PT1418180E

PT1418180E - Cadeias quiméricas que codificam para proteínas que induzem efeitos dirigidos contra vírus

Info

Publication number: PT1418180E
Application number: PT02760073T
Authority: PT
Inventors: Lisset Hermida Cruz; Rayner Rodriguez Diaz; Laura Lazo Vazquez; Aida Zulueta Morales; Carlos Lopez Abarrategui; Iris Valdes Prado; Ricardo De La C Silva Rodriguez; Glay Chinea Santiago; Gerardo Enrique Guillen Nieto; Maria Guadalupe Guzman Tirado; Beatriz De La Caridad Sierra Vazquez; Raul Rafael Espinosa Perez
Original assignee: Ct Ingenieria Genetica Biotech; Inst De Medicina Tropical Pedr
Priority date: 2001-07-16
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2007-04-30
Also published as: KR20040030056A; WO2003008571A2; EP1418180B1; MXPA04000486A; US20070141081A1; EP1418180A2; CU23245A1; WO2003008571A3; CA2453300A1; DE60217129T2; US20090274718A1; US8105606B2; BR0211178A; US7947281B2; KR100991717B1; DK1418180T3; JP2004537306A; ZA200400289B; GT200200150A; WO2003008571A9

Description

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DESCRIÇÃO "CADEIAS QUIMÉRICAS QUE CODIFICAM PARA PROTEÍNAS QUE INDUZEM EFEITOS DIRIGIDOS CONTRA VÍRUS"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se ao campo da biotecnologia e da indústria farmacêutica, de um modo particular na obtenção de cadeias quiméricas de nucleótidos as quais, quando introduzidas num vector de expressão, dão origem a proteínas capazes de induzir uma resposta imunitária humoral especifica do serotipo e de proteger contra a infecção por virus Dengue; citada daqui para a frente como DEN, evitando os efeitos da imunoamplificação virai especifica do serotipo, que causa hemorragias e complicações clinicas descritas neste tipo de patologia.

TÉCNICA ANTERIOR 0 virus Dengue (DEN) é um virus com cápsula cuja membrana lipidica contém duas das suas três proteínas estrururais: a proteína do envelope (E) e a proteína da membrana (M) . A proteína E envolve uma nucleocápside icosaédrica composta pela terceira das suas proteínas estruturais, a proteína central. Este vírus pertence à família Flaviviridae e existem quatro tipos de serotipos diferentes. A sua transmissão ao homem é levada a cabo através do mosquito Aedes aegypti que pertence à família Stegomia. A doença provocada nos humanos por este vírus foi considerada como benigna e foi descrita como a Febre de Dengue ou Dengue Clássico (DF) até ao aparecimento de uma modalidade mais séria e por vezes letal, caracterizada por febre hemorrágica e choque, denominada: Febre Hemorrágica de Dengue e Síndroma de Choque de 2

Dengue (DHF/DSS) (Hammon WMc, New hemorrhagic fever in children in the Philippines and Thailand, Trans Assoe Physicians 1960; 73: 140-155). Vários estudos epidemológicos foram levados a cabo evidenciando a infecção sequencial de dois serotipos virais diferentes como factor de risco. (Kouri GP, Guzmán MG, Brave JR, Why dengue hemorrhagic fever in Cuba) 2, An integral analysis, Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1987; 72; 821-823) . Este fenómeno é explicado pelo aumento de imunidade, que é baseado num aumento da infecção virai pelo aumento da entrada do complexo virus-anticorpo na célula através dos receptores de Fc da célula alvo (monócitos) (halstead SB, Pathogenesis of dengue: challenges to molecular biology, Science 1988; 239: 476-481).

Foram desenvolvidas diferentes tecnologias para produzir vacinas com organismos vivos atenuadas, mas no presente existem vários tópicos por resolver no que respeita aos possíveis benefícios destas vacinas, uma vez que estas podem reverter para a virulência, interferência virai e recombinação inter-genómica. De um modo alternativo, podem ser obtidos antigénios recombinantes como possíveis componentes de uma vacina subunitária (Feighny, R., Borrous, J. E Putnak R. Dengue type-2 virus envelope protein made using recombinant baculovirus protects mice against virus challenge, Am. J. Trop. Med. Hyg. 1994, 50(3), 322-328; Deubel, V., Staropoli, I., Megret, F., et al. Affinity-purified dengue-2 virus envelope glycoprotein induces neutralizing antibodies and protective immunity in mice, Vaccine, 1997, 15, 1946-1954) . 3 0 principal antigénio do vírus é a proteína do envelope DENe. Esta proteína é a principal componente da superfície virai e presume-se que medeie a ligação do vírus ao receptor celular (A Heinz FX, Berge R, Tuma w et al. A topological and functional model of epitopes on the structural protein of tick borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies, Virology, 1983; 126:525). Esta proteína tem homologia estrutural com o virus da encefalite transmitida por carraças (TBE) (Rey F.A., Heinz, F.X., Mandl, C., et al, The envelope glycoprotein from tick borne encephalitis virus at 2 A° resolution, Nature 1995; 375: 291-298) e é também muito conservada entre os serotipos.

As células do insecto constituem umados sistemas mais utilizados para a expressão de diversos genes heterólogos que empregam o sistema de baculovírus como vectores. Estes vectores têm sido utilizados para a expressão de várias combinações de proteínas estruturais e não estruturais do vírus de Encefalite Japonesa (JEV), DEN-1, DEN-2 e DEN-4, (Matsuura Y, Miyamoto M, Soto T et al. Characterization of japanese encephalitis virus envelope protein expressed by recombinant baculoviroses. Virology 1989; 173: 677-682; Deubel V, Bordier M, Megret F et al. Processing, secretion and immunoreactivity of carboxi terminally truncated dengue-2 envelope proteins expresses in the insect cell by recombinant baculoviruses. Virology 1991; 180: 440-447; Putnak R, Feighny R, Burrous J et al. Dengue 1 virus envelope glycoprotein gene expressed in recombinant baculovírus elicit virus neutralization antibodies in mice and protects them from virus challenge. Am. J Trop Med Hyg 1991; 45: 159-167; Feighy R, Burrous J, Putnak R. Dengue type 2 virus envelope 4 protein made using recombinant baculovirus protects mice against vírus challenge, Am J Trop Med Hyg 1994; 50: 322-328). Outro sistema utilizado foram as células de Drosophila melanogaster que expressam variantes diferentes da proteína E (PCT/US96/07627). Com o objectivo de obter uma resposta funcional apropriada, através da utilização das proteínas expressas nestes sistemas, elas implicam um alto custo para o desenvolvimento de processos de produção escalados; desse modo, a expressão em leveduras tem sido uma alternativa para produzir proteínas estruturais recombinantes de flavivírus. Contudo, no caso da proteína DENe, expressa em Pichi pastoris (PCT/US96/07 627) ; Sugrue R.J., Fu H., Howe J., Chan Y. Expression of the Dengue virus structural proteins in Pichi pastoris leads to the generation of virus-like particles. J. Virol. 1997. 78, 1861-1866), os níveis de expressão são baixos, tanto secretados como intreacelulares, impedindo o processo de purificação.

Em paralelo, foram obtidas várias variantes da proteína DENe em bactérias. Uma delas foi a porção C-terminal da proteína de JEV fundida com uma proteína do metabolismo de Triptofano (TrpE) de E. Coli. Esta proteína foi produzida como corpos de inclusão e foi reconhecida por anticorpos monoclonais neutralizantes (Mabs) utilizando técnicas de imunodetecção. Contudo, as preparações puras desta proteína foram incapazes de desenvolver anticorpos neutralizantes e proteger contra o desafio virai (Mason P. W. Zogel Μ. V., Semproni A.R., et al. The antigenic structure of dengue type 1 virus envelope and NS1 protein expressed in E. Coli J. Gen Virol. 1990. 71: 2107-2114). 5

De um modo adicional, foi efectuada outra construcção (Srivastava A.K., Morita K., Matsuo S., et al. Japanese encephalitis virus fusion protein with protein A expressed in E.coli confers protection in mice. Microbiol Immunol. 1991. 35: 863-870), que contém a proteína A de Staphylococcus aurius fundida com o fragmento C-terminal da proteína E, seguida pelo segmento N-terminal da proteína não-estrutural de JEV, a NS1. Neste caso a proteína solúvel foi solúvel, facilitando a sua purificação por cromatografia de afinidade. Através de ratinhos imunizados com esta proteína purificada foram obtidas titulações de anticorpos altamente neutralizantes, as auais inibiram também a hemaglutinação e protegeram contra o desafio virai com JEV. Foram obtidos resultados semelhantes utilizando a região DENe da DEN-2 fundida com a proteína A de S.aureus (Srivastava A. K. Putnak R. J., Warren R. L., Hoke C. H. Mice immunized with a dengue type 2 virus E and NS1 fusio protein made in Escherichia coli are protected against lethal dengue virus infection. Vaccine. 1995. 13: 1251-1258); contudo, não é possível utilizar estas preparações em humanos devido à presença da proteína A, a qual demonstrou uma alta afinidade para a imunoglobulina G humana (IgG). Finalmente, foi descrita uma proteína de fusão que contém o domínio B da proteína DENe de DEN-2 e a proteína de ligação à maltose (MBP) de E. Coli (Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G. Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengue envelope B domain fusion protein against dengue 2 virus infection on mice. Am J. Trop Med Hyg. 1998. 58: 655-662) denominated MBP-DomB. Esta variante de proteína foi imunogénico em ratinhos e induziu anticorpos neutralizantes. 6

No nosso caso, o objecto desta invenção detém-se com a obtenção de sequências quiméricas, como por exemplo, no primeiro caso, a sequência que codifica para a região da proteína DENe ligada ao fragmento N-terminal de uma proteína mutada com actividade de desidrogenase (MDH) de Neísseria meningitidís; no segundo caso, a sequência que codifica para uma região da proteína DENe ligada ao gene inteiro da proteína MDH em duas posições diferentes, e no terceiro caso, as sequências quiméricas são formadas por dois fragmentos da proteína DENe a partir de dois serotipos virais diferentes fundidos para o mesmo gene que codifica para a proteína MDH. Estas cadeias quiméricas foram inseridas num vector adequado, dando origem a proteínas quiméricas insolúveis dentro do citoplasma da bactéria. Estas proteínas são então capazes de induzir altos níveis de anticorpos neutralizantes contra DEN, inibidores da hemaglutinação virai e para proteger ratinhos imunizados contra o desafio virai.

No que respeita à insolubilização das proteínas acima mencionadas, foi alcançado um processo fácil de enrolamento scale-up in vitro assim como os processos de expressão e purificação os quais foram superiores aos utilizados por Simmons et al, 1998. Por outro lado, a especificidade do serotipo dos anticorpos é demonstrada, originada por imunização de ratinhos com estas proteínas, ao nível da neutralização, inibição de hemaglutinação e ELISA, utilizando doses mais baixas que as empregues por Simmons et al, 1998. Este facto constitui a primeira descrição da expressão de proteínas DENe insolúveis em E.coli capazes de estimular uma resposta imunitária funcional. 7

De um modo adicional, considerando os resultados obtidos com a variante dimérica, é possível originar anticorpos específicos do serotipo com a mesma molécula para dois serotipos virais diferentes, capazes de neutralizar a infecção virai e proteger os ratinhos contra o desafio virai. No que respeita a proteína MDH, a procura por homologia com outras sequências foi efectuada na base de dados EMBL, revelando que os primeiros 110 aminoácidos são altamente semelhantes à região do domínio de ligação ao ácido lipóico e à articulação flexível da acetiltransferase dihidrolipoamida (enzima E2 do complexo dehidrogenase piruvato e dehidrogenase α-cetoglutarato), e o resto da proteína é altamente semelhante à dehidrogenase de lipoamida (LPDH), enzima E3 dos referidos complexos (Stephens, P. E; H.M. Darlinson, e J. R. Guest., 1983. The Pyruvate dehydrogenase complex of E. Coli. Eur J. Biochem. 133: 155-162.

Por outro lado, foi também descoberto que os doentes com Cirrose Biliar Primária (PBC) produziram autoanticorpos anti-mitocondriais, específicos para o local de ligação ao ácido lipóico, comum entre estas proteínas (Gershwin ME, Mackay IR, Sturgess A, Coppel RL. Identification and specificity of a cDNA encoding the 70 Kda mitochondrial antigen recognized in primary biliary cirrhosis. J. Immunol 1987; 138: 3525-31). Desse modo, os autores decidiram mutar esta região dentro da proteína para evitar qualquer resposta autoimune quando imunizada em humanos como proteínas quiméricas- A proteína MDH mutada desta invenção foi utilizada na Fase I de ensaios clínicos e apresentou ser segura e imunogénica em humanos, e também não foi reconhecida por soros de doentes com PBC (Pérez, A., F. Dickinson, Z. Cinza, A. 8

Ruiz, T. Serrano, J. Sosa, S. González, Y. Gutiérrez, C. Nazábal, 0. Gutiérrez, D. Guzmán, M. Diaz, M. Delgado, E. Caballero, G. Sardinas, A. Alvarez, A. Martin, G. Guillén, R. Silva. Safety and preliminary immunogenicity of the recombinant outer membrane protein of Neissería meningitidis in human volunteers. Biotech. Appl. Biochem. 34: 121-125). Contudo, a possível utilização de MBP em humanos não foi ainda demonstrada (Simmons M., Nelson W. M., Wu S. J., Hayes C. G. Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengue envelope B domain fusion protein against dengue 2 virus infection in mice. Am J Trop Med Hyg. 1998. 58: 655-662).

Descrição Detalhada da Invenção

Nesta invenção é descrito que a obtenção de cadeias de nucleótidos quiméricos que quando introduzidas num vector de expressão, dão origem a proteínas quiméricas capazes de induzir uma resposta imunitária humoral específica do serotipo e protecção contra infecção por vírus Dengue, como por exemplo, a sequência que codifica para uma região da proteína DENe de cada um dos serotipos virais do vírus Dengue, ligada ao fragmento N-terminal de uma proteína mutada com actividade de desidrogenase (MDH) de Neissería meningitidis; no segundo caso, a sequência codifica para uma região da proteína DENe ligada ao gene inteiro da proteína MDH em duas posições diferentes: num local dentro da sequência que codifica para um domínio estrutural da proteína MDH (domínio de ligação ao ácido lipóico) e na extremidade 3"do gene e no terceiro caso, as sequências quiméricas são formadas por dois fragmentos da proteína DENe de dois serotipos virais diferentes, DEN-2 e DEN-4, em duas posições diferentes do gene MDH: uma dentro de um local específico da sequência que 9 codifica para o dominio de ligação ao ácido lipóico (serotipo 4) e outra na extremidade 3"do gene MDH (serotipo 2). Isto foi denominado de construto dimérico.

Estas proteínas quiméricas foram obtidas sob forma insolúvel no citoplasma da bactéria. Foi efectuado um processo de purificação por cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC), o que permitiu a obtenção de proteínas puras para estudos imunogénicos.

Quando foram analisados os resultados de antigenecidade foi demonstrado um forte reconhecimento de todas as proteínas recombinantes quiméricas para os líquidos ascíticos hiperimunes (HMAF) anti-DEN, sendo mais alto para o caso da fusão para o gene MDH inteiro, o qual evidencia um efeito positivo no modelamento da região da proteína DENe dada pelo MDH. Nos casos onde foi utilizado o serotipo 2, todas as proteínas recombinantes obtidas foram reconhecidas por um anticorpo neutralizante específico do serotipo (3H5), sendo também mais alto para o caso da fusão para o gene MDH inteiro, assim como na proteína dimérica. Foi também observado que o reconhecimento para o HMAF pelos serotipos homólogos em cada caso foi significativamente mais alto que o reconhecimento para o HMAF pelos serotipos heterólogos, evidenciando a exposição de epitopos específicos de serotipos e permitindo assim a sua utilização como um meio de diagnóstico para Dengue e classificação em serotipos.

Quando todas as proteínas quiméricas recombinantes foram imunizadas em ratinhos foi obtida uma resposta protectora e neutralizante. Foram obtidas titulações de 10 neutralização mais altas com as sequências fundidas com o gene inteiro de MDH e com a proteína dimérica, independentemente da posição do fragmento na proteína DENe. Isto demonstrou um efeito imunopotenciador da resposta imunitária mediada por MDH que pode ser explicada pela influência no enrolamento da proteína DENe reflectida nos resultados de antigenecidade obtidos. Foi também demonstrado pela primeira vez, e de modo contrário ao estado anterior da técnica, que a insolubilização destas proteínas não afectam a capacidade dd originar uma resposta imunitária adequada. A resposta imunitária produzida em todos os casos foi específica do serotipo (anticorpos contra o serotipo homólogo imunizado) na neutralização virai, na inibição da hemaglutinação e ELISA. A produção de anticorpos específicos do serotipo significa que eles não são capazes de reconhecer determinantes antigénicos a partir de um vírus de serotipos heterólogos que favorecem o fenómeno de aumento imunitário. Esta característica é de grande importância para o desnvolvimento de uma vacina candidata contra o vírus Dengue uma vez que o reconhecimento de anticorpos para serotipos heterólogos poderá ser uma das causas para a Febre Hemorrágica de Dengue (DHF).

Além disso foi demonstrada a indução de anticorpos contra dois serotipos virais após a imunização com apenas uma das proteínas quiméricas, a qual permite a formulação de uma vacina candidata contra os quatro serotipos, utilizando apenas duas das proteínas quiméricas recombinantes adequadas dos autores. 11 A obtenção do mutante da proteína MDH consistiu na eliminação do local de ligação ao ácido lipóico na sequência ETDKAT, baseada na ligação covalente deste ácido gordo com os grupos épsilon-amina de lisina (K) (Tuaillon N, andré C, Briand JP et al. A lipoyl synthetic octadecapeptide of dihydrolipoamide acetyltransferase specifically recognized by anti-M2 autoantibodies in

Primary Biliary Cirrhosis. J Immunol 1992; 148: 445-50). A mutagénese foi levada a cabo utilizando PCR com um par de primers para amplificar a região N-terminal (desde o codão de iniciação do gene IpdA até ao local de ligação ao ácido lipóico, 135 pb) e a região C-terminal da proteína (desde o local de ligação ao ácido lipóico até à extremidade 3' do gene); sendo assim eliminada a possibilidade de originar reacções autoimunes, como demonstrado nos ensaios clínicos em humanos.

Depósito de material biológico

Foram depositados os plasmídeos PLL1, PLL2, PLL3, PLH1, PLH2, PLH3, PAZ1, PAZ2, PAZ3, PID1, PID2 e PID3 de acordo com o Tratado de Budapeste na Belgian Coordinated collection of Microorganism - BCCM™, LMBP-COLLECTION, e com a data e sob números de acesso (pendente).

Descrição das Figuras

Figura 1. Estratégia de Clonagem do fragmento E2 para obter PLL1. DENe2: Fragmento da proteína do envelope de DEN-2. N-terminal: Sequência de nucleótidos que codifica para os primeiros 45 aminoácidos da proteína MDH. 12

Figura 2. Estratégia de Clonagem do fragmento E2 para obter PLL2. DENe2: Fragmento da proteína do envelope de DEN-2. MDH: mutante de desidrogenase.

Figura 3. Estratégia de Clonagem do fragmento E2 para obter PLL3. DENe2: Fragmento da proteína do envelope de DEN-2. MDH: mutante de desidrogenase.

Figura 4. Estratégia de Clonagem do fragmento EI para obter PLH1. DENel: Fragmento da proteína do envelope de DEN-1. N-terminal: Sequência de nucleótidos que codifica para os primeiros 45 aminoácidos da proteína MDH.

Figura 5. Estratégia de Clonagem do fragmento EI para obter PLH2. DENel: Fragmento da proteína do envelope de DEN-1. N-terminal: Sequência de nucleótidos que codifica para os primeiros 45 aminoácidos da proteína MDH.

Figura 6. Estratégia de Clonagem do fragmento El para obter PLH3. DENel: Fragmento da proteína do envelope de DEN-1. MDH: mutante de desidrogenase.

Figura 7. Estratégia de Clonagem do fragmento E3 para obter PAZ1. DENe3: Fragmento da proteína do envelope de DEN-3. N-terminal: Sequência de nucleótidos que codifica para os primeiros 45 aminoácidos da proteína MDH. 13

Figura 8. Estratégia de Clonagem do fragmento E3 para obter PAZ2. DENe3: Fragmento da proteína do envelope de DEN-3. MDH: mutante de desidrogenase.

Figura 9. Estratégia de Clonagem do fragmento E3 para obter PAZ3. DENe3: Fragmento da proteína do envelope de DEN-3. MDH: mutante de desidrogenase.

Figura 10. Estratégia de Clonagem do fragmento E4 para obter PID1. DENe4: Fragmento da proteína do envelope de DEN-4. N-terminal: Sequência de nucleótidos que codifica para os primeiros 45 aminoácidos da proteína MDH.

Figura 11. Estratégia de Clonagem do fragmento E4 para obter PID2. DENe4: Fragmento da proteína do envelope de DEN-4. MDH: mutante de desidrogenase.

Figura 12. Estratégia de Clonagem do fragmento E4 para obter PID3. DENe4: Fragmento da proteína do envelope de DEN-4. MDH: mutante de desidrogenase.

Figura 13. Estratégia de Clonagem para obter PD4D2. DENe4: Fragmento da proteína do envelope de DEN-4. DENe2: Fragmento da proteína do envelope de DEN-2. MDH: mutante de desidrogenase.

EXEMPLOS DE DESEMPENHO EXEMPLO 1. Obtenção de pLLl 14 A sequência nucleotidica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína do envelope do vírus DEN-2 (Sec. Id, N° 22) foi amplificada com os oligonucleótidos identificados na lista de sequências como Sequência N°1 e Sequência N°2 do genótipo da estirpe de vírus DEN-2 Jamaica (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative Analysis of the full-lenght genome. Virology 1988. 165: 234-244). 0 vector foi criado por digestão do plasmídeo pM108 His com Xba II Bam Hl, o qual contém a sequência de nucleótidos que codifica para a região N-terminal de MDH e para uma sequência de 6 Histidinas (Sequência N° 23) . Através da ligação, os potenciais recombinantes foram analisados por digestão enzimática de restrição e os clones positivos foram sequenciados para verificar as junções. As células competentes W3110 (Hill C. W., Harnish B. W. 1982. Transposition of a chromosomal segment bounded by redundant rRNA genes in Escherichia coli. J Bacteriology. 149: 449-457) foram transformadas com o clone seleccionado, denominado pLLl (Fig.l e Sequência N°24). Após o crescimento da colónia em meio Luria Bertani (LB), foi efectuado SDS-PAGE do lisado celular. Como resultado foi obtida uma banda de 25 kDA, a qual representa 10% do total de proteínas celulares. O tamanho da proteína obtida corresponde à soma da região N-terminal da proteína MDH e o fragmento da proteína DENe a partir do vírus DEN-2. A proteína foi reconhecida por Imunomarcação com anticorpos policlonais (PA) anti-DEN-2 contidos em HMAF. Esta proteína foi denominada PLLl (Sequência N°25). 15 EXEMPLO 2. Purificação da proteína PLL1 A biomassa obtida a partir da estirpe de E. Coli transformada com pLLl e crescida a 37 °C foi delectado por Prensa francesa. A proteína recombinante foi obtida de um modo preponderante como uma forma insolúvel associada ao pellet da disrupção celular. A proteína foi extraída a partir do pellet com ureia a 6 M e o sobrenadante, contendo a proteína PLLl, foi colocado numa coluna G-25 de modo a eliminar o agente caotrópico. A fracção obtida foi então colocada na coluna Chelating-sepharose FF (Pharmacia, UK) , na presença de iões de Cu++. A proteína foi eluída com Imidazol a 50 mM e o volume obtido foi colocado numa coluna G-25 para finalmente obter a proteína no tampão de formulação NaCl 100 mM, KC12 2 mM, Na2HP04 10 mM, pH 7,2, KH2P04 1 mM (PBS) . Esta preparação foi utilizada para estudos imunológicos. EXEMPLO 3. Caracterização Antigénica de PLLl A fracção purificada de PLLl foi caracterizada tanto pelo seu reconhecimento por diferentes soros policlonais e/ou anticorpos monoclonais de murino, assim como por soros humanos positivos para Dengue (tabela 1).

Tabela 1. Reactividade da proteína PLLl a anticorpos monoclonais e policlonais.

Abs** Especificidade*** PLLl* HMAF DEN-1 + HMAF DEN-2 ++ HMAF DEN-3 - HMAF DEN-4 - HMAF EEE - HMAF YFV - HMAF SLV - Mab3H5 NT + * Foi aplicado um total de 10 μΐ de PLLl purificada. A intensidade do sinal obtido foi avaliada de + a ++. 16 ** Foi utilizada HMAF a 1:100 enquanto a Mab 3H5 foi utilizada numa diluição de 1:1000. *** EEE: Virus da Encefalite de Equinos. YFV: Vírus da Febre Amarela. SLV: Vírus da Encefalite de Saint Louis. NT: Serotipo específico neutralizante.

Os reconhecimentos mais altos em Dot blot foram obtidos com anti-DEN-2 HMAF. Este resultado coincide com o facto de a região clonada pertencer ao serotipo 2. O reconhecimento por HMAF contra os outros serotipos foi menor do que no caso do serotipo 2, por ordem decrescente: DEN-1, DEN-3 e DEN-4. Os anticorpos originados por outros flavivirus tais como o Vírus da Febre Amarela e o vírus da Encefalite de Saint Louis não tiveram qualquer reconhecimento. Por outro lado, o Mab 3H5 teve de facto reactividade. Este reconhecimento por Western blot reteve-se na ponte dissulfito uma vez que quando a amostra foi reduzida perdeu-se o sinal.

Finalmente, foi medida a reactividade contra três soros humanos de altas titulações e três de baixas titulações contra DEN-2, atingindo um sinal substancial em ambos os casos por Western blot e Dot blot. EXEMPLO 4. Caracterização da resposta do anticorpo gerada por PLLl

Foram imunizados i.p. um total de 25 ratinhos Balb/c com 35 μΐ de PLLl purificada em adjuvante Freund; 10 animais foram sangrados após quatro doses e foram avaliados os anticorpos anti-DEN por ELISA. Foram obtidas altas titulações de anticorpos contra DEN-2 enquanto não foi obtida reactividade contra o resto dos serotipos (tabela 2 e tabela 5). De um modo adicional, o ensaio de inibição da hemaglutinação (IH) foi levado a cabo e apenas foram 17 encontradas titulações positivas contra DEN-2 (tabela 3 e tabela 5). Finalmente, o ensaio de neutralização in vitro foi levado a cabo e foram obtidas titulações de 1:320 contra DEN-2. Contudo, não foi encontrada neutralização da infecção virai contra o resto dos serotipos (tabela 4 e tabela 5). Estes resultados indicam a alta especificidade do serotipo dos anticorpos induzidos por PLL1.

Tabela 2. Titulações do anticorpo contra DEN-2 a partir de soros obtidos após imunização de ratinhos com PLL1.

Ratinho Titulados anti-DEN-2 PLL1 Titulados anti-DEN-2 PBS Controlo (-) 1 1/128000 < 1 100 2 1/64000 < 1 100 3 1/64000 < 1 100 4 1/128000 < 1 100 5 1/32000 < 1 100 6 1/32000 < 1 100 7 1/64000 < 1 100 8 1/32000 < 1 100 9 1/128000 < 1 100 10 1/512000 < 1 100

Tabela 3. Titulações por Hl dos soros dos animais imunizados com PLL1.

Ratinho Titulados anti-DEN-2 PLL1 Titulados anti-DEN-2 PBS Controlo (-) 1 < 1:5 < 1:5 2 > 1:640 < 1:5 3 1:320 < 1:5 4 1:320 < 1:5 5 > 1:640 < 1:5 6 > 1:640 < 1:5 7 > 1:640 < 1:5 8 1:320 < 1:5 9 > 1:640 < 1:5 10 <1:5 < 1:5 *As titulações Hl foram definidas como a diluição mais alta capaz de inibir a hemaglutinação dos eritrócitos de ganso contra 8 unidades de hemaglutinação virai.

Tabela 4. Ensaio de neutralização virai com os soros dos animais imunizados com PLL1. 18

Ratinho Titulados neutralizantes* anti-DEN-2 PLLl Titulados neutralizantes* anti-DEN-2 PBS C(-) 1 1:320 < 1:5 2 1:320 < 1:5 3 1:320 < 1:5 4 1:320 < 1:5 5 1:80 < 1:5 6 1:160 < 1:5 7 1:320 < 1:5 8 1:40 < 1:5 9 1:160 < 1:5 10 1:320 < 1:5 * Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais alta de soros tendo 50% de redução do número de placas virais.

Tabela 5. Ensaio de reactividade cruzada contra todos os serotipos virais por ELISA, HL e neutralização virai com os soros de animais imunizados com PLLl.

Mistura de soros* ELISA (anti-DEN- 1) ELISA (anti-DEN- 2) ELISA (anti-DEN- 3) ELISA (anti-DEN- 4) 1(PLLl) < 1/100 < 1:128000 < 1/100 < 1/100 2(PLLl) < 1/100 1:128000 < 1/100 < 1/100

Mistura de soros* Hl**anti- DEN-1 Hl anti-DEN-2 Hl anti-DEN-3 Hl anti-DEN-4 PLLl < 1/5 > 1/320 < 1:5 < 1:5

Mistura de soros* Titulados neutrali zantes anti-DEN-1 Titulados neutralizan tes anti-DEN-2 Titulados neutralizan tes anti-DEN-3 Titulados neutralizan tes anti-DEN-4 1(PLLl) < 1:5 1:320 < 1:5 < 1:5 2(PLLl) < 1:5 1:160 < 1:5 < 1:5 * Cada mistura foi formada de três soros. ** As titulações de Hl foram definidas como a diluição mais alta capaz de inibir a hemaglutinação dos eritrócitos de ganso contra 8 unidades de hemaglutinação virai. *** Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais alta de soros tendo 50% de redução do número de placas virais. EXEMPLO 5. Obtenção de pLL2 19 A sequência nucleotidica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína do envelope do vírus DEN-2 (Sec. Id, N° 22) foi amplificada com os oligonucleótidos identificados na lista de sequências como Sequência N°1 e Sequência N°3 do genótipo da estirpe de vírus DEN-2 Jamaica (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative Analysis of the full-lenght genome. Virology 1988. 165: 234-244). 0 vector foi criado por digestão do plasmídeo pM84 His com Xba II Eco RI, o qual contém a sequência de nucleótidos que codifica para a proteína MDH e para uma sequência de 6 Histidinas (Sequência N° 26) . Esta digestão permite a inserção do fragmento amplificado por PCR dentro da região que codifica para um domínio estrutural da proteína MDH. Através da ligação, os potenciais recombinantes foram analisados por digestão enzimática de restrição e os clones positivos foram sequenciados para verificar as junções. As células competentes MM294 (Hanahan D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: 557-580) foram transformadas com o clone seleccionado, denominado pLL2 (Fig.2 e Sequência N°27) . Após o crescimento da colónia em meio LB, foi efectuado SDS-PAGE do lisado celular. Como resultado foi obtida uma banda de 80 kDA, a qual representa 10% do total de proteínas celulares. O tamanho da proteína obtida corresponde à soma do tamanho da proteína MDH e do fragmento da proteína DENe a partir do vírus DEN-2. A proteína foi reconhecida por Imunomarcação por anti-DEN-2 de HMAF e foi denominada PLL2 (Sequência N°28). 20 EXEMPLO 6. Purificação da proteína PLL2 A biomassa obtida a partir da estirpe de E. Coli transformada com pLL2 e crescida a 37 °C foi delectado por Prensa francesa. A proteína recombinante foi obtida em ambas as formas: solúvel e insolúvel. A partir da fracção solúvel foi feita uma cromatografia de afinidade com iões metálicos utilizando a coluna Chelating-sepharose FF previamente acoplada a iões de Cu++. A coluna foi lavada utilizando imidazolde a 15 mM e a proteína foi eluida com Imidazol a 100 mM. Por outro lado a proteína associada à fracção insolúvel foi extraída utilizando ureia a 8 M, e o sobrenadante, contendo a proteína PLL2, foi colocado numa coluna G-25 de modo a eliminar o agente caotrópico. A fracção obtida foi então colocada na coluna Chelating-sepharose FF (Pharmacia, UK) , na presença de iões de Cu++. A proteína foi eluida com Imidazol a 100 mM. Finalmente, a fracção pura de cada forma da proteína foi colocada numa coluna G-25 para obter a proteína no tampão de formulação NaCl 100 mM, KCI2 2 mM, Na2HP04 10 mM, pH 7,2, KH2PO4 1 mM (PBS). Estas preparações foram utilizadas para estudos imunológicos. EXEMPLO 7. Caracterização Antigénica de PLL2 A fracção purificada de PLL2 foi caracterizada tanto pelo seu reconhecimento por diferentes soros policlonais e/ou anticorpos monoclonais de murino, assim como por soros humanos positivos para Dengue (tabela 6).

Os reconhecimentos mais altos em Dot blot foram obtidos com anti-DEN-2 de HMAF. O reconhecimento por HMAF contra os outros serotipos foi menor do que no caso do serotipo 2, por ordem decrescente: DEN-1, DEN-3 e DEN-4. Os anticorpos originados por outros flavivírus tais como o 21 Vírus da Febre Amarela e o vírus da Encefalite de Saint Louis não tiveram qualquer reconhecimento. No entanto, no que respeita a Mab 3H5, foi observada uma grande reactividade (ainda maior que a obtida com PLLl) tanto por Dot blot como por Western blot. Contrariamente aos resultados de PLLl, o reconhecimento com Mab 3H5 foi o mesmo quando os agentes redutores estavam presentes na amostra, indicando uma possível diferença conformacional entre ambas as proteínas. Finalmente, foi medida a reactividade contra os três soros humanos de altas titulações e três de baixas titulações contra DEN-2, atingindo um sinal substancial em ambos os casos por Western blot e Dot blot.

Tabela 6. Reactividade da proteína PLL2 a anticorpos monoclonais e policlonais.

Abs** Especificidade*** PLL2 sol HMAF DEN-l ++ HMAF DEN-2 +++ HMAF DEN-3 - HMAF DEN-4 - HMAF EEE - HMAF YFV - HMAF SLV - Mab3H5 NT +++ * Foi aplicado um total de 10 μΐ de PLL2 purificada. A intensidade do sinal obtido foi avaliada de + a +++. ** Foi utilizada HMAF a 1:100 enquanto a Mab 3H5 foi utilizada numa diluição de 1:1000. *** EEE: Vírus da Encefalite de Equinos. YFV: Vírus da Febre Amarela. SLV: Vírus da Encefalite de Saint Louis. NT: Serotipo específico neutralizante. EXEMPLO 8. Caracterização da resposta do anticorpo gerada por PLL2

Foram imunizados i.p. um total de 25 ratinhos Balb/c com 35 μΐ de PLL2 purificada em adjuvante Freund; 10 animais 22 foram sangrados após quatro doses e foram avaliados os anticorpos anti-DEN por ELISA. Foram obtidas altas titulações de anticorpos contra DEN-2 enquanto não foi obtida reactividade contra o resto dos serotipos (tabela 7 e tabela 10). De um modo adicional, o ensaio de inibição da hemaglutinação (IH) foi levado a cabo e apenas foram encontradas titulações positivas contra DEN-2 (tabela 8 e tabela 10). Finalmente, foi levado a cabo o ensaio de neutralização in vitro e foram obtidas titulações de 1:1280 contra DEN-2. De um modo semelhante aos resultados obtidos com PLL1, não foi encontrada neutralização da infecção virai contra o resto dos serotipos (tabela 9 e tabela 10) . Por outro lado, os resultados obtidos com ambas as variantes de PLL2 foram semelhantes, indicando que o estado de solubilidade da proteína não influencia a capacidade de gerar anticorpos funcionais.

Tabela 7. Titulações de anticorpos contra DEN-2 a partir dos soros obtidos com a imunização de ratinhos com PLL2 solúvel e insolúvel.

Ratinho Titulações anti-DEN-2 (PLL2) Titulações anti-DEN-2 PBS C(-) PLL2s PLL2ins 1 > 1:128000 1:64000 < 1:100 2 1:128000 > 1:128000 < 1:100 3 > 1:128000 1:128000 < 1:100 4 > 1:128000 > 1:128000 < 1:100 5 1:64000 > 1:128000 < 1:100 6 > 1:128000 1:128000 < 1:100 7 1:64000 > 1:128000 < 1:100 8 > 1:128000 1:64000 < 1:100 9 > 1:128000 1:64000 < 1:100 10 1:128000 > 1:128000 < 1:100

Tabela 8. Titulações de Hl dos soros a partir de animais imunizados com PLL2 solúvel e insolúvel. 23

Ratinho Titulações por Hl anti-DEN-2 (PLL2) Titulações por Hl anti-DEN-2 PBS C(-) PLL2s PLL2ins 1 > 1:640 > 1:640 < 1:5 2 > 1:640 > 1:640 < 1:5 3 1:320 > 1:640 < 1:5 4 > 1:640 1:320 < 1:5 5 1:320 < 1:5 < 1:5 6 > 1:640 > 1:640 < 1:5 7 > 1:640 1:320 < 1:5 8 < 1:5 1:320 < 1:5 9 1:320 > 1:640 < 1:5 10 > 1:640 > 1:640 < 1:5 *As titulações de Hl foram definidas como a diluição mais alta capaz de inibir a hemaglutinação dos eritrócitos de ganso contra 8 unidades de hemaglutinação virai

Tabela 9. Titulações de neutralização virai com os soros de animais imunizados com PLL2 solúvel e insolúvel.

Ratinho Titulados neutralizantes* Titulados anti-DEN-2 (PLL2) neutralizantes anti- PLL2s PLL2ins DEN-2 PBS C(-) 1 > 1:1280 > 1:1280 > 1:1280 2 > 1:1280 > 1:1280 < 1:5 3 > 1:1280 1:640 < 1:5 4 1:640 > 1:1280 < 1:5 5 1:640 1:640 < 1:5 6 > 1:1280 > 1:1280 < 1:5 7 > 1:1280 > 1:1280 < 1:5 8 > 1:1280 > 1:1280 < 1:5 9 > 1:1280 > 1:1280 < 1:5 10 > 1:1280 > 1:1280 < 1:5 * Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais alta de soros tendo 50% de redução do número de placas virais.

Tabela 10. Ensaio de reactividade cruzada contra todos os serotipos virais por ELISA, IH e neutralização virai com os soros dos animais imunizados com PLL2 solúveis e insolúveis. 24

Mistura de soros* ELISA (anti-DEN- 1) ELISA (anti-DEN-2) ELISA (anti-DEN- 3) ELISA (anti-DEN- 4) 1 (PLL2 sol.) < 1/100 > 1: 128 000 < 1/100 < 1/100 2 (PLL2 sol.) < 1/100 1: 64000 < 1/100 < 1/100 1 (PLL2 ins.) < 1/100 1: 64000 < 1/100 < 1/100 2 (PLL2 ins.) < 1/100 > 1: 128 000 < 1/100 < 1/100

Mistura de IH**anti- IH anti-DEN-2 IH anti- IH anti- soros* DEN-1 DEN-3 DEN-4 PLL2 sol. < 1/5 >1/ 320 < 1/5 < 1/5 PLL2 ins. <1/5 >1/ 320 < 1/5 < 1/5

Mistura de soros* Titulados neutraliza ntes *** anti-DEN-1 Titulados neutralizante s anti-DEN-2 Titulados neutraliza ntes anti-DEN-3 Titulados neutraliza ntes anti-DEN-4 1 (PLL2) < 1: 5 1: 320 < 1: 5 < 1: 5 2 (PLL2) <1: 5 1: 160 < 1: 5 < 1: 5 * Cada mistura foi formada por três soros. ** As titulações de IH foram definidas como a diluição mais alta capaz de inibir a hemaglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades de hemaglutinação virais. *** Os Titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais alta de soros tendo 50% de redução do número de placas virais. EXEMPLO 9. Obtenção de pLL3 A sequência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína do envelope do vírus DEN-2 (Sec. Id, N°22) foi amplificada com os oligonucleótidos identificados na lista de sequências como Sequência N°4 e Sequência N°5 do genótipo da estirpe de vírus DEN-2 Jamaica (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative Analysis of the full-lenght genome. Virology 1988. 165: 234-244). 25 0 vector foi criado por digestão do plasmideo pD4 com Bam HII Bam Hl, o qual contém a sequência de nucleótidos que codifica para a proteína MDH e para uma sequência de 6 Histidinas sem o codão de terminação (Sequência N° 29) . Esta digestão permite a fusão do fragmento amplificado por PCR após a região C-terminal da proteína MDH. Através da ligação, os potenciais recombinantes foram analisados por digestão enzimática de restrição e os clones positivos foram sequenciados para verificar as junções. As células competentes W3110 foram transformadas com o clone seleccionado, denominado pLL3 (Fig.3 e Sequência N°30) . Após o crescimento da colónia em meio LB, foi efectuado SDS-PAGE do lisado celular. Como resultado foi obtida uma banda de 80 kDA, a qual representa 20% do total de proteínas celulares. O tamanho da proteína obtida corresponde à soma do tamanho da proteína MDH e do fragmento da proteína DENe a partir do vírus DEN-2. A proteína foi reconhecida por Imunomarcação por anti-DEN-2 de HMAF e foi denominada PLL3 (Sequência N°31). EXEMPLO 10. Purificação da proteína PLL3 A biomassa obtida a partir da estirpe de E. Coli transformada com pLL3 e crescida a 37 °C foi delectado por Prensa francesa. A proteína recombinante foi obtida em ambas as formas: solúvel e insolúvel. A partir da fracção insolúvel, a proteína foi extraída utilizando ureia a 6 M, e o sobrenadante, contendo a proteína PLL3, foi colocado numa coluna G-25 de modo a eliminar o agente caotrópico. A fracção obtida foi então colocada na coluna Chelating-sepharose FF (Pharmacia, UK), na presença de iões de Cu++. A coluna foi lavada com Imidazol a 30 mM e a proteína foi eluída com Imidazol a 100 mM. Finalmente, a fracção pura da proteína foi colocada numa coluna G-25 26 para obter a proteína no tampão de formulação (PBS). Esta preparação foi utilizada para estudos imunológicos. EXEMPLO 11. Caracterização Antigénica de PLL3 A fracção purificada de PLL3 foi caracterizada tanto pelo seu reconhecimento por diferentes soros policlonais e/ou anticorpos monoclonais de murino, assim como por soros humanos positivos para Dengue (tabela 11).

Os reconhecimentos mais altos em Dot blot foram obtidos com anti-DEN-2 de HMAF. 0 reconhecimento por HMAF contra os outros serotipos foi menor do que no caso do serotipo 2, por ordem decrescente: DEN-1, DEN-3 e DEN-4. Os anticorpos originados por outros flavivírus tais como o Vírus da Febre Amarela e o vírus da Encefalite de Saint Louis não tiveram qualquer reconhecimento. No entanto, no que respeita a Mab 3H5, foi observada uma grande reactividade (semelhante à obtida com PLL2) tanto por Dot blot como por Western blot. Contrariamente aos resultados de PLL1, o reconhecimento com Mab 3H5 foi o mesmo quando os agentes redutores estavam presentes na amostra, indicando uma possível diferença conformacional entre ambas as proteínas. Finalmente, foi medida a reactividade contra três soros humanos de altas titulações e três de baixas titulações contra DEN-2, atingindo um sinal substancial em ambos os casos por Western blot e Dot blot. Estes resultados foram semelhantes aos obtidos com PLL2 .

Tabela 11. Reactividade da proteína PLL3 a anticorpos monoclonais e policlonais. 27

Abs** Especificidade*** —— PLL3* .......HMAF ++ HMAF DEN-2 +++ HMAF DEN-3 - HMAF DEN-4 - HMAF EEE - HMAF YFV - HMAF SLV - Mab3H5 NT +++ * Foi aplicado um total de 10 μΐ de PLL3 purificada. A intensidade do sinal obtido foi avaliada de + a ++. ** Foi utilizada HMAF a 1:100 enquanto a Mab 3H5 foi utilizada numa diluição de 1:1000. *** EEE: Virus da Encefalite de Equinos. YFV: Vírus da Febre Amarela. SLV: Vírus da Encefalite de Saint Louis. NT: Serotipo específico neutralizante. EXEMPLO 12. Caracterização da resposta do anticorpo gerada por PLL3

Foram imunizados i.p. um total de 25 ratinhos Balb/c com 35 μΐ de PLL3 purificada em adjuvante Freund; 10 animais foram sangrados após quatro doses e foram avaliados os anticorpos anti-DEN por ELISA. Foram obtidas altas titulações de anticorpos contra DEN-2 enquanto não foi obtida reactividade contra o resto dos serotipos (tabela 12 e tabela 15). De um modo adicional, o ensaio de inibição da hemaglutinação (IH) foi levado a cabo e apenas foram encontradas titulações positivas contra DEN-2 (tabela 13 e tabela 15) . Finalmente, foi levado a cabo o ensaio de neutralização in vitro e foram obtidas titulações de 1:1280 contra DEN-2 (tabela 14). Não foi encontrada neutralização da infecção virai contra o resto dos serotipos (tabela 15) . Utilizando os três testes, foram detectados altos níveis de anticorpos específicos do serotipo, semelhantes aos obtidos após imunização com a proteína PLL2. 28

Tabela 12. Titulações do anticorpo contra DEN-2 a partir de soros obtidos através da imunização de ratinhos com PLL3.

Ratinho Titulações anti-DEN-2 (PLL3) Titulações anti-DEN-2 PBS C(-) 1 1: 128 000 < 1: 100 2 >1: 128 000 < 1: 100 3 >1: 128 000 < 1: 100 4 1:64 000 < 1: 100 5 >1: 128 000 < 1: 100 6 1:64 000 < 1: 100 7 >1: 128 000 < 1: 100 8 >1: 128 000 < 1: 100 9 1: 128 000 < 1: 100 10 >1: 128 000 < 1: 100

Tabela 13. Titulações dos soros por IH a partir de animais imunizados com PLL3.

Ratinho Titulações por IH* anti-DEN-2 (PLL3) Titulações por IH anti-DEN-2 PBS C(-) 1 >1: 640 < 1 5 2 1: 320 < 1 5 3 1: 320 < 1 5 4 >1: 640 < 1 5 5 1: 320 < 1 5 6 >1: 640 < 1 5 7 >1: 640 < 1 5 8 >1: 640 < 1 5 9 1: 320 < 1 5 10 >1: 640 < 1 5 *As titulações por IH foram definidas como a diluição mais alta capaz de inibir a hemaglutinação dos eritrócitos de ganso contra 8 unidades de hemaglutinação virai. 29

Tabela 14. Ensaio de Neutralização virai com os soros de animais imunizados com PLL3.

Ratinho Titulados neutralizantes anti-DEN-2 PLL3 Titulados neutralizantes DEN-2 PBS C(-) anti- 1 >1: 1280 < 1: 5 2 >1: 1280 < 1: 5 3 >1: 1280 < 1: 5 4 1: 640 < 1: 5 5 >1: 1280 < 1: 5 6 >1: 1280 < 1: 5 7 >1: 1280 < 1: 5 8 >1: 1280 < 1: 5 9 1: 640 < 1: 5 10 >1: 1280 < 1: 5 * Os Titulados neutralizantes foram definidas como a diluição mais alta do soro tendo 50% de redução do número de placas virais.

Tabela 15. Ensaio de reactividade cruzada contra todos os serotipos virais por ELISA, IH e neutralização virai com os soros dos animais imunizados com PLL3.

Mistura de soros1 ELISA (anti-DEN- 1) ELISA (anti-DEN- 2) ELISA (anti-DEN- 3) ELISA (anti-DEN- 4) 1(PLL3) < 1/100 > 1: 128 000 < 1/100 < 1/100 2(PLL3) < 1/100 > 1: 128 000 < 1/100 < 1/100

Mistura de IH2anti- IH anti- IH anti- IH anti- soros1 DEN-1 DEN-2 DEN-3 DEN-4 PLL3 <1/5 >1/320 <1/5 <1/5

Mistura de soros2 Titulados neutralizan tes 3 anti-DEN-1 Titulados neutralizan tes anti-DEN-2 Titulados neutraliza ntes anti-DEN-3 Titulados neutraliza ntes anti-DEN-4 1(PLL3) <1/5 > 1: 1280 <1/5 <1/5 2(PLL3) <1/5 > 1: 1280 <1/5 <1/5 1

Cada mistura foi formada por três soros. 2

As titulações de IH foram definidas como a diluição mais 3 alta capaz de inibir a hemaglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades de hemaglutinação virais. 30 *** Os Titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais alta de soros tendo 50% de redução do número de placas virais. EXEMPLO 13. Obtenção de pLHl A sequência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína do envelope do vírus DEN-1 (Sec. Id, N° 32) foi amplificada com os oligonucleótidos identificados na lista de sequências como Sequência N°6 e Sequência N°7 do genótipo da estirpe do vírus DEN-1 (Chu M. C., 0'Rourke E. J., Trent D. W. Genetic relatedness among structural protein genes of dengue 1 virus strains. J. Gen. Virol. 1989. 70: 1701-1712). O vector foi criado por digestão do plasmídeo pM108 His com Xba II Bam Hl, o qual contém a sequência de nucleótidos que codifica para a região N-terminal de MDH e para uma sequência de 6 Histidinas (Sequência N° 23) . Através da ligação, os potenciais recombinantes foram analisados por digestão enzimática de restrição e os clones positivos foram sequenciados para verificar as junções. As células competentes W3110 foram transformadas com o clone seleccionado, denominado pLHl (Fig.4 e Sequência N°33) . Após o crescimento da colónia em meio Luria Bertani (LB), foi efectuado SDS-PAGE do lisado celular. Como resultado foi obtida uma banda de 25 kDA, a qual representa 10% do total de proteínas celulares. O tamanho da proteína obtida corresponde à soma da região N-terminal da proteína MDH e o fragmento da proteína DENe a partir do vírus DEN-1. A proteína foi reconhecida por Imunomarcação com anticorpos policlonais (PA) anti-DEN-2 contidos em HMAF. Esta proteína foi denominada PLHl (Sequência N°34) . 31 EXEMPLO 14. Purificação da proteína PLHl A biomassa obtida a partir da estirpe de E. Coli transformada com pLHl e crescida a 37 °C foi delectado por Prensa francesa. A proteina recombinante foi obtida de um modo preponderante como uma forma insolúvel associada ao pellet da disrupção celular. A proteina foi extraida a partir do pellet com ureia a 7 M e o sobrenadante, contendo a proteína PLHl, foi colocado numa coluna G-25 de modo a eliminar o agente caotrópico. A fracção obtida foi então colocada na coluna Chelating-sepharose FF (Pharmacia, UK) , na presença de iões de Cu++. A proteína foi eluída com Imidazol a 60 mM e o volume obtido foi colocado numa coluna G-25 para finalmente obter a proteína no tampão de formulação (PBS) . Esta preparação foi utilizada para estudos imunológicos. EXEMPLO 15. Caracterização Antigénica de PLHl A fracção purificada de PLHl foi caracterizada tanto pelo seu reconhecimento por diferentes soros policlonais e/ou anticorpos monoclonais de murino, assim como por soros humanos positivos para Dengue (tabela 16).

Os reconhecimentos mais altos em Dot blot foram obtidos com anti-DEN-1 de HMAF. O reconhecimento por HMAF contra os outros serotipos foi menor do que no caso do serotipo 1. Os anticorpos originados por outros flavivírus tais como o Vírus da Febre Amarela e o vírus da Encefalite de Saint Louis não tiveram qualquer reconhecimento. Finalmente, foi medida a reactividade contra três soros humanos de altas titulações e três de baixas titulações contra DEN-1, atingindo um sinal substancial em ambos os casos por Western blot e Dot blot. 32

Tabela 16. Reactividade da proteína PLH1 a anticorpos monoclonais e policlonais.

Abs** Especificidade** * PLHl* HMAF DEN-1 ++ HMAF DEN-2 + HMAF DEN-3 - HMAF DEN-4 - HMAF EEE - HMAF YFV - HMAF SLV - Mab3H5 NT - * Foi aplicado um total de 10 μΐ de PLH1 purificada. A intensidade do sinal obtido foi avaliada de + a ++. ** Foi utilizada HMAF a 1:100 enquanto a Mab 3H5 foi utilizada numa diluição de 1:1000. *** EEE: Vírus da Encefalite de Equinos. YFV: Vírus da Febre Amarela. SLV: Vírus da Encefalite de Saint Louis. NT: Serotipo específico neutralizante. EXEMPLO 16. Caracterização da resposta do anticorpo gerada por PLHl

Foram imunizados i.p. um total de 25 ratinhos Balb/c com 35 μΐ de PLHl purificada em adjuvante Freund; 10 animais foram sangrados após quatro doses e foram avaliados os anticorpos anti-DEN por ELISA. Foram obtidas altas titulações de anticorpos contra DEN-1 enquanto não foi obtida reactividade contra o resto dos serotipos (tabela 17 e tabela 20). De um modo adicional, o ensaio de inibição da hemaglutinação (IH) foi levado a cabo e apenas foram encontradas titulações positivas contra DEN-1 (tabela 18 e tabela 20). Finalmente, o ensaio de neutralização in vitro foi levado a cabo e foram obtidas titulações de 1:320 contra DEN-1. Contudo, não foi encontrada neutralização da infecção virai contra o resto dos serotipos (tabela 19 e tabela 20) . Estes resultados 33 indicam a alta especificidade do serotipo dos anticorpos induzidos por PLH1.

Tabela 17. Titulações do anticorpo contra DEN-1 a partir de soros obtidos através da imunização de ratinhos com PLH1.

Ratinho Titulações anti-DEN-1 (PLH1) Titulações anti-DEN-1 PBS C(-) 1 1/ 64 000 < 1 100 2 1/ 128 000 < 1 100 3 1/ 64 000 < 1 100 4 1/ 32 000 < 1 100 5 1/ 32 000 < 1 100 6 1/ 64 000 < 1 100 7 1/ 128 000 < 1 100 8 1/ 64 000 < 1 100 9 1/ 128 000 < 1 100 10 1/ 128 000 < 1 100

Tabela 18. Titulações dos soros por IH a partir de animais imunizados com PLH1.

Ratinho Titulaçõe anti-DEN- s por IH* -1 (PLH1) Titulações por IH* anti-DEN-1 PBS C(-) 1 >1: 640 < 1 5 2 1: 320 < 1 5 3 >1: 640 < 1 5 4 >1: 640 < 1 5 5 >1: 640 < 1 5 6 1: 320 < 1 5 7 1: 40 < 1 5 8 1: 320 < 1 5 9 >1: 640 < 1 5 10 < 1 : 5 < 1 5 *As titulações por IH foram definidas como a diluição mais alta capaz de inibir a hemaglutinação dos eritrócitos de ganso contra 8 unidades de hemaglutinação virai.

Tabela 19. Ensaio de Neutralização virai com os soros de animais imunizados com PLH1. 34

Ratinho Titulados neutralizantes* anti-DEN-1 (PLH1) Titulados neutralizantes* anti-DEN-1 PBS C(-) 1 1 : 80 < 1: 5 2 1 320 < 1: 5 3 1 : 40 < 1: 5 4 1 320 < 1: 5 5 1:80 < 1: 5 6 1 160 < 1: 5 7 1 320 < 1: 5 8 1 320 < 1: 5 9 1 320 < 1: 5 10 1 320 < 1: 5 * Os titulados neutralizantes foram definidas como a diluição mais alta de soro tendo 50% de redução do número de placas virais.

Tabela 20. Ensaio de reactividade cruzada contra todos os serotipos virais por ELISA, IH e neutralização virai com os soros dos animais imunizados com PLH1.

Mistura de soros* ELISA (anti- DEN-1) ELISA (anti- DEN-2) ELISA (anti-DEN- 3) ELISA (anti-DEN-4) 1(PLH1) 1: 128 000 < 1/100 < 1/100 < 1/100 2(PLHl) > 1: 128 000 < 1/100 < 1/100 < 1/100

Mistura de soros* IH**anti-DEN-l IH anti-DEN-2 IH anti-DEN-3 IH anti-DEN-4 PLHl >1: 320 <1/5 <1/5 <1/5

Mistura de soros* Titulados neutralizantes *** anti-DEN-1 Titulado s neutrali zantes anti- DEN-2 Titulados neutraliza ntes anti-DEN-3 Titulados neutraliz antes anti-DEN- 4 1(PLHl) 1: 160 <1/5 <1/5 <1/5 2(PLHl) 1: 320 <1/5 <1/5 <1/5 EXEMPLO 17. Obtenção de pLH2 A sequência nucleotidica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína do envelope do vírus DEN-1 (Sequência N° 32) foi amplificada com os oligonucleótidos identificados na lista de sequências como Sequência N°6 e 35

Sequência N°8 do genótipo da estirpe do vírus DEN-1 (Chu M. C., 0'Rourke E. J., Trent D. W. Genetic relatedness among structural protein genes of dengue 1 virus strains. J. Gen. Virol. 1989. 70: 1701-1712). O vector foi criado por digestão do plasmídeo pM84 His com Xba II Eco RI, o qual contém a sequência de nucleótidos que codifica para a proteína MDH e para uma sequência de 6 Histidinas (Sequência N° 26) . Esta digestão permite a inserção do fragmento amplificado por PCR dentro da região codificante para um domínio estrutural da proteína MDH. Através da ligação, os potenciais recombinantes foram analisados por digestão enzimática de restrição e os clones positivos foram sequenciados para verificar as junções. As células competentes MM294 foram transformadas com o clone seleccionado, denominado pLH2 (Fig.5 e Sequência N°35) . Após o crescimento da colónia em meio LB, foi efectuado SDS-PAGE do lisado celular. Como resultado foi obtida uma banda de 80 kDA, a qual representa 20% do total de proteínas celulares. O tamanho da proteína obtida corresponde à soma do tamanho da proteína MDH e do fragmento da proteína DENe a partir do vírus DEN-1. A proteína foi reconhecida por Imunomarcação por anti-DEN-2 de HMAF e foi denominada PLH2 (Sequência N°36). EXEMPLO 18. Purificação da proteína PLH2 A biomassa obtida a partir da estirpe de E. Coli transformada com pLH2 e crescida a 37 °C foi delectado por Prensa francesa. A proteína recombinante foi obtida em ambas as formas: solúvel e insolúvel. A proteína associada à fracção insolúvel foi extraída utilizando ureia a 7 M, e o sobrenadante, contendo a proteína PLH2, 36 foi colocado numa coluna G-25 de modo a eliminar o agente caotrópico. A fracção obtida foi então colocada na coluna Chelating-sepharose FF (Pharmacia, UK) , na presença de iões de Cu++. A coluna foi lavada com Imidazol a 40 mM e a proteína foi eluída com Imidazol a 100 mM. Finalmente, a fracção pura da proteína foi colocada numa coluna G-25 para obter a proteína no tampão de formulação (PBS). Esta preparação foi utilizada para estudos imunológicos. EXEMPLO 19. Caracterização Antigénica de PLH2 A fracção purificada de PLH2 foi caracterizada tanto pelo seu reconhecimento por diferentes soros policlonais e/ou anticorpos monoclonais de murino, assim como por soros humanos positivos para Dengue (tabela 21).

Os reconhecimentos mais altos em Dot blot foram obtidos com anti-DEN-1 de HMAF (maior que o obtido com PLH1) . O reconhecimento por HMAF contra os outros serotipos foi menor do que no caso do serotipo 1. Os anticorpos originados por outros flavivírus tais como o Vírus da Febre Amarela e o vírus da Encefalite de Saint Louis não tiveram qualquer reconhecimento. Finalmente, foi medida a reactividade contra os cinco soros humanos de altas titulações e três de baixas titulações contra DEN-2, atingindo um sinal substancial em ambos os casos por Western blot e Dot blot. 37

Tabela 21. Reactividade da proteína PLH2 a anticorpos monoclonais e policlonais.

Abs** Especificidade*** PLH2* HMAF DEN-1 +++ HMAF DEN-2 + HMAF DEN-3 - HMAF DEN-4 - HMAF EEE - HMAF YFV - HMAF SLV - Mab3H5 NT - * Foi aplicado um total de 10 μΐ de PLH2 purificada. A intensidade do sinal obtido foi avaliada de + a ++. ** Foi utilizada HMAF a 1:100 enquanto a Mab 3H5 foi utilizada numa diluição de 1:1000. *** EEE: Vírus da Encefalite de Equinos. YFV: Vírus da Febre Amarela. SLV: Vírus da Encefalite de Saint Louis. NT: Serotipo específico neutralizante. EXEMPLO 20. Caracterização da resposta do anticorpo gerada por PLH2

Foram imunizados i.p. um total de 25 ratinhos Balb/c com 20 μΐ de PLH2 purificada em adjuvante Freund; 10 animais foram sangrados após quatro doses e foram avaliados os anticorpos anti-DEN por ELISA. Foram obtidas altas titulações de anticorpos contra DEN-1 enquanto não foi obtida reactividade contra o resto dos serotipos (tabela 22 e tabela 25) . De um modo adicional, foi levado a cabo o ensaio IH e apenas foram encontradas titulações positivas contra DEN-1 (tabela 23 e tabela 25) . Finalmente, foi levado a cabo o ensaio de neutralização in vitro e foram obtidas titulações de neutralização de 1:1280 contra DEN-1 (tabela 24). Não foi encontrada neutralização da infecção virai contra o resto dos serotipos (tabela 25).

Tabela 22. Titulações do anticorpo contra DEN-1 a partir de soros obtidos através da imunização de ratinhos com PLH2. 38 38 Ratinho Titulações anti-DEN-1 (PLH2) Titulações anti-DEN-1 PBS C(—) 1 1: 128 000 < 1 100 2 > 1: 128 000 < 1 100 3 1: 64000 < 1 100 4 >1: 128 000 < 1 100 5 1: 128 000 < 1 100 6 1: 64000 < 1 100 7 > 1: 128 000 < 1 100 8 1: 128 000 < 1 100 9 >1: 128 000 < 1 100 10 >1: 128 000 < 1 100

Tabela 23. Titulações dos soros por IH a partir de animais imunizados com PLH2.

Ratinho Titulações por IH* anti-DEN-1 (PLH2) Titulações por IH anti-DEN -1 PBS C(-) 1 < 1: 5 < 1 5 2 >1 640 < 1 5 3 1 320 < 1 5 4 1 320 < 1 5 5 >1 640 < 1 5 6 >1 640 < 1 5 7 >1 640 < 1 5 8 1: 320 < 1 5 9 >1: 640 < 1 5 10 < 1: 5 < 1 5 * As titulações por IH foram definidas como a diluição mais alta capaz de inibir a hemaglutinação dos eritrócitos de ganso contra 8 unidades de hemaglutinação virai.

Tabela 24. Ensaio de Neutralização virai com os soros de animais imunizados com PLH2.

Ratinho Titulados neutralizantes* anti-DEN-1 (PLH2) Titulados neutralizantes* anti-DEN-1. C(-) 1 >1: 1280 < 1: 5 2 >1: 1280 < 1: 5 3 >1: 1280 < 1: 5 4 >1: 1280 < 1: 5 5 >1: 1280 < 1: 5 6 >1: 1280 < 1: 5 7 >1: 1280 < 1: 5 8 >1: 1280 < 1: 5 9 1: 640 < 1: 5 10 >1: 1280 < 1: 5 39 * Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais alta de soro tendo 50% de redução do número de placas virais.

Tabela 25. Ensaio de reactividade cruzada contra todos os serotipos virais por ELISA, IH e neutralização virai com os soros dos animais imunizados com PLH2.

Mistura de soros * ELISA (anti-DEN-1) ELISA (anti-DEN-2) ELISA (anti-DEN-3) ELISA (anti-DEN-4) 1 (PLH2) 1: 64 000 < 1/100 < 1/100 < 1/100 2 (PLH2) > 1: 128 000 < 1/100 < 1/100 < 1/100

Mistura de soros* IH**anti-DEN-l IH anti-DEN-2 IH anti-DEN-3 IH anti-DEN-4 PLH2 >1: 320 <1/5 <1/5 <1/5

Mistura de soros* Titulados neutralizantes *** anti-DEN-1 Titulados neutralizantes anti-DEN-2 Titulados neutralizante s anti-DEN-3 Titulados neutralizante s anti-DEN-4 1 (PLH2) >1: 1280 <1/5 <1/5 <1/5 2 (PLH2) >1: 1280 <1/5 <1/5 <1/5 * Cada mistura foi formada por três soros. ** As titulações de IH foram definidas como a diluição mais alta capaz de inibir a hemaglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades de hemaglutinação virais. *** Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais alta de soros tendo 50% de redução do número de placas virais. EXEMPLO 21. Obtenção de pLH3 A sequência nucleotidica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína do envelope do vírus DEN-1 (Sec. Id N° 32) foi amplificada com os oligonucleótidos identificados na lista de sequências como Sequência N°9 e Sequência N°10 do genótipo da estirpe do vírus DEN-1 (Chu M. C., 0"Rourke E. J., Trent D. W. Genetic relatedness among structural protein genes of dengue 1 virus strains. J. Gen. Virol. 1989. 70: 1701-1712). 40 0 vector foi criado por digestão do plasmideo pD4 com Bam HII Bam Hl, o qual contém a sequência de nucleótidos que codifica para a proteína MDH e para uma sequência de 6 Histidinas sem o codão de terminação (Sequência N° 29) . Esta digestão permite a fusão do fragmento amplificado por PCR após a região C-terminal da proteína MDH. Através da ligação, os potenciais recombinantes foram analisados por digestão enzimática de restrição e os clones positivos foram sequenciados para verificar as junções. As células competentes W3110 foram transformadas com o clone seleccionado, denominado pLH3 (Fig.6 e Sequência N°37) . Após o crescimento da colónia em meio LB, foi efectuado SDS-PAGE do lisado celular. Como resultado foi obtida uma banda de 80 kDA, a qual representa 20% do total de proteínas celulares. O tamanho da proteína obtida corresponde à soma do tamanho da proteína MDH e do fragmento da proteína DENe a partir do vírus DEN-1. A proteína foi reconhecida por Imunomarcação por anti-DEN- 1 de HMAF e foi denominada PLH3 (Sequência N°38). EXEMPLO 22. Purificação da proteína PLH3 A biomassa obtida a partir da estirpe de E. Coli transformada com pLH3 e crescida a 37 °C foi delectado por Prensa francesa. A proteína recombinante foi obtida em ambas as formas: solúvel e insolúvel. A partir da fracção insolúvel, a proteína foi extraída utilizando ureia a 6 M, e o sobrenadante, contendo a proteína PLH3, foi colocado numa coluna G-25 de modo a eliminar o agente caotrópico. A fracção obtida foi então colocada na coluna Chelating-sepharose FF (Pharmacia, UK), na presença de iões de Cu++. A coluna foi lavada com Imidazol a 30 mM e a proteína foi eluída com Imidazol a 250 mM. Finalmente, a fracção pura da proteína foi colocada numa coluna G-25 41 para obter a proteína no tampão de formulação (PBS). Esta preparação foi utilizada para estudos imunológicos. EXEMPLO 23. Caracterização Antigénica de PLH3 A fracção purificada de PLH3 foi caracterizada tanto pelo seu reconhecimento por diferentes soros policlonais e/ou anticorpos monoclonais de murino, assim como por soros humanos positivos para Dengue (tabela 26).

Os reconhecimentos mais altos em Dot blot foram obtidos com anti-DEN-1 de HMAF. 0 reconhecimento por HMAF contra os outros serotipos foi menor do que no caso do serotipo 1. Os anticorpos originados por outros flavivírus tais como o Vírus da Febre Amarela e o vírus da Encefalite de Saint Louis não tiveram qualquer reconhecimento. Finalmente, foi medida a reactividade contra três soros humanos de altas titulações e três de baixas titulações contra DEN-1, atingindo um sinal substancial em ambos os casos por Dot blot e Western blot.

Tabela 26. Reactividade da proteína PLH3 a anticorpos monoclonais e policlonais.

Abs** Especificidade*** PLH3* HMAF DEN-1 ++ + HMAF DEN-2 + HMAF DEN-3 - HMAF DEN-4 - HMAF EEE - HMAF YFV - HMAF SLV - Mab3H5 NT - * Foi aplicado um total de 10 μΐ de PLH3 purificada. A intensidade do sinal obtido foi avaliada de + a ++. ** Foi utilizada HMAF a 1:100 enquanto a Mab 3H5 foi utilizada numa diluição de 1:1000. 42 *** EEE: Vírus da Encefalite de Equinos. YFV: Vírus da Febre Amarela. SLV: Vírus da Encefalite de Saint Louis. NT: Serotipo específico neutralizante. EXEMPLO 24. Caracterização da resposta do anticorpo gerada por PLH3

Foram imunizados i.p. um total de 25 ratinhos Balb/c com 20 μΐ de PLH3 purificada em adjuvante Freund; 10 animais foram sangrados após quatro doses e foram avaliados os anticorpos anti-DEN por ELISA. Foram obtidas altas titulações de anticorpos contra DEN-1 enquanto não foi obtida reactividade contra o resto dos serotipos (tabela 27 e tabela 30). De um modo adicional, o ensaio de IH foi levado a cabo e apenas foram encontradas titulações positivas contra DEN-1 (tabela 28 e tabela 30) . Finalmente, foi levado a cabo o ensaio de neutralização in vitro e foram obtidas titulações de neutralização de 1:1280 contra DEN-1 (tabela 29). Não foi encontrada neutralização da infecção virai contra o resto dos serotipos (tabela 30).

Tabela 27. Titulações do anticorpo contra DEN-1 a partir de soros obtidos através da imunização de ratinhos com PLH3.

Ratinho Titulações anti-DEN-1 PLH3 Titulações anti-DEN-1 PBS Controlo (-) 1 1: 64000 < 1: 100 2 > 1: 128 000 < 1: 100 3 1: 64000 < 1: 100 4 >1: 128 000 < 1: 100 5 1: 128 000 < 1: 100 6 1: 128 000 < 1: 100 7 1: 128 000 < 1: 100 8 >1: 128 000 < 1: 100 9 1: 64000 < 1: 100 10 >1: 128 000 < 1: 100 43

Tabela 28. Titulações dos soros por IH a partir de animais imunizados com PLH3.

Ratinho Titulações by IH* anti-DEN-1 PLH3 Titulações by IH anti-DEN-1 PBS C(-) 1 1: 320 < 1 5 2 >1 640 < 1 5 3 >1 640 < 1 5 4 1 320 < 1 5 5 1 320 < 1 5 6 >1 640 < 1 5 7 1 320 < 1 5 8 < 1: 5 < 1 5 9 >1 640 < 1 5 10 >1 640 < 1 5 * As titulações por IH foram definidas como a diluição mais alta capaz de inibir a hemaglutinação dos eritrócitos de ganso contra 8 unidades de hemaglutinação virai.

Tabela 29. Ensaio de Neutralização virai com os soros de animais imunizados com PLH3.

Ratinho Titulados neutralizantes* anti-DEN-1 PLH3 Titulados neutralizantes* anti-DEN-1 PBS C (-) 1 >1: 1280 < 1: 5 2 >1: 1280 < 1: 5 3 >1: 1280 < 1: 5 4 1: 640 < 1: 5 5 1: 640 < 1: 5 6 >1: 1280 < 1: 5 7 >1: 1280 < 1: 5 8 >1: 1280 < 1: 5 9 >1: 1280 < 1: 5 10 >1: 1280 < 1: 5 * Os titulados neutralizantes foram definidas como a diluição mais alta de soro tendo 50% de redução do número de placas virais.

Tabela 30. Ensaio de reactividade cruzada contra todos os serotipos virais por ELISA, IH e neutralização virai com os soros dos animais imunizados com PLH3. 44

Mistura de soros* ELISA (anti-DEN-1) ELISA (anti-DEN-2) ELISA (anti-DEN- 3) ELISA (anti-DEN- 4) 1 (PLH3) 1: 128 000 < 1/100 < 1/100 < 1/100 2 (PLH3) > 1: 128 000 < 1/100 < 1/100 < 1/100

Mistura de IH**anti-DEN- IH anti-DEN-2 IH anti- IH anti- soros* 1 DEN-3 DEN-4 PLH3 >1: 320 <1/5 <1/5 <1/5

Mistura de soros* Titulados neutralizantes *** anti-DEN-1 Titulados neutralizantes anti-DEN-2 Titulados neutrali zantes anti-DEN-3 Titulados neutra lizantes anti-DEN-4 1 (PLH3) >1: 1280 <1/5 <1/5 <1/5 2 (PLH3) >1: 1280 <1/5 <1/5 <1/5 * Cada mistura foi formada por três soros. ** As titulações de IH foram definidas como a diluição mais alta capaz de inibir a hemaglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades de hemaglutinação virais. *** Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais alta de soros tendo 50% de redução do número de placas virais. EXEMPLO 25. Obtenção de pAZl A sequência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína do envelope do vírus DEN-3 (Seq. 39) foi amplificada com os oligonucleótidos identificados na lista de sequências como Sequência N°ll e Sequência N°12 do genótipo da estirpe do vírus DEN-3 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology. 1990. 176 (2): 643-647).

O vector foi criado por digestão do plasmídeo pM108 His com Xba II Bam Hl, o qual contém a sequência de nucleótidos que codifica para a região N-terminal de MDH e para uma sequência de 6 Histidinas (Sequência N° 23) . Através da ligação, os potenciais recombinantes foram analisados por digestão enzimática de restrição e os clones positivos foram sequenciados para verificar as 45 junções. As células competentes W3110 foram transformadas com o clone seleccionado, denominado pAZl (Fig.7 e Sequência N°40). Após o crescimento da colónia em meio Luria Bertani (LB), foi efectuado SDS-PAGE do lisado celular. Como resultado foi obtida uma banda de 25 kDA, a qual representa 10% do total de proteínas celulares. O tamanho da proteína obtida corresponde à soma da região N-terminal da proteína MDH e o fragmento da proteína DENe a partir do vírus DEN-3. A proteína foi reconhecida por Imunomarcação com anticorpos policlonais (PA) anti-DEN-3 contidos em HMAF. Esta proteína foi denominada pAZl (Sequência N°41). EXEMPLO 26. Purificação da proteína PAZl A biomassa obtida a partir da estirpe de E. Coli transformada com pAZl e crescida a 37 °C foi delectado por Prensa francesa. A proteína recombinante foi obtida de um modo preponderante como uma forma insolúvel associada ao pellet da disrupção celular. A proteína foi extraída a partir do pellet com ureia a 7 M e o sobrenadante, contendo a proteína PLH1, foi colocado numa coluna G-25 de modo a eliminar o agente caotrópico. A fracção obtida foi então colocada na coluna Chelating-sepharose FF (Pharmacia, UK), na presença de iões de Cu++. A proteína foi eluída com Imidazol a 60 mM e o volume obtido foi colocado numa coluna G-25 para finalmente obter a proteína no tampão de formulação (PBS) . Esta preparação foi utilizada para estudos imunológicos. EXEMPLO 27. Caracterização Antigénica de PAZl A fracção purificada de PAZl foi caracterizada tanto pelo seu reconhecimento por diferentes soros policlonais e/ou 46 anticorpos monoclonais de murino, assim como por soros humanos positivos para Dengue (tabela 31).

Os reconhecimentos mais altos em Dot blot foram obtidos com anti-DEN-3 de HMAF. 0 reconhecimento por HMAF contra os outros serotipos foi menor do que no caso do serotipo 3. Os anticorpos originados por outros flavivirus tais como o Virus da Febre Amarela e o virus da Encefalite de Saint Louis não tiveram qualquer reconhecimento. Finalmente, foi medida a reactividade contra três soros humanos de altas titulações e três de baixas titulações contra DEN-3, atingindo um sinal substancial em ambos os casos por Dot blot e Western blot.

Tabela 31. Reactividade da proteína PAZ1 para anticorpos monoclonais e policlonais

Abs** Especificidade*** PAZl HMAF DEN-1 - HMAF DEN-2 + HMAF DEN-3 ++ HMAF DEN-4 + HMAF EEE - HMAF YFV - HMAF SLV - Mab 3H5 NT - * Foi aplicado um total de 10 yg de PAZl purificada. A intensidade do sinal obtida foi avaliada a partir de + até ++. ** Foram utilizados HMAF a 1:100 enquanto que o Mab 3H5 foi utilizado na diluição 1:1000 *** EEE: vírus da Encefalite Equina. YFV: Vírus da Febre Amarela. SLV: vírus da Encefalite de Saint Louis. NT: Serotipo específico neutralizante. exemplo 28. Caracterização da resposta do anticorpo gerada pela PAZ1

Foram imunizados i.p. um total de 25 ratos Balb/c com 35 yg de PAZl purificada em adjuvante de Freund; 10 animais 47 foram sangrados após quatro doses e os anticorpos anti-DEN foram avaliados através de ELISA. Foram obtidos elevados titulados de anticorpo contra DEN-1 enquanto que, não foi obtida reactividade contra o resto dos serotipos (tabela 32 e tabela 35). Em adição, o ensaio de IH foi realizado e apenas foram verificados titulados positivos contra DEN-3 (tabela 33 e tabela 35) . Finalmente, foi realizado o ensaio de neutralização in vitro e foram obtidos titulados de neutralização de 1:320 contra DEN-3. Contudo, não foi verificada neutralização da infecção virai contra o resto dos serotipos (tabela 34 e tabela 35) . Estes resultados indicam a especificidade elevada de serotipos dos anticorpos desencadeados pela PAZ1.

Tabela 32. Titulados de anticorpo contra DEN-3 obtidos a partir de soros obtidos após imunização de ratos com PAZ1

Rato Titulados de anti-DEN-3 PAZl Titulados de anti-DEN-3 Controlo (-) PBS 1 1/64000 < 1:100 2 1/ 128 000 < 1:100 3 1/32000 < 1:100 4 1/64000 < 1:100 5 1/64000 < 1:100 6 1 / 128 000 < 1:100 7 1/64000 < 1:100 8 1/64000 < 1:100 9 1/128000 < 1:100 10 1/ 128 000 < 1:100 48

Tabela 33. Titulados através de IH dos soros obtidos a partir de animais imunizados com PAZ1

Rato Titulados através de IH* de anti-DEN-3 PAZ1 Titulados através de IH de anti-DEN-3 C (-) PBS 1 >1: 640 < 1:5 2 1:320 < 1:5 3 1: 320 < 1:5 4 1: 640 < 1:5 5 < 1/5 < 1:5 6 1: 320 < 1:5 7 <1/5 <1:5 8 1: 320 < 1:5 9 >1: 640 < 1:5 10 >1: 640 < 1:5 *0s titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemoglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação.

Tabela 34. Ensaio de neutralização virai com os soros de animais imunizados com PAZ1.

Rato Titulados neutralizantes de anti-DEN-3 PAZ1 Titulados neutralizantes de anti-DEN-3 C(-)PBS 1 1: 160 < 1 5 2 1: 320 < 1 5 3 1:320 < 1 5 4 1:320 < 1 5 5 1: 40 < 1 5 6 1: 40 < 1 5 7 1:320 < 1 5 8 1 320 < 1 5 9 1 160 < 1 5 10 1 320 < 1 5 *Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais.

Tabela 35. Ensaio de reactividade cruzada contra todos os serotipos virais através de ELISA, IH e neutralização virai com os soros de animais imunizados com PAZ1

Mistura de soros ELISA (anti-DEN- 1) ELISA (anti-DEN-2) ELISA (anti-DEN-3) ELISA (anti-DEN- 4) 1 (PAZ1) < 1/100 < 1/100 1: 64000 < 1/100 2 (PAZ2) < 1/100 < 1/100 > 1: 128 000 < 1/100 49

Mistura de IH** IH IH IH soros anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 PAZl <1/5 <1/5 >1: 320 < 1/5

Mistura de soros Titulados neutraliza ntes *** de anti-DEN-1 Titulados neutralizante s de anti-DEN-2 Titulados neutralizantes de anti-DEN-3 Titulados neutraliza ntes de anti-DEN-4 1 (PAZl) < 1: 5 <1:5 1: 320 <1:5 2 (PAZl) < 1: 5 <1:5 1: 320 <1:5 * Cada mistura era formada por três soros. ** Os titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemaglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação. *** Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais. EXEMPLO 29. Obtenção de pAZ2 A sequência de nucleótidos que codifica para os aminoácidos a partir de 286 até 426 da proteína do envelope obtida a partir do vírus DEN-3 (Sequência n° 39) foi amplificada com os oligonucleótidos identificados na lista de sequenciação como Sequência n° 11 e Sequência n° 13 de uma estirpe virai DEN-3 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology. 1990. 176 (2): 643-647). O vector foi produzido através de digestão do plasmídeo

His pM84 com Xba I/Eco RI, o qual contém a sequência de nucleótidos que codifica para a proteína MDH e para uma sequência de 6 Histidinas (Sequência n° 26) . Esta digestão permite a inserção do fragmento amplificado através de PCR dentro da região codificante para um domínio estrutural da proteína MDH. Após ligação, os recombinantes potenciais foram analisados através de 50 digestão com enzima de restrição e foram sequenciados os clones positivos para averiguação das junções. As células competentes MM294 foram transformadas com o clone seleccionado, denominado pAZ2 (Fig. 8 e Sequência n° 42) . Após crescimento da colónia em meio LB, foi realizado um SDS-PAGE do lisado celular. Como um resultado foi obtida uma banda de 80 kDa, a qual constituiu 20% das proteínas celulares totais. O tamanho da proteína obtida correspondeu à soma do tamanho da proteína MDH e ao fragmento da proteína DENe obtido a partir do vírus DEN-3. A proteína foi reconhecida em Immunoblotting através de um anti-DEN-3 de HMAF e foi denominada PAZ2 (Sequência n° 43). EXEMPLO 30. Purificação da proteína PAZ2 A biomassa obtida a partir de estirpe de E. colí transformada com pAZ2 e colocada a crescer a 37 °C foi delectado por prensa Francesa. A proteína recombinante foi obtida em ambas as formas: solúvel e insolúvel. A proteína associada à fracção insolúvel foi extraída utilizando Ureia a 7 M, e o sobrenadante, contendo a proteína PAZ2, foi aplicado numa coluna G-25 para eliminar o agente caotrópico. A fracção obtida foi então aplicada na coluna Chelating-sepharose FF (Pharmacia, UK) , na presença de iões Cu++. A coluna foi lavada com Imidazol a 40 mM e a proteína foi eluída com Imidazol a 100 mM. Finalmente, a fracção pura foi aplicada numa coluna G-25 para obter a proteína na formulação (PBS). Esta preparação foi utilizada para estudos imunológicos. EXEMPLO 31. Caracterização antigénica de PAZ2 A fracção purificada de PAZ2 foi caracterizada quer pelo seu reconhecimento de soros policlonais diferentes e/ou 51 anticorpos monoclonais de murino, assim como através de soros humanos positivos para Dengue (tabela 36).

Os reconhecimentos mais elevados em Dot blotting foram obtidos com o anti-DEN-3 de HMAF (mais elevados do que aqueles obtidos com PAZ1). 0 reconhecimento através de HMAF contra os outros serotipos foi menor do que no caso de serotipo 3. Os anticorpos gerados por outros flavivirus como o virus da Febre Amarela e o vírus da

Encefalite de Saint Louis não tiveram qualquer reconhecimento de todo. Finalmente, foi medida a reactividade contra cinco soros humanos de titulados elevados e três dos titulados reduzidos contra DEN-3, atingindo um sinal substancial em ambos os casos através de Western blotting e Dot blotting.

Tabela 36. Reactividade da proteína PAZ2 para anticorpos monoclonais e policlonais.

Abs** Especificidade*** PAZ2 HMAF DEN-1 - HMAF DEN-2 - HMAF DEN-3 +++ HMAF DEN-4 + HMAF EEE - HMAF YFV - HMAF SLV - Mab 3H5 NT - * Foi aplicado um total de 10 yg de PAZ2 purificada. A intensidade do sinal obtida foi avaliada a partir de + até ++. ** Foram utilizados HMAF a 1:100 enquanto que o Mab 3H5 foi utilizado na diluição 1:1000. *** EEE: vírus da Encefalite Equina. YFV: Vírus da Febre Amarela. SLV: vírus da Encefalite de Saint Louis. NT: Serotipo específico neutralizante. EXEMPLO 32. Caracterização da resposta do anticorpo gerada pela PAZ2 52

Foram imunizados i.p. um total de 25 ratos Balb/c com 20 yg de PAZ2 purificada em adjuvante de Freund; 10 animais foram sangrados após quatro doses e os anticorpos anti-DEN foram avaliados através de ELISA. Foram obtidos elevados titulados de anticorpo contra DEN-3 enquanto que, não foi obtida reactividade contra o resto dos serotipos (tabela 37 e tabela 40). Em adição, foi realizado o ensaio IH e apenas foram verificados titulados positivos contra DEN-3 (tabela 38 e tabela 40). Finalmente, foi realizado o ensaio de neutralização in vítro e foram obtidos titulados de neutralização de 1: 1280 contra DEN-3 (tabela 39) . Não foi verificada neutralização da infecção virai contra o resto dos serotipos (tabela 40).

Tabela 37. Titulados de anticorpo contra DEN-3 obtidos a partir dos soros obtidos após imunização de ratos com (PAZ2)

Rato Titulados de anti-DEN-3 PAZ2 Titulados de anti-DEN-3 Controlo (-) PBS 1 >1: 128 000 < 1:100 2 1: 128 000 < 1:100 3 >1: 128 000 < 1:100 4 >1: 128 000 < 1:100 5 1: 128 000 < 1:100 6 >1: 128 000 < 1:100 7 1: 64000 < 1:100 8 >1: 128 000 < 1:100 9 1: 64000 < 1:100 10 >1: 128 000 < 1:100 53

Tabela 38. Titulados através de IH dos soros obtidos a partir de animais imunizados com PAZ2

Rato Titulados de anti-DEN-3 PAZ2 Titulados de anti-DEN-3 PBS 1 >1: 640 < 1:5 2 1: 320 < 1:5 3 >1: 640 < 1:5 4 >1: 640 < 1:5 5 >1: 640 < 1:5 6 1:320 < 1:5 7 <1: 5 < 1:5 8 1: 320 < 1:5 9 >1: 640 < 1:5 10 >1: 640 < 1:5 *0s titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemoglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação.

Tabela 39. Ensaio de neutralização virai com os soros de animais imunizados com PAZ2.

Rato Titulados neutralizantes de anti-DEN-3 PAZ2 Titulados neutralizantes de anti-DEN-3 C(-)PBS 1 >1 1280 < 1 5 2 >1 1280 < 1 5 3 >1 1280 < 1 5 4 >1 1280 < 1 5 5 >1 1280 < 1 5 6 1 640 < 1 5 7 >1 1280 < 1 5 8 1 640 < 1 5 9 >1 1280 < 1 5 10 1 640 < 1 5 *0s titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais. 54

Tabela 40. Ensaio de reactividade cruzada contra todos os serotipos virais através de ELISA, IH e neutralização virai com os soros de animais imunizados com PAZ2

Mistura de soros* ELISA (anti-DEN-1) ELISA (anti-DEN- 2) ELISA (anti-DEN-3) ELISA (anti-DEN-4) 1 (PAZ2) < 1/100 < 1/100 > 1: 128 000 < 1/100 2 (PAZ2) < 1/100 < 1/100 > 1: 128 000 < 1/100

Mistura de soros* IH** anti-DEN-1 IH anti-DEN-2 IH anti-DEN-3 IH anti-DEN-4 PAZ2 <1/5 <1/5 >1/ 320 < 1/5

Mistura de soros Titulados neutralizantes*** de anti-DEN-1 Titulados neutralizantes de anti-DEN-2 Titulados neutralizantes de anti-DEN-3 Titulados neutralizantes de anti-DEN-4 1 (PAZ2) < 1: 5 < 1: 5 >1: 1280 <1:5 2 (PAZ2) < 1: 5 < 1: 5 >1: 1280 <1:5 * Cada mistura era formada por três soros. ** Os titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemaglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação. *** Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais. EXEMPLO 33. Obtenção de pAZ3 A sequência de nucleótidos que codifica para os aminoácidos a partir de 286 até 426 da proteína do envelope obtida a partir do vírus DEN-3 (Seq. 39) foi amplificada com os oligonucleótidos identificados na lista de sequenciação como Sequência n° 14 e Sequência n° 15 da estirpe virai DEN-3 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology. 1990. 176 (2): 643-647). O vector foi produzido através de digestão do plasmídeo pD4 com Bam Hl/ Bam Hl o qual contém a sequência de 55 nucleótidos que codifica para a proteína MDH e para uma sequência de 6 Histidinas sem codão de terminação (Sequência n° 29) . Esta digestão permite a fusão do fragmento amplificado através de PCR após a região C-terminal para a proteína MDH. Após ligação, os recombinantes potenciais foram analisados através de digestão com enzima de restrição e foram sequenciados os clones positivos para averiguação das junções. As células competentes W3110 foram transformadas com o clone seleccionado, denominado pAZ3 (Fig. 9 e Sequência n° 44). Após crescimento da colónia em meio LB, foi realizado um SDS-PAGE do lisado celular. Como um resultado foi obtida uma banda de 80 kDa, a qual constituiu 20% das proteínas celulares totais. O tamanho da proteína obtida correspondeu à totalidade do tamanho da proteína MDH e ao fragmento da proteína DENe obtido a partir do vírus DEN-3. A proteína foi reconhecida em Immunoblotting através de um anti-DEN-3 de HMAF e foi denominada PAZ3 (Sequência n° 45) . EXEMPLO 34. Purificação da proteína PAZ3 A biomassa obtida a partir de estirpe de E. coli transformada com pAZ3 e colocada a crescer a 37 °C foi delectado por prensa Francesa. A proteína recombinante foi obtida em ambas as formas: solúvel e insolúvel. A partir da fracção insolúvel, foi extraída a proteína utilizando Ureia a 7 M, e o sobrenadante, contendo a proteína PAZ3, foi aplicado numa coluna G-25 para eliminar o agente caotrópico. A fracção obtida foi então aplicada na coluna Chelating-sepharose FF (Pharmacia, UK) , na presença de iões Cu++. A coluna foi lavada com Imidazol a 45 mM e a proteína foi eluída com Imidazol a 230 mM. Finalmente, a fracção pura da proteína foi 56 aplicada numa coluna G-25 para obter a proteína no tampão de formulação (PBS). Esta preparação foi utilizada para estudos imunológicos. EXEMPLO 35. Caracterização antigénica de PAZ3 A fracção purificada de PAZ3 foi caracterizada quer pelo seu reconhecimento através de soros policlonais diferentes e/ou anticorpos monoclonais de murino, assim como através de soros humanos positivos para Dengue (tabela 26).

Os reconhecimentos mais elevados em Dot blotting foram obtidos com o anti-DEN-3 de HMAF. 0 reconhecimento através de HMAF contra os outros serotipos foi menor do que no caso de serotipo 3. Os anticorpos gerados pelos outros flavivírus como o vírus da Febre Amarela e o vírus da Encefalite de Saint Louis não tiveram qualquer reconhecimento de todo. Finalmente, foi medida a reactividade contra três soros humanos de titulados elevados e três dos titulados reduzidos contra DEN-3, atingindo um sinal substancial em ambos os casos através de Western blotting e Dot blotting.

Tabela 41. Reactividade da proteína PAZ3 para anticorpos monoclonais e policlonais.

Abs** Especificidade* ** PAZ 3 HMAF DEN-1 - HMAF DEN-2 - HMAF DEN-3 +++ HMAF DEN-4 + HMAF EEE - HMAF YFV - HMAF SLV - Mab 3H5 NT - * Foi aplicado um total de 10 pg de PAZ3 purificada. A intensidade do sinal obtida foi avaliada a partir de + até ++. 57 ** Foram utilizados HMAF a 1:100 enquanto que o Mab 3H5 foi utilizado na diluição 1:1000. *** EEE: virus da Encefalite Equina. YFV: Virus da Febre Amarela. SLV: vírus da Encefalite de Saint Louis. NT: Serotipo específico neutralizante. EXEMPLO 36. Caracterização da resposta do anticorpo gerada pela PAZ3

Foram imunizados i.p. um total de 25 ratos Balb/c com 20 yg de PAZ3 purificada em adjuvante de Freund; 10 animais foram sangrados após quatro doses e os anticorpos anti-DEN foram avaliados através de ELISA. Foram obtidos elevados titulados de anticorpo contra DEN-3 enquanto que, não foi obtida reactividade contra o resto dos serotipos (tabela 42 e tabela 45) . Em adição, o ensaio IH foi realizado e apenas foram verificados titulados positivos contra DEN-3 (tabela 43 e tabela 45) . Finalmente, foi realizado o ensaio de neutralização in vítro e foram obtidos titulados de neutralização de 1: 1280 contra DEN-3 (tabela 44). Não foi verificada neutralização da infecção virai contra o resto dos serotipos (tabela 45).

Tabela 42. Titulados de anticorpo contra DEN-3 obtidos a partir dos soros obtidos após imunização de ratos com PAZ 3

Rato Titulados de anti-DEN-3 PAZ 3 Titulados de antl-DEN-3 Controlo (-) PBS 1 >1: 128 000 < 1:100 2 1:128 000 < 1:100 3 >1: 128 000 < 1:100 4 1:128000 < 1:100 5 1:128000 < 1:100 6 > 1: 128 000 < 1:100 7 > 1: 128 000 < 1:100 8 1:128000 < 1:100 9 1:128000 < 1:100 10 > 1: 128 000 < 1:100 58

Tabela 43. Titulados através de IH dos soros obtidos a partir de animais imunizados com PAZ3

Rato Titulados através de IH* de anti-DEN-3 PAZ3 Titulados através de IH de anti-DEN-3 C(-)PBS 1 >1: 640 < 1:5 2 >1: 640 < 1:5 3 1: 320 < 1:5 4 < 1:5 < 1:5 5 >1: 640 < 1:5 6 < 1:5 < 1:5 7 1: 320 < 1:5 8 >1: 640 < 1:5 9 >1: 640 < 1:5 10 1: 320 < 1:5 *0s titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemoglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação.

Tabela 44. Ensaio de neutralização virai com os soros de animais imunizados com PAZ3.

Rato Titulados neutralizantes de anti-DEN-3 PAZ1 Titulados neutralizantes de anti-DEN-3 PBS C(—) 1 >1: 1280 < 1: 5 2 1: 640 < 1: 5 3 >1: 1280 < 1: 5 4 >1: 1280 < 1: 5 5 >1: 1280 < 1: 5 6 >1: 1280 < 1: 5 7 >1: 1280 < 1: 5 8 >1: 1280 < 1: 5 9 >1: 1280 < 1: 5 10 >1: 1280 < 1: 5 *0s titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais. 59

Tabela 45. Ensaio de reactividade cruzada contra todos os serotipos virais através de ELISA, IH e neutralização virai com os soros de animais imunizados Com PAZ3

Mistura de soros* ELISA (anti-DEN-1) ELISA (anti-DEN- 2) ELISA (anti-DEN- 3) ELISA (anti-DEN- 4) 1 (PAZ3) < 1/100 < 1/100 > 1: 128 000 < 1/100 2 (PAZ3) < 1/100 < 1/100 1: 128 000 < 1/100

Mistura de soros* IH** anti-DEN-1 IH anti-DEN-2 IH anti-DEN-3 IH anti-DEN-4 PAZ 3 <1/5 <1/5 >1/ 320 < 1/5

Mistura de soros* Titulados neutralizantes*** de anti-DEN-1 Titulados neutralizantes de anti-DEN-2 Titulados neutralizantes de anti-DEN-3 Titulados neutralizantes de anti-DEN-4 1 (PAZ3) <1:5 < 1: 5 >1: 1280 < 1: 5 2 (PAZ3) <1:5 < 1: 5 >1: 1280 < 1: 5 * Cada mistura foi formada por três soros. ** Os titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemaglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação. *** Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais. EXEMPLO 37. Obtenção de pIDl A sequência de nucleótidos que codifica para os aminoácidos a partir de 286 até 426 da proteína do envelope obtida a partir do vírus DEN-4 (Sequência n° 46) foi amplificada com os oligonucleótidos identificados na lista de sequenciação como Sequência n° 17 e Sequência n° 18 do genótipo de estirpe virai de DEN-4 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 virai DNA sequences: Analysis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155: 77-88). 60 O vector foi produzido através de digestão do plasmideo His pM 108 com XBa I/Bam Hl, o qual contém a sequência de nucleótidos que codifica para a região N-terminal da MDH e para uma sequência de 6 Histidinas (Sequência n° 23) . Após ligação, os recombinantes potenciais foram analisados através de digestão com enzima de restrição e foram sequenciados os clones positivos para averiguação das junções. As células competentes W3110 foram transformadas com o clone seleccionado, denominado pIDl (Fig. 10 e Sequência n° 47) . Após crescimento da colónia em meio Luria Bertani (LB), foi realizado um SDS-PAGE do lisado celular. Como um resultado foi obtida uma banda de 25 kDa, a qual constituiu 10% das proteínas celulares totais. O tamanho da proteína obtida correspondeu à totalidade da região N-terminal da proteína MDH e ao fragmento da proteína DENe obtido a partir do vírus DEN-4. A proteína foi reconhecida em Immunoblotting através de anticorpos policlonais (AP) anti-DEN-4 contidos nos HMAF. Esta proteína foi denominada PIDl (Sequência n° 48) . EXEMPLO 38. Purificação da proteína PIDl A biomassa obtida a partir da estirpe de E. coli transformada com pIDl e colocada a crescer a 37 °C foi delectado por prensa Francesa. A proteína recombinante foi obtida de um modo preponderante como forma insolúvel associada ao pellet da disrupção celular. A partir do pellet, a proteína foi extraída com ureia a 6 M e o sobrenadante, contendo a proteína PIDl, foi aplicado numa coluna G-25 para eliminar o agente caotrópico. A fracção obtida foi então aplicada na coluna Chelating-sepharose FF (Pharmacia, UK) , na presença de iões Cu++. A proteína foi eluída com Imidazol a 60 mM e o volume obtido foi 61 aplicado numa coluna G-25 para obter finalmente a proteína no tampão de formulação (PBS). Esta preparação foi utilizada para estudos imunológicos. EXEMPLO 39. Caracterização antigénica de PID1 A fracção purificada de PID1 foi caracterizada quer pelo seu reconhecimento através de soros policlonais diferentes e/ou anticorpos monoclonais de murino, assim como através de soros humanos positivos para Dengue (tabela 46).

Os reconhecimentos mais elevados em Dot blotting foram obtidos com o anti-DEN-4 de HMAF. 0 reconhecimento através de HMAF contra os outros serotipos foi menor do que no caso de serotipo 4. Os anticorpos gerados por outros flavivírus como o vírus da Febre Amarela e o vírus da Encefalite de Saint Louis não tiveram qualquer reconhecimento de todo. Finalmente, foi medida a reactividade contra três soros humanos de titulados elevados e três dos titulados reduzidos contra DEN-4, atingindo um sinal substancial em ambos os casos através de Western blotting e Dot blotting.

Tabela 46. Reactividade da proteína PIDl para anticorpos monoclonais e policlonais.

Abs1 2 Especificidade3 PIDl HMAF DEN-1 - HMAF DEN-2 - HMAF DEN-3 ++ + HMAF DEN-4 + HMAF EEE - HMAF YFV - HMAF SLV - Mab 3H5 NT - 1

Foi aplicado um total de 10 yg de PIDl purificada. A 2 intensidade do sinal obtida foi avaliada a partir de + 3 até ++. 62 ** Foram utilizados HMAF a 1:100 enquanto que o Mab 3H5 foi utilizado na diluição 1:1000. *** EEE: vírus da Encefalite Equina. YFV: Vírus da Febre Amarela. SLV: vírus da Encefalite de Saint Louis. NT: Serotipo específico neutralizante. EXEMPLO 40. Caracterização da resposta do anticorpo gerada pela PIDl

Foram imunizados i.p. um total de 25 ratos Balb/c com 35 yg de PIDl purificada em adjuvante de Freund; 10 animais foram sangrados após quatro doses e os anticorpos anti-DEN foram avaliados através de ELISA. Foram obtidos elevados titulados de anticorpo contra DEN-1 enquanto que, não foi obtida reactividade contra o resto dos serotipos (tabela 47 e tabela 50) . Em adição, o ensaio IH foi realizado e apenas foram verificados titulados positivos contra DEN-4 (tabela 48 e tabela 50) . Finalmente, foi realizado o ensaio de neutralização in vitro e foram obtidos titulados de neutralização de 1:320 contra DEN-4 (tabela 44). Contudo, não foi verificada neutralização da infecção virai contra o resto dos serotipos (tabela 49 e tabela 50). Estes resultados indicam a elevada especificidade de serotipos dos anticorpos desencadeados pela PIDl.

Tabela 47. Titulados de anticorpo contra DEN-4 obtidos a partir dos soros obtidos após imunização de ratos com PIDl 63

Rato Titulados de anti-DEN-4 PIDl Titulados de anti-DEN-4 Controlo (-) PBS 1 1/ 128 000 < 1:100 2 1/ 128 000 < 1:100 3 1/ 64 000 < 1:100 4 1/64000 < 1:100 5 1/ 128 000 < 1:100 6 1/ 32 000 < 1:100 7 1/ 128 000 < 1:100 8 1/ 32 000 < 1:100 9 1/ 128 000 < 1:100 10 1/ 128 000 < 1:100

Tabela 48. Titulados através de IH dos soros obtidos a partir de animais imunizados com PID1

Rato Titulados através de IH* de anti-DEN-4 PIDl Titulados através anti-DEN-4 PBS de IH de c(-) 1 1: 320 < 1:5 2 1: 320 < 1:5 3 1: 640 < 1:5 4 1 : 40 < 1:5 5 < 1/ 5 < 1:5 6 1: 320 < 1:5 7 1: 640 < 1:5 8 1: 640 < 1:5 9 1 : 40 < 1:5 10 1: 320 < 1:5 *0s titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemoglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação. 64

Tabela 49. Ensaio de neutralização virai com os soros de animais imunizados com PID1.

Rabo Titulados neutralizantes Titulados neutralizantes de anti- -DEN-4 P1D1 de anti-DEN -4 C(-)PBS 1 1 320 < 1 5 2 1 : 80 < 1 5 3 1 320 < 1 5 4 1 320 < 1 5 5 1 160 < 1 5 6 1 320 < 1 5 7 1 320 < 1 5 8 1 320 < 1 5 9 1 160 < 1 5 10 1 : 40 < 1 5 *0s titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais.

Tabela 50. Ensaio de reactividade cruzada contra todos os serotipos virais através de ELISA, IH e neutralização virai com os soros de animais imunizados com PID1

Mistura de soros* ELISA (anti-DEN-1) ELISA (anti-DEN- 2) ELISA (anti-DEN-3) ELISA (anti-DEN- 4) 1 (PID1) < 1/100 < 1/100 < 1/100 1: 64 000 2 (PID1) < 1/100 < 1/100 < 1/100 > 1: 128 000

Mistura de IH** IH IH IH soros* anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 PID1 <1/5 <1/5 < 1/5 >1:320

Mistura de soros* Titulados neutralizantes*** de anti-DEN-1 Titulados neutralizantes de anti-DEN-2 Titulados neutralizantes de anti-DEN-3 Titulados neutralizantes de anti-DEN-4 1 (PID1) < 1: 5 < 1: 5 < 1: 5 1: 160 2 (PID1) < 1: 5 < 1: 5 < 1: 5 1: 320 * Cada mistura era formada por três soros. ** Os titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemaglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação. *** Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais. 65 EXEMPLO 41. Obtenção de pID2 A sequência de nucleótidos que codifica para os aminoácidos a partir de 286 até 426 da proteína do envelope obtida a partir do vírus DEN-4 (Sequência n° 46) foi amplificada com os oligonucleótidos identificados na lista de sequenciação como Sequência n° 16 e Sequência n° 18 de uma estirpe virai de DEN-4 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 virai DNA sequences: Analysis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155: 77-88. 0 vector foi produzido através de digestão do plasmídeo His pM84 com Xba 1/ Eco RI, o qual contém a sequência de nucleótidos que codifica para a proteína MDH e para uma sequência de 6 Histidinas (Sequência n° 26) . Esta digestão permite a inserção do fragmento amplificado através de PCR dentro da região codificante para um domínio estrutural da proteína MDH. Após ligação, os recombinantes potenciais foram analisados através de digestão com enzima de restrição e foram sequenciados os clones positivos para averiguação das junções. As células competentes MM294 foram transformadas com o clone seleccionado, denominado pID2 (Fig. 11 e Sequência n° 49). Após crescimento da colónia em meio LB, foi realizado um SDS-PAGE do lisado celular. Como um resultado foi obtida uma banda de 80 kDa, a qual constituiu 20% das proteínas celulares totais. O tamanho da proteína obtida correspondeu à totalidade do tamanho da proteína MDH e ao fragmento da proteína DENe obtido a partir do vírus DEN-4. A proteína foi reconhecida em Immunoblotting através de um anti-DEN-4 de HMAF e foi denominada PID2 (Sequência n° 50) . 66 EXEMPLO 42. Purificação da proteína PID2 A biomassa obtida a partir da estirpe de E. coli transformada com pID2 e colocada a crescer a 37 °C foi delectado por prensa Francesa. A proteína recombinante foi obtida em ambas as formas: solúvel e insolúvel. A proteína associada à fracção insolúvel foi extraída com Ureia a 6 M, e o sobrenadante, contendo a proteína PID2, foi aplicado numa coluna G-25 para eliminar o agente caotrópico. A fracção obtida foi então aplicada na coluna Chelating-sepharose FF (Pharmacia, UK) , na presença de iões Cu++. A proteína foi lavada com Imidazol a 30 mM e a proteína foi eluída com Imidazol a 250 mM. Finalmente, a fracção pura foi aplicada numa coluna G-25 para obter a proteína na formulação (PBS). Esta preparação foi utilizada para estudos imunológicos. EXEMPLO 43. Caracterização antigénica de PID2 A fracção purificada de PID2 foi caracterizada quer pelo seu reconhecimento através de soros policlonais diferentes e/ou anticorpos monoclonais de murino, assim como através de soros humanos positivos para Dengue (tabela 51).

Os reconhecimentos mais elevados em Dot blotting foram obtidos com o anti-DEN-4 de HMAF (mais elevado do que aqueles obtidos com PID1). O reconhecimento através de HMAF contra os outros serotipos foi menor do que no caso de serotipo 4. Os anticorpos gerados por outros flavivírus como o vírus da Febre Amarela e o vírus da

Encefalite de Saint Louis não tiveram qualquer reconhecimento de todo. Finalmente, foi medida a reactividade contra cinco soros humanos de titulados elevados e três dos titulados reduzidos contra DEN-3, 67 atingindo um sinal substancial em ambos os casos através de Western blotting e Dot blotting.

Tabela 51. Reactividade da proteína PID2 para anticorpos monoclonais e policlonais.

Abs** Especificidade** * PID2 HMAF DEN-1 - HMAF DEN-2 - HMAF DEN-3 + HMAF DEN-4 +++ HMAF EEE - HMAF YFV - HMAF SLV - Mab 3H5 NT - * Foi aplicado um total de 10 pg de PID2 purificada. A intensidade do sinal obtida foi avaliada a partir de + até ++. ** Foram utilizados HMAF a 1:100 enquanto que o Mab 3H5 foi utilizado na diluição 1:1000. *** EEE: vírus da Encefalite Equina. YFV: Vírus da Febre Amarela. SLV: vírus da Encefalite de Saint Louis. NT: Serotipo específico neutralizante. exemplo 44. Caracterização da resposta do anticorpo gerada pela PID2

Foram imunizados i.p. um total de 25 ratos Balb/c com 20 yg de PID2 purificada em adjuvante de Freund; 10 animais foram sangrados após quatro doses e os anticorpos anti-DEN foram avaliados através de ELISA. Foram obtidos elevados titulados de anticorpo contra DEN-4 enquanto que, não foi obtida reactividade contra o resto dos serotipos (tabela 52 e tabela 55). Em adição, o ensaio IH foi realizado e apenas foram verificados titulados positivos contra DEN-4 (tabela 53 e tabela 54) . Finalmente, foi realizado o ensaio de neutralização in vitro e foram obtidos titulados de neutralização de 1: 1280 contra DEN-4 (tabela 54). Não foi verificada neutralização da infecção virai contra o resto dos serotipos (tabela 55). 68 68 DEN-4 obtidos a de ratos com

Tabela 52. Titulados de anticorpo contra partir dos soros obtidos após imunização PID2

Rato Titulados de anti-DEN-4 PID2 Titulados de anti-DEN-4 Controlo (-) PBS 1 1: 64000 < 1:100 2 >1: 128 000 < 1:100 3 1: 128 000 < 1:100 4 >1: 128 000 < 1:100 5 1: 64000 < 1:100 6 >1: 128 000 < 1:100 7 >1: 128 000 < 1:100 8 >1: 128 000 < 1:100 9 >1: 128 000 < 1:100 10 1: 128 000 < 1:100

Tabela 53. Titulados através de IH dos soros obtidos a partir de animais imunizados com PID2

Rato Titulados através de IH* de anti-DEN-4 (PID2) Titulados através de IH de anti-DEN-4 C(-) PBS 1 1: 320 < 1:5 2 1: 320 < 1:5 3 1: 640 < 1:5 4 1: 40 < 1:5 5 <1/5 < 1:5 6 1: 320 < 1:5 7 1:640 < 1:5 8 1:640 < 1:5 9 1:40 < 1:5 10 1: 320 < 1:5 *0s titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemoglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação. 69

Tabela 54. Ensaio de neutralização virai com os soros de animais imunizados com PID2.

Rato Titulados neutralizantes de anti-DEN-4 PID2 Titulados neutralizantes de anti-DEN-4 C(-)PBS 1 >1 1280 < 1 5 2 >1 1280 < 1 5 3 >1 1280 < 1 5 4 >1 1280 < 1 5 5 1 640 < 1 5 6 >1 1280 < 1 5 7 >1 1280 < 1 5 8 >1 1280 < 1 5 9 1 640 < 1 5 10 >1 1280 < 1 5 *0s titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais.

Tabela 55. Ensaio de reactividade cruzada contra todos os serotipos virais através de ELISA, IH e neutralização virai com os soros de animais imunizados com PID2

Mistura de soros* ELISA (anti-DEN-1) ELISA (anti-DEN-2) ELISA (anti-DEN-3) ELISA (anti-DEN-4) 1 (PID2) < 1/100 < 1/100 < 1/100 > 1: 128 000 2 (PID2) < 1/100 < 1/100 < 1/100 1: 64 000

Mistura de soros* IH** IH IH IH anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 PID2 <1/5 <1/5 < 1/5 >1/320

Mistura de soros* Titulados neutralizante s*** de anti-DEN-1 Titulados neutralizante s de anti-DEN-2 Titulados neutralizantes de anti-DEN-3 Titulados neutralizante s de anti-DEN-4 1 (PID2) < 1: 5 < 1: 5 < 1: 5 >1: 1280 2 (PID2) < 1: 5 < 1: 5 < 1: 5 >1: 1280 * Cada mistura era formada por três soros. ** Os titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemaglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação. *** Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais. EXEMPLO 45. Obtenção de pID3 70 A sequência de nucleótidos que codifica para os aminoácidos a partir de 286 até 426 da proteína do envelope obtida a partir do virus DEN-4 (Sequência n° 46) foi amplificada com os oligonucleótidos identificados na lista de sequenciação como Sequência n° 19 e Sequência n° 20 da estirpe virai de DEN-4 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 virai DNA sequences: Analysis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155: 77-88. O vector foi produzido através de digestão do plasmídeo pD4 com Bam Hl/Bam Hl, o qual contém a sequência de nucleótidos que codifica para a proteína MDH e para uma sequência de 6 Histidinas sem codão de terminação (Sequência n° 29). Esta digestão permite a fusão do fragmento amplificado através de PCR após a região C-terminal para a proteína MDH. Após ligação, os recombinantes potenciais foram analisados através de digestão com enzima de restrição e foram sequenciados os clones positivos para averiguação das junções. As células competentes W3110 foram transformadas com o clone seleccionado, denominado pID3 (Fig. 12 e Sequência n° 51) . Após crescimento da colónia em meio LB, foi realizado um SDS-PAGE do lisado celular. Como um resultado foi obtida uma banda de 80 kDa, a qual constituiu 20% das proteínas celulares totais. O tamanho da proteína obtida correspondeu à totalidade do tamanho da proteína MDH e ao fragmento da proteína DENe obtido a partir do vírus DEN-4. A proteína foi reconhecida em Immunoblotting através de um anti-DEN-4 de HMAF e foi denominada PID3 (Sequência n° 52). EXEMPLO 46. Purificação da proteína PID3 71 A biomassa obtida a partir da estirpe de E. coli transformada com pID3 e colocada a crescer a 37 °C foi delectado por prensa Francesa. A proteína recombinante foi obtida em ambas as formas: solúvel e insolúvel. A partir da fracção insolúvel, foi extraída a proteína utilizando Ureia a 6 M, e o sobrenadante, contendo a proteína PID3, foi aplicado numa coluna G-25 para eliminar o agente caotrópico. A fracção obtida foi então aplicada na coluna Chelating-sepharose FF (Pharmacia, UK) , na presença de iões Cu++. A coluna foi lavada com Imidazol a 45 mM e a proteína foi eluída com Imidazol a 200 mM. Finalmente, a fracção pura da proteína foi aplicada numa coluna G-25 para obter a proteína no tampão de formulação (PBS). Esta preparação foi utilizada para estudos imunológicos. EXEMPLO 47. Caracterização antigénica de PID3 A fracção purificada de PID3 foi caracterizada quer pelo seu reconhecimento através de soros policlonais diferentes e/ou anticorpos monoclonais de murino, assim como através de soros humanos positivos para Dengue (tabela 56).

Os reconhecimentos mais elevados em Dot blotting foram obtidos com o anti-DEN-4 de HMAF. O reconhecimento através de HMAF contra os outros serotipos foi menor do que no caso de serotipo 4. Os anticorpos gerados por outros flavivírus como o vírus da Febre Amarela e o vírus da Encefalite de Saint Louis não tiveram qualquer reconhecimento de todo. Finalmente, foi medida a reactividade contra três soros humanos de titulados elevados e três dos titulados reduzidos contra DEN-4, 72 atingindo um sinal substancial em ambos os casos através de Western blotting e Dot blotting.

Tabela 56. Reactividade da proteína PID3 para anticorpos monoclonais e policlonais.

Abs** Especificidade*** PID2 HMAF DEN-1 - HMAF DEN-2 - HMAF DEN-3 +++ HMAF DEN-4 + HMAF EEE - HMAF YFV - HMAF SLV - Mab 3H5 NT - * Foi aplicado um total de 10 pg de PID3 purificada. A intensidade do sinal obtida foi avaliada a partir de + até ++. ** Foram utilizados HMAF a 1:100 enquanto que o Mab 3H5 foi utilizado na diluição 1:1000. *** EEE: vírus da Encefalite Equina. YFV: Vírus da Febre Amarela. SLV: vírus da Encefalite de Saint Louis. NT: Serotipo específico neutralizante. EXEMPLO 48. Caracterização da resposta do anticorpo gerada pela PID3

Foram imunizados i.p. um total de 25 ratos Balb/c com 20 yg de PAZ3 purificada em adjuvante de Freund; 10 animais foram sangrados após quatro doses e os anticorpos anti-DEN foram avaliados através de ELISA. Foram obtidos elevados titulados de anticorpo contra DEN-4 enquanto que, não foi obtida reactividade contra o resto dos serotipos (tabela 57 e tabela 60). Em adição, o ensaio IH foi realizado e apenas foram verificados titulados positivos contra DEN-4 (tabela 58 e tabela 60) . Finalmente, foi realizado o ensaio de neutralização in vitro e foram obtidos titulados de neutralização de 1: 73 1280 contra DEN-4 (tabela 59) . Não foi verificada neutralização da infecção virai contra o resto dos serotipos (tabela 60).

Tabela 57. Titulados de anticorpo contra DEN-4 obtidos a partir dos soros obtidos após imunização de ratos com PID3

Rato Titulados de anti-DEN-4 (PID3) Titulados de anti-DEN-4 Controlo (-) PBS 1 >1: 128 000 < 1:100 2 >1: 128 000 < 1:100 3 >1: 128 000 < 1:100 4 1: 64000 < 1:100 5 1: 64000 < 1:100 6 >1: 128 000 < 1:100 7 1: 128 000 < 1:100 8 >1: 128 000 < 1:100 9 1: 128 000 < 1:100 10 >1: 128 000 < 1:100

Tabela 58. Titulados através de IH dos soros obtidos a partir de animais imunizados com PID3

Rato Titulados através de IH* de anti-DEN-4 PID3 Titulados através de IH de anti-DEN-4 C(-) PBS 1 >1: 640 < 1:5 2 1: 320 < 1:5 3 >1: 640 < 1:5 4 >1: 640 < 1:5 5 < 1: 5 < 1:5 6 >1: 640 < 1:5 7 1: 320 < 1:5 8 >1: 640 < 1:5 9 1: 320 < 1:5 10 >1: 640 < 1:5 74 *0s titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemoglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação.

Tabela 59. Ensaio de neutralização virai com os soros de animais imunizados com PID3.

Rato Titulados neutralizantes de anti-DEN-4 PID3 Titulados neutralizantes de anti-DEN-4 C(-)PBS 1 >1 1280 < 1: 5 2 >1 1280 < 1: 5 3 >1 1280 < 1: 5 4 >1 1280 < 1: 5 5 1 640 < 1: 5 6 >1 1280 < 1: 5 7 >1 1280 < 1: 5 8 1 640 < 1: 5 9 >1 1280 < 1: 5 10 >1 1280 < 1: 5 *0s titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais.

Tabela 60. Ensaio de reactividade cruzada contra todos os serotipos virais através de ELISA, IH e neutralização virai com os soros de animais imunizados com PID3

Mistura de soros* ELISA (anti-DEN-1) ELISA (anti-DEN- 2) ELISA (anti-DEN-3) ELISA (anti-DEN-4) 1 (PID3) < 1/100 < 1/100 < 1/100 > 1: 128 000 2 (PID3) < 1/100 < 1/100 < 1/100 1: 128 000

Mistura de soros* IH** IH IH IH anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 PID3 <1/5 <1/5 < 1/5 >1/320

Mistura de soros* Titulados Titulados Titulados Titulados neutrali- neutrali- neutrali- neutrali- zantes*** zantes de zantes de zantes de de anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 1 (PID3) < 1: 5 < 1: 5 < 1: 5 >1: 1280 2 (PID3) < 1: 5 < 1: 5 < 1: 5 >1/1280 * Cada mistura era formada por três soros. ** Os titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemaglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação. 75 *** Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais. EXEMPLO 49. Obtenção de pD4D2 A sequência de nucleótidos que codifica para os aminoácidos a partir de 286 até 426 da proteína E obtida a partir do vírus DEN-4 (Sequência n° 46) foi amplificada com os oligonucleótidos identificados na lista de sequenciação como Sequência n° 16 e Sequência n° 21 da estirpe virai de DEN-4 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 virai DNA sequences: Analysis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155: 77-88). O vector foi produzido através de digestão Xba/ Xba/ do plasmídeo pLL3, o qual contém o gene MDH mais uma sequência de 6 Histidinas na região 3' do gene e a sequência do fragmento E obtido a partir de DEN-2 na terminação 3'. Como resultado, foram obtidas duas regiões da proteína E a partir dos serotipos 2 e 4, fundidas com o mesmo gene MDH. Após ligação, os recombinantes potenciais foram analisados através de digestão com enzima de restrição e foram sequenciados os clones positivos para averiguação das junções. As células competentes MM294 foram transformadas com o clone seleccionado, denominado pD4D2 (Fig. 13 e Sequência n° 53). Após crescimento da colónia em meio LB, foi realizado um SDS-PAGE do lisado celular. Como um resultado foi obtida uma banda de 110 kDa, a qual consituiu 20% das proteínas celulares totais. 0 tamanho da proteína obtida correspondeu à totalidade do tamanho da proteína MDH e aos dois fragmentos da proteína DENe 76 obtidos a partir do vírus Dengue. Esta proteína foi reconhecida através de anticorpos policlonais anti-DEN-2 e anti-DEN-4 contidas nos HMAF. Esta proteína foi denominada PD4D2 (Sequência n° 54). EXEMPLO 50. Purificação da proteína PD4D2 A biomassa obtida a partir da estirpe de E. coli transformada com pD4D2 e colocada a crescer a 37 °C foi delectado por prensa Francesa. A proteína recombinante foi obtida quer solúvel ou insolúvel. Foi extraída a proteína a partir do pellet com ureia a 6 M e o sobrenadante, contendo a proteína PD4D2, foi aplicado numa coluna G-25 para eliminar o agente caotrópico. A fracção obtida foi então aplicada na coluna Chelating-sepharose FF (Pharmacia, UK), na presença de iões Cu++. Foi realizado um passo de lavagem com Imidazol a 30 mM e a proteína foi eluída com Imidazol a 250 mM. Finalmente, a preparação pura da proteína foi aplicada numa coluna G-25 para obter a proteína no tampão de formulação e utilizá-la para estudos imunológicos. EXEMPLO 51. Caracterização antigénica de PD4D2 A fracção purificada de PD4D2 foi caracterizada quer pelo seu reconhecimento através de soros policlonais diferentes e/ou anticorpos monoclonais de murino, assim como através de soros humanos positivos para Dengue (tabela 61).

Os reconhecimentos mais elevados em Dot blotting foram obtidos com o anti-DEN-2 e anti-DEN-4 de HMAF. O reconhecimento dos dois outros serotipos foi menor do que no caso dos serotipos 2 e 4. Os anticorpos gerados por outros flavívirus como o vírus da Febre Amarela e o vírus 77 da Encefalite de Saint Louis não tiveram qualquer reconhecimento de todo. Por outro lado, o Mab 3H5 teve de facto reactividade, semelhante àquela obtida para PLL2 e PLL3. Finalmente, foi medida a reactividade contra soros humanos de titulados reduzidos e elevados contra DEN-2 e DEN-4, atingindo um sinal substancial em ambos os casos através de Western blotting e Dot blotting.

Tabela 61. Reactividade da proteína PD4D2 contra anticorpos monoclonais e policlonais.

Abs** Especificidade** * PD4D2 HMAF DEN-1 - HMAF DEN-2 +++ HMAF DEN-3 - HMAF DEN-4 +++ HMAF EEE - HMAF YFV - HMAF SLV - Mab 3H5 NT - * Foi aplicado um total de 10 pg de PD4D2 purificada. A intensidade do sinal obtida foi avaliada a partir de + até ++. ** Foram utilizados HMAF a 1:100 enquanto que o Mab 3H5 foi utilizado na diluição 1:1000. *** EEE: vírus da Encefalite Equina. YFV: Vírus da Febre Amarela. SLV: vírus da Encefalite de Saint Louis. NT: Serotipo específico neutralizante. EXEMPLO 52. Caracterização da resposta do anticorpo gerada pela PD4D2

Foram imunizados i.p. um total de 25 ratos Balb/c com 20 yg de PD4D2 purificada em adjuvante de Freund; 10 animais foram sangrados após quatro doses e os anticorpos anti-DEN foram avaliados através de ELISA. Foram obtidos elevados titulados de anticorpo contra DEN-2 e DEN-4 enquanto que, não foi obtida reactividade contra o resto dos serotipos (tabela 62 e tabela 65) . Em adição, o 78 ensaio de inibição de hemoglutinação (IH) foi realizado e apenas foram verificados titulados positivos contra DEN-2 e DEN-4 (tabela 63 e tabela 65) . Finalmente, foi realizado o ensaio de neutralização in vitro e foram obtidos titulados de neutralização de >1:1280 contra DEN-2 e >1:1280 contra DEN-4 (tabela 64) . Não foi verificada neutralização da infecção virai contra o resto dos serotipos (tabela 65).

Tabela 62. Os titulados de anticorpo contra DEN-2 e DEN-4 obtidos a partir dos soros obtidos após imunização de ratos com PD4D2

Rato Titulados através (PD4D2) de ELISA Titulados através C(-) PBS de ELISA Anti-DEN-4 Anti-DEN-2 Anti- DEN-4 Anti- DEN-2 1 >1: 128 000 >1 : 128 000 < 1: 100 < 1: 100 2 1: 128 000 1: 128 000 < 1: 100 < 1: 100 3 >1: 128 000 >1 : 128 000 < 1: 100 < 1: 100 4 >1: 128 000 >1 : 128 000 < 1: 100 < 1: 100 5 1: 64 000 >1 : 128 000 < 1: 100 < 1: 100 6 >1: 128 000 1: 128 000 < 1: 100 < 1: 100 7 1: 64 000 >1 : 128 000 < 1: 100 < 1: 100 8 >1: 128 000 >1 : 128 000 < 1: 100 < 1: 100 9 >1: 128 000 1: 128 000 < 1: 100 < 1: 100 10 1: 128 000 >1 : 128 000 < 1: 100 < 1: 100 79

Tabela 63. Titulados através de IH dos soros obtidos a partir de animais imunizados com PD4D2

Rato Titulados através de IH (PD4D2) Titulados através de IH C(-) PBS Anti- -DEN-4 Anti -DEN-2 Anti -DEN-4 Anti -DEN-2 1 >1: 640 >1: 640 < 1: 5 < 1: 5 2 >1: 640 >1: 640 < 1: 5 < 1: 5 3 >1: 640 >1: 640 < 1: 5 < 1: 5 4 >1: 640 1: 320 < 1: 5 < 1: 5 5 1: 320 1: 640 < 1: 5 < 1: 5 6 >1: 640 >1: 640 < 1: 5 < 1: 5 7 >1: 640 >1: 640 < 1: 5 < 1: 5 8 1: 320 1: 320 < 1: 5 < 1: 5 9 1: 320 1: 320 < 1: 5 < 1: 5 10 >1: 640 >1: 640 < 1: 5 < 1: 5 *0s titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemoglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação.

Tabela 64. Ensaio de neutralização virai com os soros de animais imunizados com PD4D2.

Rato Titulados neutralizantes* (PD4D2) Titulados n< c(- sutralizantes PBS Anti -DEN-4 Anti -DEN-2 Anti -DEN-4 Anti-DEN-2 1 >1: 1280 >1: 1280 < 1: 5 < 1: 5 2 >1: 1280 >1: 1280 < 1: 5 < 1: 5 3 1: 1280 1: 1280 < 1: 5 < 1: 5 4 >1: 1280 >1: 1280 < 1: 5 < 1: 5 5 1: 640 1: 1280 < 1: 5 < 1: 5 6 >1: 1280 >1: 1280 < 1: 5 < 1: 5 7 >1: 1280 >1: 1280 < 1: 5 < 1: 5 8 1: 640 >1: 1280 < 1: 5 < 1: 5 9 >1: 1280 >1: 1280 < 1: 5 < 1: 5 10 >1: 1280 >1: 1280 < 1: 5 < 1: 5 *0s titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais.

Tabela 65. Ensaio de reactividade cruzada contra todos os serotipos virais através de ELISA, IH e neutralização virai com os soros de animais imunizados com PD4D2 80

Mistura de soros* ELISA (anti-DEN- 1) ELISA (anti-DEN-2) ELISA (anti-DEN- 3) ELISA (anti-DEN-4) 1 (PD4D2) < 1/100 > 1: 128 000 < 1/100 1: 64 000 2 (PD4D2) < 1/100 > 1: 128 000 < 1/100 > 1: 128 000

Mistura de IH* IH IH IH soros* anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 PD4D2 <1/5 >1: 320 < 1/5 >1: 320

Mistura de soros* Titulados neutralizantes*** de anti-DEN-1 Titulados neutralizantes de anti-DEN-2 Titulados neutralizantes de anti-DEN-3 Titulados neutralizantes de anti-DEN-4 1 (PD4D2) <1:5 >1: 1280 <1:5 >1: 1280 2 (PD4D2) <1:5 >1: 1280 <1:5 >1: 1280 * Cada mistura era formada por três soros. ** Os titulados de IH foram definidos como a diluição mais elevada capaz de inibir a hemaglutinação de eritrócitos de ganso contra 8 unidades virais de hemaglutinação. *** Os titulados neutralizantes foram definidos como a diluição mais elevada de soro que apresenta redução a 50% do número de placas virais. EXEMPLO 53. Ensaio de protecção

Para a avaliação da protecção conferida a ratos imunizados com todas as variantes sujeitas a ensaio após desafio com DEN fatal homólogo, foram utilizados 15 ratos de cada grupo. Cada animal recebeu uma dose de 100 LD50 de DEN fatal através de inoculação intracraneal e estes foram observados durante 21 dias para estudar a percentagem de letalidade. Como controlos positivos, foram utilizados grupos de 15 ratos imunizados com as quatro preparações virais (DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4). Todos os ratos destes grupos controlo sobreviveram 81 enquanto que os ratos do controlo negativo adoeceram entre 7-11 dias após desafio; atingindo, então, uma mortalidade de 100%. Finalmente, os grupos imunizados com as proteínas de fusão sob estudo tinham uma protecção entre 80% e 100% e em todos os casos, foram verificadas diferenças significativas no que diz respeito ao grupo controlo (tabela 66) .

Tabela 66. Percentagem de sobrevivência em ratos imunizados com as variantes de proteína sujeitos a ensaio após desafio com o vírus Dengue fatal homólogo.

Imunogénio Percentagem de sobrevivência* PBS 0 DEN-1 100 DEN-2 100 DEN-3 100 DEN-4 100 PLL1 86 PLL2 100 PLL3 100 PLHl 80 PLH2 100 PLH3 100 PAZ1 80 PAZ 2 100 PAZ 3 100 PID1 86 PID2 100 PID3 100 PD4D2 100 (DEN-4) 100 (DEN-2) *Foi calculada: (# de ratos que sobreviveram)/(# total de ratos). Os dados dos sobreviventes foram retirados 21 dias após desafio. No caso de ratos imunizados com pD4D2, foram desafiados 15 com DEN-4 e 15 com DEN-2. 82 EXEMPLO 54. Resposta linfoproliferativa

Os animais obtidos a partir de grupos diferentes imunizados com as proteínas quiméricas contendo o fragmento E obtido a partir de DEN-2 (PLLl, PLL2 e PLL3), e um grupo placebo, foram sacrificados 15 dias após a última dose. Depois, o baço dos animais foi colhido e foi estudada a resposta linfoproliferativa contra os quatro serotipos de vírus Dengue. A tabela 67 apresenta os resultados dos índices de estimulação obtidos, os quais demonstram que foi atingida uma resposta específica de serotipo.

Tabela 67. índices de estimulação, contra os quatros serotipos virais Dengue, de linfócitos obtidos a partir de ratos imunizados com PLLl, PLL2 e PLL3. PLLl PLL2 PLL3 C (-) DEN-1 1,3 1 1,0 0,8 1,2 DEN-2 12,5 10,3 8,9 1,4 DEN-3 1,0 1,6 1,8 1,4 DEN-4 1,7 1,5 1,7 1,1 Antigénio de controlo 1,1 1,0 1,3 0,9 PHA** 13,3 16,5 11,1 12, 0 * índice de estimulação: quociente das contagens das amostras por minuto entre as contagens por minuto do controlo da síntese espontânea de DNA.

Agente mitogénico: Fitohemaglutinina. 1 1 83

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> CENTRO DE ENGENHARIA GENÉTICA E BIOTECNOLOGIA

<120> CADEIAS QUIMÉRICAS QUE CODIFICAM PARA PROTEÍNAS QUE INDUZEM EFEITOS CONTRA VÍRUS <130> Dengue <140> <141> <160> 54 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(25) <223> Sequência do primer Xba-I primer para amplificação do fragmento DENe-2 <4 0 0 > 1 cttctagaca ggctgcgcat ggaca 25

<210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(29) 84 <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-2 <4 00> 2 gtggatcctt accctcccag gcttccaaa 29

<210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <2 2 0 > <221> ligação do primer <222> (1)..(25) <223> Sequência do primer Eco-RI para amplificação do fragmento DENe-2 <4 00> 3 atgaattcac gcctcccaga gatcc 25

<210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(21) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-2 <4 00> 4 cttggatcca ggctgagaat g 21

<210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> 85 <221> ligação do primer <222> (1)..(31) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-2 <4 00> 5 gaggatcctt aaccacccag agacccaaaa t 31

<210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(25) <223> Sequência do primer Xba-I para amplificação do fragmento DENe-1 <4 00> 6 cttctagaca ggctcaaaat ggata 25

<210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(28) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-1 <4 00> 7 gaggatcctt acccgccaat agaaccga 28

<210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli 86 <2 2 Ο > <221> ligação do primer <222> (1)..(25) <223> Sequência do primer Eco-RI para amplificação do fragmento DENe-1 <400> 8 acgaattcac ccctcctata gatcc 25

<210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(24) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-1 <400> 9 acaccttgga tccagactaa aaat 24

<210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(26) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-1 <400> 10 ccggatccgt gaattaccca cctata 26 <210> 11 <211> 29

<212> DNA 87 <213> Escherichia coli <2 2 Ο > <221> ligação do primer <222> (1)..(29) <223> Sequência do primer Xba-I para amplificação do fragmento DENe-3 <4 0 0 > 11 tttctagata gactcaagat ggacaaatt 29

<210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(28) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-3 <4 0 0> 12 gaggatcctt aaccacccac tgaaccaa 28

<210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <2 2 0 > <221> ligação do primer <222> (1) .. (25) <223> Sequência do primer Eco-RI para amplificação do fragmento DENe-3 <4 0 0 > 13 25 aagaattcac accacccaca gatcc 88

<210 > 14 <211> 23 <212 > DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(23) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-3 <4 0 0 > 14 acttaggatc cagactcaag atg 23

<210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(26) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-3 <4 0 0 > 15 gaggatcctt aaccacccac tgaacc 26

<210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1) . . (30) <223> Sequência do primer Xba-I para amplificação do fragmento DENe- 4 89 <4 Ο Ο > 16 cttctagaca aagtgcgtat ggagaaattg 30

<210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(28) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-4 <4 0 0 > 17 gaggatcctt aaccaccaac agaaccaa 28

<210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(25) <223> Sequência do primer Eco-RI para amplificação do fragmento DENe-4 <400> 18 atgaattcag tccaccaacg ctacc 25

<210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(27) 90 <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-4 <4 0 0 > 19 ggccatctag gatccaaagt gcgtatg 27

<210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(28) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-4 <400> 20 gaggatcctt agccaccaac cgaaccaa 28

<210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(26) <223> Sequência do primer Xba-I para amplificação do fragmento DENe-4 <4 00> 21 attctagaag accaccaacg gaacca 26

<210> 22 <211> 429 <212> DNA <213> Escherichia coli 91 <220> <2 21> gene <222> (1) .. (426) <223> Sequência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína de envelope DEN-2 <400> 22 gacaggctga gaatggacaa actacagctc aagtttaaaa ttgtgaagga aatageagaa caatatgaag gggacggetc tccatgtaaç agacacgtct taggtcgect gattacagtt gfccaacatag aagcagaacc fcccafctcgga ggacaattga aacteaactg gtttaagaaa õcaâtçagag gagcgaagag aatggceatt ctgggaggâ <210> 23 <211> 168 <212> DNA <213> Escherichia colí <22 0 > <221> gene <222> (1).. (168) <223> Sequência nucleotídica que aminoácidos da MDH <400> 23 atgggccacc accaccacca ccacgcçatg aaagtgcccg acattggcgg aaeagaaaat ggcgacacta tt:gct.gtgga cgataccctg <210> 24 <211> 603 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) .. (603) <223> Sequência nucleotídica que no plasmídeo pLLl aaaggaatgt catacíctât gtgtacagga 60 acacaacatg gaacsatagt tatcagagta 120 atcccttttg agataat.gga tttggaaaaa 180 aacccgatcg taacagaaaa agatagccca 240 gacagctaca tcatcatagg agtagagccg 300 ggaagttcea tcggccaaat gtttgagaca 360 tfcaggtgaca cagcctggga ttttggatcc 420 429 codifica para os primeiros 45 qfcagatasâa gaatggcttt agttgaattg 60 gtagatafcts tcgcggttga agfcaaacgfcg 120 attactttgg atxtagac 168 codifica para a proteína quimérica 92 <4 Ο Ο > 24 atgggccacc accaceaccs ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggçgacacta ttgctgtgga cgataccctg attaetttgg atctagacag gctgcgcatg 180 gacaaactac agctcaaagg aatgtcatac tctatgtgta caggaaagtt taaaattgtg 240 aaggaaatag cagaaaeaca acatggaaca atagttatca gagtacaata tgaaggggac 300 ggctctccat gtaagatccc ttttgagata atggatttgg aaaaaagaca cgtcttaggt 360 cgcctgatta cagttaaccc gatcgtaaca gaaaaagata gcccagtcaa catagaagca 420 gaacctccat tcggagaeag ctacatcatc ataggagtag agccgggaea attgaaactc 480 aactggttta agaaaggaag tcccatcggc caaatgtttg agacaacaat gagaggagcg 540 aagagaatgg ccattttagg tgacacagcc tgggattttg gaagcctggg agggtaagga 600 tcc 603 <210> 25 <211> 195

<212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CADEIA <222> (1)..(195) <223> Sequência aminoacídica da proteína PLL1 <400> 25

His His His His His His Met Vai Asp lis Arg Met Ma Leu Vai Glu 1 5 10 15 leu Lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His Glu Mn Vai Mp Ile Ile Ma 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile Ma Vai Mp Mp Tre leu Ile 35 40 45 Tre Leu Asp Leu Asp Arg Leu Arg Met Asp Lis Leu Gin Leu lis Gli 50 55 60 tfet Ser Tir Ser Met Cis Tre Gli Lis Fen Lis Ile Vai Lis Glu Ile 65 70 75 80 Ala Glu Tre Gin His Gli Tre Ile Vai Ile Mg Vai Gin Tir Glu Gli 85 90 95 Asp Gli Ser Pro Cis Lis Ile Pro Fen Glu Ile Met Mp Leu Glu Lis 100 105 110 Arg His Vai Leu Gli Arg Leu Ile Tre Vai Mn Pro Ile Vai Tre Glu 115 120 125 lis Asp Ser Pro Vai Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Fen Gli Mp Ser 130 135 140 Tir Ile Ile Ile Gli Vai Glu Pro Gli Gin Leu Lis Leu Mn Trp Fen 145 150 155 160 lis Lis Gli Ser Ser Ile Gli Gin Met Fen Glu Tre Tre Met Mg Gli 165 170 175 93

Ma Lis Arg ISfet Ala Ile Leu Gli Asp Tre Ma Tip Asp Fen Gli Ser 180 185 190 leu Gli Gli 195

<210> 26 <211> 1851 <212> DNA <213> Escherichía coli <2 2 0 > <2 21> gene <222> (1) .. (1851) MDH no plasmídeo pM84 His. <223> Sequência nucleotídica da <400> 26 atggqccacc accaceacca ccacgccatg aaagtgcccg aeattggcgg aacagaaaat ggcgácacta ttgctgtgga cgataeectg gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat gttgcaggcg tagteaaaga agttaaagfct ttgattgtcg tcgttgaage tgaaggeacg gccccggcgc aagaagccce taaagetgcc ggttctgccg afcgccgagta cgacgtggtc gctgcatttg cegcfcgcega tgaaggcttg ttgggcggcg tttgcctgaa cgtçggctgt gccgttatcg acgaagtgeg ccacttgget ctcgacatcg atatgcttcg cgcctacasa ttggcaggta tggcgaaaag ccgtaaagtg gatccgcacc acttggaagt gtegctgact accggcgaga aaaaaatcgfc tgccttcaaa accaaactgc ctttcattcc tgaagatccg ctgaaagaag taccgggcaa actgctgatt ggtacggttt acagcacgct gggttcgcgt acgcaaggcg cagaccgcga tttggtaaaa gacaacatta tggtcaacac caaaaccgtt gttacctttg aaggcgcgaa cgcgcctaaa gccgccggcc gcgcgcccaa cggcaaactc accgatcgcg gcttcatcga agfcggacaaa gccateggçg acatcgtcgg tcagccgátg gttgccgccç aaaaetgege eggceacaaa gttgcctaca cctcccccga agtgqcGtgg tccggccgca aastcaccaa agecaacfctc aacggttgcg acaagccgtt tsccaagctg ggcggcggca ttçtcggtcc gaacggtggc gaaatgggct gcgacgcggc agacategge atcggtafcgg cggcggaagt ggcaltgggt

<210> 27 <211> 2253 <212> DNA <213> Escherichía coli gtagataaaa gaatggcttt agttgááttg 60 gtagafcatta fccgcggttga agtaaacgtg 120 afctaefettgg atctagattt ggatctagaa ISO tcgatgaatt cgatggacgt acctgctgaa 240 aaagteggcq acaaaatctc tqaaggtggt 300 gcagccgctc ctaaagccga agcggctgcc 360 gctcctgctc cgcâagccgc gcaattcggc 420 gtafctgggtg geggtcccgg cggtfcactee 480 aaagtcgcca tcgtcgaacg ctacaaaact 540 atcçcttcca aagccttgtt gcacaatgcc 600 gccaacggta tcaaataccc cgaqccggaa 660 gacggcgfcsg tttcccgcct cacgggcggt 720 gacgttatcc aaggcgacgg gcaattctta 780 gccggcgacg cgtacgaace ggcagcccct 840 aactgtatca ttgcagcagg cagccgcgta 900 cgcatcatcg attccagcgg cgcattggct 960 atcggcggcg gcattatcgg ectegagatg 1020 ttggatgtgg ttgaa&tgat ggacggeetg 1080 gtatggcaaa aacaaaacga ataccgtttt 1140 gcagttgage cgaaaçaaga cggegtttac 1200 gagcegçsaag gctacgatgc cgtattggtt 1260 atcagcgcgg saaaagcagg cgttgccgta 1320 caastgcgta ccaatgtgcc gcaeatctac 1380 ttggcgcaca aagccgttca cgaaggccac 1440 gcctacttcg acgeacgcgt gattccgggc 1500 gtgggcgaaa ecgaactgte cgccaaagce 1560 ccgtgggcgg cttccggccg tgcgattgce 1620 atttttgatg ccgaaaccgg ccgcatcatc 1680 gatatgatcg gcgaagtetg ccttgccatc 1740 aaasccatec acecgcaccc gggcgaatcc 1800 acttgtaccg acaaaaaaaa a 1851 94 <2 2 Ο > <2 21> gene <222> (1) .. (2253) <223> Sequência nucleotídica da proteína quimérica no plasmídeo PLL2 . <400> 27 atgggecacc aaagtgcccg ggcgacacta aggctgcgca tfctaaaattg tatgaagggg eacgtcttag aaeatagaag caattgaaac atgagaggag ggaggcgtga gaagttaaag gctgaaggca cctaaagcfcg tacgacgtgg gatgaaggçt aaegtcggct cgccacttgg cgegcctaca agccgtaaag gtgtcgctga gttgccttca cctgaagatc aaactgctga ctgggttcçc gatttggtaa aceaaaaccg aacgcgccta aacggca&ae gaagtggaea ggtcagccça gcoggccaea gaagtggcgt aaagccaact tttaccaagc cçgaaçggtg gcagacatcg gtggcattgg accaccácca acattggcgg ttgctgtgga tggacaaact frgaaggaaat acggctcfccc gtcgcctgat c&gaacetcc tcaactggtt cgaagagaat attcgatgaa ttaaagtcgg cggcagccge ccgctcctgc tcgtattggg tgaaagtcgc gtatcccttc ctgccaacgg a&gacggcgfc tggacgttat ctgccggcga aaaactgtat cgcgcatcat ttatcggcgg gfcttggatgfc aagtatggca ttgcagttga aâgageegca tcatcagcgc aacaaatgcg tgttggegca aagcctactt gggtgggcga tcccgtgggc tgatttttga gcgatatgat geaaaaçcat gtacttgfcac ccacgccatg aacagaaâát cgatadcctg acagctcaaa ageagaaaca atgtaagatc taeagttaac attcggagac taagaaagga ggccatttta ttegatggac egacaaaatc tcctaaagcc tccgcaagcc tggcggtccc çatcgtcgaa caaagccttg tatcaaatsc agtttcccgc ccaaggcgac cgcgtacgaa cattgcagca cgattccagc cggcattatc ggttgaaafcg aaaacaaaac gccgaaagaa acgctacgat ggaaaaagca taccaatgtg caaagccgtt cgacgcacgc aaccgaactg ggcttccggc tgccgaaaee cggcgaagtc ccacccgcac çgacaaaaaa gtagafcaaaa gaatggcttt agttgaattg €0 : gtsgatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 : sttactttgg atctagattfc ggafcetagac 180 : ggaatgtcat actctatgtg taeaggaaag 240 caacatggaa caatagttat cagagtacsa 300 ccttttgaga taatggattt gçaaaaaaga 360 ccgatcgtaa cagaaaaaga tagcccagtc 420 agctacatca tcataggagt açagccggga 480 agttccatcg gccaaatgtt tgagacaaca 540 ; ggtgacacag cctgggattt tggatctçtg 600 ; gtacctgctg aagttgcagg cgtagfccaaa 660 tctgaaggtg gtttgattgt cgtsgttgaa 720 gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780 gegcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840 ggcggttact ecgctgcatt tgccgctgec 900 cgttacaaaa ctttgggcgg cgtttgcctg 960 ; ttgçaçaatg ccgccgttat cgaçgaagtg 1020 cccgagccgg aactcgâcat cgatatgctt 1080 ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 1140 gggcaattct taçatccgca ccacfctggaa 1200 caggcagccc ctaccggcga gaaaaaaate 1260 çgcagccgcg taaccaaact gccttteatt 1320 ggcçcattgg ctctgaaaga agtaccggge 1380 ggcctcgaga tgggtacggt ttacagcacg 1440: atggacggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 1500 gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560; gacggcgttt acgttacctfc tgaaggcgcg 1620: gccgfcattgg ttgccgccgg ecgegcgccc 1680; ggcgttgccg taaccgatcg cggettcatc 1740 ccgcacatet acgceatcgg egacatcgtc 1800 cacgaaggcc acgttgccgc cgaaaactgc 1860 gtgattccgg gcgttgecta cacttcoccc 1920 tccgccaaag cctceggccg caaaatcacc 1980 cgtgcgattg ccaacggttg cgacaagccg 2040 ggccgcatca tcggcggcgg cattgtcggt 2100 tgccttgcca tçgaaatggg ctgcgacgcg 2160 gegggcgaat ceatcggtat ggcggcggaa 2220 aaa 2253 <210> 28

<211> 748 <212 > PRT <213> Escherichia coli <2 2 0 > <221> CADEIA <222> (1) .. (748) <223> Sequência aminoacídica da PLL2. <400> 28

His His His His His His M=t Vai Asp Lis Arg INfet Ala leu Vai Glu 1 5 10 15 Leu Lis Vai Rro Asp Ile Gli Gli His Glu Asn Vai Asp Ile Ile Ala 20 25 30 95

Vai Glu Vai fen Val Gli Asp Tre Ile Ala Val Asp Asp Tre Ler Ile 35 40 45 Tre Leu Asp Leu Asp Arg Leu Arg Met Asp Lis Leu Gin Leu Lis Gli 50 55 60 Met Ser Tir Ser Met Cis Tre Gli Lis Fen Lis Ile Val Lis Glu Ile 65 70 75 80 Ala Glu Tre Gin His Gli Tre Ile Val Ile Arg Val Gin Tir Glu Gli 85 90 95 Asp Gli Ser Pro Cis Lis Ile Pro Fen Glu Ile Met Asp Leu Glu Lis 100 105 110 Arg His Vai leu Gli Arg leu Ile Tre Val fen Pro Ile Val Tre Glu 115 120 125 Lis Asp Ser Pro Val fen Ile Glu Ala Glu Pro Pro Fen Gli Asp Ser 130 135 140 Tir He Ile Ile Gli Val Glu Pro Gli Gin leu Lis leu fen Trp Fen 145 150 155 160 Lis Lis Gli Ser Ser Ile Gli Gin Met Fen Glu Tre Tre Met Arg Gli 165 170 175 Ala Lis Arg Met Ala Ile leu Gli Asp Tre Ala Trp Asp Fen Gli Ser 180 185 190 leu Gli Gli Vai fen Ser Met fen Ser Met Asp Val Prp Ala Glu Val 195 200 205 Ala Gli Vai Val Lis Glu Val Lis Val Lis Val Gli Asp Lis ile Ser 210 215 220 Glu Gli Gli leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gli Tre Ala Ala Ala 225 230 235 240 Pro Lis Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gin Glu Ala Pro Lis Ala 245 250 255 Ala Ala Pro Ala Pro Gin Ala Ala Gin Fen Gli Gli Ser Ala Asp Ala 260 265 270 Glu Tir Asp Val Val Val leu Gli Gli Gli EtO Gli Gli Tir Ser Ala 275 280 285 Ala Fen Ala Ala Ala Asp Glu Gli leu Lis Val Ala Ile Val Glu Arg 290 295 300 Tir Lis Tre leu Gli Gli Val Cis leu fen Val Gli Cis Ile Pro Ser 305 310 315 320 Lis Ala leu leu His fen Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His leu 325 330 335 Ala Ala Asn Gli Ile Lis Tir Pro Glu Pro Glu leu Asp Ile Asp Met 340 345 350 Leu Arg Ala Tir Lis Asp Gli Val Val Ser Arg Leu Tre Gli Gli leu 355 360 365 Ala Gli Met Ala Lis Ser Arg Lis Val Asp Val Ile Gin Gli Asp Gli 370 375 380 Gin Fen Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Tre Ala Gli Asp 385 390 395 400 Ala Tir Glu Gin Ala Ala Pro Tre Gli Glu lis Lis Ile Val Ala Fen 405 410 415 96

Lis fen Cis Ile Ile Ala Ala Gli Ser Arg Val Tre Lis Leu Pro Fen 420 425 430 Ile Pro Glu fep Pro Arg Ile Ile fep Ser Ser Gli Ala Leu Ala Leu 435 440 445 Lis Glu Vai Pro Gli Lis Leu Leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli 450 455 460 leu Glu Met Gli Tre Val Tir Ser Tre leu Gli Ser Arg Leu Asp Val 465 470 475 480 Vai Glu Met Met fep Gli Leu Met Gin Gli Ala fep Arg fep Loa Val 485 490 495 Lis Vai Trp Gin Lis Gin fen Glu Tir Arg Fen fep fen ile Met Val 500 505 510 fen Tre Lis Tre Vai Ala Val Glu Pro Lis Glu fep Gli Val Tir Val 515 520 525 Tre Fen Glu Gli Ala fen Ala Pro Lis Glu Pro Gin Arg Tir Asp Ala 530 535 540 Vai leu Vai Ala Ala Gli Arg Ala Pro fen Gli Lis Leu Ile Ser Ala 545 550 555 560 Glu Lis Ala Gli Val Ala Val Tre fep Arg Gli Fen Ile Glu Val fep 565 570 575 Lis Gin Met Arg Tre fen Val Pro His Ile Tir Ala Ile Gli Asp ile 580 585 590 Vai Gli Gin Pro Met leu Ala His Lis Ala Val His Glu Gli His Val 595 600 605 Ala Ala Glu fen Cis Ala Gli His Lis Ala Tir Fen fep Ala Arg Val 610 615 620 ile Pro Gli Vai Ala Tir Tre Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gli Glu 625 630 635 640 Tre Glu leu Ser Ala Lis Ala Ser Gli Arg lis Ile Tre lis Ala Asn 645 650 655 Fen Pro Trp Ala Ala Ser Gli Arg Ala Ile Ala fen Gli Cis Asp lis 660 665 670 Pro Fen Tre Lis leu Ile Fen fep Ala Glu Tre Gli Arg Ile Ile Gli 675 680 685 Gli Gli Ile Vai Gli Pro fen Gli Gli Asp Met Ile Gli Gin Val Cis 690 695 700 leu Ala Ile Glu Met Gli Cis fep Ala Ala Asp Ile Gli lis Tre Ile 705 710 715 720 His Pro His Pro Gli Glu Ser Ile Glu Met Ala Ala Glu Val Ala leu 725 730 735 Gli Tre Cis Tre fep Leu Pro Pro Gin Lis Lis Lis 740 745

<210> 29 <211> 1821 <212 > DNA <213> Escherichia coli 97 <2 2 Ο > <2 21> gene <222> (1) .. (1821) <223> Sequência nucleotídica da MDH no plasmídeo pD4 <400> 29 afcgggccace accacoacca ccacqccatg gtagataaaa gaatggcttt aqttgaattg ,60 · aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta fctgctgtgga egataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180 gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240 ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggeag ccgctcctaa agccgaagcg 300 gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaáa gctgçcgctc etgctccgcà agçegcgcaa 360 ttcggcggfct ctgccgafcgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg fccecggcggt 420 taefcccgctg eatttgccgc tgecgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480 aaaactttgg geggcgtttg cctgaacgtc ggetgtatec cttccaaagc cttgttgcac 540 aatgecgccg ttategacga agtgogccac ttggctgeca acggtafccaa ataccccgag 600 ccggaaetcg acategatat çcttcgcgce tacaaagaeg gcgtagtttc ccgccteacg 660 ggcggtttgg csggtatggc gaaaagccgt aâaqtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720 ttcttagafcc egcaccactt ogaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780 gcccctaccg gegagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840 cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900 ttggctotga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggccfce 960 gagatgggta cggcttagag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggtega aatgatggac 1020 ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080 cgttttgaca acattatggt caacaecáaa accgfetgcag ttgagccgaa agaagacgçc 1140 gtttaçgtta cctttgaagg cgcgaaogcg cctaaagagç cgcaacgcta cgatgccgta 1200 ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa ageaggcgtt 1260 gccgtaaccg atcgeggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320 atctaçgcca tcggcgacat cgtcggtcag çcgatgttgg cgcacaaage cgttcacgaa 1380 ggccacgttg cogccgaaaa ctgcgccggc cacasagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 eegggcgttg cctacacttc cccccaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500 aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagce aacttcccgt gggcggcctc cggccgtgcg 1560 attgecaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620 atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaae ggtggcgata tgatçggçga agtctgcctt 1680 gccatçgaaa tgggctgcça cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gçacccgacc 1740 ttgggcgaat cçatcggtat ggcggeggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800 ccgcaaaaga aaaaaggatc c 1821

<210> 30 <211> 2259 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) .. (2259) 98 <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pLL3 <400> 30 atgggccacc aecaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 63 aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagõtatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180 getgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240 ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag cegctoctaa agccgaagcg 300 gctgcegcec cggcgcaaga agcccetaaa gctgccgetc ctgctccgea agccgcgcaa 360 tteggeggtt ctgecgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggegg tcccggcggt 420 tactecgctg catttgcegc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgtfcac 480 aaaactttgg gcggcgtttg cetgaacgtc ggctgtatcc cttccaaage cttgttgcac 540 aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggcfcgcca aeggfeatcaa ataccccgag 600 ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660 ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttâtcçaagg cgacgggcaa 720 ttcttagatc cgcaeeacfct ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaaeaggca 780 gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtateattgc agcaggcage 840 cgcgtaacca aactgccttt eattectgaa gatcrcgcgea tcatcgattc caqcggcgca 800 ttggctctga aagaagfcacc gggcaasctg ctgattatcg gcggcggeat tatcggccte 960 gagatgggta cggtttacag cacgctgggfc tegcgtttgg atgtggttga.aatgatggac 1020 ggccfcgatgc aaggcgeaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080 cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcaq tfcgagcegaa agaagaeggc 1140 gfcttacgtta cctttgaagg cgcgââdgcg cctaaagaqc cgcaacgcta cgatgccgta 1200 tcggttgceg ccggccgcgc gceeaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260 gccgtaaccg atcgcggctt çatcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320 atctacgcea tcggcgacat cgtcgqtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcaegaa 1380 ggccacgfcfcg ççgccgaaaa ctgegccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500 aaagcctccg gecgcaaaat caccaaagoc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 attgccaacg gtígcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620 atcatcggcg gçggcattgt cggtccgsac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680 gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccefcccaccc gcacccgacc 1740 ttgggcgaafc ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtaç cgacctgcct 1800 ccgcaaaaga âaaaaggatc cgacaggctg agaatggaca aactaeagct caaaggaatg 1860 tcatactcta tgtgtacagg aaagtttaaa attgtgaagg asatageaga aacacaacat 1920 ggaacaatag ttatcagagt acaatatgaa ggggacggct ctccatgtaa gatccctttt 1980 gagataatgg atttggaaaa aagacacgtc ttaggtegcc tgattacagt taaccegate 2040 gtaacagaaa aagatagccc agtcaaeata gaagcagaac ctccattcgg agacagctac 2100 âtcatcatag gagtagagcc gggacaattg aaactcaact ggtttaagaa aggaagfctcc 2160 atcggccaaa tgtttgagac aaeaatgagâ ggagcgaaga gaatggccafc tttaggtgac 2220 acagcctggg attttgggtc tetgggtggt taaggatcc 2259

<210> 31 <211> 745 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CADEIA <222> (1)..(745) <223> Sequência aminoacídica da PLL3 99 <4 Ο Ο > 31

His His His His His His Met Vai Asp lis Mg Met Ma leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His Glu Asn Val Mp Ile Ile Ma 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile Ma Vai Asp Asp Tre Leu Ile 35 40 45 Tre Leu Asp Met Asn Ser Met -Asp Vai Pro Ma Glu Val Ma Gli Val 50 55 60 Vai Lis Glu Vai Lis Vai Lis Vai Gli Asp Lis Ile Ser Glu Gli Gli 65 70 75 80 Leu Ile Vai Vai Vai Glu Ala Glu Gli Tre Ma Ma Ma Pro Lis Ma 85 90 95 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gin Glu Ma Pro lis Ma Ma Ma Pro 100 105 110 Ala Pro Gin Ala Ala Gin Fen Gli Gli Ser Ma Asp Ma Glu Tir Mp 115 120 125 Vai Vai Vai Leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ma Ma Fen Ma 130 135 140 Ala Ala Asp Glu Gli Leu Lis Vai Ala Ile Vai Glu Mg Tir Lis Tre 145 150 155 160 Leu Gli Gli Vai Cis Leu Asn Vai Gli Cis Ile Pro Ser lis Ma Leu 165 170 175 leu His Asn Ala Ala Vai Ile Asp Glu Vai Mg His leu Ma Ma Mn 180 185 190 Gli Ile Lis Tir Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Mg Ma 195 200 205 Tir Lis Asp Gli Vai Vai Ser Arg leu Tre Gli Gli leu Ma Gli Met 210 215 220 Ala Lis Ser Arg Lis Vai Asp Vai Ile Gin Gli Asp Gli Gin Fen leu 225 230 235 240 Agp Pro His His leu Glu Vai Ser leu Tre Ma Gli Asp Ma Tir Glu 245 250 255 Gin Ala Ala Pro Tre Gli Glu Lis Lis Ile Val Ma Fen lis Asn Cis 260 265 270 lie Ile Ala Ala Gli Ser Arg Vai Tre lis leu Pro Fen Ile Pro Glu 275 280 285 Asp Pro Arg ile Ile Asp Ser Ser Gli Ma leu Ma leu lis Glu Val 290 295 300 Pro Gli Lis leu leu Ile Ile Gli Gli Gli ile ile Gli leu Glu Met 305 310 315 320 Gli Tre Vai Tir Ser Tre leu Gli Ser Arg leu Asp Val Val Glu Met 325 330 335 Met Asp Gli leu Met Gin Gli Ala Asp Asg Asp leu Val lis Val Trp 340 345 350 Gin Lis Gin Asn Glu Tir Arg Fen Asp Asn Ile Met Val Asn Tre Lis 355 360 365 Tre Vai Ala Vai Glu Pro Lis Glu Asp Gli Val Tir Val Tre Fen Glu 100 370 375 380

Gli Ma Mn Ma Pro Lis Glu Pro Gin Mg Tir Mp Ma Vai Leu Vai 385 390 395 400 i\la Ma Gli Mg Ma Pro Mn Gli Lis Leu Ile Ser Ma Glu Lis Ma 405 410 415 Gli Vai Ma Vai Tre Mp Mg Gli Fen Ile Glu Vai Mp lis Gin Met 420 425 430 Mg Tre Mn Vai Pro His Ile Tir Ma Ile Gli Mp Ile Vai Gli Gin 435 440 445 Pro Met Ler Ma His Lis Ma Vai His Glu Gli His Vai Ma Ma Glu 450 455 460 Mn Cis Ma Gli His Lis Ma Tir Fen Mp Ma Mg Vai Ile Pro Gli 465 470 475 480 Vai Ma Tir Tre Ser Pro Glu Vai Ma Trp Vai Gli Glu Tre Glu Leu 485 490 495 Ser Ma Lis Ma Ser Gli Mg Lis Ile Tre Lis Ma Mn Fen Pro Trp 500 505 510 Ma Ma Ser Gli Mg Ma Ile Ma Mn Gli Cis Mp Lis Pro Fen Tre 515 520 525 Lis Leu Ile Pen Mp Ma Glu Tre Gli Mg Ile Ile Gli Gli Gli Ile 530 535 540 Vai Gli Pro Mn Gli Gli Mp Met Ile Gli Glu Vai Cis Leu Ma Ile 545 550 555 560 Glu Met Gli Cis Mp Ma Ma Mp Ile Gli Lis Tre Ile His Pro His 565 570 575 Pro Gli Glu Ser Ile Gli Met Ma Ma Glu Vai Ma Leu Gli Tre Cis 580 585 590 Tre Mp Ler Pro Pro Gin Lis Lis Lis Gli Ser Mg Leu Mg Met Mp 595 600 605 Lis Leu Gin Leu Lis Gli Met Ser Tir Ser Met Cis Tre Gli Lis Fen 610 615 620 Lis lie VM Lis Glu Ile Ma Glu Tre Gin His Gli Tre Ile Vai Ile 625 630 635 640 Mg Vai Gin Tir Glu Gli Mp Gli Ser Pro Cis lis Ile Pro Fen Glu 645 650 655 lie Met Mp Leu Glu Lis Mg His Vai Leu Gli Mg Leu Ile Tre vai 660 665 670 Mn Pro Ile Vai Tre Glu Lis Mp Ser Pro Vai Mn Ile Glu Ma Glu 675 680 685 Pro Pro Fen Gli Mp Ser Tir Ile Ile Ile Gli Vai Glu Pro Gli Gin 690 695 700 Leu Lis Ler Mn Trp Fen Lis Lis Gli Ser Ser Ile Gli Gin Met Fen 705 710 715 720 Glu Tre Tre Met Mg Gli Ma Lis Mg Met Ma Ile Leu Gli Mp Tre 725 730 735 Ma Trp Mp Fen Gli Ser Leu Gli Gli 740 745 101

<210> 32 <211> 429 <212 > DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(429) <223> Sequência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína de envelope DEN-1 <400> 32 atgtaatgtg çacagggtca 60 ctgttctagt geaggttaaa 120 cccaagatga gaaaggagta 180 ttgacaaaga aaaaccagtc 240 tggtaggagc aggtgaaaaa 300 ggaaaatgtt tgaagcaact 360 catgggactt cggttctata 420 429 agactaaaaa fcggataaact ttcaagttag agaaggaagt taegaaggaa cagatgcacc acecagaatg ggagattgat aacafctgaag cggaçccacc gctttgaaac taagctggtt gcccgtggag cacgaaggat ggagggtaa çactttaaaa ggggtatcat gqctgagacc cagcatggaa atgcaagatc cccttctcgt aaeâgceaac eccatagtca ttttggtgag agctatattg caagaaggga agcagtatag ggccatcctg ggagacaccg

<210> 33 <211> 615 <212> DNA <213> Escherichia coli <22 0 > <2 21> gene <222> (1) .. (615) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pLHl <400> 33 afcgggccacc accaccaeca eeacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttçaattg 60 aââgtgcccg acattggcgg aacagaaaat gfcagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggegacacta ttgctgtgga cgataccctg afctactttgg aictagattt ggatctagac 180 aggctcaaaa tggataaacfc gactttaaaa ggggtatcat atgtaatgtg cacagggtca 240 ttcaagttag agaaggaagt ggctgagacc cagcatggaa ctgttctagt geaggttaaa 300 tacgaaggaa cagafcgcacc atgcaagatc cccttctcgt ccc&agatga gaaaggagta 360 acccagaatg ggagattgat aacagccaac eccatagtca ttgacaaaga aaaaccagtc 420 aacattgaag cggagceacc ttttggtgag agctatattg tggtaggagc ággtgáaaaa 480 gctttgaaac taagctggtt caageaggga agcagtatag ggaaaatgtt tgaagcaact 540 geCcgtggag cacgaaggat ggccatcctg gqagacaccg catgggactt cggttctatt 600 ggcgggtaag gatcc 615 102

<210> 34 <211> 174 <212 > PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CADEIA <222> (1)..(174) <223> Sequência aminoacídica da PLHl <400> 34

His His His His His His Met Vai Asp Lis Arg Met Ala Leu Vai Glu 1 5 10 15 Leu lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His Glu fen Vai Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile Ala Vai Asp Asp Tre Leu Ile 35 40 45 Tre Leu Asp Leu Asp Fen Lis Leu Glu Lis Glu Vai Ala Glu Tre Gin 50 55 60 His Gli Tre Vai Leu Vai Gin Vai Lis Tir Gin Gli Tre Asp Ala Pro 65 70 75 80 Cis Lis Ile Pro Fen Ser Tre Gin Asp Glu Lis Gli Vai Tre Gin fen 85 90 95 Arg Leu Ile Tre Ala fen Pro Ile Vai Tre Asp Lis Glu Lis Pro Vai 100 105 110 fen Ile Glu Tre Glu Pro Pro Fen Gli Glu Ser Tir Ile Vai Vai Gli 115 120 125 Ala Gli Glu Lis Ala Ler Lis Gin Cis Trp Fen Lis Lis Gli Ser Ser 130 135 140 Ile Gli Lis Met Fen Glu Ala Tre Ala Arg Gli Ala Arg Arg Met Ala 145 150 155 160 Ile Leu Gli Asp Tre Ala Trp Asp Fen Gli Ser Ile Gli Gli 165 170

<210> 35 <211> 2253 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) .. (2253) 103 <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pLH2 <400> 35 atgggeeacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 ãaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180 aggctcaaaa tggataaact gactttaaaa ggggtatcat atgtaatgtg cacagggtca 240 ttcaagttag agaaggaagt ggctgagacc cagcatggaa etgttctagt gcaggttaaa 300 tacgaaggaa cagatgcacc atgcaagatc cccttctcgt cccaagatga gaaaggagta 360 acccagaatg ggagattgat aacagccaac cceatagtca ttgacaaaga aaaaccagtc 420 aacattgaag cggagccãcc ttttggtgag agetatattg tggtaggagc aggtgaaaaa 480 gctttgaaac taagctggtt caagaaggga agcagtatag ggaaaatgtt tgaagcaaet 540 gcecgtggag cacgaaggat ggccatcctg ggagacaccg çatgggactt cggatctata 600 ggaggggtga attcgatgaa ttcgatggac gtaectgctg aagttgcagg cgtagtcaaa 660 gaagttaaag ttaaagtcgg cgaeaaaatc tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720 gctgaaggca cggcagccgc tcctaaagec gáãgcggctg ccgocccggc gcãagaagcc 780 cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc gcgcaattcg gcggttctgc cgafcgçcgag 840- tãcqàcqtqq tcqtãttqçg tggcggtcee ggcggttact ccgctgcatt tgeegctgec 300 gatgaagget tgaaagtcgc catcgtcgaa çgttacaaaa çtttgggcgg çgtttgcctg 960 aacgtcggct gtatcccttc eaaagccttg ttgcacaatg ccgccgttat cgacgaagtg 1020 eçceacttgg etgccaacgg tatcaaatac cccgagccgg aactcgacat egafcatgctt 1080 cccgcctaca aagacggegt agtttccegc ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 1140 agccgtaaag tggacçttat ccaaggcgaç gggeaattct tagatccgca ccscttggaa 1200 gtgtegctga c.tçccggcga cgcgtacgaa caegcagccc ctaccggcga gaaaaaaate 1260 gttgcottca aaaactgtat cattgcagca ggcagccgcg taaccaaaet gccttteatt 1320 cctgaagatc cgcgcatcat cgattccagc ggcgcattgg ctctgaaaga agtaeegggc 1380 aaactgctga ttatcggcgg cggcatfcatc ggcctcgaga tgggtacggt ttâcagcacg 1440 ctgggfctcgc gtttggatgt ggttgaaatg atggacggcc tgatgeaagg cgcagaccgc 1500 gatfctggtaa aagtatggca aaaaoaaaac çaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560 accaaaaccg ttgcagttga gccgaaagaa gacggcgttt acgttacctt tgaaggcgcg 1620 aacgogccta aagagocgca acgctacgat gccgtattgg ttgcegccgg ccgcgcgccc 1680 aacggcaaac tcatcagcge ggaaaaagca ggcgttgccg fcaaccgatcg cggcttcatc 1740 gaagtggaca aacaaatgeg fcaccaatgtg ccgcacatct acgccatcgg cgacatcgtc 1800 ggtcagçcga tgttggcgca caaagccott caegaaggec acgttgccgc cgaaaactge 1860 gecggccaca aagcctactt cgacgcacqc gtgattcegg gcgttgccfca cacttcccoc 1920 gaagtggcgt gggtgggcga aaccgaactg tccgccaaag cctccggccg caaaateacc 1980 aaagccaact tcccgtgggc ggcttccggc cgtgcgattg ccaacggttg cgacaageeg 2040 tttaccaagc tgatttttga tqccgaaacc ggccgqatca tcggcggcgq cattgtcggt 2100 cegaacggtg gcgatatgat cggcgaagtc tgccttgcea tcgaaatggg ctgcgacgcg 2X60 gcagacatcg gcaaaaccat ccacecgeae ccgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa 2220 gtggcattgg gtacttgtac cgacaaaaãã aaâ 2253

<210> 36 <211> 727 <212> PRT <213> Escherichia coli <22 0> <221> CADEIA <222> (1)..(727) <223> Sequência aminoacídica da PLH2 104 <400> 36

His His His His His His Mfet Vai Mp Lis Mg Mfet Ma Leu Vai Glu 1 5 10 15 Leu Lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His Glu Mn Vai Mp Ile Ile 741a 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Mp Tre Ile Ma Vai Mp Mp Tre Leu Ile 35 40 45 Tre Leu Asp Leu Asp Fen lis Leu Glu Lis Glu Vai Ma Glu Tre Gin 50 55 60 His Gli Tre Vai Leu Vai Gin Vai Lis Tir Gin Gli Tre Mp Ma Pro 65 70 75 80 Cis Lis Ile Pro Fen Ser Tre Gin Mp Glu Lis Gli Vai Tre Gin Mn 85 90 95 Mg Leu Ile Tre Ala Mn Pro Ile Vai Tre Asp lis Glu Lis Pro Vai 100 105 110 Mn Ile Glu Tre Glu Pro Pro Fen Gli Glu Ser Tir Ile Vai Vai Gli 115 120 125 Ala Gli Glu Lis Ma Ler lis Gin Cis Trp Fen lis Lis Gli Ser Ser 130 135 140 Ile Gli Lis Met Fen Glu Ma Tre Ma Mg Gli Ma Mg Mg Met Ma 145 150 155 160 Ile Leu Gli Asp Tre Ala Trp Mp Fen Gli Ser Ile Gli Gli Vai Mn 165 170 175 Ser Met Asn Ser Met Asp Vai Pro Ma Glu Vai Ma Gli Vai Vai lis 180 185 190 Glu Vai Lis Vai Lis Vai Gli Mp Lis Ile Ser Glu Gli Gli Ler ile 195 200 205 Vai Vai Vai Glu Ma Glu Gli Tre Ma Ma Ala Pro Lis Ma Glu Ma 210 215 220 Ala Ala Ala Pro Ma Gin Glu Ma Pro Lis Ala Ma Ma Pro Ala Pro 225 230 235 240 Gin Ala Ala Gin Fen Gli Gli Ser Ma Mp Ala Glu Tir Mp Vai Vai 245 250 255 Vai Leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ala Ma Fen Ma Ala Ma 260 265 270 Asp Glu Gli Leu Lis Vai Ma Ile Vai Glu Mg Tir Lis Tre Ler Gli 275 280 285 Gli Vai Cis Leu Asn Vai Gli Cis Ile Pro Ser lis Ma Leu Lar His 290 295 300 Asn Ala Ala Vai Ile Asp Glu Vai Mg His leu Ma Ma Mn Gli Ile 305 310 315 320 Lis Tir Pro Glu Pro Glu Leu Mp Ile Mp Met Leu Mg Ma Tir lis 325 330 335 Asp Gli Vai Vai Ser Arg leu Tre Gli Gli leu Ma Gli Met Ala lis 340 345 350 Ser Arg Lis Vai Asp Vai Ile Gin Gli Mp Gli Gin Fen Leu Asp Pro 105 355 360 365

His His leu Glu Vai Ser Leu Tre Ma Gli Asp Ma Tir Glu Gin Ma 370 375 380 Ala Pro Tre Gli Glu Lis Lis Ile Vai Ma Fen lis fen Cis Ile Ile 385 390 395 400 Ala Ala Gli Ser Arg Vai Tre Lis leu Pro Fen Ile Pro Glu Asp Pro 405 410 415 Arg Ile Ile fep Ser Ser Gli Ma leu Ma ler lis Glu Vai Pro Gli 420 425 430 Lis leu leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli Leu Glu Met Gli Tre 435 440 445 Vai Tir Ser Tre leu Gle Ser Mg leu Asp Vai Vai Glu Met Met fep 450 455 460 Gli leu Met Gin Gli Ma Asp Mg Asp leu Vai lis Vai Trp Gin lis 465 470 475 480 Gin Asn Glu Tir Arg Fen Asp fen Ile Met Vai fen Tre Lis Tre Vai 485 490 495 Ala Vai Glu Pro Lis Glu Asp Gli Vai Tir Vai Tre Fen Glu Gli Ma 500 505 510 Asn Ala Pro Lis Glu Pro Gin Mg Tir Asp Ala Vai Leu Vai Ala Ma 515 520 525 Gli Arg Ala Pro fen Gli lis Leu Ile Ser Ala Glu Lis Ma Gli Vai 530 535 540 Ala Vai Tre Asp Arg Gli Fen Ile Glu Vai Asp lis Gin Met Arg Tre 545 550 555 560 Asn Vai Pro His Ile tir Ma Ile Gli Asp Ile Vai Gli Gin Pro Met 565 570 575 Leu Ala His Lis Ala Vai His Glu Gli His Vai Ma Ma Glu fen Cis 580 585 590 Ala Gli His Lis Ala Tir Fen Asp Ma Mg Vai Ile Pro Gli Vai Ma 595 600 605 Tir Tre Ser Pro Glu Vai Ma Trp Vai Gli Glu Tre Glu Leu Ser Ma 610 615 620 Lis Ala Ser Gli Arg Lis Ile Tre Lis Ma fen Fen Pro Trp Ala Ma 625 630 635 640 Ser Gli Arg Ala Ile Ala fen Gli Cis Asp Lis Pro Fen Tre Lis Leu 645 650 655 Ile Fen Asp Ala Glu Tre Gli Mg Ile Ile Gli Gli Gli Ile Vai Gli 660 665 670 Pro Asn Gli Gli Asp Met Ile Gli Glu Vai Cis leu Ma Ile Glu Met 675 680 685 Gli Cis -Asp Ala Ala Asp Ile Gli Lis Tre Ile His Pro His Pro Gli 690 695 700 Glu Ser Ile Gli Met Ala Ma Glu Vai Ma Leu Gli Tre Cis Tre fep 705 710 715 720 Leu Pro Pro Gin Lis Lis lis <210> 37 725 106 <211> 2250 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) .. (2250) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pLH3 <400> 37 atgggccacc aaagtgcecg ggcgacacta gctgaagttg ggtggtttga gctgccgccc ttcggcggtt tactccgctg aaaactfctgg aatgccgecg ccggaactcg ggcggtttgg ttcttagatc geccctaeeg cgcgtaacca fcfcggctctga gagatgggta ggcctgatgc cgfctttgaea gtttacgtta ttggttgceg gccgtaáccg atctacgcca ggceacgttg ccgggcgttg aaagectccg attgccaacgatcatcggcg gccatcgaaa ttgggcgaat ccgcaaaagatatgtaatgt actgttctag tcccaagatg attgacaaag gtggtaggag gggaaaatgt gcatgggact accaçcacca acattggcgg ttgctgtgga caggcgtagt ttgtegtcgt cggcgcaaga ctgccgatgc catttgccge gcggcgtfctg fctatcgacgaacatcgatat caggtatggccgcaccactt gcgagaaaaa aacfcgccttt aagaagtace cggtttacag aaggcgcâga scattafcggt ccttfcgaagg ccgqccgcgc atcgcggett tcggcgacat ecgccgaaaa cctacaettc gccgcaaaat gttgcgacaa gcggcattgt tgggctgcga ccatcggtat aaaaaggate gcaoâgggte tgcaggttaa agaaaggagt aaaaaccagt caggtgaaaa ttgaagcaac tcggttctat ccacgecatg acacgaaaat cgataceetg caaagaagtt tgaagctgaa agcccctaaa cgagtacgac tgccgatgââ cctgaacgtc agtgcgccae gettegcgce gaaaagecgt ggaagtgtcg aatcgttgcc eatfccctgaagggcaaactg cacgctgggt ccgcgatttg caacaccaaa ugcgaacgcg qcccaacggc catcgsagtg cgtcggtcag ctgcgccggc ccccgaagtg caceaaagcc gccgtttacc çggtccgaac cgcggcagac çgcggcggaa cagactaaaa attcaagtta stacgaagga aacccagaat caacattgaa agctttgaaa tgcccgfcggã aggtgggtaa gtagataaaa gtagâtatta attactctgg aaagttaaag ggcacggcag gcfcgccgctc gtggtcgtat ggcttgaâag ggctgtatcc ttggcfcgcca taeaaagacg aaagtggacg ctgactgccg ttcaaaaact gatcegcgca ctgattatcg tcgcgtttgg gtaaaagtat accgttgcag ccfcaaagage aaacteatca gacaaacaaa ccgatgttgg cacaaagcct gcgtgggtgg aacttcccgt aagctgâttt ggtggcgatá afccggcaaaa gtggeafctgg atggataaac gagaaggaag acagatgcaç gggagattga gcggagccac ctaagctggt gcaçgaagga gaatggcttt tcgcggttqa atctagaaat tcggcgacaa ççgctectaa ctgctccgca tgggtggcgg tcgecatcgt cttccaaagc aeggtatcaa gcgtagtttc ttatccaagg gcgacgcgta gtatcattgc tcatcgattc gcggcggcat atgtggttga ggcââáaaca ttgagccgaa cgcaacgcta gcgcggaaaa tgcgtaccaa cgcaçaaagc acttcgacgc gcgaaaccgâ gggcggcttc ttgatgccga tgatcqgcga ccatccaccc gtacttgtac tgactttaaa tggctgagac çatgcaagat Caacagccaa cttttggtga tcaagaaggg tggccatcct agttgaattg agfcaaacgtg ggaegtacct aatctctgaa agccgaagçg agccgcgcaa teccggcggt cgaacgttac cttgttgcac ataccccgag ccgceteaeg cgacgggcaa cgaacaggca agcaggcagc cagcggcgca tatcggccte aatgatggac aaacgaatac agaagacggc. cgatgccgta agcaggcgtfc fgtgccgcac egttcacgaa acgcgtgatt actgtccgcc cggccgtgcg aaccggccgc agtctgcctt gcacccgacc cqacctgcct sggggtatca ccagcatgga cccettctcg ççccatagtc gagctatatfc aagcagtata gqgagacacc 60 120 ISO 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 .1980 2040 2100 2160 2220 2250 <210> 38 <211> 724

<212> PRT 107 <213> Escherichia coli <220> <221> CADEIA <222> (1)..(724) <223> Sequência aminoacídica da PLH3 <400> 38

His His His His His His Met Val Asp Lis Mg Met Ma leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lis Val Pro Asp Ile Gli Gli His Glu Mn Val Mp Ile Ile Ala 20 25 30 Vai Glu Val Asn Val Gli Asp Tre Ile Ma Val Mp Mp Tre leu Ile 35 40 45 Tre leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Tila Glu Val Ma Gli Val 50 55 60 Vai Lis Glu Val Lis Val Lis Val Gli Asp Lis Ile Ser Glu Gli Gli 65 70 75 80 leu He Val Val Val Glu Ma Glu Gli Tre Ala Ma Ma Pro Lis Ma 85 90 95 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gin Glu Ma Pro lis Ma Ma Ma Pro 100 105 110 Ala Pro Gin Ala Ala Gin Fen Gli Gli Ser Ala Asp Ma Glu Tir Mp 115 120 125 Val Val Val leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ma Ma Fen Ma 130 135 140 Ala Ala Asp Glu Gli leu lis Val Ala Ile Val Glu Mg Tir Lis Tre 145 150 155 160 leu Gli Gli Val Cis leu Asn Val Gli Cis Ile Elo Ser Lis Ma Leu 165 170 175 leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His leu Ma Ma Mn 180 185 190 Gli Ile lis Tir Pro Glu Pro Glu leu Asp Ile Asp Met leu Mg Ma 195 200 205 Tir Lis Asp Gli Val Val Ser Arg leu Tre Gli Gli leu Ma Gli Met 210 215 220 Ala Lis Ser Arg Lis Val Asp Val Ile Gin Gli Asp Gli Gin Fen leu 225 230 235 240 Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Tre Ala Gli Mp Ma Tir Glu 245 250 255 Gin Ala Ala Pro Tre Gli Glu Lis Lis Ile Val Ma Fen Lis Mn Cis 260 265 270 Ile Ile Ala Ala Gli Ser Arg Val Tre Lis Leu Pro Fen Ile Pro Glu 275 280 285 Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gli Ma Leu Ma Leu Lis Glu Val 290 295 300 108

Pro Gli lis Leu Leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli Leu Glu Met 305 310 315 320 Gli Tre Vai Tir Ser Tre leu Gli Ser Mg Ler Mp Vai Val Glu Met 325 330 335 Met Asp Gli Leu Met Gin Gli Ma Mp Mg Asp leu Vai Lis Val Trp 340 345 350 Gin Lis Gin Asn Glu Tir Arg Fen Mp Mn Ile Met Vai Mn Tre lis 355 360 365 Tre Vai Ala Vai Glu Pro lis Glu Mp Gli Vai Tir Vai Tre Fen Glu 370 375 380 Gli Ala Asn Ma Pro Lis Glu Pro Gin Mg Tir Mp Ma Val leu Val 385 390 395 400 Ala Ala Gli Mg Ma Pro Mn Gli Lis Leu Ile Ser Ma Glu Lis Ma 405 410 415 Gli Vai Ala Vai Tre Asp Mg Gli Fen Ile Glu Vai Mp Lis Gin Met 420 425 430 Ãrg Tre Asn Vai Pro His Ile Tir Ma Ile Gli Mp ile Val Gli Gin 435 440 445 Pro Met leu Ma His Lis Ala Vai His Glu Gli His Vai Ma Ma Glu 450 455 460 Asn Cis Ala Gli His Lis Ma Tir Fen Mp Tila Mg Val ile Pro Gli 465 470 475 480 Vai Ala Tir Tre Ser Pro Glu Vai Ma Trp Vai Gli Glu Tre Glu Leu 485 490 495 Ser Ala lis Ma Ser Gli Mg Lis Ile Tre Lis Ma Mn Fen Pro Trp 500 505 510 Ala Ala Ser Gli Mg Ma ile Ma Mn Gli Cis Mp Lis Pro Fen Tre 515 520 525 Lis leu Ile Pen Asp Ma Glu Tre Gli Mg Ile Ile Gli Gli Gli Ile 530 535 540 Vai Gli Pro Asn Gli Gli Asp Met Ile Gli Glu Vai Cis leu Ma Ile 545 550 555 560 Glu Met Gli Cis Asp Ma Ma Mp Ile Gli Lis Tre Ile His Pro His 565 570 575 Pro Gli Glu Ser Ile Gli Met Ma Ma Glu Vai Ma leu Gli Tre Cis 580 585 590 Tre Asp leu Pro Pro Gin Lis Lis Lis Gli Ser Fen Lis leu Glu Lis 595 600 605 Glu Vai Ala Glu Tre Gin His Gli Tre Vai leu Vai Gin Val Lis Tir 610 615 620 Gin Gli Tre Asp Ma Pro Cis Lis Ile Pro Fen Ser Tre Gin Mp Glu 625 630 635 640 Lis Gli Vai Tre Gin Asn Mg leu Ile Tre Ala Mn Pro Ile Val Tre 645 650 655 Asp Lis Glu Lis Pro Vai Mn Ile Glu Tre Glu Pro Pro Fen Gli Glu 660 665 670 Ser Tir Ile Vai Vai Gli Ma Gli Glu Lis Ala leu Lis Gin Cis Trp 675 680 685 109

Fen Lis Lis Gli Ser Ser Ile Gli Lis Met Fen Glu Ala Tre Ala Arg 690 695 700 Gli Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu Gli Asp Tre Ala Trp Asp Fen Gli 705 710 715 720 Ser Ile CJ-i Gli

<210> 39 <211> 426 <212 > DNA <213> Escherichía coli <220> <221> gene <222> (1)..(426) <223> Sequência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína de envelope DEN-3 <400> 39 agacfccaaga tggacaaatt gaaactcaag gggatgagct atgcaatgtq cttgaatacc 60 tttgtgttga agaaagaagt ctccgaaacg cagcatggga caatactcát taaggttgag 120 taeaaagggg aagatgcacc ctgca&qatt cctttctcca oggaggatgg acaagggaaa 180 gctcacaatg geagactgat cacaoccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 240 aacattgagg ctgaacctcc ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 300 gecetgaaaa tcaactggta caggaaggga agetcgattg ggaagatgtfc cgaggeeact 360 gecagaggtg caaggcgcat ggccatettg ggagacacag cctgggacfct tggatcagtg 420 ggfcggt 426

<210> 40 <211> 615 <212> DNA <213> Escherichía coli <220> <221> gene <222> (1) .. (615) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pAZl <400> 40 110 ôtgggcçacc acc&ccacca ecacgccafcg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg feU aaagtgcccg aeatfcgçcgg aacagaaaat gtagatatta tegcggttga. agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgetgtgga ogataeectg sttactfcfcgg atctagattt ggatctagat 180 agactcaaga tggacaaatt gaaactcaag gggatgagct atgcaatgtg cttgaatacc 240 tttgtgttga agaaagaaçt ctccgaaacg cagcatggga caatactcat taaggttgag 300 tacaaagggg aagafcgcacc ctgcaagatt cctttctcca eggaggatgg acaagggaaa 360 gctcacaatg gcagactgat cacagccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 420 aacattgagg ctgaacctec ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 480 gccetgaaaa tcaactggta caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccace 540 gccagaggtg caaggcgest ggccatcttg ggagacacag cctgggactt tggttcagtg 600 ggtggttaag gatcc 615

<210> 41 <211> 194 <212> PRT <213> Escherichia colí <22 0 > <221> CADEIA <222> (1) . . (194) <223> Sequência aminoacídica da PAZl <4 00> 41

His His His His His His Met Vai Asp Lis Arg Met Ala leu Val Glu 1 5 10 15 Lau Lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile Ala Vai Asp Asp Tre Leu ile 35 40 45 Tn= leu Asp leu Asp Arg Leu Arg Met Asp Lis Leu Gin leu Lis Gli 50 55 60 M3t Ser Tir Ala Met Cis leu Asn Tre Fen Vai Leu Lis Tis Glu val 65 70 75 80 Ser Glu Tre His Gli Tre ile leu Ile Lis Vai Glu Tir Tis Gli Glu 85 90 95 Asp Ala Pro Cis Lis Ile Pro Fen Ser Tre Glu Asp Gli Gin Gli Lis 100 105 110 Ala His Asn Gli Arg leu He Tre Ala Asn Pro Val Val Tre Lis Lis 115 120 125 Glu Glu Pro Vai Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Fen Gli Glu Ser Asn 130 135 140 Ile Vai Ile Gli ile Gli Asp Lis Ala Leu Lis Ile Asn Trp Tir Arg 145 150 155 160 Lis Gli Ser Ser ile Gli lis Met Fen Glu Ala Tre Ala Arg Gli Ala 165 170 175 Aig Arg Met Ala ile Leu Gli Asp Tre Ala Trp Asp Fen Gli Ser Val 180 185 190

Gli Gli 111

<210> 42 <211> 2253 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) .. (2253) <223> Sequência nucleotídica que no plasmídeo pAZ2 <400> 42 atgggccacc accaccacca ccaegccatg aaagtgcecg acafctggegg aacagaaaat ggcg&cacta ttgctgtgga cgataccctg açactcaaga tggacaaãtt gaaacteaag tttgtgttga agaaagaagt ctcegaaacg fcaçaaagggg aagatgeacc ctgcaaqatt gctcacaatg gcagactgat caeagecaat aacattgagg ctgaacctec ttttggggaa gccetgaâaa tcaactggta caggaaggga gccagaggtg cáaggcgeat ggccatcttg ggtggtgtga attcgatgaa ttcgatggac gaagttaaag ttaaagtcgg cgacaaaatc getgaaggca eggeagccgc tcctaaagcc cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc taegacgtgg tcgtattggg tggeggtcce gatgaaggct tgaaagtegc catcgtcgaa aaegtcggct gtatccettc caaagcctfcg cgceacttgg ctgccaacgg tatcaaatac cgcgccfcaca aagacggcgt agtltcçcge agccgtaaag tggacgttat ccaaggcgac gtgtcgctga ctgccggcga cgcgtacgaa gttgeçttea aaaactgiat cattgcagca cctgaagatc cgçgcatcat cgattccagc aaactgctga ttatcggcgg cggcattatc ctgggttcgc gtttggatgfc ggttgaaafcg gatttggtaa aagtatggca aaaacaaaac accaaaaccg ttgcagttga gccgaaagaa aacgcgdcta aagagccgca acgetacgat aacggcaaac tcateagcgc ggaaaaagca gaagtggaca aacaaatgcg taccaatgtg ggtcagccga tgttggcgca caaagccgtt gccggccaca aagcctactt cgaegeacgc gaagtggegt gggtgggcga aaccgaaetg aaagccaact tecegtgggc ggcttccggc tttaccaagc tgatttttga tgccgaaacc ccgaacggtg gcgatatgat cggegaagtc gcagacatcg gcaaaaccat ccacccgeac gtggcattgg gtacttgtac cg&caaaaaa codifica para a proteína quimérica gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 gtagatatta tcgcggctga agtaaacgtg 120 attaetttgg atctagattt ggatctagat 180 gggatgagct atgcaatgfcg cttgaataçç 240 cagcatggga caatactcaf taagçttgag 300 cctttctcca oggaggatqq acaagggaaa 360 ccâgtqgtga ccaagsagga ggagcctgtc 420 agtaatatag taattggaat tggagacaaa 480 agctcgattg ggaagatgtt cgaggccacfc 540 ggagacaeag cetgggaett tggafcctgtg 600 gtacctgctg aagttgcagg egtagtcaaa 660 tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720 gaagcggctg ccgccccggc geaagaagcc 730 gçgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840 ggcggttact ccgctgcatt tgccgetgec 900 cgttacaaaâ ctttgggcgg cgtttgcct.g 960 ttgcacaatg ccgccgttat cgacgãagtg 1020 cccgagccgg aactcgacat cgatatgctt 1080 ctcacgggcg gtttggeesgg tatggcgaaa 1140 gggcaattct tagatccgca ccacttggaa 1200 caggcagccc ctaccggcga gaaaaaaatc 1260 ggcagccgcg tsaccaaact gcctttcatt 1320 ggcgcattgg ctctgaaaga agtaccgggc 1380 ggcctcgaga tgggtacggt ttacagcacg 1440 atggacggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 1500 gaataccgtfc ttgacaacat. tatggtcaac 1560 gacggcgttt acgfctaccfcfc tgaaggcgcg 1520 gccgtatfcgg ttgecgccgg ççgegcgeee 1680 ggcgttgccg taaccgatcg cggGtteatc 1740 ccgcacatet acgeeatcgg egacatcgtc 1800 cacgaaggce acgttgccgc egaaaactgc 1860 gtgattccgg gcgtigccta cacttccccc 1920 tccgccaaag ectecggccg caaaatcacc 1980 cgtgcgáttg ccaacggttg egacaagccg 2040 gçccgcatcâ taççcggcçç csttgtcggf 2100 tgccttgcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160 ccgggcgaat cceteggtat ggcggcggaa 2220 aaa 2253 <210> 43 112

<211> 747 <212 > PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CADEIA <222> (1) ..(797) <223> Sequência aminoacídica da PAZ2 <400> 43

His His His His His His Met Vai Mp Lis Mg Met Ma leu Vai Glu 1 5 10 15 leu Lis Vai Pro Mp Ile Gli Gli His Glu Mn Vai Asp Ile Ile Ma 20 25 30 Vai Glu Vai Mn Vai Gli Mp Tre Ile Ma Vai Mp Asp Tre Leu Ile 35 40 45 Tre Lar Asp leu Mp Mg Leu Arg Met Mp Lis Leu Gin Leu Lis Gli 50 55 60 Met Ser Tir Ma Met Cis Leu Mn Tre Fen Vai Leu lis Lis Glu Vai 65 70 75 80 Ser Glu Tre His Gli Tre Ile Lar Ile Lis Vai Glu Tir Lis Gli Glu 85 90 95 Mp Ala Pro Cis Lis Ile Pro Fen Ser Tre Glu Asp Gli Gin Gli Lis 100 105 110 Ma His Mn Gli Mg Leu Ile Tre Ma Mn Pro Vai Vai Tre Lis Lis 115 120 125 Glu Glu Pro Vai Mn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Fen Gli Glu Ser Mn 130 135 140 Ile Vai Ile Gli Ile Gli Mp Lis Ma Leu Lis Ile Mn Trp Tir Mg 145 150 155 160 lis Gli Ser Ser Ile Gli Lis Met Fen Glu Ma Tre Ma Mg Gli Ma 165 170 175 Mg Arg Met Ma Ile Leu Gli Asp Tre Ma Trp Asp Fen Gli Ser Vai 180 185 190 Gli Gli Vai Mn Ser Met Mn Ser Met Mp Vai Pro Ma Glu Vai Ma 195 200 205 Gli Vai Vai lis Glu Vai Lis Vai Lis Vai Gli Asp Lis Ile Ser Glu 210 215 220 Gli Gli leu Ile Vai Vai Vai Glu Ma Glu Gli Tre Ma Ma Ma Pro 225 230 235 240 lis Ala Glu Ma Ma Ma Ma Pro Ma Gin Glu Ala Pro Lis Ma Ma 245 250 255 Ma Pro Ma Pro Gin Ma Ma Gin Fen Gli Gli Ser Ma Mp Ma Glu 260 265 270 Tir Asp Vai Vai Vai Leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ma Ma 275 280 285 113

Fen Ala Ala Ala Asp Glu Gli Ler lis Vai Ma Ile Vai Glu Mg Tir 290 295 300 lis Tne Leu Gli Gli Vai Cis Lar Mn Vai Gli Cis Ile Ero Ser Lis 305 310 315 320 Ala Loa Leu His Asn Ala Ma VM Ile Mp Glu VM Mg His Leu Ma 325 330 335 Ala Asn Gli He Lis Tir Ero Glu Ero Glu leu Mp Ile Mp Met leu 340 345 350 Arg Ala Tir lis Asp Gli Vai VM Ser Mg Leu Tre Gli Gli Leu Ma 355 360 365 Gli Met Ala lis Ser Arg Lis VM Mp Vai Ile Gin Gli Mp Gli Gin 370 375 380 Fen Lar Asp Ero His His Leu Glu Vai Ser Leu Tre Ma Gli Mp Ma 385 390 395 400 Tir Glu Gin Ala Ala Ero Tre Gli Glu Lis Lis Ile Vai Ma Fen Lis 405 410 415 Asn Cis lie Ile Ala Ala Gli Ser Arg Vai Tre Lis leu Ero Fen ile 420 425 430 Ero Glu Asp Ero Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gli Ma leu Ma leu Lis 435 440 445 Glu Vai Ero Gli Lis leu leu Ile ile Gli Gli Gli ile ile Gli leu 450 455 460 Glu Met Gli Tre Vai Tir Ser Tre leu Gli Ser Arg leu Mp Vai Val 465 470 475 480 Glu Met Met Asp Gli leu Met Gin Gli Ma Mp Arg Mp leu Vai Lis 485 490 495 Vai Trp Gin lis Gin Asn Glu Tir Arg Fen Mp Mn ile Met Vai Mn 500 505 510 Tre Lis Tre Vai Ala Vai Glu Ero Lis Glu Mp Gli Vai Tir Vai Tre 515 520 525 Fen Glu Gli Ala Asn Ala Ero Lis Glu Ero Gin Arg Tir Mp Ma val 530 535 540 leu Vai Ala Ala Gli Arg Ma Ero Mn Gli Lis leu Ile Ser Ma Glu 545 550 555 560 lis Ala Gli Vai Ala Vai Tre Asp Mg Gli Fen Ile Glu Vai Mp Lis 565 570 575 Gin Met Arg Tre Asn Vai Ero His Ile Tir Ma Ile Gli Mp Ile Val 580 585 590 Gli Gin Ero Met leu Ala His Lis Ma Vai His Glu Gli His Vai Ma 595 600 605 Ala Glu Asn Cis Ala Gli His Lis Ma Tir Fen Asp Ma Mg Vai Ile 610 615 620 Elo Gli Vai Ala Tir Tre Ser Ero Glu Vai Ma Trp Vai Gli Glu Tre 625 630 635 640 Glu Leu Ser Ala Lis Ma Ser Gli Mg Lis Ile Tre lis Ma Mn Fen 645 650 655 Ero Trp Ala Ala Ser Gli Mg Ala Ile Ma Mn Gli Cis Mp Lis Ero 660 665 670 114

Fen Tre Lis leu Ile Fen Asp Ala Glu Tre Gli Arg Ile Ile Gli Gli 675 680 685 GLi Ile Vai GLi Pro Asn Gli Gli Asp Met Ile Gli GLu Vai Cis leu 690 695 700 Ala Ile Glu M=t Gli Cis Asp Ala Ala Asp Ile Gli lis Tre Ile His 705 710 715 720 Pro His Pro Gli Glu Ser ile Gli M=t Ala Ala Glu Vai Ala Leu Gli 725 730 735 Tre Cis Tre Asp leu Pro Pro Gin lis Lis Lis 740 745 <210> 44

<211> 2256 <212 > DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) .. (2256) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pAZ3 <400> 44 atgggccacc aaaçfcgcecg ggegaeacta gctgaagttg ggtggtttga gctgccgccc ttcggcggtt tactccgctg aaaactttgg aatgccgccg ccggaacteg ggcggtttgg accaccacca acattggcgg ttgctgtgga caggegtagt ttgtcgtcgt cggcqcaaga ctgccgatgc cafcttgccgc gçggcgtttg ttatcgacga acatcgatat caggtatggc ccacgccatg acacgaaaat cgataccctg caaagaagtt tgaagctgaa agccccfcaaa cgagtacgac tgccgatgaa cctgsacgtc agtgcgccac gcttcgcgcc gaaaagccgt gtagataaaa gfcagatatta afctactttgg aaagttaaag ggcacggcag gctgccgctc gtggtcgtat ggcfctgaaag ggotgtatcc ttggctgcca tacaaagacç aaagtggacg gaatggcttt tcgcggttga atetagaaat tcggcgacaa ccgctcctaa ctgctccgca tgggtggcgg tcgccatcgt gttccaaagc acggtatcaa gcgtagtttc ttatccasgg agttgaattg 60 agtaaacgtg 120 ggacgtaccfc ISO aatctetgaa 240 agccgaagcg 300 agccgcgcaa 360 tcccggcggt 420 cgaacgttac 480 cttgttgcâc 540 ataçcccgag 600 ccgcctcacg 660 cgacgggcaa 720 115 ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 78U gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840 cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcategattc cagcggcgca 900 ttggctcfcga aagaagtacc gggcaaacfcg ctgattateg gcggcggcat tafccggcctc 960 gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgfcggttga aatgatggac 1020 ggcetgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaãagtat ggçaaaaaca aaacgaatac 1080 cgfctfctgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagcegaa agaagacggc 1140 gtttacgfcta ccfcttgaagg çgegaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200 ttggttgccg ccqgccgcgc gcccaacqgc aaactcatca gcgegga&âã agcaggcgtt 1280 gccgtaaccg atcgeggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgegtaccaa tgtgccgcac 1320 atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgtfcqg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380 ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 cegggcgtfcg cctasacttc cGocgaagtg gcgtgggtgg gegaaaccga actgtccgcc 1600 aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aaottcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggoegc 1620 atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac. ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680 gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ecatccaccc qcacccqacc 1740 ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggeattgg gtacttgtac cgacctgcet 1800 ccgcaaaaga aaaaaggatc eagacteaag atggacaaat tgaaactcaa ggggatgagc 1860 tatgcaatgt gcttgaatac ctttgtgttg aagaaagaag tctccgaaac gcagcatggg 1920 acaãtactca ttaaggttga gtacaaaggç gaagatgcac cctgcaagat tcctttctcc 1980 acggaggatg gacaagggaa agctcacaat ggcagactga tcacagccaa tceagtggfcg 2040 accaaçaagg aggagçctgt caacattgag gctgaacctc cttttgggga aagtaatata 2100 gtaattggaa ttggagacaa agccctgaaa atcaactggt acaggaaggg aagctcgatt 2160 gggaagatgt tcgaggccac tgccagaggt gcaaggcgca tggccatctt gggagacaca 2220 gcctgggact ttggttcagt ggçtggttaa ggatee 2286

<210> 45 <211> 744 <212> PRT <213> Escherichia colí <220> <221> CADEIA <222> (1)..(744) <223> Sequência aminoacidica da PAZ3 <400> 45

His His His His His His Ifet Val Asp Lis Arg Mst Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Vai Glu Val Asn Val Gli Asp Tre Ile Ala Val Asp Asp Tre leu Ile 35 40 45 Tre leu Asp Pfet Asn Ser Mst Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gli Val 50 55 60 Vai lis Glu Val Lis Val Lis Val Gli Asp Lis Ile Ser Glu Gli Gli 65 70 75 80 leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gli Tre Ala Ala Ala Pro Lis Ala 85 90 95 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gin Glu Ala Rro lis Ala Ala Ala Rro 116 100 105 110

Ala Mo Gin Ma Ma Gin Fen Gli Gli Ser Ala Mp Ma Glu Tir Mp 115 120 125 Vai Vai Vai leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ma Ma Fen Ma 130 135 140 Ala Ala Asp Glu Gli Leu lis Vai Ma Ile Vai Glu Mg Tir Lis Tre 145 150 155 160 Leu Gli Gli Vai Cis ler Mn Vai Gli Cis Ile Pro Ser Lis Ala Leu 165 170 175 Leu His Asn Ma Ma Vai Ile Mp Glu Vai Arg His Leu Ma Ala Mn 180 185 190 Gli Ile Lis Tir Pro Glu Pro Glu Leu Mp Ile Mp Met Leu Arg Ma 195 200 205 Tir lis Asp Gli Vai Vai Ser Mg Leu Tre Gli Gli Leu Ma Gli Met 210 215 220 Ala lis Ser Mg Lis Vai Mp Vai Ile Gin Gli Mp Gli Gin Fen Leu 225 230 235 240 Asp Pro His His Leu Glu Vai Ser Leu Tre Ala Gli Mp Ma Tir Glu 245 250 255 Gin Ala Ma Pro Tre Gli Glu Lis Lis Ile Vai Ma Fen Lis Mn Cis 260 265 270 Ile Ile Ma Ma Gli Ser Mg Vai Tre Lis Ler Pro Fen Ile Pro Glu 275 280 285 Asp Pro Mg Ile Ile Asp Ser Ser Gli Ma Ler Ma Leu Lis Glu Vai 290 295 300 Pro Gli Lis Leu Leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli Leu Glu Met 305 310 315 320 Gli Tre Vai Tir Ser Tre Leu Gli Ser Mg Ler Mp Vai Vai Glu Met 325 330 335 Met Asp Gli Leu Met Gin Gli Ma Mp Mg Asp Leu Vai Lis Vai Trp 340 345 350 Gin lis Gin Mn Glu Tir Mg Fen Mp Mn Ile Met Vai Mn Tre lis 355 360 365 Tre Vai Ma Vai Glu Pro lis Glu Mp Gli Vai Tir Vai Tre Fen Glu 370 375 380 Gli Ma Mn Ma Pro Lis Glu Pro Gin Mg Tir Mp Ma Vai Ler Vai 385 390 395 400 Ala Ma Gli Mg Ma Pro Mn Gli Lis Leu Ile Ser Ma Glu Lis Ma 405 410 415 Gli Vai Ma Vai Tre Asp Mg Gli Fen Ile Glu Vai Mp Lis Gin Met 420 425 430 Arg Tre Mn Vai Pro His Ile Tir Ma Ile Gli Mp Ile Vai Gli Gin 435 440 445 Pro Met Leu Ma His Lis Ma Vai His Glu Gli His Vai Ma Ala Glu 450 455 460 Asn Cis Ma Gli His Lis Ma Tir Fen Mp Ala Mg Vai Ile Pro Gli 465 470 475 480 Vai Ma Tir Tre Ser Pro Glu Vai Ma Trp Vai Gli Glu Tre Glu leu 490 485 495 117

Ser Ma Lis Ma Ser Gli Mg Lis Lie Tre Lis Ma Mn Fen Pro Trp 500 505 510 Ma Ma Ser Gli Mg Ma Lie Ma Mn Gli Cis Mp Lis Pro Fen Tre 515 520 525 Lis Leu Lie Pen Mp Ma Glu Tre Gli Mg Ile Ile Gli Gli Gli Ile 530 535 540 Vai Gli Pro Mn Gli Gli Mp Met Ile Gli Glu Val Cis Leu Ala Ile 545 550 555 560 Glu Met Gli Cis Mp Ma Ma Mp Ile Gli Lis Tre Ile His Pro His 565 570 575 Pro Gli Glu Ser lie Gli Met Ma Ma Glu Val Ma leu Gli Tre Cis 580 585 590 Tre Mp Leu Pro Pro Gin lis Lis Lis Gli Ser Mg Leu Lis Met Mp 595 600 605 Lis leu Lis leu Lis Gli Met Ser Tir Ma Met Cis Leu Mn Tre Fen 610 615 620 Vai leu Lis Lis Glu Val Ser Glu Tre His Gli Tre ile Leu Ile Lis 625 630 635 640 Vai Glu Tir Lis Gli Glu Mp Ma Pro Cis Lis Ile Pro Fen Ser Tre 645 650 655 Glu Mp Gli Gin Gli Lis Ma His Mn Gli Mg leu Ile Tre Ma Mn 660 665 670 Pro Val Val Tre Lis Lis Glu Glu Pro Val Mn ile Glu Ma Glu Pro 675 680 685 Pro Fen Gli Glu Ser Mn Ile Val Ile Gli Ile Gli Mp Lis Ma leu 690 696 700 Lis He Mn Trp Tir Mg lis Gli Ser Ser Ile Gli Lis Met Fen Glu 705 710 715 720 Ma Tre Ma Mg Gli Ma Mg Mg Met Ma Ile leu Gli Mp Tre Ma 725 730 735 Trp Mp Fen Gli Ser Val Gli Gli 740

<210> 46 <211> 426 <212 > DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(426) <223> Sequência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína de envelope DEN-4 118 <4 Ο Ο > 46 aaagtccgta tggagaaatfc gsgaatcaag ggaatgtcafc acacgatgfcg ttcaggaaag 60 ttttcaattg acaaagagat ggcagaaaca cagcatggga eaacagtggt gaaagtcaag 120 tatgaaggtg ctggagctec gtgtaaagtc cccatagaga taagagatgt aaacaaggaa ISO aaagtggttg ggcgtatcat ctcatccacc cctttggctg agaataccaa cagtgtaacc 240 aacafcagaat tagaaccccc ctttggggac agctacatag tgataggtgt tggaaacagc 300 gcattaacac tccattggtt caggaaaggg agttccattg gcaagatgtt tgagtccaca 360 tacagaggtg caaaacgaat ggccattcta ggtgaaacag cttgggattt tggttccgtt 420 ggtgga 426

<210> 47 <211> 615 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) . . (615) <223> Sequência nucleotidica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pIDl <400> 47 atgggccacc accaceacea ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaaegtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180 aaagtgcgta tggaçaaatt gagaafccaag ggaatgtcat acacgatgtg ttcaggaaag 240 ttttcaattg acaaagagat ggcagaaaca cagcatggga caacagtggt gaaagtcaag 300 tatgaaggtg ctggagctec gtgtaaagtc cccatagaga taagagatgt aaacaaggaa 360 aaagtggttg ggcgtatcat ctcatccacc cctttggctg agaataccaa cagtgtaacc 420 aacafcagaat tagaaccccc ctttggggac agctacatag tgataggtgt tggaaacagc 480 gcattaacac tccattggtt caggaaaggg agttccattg gcaagatgtt tgagtccaca 540 tacagaggtg caaaacgaat ggccattcta ggfcgaaacag cttgggattt tggttccgtt 600 ggtggataag gatcc 613

<210> 48 <211> 192 <212> PRT <213> Escherichia coli <22 0 > <221> CADEIA <222> (1) .. (192) <223> Sequência aminoacídica da PIDl 119 <4 Ο Ο > 48

His His His His His His Met Vai 1 5 Leu lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli 20 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre 35 40 Tre leu Asp Lis Vai Arg Met Glu 50 55 Tir Tre Met Cis Ser Gli Lis Fen 65 70 Tre Gin His Gli Tre Tre Vai Vai 85 Ala Pro Cis Lis Vai Pro Ile Glu 100 Vai Vai Gli Arg Ile Ile Ser Ser 115 120 Ser Vai Tre Asn Ile Glu Leu Glu 130 135 Ile Gli Vai Gli Asn Ser Ma Leu 145 150 Ser Ser Ile Gli Lis Met Fen Glu 165 Met Ala Ile leu Gli Glu Tre Ma

Asp Lis Arg Met Ma Leu Vai Glu 10 15 His Glu Asn Vai Asp Ile Ile Ala 25 30 Ile Ma Vai Asp Asp Tre Leu Ile 45 Lis Leu Mg Ile Lis Gli Met ser 60 Ser Ile Asp Lis Glu Met Ala Glu 75 80 Lis Vai Lis Tir Glu Gli Ala Gli 90 95 Ile Mg Asp Vai Mn Lis Glu Lis 105 110 Tre Pro Ler Ma Glu Mn Tre Mn 125 Mg Pro Lar Asp Ser Tir Ile Vai 140 Tre Leu His Trp Fen Mg Lis Gli 155 160 Ser Tre Tir Mg Gli Ma Lis Mg 170 175 Trp Asp Fen Gli Ser Vai Gli Gli 185 190 180

<210> 49 <211> 2241 <212 > DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) .. (2241) codifica para a proteína quimérica <223> Sequência nucleotídica que no plasmídeo pID2 <400> 49 120 afcgggecacc accaccacca ceaegccatg gtagataaaa gaatggcttt agfctgaattg 60 aãagtgcccg acattggcgg aacagaaaafc gtagatatta tcgeggtcgs agtaaacgfcg 120 ggegacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagacaa agtccgtatg 180 gagaaattga gaatcaaggg aatgtcatac acgatgtgfct caggaaagtt tteaattgac 240 aaagagatgg cagaaacaca geatgggaoa acagtggtga aagtcaagta tgaaggtget 300 ggagctccgt gtaaagtccc catagagata agagatgtaa acaaggaaaa agtggttggg 360 cgtatcôfcct catccàcccc tttggctgag aataccaaca gtgtaaccaa catagaafctâ 420 gaacccccct fctggggacag ctacatagtg ataggtgttg gaaacagcgc atfcaacactc 480 cafctggttca ggaaagggag ttceattggc aagatgtttg agtccacata cagaggtgca 540 aaacgaatgg ccattctagg tgaaacagofc tgggafcfcttg gtagcgttgg tggactgaafc €00 togatgaatt cgatggacgt acctgctgaa gttgcaggcg tagtcaaaga agttaaagtt 660 aaagtcggeg acaaaatctc tgaaggtggt ttgattgtcg tcgttgaagc tgaaggcacg 320 gcagccgctc ctaaagccçs agcggctgcc gccccggcgc aagaagcccc taaagctgcc 780 gctcctgctc çgcaagccgc gcaattcggc ggttctgccg atgccgagta cgacgtggtc 840 çtattgggtg gcggtcccgg cggttactce gctgcatttg ccgctgccga cgaaggettg 900 aaagtcgGca tcgtcçaacg ttacãaaact ttgggcggcg tttgcctgaa cgtcggcfcgt 960 atcccttcca aagccttgtt gcacaatgcc gccgttatcg acgaagtgcg ccacttgget 1020 gccaaçggta teaaataccc cgagccggaa ctcgacatcg atatgcttcg cgeetacaaa 1080 gacggcgtag tttcccgcct cacgggcggt ttggcaggta tggcgaaaag ccgtaaagtg 1140 gacgttatcc aaggcgacgg gcaattctta gatccgcacc acttggaagt gfccgctgact 1200 gccggcgacg cgtacgaaca ggcagcocct accggcgaga aaaaaatcgt tgccttcaaa 1260 aactgtatca ttgcagcagg cagccgcgta accaaactgc ctttçatfccc tgaagatccg 1320 cgcatcatcg attccagcgg cgcattggcc ctgaaagaag taccgggcaa actgctgatt 1380 atcggcggcg gcattatcgg cctcgagatg ggtacggttt acagcaçgct gggttcgcgfc 1440 ttggatgtgg ttgaaatgat ggacggcctg atgcaaggcg cagaccgcga tttggtaaaa 1500 gtatggcaaa aacaaaacga ataccgtttt gacaacatta tggtcaaeae caaaaccgtt 1560 gcagttgagc çgaaagaaga cggcgtttac gttaectttg aaggcgcgaa cgcgcctaaa 1620 gagccgcaac gctacgatgc cgtattggtt gccgccggcc gcgcgcccaa cggcaaactc 1680 atcagcgegg aaaaagcsgg cgttgccgta accgatcgcg gcttcatcga agtggacaaa 1740 caaatgcgta ccaatgtgcc gcacatctac gccatcggcg acafccgtcgg tcagccgatg 1800 ttggcgcaca âagccgttca cgaaggccac gttgccgccg aaaactgcgc cggccacaaa 1860 gcctacttcg acgcacgcgt gattccgggc gttgcctaca cttcccccga agtggcgtgg 1920 gtgggegaaa ccgaaotgtc egccaaagcc tccggccgca aaatcaccaa agccaacttc 1980 ccgtgggcgç cttccggccg tgcgattgee aacggttgcg acaagccgtt taccaagctg 2040 atttttgatg ccgaaaccgg ccgcatcatc ggcggcggea ttgteggtcc gaaeggtggc 2100 gatatgatcg gcgaagtctg ccttgccatc gaaatgggct gcgacgcggc agacatcggc 2160 aaaaccatcc acccgcaccc gggcgaatcc atcggtatgg cggeggaagt ggcattgggt 2220 acttgtaccg acaeaaaaaa a 2241

<210> 50 <211> 747 <212> PRT <213> Escherichia coli <22 0 > <221> CADEIA <222> (1) . . (747) <223> Sequência aminoacídica da PID2 <400> 50 121

His His His His His His Met Val Asp Lis Arg Met Ma Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His Glu Mn Val Mp Ile Ile Ala 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Val Gli Asp Tre Ile Ma Val Mp Mp Tre Leu Ile 35 40 45 Tre leu Asp leu Asp Arg leu Arg Met Asp Lis leu Gin leu Lis Gli 50 55 60 Met Ser Tir Tre Met Cis Ser Gli Lis Fen Ser Ile Mp Lis Glu Met 65 70 75 80 Ala Glu Tre Gin His Gli Tre Tre Val Val Lis Val Lis Tir Glu Gli 85 90 95 Ala Gli Ala Pro Cis Lis Val Pro Ile Glu Ile Mg Mp Val Mn lis 100 105 110 Glu lis Vai Vai Gli Arg Ile Ile Ser Ser Tre Pro leu Ma Glu Mn 115 120 125 Tre Asn Ser Val Tre Asn Ile Glu leu Glu Arg Pro leu Mp Ser Tir 130 135 140 Ile Vai He Gli Val Gli Asn Ser Ala leu Tre leu His Trp Fen Mg 145 150 155 160 Lis Gli Ser Ser Ile Gli lis Met Fen Glu Ser Tre Tir Mg Gli Ma 165 170 175 Lis Arg Met Ala Ile leu Gli Glu Tre Ma Trp Asp Fen Gli Ser Val 180 185 190 Gli Gli leu Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Eio Ma Glu Val Ma 195 200 205 Gli Vai Vai Lis Glu Val lis Val Lis Val Gli Asp Lis ile Ser Glu 210 215 220 Gli Gli leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gli Tre Ma Ma Ala Eio 225 230 235 240 Lis Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gin Glu Ma Pro Lis Ala Ma 245 250 255 Ala Eio Ala Pro Gin Ala Ala Gin Fen Gli Gli Ser Ma Mp Ala Glu 260 265 270 Tir Asp Vai Val Val leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ala Ma 275 280 285 Fen Ala Ala Ala Asp Glu Gli leu Lis Val Ala Ile Val Glu Arg Tir 290 295 300 Lis Tre leu Gli Gli Val Cis leu Asn Val Gli Cis Ile Pro Ser lis 305 310 315 320 Ala leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Mg His Leu Ma 325 330 335 Ala Asn Gli Ile Lis Tir Eio Glu Pro Glu leu Asp Ile Mp Met leu 340 345 350 Arg Ala Tir Lis Asp Gli Val Val Ser Mg Leu Tre Gli Gli Leu Ma 355 360 365 Gli Met Ala Lis Ser Arg lis Val Asp Val Ile Gin Gli Mp Gli Gin 370 375 380 122

Fen leu Asp Pro His His leu Glu Val Ser Ler Tre Ma Gli Asp Ma 385 390 395 400 Tir Glu Gin Ala Ma Pro Tre Gli Glu Lis Lis Ile Val Ma Fen lis 405 410 415 Mn Cis Ile Ile Ma Ala Gli Ser Mg Val Tre lis Leu Pro Fen Ile 420 425 430 Pro Glu Asp Pro Mg Ile Ile Mp Ser Ser Gli Ma leu Ma Leu Lis 435 440 445 Glu Vai Pro Gli Lis Ler leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli Leu 450 455 460 Glu Met Gli Tre Val Tir Ser Tre leu Gli Ser Mg leu Mp Val Val 465 470 475 480 Glu Brit Met Asp Gli Ler Met Gin Gli Ma Asp Mg Mp Leu VM Lis 485 490 495 Vai Trp Gin Lis Gin Mn Glu Tir Mg Fen Asp Mn ile Met Val Mn 500 505 510 Tre lis Tre Vai Ma Val Glu Pro LÍS Glu Asp Gli Val Tir Val Tre 515 520 525 Fen Glu Gli Ala Mn Ala Pro Lis Glu Pro Gin Mg Tir Mp Ala Val 530 535 540 leu Vai Ala Ma Gli Arg Ma Pro Mn Gli Lis leu Ile Ser Tila Glu 545 550 555 560 Lis Ala Gli Val Ma Val Tre Mp Mg Gli Fen ile Glu Val Asp LÍS 565 570 575 Gin Met Arg Tre Mn Val Eio His Ile Tir Ala Ile Gli Mp Ile Val 580 585 590 Gli Gin Pro Met leu Ala His Lis Ma Val His Glu Gli His Val Ma 595 600 605 Ala Glu Asn Cis Ma Gli His Lis Ma Tir Fen Mp Ma Mg Val Ile 610 615 620 Pro Gli Vai Ma Tir Tre Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gli Glu Tre 625 630 635 640 Glu leu Ser Ma Lis Ala Ser Gli Mg Lis Ile Tre Lis Ma Mn Fen 645 650 655 Pro Trp Ala Ma Ser Gli Mg Ma Ile Ma Mn Gli Cis Mp Lis Pr 660 665 670 Fen Tre Lis leu Ile Fen Mp Ma Glu Tre Gli Mg Ile Ile Gli Gli 675 680 685 Gli Ile Vai Gli Pro Mn Gli Gli Mp Met Ile Gli Glu Val Cis leu 690 695 700 Ala Ile Glu Met Gli Cis Mp Ma Ma Mp Ile Gli Lis Tre Ile His 705 710 715 720 Pro His Pro Gli Glu Ser Ile Gle Met Ma Ala Glu Val Ma leu Gli 725 730 735 Tre Cis Tre Asp Leu Pro Pro Gin Lis Lis Lis 740 745 <210 > 51 <211> 2256 123

<212 > DNA <213> Escherichía coli <22 0 > <221> gene <222> (1) .. (2256) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pID3 <400> 51 atgggccaçc accaccacca ccacgccatg gtagatsaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg aeattggcgç acacgaaaat gtagatatta tegcggttga agtaaacgtg 120

ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attâctttgg atctãgaaat ggaegtacct ISO gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240 ggtggtttga ttgtcgtegt tgaagctgaa ggcaçggcag ccgetcctaa agccgaagcg 300 gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agecgcgcaa 360 ttcggcggtt cfcgccgatge cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420 tactccgetg catttgccgc tgccgatgaa gçettgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480 aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgfcc ggetgtatcc cttccaaage cttgttgcac 540 aatgccgccg ttatcgacqs agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600 ccggaactcg acatcgatat. gcttcgcgce t.acauagacg gcgtagtttc cegcctcacg 660 ggcggtfcfcgg eaggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg tíafcceaagg cgaegggcaa 720 ttettagatc cgcaccactt gçraagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta egaacaggca 780 gcccctâCCg gcgagaaaáa aatcgttgcc ttcaaa&act gtatcatfcgc agcaggcagc 840 cgcgtaacca aactgccttt catccctgaa gatccgegca tcatcgattc cagcggcgca 900 fctggctctga aagaagtacc gggcaaactg etgattatcg gcggeggcat tatcggççtc 960 gagatgggfca cggtttaeag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020

ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1ÔSO cgttttgaca acattatggt caacaecaaa accgttgcag ttgagecgaa agaagacggc 3140 gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 3200 ttggttgceg ccggcegcgç gcccaaçgge aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgfct 1260 qecgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaaeaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320 atctacgcca teggcgaeai cgtcggtcag eegatgttgg cgeacaaage egttcacgaa 1380 ggccacgttg cegccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 ccgggcgttg cctacactfcc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500 aaagcctccg gcegcaaaat caocaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 atfcgccascg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620 atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaae ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 3680 gccatçgaaa tgggctgcga çgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 3740 ttgggcgaat ccatcggtat. ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac egsectgcct 1800 ccgcaaaaga aaaaaggatc caaagtgcgt atggagaaat tgagaatcaa gggaatgtca 1860 tacacgatgt gttcaggaaa gttttcaatt gacaaagaga tggcagaaac acagcatggg 1920 acaacagtgg tgaaagtcaa gtatgaaggt gctggagctc cgtgtaaagt ccccatagag 1980 ataagagatg taaacaagga aaaagtggtt gggcgtatca tctcatccac ccctttggct 2040 gagaatacca acagtgtaac caaeatagaa ttagaacccc cetttgggga eagetacata 2100 gtgataggtg ttggaaacãg egcattaaca ctccattggt tcaggaaagg gagttccatt 2160 ggcaagatgt ttgagtccac atacagaggt gcaaaacgaa tggcsattet aggtgaaaca 2220 gcttgggafct ttggttcggt tggtggctaa ggatcc 2256

<210> 52 <211> 744 <212> PRT <213> Escherichía coli 124 <2 2 Ο > <221> CADEIA <222> (1)..(744) <223> Sequência aminoacídica da PID3 <400> 52

His His His His His His Met Vai Asp Lis Arg Met Ala leu Vai Glu 1 5 10 15 Leu Lis Vai EAo Asp Ile Gli Gli His Glu Asn Vai Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile Ala Vai Asp Asp Tre leu Ile 35 40 45 Tre Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Vai Pro Ala Glu Vai Ala Gli Vai 50 55 60 Vai Lis Glu Vai Lis Vai Lis Vai Gli Asp lis Ile Ser Glu Gli Gli 65 70 75 80 Leu Ile Vai Vai Vai Glu Ala Glu Gli Tre Ala Ala Ala Pro Lis Ala 85 90 95 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gin Glu Ala Ero Lis Ala Ala Ala Rx> 100 105 110 Ala Pro Gin Ala Ala Gin Fen Gli Gli Ser Ala Asp Ala Glu Tir Asp 115 120 125 Vai Vai Vai leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ala Ala Fen Ala 130 135 140 Ala Ala Asp Glu Gli Leu Lis Vai Ala Ile Vai Glu Arg Tir Lis Tre 145 150 155 160 Leu Gli Gli Vai Cis Leu Asn Vai Gli Cis Ile Pro Ser Lis Ala leu 165 170 175 Leu His Asn Ala Ala Vai Ile Asp Glu Vai Arg His Leu Ala Ala Asn 180 185 190 Gli Ile Lis Tir Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala 195 200 205 Tir Lis Asp Gli Vai Vai Ser Arg Leu Tre Gli Gli Leu Ala Gli Met 210 215 220 Ala Lis Ser Arg Lis Vai Asp Vai Ile Gin Gli Asp Gli Gin Fen Leu 225 230 235 240 Asp Pro His His Leu Glu Vai Ser Leu Tre Ala Gli Asp Ala Tir Glu 245 250 255 Gin Ala Ala Pro Tre Gli Glu Lis Lis Ile Vai Ala Fen Lis Asn Cis 260 265 270 Ile Ile Ala Ala Gli Ser Arg Vai Tre Lis leu Pro Fen Ile Pro Glu 275 280 285 Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gli Ala leu Ala leu Lis Glu Vai 290 295 300 125

Pro Gli Lis Leu Leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli Leu Glu Met 305 310 315 320 Gli Tre VM Tir Ser Tre ler Gli Ser Mg leu Mp Vai Vai Glu Met 325 330 335 Met Mp Gli Leu Met Gin Gli Ma Mp Mg Mp Leu Vai Lis VM Trp 340 345 350 Gin Lis Gin Mn Glu Tir Mg Fen Mp Mn Ile Met Vai Mn Tre lis 355 360 365 Tre Vai Ma Vai Glu Pro Lis Glu Mp Gli Vai Tir Vai Tre Fen Glu 370 375 380 Gli Ma Mn Ma Pro Lis Glu Pro Gin Arg Tir Mp Ma Vai Ler Vai 385 390 395 400 Ma Ma Gli Mg Ma Pro Mn Gli Lis Ler Ile Ser Ma Glu Lis Ma 405 410 415 Gli Vai Ma Vai Tre Mp Mg Gli Fen Ile Glu Vai Mp Lis Gin Met 420 425 430 Mg Tre Mn Vai Pro His Ile Tir Ma Ile Gli Mp Ile Vai Gli Gin 435 440 445 Pro Met Ler Ma His Lis Ma Vai His Glu Gli His Vai Ma Ma Glu 450 455 460 Mn Cis Ma Gli His Lis Ma Tir Fen Mp Ma Mg Vai Ile Pro Gli 465 470 475 480 Vai Ma Tir Tre Ser Pro Glu Vai Ma Trp Vai Gli Glu Tre Glu Leu 485 490 495 Ser Ma Lis Ma Ser Gli Mg Lis Ile Tre lis Ma Mn Fen Pro Trp 500 505 510 Ma Ma Ser Gli Mg Ma Ile Ma Mn Gli Cis Mp Lis Pro Fen Tre 515 520 525 Lis Leu Ile Pen Mp Ma Glu Tre Gli Arg Ile Ile Gli Gli Gli Ile 530 535 540 Vai Gli Pro Mn Gli Gli Mp Met Ile Gli Glu Vai Cis Leu Ma Ile 545 550 555 560 Glu Met Gli Cis Mp Ma Ala Mp Ile Gli lis Tre Ile His Pro His 565 570 575 Pro Gli Glu Ser Ile Gli Met Ma Ma Glu Vai Ma Leu Gli Tre Cis 580 585 590 Tre Mp Leu Pro Pro Gin Lis Lis Lis Gli Ser Mg Leu Lis Met Mp 595 600 605 Lis Leu Mg Ile Lis Gli Met Ser Tir Tre Met Cis Ser Gli Lis Fen 610 615 620 Ser Ile Mp lis Glu Met Ala Glu Tre Gin His Gli Tre Tre VM Vai 625 630 635 640 Lis Vai Lis Tir Glu Gli Ma Gli Ma Pro Cis Lis Vai PrO Ile Glu 645 650 655 lie Mg Mp Vai Mn Lis Glu Lis Vai Vai Gli Mg Ile Ile Ser Ser 660 665 670 Tre Pro Lar Ma Glu Mn Tre Mn Ser VM Tre Mn Ile Glu Lar Glu 675 680 685 126

Arg Pro Leu Asp Ser Tir Ile Vai 690 695 Tre Leu His Trp Fen Arg Lis Gli 705 710 Ser Tre Tir Arg Gli Ala Lis Arg 725 Trp Asp Fen Gli Ser Vai Gli Gli 740

Ile Gli Vai Gli Asn Ser Ala Leu 700 Ser Ser Ile Gli Lis Met Fen Glu 715 720 Met Ala Ile Leu Gli Glu Tre Ala 730 735 <210> 53

<211> 2694 <212 > DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) .. (2694) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmideo pD4D2 <400> 53 gcagccgcgt aaccaaactg gcgeattggc tctgaaagaa gcctcgagat gggtacqgtt tggacggcct gatgcasggc aataccgttt tgacaacatt acggcgttta cgttaccttt cegtatiggt tgccgccggc gcgttgccgt aaccgafccgc cgcacatcta cgccatcggc aegaaggcca cgttgccgcc atgggccacc aaagtgcccg ggegacaeta çagaaattga aaagagatgg ggagetccgt çgfcatcatct gaeccccccfc cattggttca aaacgaatgg gaâatgçjâçg gacaaaatct cctaaagccg ccgcaagccg ggcggtcceg atçgtcgaac aaagcctf.gt atcaaatacc gtttcccgcc caeggcgacg gegtacgaac attgcagcag gattccagcg ggcattatcg gttgaaatga aaacaaaacg ccgaaagaag cgctacgatg gaaaaagcag accaatgtgc aaagccgttc aecaceacca acattggcgg ttgctgtgga gaatcaaggg cagaaaeaca gtaaaqtccc catccacccc ttggggacag ggaaagggag ccattctagg tacctgçtga ctgasggtgg aagcggctgc cgcaattcgg gcggttactc gttacaaaac tgcacaatgc ccgagccgga tcacgggcgg ggcaattctt aggcagcccc ccacgccatg acaegsaaat cgataccctg aatgtcatac gcatgggaca catagagata tttggctgag ctacatagtg ttccafctggc tgaaacagct agttgcaggc tttgattgtc egccccggcg cggttctgcc cgctgcattt tttgggcggc cgecgttatc actcgacatc tttggcaggt agatccgcac taçcggcgâg gtagataaaa gtagatatta attactttgg acgatgtgtt acagtggtga agagatgtaa aataccaaca atagqtgttg aagatgtttg tgggattttg gtagtcaaag gtcgttgaag caagaagcec gatgccgagt gcegetgeeg gfcttgcetga gacgaagtgc gafcatgcttc atggcgaaaa cacttggaag aaaaaaatcg cetttcattc gtaccgggca tacagcacgc gcagaccgcg atggtcaaca gaaggegcga cgcgcgccca ggctfccatcg gacatcgteg gaaaactgcg gaatggcttf tcgcggttga atctagacaa caggaaagtt aagtcaagta acaaggaaaa gtgtaaccaa gaaacagcgc agtccacafca gttccgttgg aagttaaagt etgaaggcac ctaaagctgc acgacgtggt atgaaggctt acgtcggctg geeacttggc gcgcctacaa gccgtaaagt tgtcgctgac ttgccttcaa cfcgaagatcc aactgctgat tgggfctcgcg atttggtaaa ccaaaaccgt acgcgcctaa acggcaaact aagcggacaa gtcagccgat ccggccacaa agfctgaattg 60 agtaaacgtg 120 agtecgtatg ISO ttcaattgac 240 igaaggtgct 300 agtggttggg 36Ô cafcagaafcta 420 stfcaacactc· 480 cagaggtgca 540 tggtcttcta 600 taaagtcggc 660 ggeagccgct 720 cgctcctgct 780 cgtattgggt 840 gaaagtcgcc 900 tatcccttcc 960 tgccaacggt 1020 agacggcgta 1080 ggacgttatc 1140 tgccggcgac 1200 aaactgtatc 1260 gcgcatcatc 1320 tatcggcggc 1380 tttggatgfcg 1440 agtatggcaa 1500 tgcagttgag 1560 agagccgcaa 1620 catcagcgçg 1680 acaaatgcgt 1740 gttggçgcac 1800 agcctacttc 1860 127 gacgcãegcg tgattccggg cgttgcctac acttcccccg aagtggcgtg ggtgggcgaa 1920 accgaactgt çcgccaaagc ctccggccge aaaatcacca aagccaactt cccgtgggcg 1980 gcttceggcc gfcgcgatfcgc caacggttgc gacaagccgt ttaccaagct gatttttgat 2040 gccgaãaceg gccgcatcat cggcggcggc attgtcggtc cgaacggtgg cgatatgatc 2100 ggcgaagtct gccttgccat cgaaatgggc tgcgacgcgg dagacãtcgg caaaaccatc 2160 cacccgeacc cgaccttggg cgaatccate ggtatggcgg cggaagtggc attgggtact 2220 tgtaccgacc tgeetccgca asaçaaaaaa ggatccgaca ggctgagaat ggacaaaçta 2280 cagctcaaag gaatgtcata ctc.tatgtgt acaggaaagt ttaaaattgt gaaggaaata 2340 gesgaaacac aacatggaac aatagttatc agagtacaat atgaagggga cggctctcca 2400 tgtaagatcc cttttgagat aatggatttg gaaaaaagac acgtcttagg tcgcctgatt 2460 acagttaacc cgatcgtaac agaeaaagat agcçcagtca acatagaage agaacctcca 2520 ttcggagaca gctacatcat cataggagta gagccgggac aattgaaact caactggttt 2580 aagaaaggaa gttccatcgg ccaaatgttt gagacaacaa tgagaggagc gaagagaatg 2640 gccattttag gtgaeâcagc ctgggatttt gggtctctgg gtggttaagg atcc 2694

<210> 54 <211> 891 <212> PRT <213> Escheríchia coli <220> <221> CADEIA <222> (1)..(891) <223> Sequência aminoacídica da PD4D2 <400> 54

His His His His His His Met Vai Asp Lis Arg Met Ala Leu Vai Glu 1 5 10 15 Leu lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His Glu Asn Vai Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile Ala Vai Asp Asp Tre Leu Ile 35 40 45 Tre leu Asp Leu Asp Arg leu Arg Met Asp Lis leu Gin Leu Lis Gli 50 55 60 Met Ser Tir Tre Met Cis Ser Gli Lis Fen Ser Ile Asp Lis Glu Met 65 70 75 80 Ala Glu Tre Gin His Gli Tre Tre Vai Vai Lis Vai Lis Tir Glu Gli 85 90 95 Ala Gli Ala Pro Cis Lis Vai Pro Ile Glu Ile Arg Asp Vai Asn lis 100 105 110 Glu lis Vai Vai Gli Arg Ile Ile Ser Ser Tre Pro Leu Ala Glu Asn 115 120 125 Tre Asn Ser Vai Tre Asn Ile Glu Leu Glu Arg Pro leu Asp Ser Tir 130 135 140 Ile Vai ile Gli Vai Gli Asn Ser Ala Leu Tre leu His Trp Fen Arg 145 150 155 160 Lis Gli Ser Ser ile Gli lis Met Fen Glu Ser Tre Tir Arg Gli Ala 165 170 175 128

Lis Arg Met Ala Ile Ler Gli Glu Tre Ala Trp Asp Fen Gli Ser Val 180 185 190 Gli Gli Leu Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala 195 200 205 Gli Vai Vai Lis Glu Vai Lis Vai Lis Val Gli Asp Lis Ile Ser Glu 210 215 220 Gli Gli leu Ile Vai Vai Vai Glu Ala Glu Gli Tre Ala Ala Ala Pro 225 230 235 240 Lis Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gin Glu Ala Pro Lis Ala Ala 245 250 255 Ala Pro Ala Pro Gin Ala Ala Gin Fen Gli Gli Ser Ala Asp Ala Glu 260 265 270 Tir Asp Vai Vai Vai Lee Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ala Ala 275 280 285 Fen Ala Ala Ala Asp Glu Gli leu Lis Val Ala ile Val Glu Arg Tir 290 295 300 Lis Tre leu Gli Gli Vai Cis leu Asn Val Gli Cis ile Pro Ser Lis 305 310 315 320 Ala leu leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala 325 330 335 Ala Asn Gli ile Lis Tir Pro Glu Pro Glu Leu ÃSp Ile Asp Met leu 340 345 350 Arg Ala Tir Lis Asp Gli Vai Val Ser Arg Leu Tre Gli Gli Leu Ala 355 360 365 Gli Met Ala Lis Ser Arg lis Val Asp Val Ile Gin Gli Asp Gli Gin 370 375 380 Fen leu Asp Pro His His leu Glu Val Ser Leu Tre Ala Gli Asp Ala 385 390 395 400 Tir Glu Gin Ala Ala Pro Tre Gli Glu Lis Lis Ile Val Ala Fen lis 405 410 415 Asn Cis Ile Ile Ala Ala Gli Ser Arg Val Tre lis leu Pro Fen Ile 420 425 430 Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gli Ala leu Ala leu lis 435 440 445 Glu Vai Pro Gli Lis leu leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli leu 450 455 460 Glu Met Gli Tre Vai Tir Ser Tre leu Gli Ser Arg leu Asp Val Val 465 470 475 480 Glu Hat Met Asp Gli leu Met Gin Gli Ala Asp Arg Asp leu Val lis 485 490 495 Vai Trp Gin Lis Gin Asn Glu Tir Arg Fen Asp Asn Ile Met Val Asn 500 505 510 Tre lis Tre Vai Ala Vai Glu Pro Lis Glu Asp Gli Val Tir Val Tre 515 520 525 Fen Glu Gli Ala Asn Ala Pro Lis Glu Pro Gin Arg Tir Asp Ala Val 530 535 540 Leu Vai Ala Ala Gli Arg Ala Pro Asn Gli Lis leu Ile Ser Ala Glu 545 550 555 560 129

Lis Ma Gli Vai Ma VM Tre Mp Mg Gli Fen Ile Glu Val Asp Lis 565 570 575 Gin Met Mg Tre Mn VM Pro His Ile Tir Ala Ile Gli Mp Ile Val 580 585 590 Gli Gin Pro Met Leu Ala His Lis Ma Vai His Glu Gli His VM Ma 595 600 605 Ala Glu Asn Cis Ma Gli His Lis Ma Tir Fen Mp Ma Mg VM Ile 610 615 620 Pro Gli Vai Ma Tir Tre Ser Pro Glu Vai Ala Trp Val Gli Glu Tre 625 630 635 640 Glu leu Ser Ma Lis Ala Ser Gli Mg Lis Ile Tre Lis Ma Mn Fen 645 650 655 Pro Trp Ma Ma Ser Gli Mg Ma Ile Ma Mn Gli Cis Mp Lis Pr 660 665 670 Fen Tre Lis leu Ile Fen Mp Ma Glu Tre Gli Mg ile Ile Gli Gli 675 680 685 Gli Ile Vai Gli Pro Mn Gli Gli Mp Met Ile Gli Glu Val Cis leu 690 695 700 Ala Ile Glu Met Gli Cis Mp Ma Ma Mp Ile Gli Lis Tre ile His 705 710 715 720 Pro His Pro Gli Glu Ser ile Gle Met Ma Ala Glu Val Ma Leu Gli 725 730 735 Tre Cis Tre Asp leu Pro Pro Gin Lis Lis Lis Gli Ser Mg Leu Mg 740 745 750 Met Asp Lis leu Gin leu lis Gli Met Ser Tir Ser Met Cis Tre Gli 755 760 765 Lis Fen Lis ile Vai Lis Glu Ile Ma Glu Tre Gin His Gli Tre Ile 770 775 780 Vai Ile Arg Vai Gin Tir Glu Gli Mp Gli Ser Elo Cis Lis Ile Elo 785 790 795 800 Fen Glu Ile Met Mp leu Glu Lis Mg His Vai Leu Gli Mg Leu Ile 805 810 815 Tre Vai Asn Pro Ile Vai Tre Glu Lis Mp Ser Elo Val Mn Ile Glu 820 825 830 Ala Glu Pro Pro Fen Gli Mp Ser Tir Ile Ile Ile Gli Val Glu Elo 835 840 845 Gli Gin leu Lis leu Mn Trp Fen Lis Lis Gli Ser Ser Ile Gli Gin 850 855 860 Met Fen Glu Tre Tre Met Mg Gli Ma Lis Arg Met Ma Ile Leu Gli 865 870 875 880 Asp Tre Ma Trp Mp Fen Gli Ser Leu Gli Gli 885 890

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> CENTRO DE ENGENHARIA GENÉTICA E BIOTECNOLOGIA 130

<210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(25) <223> Sequência do primer Xba-I primer para amplificação do fragmento DENe-2 <400> 1 cttctagaca ggctgcgcat ggaca 25

<210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(29) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-2 <400> 2 29 gtggatcctt accctcccag gcttccaaa 131

<210 > 3 <211> 25 <212 > DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(25) <223> Sequência do primer Eco-RI para amplificação do fragmento DENe-2 <4 00> 3 atgaattcac gcctcccaga gatcc 25

<210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(21) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-2 <4 00> 4 cttggatcca ggctgagaatg 21

<210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1) . . (31) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-2 <4 00> 5 132 gaggatcctt aaccacccag agacccaaaat 31

<210 > 6 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(25) <223> Sequência do primer Xba-I para amplificação do fragmento DENe-1 <4 00> 6 cttctagaca ggctcaaaat ggata 25

<210 > 7 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1) .. (28) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-1 <400> 7 gaggatcctt acccgccaat agaaccga 28

<210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1) .. (25) <223> Sequência do primer Eco-RI para amplificação do fragmento DENe-1 133 <4 Ο Ο > 8 acgaattcac ccctcctata gatcc 25

<210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(26) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-1 <400> 10 ccggatccgt gaattaccca cctata 26

<210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer 134 <222> (1)..(29) <223> Sequência do primer Xba-I para amplificação do fragmento DENe-3 <4 0 0 > 11 tttctagata gactcaagat ggacaaatt 29

<210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(28) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-3 <4 0 0 > 12 gaggatcctt aaccacccac tgaaccaa 28

<210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(25) <223> Sequência do primer Eco-RI para amplificação do fragmento DENe-3 <4 0 0 > 13 aagaattcac accacccaca gatcc 25

<210> 14 <211> 23 <212> DNA 135 <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(23) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-3 <400> 14 acttaggatc cagactcaag atg 23

<210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1) . . (26) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-3 <400> 15 gaggatcctt aaccacccac tgaacc 26

<210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(30) <223> Sequência do primer Xba-I para amplificação do fragmento DENe-4 <400> 16 30 cttctagaca aagtgcgtat ggagaaattg 136

<210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1)..(28) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-4 <400> 17 gaggatcctt aaccaccaac agaaccaa 28

<210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <22 0 > <221> ligação do primer <222> (1)..(25) <223> Sequência do primer Eco-RI para amplificação do fragmento DENe-4 <400> 18 atgaattcag tccaccaacg ctacc 25

<210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (1) .. (27) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-4 137 <4 Ο Ο > 19 ggccatctag gatccaaagt gcgtatg 27 <210> 20 <211> 28 <212> DNA Λ co \—1 C\] V Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (D · · (28) <223> Sequência do primer Bam-HI para amplificação do fragmento DENe-4 <400> 20 gaggatcctt agccaccaac cgaaccaa 28 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> ligação do primer <222> (D · · (26) Λ ro C\] C\] V Sequência do primer Xba-I para amplificação do fragmento DENe <4 0 0 > 21 attctagaag accaccaacg gaacca 26 <210> 22 <211> 429 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (D · · (426) 138 <223> Sequência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína de envelope DEN-2

138 <400> 22 gacaggctga aagttfcaaaa caatatgaag scracâcqtct gtcaacatag ggacaaftga acaatgagag ctgggaçgá <210> 23 <211> 168 <212 > DNA <213> Escherichia coli <2 2 0 > <221> gene <222> (1)..(168) <223> Sequência nucleotídica que codifica para os primeiros 45 aminoácidos da MDH gaatggacaa ttgtgaagga gggacggctc taggtôgcct aagcagaacc aactcaactg gagcgaagag acfcacagctc aatagcagaa tccatgtaag gaftac&gtt tccattcgga gtttaagaaa aatggccatt aaaggaatgt acacaacatg atcccftttg âaccegatcg gacagctaca ggaagttcca ttaggtgâca catactctat gaacaatagt agataatgga táacagáaas tcâtcatagg tçggccaaat cagcctqgga gtgtacagga 60 tatcagagta 120 tttggaaaaa 180 agatagccca 240 agtagagccg 300 gtttgagaca .360 ttttgçatcc 420 423 <400> 23 atgggccacc aecaccacca ceacgccatg gtagataaaa gaatngcttt agttgaattg 6U aaagfcgcccg acattggcgg aaeagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggegacacta ttgcfcgtgga cgataccctg attactttgg atctagac 168 <210> 24 <211> 603

<212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(603) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pLLl <400> 24 139 átggçécacc aaagtgcccg ggcgacacta gacaaaetac aaggaaatag ggctctccafc cgcctgatta qaacctccat aaetggttta aagagaatgg tc-c acçsccacca acattçgcgg ttgctgtgga agcfccaaagg cagaaacaca gtaaçatcec cagfctaaccc tcggagacaç ccattttagg cçacgccatg gtsgata&aa aacagaaaat gtagatatta cgataccctg afetaetttçg aatgtcatac tctatgtgta âcatggaaca atagttatca ttttgagata atggatfctgg gâtcgtaacâ gaaaaagata ctacatcatc ataggagtag ttcoatcggc caaatgtttg tgacacagcc tgggattttg gaatggcttt agttgaattg 60 tcgcggtfcga agtaaacgtg 120 atctagacag gctgcgcatg 180 caggaaagtt taaaattgtg 240 gagtacaata tgaaggggac 300 aaaaaagacs cgtcttaggt 360 gc.ccagtcaa catagaagca 420 sgccgggaca attgaaactc 480 agacaacaat gagaggagcg 540 gaagcetggc agggtaãgga 600 603

<210> 25 <211> 195 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CADEIA <222> (1)..(195) <223> Sequência aminoacídica da proteína PLLl <400> 25

His His His His His His Met Vai Asp Lis Arg Met Ala leu Vai Glu 1 5 10 15 Leu Lis Vai Ero Asp Ile Gli Gli His Glu Asn Vai Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile Ala Vai Asp Asp Tre leu Ile 35 40 45 Tre Leu Asp leu Asp Arg Leu Arg Met Asp Lis leu Gin leu Lis Gli 50 55 60 Met Ser Tir Ser Met Cis Tre Gli Lis Fen Lis Ile Vai lis Glu Ile 65 70 75 80 Ala Glu Tre Gin His Gli Tre Ile Vai Ile Arg Vai Gin Tir Glu Gli 85 90 95 Asp Gli Ser Rro Cis Lis Ile Rro Fen Glu Ile Met Asp leu Glu Lis 100 105 110 Arg His Vai leu Gli Arg Leu Ile Tre Vai Asn Pro Ile Vai Tre Glu 115 120 125 Lis Asp Ser Rro Vai Asn Ile Glu Ala Glu Rro Pro Fen Gli Asp Ser 130 135 140 Tir Ile Ile Ile Gli Vai Glu Rro Gli Gin leu Lis leu Asn Trp Fen 145 150 155 160 Lis Lis Gli Ser Ser Ile Gli Glu Met Fen Glu Tre Tre tfet Arg Gli 165 170 175 140

Ala Lis Arg tfet Ala Ile Leu Gli Asp Tre Ala Trp Asp Fen Gli Ser 180 185 190 Leu Gli Gli 195

<210> 26 <211> 1851 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) .. (1851) <223> Sequência nucleotídica da MDH no plasmídeo pM84 His. <400> 26 atgggccacc aceaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt açttgaattg 6Õ aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gfcagatafcta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg afcctagattt ggatctagaa 180 gaactagtgg atcccççggg ctgcaggaat tcgatgaatt cgatggacgt acctgctgaa 240 gttgcsggcg tagtcaaaga agttaaagtt aaagtcggcg acaaaatctc tgaaggtggt 300 ttgattgfccg tcgttgaagc tgaaggcacq gcagocgctc etaaagccga agcggctgcc 3S0 gccccggcgc aagaagcccc taaagctgcc gctcctgctc cgcaagccgc çcaattcggc 420 ggfctctgccg atgccgagta cgacgtggtc gtatfcgggtg gcggtcccgq cggttactcc 480 gctgcatctg ccgctgccga fcgaagçcttg aaagfccgcca fccgtcgaacg ttacaaaact 540 ttgggcggcg fcttgcccgaa cgtcggctgt atcccttcca aagccttgtt gcacaatgec 600 141 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcfctt; agfctgaattg 60 saagtgcceg acattggcgg aacag&aaat gtagatatta tcgcggttga agtaaaegtg 120 ggcgacacta ttgetgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatetagaa 180 gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcg&tgaatt cgatggacgt acctgctgaa 240 gttgcaggcg tagtcaaaga agttaaagtt aaagtcggcg acaaaatotc tçaaggtggt 300 ttgattgtcg tcgttgaagc tgaaggcacg gcagccgctc ctaaagecga aççggctgcc 360 gecccggcgc aagaagcccc taaagctgcc gctcctgctc cgcaagccgc gcaatfccgcjc: 420 ggttctgccg atgccgagta cgacgtggtc gcafctgggtg gcggtcccgg cçgttactcc 480 gctgcatttg ccgctgccga tgaaggcttg aaagtcgcca tcgtcgaacg ttacaaaact 540 ttgggcggeg tttgcctgaa cgtcggctgt atcccttcca aagccttgtt gcacaatgcc 600 gccgttatcg acgaagtgcg ccacttggct gccaacggta tcaaataccc cgagccggaa 660 ctcgacatcg atatgcttcg cgcctacaaa gacggcgtag tttcccgcct cacgggcggt 720 ttggcaggta tggcgaaaag ccgtaaagtg gacgttafccc aaggcgaogg gcaattctta 780 gatccgcacc acttggaagt gtcgctgact gccggcgacg cgtacgaaca ggcagcccct 840

âccggcgaga aaaaaatcgt tgccttcaaa aactgtatca ttgcagcagg cagccgcgta SOO accaaactgc ctttcattcc tgaagatccg egcatcatcg attccagcgg cgcattggct 060 ctgaaagaag taccgggcaa actgctgatt atcggcçgcg gcattatcgg cctcgagatg 1020 ggtacggttt acagcacgct gggttcgcgt ttggatgtgg ttgaaatgat ggacggcctg 1080 atgcaaggcg cagaccgega tttggtaaaa gtatggcaaa «acaaaaçga ataccgttfct 1140 gacaacatta tggtcaacac caaaaccgtt gcagttgagç cgaaagaaga cggcgtttac 1200 gttacctttg aaggcgcgaa cgcgcctaaa gagccgcaac gctacgatgc cgtattggfct 1260 gccgccggcc gcgcgcccaa cggcaaactc atcagcgcgg aaaaagcagg egctgccgfca 1320 accgatcgcg gcttcatcga agtggacaaa caaatgcgta ccaatgfcgcc gcacatctac 1380 gccatcggcg aoatcgtcgg tcagccgatg ttggcgcaca aagccgttca cgaaggccac 1440 gttgccgecg aaaaetçcgc çggccaçaaa gcefcacttcg acgcaçgcgfc gattccgggc 1500 gtt gcctaca cttcccccga agtggcgtgg gtgggcgaaa ccgaaetgtc cgccaaagcc 1560 tccggccgca aaatcaccaa agccaacttc ccgtgggcgg cttccggccg tgcgattgcc 1620 aacggttgcg acaagccgtt taccaagotg atttttgafcg ccgaaaccgg ccgcatcatc 1680 ggcggcggca ttgtcggtcc gaacggtggc gatatgatcç gcgaagtctg ccttgeeatc 1740 gaaatgggct gcgaegcggc agacatcggc aaaaccatcc aeccgcacce gggcgaatcc 1800 atcggtatgg cggcggaagt ggcattgggt acttgtaccg acaaaaaaaa a 1851

<210> 27 <211> 2253 <212> DNA <213> Escherichia coli <2 2 0 > <2 21> gene <222> (1) .. (2253) <223> Sequência nucleotídica da proteína quimérica no plasmídeo PLL2 . <400> 27 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagâaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgetgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180 aggctgcgca tggacaasct acagctcaaa ggaatgtcat actctatgtg tacaggaaag 240 tttaaaattg tgaaggaaat agcagaaaca caacatggaa caatagttat cagagtacaa 300 tatgaagggg acggctctcc atgtaagatc ccttttgaga taatggattt çgaaaaaaga 360 cacgtctfcag gtcgcctgat tacagttaac cegatcgtaa cagaaaaaga tagcccagtc 420 aacatagaag cagaacctcc attcggagac agctácatca teataggagt agáqccgggá 480 142 caatfcgaaac atgagaggag ggaggcgtga gaagttaaag gctgaaggca cotaaagctg fcaegacgtgg gatgaaggct aaegfccggct cgçcaci-tgg cgcgcctaca agccgtãâág gtgtcgctga gtfcgccttea c.ctgaagatç aaactgctgs ctgggttcgc gatttggtaa accaaaaccg aacgcgccta aacggcaaac gaagtggaca ggtcagccga gccggccaca gaagtggcgt aaagccaaet tttaccaagc ccgaacggtç gcagacatcg gtggcattgg fecaactggtt taagaaagga cgasgagaat attcgatgaa ttaaagtcgg eggeagccgc ggccatttta ttcgatggac cgacaaaatc tcctaaagoc toogcaagec ccgctcctgc tcgtattggg tggcggtccc tgaaagtcgc catcgtcgaa gtatcccttc caaagccttg ctgccaacgg tatcaaatac aagaeggegt agtttcccgc tggacgttat ccaaggcgac ctgccggcga eçegtacgaa aaa&etgtât cgcgcatcat ttatcggcgg cattgcagca cgattccagc cggcattatc ggttgaaatg gtttggatgt aagtatggca aaaacaaaac ttgcagttga gccgaaagaa aagagccgca acgctacgat tcatcagcgc ggaaaaagca aaçaaatgçg tôccaatgtg fcgttggcgca caaagccgtt aagcctactt cgacgcacgc gggtgggcga aaccgaacfcg tcccgtgqgc ggçttccggc tgatttttga tgccgaaacc gcgatatgat cggcgaagtc gcaaaaccat ççacccgcac gfcacttgtac egacaaaaaa agttccateg gccaaatgtt tgagacaaca 540 ggtgacacag cctgggattt tggatctctg 000 gtacctgctg aagtlgcagg cgtagtcaaa 060 tctgaaggtg gtttgatfcgt cgtcgttgaa 120 gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780 gcgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840 ggcggttact ccqctgcatt tgccgctgcc 900 cgttaaaaaa ctttgggcgg cgtfctgcctg 960 ttgcacaafcg ccgccgttat cgacgaagfcg 1020 cccgagccgg aactcgacai cgatatgctt 1080 cteacgggcg gtttçgcagg tatggcgaâá 1140 gggeaattct tagstccgca ccacttggaa 1200 eaggcagccc ctaccggcga gaaaaaaatc 1260 ggcagccgcg taaccaaact gcctttcatt 1320 ggcgcattgg etctgaaaga agtaecggge 1380 ggeetegaga tgggtacggt ttacagcscg 1440 atggaeggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 1500 gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560 gaçggcgttt acgttacctt t.gaaggcgcg 1620 gccgtattgg ttgccgccgg ccgcgcgccc 1680 ggcgttgecg taaccgatcg cggcttcatc 1140 ccgcacatct acgccatcgg cgacategtc 1800 cacgaaggec acgfctgcegc cgaaaactgc 1860 gtgattocgg gogttgccta cacttcccce 1S20 tccgccaaag cctccggccg caaaatcacc 19S0 cgtgcgafctg ceaaeggttg cgacaagccg 2040 ggccgcatca Ucggsgqcgg eattgtcggt 2100 tgcc.tt.gcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160 ccgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa 2220 ãâ« 2253 <210> 28 <211> 748 <212 > PRT <213> Escherichia coli <22 0 > <221> CADEIA <222> (1) .. (748) <223> Sequência aminoacídica da PLL2. <400> 28 His His His His His His Mat Vai 1 5 Leu Lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli 20 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre 35 40 Tre leu Asp Leu Asp Arg leu Arg 50 55

Asp lis Arg ffet Ala leu Vai Glu 10 15 His Glu Asn Vai Asp Ile Ile Ala 25 30 Ile Ala Vai Asp Asp Tre leu Ile 45 Mat Asp Lis leu Gin leu Lis Gli 60 143

Met Ser Tir Ser Met Cis Tre Gli Lis Fen Lis Ile Val Lis Glu Ile 65 70 75 80 Ma Glu Tre Gin His Gli Tre Ile Val Ile Mg Val Gin Tir Glu Gli 85 90 95 Asp Gli Ser Pro Cis Lis Ile Pro Fen Glu Ile Met Asp Leu Glu Lis 100 105 110 Mg His Vai leu Gli Arg leu Ile Tre Val Asn Pro Ile Val Tre Glu 115 120 125 Lis Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ma Glu Pro Pro Fen Gli Asp Ser 130 135 140 Tir lie lie lie Gli Val Glu Pro Gli Gin leu Lis leu Asn Trp Fen 145 150 155 160 Lis lis Gli Ser Ser Ile Gli Gin Met Fen Glu Tre Tre Met Mg Gli 165 170 175 Ma lis Mg Met Ma Ile leu Gli Asp Tre Ala Trp Asp Fen Gli Ser 180 185 190 Leu Gli Gli Vai Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Prp Ma Glu Val 195 200 205 Ma Gli Vai Val Lis Glu Val Lis Val Lis Val Gli Asp Lis ile Ser 210 215 220 Glu Gli Gli leu Ile Val Val Val Glu Ma Glu Gli Tre Ma Ala Ma 225 230 235 240 Pro lis Ma Glu Ma Ala Ma Ma Pro Ma Gin Glu Ma Pro Lis Ma 245 250 255 Ma Ma Pro Ma Pro Gin Ma Ma Gin Fen Gli Gli Ser Ma Asp Ma 260 265 270 Glu Tir Asp Val Val Val leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ma 275 280 285 Ma Fen Ma Ma Ma Asp Glu Gli leu Lis Val Ma Ile Val Glu Mg 290 295 300 Tir lis Tre leu Gli Gli Val Cis leu Asn Val Gli Cis Ile Pro Ser 305 310 315 320 Lis Ma Leu leu His Asn Ma Ma Val Ile Asp Glu Val Mg His leu 325 330 335 Ma Ma Asn Gli Ile Lis Tir Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met 340 345 350 Leu Mg Ma Tir Lis Asp Gli Val Val Ser Arg leu Tre Gli Gli leu 355 360 365 Ma Gli Met Ma Lis Ser Mg Lis Val Asp Val Ile Gin Gli Asp Gli 370 375 380 Gin Fen Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser leu Tre Ma Gli Asp 385 390 395 400 Ma Tir Glu Gin Ma Ala ETo Tre Gli Glu Lis lis Ile Val Ala Fen 405 410 415 Lis Asn Cis Ile Ile Ma Ma Gli Ser Mg Val Tre Lis Leu Pro Fen 420 425 430 lie Ero Glu Asp Pro Mg Ile Ile Asp Ser Ser Gli Ma Leu Ma leu 435 440 445 144

Lis Glu Vai Pro Gli Lis Leu Leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli 450 455 460 Leu Glu Met Gli Tre Vai Tir Ser Tre Leu Gli Ser Arg Leu Asp Val 465 470 475 480 Vai Glu Met Met Asp Gli Leu Met Gin Gli Ala Asp Arg Asp Loa Val 485 490 495 Lis Vai Trp Gin Lis Gin Asn Glu Tir Arg Fen Asp Asn Ile Met Val 500 505 510 Asn Tre Lis Tre Vai Ala Vai Glu Pro Lis Glu Asp Gli Vai Tir Val 515 520 525 Tre Fen Glu Gli Ala Asn Ala Pro Lis Glu Pro Gin Arg Tir Asp Ala 530 535 540 Vai leu Vai Ala Ala Gli Arg Ala Pro Asn Gli Lis Leu Ile Ser Ala 545 550 555 560 Glu lis Ala Gli Vai Ala Vai Tre Asp Arg Gli Fen Ile Glu Val Asp 565 570 575 Lis Gin Met Arg Tre Asn Vai Pro His Ile Tir Ala Ile Gli Asp ile 580 585 590 Vai Gli Gin Pro Met leu Ala His Lis Ala Vai His Glu Gli His Val 595 600 605 Ala Ala Glu Asn Cis Ala Gli His Lis Ala Tir Fen Asp Ala Arg Val 610 615 620 lie Pro Gli Vai Ala Tir Tre Ser Pro Glu Vai Ala Trp Val Gli Glu 625 630 635 640 Tre Glu leu Ser Ala Lis Ala Ser Gli Arg Lis Ile Tre lis Ala Asn 645 650 655 Fen Pro Trp Ala Ala Ser Gli Arg Ala Ile Ala Asn Gli Cis Asp Lis 660 665 670 Pro Fen Tre Lis leu Ile Fen Asp Ala Glu Tre Gli Arg Ile Ile Gli 675 680 685 Gli Gli Ile Vai Gli Pro Asn Gli Gli Asp Met Ile Gli Gin Val Cis 690 695 700 leu Ala Ile Glu Met Gli Cis Asp Ala Ala Asp Ile Gli lis Tre Ile 705 710 715 720 His Pro His Pro Gli Glu Ser Ile Glu Met Ala Ala Glu Val Ala Leu 725 730 735 Gli Tre Cis Tre Asp leu Pro Pro Gin Lis Lis lis 740 745

<210> 29 <211> 1821 <212 > DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) .. (1821) 145 <223> Sequência nucleotídica da MDH no plasmídeo pD4 <400> 29 atgggccacc aaagtgcccg ggcgacacta gctgaagttg ggtggtttga gctgecgccc ttcggcggtt tactccgctg aaaactttgg aatgccgccg ceggagçtçg ggcggtttgg ttcttagatc gcccctaccg cgcgtaacca ttggctctga gagatgggta ggcctgatgc cgttttgaca gtttacgtta ttggttgccg gccgtaaccg atctacgcca ggccacgttg ccgggcgttg aaagcctccg attgccaacg atcatcgqcg gceatcgaaa ttgqgcgaat ccgcaaaaga accaccacca acattggcgg ttgctgtgga caggcgtagt ttgtcgtcgt cggcgcaaga ctgccgatgc catttgccgc gcggcgtttg ttatcgacga acatçgatat caggtatggc cgcaccactt gcgagaaaaa aactgccttt aagaagtacc cggttLacag aaggcgcaga acafctatggt cctttgaagg ccggccgcgc atcgcggctt teggcgacat ccgccgaaaa cctacacttç gccgcaaaat gttgcgacaa gcggcattgt tgggctgcga ccatcggtat aaaaaggatc ccacgscatg acacgaaaat cgataccctg caaagaagtt tgaagctgaa agdccctaaa cgagtacgac tgccgatgaa cctgaacgtc agtgcgccac gcttcgcgcc gaaaagcegt ggaagtgtcg aatcgttgcc cattcctgaa gggcaaactg caegefcgggt ccgcgatttg caacaccáaa cgcgaaegcg gcccaacggc catogaaçtç cgtcggtcag ctgcgccggc ccccgaagtg caccaaagcc gccqtttacc cggtecgaac cgcggcagac ggcggcggaa c gtagataaaa gtagatatta attactttgg aaagttaaag ggcacggcag gctgccgctc gtggtcgtat ggcttgaaag ggctgtatcc ttggctgcca tacaaagacg aaagtggacg ctgactgccg ttcaaaaact gatccgcgca ctgattateg tcgegttfcgg gtaaaagtat accgttgcag cctaaagagc aaactcatca gacaaacaaa ccgatgttgg caçaaagcct gcgtgggtgg aacttoccgt aagctgattt ggtggcgaxa atcggcaaaa gtggcattgg gaatggcttt tcgcggttga atetagaaat tcggcgacaa ccgctcctaa ctgctccgca tgggtggcgg tcgccatcgt ettçcaaagc acggtatcaa gcgtagtttc ttatccaagg gcgacgcgta gtatcattgc tcatcgattc gcggcggcat atgtggttga ggcaaaaaca ttgagccgaa cgcaacgcta gegcggaaaa fcgcgtaccaa cgcacaaagc acttcgacgc gcgaaaccga gggcggcttc ttgatgccga tgateggcgs cçatccaccc gtacttgtac agttgaatlg agtaaacgtg ggacçtacct aatctctgaa agccgaagcg agccgcgcaa tcceggcggt cgaacgttaç cttgttgcac ataccccgag ccgcctcacg cgacgggcaa cgaacaggca agcaggcagc cagcggcgca tatcggcctc aatgatggac aaacgaatac agaagacgge egatgccgta agcaggcgtt tgtgccgcac cgfctcacgâa acgcgtgatt actgtccgcc cggccgtgcg aaccggccgc agtctgcctt gcacccgacc cgaeetgcct 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 730 ?S0 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1569 1620 1680 1740 1800 1821 146 atgggcdatc aaagtgcccg ggegacacta gctgaagttg ggtggtttga gctgccgc.cc ttcggcggtt tactccgctg aaasctttgg aatgccgccg ccggaaeteg ggcggtttgg ttcttagate gcccctaccg cgcgtaacca ttggctctga gagatgggta ggcctgatgc cgiitfctgaca gtttacgtta ttggtfcgccg gccgtaaccg atctacgcca ggce.aegfctg ccgggcgttg aaagcctccg attgccaacg atcatcygeg gccatcgaaa ttgggcgaat ccgcaasaga tcatactcfca ggaacaatag gagataatgg giaacagsaa atcatcatag atcggocsaa acagcctgçg açcaccacca acattggcgg ttgctgtgga caggcgtagt ttgtcgtcgt cggcgcaaga ctgccgatgc catttgccgc gcagcgtttg ttatcgaega acatcgatat eaggtatggc cgcaccactt gcgagaaaaa aactgccttt aagaagtacc eggtttacaç aaggcgcaga acattatggt cctttgaagg ccggccgcgc afccgcggctt tcggcgacat ccgccgaaaa cctacacttc gccgcaaaat gttgcgacaa gcggcattgt tgggctgcga ccatcggtat aaaaaggatc tgtgtacagg ttateagagt auttggaaaa aagatagccc gagtagagcc tgtttgagae âttttgggtc ccacgccatg acacgaaaat cgataecctg caaagaagtt tgaagctgaa agcccctaaa cgagtacgac tgccgatgaa cctgaacgtc agtgcgccac gcttcgcgcc gaaaagccgt ggaagtgtcg aatcgttgcc eattcefcgaa gggeaaactg cacgctçggt ccgcgatttg caacaccaaa cgcgaacgcg gcccaacggc catcgaagtg cgtcggtcag ctgcgccggc ccccgaagtg caceasagce gccgttfcacc eggtccgaac cycgccagac ggcggeggaa cgacaggctg aa.agttt.aaa acaatatgaa aagacacgtc agtcaacatâ gggacaattg aacaatgaga tctgggtggt gtagataaaa gtagatatta attactttgg aaagttaaag ggeaeggcag gctgccgctc gtggfccgtat ggcttgaaag ggctgtatcc ttggctgcca tacaaagacg aaagtggacg ctgactgccg ttcaaaaact gatccgcgca ctgattatcg tcgcgtttgg gtaaaagtat accgttgcag cctaaagagc gtggcattgg agaatggaca afctgtgaagg ggggacggct gaatggcttc tcgcggttga atcfcag&aat tcggcgacaa cegctcctaa ctgctccgca tgggtggcgg tcgccatcgt ettccaaagc acggtatcaa gcgtagtttc ttatccaagg gtatcattgc tcafccgattc gcggcggcãt atgtggtfcga ggcaaaaaca ttgagccgaa cgcaacgcta gtacttgtsc aactacagct aaatagcaga ctccatgtaa ttaggtcgcc tgattaeagt gaagcagaac ctccattcgg aaactcaact ggfcttaagaa ggagegaaga gaatggecat fcaaggatce aaactcatca gcgcggaaaa gacaaacaaa tgcgtaccaa ccgatgttgg cgcacaaagc cacaaagcct acttcgacgc gcgtgggtgg gcgaaaccga aacttcccgt gggcggcttc aagctgattt ttgatgccga ggtggcgata tgatcggcga atcggcaaaa ccatccacçc agttgaattg 60 agtaaacgtg 120 ggacgtacct 130 aatctctgaa 240 agccgaagcg 300 açccgcgcaa 360 fccccggcggt 420 cgaacgttac 480 cttgttgcac 540 ataccecgag 600 ccgcctGacg 660 cgacgggcaa 720 cgaacaggca 7S0 agcaggcagc 840 cagcggegca 900 tatcggcete 960 aatgatggac 1020 aaacgaatac 1080 agaagacggc .1140 çgafcgscgta 1200 sgeaggcgtt 1260 tgtgeegcae 1320 cgttcacgaa 1380 aegcgtgatt 1440 actgtccgcc 1500 cggccgtgcg 1560 aaccggccgc 1620 agtctgcctt 1680 gcacccgacc 1740 cgacctgcct 1800 caaaggaatg 1860 aacacaacat 1320 gatccctttt 1980 taacccgatc 2040 agacagctac 2100 aggaagttcc 2160 tttaggtgac 2220 2259

<210> 30 <211> 2259 <212> DNA <213> Escherichia coli <2 2 0 > <2 21> gene <222> (1) . . (2259) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pLL3 <400> 30 147 atgggccace aecaeeacea ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaaglgcccg açattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggegacaets ttgctgtgga egataccctç attactttgg atcfcagaaat ggacgtacet 180 gctgaagttç caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgas 240 ggtggtttça ttgtcgtegt tgaagctgaa ggnacggcag ccgctcctaa ageegaagcg 300 gctgccgccc éggcgeaaga agcecetasa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360 ttcggcggtt etgecgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420 tactccgctg catfctgccge tgccgatgaa ggettgaaag tcgccategt cgaacgttac 480 aaaacttfcgq gcggegtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540 aatgcegccg ttatcgacga agtgcgceae ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600 ccggaactcg acateg.at.at gcttegcgcc taeaaagaeg gcgtagtttc ccgceteacg 660 ggcggtttgg caggtatggc gaaaâqccgt aaagtggaeg ttatccaagg cgacgggcaa 720 ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgeeg gcgacgcgta cgaacaggca 780 gcccctaccg gcgaçaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840 cgegtaaeea aactgccttt eatfcectgaa gstccgcgea tcatcgattc cageggcgca 900 ttggccctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960 gagatgggta cggtttaeag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggfctga aatgatggac 1020 ggoctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat çgcaaaaaea aaacgaatac 1080 cgttttgaca aeattatggl. caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140 gtttacgtta cetttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200 fctggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcabca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260 gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgugccgcac 1320 atcíacgcca tçggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcaeaaagc cgttcacgaa 1380 ggceaegfctg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 ccgggcgttg cctseactfcc ccecgaagtg gcgtgggtgg gegaaaecga actgtccgcc 1500 aaagcctocg gccgcaaaat caccaaagcc aaettcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 attgccaacg gttgegacaa gccgtt.tacc aagctgattt fctgatgcega aaccggccgc 1620 ateaceggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680 gccatcgaaa tgggctgcga cçcçgcagac atrcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740 ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtactfcgtac cgacctgcct 1800 aaaaaggafcc cgacaggctg agaatggaca aactacagct caaagçaatg 1860 tcatactcta tgtgtacagg aaagtttaaa attgtgaagg aaatagcaga aaeacaacat 1920 ggaacaatag ttatcagagt acaatatgaa ggggacggct ctccatgtaa gatccctttt 1980 gagaraatgg atttggaaaa aagacacgtc ttaggtcgcc tgattacagt taacccgatc 204 0 gtaacagaaa aagafcagccc agtcascata gaagcagaae ctccattçgg agacagctac 2100 atcatcatag gagtagagcc gggacaattg aaactcaact ggtttaagaa aggaagttcc 2160 atcggccaaa tgtttgagac aacaatgaga ggagcgaaga gsatggccat tttâggtgac 2220 acagcctggg attttgggtc tctgggtggt taaggatcc 2 259 <210> 31 <211> 745 <212 > PRT <213> Escherichia col i <220> <221> CADEIA <222> (1).. (745) <223> Sequência aminoacidica da PLL3 <4 Ο Ο > 31 148

His His His His His His Met VM Mp Lis Mg Met Ala leu Val Glu 1 5 10 15 Lsu Lis Val Pro Mp Ile Gli Gli His Glu Mn Val Asp Ile Ile Ma 20 25 30 Vai Glu Val Mn Val Gli Mp Tre Ile Ma Val Mp Asp Tre Leu Ile 35 40 45 Tre leu Asp Met Mn Ser Met Asp Val Pro Ma Glu Val Ma Gli Val 50 55 60 Vai Lis Glu Val Lis Val Lis VM Gli Mp Lis Ile Ser Glu Gli Gli 65 70 75 80 leu He Val Val Val Glu Ma Glu Gli Tre Ma Ala Ma Pro Lis Ma 85 90 95 Glu Ma Ma Ma Ala Pro Ma Gin Glu Ma Pro Lis Ma Ma Ma Pro 100 105 110 Ma Pro Gin Ma Ma Gin Fen Gli Gli Ser Ma Asp Ma Glu Tir Mp 115 120 125 Val Val Val leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ma Ma Fen Ma 130 135 140 Ma Ma Asp Glu Gli leu Lis VM Ma Ile Val Glu Mg Tir Lis Tre 145 150 155 160 leu Gli Gli Val Cis leu Mn VM Gli Cis ile Pro Ser Lis Ma leu 165 170 175 leu His Asn Ma Ala Val Ile Asp Glu Val Mg His leu Ma Ma Mn 180 185 190 Gli Ile Lis Tir Pro Glu Pro Glu leu Mp Ile Asp Met leu Mg Ma 195 200 205 Tir Lis Asp Gli Val Val Ser Ãig leu Tre Gli Gli leu Ma Gli Met 210 215 220 Ma Lis Ser Mg Lis Val Mp VM Ile Gin Gli Asp Gli Gin Fen leu 225 230 235 240 Mp Pro His His leu Glu Val Ser leu Tre Ma Gli Mp Ma Tir Glu 245 250 255 Gin Ala Ma Pro Tre Gli Glu Lis lis Ile Val Ala Fen Lis Mn Cis 260 265 270 Ile Ile Ma Ma Gli Ser Mg VM Tre Lis leu Pro Fen Ile Pro Glu 275 280 285 Mp Pro Mg Ile Ile Mp Ser Ser Gli Ma leu Ala leu Lis Glu Val 290 295 300 Mo Gli Lis leu leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli leu Glu Met 305 310 315 320 Gli Tre Val Tir Ser Tre Leu Gli Ser Mg Leu Asp Val Val Glu Met 325 330 335 Met Asp Gli leu Met Gin Gli Ala Mp Mg Mp leu Val Lis Val Trp 340 345 350 Gin Lis Gin Mn Glu Tir Mg Fen Mp Mn Ile Met Val Mn Tre Lis 355 360 365 Tre Val Ma Val Glu Pro Lis Glu Mp Gli Val Tir Val Tre Fen Glu 370 375 380 149

Gli Ma Mn Ma Pro Lis Glu Pro Gin Mg Tir Mp Ma Vai Leu Vai 385 390 395 400 Ma Ma Gli Mg Ma Pro Mn Gli Lis Leu Ile Ser Ma Glu Lis Ma 405 410 415 Gli Vai Ma Vai Tre Mp Mg Gli Fen Ile Glu Vai Mp Lis Gin Met 420 425 430 Mg Tre Mn Vai Pro His Ile Tir Ma Ile Gli Mp Ile Vai Gli Gin 435 440 445 Mo Met Leu Ma His Lis Ma Vai His Glu Gli His Vai Ma Ma Glu 450 455 460 Mn Cis Ma Gli His Lis Ma Tir Fen Mp Ma Mg Vai ile Pro Gli 465 470 475 480 Vai Ma Tir Tre Ser Pro Glu Vai Ma Trp Vai Gli Glu Tre Glu Leu 485 490 495 Ser Ma Lis Ma Ser Gli Mg Lis Ile Tre Lis Ala Mn Fen Pro Trp 500 505 510 Ma Ma Ser Gli Mg Ma Ile Ma Mn Gli Cis Asp lis Pro Fen Tre 515 520 525 lis leu ile Pen Mp Ma Glu Tre Gli Mg Ile ile Gli Gli Gli Ile 530 535 540 Vai Gli Pro Mn Gli Gli Mp Met Ile Gli Glu Vai Cis leu Ma Ile 545 550 555 560 Glu Met Gli Cis Mp Ma Ma Mp Ile Gli Lis Tre ile His Pro His 565 570 575 Mo Gli Glu Ser Ile Gli Met Ma Ma Glu Vai Ma leu Gli Tre Cis 580 585 590 Tre Mp leu Pro Pro Gin Lis Lis lis Gli Ser Mg leu Mg Met Mp 595 600 605 lis leu Gin leu Lis Gli Met Ser Tir Ser Met Cis Tre Gli Lis Fen 610 615 620 lis Ile Vai Lis Glu Ile Ma Glu Tre Gin His Gli Tre Ile Vai Ile 625 630 635 640 Mg Vai Gin Tir Glu Gli Mp Gli Ser Pro Cis Lis Ile Pro Fen Glu 645 650 655 Ile Met Mp leu Glu Lis Mg His Vai Leu Gli Arg leu Ile Tre vai 660 665 670 Mn Pro Ile Vai Tre Glu Lis Mp Ser Pro Vai Mn Ile Glu Ma Glu 675 680 685 Mo Pio Fen Gli Mp Ser Tir Ile Ile Ile Gli Vai Glu Pro Gli Gin 690 695 700 leu Lis Leu Mn Trp Fen Lis Lis Gli Ser Ser Ile Gli Gin Met Fen 705 710 715 720 Glu Tre Tre Met Mg Gli Ma Lis Mg Met Ma Ile leu Gli Mp Tre 725 730 735 Ma Trp Mp Fen Gli Ser Leu Gli Gli 740 745 <210> 32 150

<211> 429 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(429) <223> Sequência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína de envelope DEN-1 <400> 32 ggggtatcat atgtaatgtg cacagggtca 60 cagcatggaa ctgttctagt çcaggttaaa 120 eecfctctcgt cccaagátgã gãáaggagta 180 cccatagtca ttgacaaaga aaaaccagtc 240 agetatattg tggtaggagc aggtgaaaaa 300 agcagtatag ggaaaatgtt tgaagcaact 360 gçagacaecg catgggactt cggttctata 420 429 agactaaaaa tteaagttag tacgããggâã acccagaatg áãCatfcgââg gctttgaaac gcecgtggag ggagggtaa tggataaact agaaggaagt cagatgcácc ggagattgat eggageeace taagctggtt cacgaaggat gacttiaaaa ggctgagaee atgcaagatc aacagccaac ttttggtgag caagaaggga ggccatcctg

<210> 33 <211> 615 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) .. (615) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pLHl <400> 33 agttgaattg 60 agtaaacgtg 120 ggatctagac 180' cacagggtca 240 gcaggttaaa 300 gaaaggagta 360 aaaaecagtc 420 aggtgaaaaa 480 tgaagcaact 840 cggttctatt 600 615 atgggecacc aaagtgcceg ggcgacacta aggctceaaa ttcaagttag tacgaaggaa acceagaatç aacattgaag gctttgaaac gcecgtggag ggcgggtaag accaccacca acattggcgg ttgctgtgga tggataaact sgaaggaagt cagatgcacc ggagattgat cgçagccacc taagctggtt cacgaaggat gatcc eeacgceatg aacagaaaat cgataccctg gactttaaaa ggctgagacc atgcaaçatc aacageeaac ttttggtgag caagsaggga ggccatcctg gtagataaaa gfcagatatta attactttgg gçggtatcat cagcatggaa cccttctcgt cccatagtca agctatattg aacagtatag ggagacaccg gaatggcttt tcgcggttga atctagattt atgtaatgtg ctgttetagt cccaagatga ttgâcaaaga tggtaggagc ggaaaatgtt catgggactt <210> 34 151

<211> 174 <212 > PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CADEIA <222> (1)..(174) <223> Sequência aminoacídica da PLH1 <400> 34

His His His His His His Met Val Asp Lis Arg Met Ala leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lis Val Pro Asp ile Gli Gli His Glu Asn Val Asp ile ile Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gli Asp Tre Ile Ala Val Asp Asp Tre leu ile 35 40 45 Tre leu Asp leu Asp Fen Lis leu Glu Lis Glu Val Ala Glu Tre Gin 50 55 60 His Gli Tre Val leu Val Gin Val Lis Tir Gin Gli Tre Asp Ala Pro 65 70 75 80 Cis Lis Ile Pro Fen Ser Tre Gin Asp Glu Lis Gli Val Tre Gin Asn 85 90 95 Arg leu ile Tre Ala Asn Pro ile Val Tre Asp Lis Glu Lis Pro Val 100 105 110 Asn Ile Glu Tre Glu Pro Eto Fen Gli Glu Ser Tir Ile Val Val Gli 115 120 125 Ala Gli Glu Lis Ala leu lis Gin Cis Trp Fen lis Lis Gli Ser Ser 130 135 140 Ile Gli Lis Met Fen Glu Ala Tre Ala Arg Gli Ala Arg Arg Met Ala 145 150 155 160 Ile leu Gli Asp Tre Ala Trp Asp Fen Gli Ser Ile Gli Gli 165 170

<210> 35 <211> 2253 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) .. (2253) <223> Sequência nucleotidica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pLH2 152 <4 Ο Ο > 35 atgggccacc aaagtgcccg gçcgacacta aggcteaaaa ttcaagttsg tacgaaggaa acccagaafcg aacattgaag gctttgaaac gcccgtggag ggaggggtga gaagttaaag gctgaaggca cetaaagetg taegacgtgg gatgaaggct aaogfccggct cgeeacttgg cgcgcctaca agocgtaaag gtgtegctaa gttgccctca cctgaagatc aaactgetga ctgggttcgc gatttggtaa accaaaaccg aaegegccta aaeggcaaae gaagtqgaca ggtcagccga gccggccac.a gaagtggcgt

aaaQcoascO tttaccaage ccgaacggtg goagacatcg gtggcattgg accaccacca acattggcgg ttgctgtgça tggataaact agaaggasgt. cagatgcacc ggagattgat cggagccscc tsagctggtt cscgaaggat attcgatgaa ttaaagtcgg cggcagccgc ccgctcctgc ccgtattggg tgaaagtcgc gtatcccttc ctgccaacgg aagacggcgt tggaegttat ctgeeggega aaaactgtat cgcgcatcat ttatcggcgg çtttggatgt aagtatggea ttgcagttga aagageegca tcatcagcgc aaçaaatgçg tgttggcgca aagcctactt gggtgggcgs tcccgtgggc tgatttttga gcgatatgat gcaaaaccat gtacttgtac ccacgccatg aacagaaaat cgataccctg gactttaaaa ggctgagacc atgcaagatc aacagccaac ttfctggtgag caagaaggga ggccafccctg ttcgatggac cgacaaaatc toctaaagce fceegeaagee tggcggtccc catcgtcgaa caaagccttg featcaaatac agtttcccgc cgegtacgaâ cattgcagca cgattocagc cggcáttatc ggttgaaat.g aâaacijciciac gccgâÊâgaa acgctacgat ggaaaaagea taccaatgtg caaagccgtt egacgcacçc aaccgâactg ggcttecgge tgccgaaacc cggcgaagtc ccaccegeae cgscaaaaaa gtagafcaaaa gtagatatta attactttgg ggggtatcat cagcatggaa cccttctcgt cccatagtca agctatattg agcagtatag ggagacaccg gtacctgctg tctgssggtg gaagcggctg gcgcaatteg ggcggttaet cgttacaaaa ttgcacaatg eccgagccgg etcacgggcg gggcaattcfc caggcagccc ggcagccgcg ggcgcattgg ggcctcgaga atggaeggcc gaataccgtt gacggcgttt gccgtat.tgg ggcgttgccg ccgcacatct cacgaaggcc gtgattccgg tccgceaaag cgtgcgattg ggecgcstea tgccttgcca ccgggcgaat aaa gaatggcttt: agfctgaattg 60 tcgcggttga agtaaacgtg 120 atctagattt ggatctagac 180 atgtaatgtg cacagggtca 240 ctgttctagt gcaggttaaa 300 cccaagatga gaaaggagta 360 ttgacaaaga aaaaccagtc 420 tggtaggagc aggtgaaaaa 480 ggaaaatgtt tgaagcagct 540 catgggactt cggatctata 600 aagttgcagg cgtagtcaaa 660 gtttgactgt cgtcgttgaa 720 ccgccccgçc gcaagaagcc 780 gcggttctgc egatgccgag 840 ccgctgcatt tgcegctgcc 900 ctttgggcçg cgtttgcctg 560 ccgecgttat cgacgaagtg 1020 aactcgacat cgatatgctt 1080 gtttggcaçg tatggcgaaa 1140 tagatccgca ccacttggaa .1200 ctaccggcga gaaaaaaatc 1260 taaccaaaet gcctttcatt 1320 ctctgaaaga aguaecggge 1380 fcçggtacggt ttacagcacg 1440 tgatgcaagg cgcagaccgc 1500 ttgacaacat tatggtcaac 1560 acgttacctt tgaaggcgcg 1620 ttgcegeegg ççgcgcgccc 1680 taaccgatcg cggcttcatc 1740 acgceatcgg cgacatcgtc 1S00 acgttgccgc cgaaaactgc 1860 gcgttgccta cacttccccc 1929 ccfcceggccg caaaatcacc 1380 ccaacggttg cgacaagcng 2040 tcggcggcgg cattgtcggt 2100 tcgaaatggg ct.gcgacgcg 2160 ccatcggtat ggcggcggaa 2220 2253

<210> 36 <211> 727 <212 > PRT <213> Escherichia colí <2 2 0 > <221> CADEIA <222> (1)..(727) <223> Sequência aminoacídica da PLH2 <400> 36 153

His His His His His His Met Vai Asp Lis Arg Met Ala Leu Vai Glu 1 5 10 15 Leu lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His Glu Asn Vai Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile Ala Vai Asp Asp Tre Leu Ile 35 40 45 Tre leu Asp leu Asp Fen Lis leu Glu Lis Glu Vai Ala Glu Tre Gin 50 55 60 His Gli Tre Vai Leu Vai Gin Vai Lis Tir Gin Gli Tre Asp Ala Pro 65 70 75 80 Cis lis Ile Pro Fen Ser Tre Gin Asp Glu Lis Gli Vai Tre Gin Asn 85 90 95 Arg leu Ile Tre Ala Asn Pro Ile Vai Tre Asp lis Glu Lis Pro Vai 100 105 110 Asn Ile Glu Tre Glu Pro Pro Fen Gli Glu Ser Tir Ile Vai Vai Gli 115 120 125 Ala Gli Glu Lis Ala Leu lis Gin Cis Trp Fen lis Lis Gli Ser Ser 130 135 140 Ile Gli Lis Met Fen Glu Ala Tre Ala Arg Gli Ala Arg Arg Met Ala 145 150 155 160 Ile leu Gli Asp Tre Ala Trp Asp Fen Gli Ser Ile Gli Gli Vai Asn 165 170 175 Ser Met Asn Ser Met Asp Vai Pro Ala Glu Vai Ala Gli Vai Vai lis 180 185 190 Glu Vai Lis Vai Lis Vai Gli Asp Lis Ile Ser Glu Gli Gli Leu ile 195 200 205 Vai Vai Vai Glu Ala Glu Gli Tre Ala Ala Ala Pro Lis Ala Glu Ala 210 215 220 Ala Ala Ala Pro Ala Gin Glu Ala Pro Lis Ala Ala Ala Pro Ala Pro 225 230 235 240 Gin Ala Ala Gin Fen Gli Gli Ser Ala Asp Ala Glu Tir Asp Vai Vai 245 250 255 Vai leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ala Ala Fen Ala Ala Ala 260 265 270 Asp Glu Gli leu Lis Vai Ala Ile Vai Glu Arg Tir Lis Tre Leu Gli 275 280 285 Gli Vai Cis leu Asn Vai Gli Cis Ile Pro Ser lis Ala Leu Ler His 290 295 300 Asn Ala Ala Vai Ile Asp Glu Vai Arg His Leu Ala Ala Asn Gli Ile 305 310 315 320 Lis Tir Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala Tir lis 325 330 335 Asp Gli Vai Vai Ser Arg Leu Tre Gli Gli Leu Ala Gli Met Ala lis 340 345 350 Ser Arg Lis Vai Asp Vai Ile Gin Gli Asp Gli Gin Fen Leu Asp Pro 355 360 365 154

His His Leu Glu Vai Ser leu Tre Ma Gli Asp Ma Tir Glu Gin Ma 370 375 380 Ma Pro Tre Gli Glu Lis Lis Ile Vai Ma Fen lis Mn Cis Ile Ile 385 390 395 400 Ma Ma Gli Ser Mg Vai Tre Lis Leu Pro Fen Ile Pro Glu Asp Pro 405 410 415 Mg lie Ile Mp Ser Ser Gli Ma leu Ma leu lis Glu Val Pro Gli 420 425 430 Lis leu Leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli leu Glu Met Gli Tre 435 440 445 Vai Tir Ser Tre leu Gle Ser Mg leu Mp Val Val Glu Met Met Mp 450 455 460 Gli leu Met Gin Gli Ala Mp Mg Mp Leu Val lis Val Trp Gin lis 465 470 475 480 Gin Mn Glu Tir Mg Fen Mp Mn ile Met Val Mn Tre Lis Tre Val 485 490 495 Ma Vai Glu Pro Lis Glu Mp Gli Val Tir Val Tre Fen Glu Gli Ma 500 505 510 Mn Ma Pro Lis Glu Pro Gin Mg Tir Mp Ala Val leu Val Ala Ma 515 520 525 Gli Mg Ma Pro Mn Gli lis leu Ile Ser Ala Glu Lis Ma Gli Val 530 535 540 Ma Vai Tre Mp Mg Gli Fen ile Glu Val Asp lis Gin Met Mg Tre 545 550 555 560 Mn Vai Pro His Ile tir Ma Ile Gli Mp Ile Val Gli Gin Pro Met 565 570 575 leu Ma His Lis Ma Vai His Glu Gli His Val Ma Ma Glu Mn Cis 580 585 590 Ma Gli His Lis Ma Tir Fen Mp Ma Mg Val Ile Pro Gli Val Ma 595 600 605 Tir Tre Ser Pro Glu Vai Ma Trp Val Gli Glu Tre Glu leu Ser Ma 610 615 620 Lis Ma Ser Gli Mg Lis Ile Tre Lis Ma Mn Fen Pro Trp Ala Ma 625 630 635 640 Ser Gli Mg Ma Ile Ala Mn Gli Cis Mp Lis Mo Fen Tre Lis Leu 645 650 655 Ile Fen Mp Ma Glu Tre Gli Mg Ile Ile Gli Gli Gli Ile Val Gli 660 665 670 Pro Mn Gli Gli Mp Met Ile Gli Glu Val Cis leu Ma Ile Glu Met 675 680 685 Gli Cis Mp Ma Ma Asp Ile Gli Lis Tre Ile His Pro His Pro Gli 690 695 700 Glu Ser Ile Gli Met Ala Ma Glu Val Ma leu Gli Tre Cis Tre Mp 705 710 715 720 Leu Pro Pro Gin Lis Lis lis <210> 37 725 155

<211> 2250 <212 > DNA <213> Escherichia colí <2 2 0 > <221> gene <222> (1) .. (2250) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pLH3 cacaaagcct acttcgacgc gcgtçggtgg qcgaaaecga aacttcccgt gggcggcttc aagctgastt ttgatgccga ggtggcgata tgateggcga atcggcaaaa ccatccaccc <400> 37 atgggcoacc aaagtgceeg çgcgacacta çetgaagttg ggtggtttga gcfcgecgccc ttcggcggtt fcaefcccgctg aaaaetttgg aatgeegecg ccggaactcg ggcggtttgg fctctta.ga.tc qcccctacc.q cgcgtaacca ttggctctga gagatgggta ggcctgatgc egttfctgaca gtttacgtta ttggttgccg gccgtaaccg atctacgcca ggccacgttg ccgggcgttg aaagcctccg attgccaacg atcatcggcg gccatcgaaa ttgggcgaat ccgcaaaaga fcatgtaatgt actgttctag tceeaagatg afctgaca&ag gtggtaggag gggaaaatgt gcatgggact accaccacca aeattggcgg ttgctgtgga caggcgtaçt ttgtcgtcgt cggcgcaaga ctgccgatgc eatttçcogc gcggcgtttg ttatcgacga acstcgatat caggtatggc egeaccacfcfc gcgaqaaaaa aactgeçttt aaqaagtaec cggttfcacag aaggcgcaga aeattatggt cctttgaagg ccggcçgcgc atcgcggctt tcggcgacat ccgccgaaaa cctacacttc: gccgcaaaat gttgcgacaa gcggcat-tgt tgggctgcga ccatcggtat aaaaaggatc gcacagggtc tgcaggttaa agaaaggagt aaaaaccagt caggtgaaaa fctgaagcaac tcggttctat ccacgccatg âcacgaaaat cgataccctg eaaagaagtt tgaagctgaa agcccctaaa cgagtacgac tgccgatgaa cctgaacgtc agtgcgccac gcttcgcgcc gaaaagccgt ggaagtgtcg aatcgttgcc cattcctgaa gggcaaactg cacgctgggt ccgcgafcttg caacaccaaa cgcgaacgçg gcccaacggc catcgaagtg cgtcggtcag ctgcgccggc cccegaagtg caccaaagcc gccgtttacc cggtccgaec cgcggcagac çgcçgeggaa cagactaaas attcaagtta atacgaagga aacccagaat caacattgaa agctttgaaa tgcccgtgga aggtgggtaa gtagataaaa gtagatatta attactfctgg aaagttaaag ggcacçgeag gctgccgctc gtggtcgtat ggcttgaaag ggctgtatcc ttggetgcea tacaaagacg «aagtggacg ctgactgccg ttcaaaaact gatceçcçca ctgattatcg tcgcgtttgg gtaaaagtat accgttgcag cctaaagagc aaactcatca gac&aacaaa ccgatgttgg gtggcattgg afcggataaac gagaaggaag acagatgcac gggagattga gcggageeac ctaagctggt gcaegaagga gaatggcfctt tcgcggttga aíctagaaat tçggcgacaa cegctectaa ctgctccgca tgggtggcgg tcgccatcgt cttccaaagc acggtatcaa gcgtagtttc tfatccaagg gcgacgcgta gtatcattgc tcatcgattc gcggcggcat atgtggttga ggeaaaaaça ctgagccgaâ cgcaacgcta gcgcggaaaa tgcgtaccaa cgcacaaagc gtacttgtac tgaetttaaa tggctgagac catgcaagat taacagccaa cttttggtga tcsagaaggg tgçceatccfc agttgaattg 60 agtaaacgtg 120 ggacgtacc.t 180 aatctctgas 240 agcegaageg 300 sgccgcgcaa 360 tcccggcggt 420 cgaacgttac 480 ctfcgttgcac 540 ataceccçag 600 ccgectcacg 660 çgacgggcas 720 cgaâcaggcs 780 agcaggcagc 840 eagcggcgca 990 tafcggeetc 960 aatgatggac 1020 aaacgaatac 1080 agaagacggc 1140 cgatgecgta 1200 agcaggcgtt 1269 tgtgccgcac 1320 cgttcacgaa 1380 acgcgtgatt 1440 actgtccgcc 1500 cggccgtgcg 1560 aaccggccgc 1620 agtctgcctt 1680 gcacccgacc 1740 cgacetgcct 1800 aggggtatca 1860 ccageatgga 1920 ccccttctcg 1980 ccecatagtc 2040 gagctatatt 2100 aagcagtata 2160 gggaqacace 2220 2250 <210> 38 <211> 724 156

<212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CADEIA <222> (1)..(724) <223> Sequência aminoacídica da PLH3 <400> 38

His His His His His His Met Vai Asp Lis Arg Met Ala Leu Vai Glu 1 5 10 15 leu Lis Vai Eto Asp Ile Gli Gli His Glu Asn Vai Asp Ile Ile Ma 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile Ma Vai Asp Asp Tre leu Ile 35 40 45 Tre Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Vai Pro Ma Glu Vai Ma Gli Vai 50 55 60 Vai Lis Glu Vai Lis Vai Lis Vai Gli Asp Lis Ile Ser Glu Gli Gli 65 70 75 80 leu Ile Vai Vai Vai Glu Ala Glu Gli Tre Ma Ala Ma Pro Lis Ma 85 90 95 Glu Ala Ala Ala Ala Pro 7\la Gin Glu Ma Pro Lis Ma Ma Ma Pro 100 105 110 Ala Pro Gin Ala Ala Gin Fen Gli Gli Ser Ma Asp Ma Glu Tir Mp 115 120 125 Vai Vai Vai Leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ma Ma Fen Ma 130 135 140 Ala Ala Asp Glu Gli Leu Lis Vai Ma Ile Vai Glu Mg Tir Lis Tre 145 150 155 160 leu Gli Gli Vai Cis Leu Asn Vai Gli Cis Ile Pro Ser Lis Ma Leu 165 170 175 leu His Asn Ala Ala Vai Ile Asp Glu Vai Mg His leu Ma Ma Mn 180 185 190 Gli Ile Lis Tir Pro Glu Pro Glu leu Asp Ile Asp Met Leu Mg Ma 195 200 205 Tir Lis Asp Gli Vai Vai Ser Arg leu Tre Gli Gli leu Ma Gli Met 210 215 220 Ala Lis Ser Arg Lis Vai Asp Vai Ile Gin Gli Asp Gli Gin Fen leu 225 230 235 240 Asp Pro His His Leu Glu Vai Ser leu Tre Ma Gli Asp Ma Tir Glu 245 250 255 Gin Ala Ala Pro Tre Gli Glu Lis lis Ile Vai Ala Fen Lis Mn Cis 260 265 270 Ile Ile Ala Ala Gli Ser Arg Vai Tre Lis leu Pro Fen Ile Pro Glu 275 280 285 157

Mp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gli Ma Leu Ala Leu Lis Glu Val 290 295 300 Pro Gli Lis leu Leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli Leu Glu Met 305 310 315 320 Gli Tre Vai Tir Ser Tre Leu Gli Ser Mg Leu Asp Vai Val Glu Met 325 330 335 Met Asp Gli leu Met Gin Gli Tila Asp Mg Mp Leu Vai Lis Val Trp 340 345 350 Gin Lis Gin Asn Glu Tir Arg Fen Asp Mn Ile Met Val Mn Tre Lis 355 360 365 Tre Vai Ala Vai Glu Pro Lis Glu Asp Gli Vai Tir Val Tre Fen Glu 370 375 380 Gli Ala Asn Ala Pro Lis Glu Pro Gin Mg Tir Asp Ma Val Leu Val 385 390 395 400 Ala Ala Gli Arg Ala Pro Asn Gli Lis leu Ile Ser Ma Glu Lis Ma 405 410 415 Gli Vai Ala Vai Tre Asp Arg Gli Fen Ile Glu Vai Mp Lis Gin Met 420 425 430 Arg Tre Asn Vai Pro His Ile Tir Ma Ile Gli Asp ile Val Gli Gin 435 440 445 Pro Met leu Ala His Lis Ma Vai His Glu Gli His Val Ma Ma Glu 450 455 460 Agn Cis Ala Gli His Lis Ma Tir Fen Mp Ma Arg Val ile Pro Gli 465 470 475 480 Vai Ala Tir Tre Ser Pro Glu Vai Ma Trp Vai Gli Glu Tre Glu leu 485 490 495 Ser Ala Lis Ala Ser Gli Mg Lis ile Tre Lis Ala Mn Fen Pro Trp 500 505 510 Ala Ala Ser Gli Arg Ala Ile Ala Mn Gli Cis Asp lis Pro Fen Tre 515 520 525 lis Leu Ile Pen Asp Ala Glu Tre Gli Mg Ile Ile Gli Gli Gli Ile 530 535 540 Vai Gli Pro Asn Gli Gli Asp Met Ile Gli Glu Vai Cis leu Ma Ile 545 550 555 560 Glu Met Gli Cis Asp Ala Ma Asp Ile Gli Lis Tre Ile His Pro His 565 570 575 Rx> Gli Glu Ser Ile Gli Met Ala Ma Glu Vai Ma leu Gli Tre Cis 580 585 590 Tre Asp leu Pro Pro Gin Lis Lis lis Gli Ser Fen lis leu Glu Lis 595 600 605 Glu Vai Ala Glu Tre Gin His Gli Tre Vai Leu Vai Gin Val Lis Tir 610 615 620 Gin Gli Tre Asp Ala Pro Cis Lis Ile Pro Fen Ser Tre Gin Mp Glu 625 630 635 640 lis Gli Vai Tre Gin Asn Mg Leu Ile Tre Ma Mn Pro Ile Val Tre 645 650 655 Asp Lis Glu Lis Pro Vai Mn Ile Glu Tre Glu Pro Pro Fen Gli Glu 660 665 670 158 Ser Tir Ile Vai Vai Gli 675 Fen Lis Lis Gli Ser Ser 690 Gli Ala Arg Arg Met Ala 705 710 Ser Ile Gli Gli

Ala Gli Glu Lis Ala 680 Ile Gli lis Met Fen 695 Ile Leu Gli Asp Tre 715

Ler lis Gin Cis Trp 685 Glu Ala Tre Ala Arg 700 Ala Trp Asp Fen Gli 720 <210> 39 <211> 426 <212> DNA <213> Escherichía coli <220> <221> gene <222> (1)..(426) <223> Sequência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína de envelope DEN-3 <400> 39 agacteaaga ttfcgtgttga taeaaagggg gctcacaãtg aacattgagg qccctgaaaa gccagaggtg ggtggt <210> 40 <211> 615 <212> DNA <213> Escherichía coli <2 2 0 > <2 21> gene <222> (1) . .(615) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pAZl tggacaâatt agaaagaagt aagatgcacc gcaçsctgêt ctgaacctcc tcaactggta caaggcgcat ctccgaaacg ctgcaagatt cacagccaat fctttggggas caggaaggga ggccatcttg gggatgagct cagcatggga cctttctcca ccagtggtga agtaatatag agctcgattg ggagacacag átgcââtgtg caatactcat cggaggatgg ccaagaagga taattejgaat ggaagatgtt cctgggactt cttgaatacc 60 taaggttçag 120 acaagggaaa 180 ggagcctgtc 240 tggagacaaa 300 cçaggccagt 360 tggatcagtg 420 426 <400> 40 159 «tgggccscc accaccacca aaagtgcccg ggcgscacfca agactcaaga tttgtgttça tacasagggg gctcacaatg aaeattgagg gccctgaaaa gccagaçgtg ggtggttaag acattggcgg ttgctgtgga tggacaaatt agaaagaagt aagatgcacc gcagactgat ctgaacctcc tcaactggta caaggcgcat gatcc ccscgccafcg gtagafcaaaa gaatggct *: S; agttgaattg 60 aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 cgatáccctg attsctttgg etcfcagíttt ggatctagat 180 gaaactcaag gggatgagct atgcaatçtg cttgaatacc 240 ctccgsaacg cageatggga caatactcat taaggttgag 300 ctgcaagatt cctttctcca cggaggatgg acaagggaaa 360 cacagccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 420 ttttggggaa agtaatatag taattçgaat tggagacaaa 480 caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccact 540 ggccatcttg ggagacacag cctgggactt tggttcagtg 600 615

<210> 41 <211> 194 <212> PRT <213> Escherichia coli <2 2 0 > <221> CADEIA <222> (1) . . (194) <223> Sequência aminoacídica da PAZ1 <400> 41

His His His His His His Met vai 1 5 leu lis Val Pro Asp ile Gli Gli 20 Val Glu val Asn Val Gli Asp Tre 35 40 Tre leu Asp Leu Asp Arg leu Arg 50 55 Met Ser Tir Ala Met Cis leu Asn 65 70 Ser Glu Tre His Gli Tre Ile leu 85 Asp Ala Pro Cis Lis Ile Pro Fen 100 Ala His Asn Gli Arg leu Ile Tre 115 120 Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala 130 135 Ile Val ile Gli Ile Gli Asp lis 145 150 Lis Gli Ser Ser Ile Gli Lis Met

Asp Lis Arg Met Ala leu Val Glu 10 15 His Glu Asn Val Asp ile Ile Ala 25 30 ile Ala Val Asp Asp Tre leu ile 45 Met Asp Lis leu Gin leu Lis Gli 60 Tre Fen Val leu Lis lis Glu val 75 80 Ile Lis Val Glu Tir lis Gli Glu 90 95 Ser Tre Glu Asp Gli Gin Gli Lis 105 110 Ala Asn Pro Val Val Tre Lis Lis 125 Glu Rro Pro Fen Gli GLu Ser Asn 140 Ala Leu Lis Ile Asn Trp Tir Arg 155 160 Fen Glu Ala Tre Ala Arg Gli Ala 170 175 165 160 Arg Arg

Met

Ala Ile 180

Leu

Gli Asp

Tre 185

Ala Trp Asp

Fen

Gli 190

Ser

Vai

Gli Gli

<210> 42 <211> 2253 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1).. (2253) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pAZ2 <400> 42 átgggccacc aaagtgcccg ggcgaeacta agacfccaaga tttgtgttga tacaâagggg gctcacaatg aaeattgagg gccctgaaaa gccagaggtg ggtggtgtga gaagttaasg gctgaaggca cctaaagctg fcacgscçtgg gabgaagçct aacgtcggct cgccacttgg cgcgcctaca â.gccg'caa Si cj gtgtcgctga gtngcettca cctgâsgatc aaactgctga ctgggttcgc gatttggtaa accaaaaccg aacgcgccta aacggeaaae gaaçfcggaaa ggtcagccga gccggccaca gaagtggcgt aaagccasct accaccâcca acattggcgg ttgctgtgga tggacaaatt agaaagaagt aâgatgcaco gcagactgafc etgaacetec tcaactggta caaggcgcat attcgatgaa ttaaagtagg cggcagccge ccgctcctgc fcpgtattggg tgaaagtcgc gtatcccttc cfcgccaacgg aagacggcgt tggacgttafc ctgccggcga aaaactgtat cgcgcatcat ttatcggcgg gtttggatgt aagtatggca ttgcagttga aagaqccgca teatcagcge aaçaaatgcg tgttggcgca aageetaett gggtgggcga tcccgtgggc ccaccccatg aacagaaaat cgataccctg gaaactcaag ctccgaaacg cúgcaagatt cacagccaat ttttggggaa caggasggga ggccatcttg ttcgstggac cgacaaaatc tcctaaagcc fcccgcaagcc tggcggtccc catcgtcgaa caaagccfctg tatcaaatac agtttcccgc ccaaggcgac cgcgtaçgaa cafctgcagca cgattccagc cggeattate ggttgaaatg aaaacaaaac gcegaaagaa acgctacgat ggaaaaagea taccaatgtg caaagccgtt çgacgeacgc aaccgaactg ggcttceggc gtagataaaa gtagatatia attactttgg gggatgagct cagcatggga cctfctctxca ccagtggtga agtaatatag agctegsttg ggagaeacag gtacctçctg tetgaaggtg gaagcggetg gcgeaattcg ggcggttact cgttacsaaa ttgcacaatg cccgagccgg ctcacgggcg gggcaattet. caggcagaec ggcaçccgcg ggcgcatfegg ggcctcgaga atggacggcc gaatsccgfct gacggcgttt gccgtattgg ggcgttgeeg ccgcacatct cacgaaggcc gtgattccgg tccgccaaag cgtgcgattg gaatggcm tcgcggttga atctagattt atgcaatgtg caatactcat eqgaggatgg ccaagaagga taatfcggaat ggaagatgtt cctgggactt aagttgcagg gfcttgattgt cegeeecggc gcggttctgc ccgctgcatt ctttgggcgg ccgccgttat aactcgacat gtttçgcagg tagatecgca otacçggcgci tasccaaact ctctgaaaga tgggtacggt tgstgcaagg ttgacaacat acgttacckt ttgccgccgg taaccgatcg acgccafccgg acgttgccge ççgttgccts cctccggccg ccaaeggttg agttgaattg 60 agtaaacgtg 120 ggatctagat 180 cttgaatacc' 240 tssggttgag 300 acaagggaaa 360 gqagcctgtc 420 fcggagacaaa 480 cgaggccact 540 tggatctgtg 600 cgtagtcaaa 660 egtegttgaa 720 gcaagaagcc 7Θ0 cgatgccgag 840 tgeegctgcc 900 cgtttgcctg 960 cgacgaagtg 1020 cgaiatgctt 1080 tatggcgaaa 1.140 ccaettggaa 1200 gaaauuaatc ί*ι60 gcctttcatt 1320 agtàccgggc 1380 ttacagcacg 1440 cgcagaccgc 1500 tatggtcaac 1560 tgsaggcgcg 1620 ccgcgcgccc 1630 cggcttcatc 1740 cgacatcgtc 1800 egaa a actg c 1860 cactt CC ccc 1920 caaaatcacc 1980 cgacaagecg 2040 161 161 tttaccaagc eçgâaeggtg gcagacstcg gtggcattgg tgatttttga tgeegaaaec gcgatatgat cggcgaagtc goaaaaccat ccacccgcac gtact fcgtac cgacaaaaaa ggccgcatca tcggcggcgg çattgtcggt 2100 tgccttgcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160 ccgggcgaat ccatcggtafc ggcgçcggaa 2220 aaa 2253

<210> 43 <211> 747 <212> PRT <213> Escherichia coli <2 2 0 > <221> CADEIA <222> (1) . . (747) <223> Sequência aminoacídica da PAZ2 <400> 43

His His His His His His Met Val Asp Lis Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His Glu Asn vai Asp Ile ile Ala 20 25 30 Vai Glu Val Asn Val Gli Asp Tre Ile Ala Val Asp Asp Tre leu ile 35 40 45 Tre leu Asp Leu Asp Arg leu Arg Met Asp Lis leu Gin leu Lis Gli 50 55 60 Met Ser Tir Ala Met Cis leu Asn Tre Fen Val leu Lis Lis Glu Val 65 70 75 80 Ser Glu Tre His Gli Tre Ile leu Ile Lis Val Glu Tir Lis Gli Glu 85 90 95 Asp Ala Pro Cis Lis Ile Pro Fen Ser Tre Glu Asp Gli Gin Gli lis 100 105 110 Ala His Asn Gli Arg leu Ile Tre Ala Asn Pro Val Val Tre Lis lis 115 120 125 Glu Glu Pro Val Asn ile Glu Ala Glu Pro Pro Fen Gli Glu Ser Asn 130 135 140 Ile Vai ile Gli Ile Gli Asp Lis Ala leu Lis Ile Asn Trp Tir Arg 145 150 155 160 Lis Gli Ser Ser Ile Gli Lis Met Fen Glu Ala Tre Ala Arg Gli Ala 165 170 175 Arg Arg Met Ala Ile leu Gli Asp Tre Ala Trp Asp Fen Gli Ser Val 180 185 190 Gli Gli Val Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala 195 200 205 Gli Vai Val Lis Glu Val Lis Val Lis Val Gli Asp Lis Ile Ser Glu 210 215 220 162

Gli Gli Leu Lie Vai VM Vai Glu Ma Glu Gli Tre Ma Ma Ala Pro 225 230 235 240 Lis Ma Glu Ma Ma Ala Ma Pro Ma Gin Glu Ma Pro Lis Ala Ma 245 250 255 Ala Pro Ma Pro Gin Ala Ma Gin Fen Gli Gli Ser Ma Mp Ma Glu 260 265 270 Tir Asp Vai Vai Vai Leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ala Ma 275 280 285 Fen Ma Ma Ma Asp Glu Gli Leu Lis Vai Ala Ile Vai Glu Arg Tir 290 295 300 Lis Tre leu Gli Gli Vai Cis leu Mn Vai Gli Cis Ile Pro Ser lis 305 310 315 320 Ala leu Leu His Asn Ala Ma Vai Ile Mp Glu Vai Mg His Ler Ma 325 330 335 Ala Asn Gli He Lis Tir Pro Glu Pro Glu leu Mp Ile Mp Met leu 340 345 350 Arg Ma Tir Lis Asp Gli Vai Vai Ser Mg leu Tre Gli Gli Leu Ma 355 360 365 Gli Met Ma Lis Ser Arg lis Vai Mp Vai ile Gin Gli Mp Gli Gin 370 375 380 Fen leu Asp Pro His His leu Glu Vai Ser leu Tre Ma Gli Asp Ma 385 390 395 400 Tir Glu Gin Ma Ma Pro Tre Gli Glu Lis Lis Ile Vai Ma Fen lis 405 410 415 Asn Cis Ile Ile Ma Ala Gli Ser Mg Vai Tre lis leu Pro Fen Ile 420 425 430 Pro Glu Asp Pro Mg Ile Ile Mp Ser Ser Gli Ma leu Ma Leu lis 435 440 445 Glu Vai Pro Gli Lis leu leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli leu 450 455 460 Glu Met Gli Tre Vai Tir Ser Tre leu Gli Ser Mg leu Mp Vai Vai 465 470 475 480 Glu Met Met Asp Gli leu Met Gin Gli Ma Asp Mg Mp leu Vai lis 485 490 495 Vai Trp Gin Lis Gin Mn Glu Tir Mg Fen Asp Mn Ile Met Vai Mn 500 505 510 Tre Lis Tre Vai Ma Vai Glu Pro Lis Glu Asp Gli Vai Tir Vai Tre 515 520 525 Fen Glu Gli Ma Asn Ala Pro Lis Glu Pro Gin Mg Tir Mp Ala vai 530 535 540 Leu Vai Ma Ma Gli Mg Ma Pro Mn Gli Lis leu Ile Ser Ma Glu 545 550 555 560 Lis Ma Gli Vai Ma Vai Tre Mp Mg Gli Fen Ile Glu Vai Asp lis 565 570 575 Gin Met Mg Tre Mn Vai Pro His Ile Tir Ma Ile Gli Mp Ile Vai 580 585 590 Gli Gin Pro Met Leu Ma His Lis Ma Vai His Glu Gli His Vai Ma 595 600 605 163

Ala Glu Asn Cis Ala Gli His Lis Ala Tir Fen Asp Ala Arg Val Ile 610 615 620 Pro Gli Vai Ala Til- Tre Ser Pro Glu Vai Ala Trp Vai Gli Glu Tre 625 630 635 640 Glu leu Ser Ala Lis Ala Ser Gli Arg Lis Ile Tre Lis Ala Asn Fen 645 650 655 Pro Trp Ala Ala Ser Gli Arg Ala He Ala Asn Gli cis Asp Lis Pro 660 665 670 Fen Tre Lis leu Ile Fen Asp Ala Glu Tre Gli Arg ile ile Gli Gli 675 680 685 Gli Ile Vai Gli Pro Asn Gli Gli Asp Met ile Gli Glu Val Cis leu 690 695 700 Ala Ile Glu Met Gli Cis Asp Ala Ala Asp Ile Gli Lis Tre Ile His 705 710 715 720 Pro His Pro Gli Glu Ser ile Gli Met Ala Ala Glu Vai Ala Leu Gli 725 730 735 Tre Cis Tre Asp Leu Pro Pro Gin Lis Lis Lis 740 ^45

<210> 44 <211> 2256 <212> DNA <213> Escherichia coli <2 2 0 > <221> gene <222> (1) .. (2256) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pAZ3 <400> 44 atgggecaee aaagtgcccg ggcgacacta gctgaagttg ggtggtktga gctgccgecc ttcggcggtt tactccgctg aaaactttgg aatgecgccg ccngaactcg ggcggtttgg accaccacca acattggcgç ttgctgtgga cagçcgtagt ttgtcgtcgt cggcgcaaga ctgccgatçc catttgccgc gcggcgtttg ttatcgacga acatcgatat caggtatggc ccacgecatg acacgaaaat cgataccctg caaagaagtt tgaagctgaa agcccctaaa cçagtacgac fcgccgatgaa cctgaacgtc açtgcgacac gcttcgegee çaaaagccgt gtagataaaa gtagatatta attactttgg aaagttaaag ggcacoccag getgccgctc gtçgteçtat ggcttgaaag ggctgtatcc ttggctgcca tacaaagaeg aaagtcaacq gaatggcttt tcgcggttga atctagaaat tcggegaeaa ccgctcctaa ctgcteegca tgggtggcgg tcgccatcgt

Cttccaaagc acggtatcaa gcgtagtttc ttatccaagg agttgaattg agtaaaçgtg ggaegtacct. satctctgaa agccgaagcg agccgcgcsa tcccggcggt cgaacgttac cttgttgcac ataccccgag ccgcctcacg cgacgggcaa 60 120 130 240 300 360 420 480 540 SOO 660 720 164 ttcttagatc gcccctacog cgcgtaacca ttggctctga gagatgggta ggcctgatge çgttttgaca gtttacgfcta ttggttgccg gccgtaaccg atctáçgcca ggççacgtcg ccgggcgttg aaagcctccg attgccaacg atcatcggcg gccatcgaaa ttgggegaat ccgcaaaaga fcatgcaatgfc acaatactca acggaggatg accaagaagg gtaattggaa gggaagatgt gcctgggaet cgcaccactt qcçagsaaaa aaotgccttt aagaagtacc çggtttacag aaggcgcaga acattatcgt cctttgaagg ccggccgcge atcgcggctt tcggcgacat ccgccgaaaa gcogcaaaat gtt gcgacaa gçggcattgt tgggctgcga ccatcggtat aaaaaggatc gctteaatae ttaaggttga gacasgggaa aggagcctgt Utggagacaa tcgaggccac ttggttcagt ggaagtgfccg aatcgttgcc cattcçtgaa ggçcaaactg cacgctgggt eegcgatttg caacaccaaa cgcgaacgcg gcceaaeggc categaagtg cgtcggtcag ctgcgccçgc csccgaagtg caccaaagcc gecgtttacc cggtccgaac cgcggcagac ggcggcggaa cagactcaag ctttgtgttg gtaeaaaggç agctcacaat eaacattgag agecctgaaa tgccagaggt gggtggttaa ctgactgccg ttcaaaaact gatccgcgca ctgattatcg tcgcgtttgg gtaaaagtiat accgttgeag cctaaagago aaactcatca gacaaacaaa ccgatgttgg cacaaageet gcgtgggtgg aacttcccgt aagctgattt ggtggcgata atcggcaõaa gtggcattgg atggacaaat aagaaagaag gaagatgcac ggcagactga gctgaaccic atcaactggt gcaaggcgca ggatcc gcgacgcgta cgaacaggca gtateattçc agcaggcagc tcatcgattc cagcggcgca gcggcggcat tatcggcctc atgtggttga aatgatggac ggcaaaaaca aaacgaatao ttgagecgaâ agaagacgge cgcsacgcta cgatgccgta gcgcggaaaa agcaggcgtt tgegtaecaa tgtgccgcac cgcacaaagc cgttcacgaa acttcgaegc acgcgcgatt gcgaaaccga actgtcegec gçgcgg ct t c cggccgt gcg ttgatgccga aaccggccgc tgatcgçcga agtetgcctt ccatccacec gcacccgacc gtacttgtac cgacctgcct tgaaactcaa ggggatgagc tctccgaaac gcagcatggg cctgeaaqat tcctttctcc tcacagccaa tccagtggtg cttttgggga aagtaatafca acagçaaggg aagctegatt tggccatott gggagacaca 7S0 840 900 960 .1020 1080 1.140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2256 <210> 45 <211> 744 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CADEIA <222> (1)..(744) <223> Sequência aminoacídica da PAZ3 <400> 45

His His His His His His M=t Vai Asp 1 5 Leu lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His 20 25 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile 35 40 Tre leu Asp Met Asn Ser M=t Asp Vai 50 55 Vai lis Glu Vai Lis Vai Lis Vai Gli 65 70

Lis Arg tfet Ala leu Vai Glu 10 15 Glu Asn Vai Asp Ile Ile Ala 30 Ala Vai Asp Asp Tre leu Ile 45 Pro Ala Glu Vai Ala Gli Vai 60 Asp Lis Ile Ser Glu Gli Gli 75 165

Leu Lie Vai Vai Vai Glu Ma Glu Gli Tre Ala Ma Ma Pro Lis Ma 85 90 95 Glu Ma Ma Ma Ma Pro Ma Gin Glu Ma Pro Lis Ma Ma Ala Pro 100 105 110 Ala Pro Gin Ma Ma Gin Fen Gli Gli Ser Ala Mp Ma Glu Tir Mp 115 120 125 Vai Vai Vai leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ma Ma Fen Ma 130 135 140 Ala Ma Asp Glu Gli Ler lis Vai Ma Ile Vai Glu Mg Tir Lis Tre 145 150 155 160 leu Gli Gli Vai Cis leu Mn Vai Gli Cis Ile Pro Ser Lis Ala leu 165 170 175 Leu His Asn Ma Ma Vai Ile Mp Glu Vai Mg His Leu Ma Ala Mn 180 185 190 Gli ile Lis Tir Pro Glu Pro Glu leu Mp Ile Mp Met leu Arg Ma 195 200 205 Tir lis Asp Gli Vai Vai Ser Mg leu Tre Gli Gli leu Ma Gli Met 210 215 220 Ala lis Ser Mg Lis Vai Mp Vai ile Gin Gli Mp Gli Gin Fen leu 225 230 235 240 Asp Pro His His leu Glu Vai Ser leu Tre Ala Gli Mp Ma Tir Glu 245 250 255 Gin Ma Ma Pro Tre Gli Glu Lis Lis Ile Val Ma Fen Lis Mn Cis 260 265 270 Ile Ile Ma Ma Gli Ser Mg Vai Tre Lis leu Pro Fen Ile Pro Glu 275 280 285 Asp Pro Mg ile Ile Asp Ser Ser Gli Ma leu Ma leu Lis Glu Val 290 295 300 Pro Gli Lis leu leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli leu Glu Met 305 310 315 320 Gli Tre Vai Tir Ser Tre leu Gli Ser Mg leu Mp Val Val Glu Met 325 330 335 Met Asp Gli leu Met Gin Gli Ma Mp Mg Asp leu Val Lis Val Trp 340 345 350 Gin lis Gin Mn Glu Tir Mg Fen Mp Mn Ile Met Val Mn Tre lis 355 360 365 Tre Vai Ma Vai Glu Pro lis Glu Mp Gli Val Tir Val Tre Fen Glu 370 375 380 Gli Ma Asn Ma Pro Lis Glu Pro Gin Mg Tir Mp Ma Val leu Val 385 390 395 400 Ala Ma Gli Mg Ma Pro Mn Gli Lis Leu Ile Ser Ma Glu Lis Ma 405 410 415 Gli Vai Ma Vai Tre Asp Mg Gli Fen Ile Glu Val Mp Lis Gin Met 420 425 430 Arg Tre Mn Vai Pro His Ile Tir Ma Ile Gli Mp Ile Val Gli Gin 435 440 445 Pro Met Leu Ma His Lis Ma Vai His Glu Gli His Val Ma Ala Glu 450 455 460 166

Mn Cis Ma Gli His Lis Ma Tir Fen Asp Ala Mg Val Ile Pro Gli 465 470 475 480 Vai Ma Tir Tre Ser Pro Glu Val Ma Trp Val Gli Glu Tre Glu Leu 485 490 495 Ser Ma Lis Ma Ser Gli Mg Lis Ile Tre Lis Ma Mn Fen Pro Trp 500 505 510 Ala Ma Ser Gli Mg Ala Ile Ma Asn Gli Cis Asp Lis Pro Fen Tre 515 520 525 Lis Leu Ile Pen Asp Ala Glu Tre Gli Mg Ile Ile Gli Gli Gli Ile 530 535 540 Vai Gli Pro Asn Gli Gli Asp Met Ile Gli Glu Val Cis leu Ala Ile 545 550 555 560 Glu Met Gli Cis Asp Ala Ma Asp Ile Gli Lis Tre Ile His Pro His 565 570 575 Pro Gli Glu Ser Ile Gli Met Ma Ma Glu Val Ma leu Gli Tre Cis 580 585 590 Tre Asp leu Pro Pro Gin Lis Lis Lis Gli Ser Mg leu Lis Met Mp 595 600 605 Lis leu Lis leu Lis Gli Met Ser Tir Ma Met Cis leu Mn Tre Fen 610 615 620 Vai leu Lis Lis Glu Val Ser Glu Tre His Gli Tre ile leu Ile Lis 625 630 635 640 Vai Glu Tir Lis Gli Glu Asp Ma Pro Cis Lis Ile Pro Fen Ser Tre 645 650 655 Glu Asp Gli Gin Gli Lis Ma His Asn Gli Arg leu Ile Tre Ala Mn 660 665 670 Pro Val Val Tre Lis Lis Glu Glu Pro Val Asn ile Glu Ma Glu Pro 675 680 685 Pro Fen Gli Glu Ser Asn Ile Val Ile Gli Ile Gli Mp Lis Ala leu 690 696 700 Lis Ile Asn Trp Tir Arg lis Gli Ser Ser Ile Gli Lis Met Fen Glu 705 710 715 720 Ala Tre Ma Arg Gli Ala Mg Mg Met Ma Ile leu Gli Mp Tre Ma 725 730 735 Trp Asp Fen Gli Ser Val Gli Gli 740

<211> 426 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(426) <223> Sequência nucleotídica que codifica para os aminoácidos 286 a 426 da proteína de envelope DEN-4 167 <4 Ο Ο > 46 aaagtccgta ttttcaattg tãtgasgçt.g aaagtggttg aacatagsat gcafctsacac tacagaggtg ggtgga tggagaaatt gagaatcaag acaaagagat ggcagaaaca ctggagctcc gtgtssagtc ggegtatcat ctcatccacc tagaaccccc etttggggac teeattggtt eaggaaaggg caaaacgaat ggccattcta ggaatgtcat acacgstgtg ttcaggaaag 60 cagcstggga caacagtggt gaaagtcaag 120 cccatagaga taagagatgt aaacaaggaa 180 cctttggctg agaataccaa cagtgtaacc 240 agctacatag tgataggtgt tggaaacagc 300 agttccattg gcaagatgtt tgagtccaca 360 ggtgaaacag cttgggattt tggttccgtt 420 426

<210> 47 <211> 615 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) . . (615) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pIDl <400> 47 gtagataaaa gaatggcttt gtagatattâ ccgcggttga attactttgg atetagattt ggaatgtcat aeaegatgtg cagcatggga caacagtggt cccatagaga taagagatgt cctttggctg agaataccaa agctacatag tgataggtgt agttccattg gcaagatgtt ggtgaaacag cttgggattt agttgaattg 60 agtaaaçgtg 120 ggatctagac 180 ttcaggaaag 240 gaaagtcaag 300 aaacaaggaa 360 cagtgtaacc 420 tggaaacagc 480 tgagtccaca 540 tggttccgtt 600 615 atgggccscc aââgtgcccg ggcgacacta aaagtgcgta ttttcaattg tatgaaggtg aaagtggttg aacatagaat gcattaacac tacagaggtg ggtggataag accaccacca acafctggcgg ttgctgtgga tggagaaatt acaaagagat ctggagctcc ggegtatcat tagaaccccc tccafctggtt caaaacgaat gatcc ccacgccatg aacagaaaat cgataccctg gagaatcaag ggcagaaaca gtgtaaagtc ctcatccacc ctttggggac caggaaaggg ggccattcta

<210> 48 <211> 192 <212> PRT <213> Escherichia coli <2 2 0 > <221> CADEIA <222> (1) .. (192) <223> Sequência aminoacídica da PIDl <400> 48 168

His His His His His His Met Vai Asp Lis Arg Met Ala Leu Vai Glu 1 5 10 15 Leu Lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His Glu Asn Vai Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile Ala Vai Asp Asp Tre Leu Ile 35 40 45 Tre Leu Asp Lis Vai Arg Met Glu Lis Leu Arg Ile Lis Gli Met ser 50 55 60 Tir Tre Met Cis Ser Gli Lis Fen Ser Ile Asp lis Glu Met Ala Glu 65 70 75 80 Tre Gin His Gli Tre Tre Vai Vai Lis Vai Lis Tir Glu Gli Ala Gli 85 90 95 Ala Pro Cis Lis Vai Pro Ile Glu Ile Arg Asp Vai Asn Lis Glu lis 100 105 110 Vai Vai Gli Arg Ile Ile Ser Ser Tre Pro Leu Ala Glu Asn Tre Asn 115 120 125 Ser Vai Tre Asn Ile Glu Leu Glu Arg Pro Leu Asp Ser Tir Ile Vai 130 135 140 Ile Gli Vai Gli Asn Ser Ala Leu Tre Leu His Trp Fen Arg Lis Gli 145 150 155 160 Ser Ser Ile Gli Lis Met Fen Glu Ser Tre Tir Arg Gli Ala Lis Arg 165 170 175 Met Ala Ile Leu Gli Glu Tre Ala Trp Asp Fen Gli Ser Vai Gli Gli 180 185 190

<210> 49 <211> 2241 <212> DNA <213> Escherichia coli <2 2 Ο > <2 21> gene <222> (1) .. (2241) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pID2 <400> 49 169 169 ataggtgttg gaaacagcgc aagatgtttg agtccacata tgggattttg gtágcgttgg stgggccacc aaagtgcccg ggggacacts gagaaattga aaagagatgg ggagctccgt cgtatcatct gaacccccct cattggttca aaacgaatgg tcgatgaatt aaagtcggeg geagccgetc gctcctgctc gtattgggtg aaagtcgcca atcccttcca gccaacggta gacggcgtag gacgtfcatce gccggcgacg aactgtatca cgcatcatog atcggcggcg ttggatgtgg gtatggcaaa gcagttgagc gagccgcaac atcagcgcgg caaatgcgta ttggcgcaca gcctacttog gtgggcgaaa ccgtgggcgg atttttgatg gatstgatcg aaaaccatcc acttgtaccg accaccacca acattggcgg ttgctgtgga gaatcaaggg cagaaacaca gtaaagtccc catccacccc ttggggaçag ggaaagggag ccattctagg cgstggacgt acaaaatctc ctaaagccga cgcaagccgc gcggtcccgg tcgtcgaacg aagccttgtt tcaaataccc tttcccgcct aaggcgacgg cgtacgaaca ttgcagcagg attccagcgg geattatcgg ttgaaatgat β â C â <3 cí 3 C Ç 3. cg^agaaga gctacgatgc aaaaagcagg ccaatgtgcc aagccgttca acgcacgcgt ccgasetgtc

Ct-t-CCcgCCg ccgaaaccgg gcgaagtctg acccgcaccc

3 C 3. â. o 3 o 3 5 S CCâCgccatg aacagaaaat cgataccctg aatgtcatac gcatgggaca catagagata tttggctgag ctacstagtg ttccattggc tgaaaeaget acotgctgaa tg&açgtggt agcqçctgec geaatteggc gtagatsaaa gtagatatta attactttgg acgatgtgtt acagtggtga agagatgtaa aataccaaca gttgcaggcg fctgattgtcg geeceggcgc ggttctgccg gaatggcttt tcgcggttga atctagacaa eagqaaagtt aagtcaagta acaaggaaaa gtgtaaccaa tagtcaaaga fcçgttgaagç aagaagcccc atgccgsgta cggttactcc gctgcatttg ccgctgecga tgaaggcttg 900 ttacaaaact ttgggcggcg tttgcctgaa cgteggctgt 960 gcacaatgcc gccgttatcg acgaagtgcg ccacttggct 1020 egagccggaa etcgacateg atatgctfccg cgcctacaaa 1080 cacgggcggt ttggcaggta tggcgaaaag ccgtaaagtg 1140 gcaattctta gatccgcacc acttggaaat gtcgctgact 1200 ggcagcccct accggcgaga aaaaaatcgt tgccttcaaa 1260 çagecgcgta gçcaaactgc ctttcatfccc tgaagatccg 1320 cgcattggct ctgaaagaag taccgggcaa actgctgatt 1380 cetegagatg ggtaeggttt acagcacgct gggttcgcgt 1440 ggacggcctg afcgcaaggcg cagaccgcga tttggtaaaa 1500 ataccgtttt gacaacatta tggtcaacac caaaaccgtt 1560 cggcgtttac gttacctttg aaagcgcgaa cacgcctaaa 1620 cgtattggtt gccgccggcc gcgcgcccaa eggcaaactc 1680 cgttgccgta accgatcgcg gcttcatcga agtggacaaa 1740 gcacatctac gccatcggcg acatcgtcgg tcagccgatg 1800 cgaaggceae gttgccgccg aaâactgcgc eggccacaisa 1860 gattccgggc gttgcctaca cttcccccga agtggcgtgg 1920 cgccaaagcc tccggccgca aaatcaccaa agccaacttc 1980 tgcgattgcc aacggttgcg acaagccgtt taccaagctg 2040 ccgcatcatc ggcggcggca ttgtcggtcc gaacggtggc 2100 ccttgecatc gaaatggget gcgacgcgge sgacafccggc 2X60 gggcgaatcc atcggtatgg cggcggaagt ggcattgggt 2220 a 2241 agttgaattg 60 agtaaacgtg 120 agtccgtatg 180 tScaattgac 240 tgaaggtgct 300 agtggttggg 360 eatagaatta 420 attaacactc 480' cagaggtgca 540 tggâctgaat 600 agttaaagtt 660 tgaaggcacg 720 taaagctgcc 780 cgacgtggtc 840

<210> 50 <211> 747 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CADEIA <222> (1)..(747) <223> Sequência aminoacídica da PID2 <400> 50

His His His His His His tfet Vai Asp Lis Arg tfet Ala leu Vai Glu 1 5 10 15 170

Leu lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His Glu fen Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile Ala Val Asp Asp Tre Leu Ile 35 40 45 Tre leu Asp Leu Asp Arg leu Arg Met Asp Lis leu Gin Leu Lis Gli 50 55 60 Met Ser Tir Tre Met Cis Ser Gli Lis Fen Ser Ile Asp Lis Glu Met 65 70 75 80 Ala Glu Tre Gin His Gli Tre Tre Val Val Lis Val Lis Tir Glu Gli 85 90 95 Ala Gli Ala Pro Cis Lis Val Pro Ile Glu ile Arg Asp Val fen lis 100 105 110 Glu lis Vai Vai Gli Arg Ile Ile Ser Ser Tre Pro Leu Ala Glu fen 115 120 125 Tre Asn Ser Vai Tre Asn Ile Glu leu Glu Arg Pro leu Asp Ser Tir 130 135 140 Ile Vai He Gli Vai Gli Asn Ser Ala leu Tre leu His Trp Fen Arg 145 150 155 160 Lis Gli Ser Ser Ile Gli lis Met Fen Glu Ser Tre Tir Arg Gli Ala 165 170 175 Lis Arg Met Ala Ile leu Gli Glu Tre Ala Trp Asp Fen Gli Ser Val 180 185 190 Gli Gli leu Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala 195 200 205 Gli Vai Vai Lis Glu Vai lis Val Lis Val Gli Asp Lis Ile Ser Glu 210 215 220 Gli Gli leu Ile Vai Val Val Glu Ala Glu Gli Tre Ala Ala Ala Pro 225 230 235 240 Lis Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gin Glu Ala Pro Lis Ala Ala 245 250 255 Ala Ero Ala Pro Gin Ala Ala Gin Fen Gli Gli Ser Ala Asp Ala Glu 260 265 270 Tir Asp Vai Vai Vai leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ala Ala 275 280 285 Fen Ala Ala Ala Asp Glu Gli leu Lis Val Ala Ile Val Glu Arg Tir 290 295 300 Lis Tre leu Gli Gli Val Cis leu Asn Val Gli Cis Ile Pro Ser lis 305 310 315 320 Ala leu leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His leu Ala 325 330 335 Ala Asn Gli Ile Lis Tir Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met leu 340 345 350 Arg Ala Tir Lis Asp Gli Val Val Ser Arg leu Tre Gli Gli leu Ala 355 360 365 Gli Met Ala Lis Ser Arg lis Val Asp Val Ile Gin Gli Asp Gli Gin 370 375 380 Fen leu Asp Pro His His leu Glu Val Ser Leu Tre Ala Gli Asp Ala 385 390 395 400 171

Tir Glu Gin Ma Ma Pro Tre Gli Glu Lis Lis Ile Val Ma Fen Lis 405 410 415 Μη Cis Ile Ile Ma Ala Gli Ser Mg Val Tre lis Leu Pro Fen Ile 420 425 430 Pro Glu Mp Pro Mg Ile Ile Mp Ser Ser Gli Ma Leu Ma Loa lis 435 440 445 Glu Vai Pro Gli Lis leu leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli leu 450 455 460 Glu Met Gli Tre Val Tir Ser Tre Leu Gli Ser Mg Leu Mp Val Val 465 470 475 480 Glu Hat Met Asp Gli leu Met Gin Gli Ma Asp Mg Mp leu Val Lis 485 490 495 Vai Trp Gin Lis Gin Mn Glu Tir Mg Fen Asp Mn Ile Met Val Mn 500 505 510 Tre lis Tre Vai Ma Val Glu Pro LÍS Glu Asp Gli Val Tir Val Tre 515 520 525 Fen Glu Gli Ma Mn Tila Pro Lis Glu Pro Gin Mg Tir Mp Ala Val 530 535 540 leu Vai Ma Ma Gli Arg Ma Pro Mn Gli Lis leu ile Ser Ala Glu 545 550 555 560 Lis Ma Gli Val Ma Val Tre Mp Mg Gli Fen ile Glu Val Asp LÍS 565 570 575 Gin Met Mg Tre Mn Val Pro His Ile Tir Ala ile Gli Mp ile Val 580 585 590 Gli Gin Pro Met leu Ala His Lis Ma Val His Glu Gli His Val Ma 595 600 605 Ma Glu Mn Cis Ma Gli His Lis Ma Tir Fen Mp Ma Mg Val ile 610 615 620 Pro Gli Vai Ma Tir Tre Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gli Glu Tre 625 630 635 640 Glu leu Ser Ma Lis Ala Ser Gli Mg Lis Ile Tre Lis Ma Mn Fen 645 650 655 Pro Trp Ma Ma Ser Gli Mg Ma Ile Ma Mn Gli Cis Mp Lis Pr 660 665 670 Fen Tre Lis leu Ile Fen Mp Ma Glu Tre Gli Mg Ile Ile Gli Gli 675 680 685 Gli Ile Vai Gli Pro Mn Gli Gli Mp Met Ile Gli Glu Val Cis leu 690 695 700 Ma Ile Glu Met Gli Cis Mp Ma Ma Mp Ile Gli Lis Tre Ile His 705 710 715 720 Pro His Pro Gli Glu Ser Ile Gle Met Ma Ala Glu Val Ma Leu Gli 725 730 735 Tre Cis Tre Asp leu Pro Pro Gin Lis Lis Lis 740 745

<210> 51 <211> 2256 <212> DNA 172 <213> Escherichia coli <2 2 0 > <2 21> gene <222> (1) . . (2256) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmideo pID3 <4 00> 51 atgggcceec aa agtgoccg ggegacacta gctgaagttg ggtggttíga gctgcegccc ttcggeggtt taetcggctg aaaactttgg aatgeegccg ccggaeetcg çgcggtttgg ttettagatc gcccctaeeg egcgtaacca ttggctcfcga gagatgggta ggcctgatgc cgttttgaca çtttacgfcta ttggttgccg gccgfeaccg atctõcçcca ggcçacgttg e;cggçegttg aaagcctccg attgccaaeg atcatcggcg gccatcçaaa ttgggcgast tacacgatgt acaacaçfcgg ataagagatg gagaatacea gtgataggtg ggcaagatgt gettgggatt aecaccacca acattggegg ttgctgtgga eaggcgtagt Λι*ιί- cggcgcaaga etgccgatge catttgccgç gcggcgtttg ttatcgacga acatcgatat eaggtatggc egcaccactt çegagaaaaa aactgccttt aagaagtacc cggtttacag aaggegcaga acattatggt cctttgaagg ceggccgcgc atcgcggctt tcggcgacat ccgccgaaaa cctacacttc gccgcaaaat gttgcgacíia gcggcattgt tgggctgcga ceatcggtat aaaaaggatc gttcaggaaa tgaaagteaa taaacaaggs acagtgtaac ttggaaacag ttgagtccac fctggttcggt ccacgccatg aeacgaaaat cgataccctg caaagaagfct i^gaagctgaa agcccctaaa cgagtacgac tgccgatgaa ectgaacgtc agtgcgccac gcttcgcgcc gaaaagccgt. ggaagtgtcg aatcgttgoc cattcctgaa gggcaaaetg cacgctgggt ccgcgatfctg caacaccaaa cgcgaacçcg gcccaacggc catcgaagtg cgtcggtcag ctgcgccggc ccccgaagtg caccasagce gccgtttace cggtccgaac cgcggcagac ggcggcggaa eaaagtgcgt gttttcaatt gtafcgaaggfc aaaagtggtt caacatagaa cgcattaaca ataeagaggí tggtggctaa gtagataaaa gtagatatta attactttgg aaagttaaag ggcacggcag gctgccgctc gtggtcgtat ggcttgaaag ggctgtatcc ttggctgcca tacaaagacg aaagtggacg ctgactgccg ttcaaaaact gatccgcgca ctgattatcg tcgcgtttgg gta&aagtat accgttgcag cctaaagagc aaactcatca âCâââ ccgstgttgg cacaaagcct gcçtgggtgg aacttcccgt aagctgattt ggtçgcgata atcggcaaaa gtggcattgg atggagaaat gaçaaagaga gctggagcte gggcgtatca ttagaacccc ctccattggt gcaaaacgaa ggatcc gaatçgcttt tcgcggttga atctagaaat tcgçcgacaa cccjct cctsã ctgctccgca tggçtggcgg tegccatcgt ettccaaagc acggtatcaa gcgtâgtttc ttatccaagg gcgacgcgta gtatcafcfcgc tcatcgattc geggcggeat: atgtggfctga ggcaaaaaea ttgegccçaa cgcaacgcta gcgeggaaaa tgcgtaccaa cgcacaaagc acttcgacgc gcgaaaccga gggcçgcttc ttgatgecga tçatcggcga ccatccaecc gtacttgtac tgagaatcaa tggcagaaac cgtgfcaaagt tefccatccac cctttgggga tcaggaaagg tggccattct agttgaâttg 60 agtaaacgtg 1.20 ggacgtacct 180 aatctctgaa 240 agccgaagcg 300 agccgcgcaa 360 tcccggcggt 420 egaacgttac 480 cttgttgcac 540 ataccocgag 600 ccgcctcacg 660 cgacgggcaa 720 cgaacaggca 780 agcaggcagc 840 cagcggcgca 900 tatcggcctc 960 aatgatggac 1020 aaacgaatac 1080 agaagacgge 1140 cgatgccgta 1200 ageaggegtt 1260 tgtgççgeac 1320 cgttcacgaa 1380 acgcgtgatt 1440 actgtccgcc 1500 cggccgtgcg 1560 aaecggcege 1620 agtctgcctt 1680 gcacccgacc 1740 cgacctçcct 1800 gggaatgtca 1860 acagcatggg 1020 ccccatagag 1980 ccctttggct 2040 cagctacata 2100 gagttccatt 2160 aggtgaaaca 2220 2256 <210> 52 <211> 744

<212> PRT <213> Escherichia coli 173 <2 2 Ο >

<221> CADEIA <222> (1)..(744) <223> Sequência aminoacídica da PID3 <400> 52

His His His His His His Met Vai Asp Lis Arg Met Ma leu Vai Glu 1 5 10 15 Leu lis Vai Pro Asp Ile Gli Gli His Glu Asn Vai Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile Ma Vai Asp Asp Tre leu Ile 35 40 45 Tre leu Asp Met Asn Ser Met Asp Vai Pro Ala Glu Vai Ma Gli Vai 50 55 60 Vai lis Glu Vai Lis Vai lis Vai Gli Asp Lis Ile Ser Glu Gli Gli 65 70 75 80 Leu Ile Vai Vai Vai Glu Ala Glu Gli Tre Ala Ma Ma Pro Lis Ma 85 90 95 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ma Gin Glu Ma Pro lis Ma Ma Ala Pro 100 105 110 Ala Ero Gin Ala Ala Gin Fen Gli Gli Ser Ala Asp Ma Glu Tir Mp 115 120 125 Vai Vai Vai Leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ma Ma Fen Ma 130 135 140 Ala Ala Asp Glu Gli Leu lis Vai Ma Ile Vai Glu Mg Tir Lis Tre 145 150 155 160 Leu Gli Gli Vai Cis Leu Asn Vai Gli Cis Ile Pro Ser Lis Ala Leu 165 170 175 Leu His Asn Ala Ala Vai Ile Asp Glu Vai Arg His Leu Ma Ala Mn 180 185 190 Gli Ile Lis Tir Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ma 195 200 205 Tir lis Asp Gli Vai Vai Ser Mg Leu Tre Gli Gli Leu Ma Gli Met 210 215 220 Ala lis Ser Mg Lis Vai Asp Vai Ile Gin Gli Asp Gli Gin Fen Leu 225 230 235 240 Asp Pro His His Leu Glu Vai Ser Leu Tre Ala Gli Asp Ma Tir Glu 245 250 255 Gin Ala Ala Pro Tre Gli Glu Lis Lis Ile Vai Ma Fen Lis Mn Cis 260 265 270 Ile Ile Ala Ala Gli Ser Arg Vai Tre Lis Leu Pro Fen Ile Pro Glu 275 280 285 Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gli Ma Lee Ma Leu Lis Glu Vai 290 295 300 Pro Gli Lis Leu Leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli Leu Glu Met 305 310 315 320 174

Gli Tre Vai Tir Ser Tre Leu Gli Ser Mg Lar Mp Vai Val Glu Met 325 330 335 Met Asp Gli Leu Met Gin Gli Ma Mp Mg Asp Leu Vai Lis VM Trp 340 345 350 Gin lis Gin Asn Glu Tir Mg Fen Mp Mn Ile Met Vai Mn Tre lis 355 360 365 Tre Vai Ala Vai Glu Pro Lis Glu Mp Gli Vai Tir Vai Tre Fen Glu 370 375 380 Gli Ala Asn Ala Pro Lis Glu Pro Gin Mg Tir Mp Ma Val Ler Val 385 390 395 400 Ala Ala Gli Arg Ma Pro Asn Gli Lis leu Ile Ser Ma Glu Lis Ma 405 410 415 Gli Vai Ala Vai Tre Asp Mg Gli Fen Ile Glu Vai Mp Lis Gin Met 420 425 430 Ãrg Tre Asn Vai Pro His Ile Tir Ma Ile Gli Mp ile Val Gli Gin 435 440 445 Pro Met leu Ala His Lis Ma Vai His Glu Gli His Vai Ma Ala Glu 450 455 460 Agn Cis Ala Gli His Lis Ma Tir Fen Mp Ala Mg Val ile Pro Gli 465 470 475 480 Vai Ala Tir Tre Ser Pro Glu Vai Ma Trp Vai Gli Glu Tre Glu leu 485 490 495 Ser Ala Lis Ala Ser Gli Mg Lis ile Tre Lis Ma Mn Fen Pro Trp 500 505 510 Ala Ala Ser Gli Mg Ala Ile Ma Mn Gli Cis Mp Lis Pro Fen Tre 515 520 525 Lis leu ile Pen Asp Ala Glu Tre Gli Mg ile ile Gli Gli Gli Ile 530 535 540 Vai Gli Pro Asn Gli Gli Mp Met Ile Gli Glu Vai Cis leu Ala Ile 545 550 555 560 Glu Met Gli Cis Asp Ala Ma Mp Ile Gli Lis Tre Ile His Pro His 565 570 575 Pro Gli Glu Ser Ile Gli Met Ma Ma Glu Vai Ma leu Gli Tre Cis 580 585 590 Tre Asp leu Pro Pro Gin lis Lis Lis Gli Ser Mg leu Lis Met Mp 595 600 605 Lis leu Arg Ile Lis Gli Met Ser Tir Tre Met Cis Ser Gli Lis Fen 610 615 620 Ser Ile Asp Lis Glu Met Ma Glu Tre Gin His Gli Tre Tre Val Val 625 630 635 640 Lis Vai Lis Tir Glu Gli Ma Gli Ma Pro Cis lis Val PrO Ile Glu 645 650 655 Ile Arg Asp Vai Asn Lis Glu Lis Vai Vai Gli Mg Ile Ile Ser Ser 660 665 670 Tre Pro Leu Ma Glu Mn Tre Mn Ser Vai Tre Mn Ile Glu Leu Glu 675 680 685 Arg Ero Leu Asp Ser Tir Ile Vai Ile Gli Vai Gli Mn Ser Ma leu 690 695 700 175

Tre leu His Trp Fen Arg lis Gli 705 710 Ser Tre Tir Arg Gli Ala lis Arg 725 Trp Asp Fen Gli Ser Vai Gli Gli 740

Ser Ser Ile Gli Lis Met Fen Glu 715 720 Met Ala Ile leu Gli Glu Tre Ala 730 735

<210> 53 <211> 2694 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1) .. (2694) <223> Sequência nucleotídica que codifica para a proteína quimérica no plasmídeo pD4D2 <400> 53 atgggccacc aâaqtgcccq ggcgacacta gágaaattqã aaagagatgg ggaçctccgt cgtateatct gaaccccect cattggttca aaaçgaatgg gaaatgoacg gacaasatct eetaaagecg ccgcaagccg ggcggtcccg ateçtcgaac a&agccttgt atcaaatacc cjtttcccgcc caaggcgacg gcgrtacgaac attgcagcag gatfccagcg ggeattatcg gttgaaatga aaacaaaacg ccgsaagaag cgctaegatg gaaaaagcag acesatgtgc aaagccgttc accaccacca acattggcgg ttgctgtagâ gaatcãaggg cagaaacaca gtaaagtcee catccacccc ttggggacag ggaaagggag ccattctagg tacetgotga ctgaaggtgg aagcggctgc cgcaattcçg gcggttactc gttacaaaac tgcacaatgc ccgagccçga tcacgggngg ggcaattctt aggcagcccc gcagccgcgt gcgcactggc gcctcgagat tggaeggect aataccgttt aeggcgttta ccgtattggf gogttgccgt cgcâcatcta acgaaggcca ccacgccatg acacgaasat egataccctg aatgtcatac gcatgggaca catagagata tttggctgag ctacatagfg tteeattggc tgaaaçagct agttgcaggc tttgattgtc cgccccggcg cggttctgcc cgctgcattt tttgggcggc cgccgttatc actegacatc tttggcaggt agatccgcac taecggcgag aaceaaactg fcctigaaagaa gggtacggtt gatgcaaggc tgaeaacatt cgttaccttt tgecgccggc aaccgatcgc cgccategge cgttgccgcc gtagataaaa gtag&tatta afctactttgg acgatgtgtt acagtggtga agagstgtaa aataecaáca ataggtgttg aagatgttfcg tgggattttg gtaotcaaag gtcgttgaag caaçaageec gatgccgsgt gccgctgecg gtttgeetga gacçaagtgc gatatgcttc atggegããaa cacttggaag aaaaaaatcg cctttcattc gtaccgggca tacagcacgc gcagaccgcg atggtcaaca gaaggçgcga cgcgcgccea ggettçatcg gãCátcgtcg gaaaactgcg gaatggctfct tcgcggttga atctagacaa caggaaagtt aagtcaagta acaaggaaaa gtgtaaccas gaascagcgc agtecaeata gtcccgttgg aagttaaagt ctgaaggeac ctaaagctgc acgacgtggt atgaaggctt aegtcggctg gccacttggc gcgcctacaa gccgtaaagt tgtcgctgac ttgccttcaa ctgaagatcc aactgctgat tgggttçgcg atttggtaaa ccaaaaccgt acgçgcctaa âcggcaaact aagtggacaa gtcagccgat ccggccacaa sgttgaattg 60 agtaaacgtg 120 agtccgtatg 180 ctcaattgac 240 tgaaggtgct 300 agtggttggg 360 catagaatta 420 sttaacactc 480 cagaggtgca 540 fcggtcttcta 600 taaagtcggc 660 ggcagccgct 720 cgctcctgct '580 egtattgggt 840 gaaagtcgcc 900 tatcccttcc 960 tgccaacggt 1020 agacggcqta 1080 ggacgttatc 1140 tgccggcgae 1200 aaactgtatç 12$0 gcgcatcatc 1320 tatcggcgge 1380 tttggatgtg 1440 agtatggcaa 1500 tgcagttgag 1560 agagcagcaa 1620 cateagcgeg 1680 acaaatgcgt 1740 gttggcgcac 1800 agcctacttc 1860 176 gacgcaegcg accgaaetgt gcttccggce gccgaaaccg ggcgaagtct cacccgcacc tgtaccgacc eagcfccaaag gcagaaacac tgtaagatce acagttaacc ttcggagaca aagaaaggaa gceafcfcttag fcgattccggg ccgccaaagc gtgcgattçc gccgcatcat gccttgccst cgaccttçgg tgcctccgcã gaatgtcata aacatggaac cttttgagat egatcçtaac gctacatcat rtl· f' fxpsfrirrr XJ H. '— '-'V, V-·*»- y gfcgacacagc cgttgcctac ctccggocgc caacggttgc cggcggcçgc cgaaatgggc cgaatccatc aaagaaaaaa ctctatgtgt aatagttatc aatggatttg agaaaaaga t cataggagta ccaaatgttt ctgggatttt actteecccg aagtggcgtg aaaatcacca aaçccaactt gacaagcrcgt ttaccaagct attgtcggte cgaacçqtgg tgcgacgcgg eaqacatcgg ggtatggcgg cçgaagtggc ggatccgaca ggetgagaat acaggaaagt ttaaaattgt agagtacâat atgaaqggga gaaaaaagac acgtcttagg agcccagtca acatagaaqc gagccgggac asttgaaact gagacaacaa tgagaggagc gggtctctgg gtggttaagg ggtgggegaa 1920 cccgtgggcg 1980 gatttttgat 2040 cgaLatgate 2100 caaaaccatc 2160 attgggtact 2220 ggacaaacta 2280 gaaggaaata 23-10 cggctctcca 2100 tcgcctgatt 2460 agaacctcca 2520 eaaetggttt 2580 gaagagaatg 2640 atcc 2694

<210> 54 <211> 891 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CADEIA <222> (1)..(891) <223> Sequência aminoacídica da PD4D2 <400> 54

His His His His His His Met Vai Asp Lis Arg Met Ala leu Vai Glu 1 5 10 15 leu Lis Vai Ero Asp Ile Gli Gli His Glu Asn Vai Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Vai Glu Vai Asn Vai Gli Asp Tre Ile Ala Vai Asp Asp Tre Leu Ile 35 40 45 Tre leu Asp leu Asp Arg leu Arg tfet Asp Lis leu Gin leu Lis Gli 50 55 60 tfet Ser Tir Tre tfet Cis Ser Gli Lis Fen Ser Ile Asp Lis Glu tfet 65 70 75 80 Ala Glu Tre Gin His Gli Tre Tre Vai Vai Lis Vai Lis Tir Glu Gli 85 90 95 Ala Gli Ala Pro Cis Lis Vai Pro Ile Glu Ile Arg Asp Vai Asn Lis 100 105 110 Glu Lis Vai Vai Gli Arg Ile Ile Ser Ser Tre Pro leu Ala Glu Asn 115 120 125 Tre Asn Ser Vai Tre Asn Ile Glu leu Glu Arg Pro leu Asp Ser Tir 130 135 140 Ile Vai Ile Gli Vai Gli Asn Ser Ala Leu Tre Leu His Trp Fen Arg 145 150 155 160 177 lis Gli Ser Ser Ile Gli Lis Met Fen Glu Ser Tre Tir Mg Gli Ma 165 170 175 lis Arg Met Ma Ile Leu Gli Glu Tre Ma Trp Asp Fen Gli Ser Val 180 185 190 Gli Gli Leu Mn Ser Met Mn Ser Met Mp Val Pro Ma Glu Val Ma 195 200 205 Gli Vai Vai lis Glu Vai Lis Val lis Val Gli Asp lis ile Ser Glu 210 215 220 Gli Gli Leu Ile Vai Val Val Glu Ma Glu Gli Tre Ma Ma Ma Pro 225 230 235 240 lis Ala Glu Ma Ma Ma Ma Pro Ma Gin Glu Tila Pro Lis Ma Ma 245 250 255 Ma Pro Ma Pro Gin Ma Ma Gin Fen Gli Gli Ser Ma Mp Ma Glu 260 265 270 Tir Asp Vai Vai Vai Leu Gli Gli Gli Pro Gli Gli Tir Ser Ma Ma 275 280 285 Fen Ala Ma Ma Mp Glu Gli leu lis Val Ma Ile Val Glu Mg Tir 290 295 300 lis Tre leu Gli Gli Val Cis leu Mn Val Gli Cis ile Pro Ser Lis 305 310 315 320 Ma Leu Leu His Mn Ma Ma Val Ile Mp Glu Val Mg His Leu Ma 325 330 335 Ma Asn Gli ile Lis Tir Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Mp Met Leu 340 345 350 Mg Ala Tir lis Mp Gli Val Val Ser Mg leu Tre Gli Gli leu Ma 355 360 365 Gli Met Ma lis Ser Mg Lis Val Mp Val ile Gin Gli Mp Gli Gin 370 375 380 Fen Leu Mp Eio His His Leu Glu Val Ser leu Tre Ma Gli Mp Ma 385 390 395 400 Tir Glu Gin Ma Ma Pro Tre Gli Glu Lis Lis Ile Val Ma Fen Lis 405 410 415 Mn Cis Ile Ile Ma Ma Gli Ser Mg Val Tre Lis leu Pro Fen Ile 420 425 430 Eio Glu Mp Eio Mg Ile Ile Asp Ser Ser Gli Ala leu Ma leu Lis 435 440 445 Glu Vai Pro Gli Lis leu leu Ile Ile Gli Gli Gli Ile Ile Gli leu 450 455 460 Glu Met Gli Tre Vai Tir Ser Tre leu Gli Ser Arg leu Mp Val Val 465 470 475 480 Glu Errt Met Mp Gli Leu Met Gin Gli Ma Mp Arg Mp Leu Val Lis 485 490 495 Vai Trp Gin lis Gin Mn Glu Tir Mg Fen Mp Mn Ile Met Val Mn 500 505 510 Tre Lis Tre Vai Ma Val Glu Pro lis Glu Mp Gli Val Tir Val Tre 515 520 525 Fen Glu Gli Ma Mn Ma Pro Lis Glu Pro Gin Mg Tir Mp Ma Val 530 535 540 178

Lsu Vai Ma Ma Gli Mg Ma Ero Mn Gli Lis Loa Ile Ser Ma Glu 545 550 555 560 lis Ma Gli Vai Ma Vai Tre Asp Mg Gli Fen Ile Glu Vai Mp Lis 565 570 575 Gin Met Mg Tre Mn Vai Ero His Ile Tir Ma Ile Gli Mp Ile Val 580 585 590 Gli Gin Ero Met leu Ma His Lis Ma Vai His Glu Gli His Vai Ma 595 600 605 Ma Glu Mn Cis Ma Gli His Lis Ma Tir Fen Asp Ma Mg Val Ile 610 615 620 Ero Gli Vai Ma Tir Tre Ser Ero Glu Vai Ma Trp Vai Gli Glu Tre 625 630 635 640 Glu Loa Ser Ma Lis Ma Ser Gli Mg Lis Ile Tre lis Ma Mn Fen 645 650 655 Ero Trp Ma Ma Ser Gli Mg Ala Ile Ma Mn Gli Cis Mp Lis Er 660 665 670 Fen Tre Lis leu Ile Fen Mp Ala Glu Tre Gli Arg ile Ile Gli Gli 675 680 685 Gli Ile Vai Gli Ero Mn Gli Gli Mp Met Ile Gli Glu Vai Cis leu 690 695 700 Ma Ile Glu Met Gli Cis Mp Ala Ma Mp Ile Gli lis Tre ile His 705 710 715 720 Ero His Ero Gli Glu Ser Ile Gle Met Ma Ma Glu Vai Ma leu Gli 725 730 735 Tre Cis Tre Mp leu Ero Ero Gin lis Lis Lis Gli Ser Mg leu Mg 740 745 750 Met Asp Lis leu Gin leu Lis Gli Met Ser Tir Ser Met Cis Tre Gli 755 760 765 lis Fen Lis Ile Vai Lis Glu Ile Ma Glu Tre Gin His Gli Tre Ile 770 775 780 Vai Ile Mg Vai Gin Tir Glu Gli Mp Gli Ser Ero Cis Lis Ile Ero 785 790 795 800 Fen Glu Ile Met Mp leu Glu Lis Mg His Vai leu Gli Mg leu Ile 805 810 815 Tre Vai Mn Elo Ile Vai Tre Glu lis Mp Ser Ero Vai Mn Ile Glu 820 825 830

Lisboa, 26 de Março de 2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de nucleótidos codificando para um fragmento da proteina E de um Flavivírus e uma sequência de nucleótidos SEQ ID N° 26 ou SEQ ID N° 29 que codifica para uma proteina mutante de Neisseria meningitidis Desidrogenase (MDH), ou uma sequência de nucleótidos SEQ ID N° 23 que codifica para um fragmento da referida proteina MDH, em que o referido ácido nucleico quimérico codifica para uma proteina quimérica a qual é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de anticorpos neutralizantes e protectores contra os Flavivírus.

2. Ácido nucleico quimérico de acordo com a reivindicação 1, em que a referida sequência de nucleótidos que codifica para um fragmento da proteína E de um Flavivírus é uma sequência de nucleótidos que codifica para os aminoácidos nos 286 a 426 da proteína E do serotipo 1, 2, 3 e/ou 4 do vírus Dengue e em que os referidos ácidos nucleicos quiméricos codificam para uma proteína quimérica a qual é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral específica de serotipo de anticorpos neutralizantes e protectores contra o(s) referido(s) serotipo(s) Flavivírus.

3. Ácido nucleico quimérico de acordo com as reivindicações 1 e 2, compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica para os aminoácidos nos 286 a 426 da proteína E do serotipo 1, 2, 3 e/ou 4 do vírus Dengue, fundidos com a extremidade 3'de uma sequência de nucleótidos SEQ ID N° 23 que codifica para os primeiros 45 aminoácidos da proteína MDH. 2

4. Ácido nucleico quimérico de acordo com as reivindicações 1 e 2, compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica para os aminoácidos nos 286 a 426 da proteína E do serotipo 1, 2, 3 e/ou 4 do vírus Dengue, inseridos numa região que codifica para o aminoácido n° 45 numa sequência de nucleótidos SEQ ID N° 26 que codifica para a proteína MDH.

5. Ácido nucleico quimérico de acordo com as reivindicações 1 e 2, compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica para os aminoácidos nos 286 a 426 da proteína E do serotipo 1, 2, 3 e/ou 4 do vírus Dengue, fundidos com a extremidade 3'de uma sequência de nucleótidos SEQ ID N° 29 que codifica para a proteína MDH.

6. Ácido nucleico quimérico de acordo com as reivindicações 1 e 2, compreendendo sequências de nucleótidos que codificam para os aminoácidos 286 a 426 da proteína E de dois serotipos diferentes do vírus Dengue, em que uma das sequências de nucleótidos referidas está inserida numa região que codifica para o aminoácido n° 45 numa sequência de nucleótidos SEQ ID N° 29 que codifica para a proteína MDH e a outra sequência de nucleótidos é fundida com a extremidade 3' da referida sequência de nucleótidos SEQ ID N° 29.

7. Proteína quimérica recombinante que é o produto da expressão de um ácido nucleico quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral específica do serotipo de anticorpos protectores e neutralizantes contra o vírus Dengue. 3

8. Proteína quimérica recombinante que é o produto da expressão de um ácido nucleíco quimérico como definido na reivindicação 6 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de anticorpos protectores e neutralizantes específicos contra dois serotipos do vírus Dengue.

9. Ácido nucleico quimérico SEQ ID N° 24 de acordo com as reivindicações 1,2 e 3 compreendendo as sequências SEQ ID N° 22 e SEQ ID N° 23 e que codifica para a proteína quimérica PLL1.

10. Proteína quimérica PLL1 de acordo com a reivindicação 7 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 25, a qual é o produto da expressão da SEQ ID N° 24 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de anticorpos protectores e neutralizantes contra o vírus Dengue-2 .

11. Ácido nucleico quimérico SEQ ID N° 27 de acordo com as reivindicações 1,2 e 4 compreendendo as sequências SEQ ID N° 22 e SEQ ID N° 26 e que codifica para a proteína quimérica PLL2.

12. Proteína quimérica PLL2 de acordo com a reivindicação 7 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 28, a qual é o produto da expressão da SEQ ID N° 27 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de anticorpos protectores e neutralizantes contra o vírus Dengue-2 .

13. Ácido nucleico quimérico SEQ ID N° 30 de acordo com as reivindicações 1,2 e 5 compreendendo as sequências SEQ 4 ID N° 22 e SEQ ID N° 29 e que codifica para a proteína quimérica PLL3.

14. Proteína quimérica PLL3 de acordo com a reivindicação 7 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 31, a qual é o produto da expressão da SEQ ID N° 30 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de anticorpos protectores e neutralizantes contra o vírus Dengue-2 .

15. Ácido nucleico quimérico SEQ ID N° 33 de acordo com as reivindicações 1,2 e 3 compreendendo as sequências SEQ ID N° 32 e SEQ ID N° 23 e que codifica para a proteína quimérica PLH1.

16. Proteína quimérica PLH1 de acordo com a reivindicação 7 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 34, a qual é o produto da expressão da SEQ ID N° 33 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de anticorpos protectores e neutralizantes contra o vírus Dengue-1.

17. Ácido nucleico quimérico SEQ ID N° 35 de acordo com as reivindicações 1,2 e 4 compreendendo as sequências SEQ ID N° 32 e SEQ ID N° 26 e que codifica para a proteína quimérica PLH2.

18. Proteína quimérica PLH2 de acordo com a reivindicação 7 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 36, a qual é o produto da expressão da SEQ ID N° 35 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de anticorpos protectores e neutralizantes contra o vírus Dengue-1. 5

19. Ácido nucleico quimérico SEQ ID N° 37 de acordo com as reivindicações 1,2 e 5 compreendendo as sequências SEQ ID N° 32 e SEQ ID N° 29 e que codifica para a proteína quimérica PLH3.

20. Proteína quimérica PLH3 de acordo com a reivindicação 7 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 38, a qual é o produto da expressão da SEQ ID N° 37 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de anticorpos protectores e neutralizantes contra o vírus Dengue-1.

21. Ácido nucleico quimérico SEQ ID N° 40 de acordo com as reivindicações 1,2 e 3 compreendendo as sequências SEQ ID N° 39 e SEQ ID N° 23 e que codifica para a proteína quimérica PAZ1.

22. Proteína quimérica PAZ1 de acordo com a reivindicação 7 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 41, a qual é o produto da expressão da SEQ ID N° 40 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de anticorpos protectores e neutralizantes contra o vírus Dengue-3.

23. Ácido nucleico quimérico SEQ ID N° 42 de acordo com as reivindicações 1,2 e 4 compreendendo as sequências SEQ ID N° 39 e SEQ ID N°26 e que codifica para a proteína quimérica PAZ2.

24. Proteína quimérica PAZ2 de acordo com a reivindicação 7 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 43, a qual é o produto da expressão da SEQ ID N° 42 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de 6 anticorpos protectores e neutralizantes contra o vírus Dengue-3.

25. Ácido nucleico quimérico SEQ ID N° 44 de acordo com as reivindicações 1,2 e 5 compreendendo as sequências SEQ ID N° 39 e SEQ ID N°29 e que codifica para a proteína quimérica PAZ3.

26. Proteína quimérica PAZ3 de acordo com a reivindicação 7 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 45, a qual é o produto da expressão da SEQ ID N° 44 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de anticorpos protectores e neutralizantes contra o vírus Dengue-3.

27. Ácido nucleico quimérico SEQ ID N° 47 de acordo com as reivindicações 1,2 e 3 compreendendo as sequências SEQ ID N° 46 e SEQ ID N°23 e que codifica para a proteína quimérica PIDl.

28. Proteína quimérica PIDl de acordo com a reivindicação 7 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 48, a qual é o produto da expressão da SEQ ID N° 47 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de anticorpos protectores e neutralizantes contra o vírus Dengue-4 .

29. Ácido nucleico quimérico SEQ ID N° 49 de acordo com as reivindicações 1,2 e 4 compreendendo as sequências SEQ ID N° 46 e SEQ ID N°26 e que codifica para a proteína quimérica PID2. 7

30. Proteína quimérica PID2 de acordo com a reivindicação 7 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 50, a qual é o produto da expressão da SEQ ID N° 4 9 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de anticorpos protectores e neutralizantes contra o vírus Dengue-4 .

31. Ácido nucleico quimérico SEQ ID N° 51 de acordo com as reivindicações 1,2 e 5 compreendendo as sequências SEQ ID N° 46 e SEQ ID N°29 e que codifica para a proteína quimérica PID3.

32. Proteína quimérica PID3 de acordo com a reivindicação 7 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 52, a qual é o produto da expressão da SEQ ID N° 51 e é capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária humoral de anticorpos protectores e neutralizantes contra o vírus Dengue-4 .

33. Composição farmacêutica capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária protectora específica contra o vírus Dengue, compreendendo uma proteína quimérica como definido nas reivindicações 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 e 32, e um veículo farmacêutico.

34. Composição farmacêutica capaz de induzir num receptor uma resposta imunitária protectora específica contra o vírus Dengue, compreendendo duas ou mais proteínas quiméricas como definido nas reivindicações 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 e 32, e um veículo farmacêutico. 8

35. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 33, a qual é efectiva como um agente preventivo ou terapêutico contra os virus Dengue, para utilização oral, intramuscular, subcutânea, mucosal ou intravenosa.

36. Reagente de diagnóstico compreendendo uma ou mais proteínas como definido nas reivindicações 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 e 32, útil para o diagnóstico e tipificação de soro do vírus Dengue. Lisboa, 26 de Março de 2007