剤が試料中に存在する時Mab 3H5による認識は同じであり、両方のタンパク質間のコンフォメーションの差の可能性を示している。最後に、DEN−2に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。これらの結果は、PLL2で得られたものと同様であった。
* 全部で10μgの精製PLL3を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
全部で25匹のBalb/cマウスを、35μgのフロイントアジュバント中の精製PLL3で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−2に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表12と表15)。さらに、血球凝集阻害(HI)測定を行い、陽性力価はDEN−2に対してのみ見いだされた(表13と表15)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−2に対して中和力価1:1280が得られた(表14)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表15)。3つの試験を使用して、高レベルの血清型特異的抗体が検出され、PLL2タンパク質で免疫した後に得られたものと同様であった。
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
DEN−1ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号32)を、DEN−1ウイルス株遺伝子型(Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.、デング1ウイルス株の構造タンパク質遺伝子間の遺伝的関連性、J. Gen. Virol. 1989, 70:1701-1712)からの配列6と配列7として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM108プラスミドをXbaI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHのN末端領域と6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列23)。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pLH1と呼ぶ、図4と配列番号33)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。ルリアベルタニ(Luria Bertani)(LB)培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果25kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の10%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質のN末端領域とDEN−1ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAFに含有されるポリクローナル抗体(PA)抗DEN−1による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をPLH1と命名した(配列番号34)。
pLH1で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、7M尿素でタンパク質を抽出し、上清(PLH1タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。60mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をG−25カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
PLH1の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表16)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−1で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型1の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−1に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
* 全部で10μgの精製PLH1を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
全部で25匹のBalb/cマウスを、35μgのフロイントアジュバント中の精製PLL1で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−1に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表17と表20)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−1に対してのみ見いだされた(表18と表20)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−1に対して中和力価1:320が得られた。しかし、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表19と表20)。これらの結果は、PLL1に誘発された抗体の高い血清型特異性を示す。
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
DEN−1ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号32)を、DEN−1ウイルス株(Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.、デング1ウイルス株の構造タンパク質遺伝子間の遺伝的関連性、J. Gen. Virol. 1989, 70:1701-1712)からの配列6と配列8として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM84 HisプラスミドをXbaI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHのN末端領域と6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列26)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pLH2と呼ぶ、図5と配列番号35)を用いて、コンピタントな細胞MM294を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−1ウイルスからのDENeタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、HMAF抗DEN−1による免疫ブロッティングで認識され、このタンパク質をPLH2と命名した(配列番号36)。
PLL2で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分に結合したタンパク質を、7M尿素を使用して抽出し、上清(PLH2タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。40mMイミダゾールでカラムを洗浄し、100mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をG−25カラムにのせて、調製物を調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
PLH2の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表21)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−1で得られた(PLH1で得られたものより高い)。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型1の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−1に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
* 全部で10μgの精製PLH2を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PLH2で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−1に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表22と表25)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−1に対してのみ見いだされた(表23と表25)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−1に対して中和力価1:1280が得られた(表24)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表25)。
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
DEN−1ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号32)を、DEN−1ウイルス株(Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.、デング1ウイルス株の構造タンパク質遺伝子間の遺伝的関連性、J. Gen. Virol. 1989, 70:1701-1712)からの配列9と配列10として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pD4プラスミドをBamHI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHタンパク質をコードするヌクレオチド配列と停止コドンの無い6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列29)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質のC末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pLH3と呼ぶ、図6と配列番号37)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−1ウイルスからのDENeタンパク質断片のサイズの合計に対応した。このタンパク質は、HMAF 抗DEN−1による免疫ブロッティングで認識され、PLH3と命名した(配列番号38)。
pLH3で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分から、6M尿素を使用してタンパク質を抽出し、上清(PLH3タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。30mMイミダゾールで洗浄し、タンパク質を250mMイミダゾールで溶出した。最後に、タンパク質の純粋な画分をG−25カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
PLH3の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表26)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−1で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型1の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−1に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
* 全部で10μgの精製PLH3を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PLH3で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−1に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表27と表30)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−1に対してのみ見いだされた(表28と表30)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−1に対して中和力価1:1280が得られた(表29)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表30)。
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
DEN−3ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号39)を、DEN−3ウイルス株遺伝子型(Osatomi K., Sumiyoshi H. デング3型ウイルスゲノムRNAの完全なヌクレオチド配列、Virology 1990, 176(2):643-647)からの配列11と配列12として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM108 HisプラスミドをXbaI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHのN末端領域と6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列23)。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pAZ1と呼ぶ、図7と配列番号40)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。ルリアベルタニ(Luria Bertani)(LB)培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果25kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の10%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質のN末端領域とDEN−3ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAFに含有されるポリクローナル抗体(PA)抗DEN−3による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をPAZ1と命名した(配列番号41)。
pAZ1で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、7M尿素でタンパク質を抽出し、上清(PLH1タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。60mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をG−25カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
PAZ1の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表31)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−3で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型3の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−3に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
* 全部で10μgの精製PAZ1を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
全部で25匹のBalb/cマウスを、35μgのフロイントアジュバント中の精製PAZ1で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−1に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表32と表35)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−3に対してのみ見いだされた(表33と表35)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−3に対して中和力価1:320が得られた。しかし、残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表34と表35)。これらの結果は、PAZ1に誘発された抗体の高い血清型特異性を示す。
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
DEN−3ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号39)を、DEN−3ウイルス株遺伝子型(Osatomi K., Sumiyoshi H. デング3型ウイルスゲノムRNAの完全なヌクレオチド配列、Virology 1990, 176(2):643-647)からの配列11と配列13として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM84 HisプラスミドをXbaI/EcoRIで消化してベクターを作成し、これは、MDHタンパク質をコードするヌクレオチド配列と6つのヒスチジンの配列をコードするヌクレオチド配列とを含有する(配列26)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pAZ2と呼ぶ、図8と配列番号42)を用いて、コンピタントな細胞MM294を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−3ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAF抗DEN−3による免疫ブロッティングで認識され、PAZ2と命名した(配列番号43)。
PAZ2で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分に結合したタンパク質を、7M尿素を使用して抽出し、上清(PAZ2タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。カラムを40mMイミダゾールで洗浄し、100mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をG−25カラムにのせて、調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
PAZ2の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表36)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−3で得られた(PAZ1で得られたものより高い)。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型3の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−3に対する高力価の5つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
* 全部で10μgの精製PAZ2を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PAZ2で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−3に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表37と表40)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−3に対してのみ見いだされた(表38と表40)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−3に対して中和力価1:1280が得られた(表39)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表40)。
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
DEN−3ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号39)を、DEN−3ウイルス株(Osatomi K., Sumiyoshi H. デング3型ウイルスゲノムRNAの完全なヌクレオチド配列、Virology 1990, 176(2):643-647)からの配列14と配列15として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pD4プラスミドをBamHI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHタンパク質をコードするヌクレオチド配列と停止コドンの無い6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列29)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質のC末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pAZ3と呼ぶ、図9と配列番号44)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−3ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAF抗DEN−3による免疫ブロッティングで認識され、PAZ3と命名した(配列番号45)。
PAZ3で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分から、タンパク質を7M尿素を使用して抽出し、上清(PAZ3タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。カラムを45mMイミダゾールで洗浄し、230mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、タンパク質の純粋な画分をG−25カラムにのせて、調製緩衝液(PBS)中のタンパク質を得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
PAZ3の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表26)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−3で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型3の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−3に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
* 全部で10μgの精製PAZ3を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PAZ3で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−3に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表42と表45)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−3に対してのみ見いだされた(表43と表45)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−3に対して中和力価1:1280が得られた(表44)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表45)。
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
DEN−4ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号46)を、DEN−4ウイルス株遺伝子型(Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング4型ウイルスDNA配列のクローニング:構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88)からの配列17と配列18として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM108 His プラスミドをXbaI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHのN末端領域と6つのヒスチジンの配列とをコードするヌクレオチド配列を含有する(配列23)。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(plD1と呼ぶ、図10と配列番号47)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。ルリアベルタニ(LB)培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果25kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の10%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−4ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAF中に含有されるポリクローナル抗体(PA)抗DEN−4による免疫ブロッティングで認識され、plD1と命名した(配列番号48)。
plD1で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。細胞破砕物のペレットに結合した不溶性型として、組換えタンパク質が主に得られた。ペレットから、6M尿素でタンパク質を抽出し、上清(PlD1タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。60mMイミダゾールでタンパク質を溶出し、得られた容量をG−25カラムにのせて、最後にタンパク質を、調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
PlD1の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表46)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−4で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型4の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−4に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
* 全部で10μgの精製PlD1を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
全部で25匹のBalb/cマウスを、35μgのフロイントアジュバント中の精製PlD1で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−1に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表47と表50)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−4に対してのみ見いだされた(表48と表50)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−4に対して中和力価1:320が得られた。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表49と表50)。これらの結果は、PlD1により誘発される抗体の高い血清型特異性を示す。
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
DEN−4ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号46)を、DEN−4ウイルス株(Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング4型ウイルスDNA配列のクローニング:構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88)からの配列16と配列18として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pM84 HisプラスミドをXbaI/EcoRIで消化してベクターを作成し、これは、MDHタンパク質をコードするヌクレオチド配列と6つのヒスチジンの配列をコードするヌクレオチド配列とを含有する(配列26)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質の構造ドメインのコード領域内に挿入することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(plD2と呼ぶ、図11と配列番号49)を用いて、コンピタントな細胞MM294を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−4ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAF抗DEN−4による免疫ブロッティングで認識され、PlD2と命名した(配列番号50)。
plD2で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分に結合したタンパク質を6M尿素を使用して抽出し、上清(PlD2タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。カラムを30mMイミダゾールで洗浄し、250mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をG−25カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
PlD2の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表51)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−4で得られた(PlD1で得られたものより高い)。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型4の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−3に対する高力価の5つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
* 全部で10μgの精製PlD2を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PlD2で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−4に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表52と表55)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−4に対してのみ見いだされた(表53と表55)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−4に対して中和力価1:1280が得られた(表54)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表55)。
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
DEN−4ウイルスからのエンベロープタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号46)を、DEN−4ウイルス株(Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング4型ウイルスDNA配列のクローニング:構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88)からの配列19と配列20として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pD4プラスミドをBamHI/BamHIで消化してベクターを作成し、これは、MDHタンパク質をコードするヌクレオチド配列と6つのヒスチジンの配列をコードするヌクレオチド配列とを含有する(配列29)。この消化により、PCRにより増幅した断片を、MDHタンパク質のC末端領域後に融合することが可能になる。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(plD3と呼ぶ、図12と配列番号51)を用いて、コンピタントな細胞W3110を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果80kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とDEN−4ウイルスからのDENeタンパク質断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAF抗DEN−4による免疫ブロッティングで認識され、PlD3と命名した(配列番号52)。
plD3で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が両方の型(可溶性と不溶性)で得られた。不溶性画分から、タンパク質を6M尿素を使用して抽出し、上清(PlD3タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。カラムを45mMイミダゾールで洗浄し、200mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をG−25カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液(PBS)中に得た。この調製物を免疫学的試験に使用した。
PlD3の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表56)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−4で得られた。他の血清型に対するHMAFによる認識は、血清型4の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。最後に、DEN−4に対する高力価の3つのヒト血清と低力価の3つに対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
* 全部で10μgの精製PlD3を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PAZ3で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−4に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表57と表60)。さらに、HI測定を行い、陽性力価はDEN−4に対してのみ見いだされた(表58と表60)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−4に対して中和力価1:1280が得られた(表59)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表60)。
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
DEN−4ウイルスからのEタンパク質のアミノ酸286〜426をコードするヌクレオチド配列(配列番号46)を、DEN−4ウイルス株(Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y.、完全長デング4型ウイルスDNA配列のクローニング:構造タンパク質をコードする遺伝子の解析、Virology 1986, 155:77-88)からの配列16と配列21として配列リストで特定されるオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
pLL3プラスミドをXbaI/XbaIで消化してベクターを作成し、これは、MDH遺伝子と、この遺伝子の3’領域の6つのヒスチジンの配列および3’末端中のDEN−2からのE断片の配列とを含有する。その結果、同じMDH遺伝子に融合した、血清型2と4からEタンパク質の2つの領域が得られた。連結して、組み換え体候補を制限酵素消化により分析し、陽性クローンを配列決定して接合部分をチェックした。選択したクローン(pD4D2と呼ぶ、図13と配列番号53)を用いて、コンピタントな細胞MM294を形質転換した。LB培地でコロニーを増殖させて、細胞溶解物のSDS−PAGEを行った。その結果110kDaのバンドが得られ、これは総細胞タンパク質の20%を占めた。得られたタンパク質のサイズは、MDHタンパク質とデング熱ウイルスからのDENeタンパク質の2つの断片の合計に対応した。このタンパク質は、HMAFに含有されるポリクローナル抗体抗DEN−2と抗DEN−4による免疫ブロッティングで認識された。このタンパク質をPD4D2と命名した(配列番号54)。
pD4D2で形質転換し37℃で培養した大腸菌(E. coli)株から得られた菌体を、フレンチプレスで破砕した。組換えタンパク質が可溶性または不溶性で得られた。ペレットからタンパク質を6M尿素を使用して抽出し、上清(PD4D2タンパク質を含有)をG−25カラムにのせてカオトロピック物質を除去した。次に得られた画分を、Cu++イオンの存在下でキレート−セファロースFFカラム(ファルマシア(Pharmacia)、英国)にのせた。30mMイミダゾールで洗浄工程を行い、250mMイミダゾールでタンパク質を溶出した。最後に、純粋な画分をG−25カラムにのせて、タンパク質を調製緩衝液中に得て、これを免疫学的試験に使用した。
PD4D2の精製した画分を、種々のポリクローナル血清および/またはマウスモノクローナル抗体による認識、ならびにデングに対する陽性ヒト血清により性状解析した(表61)。
ドットブロッティングの最も高い認識は、HMAF抗DEN−2と抗DEN−4で得られた。他の2つの血清型の認識は、血清型2と4の場合より低かった。黄熱病ウイルスやセントルイス脳炎ウイルスのような他のフラビウイルスにより生成する抗体は、全く認識しなかった。一方、PLL2とPLL3について得られたものと同様に、Mab 3H5は確かに反応性を有した。最後に、DEN−2とDEN−4に対する高力価と低力価のヒト血清に対する反応性を測定し、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングの両方で大きなシグナルが得られた。
* 全部で10μgの精製P4D2を使用した。得られたシグナルの強度を+から++まで評価した。
** HMAFは1:100で使用し、Mab 3H5は1:1000希釈で使用した。
*** EEE:ウマ脳炎ウイルス。YFV:黄熱病ウイルス。SLV:セントルイス脳炎ウイルス。NT:中和性特異的血清型。
全部で25匹のBalb/cマウスを、20μgのフロイントアジュバント中の精製PD4D2で腹腔内免疫し、4回投与後に10匹の動物を放血させ、抗DEN抗体をELISAにより評価した。DEN−2とDEN−4に対する高抗体力価が得られたが、残りの血清型に対しては反応性は得られなかった(表62と表65)。さらに、血球凝集阻害測定(HI)を行い、陽性力価はDEN−2とDEN−4に対してのみ見いだされた(表63と表65)。最後に、インビトロ中和測定を行い、DEN−2に対して中和力価>1:1280およびDEN−4に対して>1:1280が得られた(表64)。残りの血清型に対してはウイルス感染の中和は見いだされなかった(表65)。
* 各混合物は3つの血清により作成した。
** HI力価は、8血球凝集ウイルス単位に対してガチョウの赤血球の血球凝集を阻害することができる最大希釈率として定義した。
*** 中和力価は、ウイルスプラークの数が50%低下する血清の最大希釈率として定義した。
同種の致死的DENで抗原刺激したすべての測定した変種で免疫したマウスに付与される防御の評価のために、各群15匹のマウスを使用した。各動物に、致死的DENの100 LD50を1回頭蓋内接種し、21日間観察して致死率を調べた。陽性対照として、4つのウイルス調製物(DEN−1、DEN−2、DEN−3およびDEN−4)で免疫した15匹のマウスの群を使用した。これらの対照群のすべてのマウスは生き残ったが、陰性対照群からのマウスは、抗原刺激の7〜11日後に病気になり、死亡率100%であった。最後に、被験融合タンパク質は、80%〜100%の防御率であり、すべての場合に、対照群と比較して大きな差があった(表66)。
DEN−2からのE断片を含有するキメラタンパク質(PLL1、PLL2、およびPLL3)で免疫した異なる群からの動物、およびプラセボ群を、最後の投与の15日後に屠殺した。次に、動物の脾臓を採取し、4つの血清型のデング熱ウイルスに対するリンパ増殖性応答を調べた。表67は、得られた刺激指数の結果を示し、これは、血清型特異的応答が得られたことを示す。
Claims (16)
- 配列番号22と配列番号26との遺伝子配列の組合せであり、配列番号27の遺伝子配列からなり、コードするキメラタンパク質が医薬調製物中に存在すると、フラビウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるか、またはフラビウイルスの各血清型に対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号28のアミノ酸配列からなり、配列番号27の遺伝子配列の発現産物であり、かつ医薬調製物中に存在すると、デング−2ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できるキメラタンパク質。
- 配列番号22と配列番号29との遺伝子配列の組合せであり、配列番号30の遺伝子配列からなり、コードするキメラタンパク質が医薬調製物中に存在すると、フラビウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるか、またはフラビウイルスの各血清型に対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号31のアミノ酸配列からなり、配列番号30の遺伝子配列の発現産物であり、かつ医薬調製物中に存在すると、デング−2ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できるキメラタンパク質。
- 配列番号26と配列番号32との遺伝子配列の組合せであり、配列番号35の遺伝子配列からなり、コードするキメラタンパク質が医薬調製物中に存在すると、フラビウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるか、またはフラビウイルスの各血清型に対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号36のアミノ酸配列からなり、配列番号35の遺伝子配列の発現産物であり、かつ医薬調製物中に存在すると、デング−1ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できるキメラタンパク質。
- 配列番号29と配列番号32との遺伝子配列の組合せであり、配列番号37の遺伝子配列からなり、コードするキメラタンパク質が医薬調製物中に存在すると、フラビウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるか、またはフラビウイルスの各血清型に対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号38のアミノ酸配列からなり、配列番号37の遺伝子配列の発現産物であり、かつ医薬調製物中に存在すると、デング−1ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できるキメラタンパク質。
- 配列番号26と配列番号39との遺伝子配列の組合せであり、配列番号42の遺伝子配列からなり、コードするキメラタンパク質が医薬調製物中に存在すると、フラビウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるか、またはフラビウイルスの各血清型に対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号43のアミノ酸配列からなり、配列番号42の遺伝子配列の発現産物であり、かつ医薬調製物中に存在すると、デング−3ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できるキメラタンパク質。
- 配列番号29と配列番号39との遺伝子配列の組合せであり、配列番号44の遺伝子配列からなり、コードするキメラタンパク質が医薬調製物中に存在すると、フラビウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるか、またはフラビウイルスの各血清型に対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号45のアミノ酸配列からなり、配列番号44の遺伝子配列の発現産物であり、かつ医薬調製物中に存在すると、デング−3ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できるキメラタンパク質。
- 配列番号26と配列番号46との遺伝子配列の組合せであり、配列番号49の遺伝子配列からなり、コードするキメラタンパク質が医薬調製物中に存在すると、フラビウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるか、またはフラビウイルスの各血清型に対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号50のアミノ酸配列からなり、配列番号49の遺伝子配列の発現産物であり、かつ医薬調製物中に存在すると、デング−4ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できるキメラタンパク質。
- 配列番号29と配列番号46との遺伝子配列の組合せであり、配列番号51の遺伝子配列からなり、コードするキメラタンパク質が医薬調製物中に存在すると、フラビウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるか、またはフラビウイルスの各血清型に対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導することができるキメラヌクレオチド鎖。
- 配列番号52のアミノ酸配列からなり、配列番号51の遺伝子配列の発現産物であり、かつ医薬調製物中に存在すると、デング−4ウイルスに対して、受容体中で中和性および防御性抗体の体液性免疫応答を誘導できるキメラタンパク質。
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