KR100991717B1 - 바이러스에 대한 효과를 유도하는 단백질을 코딩하는키메라 사슬 - Google Patents

바이러스에 대한 효과를 유도하는 단백질을 코딩하는키메라 사슬 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수용자에게서 뎅기 바이러스에 의한 감염에 대한 혈청형 특이적인 방어 체액성 면역반응을 유도함으로써 출혈 및 이러한 유형의 병리학에서 공지된 임상적 합병증을 야기하는 혈청형 비특이적 바이러스 면역향상 효과를 제거할 수 있는 단백질을 코딩하는 키메라 사슬을 수득하는 것에 관한 것이다. 이러한 키메라 핵산 사슬은 데히드로게나제 활성을 지닌 나이세리아 메닌지티디스로부터의 돌연변이 단백질의 유전자에 속하는 단편 및 발현 벡터에 삽입되는 경우에 특정한 특성을 지닌 키메라 단백질을 생성시키는 뎅기 바이러스로부터의 외피 (E) 단백질의 영역을 코딩하는 단편의 특정 조합으로 구성된다. 본 발명에 따라 생성된 키메라 분자는 높은 혈청형 특이성을 지닌 인간용 백신 제제 및 진단 수단을 수득하기 위해 제약 산업에 적용될 수 있다.

Description

바이러스에 대한 효과를 유도하는 단백질을 코딩하는 키메라 사슬{CHIMERIC CHAINS THAT CODE FOR PROTEINS THAT INDUCE EFFECTS DIRECTED AGAINST VIRUSES}
본 발명은 생명공학 및 제약 산업 분야, 특히 발현 벡터내로 도입된 경우에 뎅기 바이러스 감염에 대한 혈청형 특이적 체액성 면역반응 및 방어를 유도해낼 수 있는 단백질을 생성하는 키메라 누클레오티드 사슬을 수득하는 것에 관한 것이며, 이하 DEN으로 인용되는 뎅기 바이러스는 혈청형 특이적 바이러스 면역증폭 효과를 회피하여 출혈 및 이러한 유형의 병리학에서 공지된 임상적 합병증을 야기한다.
뎅기 바이러스 (DEN)는 지질막이 이의 3개의 구성 단백질 중 2개, 즉, 외피 단백질 (E) 및 막 단백질 (M)을 함유하는 피막 바이러스이다. E 단백질은 구성 단백질 중 3번째 단백질인 코어 단백질로 구성된 이코사에드릭 (icosaedric) 누클레오캡시드를 포함한다. 상기 바이러스는 플라비비리대 (Flaviviridae)과에 속하며, 4가지 상이한 혈청형이 존재한다. 상기 바이러스의 인간으로의 전달은 스테고미아 (Stegomia)과에 속하는 모기인 아에데스 애집티 (Aedes aegypti)를 통해 수행된다. 상기 바이러스로 인해 인간에게서 나타나는 질병은 양성인 것으로 간주되었고, 출혈성 뎅기열 및 뎅기 쇽 증후군 (HDF/DSS)로 일컬어지는 출혈열 및 출혈성 쇽을 특징으로 하는 보다 심각한, 때때로 치명적인 종류가 출현할 때까지 뎅기열 또는 전 형적 뎅기 (DF)로서 알려져 있었다 (Hammon WMc. New hemorrhagic fever in children in the Philippines and Thailand. Trans Assoc Physicians 1960; 73: 140-155). 두 가지 상이한 바이러스 혈청형의 순차적 감염이 위험 인자임을 입증하는 다수의 역학 조사가 수행되었다 (Kouri GP, Guzman MG, Brave JR. Why dengue hemorrhagic fever in Cuba) 2. An integral analysis. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1987;72: 821-823). 이러한 현상은 표적 세포 (단핵구)의 Fc 수용체를 통한 바이러스-항체 복합체의 세포로의 유입을 증가시킴으로써 바이러스 감염이 증가한다는 것을 기초로 하는 면역향상에 의해 설명된다 (halstead SB. Pathogenesis of dengue: challenges to molecular biology. Science 1988; 239; 476-481).
약독된 생백신을 제조하기 위해 다양한 기술이 개발되어 왔지만, 현재 이들 백신의 가능한 이점에 관해 다수의 문제가 해결되어 있지 않은데, 이는 이들 백신이 독성, 바이러스 간섭 및 게놈간 재조합으로 복귀할 수 있기 때문이다. 또한, 재조합 항원이 서브유닛 백신의 가능한 성분으로서 수득될 수 있다 (Feighny, R., Borrous, J. and Putnak R. Dengue type-2 virus envelope protein made using recombinant baculovirus protects mice against virus challenge. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1994. 50(3). 322-328; Deubel, V., Staropoli, I., Megret, F., et al. Affinity-purified dengue-2 virus envelope glycoprotein induces neutralizing antibodies and protective immunity in mice. Vaccine. 1997. 15, 1946-1954).
상기 바이러스의 주요 항원은 외피 단백질 DENe 이다. 이러한 단백질은 바이러스 표면의 주성분이며, 바이러스가 세포 수용체에 결합하는 것을 매개하는 것 으로 여겨진다 (A Heinz FX, Berge R, Tuma W et al. A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies. Virology. 1983; 126:525). 이러한 단백질은 진드기 매개 뇌염 바이러스 (TBE)의 단백질과 구조적 상동성을 지니며 (Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, C., et al. The envelope glycoprotein from tick borne encephalitis virus at 2 A˚resolution. Nature 1995; 375: 291-298), 이는 혈청형 사이에서 또한 구조적으로 보존된다.
곤충 세포는 바쿨로바이러스 시스템을 벡터로서 사용하는 다양한 이종 유전자의 발현용으로 주로 사용되는 시스템 중의 하나를 구성한다. 이러한 벡터는 일본 뇌염 바이러스 (JEV)의 구성 단백질 및 비구성 단백질, DEN-1, DEN-2 및 DEN-4의 여러 조합물을 발현시키기 위해 사용되어 왔다 (Matsuura Y, Miyamoto M, Soto T et al. Characterization of japanese encephalitis virus envelope protein expressed by recombinant baculoviruses. Virology 1989; 173: 677-682; Deubel V, Bordier M, Megret F et al. Processing, secretion and immunoreactivity of carboxy terminally truncated dengue-2 envelope proteins expressed in insect cell by recombinant baculoviruses. Virology 1991; 180: 440-447; Putnak R, Feighny R, Burrous J et al. Dengue 1 virus envelope glycoprotein gene expressed in recombinant baculovirus elicit virus neutralization antibodies in mice and protects them from virus challenge. Am J Trop Med Hyg 1991; 45: 159-167; Feighny R, Burrous J, Putnak R. Dengue type 2 virus envelope protein made using recombinant baculovirus protects mice against virus challenge. Am J Trop Med Hyg 1994; 50: 322-328). 사용되는 또 다른 시스템은 E 단백질의 다수의 변이체를 발현하는 드로소필라 멜라노개스터 (Drosophila melanogaster)의 세포였다 (PCT/US96/07627). 적당한 기능적 반응을 수득함에도 불구하고, 이러한 시스템에서 발현된 단백질을 사용하는 경우, 이러한 단백질은 스케일-업 생산 공정의 개발을 위한 고비용을 암시하는데; 따라서, 효모에서 발현시키는 것이 플라비바이러스의 재조합 구성 단백질을 제조하는 대안이었다. 그러나, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 발현된 DENe 단백질의 경우 (PCT/US96/07627; Sugrue R.J., Fu H., Howe J., Chan Y. Expression of the Dengue virus structural proteins in Pichia pastoris leads to the generation of virus-like particles. J Virol. 1997. 78, 1861-1866), 발현 수준이 낮고, 분비되거나 세포내에 존재하여, 정제 공정을 방해한다.
동시에, DENe 단백질의 다수의 변이체가 세균에서 수득되었다. 이러한 변이체 중의 하나는 대장균의 트립토판 대사의 단백질에 융합된 JEV의 E 단백질의 C-말단 부분 (TrpE)이었다. 이러한 단백질은 봉입체로서 생성되었고, 면역검출 기술을 이용하여 중화 모노클로날 항체 (Mab)에 의해 인식되었다. 그러나, 이러한 단백질의 순수한 제제는 중화 항체를 생성시키지 못하여 바이러스 공격을 방어할 수 없다 (Mason P.W., Zogel M.V., Semproni A.R., et al. The antigenic structure of dengue type 1 virus envelope and NS1 protein expressed in E. coli. J Gen Virol. 1990. 71: 2107-2114). 또한, E 단백질의 C-말단 단편에 융합된 스태필로 코커스 아우리우스 (Staphylococcus aurius)의 단백질 A에 이어서 JEV의 비구성 단백질의 N-말단 세그먼트인 NS1를 함유하는 또 다른 작제물이 제조되었다 (Srivastava A.K., Morita K., Matsuo S., et al. Japanese encephalitis virus fusion protein with protein A expressed in E. coli confers protection in mice. Microbiol Immunol. 1991. 35: 863-870). 이 경우, 융합 단백질은 가용성이어서, 친화성 크로마토그래피에 의한 이의 정제를 용이하게 한다. 마우스를 이러한 순수한 단백질로 면역시킨 경우, 높은 중화 항체 역가가 수득되었으며, 이는 또한 혈구응집을 억제하고 JEV에 의한 바이러스 공격을 방어하였다. 스태필로코커스 아우리우스의 단백질 A에 융합된 DEN-2의 DENe 영역을 사용한 경우에 유사한 결과가 수득되었지만 (Srivastava A. K., Putnak R. J., Warren R. L., Hoke C. H. Mice immunized with a dengue type 2 virus E and NS1 fusion protein made in Escherichia coli are protected against lethal dengue virus infection. Vaccine. 1995. 13: 1251-1258); 인간 면역글로불린 G (IgG)에 대해 고친화성을 나타내는 단백질 A의 존재로 인해 이러한 제제를 인간에 사용하는 것은 가능하지 않다.
최종적으로, MBP-DomB로 일컬어지는 DEN-2의 DENe 단백질의 B 도메인 및 대장균의 말토오스 결합 단백질 (MBP)을 함유하는 융합 단백질이 보고되었다 (Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G. Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengue envelope B domain fusion protein against dengue 2 virus infection in mice. Am J Trop Med Hyg. 1998. 58: 655-662). 이 러한 단백질 변이체는 마우스에서 면역원성이었고, 중화 항체를 유도해내었다.
본원에 있어서, 본 발명은 키메라 서열을 수득하는 것에 관한 것인데, 예를 들어, 첫 번째 양태는 나이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis)로부터의 데히드로게나제 활성을 지닌 돌연변이 단백질 (MDH)의 N-말단 단편에 결합된 DENe 단백질의 영역을 코딩하는 서열이고; 두 번째 양태는 두 개의 상이한 위치에서 MDH 단백질의 전체 유전자에 결합된 DENe 단백질의 영역을 코딩하는 서열이고, 세 번째 양태에서 키메라 서열은 MDH 단백질을 코딩하는 동일한 유전자에 융합된 두 가지 상이한 바이러스 혈청형으로부터의 DENe 단백질의 두 개의 단편에 의해 형성된다. 이러한 키메라 사슬은 적당한 벡터내로 삽입되는 경우에 세균의 세포질내에서 불용성 키메라 단백질을 생성시킨다. 그 후, 이러한 단백질은 바이러스 혈구응집의 억제제인 DEN에 대한 중화 항체를 고수준으로 유도해낼 수 있고, 면역된 마우스를 바이러스 공격으로부터 방어할 수 있다.
상기 언급된 단백질의 불용성과 관련하여, 용이한 스케일-업 폴딩 공정 뿐만 아니라 사이먼즈 (Simmons) 등 (1998)에 의해 사용된 공정 보다 우수한 발현 및 정제 공정이 시험관내에서 달성되었다. 다른 한편, 마우스를 이러한 단백질로 면역시킴으로써 생성된 항체의 혈청형 특이성은, 중화, 혈구응집의 억제 및 ELISA 수준에서 사이먼즈 등 (1998)에 의해 사용된 용량 보다 적은 용량을 사용하여 입증된다. 이러한 사실은 기능적 면역반응을 자극할 수 있는 대장균에서의 불용성 DENe 단백질의 발현에 관한 첫 번째 보고를 구성한다.
또한, 이량체 변이체로 수득된 결과를 고려해 볼때, 두 가지 상이한 바이러 스 혈청형에 대한 동일한 분자를 사용하여, 바이러스 감염을 중화시킬 수 있고 마우스를 바이러스 공격으로부터 방어할 수 있는 혈청형-특이적 항체를 생성시키는 것이 가능하다. MDH 단백질에 관해, 다른 서열과의 상동성 검색을 EMBL 데이터 베이스에서 수행한 결과, 최초 110개의 아미노산은 디히드로리포아미드 아세틸트랜스퍼라제의 리포익 (lipoic) 결합 도메인 영역 및 플렉시블 힌지와 매우 유사하고 (피루베이트 데히드로게나제 복합체의 E2 효소 및 α-세토글루타레이트 데히드로게나제), 단백질의 나머지 부분은 상기 복합체의 효소 E3인 리포아미드 데히드로게나제 (LPDH)와 매우 유사한 것으로 밝혀졌다 (Stephens, P. E; H. M. Darlinson, and J. R. Guest., 1983. The Pyruvate dehydrogenase complex of E. coli. Eur. J. Biochem. 133:155-162).
다른 한편, 원발성 담즙성 간경변 (PBC)에 걸린 환자는 이들 단백질 사이에서 공통적인 리포산 결합 부위에 eogo 특이적인 항미토콘드리아 자가항체를 생성시키는 것으로 또한 밝혀졌다 (Gershwin ME, Mackay IR, Sturgess A, Coppel RL. Identification and specificity of a cDNA encoding the 70 KDa mitochondrial antigen recognized in primary biliary cirrhosis. J Immunol 1987;138:3525-31). 따라서, 본 발명자들은 키메라 단백질로서 인간에게 면역된 경우에 임의의 자기면역반응을 회피하기 위해 상기 단백질 중 이러한 영역을 돌연변이시키기로 결정하였다. 본 발명의 돌연변이 MDH 단백질을 I상 임상 실험에 사용한 결과, 인간에서 안전하고 면역원성인 것으로 밝혀졌고, 또한 PBC에 걸린 환자의 혈청에 의해 인식되지 않았다 (Perez, A., F. Dickinson, Z. Cinza, A. Ruiz, T. Serrano, J. Sosa, S. Gonzalez, Y. Gutierrez, C. Nazabal, O. Gutierrez, D. Guzman, M. Diaz, M. Delgado, E. Caballero, G. Sardinas, A. Alvarez, A. Martin, G. Guillen, R. Silva. Safety and preliminary immunogenicity of the recombinant outer membrane protein of Neisseria meningitidis in human volunteers. Biotech. Appl. Biochem. 34: 121-125). 그러나, MBP를 인간에 사용하는 것이 가능한 지는 아직 입증되지 않았다 (Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G. Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengue envelope B domain fusion protein against dengue 2 virus infection in mice. Am J Trop Med Hyg. 1998. 58:655-662).
본 발명에는 발현 벡터내로 도입되는 경우에 혈청형-특이적 체액성 면역반응을 유도하여 뎅기 바이러스에 의한 감염을 방어할 수 있는 키메라 단백질을 생성시키는 키메라 누클레오티드 사슬을 수득하는 것이 기재되어 있는데, 예를 들어 나이세리아 메닌지티디스로부터의 데히드로게나제 활성을 지닌 돌연변이 단백질 (MDH)의 N-말단 단편에 결합된 뎅기 바이러스의 바이러스 혈청형 각각으로부터의 DENe 단백질의 영역을 코딩하는 서열; 두 번째 양태에서, 두 가지 상이한 위치: MDH 단백질의 구성 도메인을 코딩하는 서열의 하나의 부위내 (리포산 결합 도메인 및 유전자의 3' 단부)에서 MDH 단백질의 전체 유전자에 결합된 DENe 단백질의 영역을 코딩하는 서열, 세 번째 양태에서, 키메라 서열은 MDH 유전자의 두 가지 상이한 위치에서 두 가지 상이한 바이러스 혈청형인 DEN-2 및 DEN-4로부터의 DENe 단백질의 두 개의 단편에 의해 형성된다 (하나는 리포산 결합 도메인을 코딩하는 서열의 특정 부위내에 존재하고 (혈청형 4), 나머지 하나는 MDH gen의 3' 단부에 존재한다 (혈청형 2)). 이는 이량체 작제물로 일컬어진다.
이러한 키메라 단백질은 세균의 세포질내에서 불용성 형태로 수득되었다. 고정 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의한 정제 공정을 수행하여, 면역원성 실험을 위한 순수한 단백질을 수득하였다.
항원성 결과를 분석한 경우, 고도면역 복수액 (HMAF) 항-DEN에 대한 모든 재조합 키메라 단백질의 강력한 인식이 입증되었고 전체 MDH 유전자에 융합된 경우에 보다 높았는데, 이는 MDH에 의해 제공되는 DENe 단백질로부터의 영역의 폴딩에 대한 포지티브 효과를 증명해준다. 혈청형 2가 사용된 경우, 수득된 모든 재조합 단백질은 혈청형-특이적 중화 항체 (3H5)에 의해 인식되었고, 또한 전체 MDH 유전자에 융합된 경우 뿐만 아니라 이량체 단백질에서 보다 높았다. 각각의 경우에 동종 혈청형으로부터의 HMAF에 대한 인식은 이종 혈청형으로부터의 HMAF에 대한 인식 보다 현저히 높은 것으로 또한 관찰되었는데, 이는 혈청형-특이적 에피토프의 노출을 증명하므로 뎅기 및 혈청형판별 (serotyping)을 위한 진단 수단으로서 사용될 수 있게 해준다.
마우스가 모든 재조합 키메라 단백질로 면역된 경우, 중화 및 방어 반응이 수득되었다. 최고 중화 역가는 DENe 단백질로부터의 단편의 위치와 무관하게 MDH의 전체 유전자에 융합된 서열 및 이량체 단백질로 수득되었다. 이는 수득된 항원성 결과에서 반영된 DENe 단백질의 폴딩의 영향에 의해 설명될 수 있는 MDH에 의해 매개된 면역반응의 면역증강 효과를 나타내었다. 이러한 단백질의 불용성이 적당한 면역반응을 생성시키는 능력에 영향을 주지 않는다는 것이 또한 최초로 입증되었는데, 이는 종래 기술과 대조적인 것이다.
모든 경우에 생성된 면역반응은 바이러스 중화, 혈구응집 억제 및 ELISA에서 혈청형-특이적이었다 (면역된 동종 혈청형에 대한 항체). 혈청형-특이적 항체의 생성은 이러한 항체가 면역향상 현상을 유리하게 하는 이종 혈청형의 바이러스로부터의 항원 결정기를 인식할 수 없다는 것을 의미한다. 이러한 특징은 뎅기 바이러스에 대한 백신 후보체의 개발에 매우 중요한데, 이는 이종 혈청형에 대한 항체의 인식이 출혈성 뎅기열 (HDF)에 대한 원인 중 하나일 수 있기 때문이다.
게다가, 키메라 단백질 중의 하나만으로 면역시킨 후에 두 가지 바이러스 혈청형에 대한 항체가 유도된 것으로 나타났는데, 이는 본 발명의 이용가능한 재조합 키메라 단백질 중 두 가지만을 사용하여 네 가지 혈청형에 대한 백신 후보체의 포뮬레이션을 가능하게 한다.
돌연변이 MDH 단백질을 수득하는 것은 리포산 결합 부위를 서열 ETDKAT에서 제거하는 것으로 이루어지는데, 이는 상기 지방산과 리신 (K)의 엡실론-아민기와의 공유결합을 기초로 한다 (Tuaillon N, Andre C, Briand JP et al. A lipoyl synthetic octadecapeptide of dihydrolipoamide acetyltransferase specifically recognized by anti-M2 autoantibodies in Primary Biliary Cirrhosis. J Immunol 1992; 148:445-50).
돌연변이유발은 단백질의 N-말단 영역 (IpdA 유전자의 개시 코돈에서 유전자 의 3' 단부까지) 및 C-말단 (리포산 결합 부위에서 유전자의 3' 단부까지)을 증폭시키는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 수행하였고; 이로써 인간 임상 실험에서 입증된 바와 같이 자기면역반응을 생성시킬 가능성은 배제된다.
생물학적 물질의 기탁
플라스미드 PLL1, PLL2, PLL3, PLH1, PLH2, PLH3, PAZ1, PAZ2, PAZ3, PID1, PID2 및 PID3를 부다페스트 조약에 따라 벨지안 코디네이티드 컬렉션 오브 마이크로오가니즘 (Belgian Coordinated Collection of Microorganism - BCCMTM, LMBP-COLLECTION)에 수탁번호 (미지정)로 기탁하였다.
도 1. PLL1을 수득하기 위한 E2 단편의 클로닝 전략.
DENe2: DEN-2의 외피 단백질의 단편.
N-말단: MDH 단백질의 최초 45개 아미노산을 코딩하는 누클레오티드 서열.
도 2. PLL2을 수득하기 위한 E2 단편의 클로닝 전략.
DENe2: DEN-2의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 3. PLL3를 수득하기 위한 E2 단편의 클로닝 전략.
DENe2: DEN-2의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 4. PLH1을 수득하기 위한 E1 단편의 클로닝 전략.
DENe1: DEN-1의 외피 단백질의 단편.
N-말단: MDH 단백질의 최초 45개 아미노산을 코딩하는 누클레오티드 서열.
도 5. PLH2를 수득하기 위한 E1 단편의 클로닝 전략.
DENe1: DEN-1의 외피 단백질의 단편.
N-말단: MDH 단백질의 최초 45개 아미노산을 코딩하는 누클레오티드 서열.
도 6. PLH3를 수득하기 위한 E1 단편의 클로닝 전략.
DENe1: DEN-1의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 7. PAZ1을 수득하기 위한 E3 단편의 클로닝 전략.
DENe3: DEN-3의 외피 단백질의 단편.
N-말단: MDH 단백질의 최초 45개 아미노산을 코딩하는 누클레오티드 서열.
도 8. PAZ2를 수득하기 위한 E3 단편의 클로닝 전략.
DENe3: DEN-3의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 9. PAZ3를 수득하기 위한 E3 단편의 클로닝 전략.
DENe3: DEN-3의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 10. PID1을 수득하기 위한 E4 단편의 클로닝 전략.
DENe4: DEN-4의 외피 단백질의 단편.
N-말단: MDH 단백질의 최초 45개 아미노산을 코딩하는 누클레오티드 서열.
도 11. PID2를 수득하기 위한 E4 단편의 클로닝 전략.
DENe4: DEN-4의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 12. PID3를 수득하기 위한 E4 단편의 클로닝 전략.
DENe4: DEN-4의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
도 13. PD4D2를 수득하기 위한 클로닝 전략.
DENe4: DEN-4의 외피 단백질의 단편.
DENe2: DEN-2의 외피 단백질의 단편.
MDH: 데히드로게나제 돌연변이체.
실시예 1. PLL1의 수득
DEN-2 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID NO.22)을 DEN-2 바이러스 균주 유전자형 자마이카 (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative analysis of the full-length genome. Virology 1988. 165:234-244)로부터의 SEQ ID No.1 및 SEQ ID No.2로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH의 N-말단 영역 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.23)을 함유하는 벡터는 pM108 His 플라스미드를 Xba I/Bam HI으로 분해함으로써 제조하였다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 (competent) 세포 W3110 (Hill C.W., Harnish B.W. 1982. Transposition of a chromosomal segment bounded by redundant rRNA genes in Escherichia coli. J Bacteriology. 149:449-457)을 pLL1 (도 1 및 SEQ ID No.24)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 루리아 버타니 (LB) 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 25kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 10%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질로부터의 N-말단 영역과 DEN-2 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF에 함유된 폴리클로날 항체 (PA) 항-DEN-2에 의해 인식되었다. 상기 단백질을 PLL1 (SEQ ID No.25)로 명명하였다.
실시예 2. PLL1 단백질의 정제
pLL1로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스 (biomass)를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 주로 세포 파괴물의 펠레트에 결합된 불용성 형태로서 수득하였다. 단백질은 우레아 6M을 사용하여 펠레트로부터 추출하고, PLL1 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++ 이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 단백질을 이미 다졸 50mM로 용리하고, 수득된 부피를 G-25 컬럼상에 로딩하여 최종적으로 포뮬레이션 완충액 NaCl 100mM, KCl2 2mM, Na2HPO4 10mM, pH 7.2, KH2PO 4 1mM (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 3. PLL1의 항원성 특징화
PLL1의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의해 특징화하였다 (표 1).
표 1. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PLL1 단백질의 반응성.
Abs** 특이성*** PLL1*
HMAF DEN-1 +
HMAF DEN-2 ++
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 -
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT +
* 정제된 PLL1의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
도트 블로팅 (Dot blotting)에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-2로 수득되었다. 이러한 결과는 클로닝된 영역이 혈청형 2에 속한다는 사실과 일치한다. 나머지 혈 청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 2의 경우 보다 낮았는데, DEN-1, DEN-3 및 DEN-4의 순서로 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 다른 한편, Mab 3H5는 실제로 반응성을 나타냈다. 웨스턴 블로팅에 의한 이러한 인식은 이황화물 결합에 의존했는데, 이는 샘플이 환원된 경우에 신호가 소실되었기 때문이다. 최종적으로, DEN-2에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
실시예 4. PLL1에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PLL1로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-2에 대한 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 2 및 표 5). 또한, 혈구응집 억제 검정 (HIA)을 수행한 결과, DEN-2에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 3 및 표 5). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-2에 대해 1:320의 중화 역가가 수득되었다. 그러나, 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 4 및 표 5). 이러한 결과는 PLL1에 의해 유도된 항체의 높은 혈청형-특이성을 나타낸다.
표 2. PLL1에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-2에 대한 항체 역가
마우스 역가 항-DEN-2 PLL1 역가 항-DEN-2 PBS 대조군 (-)
1 1/128000 <1:100
2 1/64000 <1:100
3 1/64000 <1:100
4 1/128000 <1:100
5 1/32000 <1:100
6 1/32000 <1:100
7 1/64000 <1:100
8 1/32000 <1:100
9 1/128000 <1:100
10 1/512000 <1:100
표 3. PLL1에 의해 면역된 동물 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 HI* 항-DEN-2 PLL1에 의한 역가 HI 항-DEN-2 PBS C(-)에 의한 역가
1 <1:5 <1:5
2 >1:640 <1:5
3 1:320 <1:5
4 1:320 <1:5
5 >1:640 <1:5
6 >1:640 <1:5
7 >1:640 <1:5
8 1:320 <1:5
9 >1:640 <1:5
10 <1:5 <1:5
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 4. PLL1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 중화 역가* 항-DEN-2 PLL1 중화 역가 항-DEN-2 PBS C(-)
1 1:320 <1:5
2 1:320 <1:5
3 1:320 <1:5
4 1:320 <1:5
5 1:80 <1:5
6 1:160 <1:5
7 1:320 <1:5
8 1:40 <1:5
9 1:160 <1:5
10 1:320 <1:5
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 5. PLL1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* ELISA (항-DEN-1) ELISA (항-DEN-2) ELISA (항-DEN-3) ELISA (항-DEN-4)
1 (PLL1) <1/100 >1:128000 <1/100 <1/100
2 (PLL1) <1/100 1:128000 <1/100 <1/100
혈청의 혼합물* HI** 항-DEN-1 HI 항-DEN-2 HI 항-DEN-3 HI 항-DEN-4
PLL1 <1/5 >1/320 <1/5 <1/5
혈청의 혼합물* 중화 역가*** 항-DEN-1 중화 역가 항-DEN-2 중화 역가 항-DEN-3 중화 역가 항-DEN-4
1 (PLL1) <1:5 1:320 <1:5 <1:5
2 (PLL1) <1:5 1:160 <1:5 <1:5
* 각각의 혼합물은 3개의 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 5. PLL2의 수득
DEN-2 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.22)을 DEN-2 바이러스 균주 유전자형 자마이카 (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative analysis of the full-length genome. Virology 1988. 165:234-244)로부터의 SEQ ID No.1 및 SEQ ID No.3으로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.26)을 함유하는 벡터는 pM84 His 플라스미드를 Xba I/Eco RI으로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질의 구성 도메인에 대한 코딩 영역내에 삽입시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 (competent) 세포 MM294 (Hanahan D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166:557-580)을 pLL2 (도 2 및 SEQ ID No.27)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 10%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-2 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-2에 의해 인식되었으며, 이를 PLL2 (SEQ ID No.28)로 명명하였다.
실시예 6. PLL2 단백질의 정제
pLL2로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 수용성 및 불용성 둘 모두의 형태로서 수득하였다. 가용성 분획으로부터, Cu++ 이온과 미리 커플링시킨 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼을 이용하여 금속 이온-친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 컬럼을 이마다졸 15mM를 사용하여 세척하고, 단백질을 이미다졸 100mM로 용리 하였다. 다른 한편, 불용성 분획에 결합된 단백질을 우레아 8M을 사용하여 추출하고, PLL2 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++ 이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 단백질을 이미다졸 100mM로 용리하였다. 최종적으로, 각각의 형태의 단백질의 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 완충액 NaCl 100mM, KCl2 2mM, Na2HPO4 10mM, pH 7.2, KH2 PO4 1mM (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 7. PLL2의 항원성 특징화
PLL2의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의해 특징화하였다 (표 6).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-2로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 2의 경우 보다 낮았는데, DEN-1, DEN-3 및 DEN-4의 순서로 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 그럼에도 불구하고, Mab 3H5에 관해, 도트 블롯 및 웨스턴 블롯에 의해 커다란 반응성이 관찰되었다 (PLL1로 수득된 반응성 보다도 크다). PLL1 결과와 대조적으로, Mab 3H5에 의한 인식은 환원제가 샘플에 존재하는 경우에 동일하였는데, 이는 둘 모두의 단백질 간의 가능한 입체형태 차이를 나타낸다. 최종적으로, DEN-2에 대한 3가 지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 6. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PLL2 단백질의 반응성.
Abs** 특이성*** PLL2 가용성,불용성*
HMAF DEN-1 ++
HMAF DEN-2 +++
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 -
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT +++
* 정제된 PLL2의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 8. PLL2에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PLL2로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-2에 대한 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 7 및 표 10). 또한, 혈구응집 억제 검정 (HI)을 수행한 결과, DEN-2에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 8 및 표 10). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-2에 대해 1:1280의 중 화 역가가 수득되었다. PLL1로 수득된 결과와 유사하게, 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 9 및 표 10). 다른 한편, PLL2의 둘 모두의 변이체로 수득된 결과는 유사하였는데, 이는 단백질의 가용화 상태가 기능적 항체를 생성시키는 능력에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
표 7. 가용성 및 불용성 PLL2에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-2에 대한 항체 역가
마우스 역가 항-DEN-2 (PLL2) 역가 항-DEN-2 PBS C(-)
PLL2 가용성 PLL2 불용성
1 >1:128000 1:64000 <1:100
2 1:128000 >1:128000 <1:100
3 >1:128000 1:128000 <1:100
4 >1:128000 >1:128000 <1:100
5 1:64000 >1:128000 <1:100
6 >1:128000 1:128000 <1:100
7 1:64000 >1:128000 <1:100
8 >1:128000 1:64000 <1:100
9 >1:128000 1:64000 <1:100
10 1:128000 >1:128000 <1:100
표 8. 가용성 및 불용성 PLL2로 면역시킨 동물 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 HI*에 의한 역가 항-DEN-2 (PLL2) HI에 의한 역가 항-DEN-2 PBS C(-)
PLL2 가용성 PLL2 불용성
1 >1:640 >1:640 <1:5
2 >1:640 >1:640 <1:5
3 1:320 >1:640 <1:5
4 >1:640 1:320 <1:5
5 1:320 <1:5 <1:5
6 >1:640 >1:640 <1:5
7 >1:640 1:320 <1:5
8 <1:5 1:320 <1:5
9 1:320 >1:640 <1:5
10 >1:640 >1:640 <1:5
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 9. 가용성 및 불용성 PLL2로 면역시킨 동물 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 중화 역가 항-DEN-2 (PLL2) 중화 역가 항-DEN-2 PBS C(-)
PLL2 가용성 PLL2 불용성
1 >1:1280 >1:1280 >1:1280
2 >1:1280 >1:1280 <1:5
3 >1:1280 1:640 <1:5
4 1:640 >1:1280 <1:5
5 1:640 1:640 <1:5
6 >1:1280 >1:1280 <1:5
7 >1:1280 >1:1280 <1:5
8 >1:1280 >1:1280 <1:5
9 >1:1280 >1:1280 <1:5
10 >1:1280 >1:1280 <1:5
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 10. 가용성 및 불용성 PLL2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* ELISA (항-DEN-1) ELISA (항-DEN-2) ELISA (항-DEN-3) ELISA (항-DEN-4)
1 (PLL2 가용성) <1/100 >1:128000 <1/100 <1/100
2 (PLL2 가용성) <1/100 1:64000 <1/100 <1/100
1 (PLL2 불용성) <1/100 1:64000 <1/100 <1/100
2 (PLL2 불용성) <1/100 >1:128000 <1/100 <1/100
혈청의 혼합물* HI** 항-DEN-1 HI 항-DEN-2 HI 항-DEN-3 HI 항-DEN-4
PLL2 가용성 <1/5 >1/320 <1/5 <1/5
PLL2 불용성 <1/5 >1/320 <1/5 <1/5
혈청의 혼합물* 중화 역가*** 항-DEN-1 중화 역가 항-DEN-2 중화 역가 항-DEN-3 중화 역가 항-DEN-4
1 (PLL2) <1:5 1:320 <1:5 <1:5
2 (PLL2) <1:5 1:160 <1:5 <1:5
* 각각의 혼합물은 3개의 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희 석률로서 정의되었다.
실시예 9. pLL3의 수득
DEN-2 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.22)을 DEN-2 바이러스 균주 유전자형 자마이카 (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative analysis of the full-length genome. Virology 1988. 165:234-244)로부터의 SEQ ID No.4 및 SEQ ID No.5로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 정지 코돈이 없는 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.29)을 함유하는 벡터는 pD4 플라스미드를 Bam HI/Bam HI으로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질의 C-말단 영역 다음에 융합시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pLL3 (도 3 및 SEQ ID No.30)으로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-2 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAFI 항-DEN-2에 의해 인식되었으며, 이를 PLL3 (SEQ ID No.31)으로 명명하였다.
실시예 10. PLL3 단백질의 정제
pLL2로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로서 수득하였다. 불용성 분획으로부터, 단백질을 우레아 6M을 사용하여 추출하고, PLL3 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++ 이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 30mM로 세척하고, 단백질을 이미다졸 100mM로 용리하였다. 최종적으로, 단백질의 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 11. PLL3의 항원성 특징화
PLL3의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의해 특징화하였다 (표 11).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-2로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 2의 경우 보다 낮았는데, DEN-1, DEN-3 및 DEN-4의 순서로 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 그럼에도 불구하고, Mab 3H5에 관해, 도트 블롯 및 웨스턴 블롯에 의해 커다란 반응성이 관찰되었다 (PLL2로 수득된 반응성과 유사하다). PLL1 결과와 대조적으로, Mab 3H5에 의한 인식은 환원제가 샘플에 존재하는 경우에 동일하였는데, 이는 둘 모두의 단백질 간의 가능한 입체형태 차이를 나타낸다. 최종적으로, DEN-2에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다. 이러한 결과는 PLL2로 수득된 결과와 유사하였다.
표 11. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PLL3 단백질의 반응성.
Abs** 특이성*** PLL3*
HMAF DEN-1 ++
HMAF DEN-2 +++
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 -
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT +++
* 정제된 PLL3의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 12. PLL3에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PLL3으로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의 해 평가하였다. DEN-2에 대한 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 12 및 표 15). 또한, 혈구응집 억제 (HI) 검정을 수행한 결과, DEN-2에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 13 및 표 15). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-2에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 14). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 15). 3회의 시험을 사용한 경우, 고수준의 혈청형-특이적 항체가 검출되었으며, 이는 PLL2 단백질을 사용하여 면역시킨 후에 수득된 결과와 유사하였다.
표 12. PLL3에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-2에 대한 항체 역가
마우스 역가 항-DEN-2 (PLL3) 역가 항-DEN-2 PBS C(-)
1 1:128000 <1:100
2 >1:128000 <1:100
3 >1:128000 <1:100
4 1:64000 <1:100
5 >1:128000 <1:100
6 1:64000 <1:100
7 >1:128000 <1:100
8 >1:128000 <1:100
9 1:128000 <1:100
10 >1:128000 <1:100
표 13. PLL3으로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 HI*에 의한 역가 항-DEN-2 (PLL3) HI에 의한 역가 항-DEN-2 PBS C(-)
1 >1:640 <1:5
2 1:320 <1:5
3 1:320 <1:5
4 >1:640 <1:5
5 1:320 <1:5
6 >1:640 <1:5
7 >1:640 <1:5
8 >1:640 <1:5
9 1:320 <1:5
10 >1:640 <1:5
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 14. PLL3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 중화 역가 항-DEN-2 PLL3 중화 역가 항-DEN-2 PBS C(-)
1 >1:1280 <1:5
2 >1:1280 <1:5
3 >1:1280 <1:5
4 1:640 <1:5
5 >1:1280 <1:5
6 >1:1280 <1:5
7 >1:1280 <1:5
8 >1:1280 <1:5
9 1:640 <1:5
10 >1:1280 <1:5
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 15. PLL3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* ELISA (항-DEN-1) ELISA (항-DEN-2) ELISA (항-DEN-3) ELISA (항-DEN-4)
1 (PLL3) <1/100 >1:128000 <1/100 <1/100
2 (PLL3) <1/100 >1:128000 <1/100 <1/100
혈청의 혼합물* HI** 항-DEN-1 HI 항-DEN-2 HI 항-DEN-3 HI 항-DEN-4
PLL3 <1/5 >1/320 <1/5 <1/5
혈청의 혼합물* 중화 역가*** 항-DEN-1 중화 역가*** 항-DEN-2 중화 역가*** 항-DEN-3 중화 역가*** 항-DEN-4
1 (PLL3) <1:5 >1:1280 <1:5 <1:5
2 (PLL3) <1:5 >1:1280 <1:5 <1:5
* 각각의 혼합물은 3개의 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희 석률로서 정의되었다.
실시예 13. pLH1의 수득
DEN-1 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.32)을 DEN-1 바이러스 균주 유전자형 (Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.Genetic relateness among structural protein genes of dengue 1 virus strains.J. Gen. Virol.1989. 70:1701-1712)으로부터의 SEQ ID No.6 및 SEQ ID No.7로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH의 N-말단 영역 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.23)을 함유하는 벡터는 pM108 His 플라스미드를 Xba I/Bam HI으로 분해함으로써 제조하였다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pLH1 (도 4 및 SEQ ID No.33)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 루리아 버타니 (LB) 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 25kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 10%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질로부터의 N-말단 영역과 DEN-1 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF에 함유된 폴리클로날 항체 (PA) 항-DEN-1에 의해 인식되었다. 상기 단백질을 PLH1 (SEQ ID No.34)으로 명명하였다.
실시예 14. PLH1 단백질의 정제
pLH1로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 주로 세포 파괴물의 펠레트에 결합된 불용성 형태로서 수득하였다. 펠레트로부터, 단백질을 우레아 7M로 추출하고, PLH1 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++ 이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 단백질을 이미다졸 60mM로 용리하고, 수득된 부피를 G-25 컬럼상에 로딩하여 최종적으로 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 15. PLH1의 항원성 특징화
PLH1의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의해 특징화하였다 (표 16).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-1로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 1의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-1에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 16. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PLH1 단백질의 반응성.
Abs** 특이성*** PLH1
HMAF DEN-1 ++
HMAF DEN-2 +
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 -
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
* 정제된 PLH1의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 16. PLH1에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PLH1로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-1에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 17 및 표 20). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-1에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 18 및 표 20). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-1에 대해 1:320의 중화 역가가 수득되었다. 그러나, 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 19 및 표 20). 이러한 결과는 PLH1에 의해 유도된 항체의 높은 혈청형-특이성을 나타낸다.
표 17. PLH1에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-1에 대한 항체 역가
마우스 역가 항-DEN-1 (PLH1) 역가 항-DEN-1 PBS C(-)
1 1/64000 <1:100
2 1/128000 <1:100
3 1/64000 <1:100
4 1/32000 <1:100
5 1/32000 <1:100
6 1/64000 <1:100
7 1/128000 <1:100
8 1/64000 <1:100
9 1/128000 <1:100
10 1/128000 <1:100
표 18. PLH1로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 HI*에 의한 역가 항-DEN-1 (PLH1) HI*에 의한 역가 항-DEN-1 PBS C(-)
1 >1:640 <1:5
2 1:320 <1:5
3 >1:640 <1:5
4 >1:640 <1:5
5 >1:640 <1:5
6 1:320 <1:5
7 1:40 <1:5
8 1:320 <1:5
9 >1:640 <1:5
10 <1:5 <1:5
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 19. PLH1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 중화 역가* 항-DEN-1 (PLH1) 중화 역가* 항-DEN-1 PBS C(-)
1 1:80 <1:5
2 1:320 <1:5
3 1:40 <1:5
4 1:320 <1:5
5 1:80 <1:5
6 1:160 <1:5
7 1:320 <1:5
8 1:320 <1:5
9 1:320 <1:5
10 1:320 <1:5
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 20. PLH1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* ELISA (항-DEN-1) ELISA (항-DEN-2) ELISA (항-DEN-3) ELISA (항-DEN-4)
1 (PLH1) 1:128000 <1/100 <1/100 <1/100
2 (PLH1) >1:128000 <1/100 <1/100 <1/100
혈청의 혼합물* HI** 항-DEN-1 HI 항-DEN-2 HI 항-DEN-3 HI 항-DEN-4
PLH1 >1:320 <1/5 <1/5 <1/5
혈청의 혼합물* 중화 역가*** 항-DEN-1 중화 역가*** 항-DEN-2 중화 역가*** 항-DEN-3 중화 역가*** 항-DEN-4
1 (PLH1) 1:160 <1:5 <1:5 <1:5
2 (PLH1) 1:320 <1:5 <1:5 <1:5
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 17. pLH2의 수득
DEN-1 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.32)을 DEN-1 바이러스 균주 (Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.Genetic relateness among structural protein genes of dengue 1 virus strains.J. Gen. Virol.1989. 70:1701-1712)으로부터의 SEQ ID No.6 및 SEQ ID No.8로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.26)을 함유하는 벡터는 pM84 His 플라스미드를 Xba I/Eco RI로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질의 구성 도메인에 대한 코딩 영역내에 삽입시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 MM294를 pLH2 (도 5 및 SEQ ID No.35)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-1 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-1에 의해 인식되었으며, 이를 PLH2 (SEQ ID No.36)로 명명하였다.
실시예 18. PLH2 단백질의 정제
PLH2로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로 수득하였다. 불용성 분획에 결합된 단백질을 우레아 7M을 사용하여 추출하고, PLH2 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++ 이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 40mM로 세척하고, 단백질을 이미다졸 100mM로 용리하였다. 최종적으로, 순수한 분획을 G-25 컬 럼상에 로딩하여 포뮬레이션 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 19. PLH2의 항원성 특징화
PLH2의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 21).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-1로 수득되었다 (PLH1로 수득된 인식 보다 높다). 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 1의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-1에 대한 5가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 21. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PLH2 단백질의 반응성.
Abs** 특이성*** PLH2
HMAF DEN-1 +++
HMAF DEN-2 +
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 -
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
* 정제된 PLH2의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사 용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 20. PLH2에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PLH2로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-1에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 22 및 표 25). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-1에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 23 및 표 25). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-1에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 24). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 25).
표 22. PLH2에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-1에 대한 항체 역가
마우스 역가 항-DEN-1 (PLH2) 역가 항-DEN-1 PBS C(-)
1 1:128000 <1:100
2 >1:128000 <1:100
3 1:64000 <1:100
4 >1:128000 <1:100
5 1:128000 <1:100
6 1:64000 <1:100
7 >1:128000 <1:100
8 1:128000 <1:100
9 >1:128000 <1:100
10 >1:128000 <1:100
표 23. PLH2로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 HI*에 의한 역가 항-DEN-1 (PLH2) HI*에 의한 역가 항-DEN-1 PBS C(-)
1 <1:5 <1:5
2 >1:640 <1:5
3 1:320 <1:5
4 1:320 <1:5
5 >1:640 <1:5
6 >1:640 <1:5
7 >1:640 <1:5
8 1:320 <1:5
9 >1:640 <1:5
10 <1:5 <1:5
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 24. PLH2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 중화 역가* 항-DEN-1 (PLH2) 중화 역가* 항-DEN-1. C(-)
1 >1:1280 <1:5
2 >1:1280 <1:5
3 >1:1280 <1:5
4 >1:1280 <1:5
5 >1:1280 <1:5
6 >1:1280 <1:5
7 >1:1280 <1:5
8 >1:1280 <1:5
9 1:640 <1:5
10 >1:1280 <1:5
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 25. PLH2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* ELISA (항-DEN-1) ELISA (항-DEN-2) ELISA (항-DEN-3) ELISA (항-DEN-4)
1 (PLH2) 1:64000 <1/100 <1/100 <1/100
2 (PLH2) >1:128000 <1/100 <1/100 <1/100
혈청의 혼합물* HI** 항-DEN-1 HI 항-DEN-2 HI 항-DEN-3 HI 항-DEN-4
PLH2 >1/320 >1/5 <1/5 <1/5
혈청의 혼합물* 중화 역가*** 항-DEN-1 중화 역가 항-DEN-2 중화 역가 항-DEN-3 중화 역가 항-DEN-4
1 (PLH2) >1:1280 <1:5 <1:5 <1:5
2 (PLH2) >1:1280 <1:5 <1:5 <1:5
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 21. pLH3의 수득
DEN-1 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.32)을 DEN-1 바이러스 균주 (Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.Genetic relateness among structural protein genes of dengue 1 virus strains.J. Gen. Virol.1989. 70:1701-1712)으로부터의 SEQ ID No.9 및 SEQ ID No.10으로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 정지 코돈이 없는 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.29)을 함유하는 벡터는 pD4 플라스미드를 Bam HI/Bam HI로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질에 대한 C-말단 영역 다음에 융합시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pLH3 (도 6 및 SEQ ID No.37)으로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-1 바이러스 로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-1에 의해 인식되었으며, 이를 PLH3 (SEQ ID No.38)으로 명명하였다.
실시예 22. PLH3 단백질의 정제
pLH3으로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로 수득하였다. 불용성 분획으로부터, 단백질을 우레아 6M을 사용하여 추출하고, PLH3 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++ 이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 30mM로 세척하고, 단백질을 이미다졸 250mM로 용리하였다. 최종적으로, 단백질의 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 23. PLH3의 항원성 특징화
PLH3의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 26).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-1로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 1의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-1에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 26. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PLH3 단백질의 반응성.
Abs** 특이성*** PLH3
HMAF DEN-1 +++
HMAF DEN-2 +
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 -
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
* 정제된 PLH3의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 24. PLH3에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 20ug의 정제된 PLH2로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-1에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 27 및 표 30). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-1에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 28 및 표 30). 최종적으 로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-1에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 29). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 30).
표 27. PLH3에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-1에 대한 항체 역가
마우스 역가 항-DEN-1 PLH3 역가 항-DEN-1 PBS 대조군(-)
1 1:64000 <1:100
2 >1:128000 <1:100
3 1:64000 <1:100
4 >1:128000 <1:100
5 1:128000 <1:100
6 1:128000 <1:100
7 1:128000 <1:100
8 >1:128000 <1:100
9 1:64000 <1:100
10 >1:128000 <1:100
표 28. PLH3으로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 HI*에 의한 역가 항-DEN-1 PLH3 HI*에 의한 역가 항-DEN-1 PBS C(-)
1 1:320 <1:5
2 >1:640 <1:5
3 >1:640 <1:5
4 1:320 <1:5
5 1:320 <1:5
6 >1:640 <1:5
7 1:320 <1:5
8 <1:5 <1:5
9 >1:640 <1:5
10 >1:640 <1:5
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 29. PLH3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 중화 역가* 항-DEN-1 (PLH2) 중화 역가* 항-DEN-1 PBS C(-)
1 >1:1280 <1:5
2 >1:1280 <1:5
3 >1:1280 <1:5
4 1:640 <1:5
5 1:640 <1:5
6 >1:1280 <1:5
7 >1:1280 <1:5
8 >1:1280 <1:5
9 >1:1280 <1:5
10 >1:1280 <1:5
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 30. PLH3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* ELISA (항-DEN-1) ELISA (항-DEN-2) ELISA (항-DEN-3) ELISA (항-DEN-4)
1 (PLH3) 1:128000 <1/100 <1/100 <1/100
2 (PLH3) >1:128000 <1/100 <1/100 <1/100
혈청의 혼합물* HI** 항-DEN-1 HI 항-DEN-2 HI 항-DEN-3 HI 항-DEN-4
PLH3 >1/320 <1/5 <1/5 <1/5
혈청의 혼합물* 중화 역가*** 항-DEN-1 중화 역가 항-DEN-2 중화 역가 항-DEN-3 중화 역가 항-DEN-4
1 (PLH3) >1:1280 <1:5 <1:5 <1:5
2 (PLH3) >1:1280 <1:5 <1:5 <1:5
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 25. pAZ1의 수득
DEN-3 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하 는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.39)을 DEN-3 바이러스 균주 유전자형 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology.1990. 176(2):643-647)로부터의 SEQ ID No.11 및 SEQ ID No.12로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH의 N-말단 영역 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.23)을 함유하는 벡터는 pM108 His 플라스미드를 Xba I/Bam HI로 분해함으로써 제조하였다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pAZ1 (도 7 및 SEQ ID No.40)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 루리아 버타니 (LB) 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 25kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 10%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질로부터의 N-말단 영역과 DEN-3 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF에 함유된 폴리클로날 항체 (PA) 항-DEN-3에 의해 인식되었다. 상기 단백질을 PAZ1 (SEQ ID No.41)로 명명하였다.
실시예 26. PAZ1 단백질의 정제
pAZ1로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 주로 세포 파괴물의 펠레트에 결합된 불용성 형태로서 수득하였다. 펠레트로부터, 단백질을 우레아 7M을 사용하여 추출하고, PLH1 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카 오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++ 이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 단백질을 이미다졸 60mM로 용리하고, 수득된 부피를 G-25 컬럼상에 로딩하여 최종적으로 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 27. PAZ1의 항원성 특징화
PAZ1의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 31).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-3으로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 3의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-3에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 31. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PAZ1 단백질의 반응성.
Abs** 특이성*** PLH3
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 +
HMAF DEN-3 ++
HMAF DEN-4 +
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
* 정제된 PAZ1의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 28. PAZ1에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PAZ1로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-1에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 32 및 표 35). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-3에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 33 및 표 35). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-3에 대해 1:320의 중화 역가가 수득되었다. 그러나, 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 34 및 표 35). 이러한 결과는 PAZ1에 의해 유도된 항체의 높은 혈청형-특이성을 나타낸다.
표 32. PAZ1에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-3에 대한 항체 역가
마우스 역가 항-DEN-3 PAZ1 역가 항-DEN-3 PBS 대조군(-)
1 1/64000 <1:100
2 1/128000 <1:100
3 1/32000 <1:100
4 1/64000 <1:100
5 1/64000 <1:100
6 1/128000 <1:100
7 1/64000 <1:100
8 1/64000 <1:100
9 1/128000 <1:100
10 1/128000 <1:100
표 33. PAZ1로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 HI*에 의한 역가 항-DEN-3 PAZ1 HI에 의한 역가 항-DEN-3 PBS C(-)
1 >1:640 <1:5
2 1:320 <1:5
3 1:320 <1:5
4 1:640 <1:5
5 <1/5 <1:5
6 1:320 <1:5
7 <1/5 <1:5
8 1:320 <1:5
9 >1:640 <1:5
10 >1:640 <1:5
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 34. PAZ1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 중화 역가 항-DEN-3 PAZ1 중화 역가 항-DEN-3 PBS C(-)
1 1:160 <1:5
2 1:320 <1:5
3 1:320 <1:5
4 1:320 <1:5
5 1:40 <1:5
6 1:40 <1:5
7 1:320 <1:5
8 1:320 <1:5
9 1:160 <1:5
10 1:320 <1:5
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 35. PAZ1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* ELISA (항-DEN-1) ELISA (항-DEN-2) ELISA (항-DEN-3) ELISA (항-DEN-4)
1 (PAZ1) <1/100 <1/100 1:64000 <1/100
2 (PAZ1) <1/100 <1/100 >1:128000 <1/100
혈청의 혼합물* HI** 항-DEN-1 HI 항-DEN-2 HI 항-DEN-3 HI 항-DEN-4
PAZ1 <1/5 <1/5 >1:320 <1/5
혈청의 혼합물* 중화 역가*** 항-DEN-1 중화 역가 항-DEN-2 중화 역가 항-DEN-3 중화 역가 항-DEN-4
1 (PAZ1) <1:5 <1:5 1:320 <1:5
2 (PAZ1) <1:5 <1:5 1:320 <1:5
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 29. pAZ2의 수득
DEN-3 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.39)을 DEN-3 바이러스 균주 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology.1990. 176(2):643-647)로부터의 SEQ ID No.11 및 SEQ ID No.13으로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.26)을 함유하는 벡터는 pM84 His 플라스미드를 Xba I/Eco RI로 분해함으로써 제 조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질의 구성 도메인에 대한 코딩 영역내에 삽입시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 MM294를 pAZ2 (도 8 및 SEQ ID No.42)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-3 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-3에 의해 인식되었고, 이를 PAZ2 (SEQ ID No.43)로 명명하였다.
실시예 30. PAZ2 단백질의 정제
pAZ2로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로 수득하였다. 불용성 분획에 결합된 단백질을 우레아 7M을 사용하여 추출하고, PAZ2 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++ 이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 40mM로 세척하고, 단백질을 이미다졸 100mM로 용리하였다. 최종적으로, 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 31. PAZ2의 항원성 특징화
PAZ2의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 36).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-3으로 수득되었다 (PAZ1로 수득된 인식 보다 높다). 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 3의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-3에 대한 5가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 36. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PAZ2 단백질의 반응성.
Abs** 특이성*** PAZ2
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 -
HMAF DEN-3 +++
HMAF DEN-4 +
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
* 정제된 PAZ2의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 32. PAZ2에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 20ug의 정제된 PAZ2로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-3에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 37 및 표 40). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-3에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 38 및 표 40). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-3에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 39). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 40).
표 37. PAZ2에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-3에 대한 항체 역가
마우스 역가 항-DEN-3 PAZ2 역가 항-DEN-3 PBS 대조군(-)
1 >1:128000 <1:100
2 1:128000 <1:100
3 >1:128000 <1:100
4 >1:128000 <1:100
5 1:128000 <1:100
6 >1:128000 <1:100
7 1:64000 <1:100
8 >1:128000 <1:100
9 1:64000 <1:100
10 >1:128000 <1:100
표 38. PAZ2로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 HI*에 의한 역가 항-DEN-3 PAZ2 HI에 의한 역가 항-DEN-3 PBS C(-)
1 >1:640 <1:5
2 1:320 <1:5
3 >1:640 <1:5
4 >1:640 <1:5
5 >1:640 <1:5
6 1:320 <1:5
7 <1:5 <1:5
8 1:320 <1:5
9 >1:640 <1:5
10 >1:640 <1:5
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 39. PAZ2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 중화 역가 항-DEN-3 PAZ2 중화 역가 항-DEN-3 PBS C(-)
1 >1:1280 <1:5
2 >1:1280 <1:5
3 >1:1280 <1:5
4 >1:1280 <1:5
5 >1:1280 <1:5
6 1:640 <1:5
7 >1:1280 <1:5
8 1:640 <1:5
9 >1:1280 <1:5
10 1:640 <1:5
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 40. PAZ2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* ELISA (항-DEN-1) ELISA (항-DEN-2) ELISA (항-DEN-3) ELISA (항-DEN-4)
1 (PAZ2) <1/100 <1/100 >1:128000 <1/100
2 (PAZ2) <1/100 <1/100 >1:128000 <1/100
혈청의 혼합물* HI** 항-DEN-1 HI 항-DEN-2 HI 항-DEN-3 HI 항-DEN-4
PAZ2 <1/5 <1/5 >1/320 <1/5
혈청의 혼합물* 중화 역가*** 항-DEN-1 중화 역가 항-DEN-2 중화 역가 항-DEN-3 중화 역가 항-DEN-4
1 (PAZ2) <1:5 <1:5 >1:1280 <1:5
2 (PAZ2) <1:5 <1:5 >1:1280 <1:5
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 33. pAZ3의 수득
DEN-3 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.39)을 DEN-3 바이러스 균주 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology.1990. 176(2):643-647)로부터의 SEQ ID No.14 및 SEQ ID No.15로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 정지 코돈이 없는 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.29)을 함유하는 벡터는 pD4 플라스미드를 Bam HI/Bam HI로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질의 C-말단 영역 다음에 융합시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pAZ3 (도 9 및 SEQ ID No.44)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-3 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-3에 의해 인식되었으며, 이를 PAZ3 (SEQ ID No.45)로 명명하였다.
실시예 34. PAZ3 단백질의 정제
pAZ3으로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로 수득하였다. 불용성 분획으로부터, 단백질을 우레아 7M을 사용하여 추출하고, PAZ3 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++ 이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 45mM로 세척하고, 단백질을 이미다졸 230mM로 용리하였다. 최종적으로, 단백질의 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 35. PAZ3의 항원성 특징화
PAZ3의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 26).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-3으로 수득되었다. 나머지 혈청 형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 3의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-3에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 41. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PAZ3 단백질의 반응성.
Abs** 특이성*** PAZ3
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 -
HMAF DEN-3 +++
HMAF DEN-4 +
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
* 정제된 PAZ3의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 36. PAZ3에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 20ug의 정제된 PAZ3으로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-3에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형 에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 42 및 표 45). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-3에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 43 및 표 45). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-3에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 44). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 45).
표 42. PAZ3에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-3에 대한 항체 역가
마우스 역가 항-DEN-3 PAZ3 역가 항-DEN-3 PBS 대조군(-)
1 >1:128000 <1:100
2 1:128000 <1:100
3 >1:128000 <1:100
4 1:128000 <1:100
5 1:128000 <1:100
6 >1:128000 <1:100
7 >1:128000 <1:100
8 1:128000 <1:100
9 1:128000 <1:100
10 >1:128000 <1:100
표 43. PAZ3으로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 HI*에 의한 역가 항-DEN-3 PAZ3 HI에 의한 역가 항-DEN-3 PBS C(-)
1 >1:640 <1:5
2 >1:640 <1:5
3 1:320 <1:5
4 <1:5 <1:5
5 >1:640 <1:5
6 <1:5 <1:5
7 1:320 <1:5
8 >1:640 <1:5
9 >1:640 <1:5
10 1:320 <1:5
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 44. PAZ3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 중화 역가 항-DEN-3 PAZ3 중화 역가 항-DEN-3 PBS C(-)
1 >1:1280 <1:5
2 1:640 <1:5
3 >1:1280 <1:5
4 >1:1280 <1:5
5 >1:1280 <1:5
6 >1:1280 <1:5
7 >1:1280 <1:5
8 >1:1280 <1:5
9 >1:1280 <1:5
10 >1:1280 <1:5
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 45. PAZ3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* ELISA (항-DEN-1) ELISA (항-DEN-2) ELISA (항-DEN-3) ELISA (항-DEN-4)
1 (PAZ3) <1/100 <1/100 >1:128000 <1/100
2 (PAZ3) <1/100 <1/100 1:128000 <1/100
혈청의 혼합물* HI** 항-DEN-1 HI 항-DEN-2 HI 항-DEN-3 HI 항-DEN-4
PAZ3 <1/5 <1/5 >1/320 <1/5
혈청의 혼합물* 중화 역가*** 항-DEN-1 중화 역가 항-DEN-2 중화 역가 항-DEN-3 중화 역가 항-DEN-4
1 (PAZ3) <1:5 <1:5 >1:1280 <1:5
2 (PAZ3) <1:5 <1:5 >1:1280 <1:5
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 37. pID1의 수득
DEN-4 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하 는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.46)을 DEN-4 바이러스 균주 유전자형 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Anaylsis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155:77-88)로부터의 SEQ ID No.17 및 SEQ ID No.18로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질의 N-말단 영역 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.23)을 함유하는 벡터는 pM108 His 플라스미드를 Xba I/Bam HI로 분해함으로써 제조하였다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pID1 (도 10 및 SEQ ID No.47)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 루리아 버타니 (LB) 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 25kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 10%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질로부터의 N-말단 영역과 DEN-4 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF에 함유된 폴리클로날 항체 (PA) 항-DEN-4에 의해 인식되었다. 상기 단백질을 PID1 (SEQ ID No.48)로 명명하였다.
실시예 38. PID1 단백질의 정제
pID1로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 주로 세포 파괴물의 펠레 트에 결합된 불용성 형태로서 수득하였다. 펠레트로부터, 단백질을 우레아 6M로 추출하고, PID1 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++ 이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 단백질을 이미다졸 60mM로 용리하고, 수득된 부피를 G-25 컬럼상에 로딩하여 최종적으로 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 39. PID1의 항원성 특징화
PID1의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 46).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-4로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 4의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-4에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 46. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PID1 단백질의 반응성.
Abs** 특이성*** PID1
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 -
HMAF DEN-3 +
HMAF DEN-4 ++
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
* 정제된 PID1의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 40. PID1에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 35ug의 정제된 PID1로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-1에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 47 및 표 50). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-4에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 48 및 표 50). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-4에 대해 1:320의 중화 역가가 수득되었다. 그러나, 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 49 및 표 50). 이러한 결과는 PID1에 의해 유도된 항체의 높은 혈청형-특이성을 나타낸다.
표 47. PID1에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-4에 대한 항체 역가
마우스 역가 항-DEN-4 PID1 역가 항-DEN-4 PBS 대조군(-)
1 1/128000 <1:100
2 1/128000 <1:100
3 1/64000 <1:100
4 1/64000 <1:100
5 1/128000 <1:100
6 1/32000 <1:100
7 1/128000 <1:100
8 1/32000 <1:100
9 1/128000 <1:100
10 1/128000 <1:100
표 48. PID1로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 HI*에 의한 역가 항-DEN-4 PID1 HI에 의한 역가 항-DEN-4 PBS C(-)
1 1:320 <1:5
2 1:320 <1:5
3 1:640 <1:5
4 1:40 <1:5
5 <1/5 <1:5
6 1:320 <1:5
7 1:640 <1:5
8 1:640 <1:5
9 1:40 <1:5
10 1:320 <1:5
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 49. PID1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 중화 역가 항-DEN-4 PID1 중화 역가 항-DEN-4 PBS C(-)
1 1:320 <1:5
2 1:80 <1:5
3 1:320 <1:5
4 1:320 <1:5
5 1:160 <1:5
6 1:320 <1:5
7 1:320 <1:5
8 1:320 <1:5
9 1:160 <1:5
10 1:40 <1:5
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 50. PID1로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* ELISA (항-DEN-1) ELISA (항-DEN-2) ELISA (항-DEN-3) ELISA (항-DEN-4)
1 (PID1) <1/100 <1/100 <1/100 1:64000
2 (PID1) <1/100 <1/100 <1/100 >1:128000
혈청의 혼합물* HI** 항-DEN-1 HI 항-DEN-2 HI 항-DEN-3 HI 항-DEN-4
PID1 <1/5 <1/5 <1/5 >1:320
혈청의 혼합물* 중화 역가*** 항-DEN-1 중화 역가 항-DEN-2 중화 역가 항-DEN-3 중화 역가 항-DEN-4
1 (PID1) <1:5 <1:5 <1:5 1:160
2 (PID1) <1:5 <1:5 <1:5 1:320
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 41. pID2의 수득
DEN-4 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.46)을 DEN-4 바이러스 균주 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Anaylsis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155:77-88)로부터의 SEQ ID No.16 및 SEQ ID No.18로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.26)을 함유하는 벡터는 pM84 His 플라스미드를 Xba I/Eco RI로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질의 구성 도메인에 대한 코딩 영역내에 삽입시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 MM294를 pID2 (도 11 및 SEQ ID No.49)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-4 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-4에 의해 인식되었고, 이를 PID2 (SEQ ID No.50)로 명명하였다.
실시예 42. PID2 단백질의 정제
pID2로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로 수득하였다. 불용성 분획에 결합된 단백질을 우레아 6M을 사용하여 추출하고, PID2 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++ 이온의 존재하에서 킬레이팅-세파 로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 30mM로 용리하고, 단백질을 이미다졸 250mM로 용리하였다. 최종적으로, 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 43. PID2의 항원성 특징화
PID2의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 51).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-4로 수득되었다 (PID1로 수득된 인식 보다 높다). 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 4의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-3에 대한 5가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 51. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PID2 단백질의 반응성.
Abs** 특이성*** PID2
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 -
HMAF DEN-3 +
HMAF DEN-4 +++
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
* 정제된 PID2의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 44. PID2에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 20ug의 정제된 PID2로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-4에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 52 및 표 55). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-4에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 53 및 표 55). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-4에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 54). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 55).
표 52. PID2에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-4에 대한 항체 역가
마우스 역가 항-DEN-4 PID2 역가 항-DEN-4 PBS 대조군(-)
1 1:64000 <1:100
2 >1:128000 <1:100
3 1:128000 <1:100
4 >1:128000 <1:100
5 1:64000 <1:100
6 >1:128000 <1:100
7 >1:128000 <1:100
8 >1:128000 <1:100
9 >1:128000 <1:100
10 1:128000 <1:100
표 53. PID2로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 HI*에 의한 역가 항-DEN-4 (PID2) HI에 의한 역가 항-DEN-4 PBS C(-)
1 1:320 <1:5
2 1:320 <1:5
3 1:640 <1:5
4 1:40 <1:5
5 <1/5 <1:5
6 1:320 <1:5
7 1:640 <1:5
8 1:640 <1:5
9 1:40 <1:5
10 1:320 <1:5
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 54. PID2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 중화 역가 항-DEN-4 PID2 중화 역가 항-DEN-4 PBS C(-)
1 >1:1280 <1:5
2 >1:1280 <1:5
3 >1:1280 <1:5
4 >1:1280 <1:5
5 1:640 <1:5
6 >1:1280 <1:5
7 >1:1280 <1:5
8 >1:1280 <1:5
9 1:640 <1:5
10 >1:1280 <1:5
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 55. PID2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* ELISA (항-DEN-1) ELISA (항-DEN-2) ELISA (항-DEN-3) ELISA (항-DEN-4)
1 (PID2) <1/100 <1/100 <1/100 >1:128000
2 (PID2) <1/100 <1/100 <1/100 1:64000
혈청의 혼합물* HI** 항-DEN-1 HI 항-DEN-2 HI 항-DEN-3 HI 항-DEN-4
PID2 <1/5 <1/5 <1/5 >1/320
혈청의 혼합물* 중화 역가*** 항-DEN-1 중화 역가 항-DEN-2 중화 역가 항-DEN-3 중화 역가 항-DEN-4
1 (PID2) <1:5 <1:5 <1:5 >1:1280
2 (PID2) <1:5 <1:5 <1:5 >1:1280
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 45. pID3의 수득
DEN-4 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.46)을 DEN-4 바이러스 균주 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Anaylsis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155:77-88)로부터의 SEQ ID No.19 및 SEQ ID No.20으로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 단백질 및 정지 코돈이 없는 6개의 히스티딘 서열을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.29)을 함유하는 벡터는 pD4 플라스미드를 Bam HI/Bam HI로 분해함으로써 제조하였다. 이러한 분해는 증폭된 단편을 PCR에 의해 MDH 단백질에 대한 C-말단 영역 다음에 융합시킬 수 있게 한다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하였다. 컴피턴트 세포 W3110을 pID3 (도 12 및 SEQ ID No.51)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 80kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 DEN-4 바이러스로부터의 DENe 단백질 단편의 합에 해당한다. 상기 단백질은 면역블로팅에서 HMAF 항-DEN-4에 의해 인식되었고, 이를 PID3 (SEQ ID No.52)로 명명하였다.
실시예 46. PID3 단백질의 정제
pID3으로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 둘 모두의 형태로 수득하였다. 불용성 분획으로부터, 단백질을 우레아 6M을 사용하여 추출하고, PID3 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++ 이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 컬럼을 이미다졸 45mM로 용리하고, 단백질을 이미다졸 200mM로 용리하였다. 최종적으로, 단백질의 순수한 분획을 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 완충액 (PBS) 중의 단백질을 수득하였다. 이러한 제제를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 47. PID3의 항원성 특징화
PID3의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 56).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-4로 수득되었다. 나머지 혈청형에 대한 HMAF에 의한 인식은 혈청형 4의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 최종적으로, DEN-4에 대한 3가지 고역가 및 3가지 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 56. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PID3 단백질의 반응성.
Abs** 특이성*** PID3
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 -
HMAF DEN-3 +
HMAF DEN-4 +++
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
* 정제된 PID3의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사 용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형
실시예 48. PID3에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 20ug의 정제된 PAZ3으로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-4에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 57 및 표 60). 또한, HI 검정을 수행한 결과, DEN-4에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 58 및 표 60). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-4에 대해 1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 59). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 60).
표 57. PID3에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-4에 대한 항체 역가
마우스 역가 항-DEN-4 (PID3) 역가 항-DEN-4 PBS 대조군(-)
1 >1:128000 <1:100
2 >1:128000 <1:100
3 >1:128000 <1:100
4 1:64000 <1:100
5 1:64000 <1:100
6 >1:128000 <1:100
7 1:128000 <1:100
8 >1:128000 <1:100
9 1:128000 <1:100
10 >1:128000 <1:100
표 58. PID3으로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 HI*에 의한 역가 항-DEN-4 PID3 HI에 의한 역가 항-DEN-4 PBS C(-)
1 >1:640 <1:5
2 1:320 <1:5
3 >1:640 <1:5
4 >1:640 <1:5
5 <1:5 <1:5
6 >1:640 <1:5
7 1:320 <1:5
8 >1:640 <1:5
9 1:320 <1:5
10 >1:640 <1:5
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 59. PID3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 중화 역가* 항-DEN-4 PID3 중화 역가 항-DEN-4 PBS C(-)
1 >1:1280 <1:5
2 >1:1280 <1:5
3 >1:1280 <1:5
4 >1:1280 <1:5
5 >1:1280 <1:5
6 >1:1280 <1:5
7 >1:1280 <1:5
8 1:640 <1:5
9 >1:1280 <1:5
10 >1:1280 <1:5
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 60. PID3으로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* ELISA (항-DEN-1) ELISA (항-DEN-2) ELISA (항-DEN-3) ELISA (항-DEN-4)
1 (PID3) <1/100 <1/100 <1/100 >1:128000
2 (PID3) <1/100 <1/100 <1/100 1:128000
혈청의 혼합물* HI** 항-DEN-1 HI 항-DEN-2 HI 항-DEN-3 HI 항-DEN-4
PID3 <1/5 <1/5 <1/5 >1/320
혈청의 혼합물* 중화 역가*** 항-DEN-1 중화 역가 항-DEN-2 중화 역가 항-DEN-3 중화 역가 항-DEN-4
1 (PID3) <1:5 <1:5 <1:5 >1:1280
2 (PID3) <1:5 <1:5 <1:5 >1/1280
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 49. pD4D2의 수득
DEN-4 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열 (SEQ ID No.46)을 DEN-4의 바이러스 균주 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C.-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Anaylsis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155:77-88)로부터의 SEQ ID No.16 및 SEQ ID No.21로서 서열목록에서 확인되는 올리고누클레오티드로 증폭시켰다.
MDH 유전자 + 유전자의 3' 영역에 있는 6개의 히스티딘 서열 및 3' 단부에 있는 DEN-2로부터의 E 단편의 서열을 함유하는 벡터는 pLL3 플라스미드의 Xba /Xba I 분해에 의해 제조하였다. 그 결과, 동일한 MDH 유전자에 융합된, 혈청형 2 및 4로부터의 E 단백질의 2개의 영역이 수득되었다. 연결시에, 잠재적인 재조합체를 제한 효소 분해에 의해 분석하였고, 포지티브 클론을 시퀀싱하여 접합부를 검사하 였다. 컴피턴트 세포 MM294를 pD4D2 (도 13 및 SEQ ID No.53)로 일컬어지는 선택된 클론으로 형질전환시켰다. 콜로니를 LB 배지에서 성장시키고, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과 110kDA 밴드가 수득되었는데, 이는 전체 세포 단백질의 20%를 차지하였다. 수득된 단백질의 크기는 MDH 단백질과 뎅기 바이러스로부터의 DENe 단백질의 2개의 단편의 합에 해당하였다. 상기 단백질은 HMAF에 함유된 폴리클로날 항체 항-DEN-2 및 항-DEN-4에 의해 인식되었다. 이러한 단백질을 PD4D2 (SEQ ID No.54)로 명명하였다.
실시예 50. PD4D2 단백질의 정제
pD4D2로 형질전환시키고 37℃에서 성장시킨 대장균 균주로부터 수득한 바이오매스를 프렌치 프레스로 파괴하였다. 재조합 단백질을 가용성 또는 불용성 형태로 수득하였다. 펠레트로부터, 단백질을 우레아 6M로 추출하고, PD4D2 단백질을 함유하는 상층액을 G-25 컬럼상에 로딩하여 카오트로픽 물질을 제거하였다. 그 후, 수득된 분획을 Cu++ 이온의 존재하에서 킬레이팅-세파로오스 FF 컬럼 (Pharmacia, UK)상에 로딩하였다. 세척 단계를 이미다졸 30mM로 수행하고, 단백질을 이미다졸 250mM로 용리하였다. 최종적으로, 순수한 제제를 G-25 컬럼상에 로딩하여 포뮬레이션 완충액 중의 단백질을 수득하고, 이를 면역학적 실험을 위해 사용하였다.
실시예 51. PD4D2의 항원성 특징화
PD4D2의 정제된 분획을 다양한 폴리클로날 혈청 및/또는 뮤린 모노클로날 항 체에 의한 인식 뿐만 아니라 뎅기에 대한 포지티브 인간 혈청에 의한 인식에 의해 특징화하였다 (표 61).
도트 블로팅에서 최대 인식은 HMAF 항-DEN-2 및 항-DEN-4로 수득되었다. 나머지 2가지 혈청형의 인식은 혈청형 2 및 4의 경우 보다 낮았다. 황열 바이러스 및 세인트루이스 뇌염 바이러스와 같은 그 밖의 플라비바이러스에 의해 생성된 항체는 인식을 전혀 나타내지 못했다. 다른 한편, Mab 3H5는 실제로 PLL2 및 PLL3에 대해 수득된 반응성과 유사한 반응성을 지녔다. 최종적으로, DEN-2 및 DEN-4에 대한 고역가 및 저역가 인간 혈청에 대한 반응성이 측정되었고, 둘 모두의 경우에 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅에 의해 상당한 신호를 수득하였다.
표 61. 모노클로날 및 폴리클로날 항체에 대한 PD4D2 단백질의 반응성.
Abs** 특이성*** PID3
HMAF DEN-1 -
HMAF DEN-2 +++
HMAF DEN-3 -
HMAF DEN-4 +++
HMAF EEE -
HMAF YFV -
HMAF SLV -
Mab 3H5 NT -
* 정제된 PD4D2의 총 10㎍이 적용되었다. 수득된 신호의 강도는 + 내지 ++로 평가되었다.
** HMAF는 1:100의 희석률로 사용된 반면, Mab 3H5는 1:1000의 희석률로 사용되었다.
*** EEE: 말 뇌염 바이러스. YFV: 황열 바이러스. SLV: 세인트루이스 뇌염 바이러스. NT: 중화 특이적-혈청형.
실시예 52. PD4D2에 의해 생성된 항체 반응의 특징화
총 25마리의 Balb/c 마우스를 프로인트 보조제 중의 20ug의 정제된 PD4D2로 복강내 면역시키고; 4회 투여 후 10마리로부터 채혈하여 항체 항-DEN을 ELISA에 의해 평가하였다. DEN-2 및 DEN-4에 대해서는 높은 항체 역가가 수득되었지만, 나머지 혈청형에 대한 반응성은 수득되지 않았다 (표 62 및 표 65). 또한, 혈구응집 억제 검정 (HI)을 수행한 결과, DEN-2 및 DEN-4에 대해서는 포지티브 역가만이 관찰되었다 (표 63 및 표 65). 최종적으로, 시험관내 중화 검정을 수행한 결과, DEN-2에 대해 >1:1280 및 DEN-4에 대해 >1:1280의 중화 역가가 수득되었다 (표 64). 나머지 혈청형에 대한 바이러스 감염의 중화는 관찰되지 않았다 (표 65).
표 62. PD4D2에 의한 마우스의 면역시에 수득된 혈청으로부터의 DEN-2 및 DEN-4에 대한 항체 역가
마우스 ELISA에 의한 역가 (PD4D2) ELISA에 의한 역가 PBS C(-)
항-DEN-4 항-DEN-2 항-DEN-4 항-DEN-2
1 >1:128000 >1:128000 <1:100 <1:100
2 1:128000 1:128000 <1:100 <1:100
3 >1:128000 >1:128000 <1:100 <1:100
4 >1:128000 >1:128000 <1:100 <1:100
5 1:64000 >1:128000 <1:100 <1:100
6 >1:128000 1:128000 <1:100 <1:100
7 1:64000 >1:128000 <1:100 <1:100
8 >1:128000 >1:128000 <1:100 <1:100
9 >1:128000 1:128000 <1:100 <1:100
10 1:128000 >1:128000 <1:100 <1:100
표 63. PD4D2로 면역시킨 동물의 혈청의 HI에 의한 역가
마우스 HI에 의한 역가 (PD4D2) HI에 의한 역가 PBS C(-)
항-DEN-4 항-DEN-2 항-DEN-4 항-DEN-2
1 >1:640 >1:640 <1:5 <1:5
2 >1:640 >1:640 <1:5 <1:5
3 >1:640 1:320 <1:5 <1:5
4 >1:640 >1:640 <1:5 <1:5
5 1:320 1:640 <1:5 <1:5
6 >1:640 >1:640 <1:5 <1:5
7 >1:640 >1:640 <1:5 <1:5
8 1:320 1:320 <1:5 <1:5
9 1:320 1:320 <1:5 <1:5
10 >1:640 >1:640 <1:5 <1:5
* HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
표 64. PD4D2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
마우스 중화 역가* (PD4D2) 중화 역가 PBS C(-)
항-DEN-4 항-DEN-2 항-DEN-4 항-DEN-2
1 >1:1280 >1:1280 <1:5 <1:5
2 >1:1280 >1:1280 <1:5 <1:5
3 1:1280 1:1280 <1:5 <1:5
4 >1:1280 >1:1280 <1:5 <1:5
5 1:640 1:1280 <1:5 <1:5
6 >1:1280 >1:1280 <1:5 <1:5
7 >1:1280 >1:1280 <1:5 <1:5
8 1:640 >1:1280 <1:5 <1:5
9 >1:1280 >1:1280 <1:5 <1:5
10 >1:1280 >1:1280 <1:5 <1:5
* 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
표 65. PD4D2로 면역시킨 동물의 혈청을 사용한 ELISA, HI 및 바이러스 중화에 의한 모든 바이러스 혈청형에 대한 교차반응성 검정.
혈청의 혼합물* ELISA (항-DEN-1) ELISA (항-DEN-2) ELISA (항-DEN-3) ELISA (항-DEN-4)
1 (PD4D2) <1/100 >1:128000 <1/100 1:64000
2 (PD4D2) <1/100 >1:128000 <1/100 >1:128000
혈청의 혼합물* HI** 항-DEN-1 HI 항-DEN-2 HI 항-DEN-3 HI 항-DEN-4
PD4D2 <1:5 >1:320 <1:5 >1:320
혈청의 혼합물* 중화 역가*** 항-DEN-1 중화 역가 항-DEN-2 중화 역가 항-DEN-3 중화 역가 항-DEN-4
1 (PD4D2) <1:5 >1:1280 <1:5 >1:1280
2 (PD4D2) <1:5 >1:1280 <1:5 >1:1280
* 각각의 혼합물은 3가지 혈청에 의해 형성되었다.
** HI 역가는 8개의 혈구응집 바이러스 단위에 대해 거위 적혈구의 혈구응집을 억제할 수 있는 최대 희석률로서 정의되었다.
*** 중화 역가는 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 나타내는 혈청의 최대 희석률로서 정의되었다.
실시예 53. 방어 검정
동종 치사 DEN에 의한 공격시에 모든 검정된 변이체로 면역된 마우스에 부여되는 방어를 평가하기 위해, 각각의 군 당 15마리의 마우스를 사용하였다. 각각의 동물에 두개내 접종에 의해 100 LD50의 치사 DEN의 1회 용량을 투여하고, 21일 동안 관찰하여 치사율을 조사하였다. 포지티브 대조군으로서, 4가지 바이러스 제제 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4)로 면역시킨 15마리의 마우스의 그룹을 사용하였다. 이러한 대조군 중의 모든 마우스가 생존한 반면, 네거티브 대조 그룹의 마우스는 공격 후 7 내지 11일 사이에 병이 들었고, 이로써 100%의 치사율을 달성하였다. 최종적으로, 실험에서 융합 단백질로 면역된 그룹은 80% 내지 100%의 방어를 나타냈으며, 모든 경우에 대조 그룹과 비교하여 현저한 차이가 발견되었다 (표 66).
표 66. 동종 치사 뎅기 바이러스에 의한 공격시에 검정된 단백질 변이체로 면역된 마우스의 생존율
면역원 생존율*
PBS 0
DEN-1 100
DEN-2 100
DEN-3 100
DEN-4 100
PLL1 86
PLL2 100
PLL3 100
PLH1 80
PLH2 100
PLH3 100
PAZ1 80
PAZ2 100
PAZ3 100
PID1 86
PID2 100
PID3 100
PD4D2 100 (DEN-4)
100 (DEN-2)
* (생존 마우스 수)/(전체 마우스 수)가 계산되었다. 생존 마우스의 데이터는 공격 후 21일째에 수집하였다. PD4D2로 면역된 마우스의 경우, 15마리는 DEN-4로 공격하고, 15마리는 DEN-2로 공격하였다.
실시예 54. 림프구증식 반응
DEN-2로부터의 E 단편을 함유하는 키메라 단백질 (PLL1, PLL2 및 PLL3)로 면역시킨 다양한 그룹 및 플라세보 그룹의 동물들을 최종 투여 후 15일째에 치사시켰다. 그 후, 동물들의 비장을 수거하여 뎅기 바이러스의 4가지 혈청형에 대한 림프구증식 반응을 조사하였다. 표 67은 수득된 자극 지수의 결과를 나타내는데, 이는 혈청형 특이적 반응이 달성되었음을 입증해준다.
표 67. PLL1, PLL2 및 PLL3으로 면역시킨 마우스로부터의 림프구의 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 자극 지수.
PLL1 PLL2 PLL3 C(-)
DEN-1 1.3* 1.0 0.8 1.2
DEN-2 12.5 10.3 8.9 1.4
DEN-3 1.0 1.6 1.8 1.4
DEN-4 1.7 1.5 1.7 1.1
대조 항원 1.1 1.0 1.3 0.9
PHA** 13.3 16.5 11.1 12.0
* 자극 지수: DNA의 자발적 합성에 대한 샘플의 분 당 카운트 대 대조군의 분 당 카운트의 비
** 마이토젠: 피토헤마글루티닌
SEQUENCE LIST <110> CENTER FOR GENETIC ENGINEERING AND BIOTECNOLOGY <120> CHIMERIC CHAINS THAT CODING FOR PROTEINS THAT INDUCE EFFECTS DIRECTED AGAINST VIRUSES. <130> Dengue <140> <141> <160> 54 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <223> Sequence of the Xba-I primer for the amplification of DENe-2 fragment <400> 1 cttctagaca ggctgcgcat ggaca 25 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(29) <223> Sequence of the Bam-HI primer for the amplification of DENe-2 fragment <400> 2 gtggatcctt accctcccag gcttccaaa 29 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <223> Sequence of the Eco-RI primer for the amplification of DENe-2 fragment <400> 3 atgaattcac gcctcccaga gatcc 25 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <223> Sequence of the Bam-HI primer for the amplification of DENe-2 fragment <400> 4 cttggatcca ggctgagaat g 21 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(31) <223> Sequence of the Bam-HI primer for the amplification of DENe-2 fragment <400> 5 gaggatcctt aaccacccag agacccaaaa t 31 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <223> Sequence of the Xba-I primer for the amplification of DENe-1 fragment <400> 6 cttctagaca ggctcaaaat ggata 25 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(28) <223> Sequence of the Bam-HI primer for the amplification of DENe-1 fragment <400> 7 gaggatcctt acccgccaat agaaccga 28 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <223> Sequence of the Eco-RI primer for the amplification of DENe-1 fragment <400> 8 acgaattcac ccctcctata gatcc 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(24) <223> Sequence of the Bam-HI primer for the amplification of DENe-1 fragment <400> 9 acaccttgga tccagactaa aaat 24 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(26) <223> Sequence of the Bam-HI primer for the amplification of DENe-1 fragment <400> 10 ccggatccgt gaattaccca cctata 26 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(29) <223> Sequence of the Xba-I primer for the amplification of DENe-3 fragment <400> 11 tttctagata gactcaagat ggacaaatt 29 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(28) <223> Sequence of the Bam-HI primer for the amplification of DENe-3 fragment <400> 12 gaggatcctt aaccacccac tgaaccaa 28 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <223> Sequence of the Eco-RI primer for the amplification of DENe-3 fragment <400> 13 aagaattcac accacccaca gatcc 25 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(23) <223> Sequence of the Bam-HI primer for the amplification of DENe-3 fragment <400> 14 acttaggatc cagactcaag atg 23 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(26) <223> Sequence of the Bam-HI primer for the amplification of DENe-3 fragment <400> 15 gaggatcctt aaccacccac tgaacc 26 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(30) <223> Sequence of the Xba-I primer for the amplification of DENe-4 fragment <400> 16 cttctagaca aagtgcgtat ggagaaattg 30 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(28) <223> Sequence of the Bam-HI primer for the amplification of DENe-4 fragment <400> 17 gaggatcctt aaccaccaac agaaccaa 28 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <223> Sequence of the Eco-RI primer for the amplification of DENe-4 fragment <400> 18 atgaattcag tccaccaacg ctacc 25 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(27) <223> Sequence of the Bam-HI primer for the amplification of DENe-4 fragment <400> 19 ggccatctag gatccaaagt gcgtatg 27 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(28) <223> Sequence of the Bam-HI primer for the amplification of DENe-4 fragment <400> 20 gaggatcctt agccaccaac cgaaccaa 28 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(26) <223> Sequence of the primer Xba-I for the amplification of DENe-4 fragment <400> 21 attctagaag accaccaacg gaacca 26 <210> 22 <211> 429 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(426) <223> Nucleotidic sequence coding for the aminoacids 286 to 426 of DEN-2 envelope protein <400> 22 gacaggctga gaatggacaa actacagctc aaaggaatgt catactctat gtgtacagga 60 aagtttaaaa ttgtgaagga aatagcagaa acacaacatg gaacaatagt tatcagagta 120 caatatgaag gggacggctc tccatgtaag atcccttttg agataatgga tttggaaaaa 180 agacacgtct taggtcgcct gattacagtt aacccgatcg taacagaaaa agatagccca 240 gtcaacatag aagcagaacc tccattcgga gacagctaca tcatcatagg agtagagccg 300 ggacaattga aactcaactg gtttaagaaa ggaagttcca tcggccaaat gtttgagaca 360 acaatgagag gagcgaagag aatggccatt ttaggtgaca cagcctggga ttttggatcc 420 ctgggagga 429 <210> 23 <211> 168 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(168) <223> Nucleotidic sequence coding for the first 45 aminoacids of the MDH. <400> 23 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagac 168 <210> 24 <211> 603 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(603) <223> Nucleotidic sequence coding for the quimeric protein in the plasmid pLL1 <400> 24 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagacag gctgcgcatg 180 gacaaactac agctcaaagg aatgtcatac tctatgtgta caggaaagtt taaaattgtg 240 aaggaaatag cagaaacaca acatggaaca atagttatca gagtacaata tgaaggggac 300 ggctctccat gtaagatccc ttttgagata atggatttgg aaaaaagaca cgtcttaggt 360 cgcctgatta cagttaaccc gatcgtaaca gaaaaagata gcccagtcaa catagaagca 420 gaacctccat tcggagacag ctacatcatc ataggagtag agccgggaca attgaaactc 480 aactggttta agaaaggaag ttccatcggc caaatgtttg agacaacaat gagaggagcg 540 aagagaatgg ccattttagg tgacacagcc tgggattttg gaagcctggg agggtaagga 600 tcc 603 <210> 25 <211> 195 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(195) <223> Aminoacidic sequence of the PLL1 protein <400> 25 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly 50 55 60 Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile 65 70 75 80 Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly 85 90 95 Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys 100 105 110 Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu 115 120 125 Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser 130 135 140 Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe 145 150 155 160 Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly 165 170 175 Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser 180 185 190 Leu Gly Gly 195 <210> 26 <211> 1851 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(1851) <223> Nucleotidic sequence of the MDH in the plasmid pM84 His. <400> 26 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagaa 180 gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatgaatt cgatggacgt acctgctgaa 240 gttgcaggcg tagtcaaaga agttaaagtt aaagtcggcg acaaaatctc tgaaggtggt 300 ttgattgtcg tcgttgaagc tgaaggcacg gcagccgctc ctaaagccga agcggctgcc 360 gccccggcgc aagaagcccc taaagctgcc gctcctgctc cgcaagccgc gcaattcggc 420 ggttctgccg atgccgagta cgacgtggtc gtattgggtg gcggtcccgg cggttactcc 480 gctgcatttg ccgctgccga tgaaggcttg aaagtcgcca tcgtcgaacg ttacaaaact 540 ttgggcggcg tttgcctgaa cgtcggctgt atcccttcca aagccttgtt gcacaatgcc 600 gccgttatcg acgaagtgcg ccacttggct gccaacggta tcaaataccc cgagccggaa 660 ctcgacatcg atatgcttcg cgcctacaaa gacggcgtag tttcccgcct cacgggcggt 720 ttggcaggta tggcgaaaag ccgtaaagtg gacgttatcc aaggcgacgg gcaattctta 780 gatccgcacc acttggaagt gtcgctgact gccggcgacg cgtacgaaca ggcagcccct 840 accggcgaga aaaaaatcgt tgccttcaaa aactgtatca ttgcagcagg cagccgcgta 900 accaaactgc ctttcattcc tgaagatccg cgcatcatcg attccagcgg cgcattggct 960 ctgaaagaag taccgggcaa actgctgatt atcggcggcg gcattatcgg cctcgagatg 1020 ggtacggttt acagcacgct gggttcgcgt ttggatgtgg ttgaaatgat ggacggcctg 1080 atgcaaggcg cagaccgcga tttggtaaaa gtatggcaaa aacaaaacga ataccgtttt 1140 gacaacatta tggtcaacac caaaaccgtt gcagttgagc cgaaagaaga cggcgtttac 1200 gttacctttg aaggcgcgaa cgcgcctaaa gagccgcaac gctacgatgc cgtattggtt 1260 gccgccggcc gcgcgcccaa cggcaaactc atcagcgcgg aaaaagcagg cgttgccgta 1320 accgatcgcg gcttcatcga agtggacaaa caaatgcgta ccaatgtgcc gcacatctac 1380 gccatcggcg acatcgtcgg tcagccgatg ttggcgcaca aagccgttca cgaaggccac 1440 gttgccgccg aaaactgcgc cggccacaaa gcctacttcg acgcacgcgt gattccgggc 1500 gttgcctaca cttcccccga agtggcgtgg gtgggcgaaa ccgaactgtc cgccaaagcc 1560 tccggccgca aaatcaccaa agccaacttc ccgtgggcgg cttccggccg tgcgattgcc 1620 aacggttgcg acaagccgtt taccaagctg atttttgatg ccgaaaccgg ccgcatcatc 1680 ggcggcggca ttgtcggtcc gaacggtggc gatatgatcg gcgaagtctg ccttgccatc 1740 gaaatgggct gcgacgcggc agacatcggc aaaaccatcc acccgcaccc gggcgaatcc 1800 atcggtatgg cggcggaagt ggcattgggt acttgtaccg acaaaaaaaa a 1851 <210> 27 <211> 2253 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(2253) <223> Nucleotidic sequence of the quimeric protein in the plasmid pLL2. <400> 27 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180 aggctgcgca tggacaaact acagctcaaa ggaatgtcat actctatgtg tacaggaaag 240 tttaaaattg tgaaggaaat agcagaaaca caacatggaa caatagttat cagagtacaa 300 tatgaagggg acggctctcc atgtaagatc ccttttgaga taatggattt ggaaaaaaga 360 cacgtcttag gtcgcctgat tacagttaac ccgatcgtaa cagaaaaaga tagcccagtc 420 aacatagaag cagaacctcc attcggagac agctacatca tcataggagt agagccggga 480 caattgaaac tcaactggtt taagaaagga agttccatcg gccaaatgtt tgagacaaca 540 atgagaggag cgaagagaat ggccatttta ggtgacacag cctgggattt tggatctctg 600 ggaggcgtga attcgatgaa ttcgatggac gtacctgctg aagttgcagg cgtagtcaaa 660 gaagttaaag ttaaagtcgg cgacaaaatc tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720 gctgaaggca cggcagccgc tcctaaagcc gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780 cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc gcgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840 tacgacgtgg tcgtattggg tggcggtccc ggcggttact ccgctgcatt tgccgctgcc 900 gatgaaggct tgaaagtcgc catcgtcgaa cgttacaaaa ctttgggcgg cgtttgcctg 960 aacgtcggct gtatcccttc caaagccttg ttgcacaatg ccgccgttat cgacgaagtg 1020 cgccacttgg ctgccaacgg tatcaaatac cccgagccgg aactcgacat cgatatgctt 1080 cgcgcctaca aagacggcgt agtttcccgc ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 1140 agccgtaaag tggacgttat ccaaggcgac gggcaattct tagatccgca ccacttggaa 1200 gtgtcgctga ctgccggcga cgcgtacgaa caggcagccc ctaccggcga gaaaaaaatc 1260 gttgccttca aaaactgtat cattgcagca ggcagccgcg taaccaaact gcctttcatt 1320 cctgaagatc cgcgcatcat cgattccagc ggcgcattgg ctctgaaaga agtaccgggc 1380 aaactgctga ttatcggcgg cggcattatc ggcctcgaga tgggtacggt ttacagcacg 1440 ctgggttcgc gtttggatgt ggttgaaatg atggacggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 1500 gatttggtaa aagtatggca aaaacaaaac gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560 accaaaaccg ttgcagttga gccgaaagaa gacggcgttt acgttacctt tgaaggcgcg 1620 aacgcgccta aagagccgca acgctacgat gccgtattgg ttgccgccgg ccgcgcgccc 1680 aacggcaaac tcatcagcgc ggaaaaagca ggcgttgccg taaccgatcg cggcttcatc 1740 gaagtggaca aacaaatgcg taccaatgtg ccgcacatct acgccatcgg cgacatcgtc 1800 ggtcagccga tgttggcgca caaagccgtt cacgaaggcc acgttgccgc cgaaaactgc 1860 gccggccaca aagcctactt cgacgcacgc gtgattccgg gcgttgccta cacttccccc 1920 gaagtggcgt gggtgggcga aaccgaactg tccgccaaag cctccggccg caaaatcacc 1980 aaagccaact tcccgtgggc ggcttccggc cgtgcgattg ccaacggttg cgacaagccg 2040 tttaccaagc tgatttttga tgccgaaacc ggccgcatca tcggcggcgg cattgtcggt 2100 ccgaacggtg gcgatatgat cggcgaagtc tgccttgcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160 gcagacatcg gcaaaaccat ccacccgcac ccgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa 2220 gtggcattgg gtacttgtac cgacaaaaaa aaa 2253 <210> 28 <211> 748 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(748) <223> Aminoacidic sequence of PLL2. <400> 28 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly 50 55 60 Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile 65 70 75 80 Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly 85 90 95 Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys 100 105 110 Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu 115 120 125 Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser 130 135 140 Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe 145 150 155 160 Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly 165 170 175 Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser 180 185 190 Leu Gly Gly Val Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val 195 200 205 Ala Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser 210 215 220 Glu Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala 225 230 235 240 Pro Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala 245 250 255 Ala Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala 260 265 270 Glu Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala 275 280 285 Ala Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg 290 295 300 Tyr Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser 305 310 315 320 Lys Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu 325 330 335 Ala Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met 340 345 350 Leu Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu 355 360 365 Ala Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly 370 375 380 Gln Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp 385 390 395 400 Ala Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe 405 410 415 Lys Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe 420 425 430 Ile Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu 435 440 445 Lys Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly 450 455 460 Leu Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val 465 470 475 480 Val Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val 485 490 495 Lys Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val 500 505 510 Asn Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val 515 520 525 Thr Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala 530 535 540 Val Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala 545 550 555 560 Glu Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp 565 570 575 Lys Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile 580 585 590 Val Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val 595 600 605 Ala Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val 610 615 620 Ile Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu 625 630 635 640 Thr Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn 645 650 655 Phe Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys 660 665 670 Pro Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly 675 680 685 Gly Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys 690 695 700 Leu Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile 705 710 715 720 His Pro His Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu 725 730 735 Gly Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys 740 745 <210> 29 <211> 1821 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(1821) <223> Nucleotidic sequence of the MDH in the plasmid pD4 <400> 29 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180 gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240 ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300 gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360 ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420 tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480 aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540 aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600 ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660 ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720 ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780 gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840 cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900 ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960 gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020 ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080 cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140 gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200 ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260 gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320 atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380 ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500 aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620 atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680 gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740 ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800 ccgcaaaaga aaaaaggatc c 1821 <210> 30 <211> 2259 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(2259) <223> Nucleotidic sequence coding for the quimeric protein in the plasmid pLL3 <400> 30 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180 gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240 ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300 gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360 ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420 tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480 aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540 aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600 ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660 ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720 ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780 gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840 cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900 ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960 gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020 ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080 cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140 gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200 ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260 gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320 atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380 ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500 aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620 atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680 gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740 ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800 ccgcaaaaga aaaaaggatc cgacaggctg agaatggaca aactacagct caaaggaatg 1860 tcatactcta tgtgtacagg aaagtttaaa attgtgaagg aaatagcaga aacacaacat 1920 ggaacaatag ttatcagagt acaatatgaa ggggacggct ctccatgtaa gatccctttt 1980 gagataatgg atttggaaaa aagacacgtc ttaggtcgcc tgattacagt taacccgatc 2040 gtaacagaaa aagatagccc agtcaacata gaagcagaac ctccattcgg agacagctac 2100 atcatcatag gagtagagcc gggacaattg aaactcaact ggtttaagaa aggaagttcc 2160 atcggccaaa tgtttgagac aacaatgaga ggagcgaaga gaatggccat tttaggtgac 2220 acagcctggg attttgggtc tctgggtggt taaggatcc 2259 <210> 31 <211> 745 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(745) <223> Aminoacidic sequence of PLL3 <400> 31 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Thr Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val 50 55 60 Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala 85 90 95 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro 100 105 110 Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp 115 120 125 Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala 130 135 140 Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr 145 150 155 160 Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu 165 170 175 Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn 180 185 190 Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala 195 200 205 Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met 210 215 220 Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu 225 230 235 240 Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu 245 250 255 Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys 260 265 270 Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu 275 280 285 Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val 290 295 300 Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met 305 310 315 320 Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met 325 330 335 Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp 340 345 350 Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys 355 360 365 Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu 370 375 380 Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val 385 390 395 400 Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala 405 410 415 Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met 420 425 430 Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln 435 440 445 Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu 450 455 460 Asn Cys Ala Gly His Lys Ala 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420 ggagggtaa 429 <210> 33 <211> 615 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(615) <223> Nucleotidic sequence coding for the quimeric protein in the plasmid pLH1 <400> 33 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180 aggctcaaaa tggataaact gactttaaaa ggggtatcat atgtaatgtg cacagggtca 240 ttcaagttag agaaggaagt ggctgagacc cagcatggaa ctgttctagt gcaggttaaa 300 tacgaaggaa cagatgcacc atgcaagatc cccttctcgt cccaagatga gaaaggagta 360 acccagaatg ggagattgat aacagccaac cccatagtca ttgacaaaga aaaaccagtc 420 aacattgaag cggagccacc ttttggtgag agctatattg tggtaggagc aggtgaaaaa 480 gctttgaaac taagctggtt caagaaggga agcagtatag ggaaaatgtt tgaagcaact 540 gcccgtggag cacgaaggat ggccatcctg ggagacaccg catgggactt cggttctatt 600 ggcgggtaag gatcc 615 <210> 34 <211> 174 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(174) <223> Aminoacidic sequence of the PLH1 <400> 34 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln 50 55 60 His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Gln Gly Thr Asp Ala Pro 65 70 75 80 Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn 85 90 95 Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val 100 105 110 Asn Ile Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly 115 120 125 Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Gln Cys Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser 130 135 140 Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala 145 150 155 160 Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly 165 170 <210> 35 <211> 2253 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(2253) <223> Nucleotidic sequence coding for the quimeric protein in the plasmid pLH2 <400> 35 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180 aggctcaaaa tggataaact gactttaaaa ggggtatcat atgtaatgtg cacagggtca 240 ttcaagttag agaaggaagt ggctgagacc cagcatggaa ctgttctagt gcaggttaaa 300 tacgaaggaa cagatgcacc atgcaagatc cccttctcgt cccaagatga gaaaggagta 360 acccagaatg ggagattgat aacagccaac cccatagtca ttgacaaaga aaaaccagtc 420 aacattgaag cggagccacc ttttggtgag agctatattg tggtaggagc aggtgaaaaa 480 gctttgaaac taagctggtt caagaaggga agcagtatag ggaaaatgtt tgaagcaact 540 gcccgtggag cacgaaggat ggccatcctg ggagacaccg catgggactt cggatctata 600 ggaggggtga attcgatgaa ttcgatggac gtacctgctg aagttgcagg cgtagtcaaa 660 gaagttaaag ttaaagtcgg cgacaaaatc tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720 gctgaaggca cggcagccgc tcctaaagcc gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780 cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc gcgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840 tacgacgtgg tcgtattggg tggcggtccc ggcggttact ccgctgcatt tgccgctgcc 900 gatgaaggct tgaaagtcgc catcgtcgaa cgttacaaaa ctttgggcgg cgtttgcctg 960 aacgtcggct gtatcccttc caaagccttg ttgcacaatg ccgccgttat cgacgaagtg 1020 cgccacttgg ctgccaacgg tatcaaatac cccgagccgg aactcgacat cgatatgctt 1080 cgcgcctaca aagacggcgt agtttcccgc ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 1140 agccgtaaag tggacgttat ccaaggcgac gggcaattct tagatccgca ccacttggaa 1200 gtgtcgctga ctgccggcga cgcgtacgaa caggcagccc ctaccggcga gaaaaaaatc 1260 gttgccttca aaaactgtat cattgcagca ggcagccgcg taaccaaact gcctttcatt 1320 cctgaagatc cgcgcatcat cgattccagc ggcgcattgg ctctgaaaga agtaccgggc 1380 aaactgctga ttatcggcgg cggcattatc ggcctcgaga tgggtacggt ttacagcacg 1440 ctgggttcgc gtttggatgt ggttgaaatg atggacggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 1500 gatttggtaa aagtatggca aaaacaaaac gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560 accaaaaccg ttgcagttga gccgaaagaa gacggcgttt acgttacctt tgaaggcgcg 1620 aacgcgccta aagagccgca acgctacgat gccgtattgg ttgccgccgg ccgcgcgccc 1680 aacggcaaac tcatcagcgc ggaaaaagca ggcgttgccg taaccgatcg cggcttcatc 1740 gaagtggaca aacaaatgcg taccaatgtg ccgcacatct acgccatcgg cgacatcgtc 1800 ggtcagccga tgttggcgca caaagccgtt cacgaaggcc acgttgccgc cgaaaactgc 1860 gccggccaca aagcctactt cgacgcacgc gtgattccgg gcgttgccta cacttccccc 1920 gaagtggcgt gggtgggcga aaccgaactg tccgccaaag cctccggccg caaaatcacc 1980 aaagccaact tcccgtgggc ggcttccggc cgtgcgattg ccaacggttg cgacaagccg 2040 tttaccaagc tgatttttga tgccgaaacc ggccgcatca tcggcggcgg cattgtcggt 2100 ccgaacggtg gcgatatgat cggcgaagtc tgccttgcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160 gcagacatcg gcaaaaccat ccacccgcac ccgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa 2220 gtggcattgg gtacttgtac cgacaaaaaa aaa 2253 <210> 36 <211> 727 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(727) <223> Aminoacidic sequence of the PLH2 <400> 36 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln 50 55 60 His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Gln Gly Thr Asp Ala Pro 65 70 75 80 Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn 85 90 95 Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val 100 105 110 Asn Ile Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly 115 120 125 Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Gln Cys Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser 130 135 140 Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala 145 150 155 160 Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Asn 165 170 175 Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val Val Lys 180 185 190 Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly Leu Ile 195 200 205 Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala Glu Ala 210 215 220 Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro Ala Pro 225 230 235 240 Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp Val Val 245 250 255 Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala Ala Ala 260 265 270 Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr Leu Gly 275 280 285 Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His 290 295 300 Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn Gly Ile 305 310 315 320 Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala Tyr Lys 325 330 335 Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys 340 345 350 Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu Asp Pro 355 360 365 His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu Gln Ala 370 375 380 Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys Ile Ile 385 390 395 400 Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu Asp Pro 405 410 415 Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val Pro Gly 420 425 430 Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met Gly Thr 435 440 445 Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu 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tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480 aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540 aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600 ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660 ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720 ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780 gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840 cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900 ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960 gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020 ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080 cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140 gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200 ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260 gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320 atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380 ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500 aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620 atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680 gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740 ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800 ccgcaaaaga aaaaaggatc cagactaaaa atggataaac tgactttaaa aggggtatca 1860 tatgtaatgt gcacagggtc attcaagtta gagaaggaag tggctgagac ccagcatgga 1920 actgttctag tgcaggttaa atacgaagga acagatgcac catgcaagat ccccttctcg 1980 tcccaagatg agaaaggagt aacccagaat gggagattga taacagccaa ccccatagtc 2040 attgacaaag aaaaaccagt caacattgaa gcggagccac cttttggtga gagctatatt 2100 gtggtaggag caggtgaaaa agctttgaaa ctaagctggt tcaagaaggg aagcagtata 2160 gggaaaatgt ttgaagcaac tgcccgtgga gcacgaagga tggccatcct gggagacacc 2220 gcatgggact tcggttctat aggtgggtaa 2250 <210> 38 <211> 724 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(724) <223> Aminoacidic sequence of the PLH3 <400> 38 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Thr Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val 50 55 60 Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala 85 90 95 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro 100 105 110 Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp 115 120 125 Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala 130 135 140 Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu 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tttgtgttga agaaagaagt ctccgaaacg cagcatggga caatactcat taaggttgag 120 tacaaagggg aagatgcacc ctgcaagatt cctttctcca cggaggatgg acaagggaaa 180 gctcacaatg gcagactgat cacagccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 240 aacattgagg ctgaacctcc ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 300 gccctgaaaa tcaactggta caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccact 360 gccagaggtg caaggcgcat ggccatcttg ggagacacag cctgggactt tggatcagtg 420 ggtggt 426 <210> 40 <211> 615 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(615) <223> Nucleotidic sequence coding for the quimeric protein in the plasmid pAZ1 <400> 40 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagat 180 agactcaaga tggacaaatt gaaactcaag gggatgagct atgcaatgtg cttgaatacc 240 tttgtgttga agaaagaagt ctccgaaacg cagcatggga caatactcat taaggttgag 300 tacaaagggg aagatgcacc ctgcaagatt cctttctcca cggaggatgg acaagggaaa 360 gctcacaatg gcagactgat cacagccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 420 aacattgagg ctgaacctcc ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 480 gccctgaaaa tcaactggta caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccact 540 gccagaggtg caaggcgcat ggccatcttg ggagacacag cctgggactt tggttcagtg 600 ggtggttaag gatcc 615 <210> 41 <211> 194 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(194) <223> Aminoacidic sequence of the PAZ1 <400> 41 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly 50 55 60 Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val 65 70 75 80 Ser Glu Thr His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu 85 90 95 Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys 100 105 110 Ala His Asn Gly Arg 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ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 420 aacattgagg ctgaacctcc ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 480 gccctgaaaa tcaactggta caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccact 540 gccagaggtg caaggcgcat ggccatcttg ggagacacag cctgggactt tggatctgtg 600 ggtggtgtga attcgatgaa ttcgatggac gtacctgctg aagttgcagg cgtagtcaaa 660 gaagttaaag ttaaagtcgg cgacaaaatc tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720 gctgaaggca cggcagccgc tcctaaagcc gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780 cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc gcgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840 tacgacgtgg tcgtattggg tggcggtccc ggcggttact ccgctgcatt tgccgctgcc 900 gatgaaggct tgaaagtcgc catcgtcgaa cgttacaaaa ctttgggcgg cgtttgcctg 960 aacgtcggct gtatcccttc caaagccttg ttgcacaatg ccgccgttat cgacgaagtg 1020 cgccacttgg ctgccaacgg tatcaaatac cccgagccgg aactcgacat cgatatgctt 1080 cgcgcctaca aagacggcgt agtttcccgc ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 1140 agccgtaaag tggacgttat ccaaggcgac gggcaattct tagatccgca ccacttggaa 1200 gtgtcgctga ctgccggcga cgcgtacgaa caggcagccc ctaccggcga gaaaaaaatc 1260 gttgccttca aaaactgtat cattgcagca ggcagccgcg taaccaaact gcctttcatt 1320 cctgaagatc cgcgcatcat cgattccagc ggcgcattgg ctctgaaaga agtaccgggc 1380 aaactgctga ttatcggcgg cggcattatc ggcctcgaga tgggtacggt ttacagcacg 1440 ctgggttcgc gtttggatgt ggttgaaatg atggacggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 1500 gatttggtaa aagtatggca aaaacaaaac gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560 accaaaaccg ttgcagttga gccgaaagaa gacggcgttt acgttacctt tgaaggcgcg 1620 aacgcgccta aagagccgca acgctacgat gccgtattgg ttgccgccgg ccgcgcgccc 1680 aacggcaaac tcatcagcgc ggaaaaagca ggcgttgccg taaccgatcg cggcttcatc 1740 gaagtggaca aacaaatgcg taccaatgtg ccgcacatct acgccatcgg cgacatcgtc 1800 ggtcagccga tgttggcgca caaagccgtt cacgaaggcc acgttgccgc cgaaaactgc 1860 gccggccaca aagcctactt cgacgcacgc gtgattccgg gcgttgccta cacttccccc 1920 gaagtggcgt gggtgggcga aaccgaactg tccgccaaag cctccggccg caaaatcacc 1980 aaagccaact tcccgtgggc ggcttccggc cgtgcgattg ccaacggttg cgacaagccg 2040 tttaccaagc tgatttttga tgccgaaacc ggccgcatca tcggcggcgg cattgtcggt 2100 ccgaacggtg gcgatatgat cggcgaagtc tgccttgcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160 gcagacatcg gcaaaaccat ccacccgcac ccgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa 2220 gtggcattgg gtacttgtac cgacaaaaaa aaa 2253 <210> 43 <211> 747 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(747) <223> Aminoacidic sequence of the PAZ2 <400> 43 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly 50 55 60 Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val 65 70 75 80 Ser Glu Thr His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu 85 90 95 Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys 100 105 110 Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys 115 120 125 Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser 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<223> Nucleotidic sequence coding for the quimeric protein in the plasmid pAZ3 <400> 44 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180 gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240 ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300 gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360 ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420 tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480 aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540 aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600 ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660 ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720 ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780 gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840 cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900 ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960 gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020 ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080 cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140 gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200 ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260 gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320 atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380 ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500 aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620 atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680 gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740 ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800 ccgcaaaaga aaaaaggatc cagactcaag atggacaaat tgaaactcaa ggggatgagc 1860 tatgcaatgt gcttgaatac ctttgtgttg aagaaagaag tctccgaaac gcagcatggg 1920 acaatactca ttaaggttga gtacaaaggg gaagatgcac cctgcaagat tcctttctcc 1980 acggaggatg gacaagggaa agctcacaat ggcagactga tcacagccaa tccagtggtg 2040 accaagaagg aggagcctgt caacattgag gctgaacctc cttttgggga aagtaatata 2100 gtaattggaa ttggagacaa agccctgaaa atcaactggt acaggaaggg aagctcgatt 2160 gggaagatgt tcgaggccac tgccagaggt gcaaggcgca tggccatctt gggagacaca 2220 gcctgggact ttggttcagt gggtggttaa ggatcc 2256 <210> 45 <211> 744 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(744) <223> Aminoacidic sequence of the PAZ3 <400> 45 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His 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caggaaaggg agttccattg gcaagatgtt tgagtccaca 360 tacagaggtg caaaacgaat ggccattcta ggtgaaacag cttgggattt tggttccgtt 420 ggtgga 426 <210> 47 <211> 615 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(615) <223> Nucleotidic sequence coding for the quimeric protein in the plasmid pID1 <400> 47 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180 aaagtgcgta tggagaaatt gagaatcaag ggaatgtcat acacgatgtg ttcaggaaag 240 ttttcaattg acaaagagat ggcagaaaca cagcatggga caacagtggt gaaagtcaag 300 tatgaaggtg ctggagctcc gtgtaaagtc cccatagaga taagagatgt aaacaaggaa 360 aaagtggttg ggcgtatcat ctcatccacc cctttggctg agaataccaa cagtgtaacc 420 aacatagaat tagaaccccc ctttggggac agctacatag tgataggtgt tggaaacagc 480 gcattaacac tccattggtt caggaaaggg agttccattg gcaagatgtt tgagtccaca 540 tacagaggtg caaaacgaat ggccattcta ggtgaaacag cttgggattt tggttccgtt 600 ggtggataag gatcc 615 <210> 48 <211> 192 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(192) <223> Aminoacidic sequence of the PID1 <400> 48 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Thr Leu Asp Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser 50 55 60 Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu 65 70 75 80 Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly 85 90 95 Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys 100 105 110 Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn 115 120 125 Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Arg Pro Leu Asp Ser Tyr Ile Val 130 135 140 Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg 165 170 175 Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly 180 185 190 <210> 49 <211> 2241 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(2241) <223> Nucleotidic sequence coding for the quimeric protein in the plasmid pID2 <400> 49 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagacaa agtccgtatg 180 gagaaattga gaatcaaggg aatgtcatac acgatgtgtt caggaaagtt ttcaattgac 240 aaagagatgg cagaaacaca gcatgggaca acagtggtga aagtcaagta tgaaggtgct 300 ggagctccgt gtaaagtccc catagagata agagatgtaa acaaggaaaa agtggttggg 360 cgtatcatct catccacccc tttggctgag aataccaaca gtgtaaccaa catagaatta 420 gaacccccct ttggggacag ctacatagtg ataggtgttg gaaacagcgc attaacactc 480 cattggttca ggaaagggag ttccattggc aagatgtttg agtccacata cagaggtgca 540 aaacgaatgg ccattctagg tgaaacagct tgggattttg gtagcgttgg tggactgaat 600 tcgatgaatt cgatggacgt acctgctgaa gttgcaggcg tagtcaaaga agttaaagtt 660 aaagtcggcg acaaaatctc tgaaggtggt ttgattgtcg tcgttgaagc tgaaggcacg 720 gcagccgctc ctaaagccga agcggctgcc gccccggcgc aagaagcccc taaagctgcc 780 gctcctgctc cgcaagccgc gcaattcggc ggttctgccg atgccgagta cgacgtggtc 840 gtattgggtg gcggtcccgg cggttactcc gctgcatttg ccgctgccga tgaaggcttg 900 aaagtcgcca tcgtcgaacg ttacaaaact ttgggcggcg tttgcctgaa cgtcggctgt 960 atcccttcca aagccttgtt gcacaatgcc gccgttatcg acgaagtgcg ccacttggct 1020 gccaacggta tcaaataccc cgagccggaa ctcgacatcg atatgcttcg cgcctacaaa 1080 gacggcgtag tttcccgcct cacgggcggt ttggcaggta tggcgaaaag ccgtaaagtg 1140 gacgttatcc aaggcgacgg gcaattctta gatccgcacc acttggaagt gtcgctgact 1200 gccggcgacg cgtacgaaca ggcagcccct accggcgaga aaaaaatcgt tgccttcaaa 1260 aactgtatca ttgcagcagg cagccgcgta accaaactgc ctttcattcc tgaagatccg 1320 cgcatcatcg attccagcgg cgcattggct ctgaaagaag taccgggcaa actgctgatt 1380 atcggcggcg gcattatcgg cctcgagatg ggtacggttt acagcacgct gggttcgcgt 1440 ttggatgtgg ttgaaatgat ggacggcctg atgcaaggcg cagaccgcga tttggtaaaa 1500 gtatggcaaa aacaaaacga ataccgtttt gacaacatta tggtcaacac caaaaccgtt 1560 gcagttgagc cgaaagaaga cggcgtttac gttacctttg aaggcgcgaa cgcgcctaaa 1620 gagccgcaac gctacgatgc cgtattggtt gccgccggcc gcgcgcccaa cggcaaactc 1680 atcagcgcgg aaaaagcagg cgttgccgta accgatcgcg gcttcatcga agtggacaaa 1740 caaatgcgta ccaatgtgcc gcacatctac gccatcggcg acatcgtcgg tcagccgatg 1800 ttggcgcaca aagccgttca cgaaggccac gttgccgccg aaaactgcgc cggccacaaa 1860 gcctacttcg acgcacgcgt gattccgggc gttgcctaca cttcccccga agtggcgtgg 1920 gtgggcgaaa ccgaactgtc cgccaaagcc tccggccgca aaatcaccaa agccaacttc 1980 ccgtgggcgg cttccggccg tgcgattgcc aacggttgcg acaagccgtt taccaagctg 2040 atttttgatg ccgaaaccgg ccgcatcatc ggcggcggca ttgtcggtcc gaacggtggc 2100 gatatgatcg gcgaagtctg ccttgccatc gaaatgggct gcgacgcggc agacatcggc 2160 aaaaccatcc acccgcaccc gggcgaatcc atcggtatgg cggcggaagt ggcattgggt 2220 acttgtaccg acaaaaaaaa a 2241 <210> 50 <211> 747 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(747) <223> Aminoacidic sequence of the PID2 <400> 50 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly 50 55 60 Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met 65 70 75 80 Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly 85 90 95 Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys 100 105 110 Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn 115 120 125 Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Arg Pro Leu Asp Ser Tyr 130 135 140 Ile Val Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg 145 150 155 160 Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala 165 170 175 Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val 180 185 190 Gly Gly Leu Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala 195 200 205 Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu 210 215 220 Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro 225 230 235 240 Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala 245 250 255 Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu 260 265 270 Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala 275 280 285 Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr 290 295 300 Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys 305 310 315 320 Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala 325 330 335 Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu 340 345 350 Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala 355 360 365 Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln 370 375 380 Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala 385 390 395 400 Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys 405 410 415 Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile 420 425 430 Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys 435 440 445 Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu 450 455 460 Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val 465 470 475 480 Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys 485 490 495 Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn 500 505 510 Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr 515 520 525 Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val 530 535 540 Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu 545 550 555 560 Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys 565 570 575 Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val 580 585 590 Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala 595 600 605 Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile 610 615 620 Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr 625 630 635 640 Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe 645 650 655 Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro 660 665 670 Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly 675 680 685 Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu 690 695 700 Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His 705 710 715 720 Pro His Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly 725 730 735 Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys 740 745 <210> 51 <211> 2256 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(2256) <223> Nucleotidic sequence coding for the quimeric protein in the plasmid pID3 <400> 51 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180 gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240 ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300 gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360 ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420 tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480 aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540 aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600 ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660 ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720 ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780 gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840 cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900 ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960 gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020 ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080 cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140 gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200 ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260 gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320 atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380 ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500 aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620 atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680 gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740 ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800 ccgcaaaaga aaaaaggatc caaagtgcgt atggagaaat tgagaatcaa gggaatgtca 1860 tacacgatgt gttcaggaaa gttttcaatt gacaaagaga tggcagaaac acagcatggg 1920 acaacagtgg tgaaagtcaa gtatgaaggt gctggagctc cgtgtaaagt ccccatagag 1980 ataagagatg taaacaagga aaaagtggtt gggcgtatca tctcatccac ccctttggct 2040 gagaatacca acagtgtaac caacatagaa ttagaacccc cctttgggga cagctacata 2100 gtgataggtg ttggaaacag cgcattaaca ctccattggt tcaggaaagg gagttccatt 2160 ggcaagatgt ttgagtccac atacagaggt gcaaaacgaa tggccattct aggtgaaaca 2220 gcttgggatt ttggttcggt tggtggctaa ggatcc 2256 <210> 52 <211> 744 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(744) <223> Aminoacidic sequence of the PID3 <400> 52 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Thr Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val 50 55 60 Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala 85 90 95 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro 100 105 110 Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp 115 120 125 Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala 130 135 140 Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr 145 150 155 160 Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu 165 170 175 Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn 180 185 190 Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala 195 200 205 Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met 210 215 220 Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu 225 230 235 240 Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu 245 250 255 Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys 260 265 270 Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu 275 280 285 Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val 290 295 300 Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met 305 310 315 320 Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met 325 330 335 Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp 340 345 350 Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys 355 360 365 Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu 370 375 380 Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val 385 390 395 400 Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala 405 410 415 Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met 420 425 430 Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln 435 440 445 Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu 450 455 460 Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly 465 470 475 480 Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu 485 490 495 Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp 500 505 510 Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr 515 520 525 Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gly Ile 530 535 540 Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile 545 550 555 560 Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His 565 570 575 Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys 580 585 590 Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Lys Val Arg Met Glu 595 600 605 Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe 610 615 620 Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val 625 630 635 640 Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu 645 650 655 Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser 660 665 670 Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu 675 680 685 Arg Pro Leu Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu 690 695 700 Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu 705 710 715 720 Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala 725 730 735 Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly 740 <210> 53 <211> 2694 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(2694) <223> Nucleotidic sequence coding for the quimeric protein in the plasmid pD4D2 <400> 53 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagacaa agtccgtatg 180 gagaaattga gaatcaaggg aatgtcatac acgatgtgtt caggaaagtt ttcaattgac 240 aaagagatgg cagaaacaca gcatgggaca acagtggtga aagtcaagta tgaaggtgct 300 ggagctccgt gtaaagtccc catagagata agagatgtaa acaaggaaaa agtggttggg 360 cgtatcatct catccacccc tttggctgag aataccaaca gtgtaaccaa catagaatta 420 gaacccccct ttggggacag ctacatagtg ataggtgttg gaaacagcgc attaacactc 480 cattggttca ggaaagggag ttccattggc aagatgtttg agtccacata cagaggtgca 540 aaacgaatgg ccattctagg tgaaacagct tgggattttg gttccgttgg tggtcttcta 600 gaaatggacg tacctgctga agttgcaggc gtagtcaaag aagttaaagt taaagtcggc 660 gacaaaatct ctgaaggtgg tttgattgtc gtcgttgaag ctgaaggcac ggcagccgct 720 cctaaagccg aagcggctgc cgccccggcg caagaagccc ctaaagctgc cgctcctgct 780 ccgcaagccg cgcaattcgg cggttctgcc gatgccgagt acgacgtggt cgtattgggt 840 ggcggtcccg gcggttactc cgctgcattt gccgctgccg atgaaggctt gaaagtcgcc 900 atcgtcgaac gttacaaaac tttgggcggc gtttgcctga acgtcggctg tatcccttcc 960 aaagccttgt tgcacaatgc cgccgttatc gacgaagtgc gccacttggc tgccaacggt 1020 atcaaatacc ccgagccgga actcgacatc gatatgcttc gcgcctacaa agacggcgta 1080 gtttcccgcc tcacgggcgg tttggcaggt atggcgaaaa gccgtaaagt ggacgttatc 1140 caaggcgacg ggcaattctt agatccgcac cacttggaag tgtcgctgac tgccggcgac 1200 gcgtacgaac aggcagcccc taccggcgag aaaaaaatcg ttgccttcaa aaactgtatc 1260 attgcagcag gcagccgcgt aaccaaactg cctttcattc ctgaagatcc gcgcatcatc 1320 gattccagcg gcgcattggc tctgaaagaa gtaccgggca aactgctgat tatcggcggc 1380 ggcattatcg gcctcgagat gggtacggtt tacagcacgc tgggttcgcg tttggatgtg 1440 gttgaaatga tggacggcct gatgcaaggc gcagaccgcg atttggtaaa agtatggcaa 1500 aaacaaaacg aataccgttt tgacaacatt atggtcaaca ccaaaaccgt tgcagttgag 1560 ccgaaagaag acggcgttta cgttaccttt gaaggcgcga acgcgcctaa agagccgcaa 1620 cgctacgatg ccgtattggt tgccgccggc cgcgcgccca acggcaaact catcagcgcg 1680 gaaaaagcag gcgttgccgt aaccgatcgc ggcttcatcg aagtggacaa acaaatgcgt 1740 accaatgtgc cgcacatcta cgccatcggc gacatcgtcg gtcagccgat gttggcgcac 1800 aaagccgttc acgaaggcca cgttgccgcc gaaaactgcg ccggccacaa agcctacttc 1860 gacgcacgcg tgattccggg cgttgcctac acttcccccg aagtggcgtg ggtgggcgaa 1920 accgaactgt ccgccaaagc ctccggccgc aaaatcacca aagccaactt cccgtgggcg 1980 gcttccggcc gtgcgattgc caacggttgc gacaagccgt ttaccaagct gatttttgat 2040 gccgaaaccg gccgcatcat cggcggcggc attgtcggtc cgaacggtgg cgatatgatc 2100 ggcgaagtct gccttgccat cgaaatgggc tgcgacgcgg cagacatcgg caaaaccatc 2160 cacccgcacc cgaccttggg cgaatccatc ggtatggcgg cggaagtggc attgggtact 2220 tgtaccgacc tgcctccgca aaagaaaaaa ggatccgaca ggctgagaat ggacaaacta 2280 cagctcaaag gaatgtcata ctctatgtgt acaggaaagt ttaaaattgt gaaggaaata 2340 gcagaaacac aacatggaac aatagttatc agagtacaat atgaagggga cggctctcca 2400 tgtaagatcc cttttgagat aatggatttg gaaaaaagac acgtcttagg tcgcctgatt 2460 acagttaacc cgatcgtaac agaaaaagat agcccagtca acatagaagc agaacctcca 2520 ttcggagaca gctacatcat cataggagta gagccgggac aattgaaact caactggttt 2580 aagaaaggaa gttccatcgg ccaaatgttt gagacaacaa tgagaggagc gaagagaatg 2640 gccattttag gtgacacagc ctgggatttt gggtctctgg gtggttaagg atcc 2694 <210> 54 <211> 891 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(891) <223> Aminoacidic sequence of the PD4D2 <400> 54 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly 50 55 60 Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met 65 70 75 80 Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly 85 90 95 Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys 100 105 110 Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn 115 120 125 Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Arg Pro Leu Asp Ser Tyr 130 135 140 Ile Val Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg 145 150 155 160 Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala 165 170 175 Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val 180 185 190 Gly Gly Leu Leu Glu Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala 195 200 205 Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu 210 215 220 Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro 225 230 235 240 Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala 245 250 255 Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu 260 265 270 Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala 275 280 285 Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr 290 295 300 Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys 305 310 315 320 Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala 325 330 335 Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu 340 345 350 Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala 355 360 365 Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln 370 375 380 Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala 385 390 395 400 Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys 405 410 415 Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile 420 425 430 Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys 435 440 445 Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu 450 455 460 Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val 465 470 475 480 Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys 485 490 495 Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn 500 505 510 Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr 515 520 525 Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val 530 535 540 Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu 545 550 555 560 Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys 565 570 575 Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val 580 585 590 Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala 595 600 605 Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile 610 615 620 Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr 625 630 635 640 Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe 645 650 655 Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro 660 665 670 Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly 675 680 685 Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu 690 695 700 Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His 705 710 715 720 Pro His Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly 725 730 735 Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Arg Leu Arg 740 745 750 Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly 755 760 765 Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile 770 775 780 Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro 785 790 795 800 Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile 805 810 815 Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu 820 825 830 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro 835 840 845 Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln 850 855 860 Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly 865 870 875 880 Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly 885 890 45

Claims (35)

  1. 뎅기 바이러스(Dengue virus)로부터의 E 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 하나 이상의 서열과 MDH(데히드로게나제 활성을 지닌 돌연변이 단백질; mutated protein with dehydrogenase activity) 단백질의 누클레오티드 서열의 특정 조합으로, 상기 하나 이상의 서열과 MDH 단백질의 누클레오티드 서열의 특정 조합이 서열목록에서 SEQ ID No.26, SEQ ID No.29 또는 SEQ ID No.23으로 확인되는 서열에 삽입되거나 융합되고, 수용자에게서 뎅기 바이러스(Dengue virus)의 혈청형 1, 2, 3 및 4에 대해 혈청형-특이적인 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있는 키메라 단백질을 코딩하는 키메라 누클레오티드 사슬.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, SEQ ID No.23으로 확인되는 MDH 단백질의 최초 45개 아미노산을 코딩하는 3' 단부 영역에 융합된, 뎅기 바이러스(Dengue virus)의 각각의 혈청형 1, 2, 3 및 4로부터의 E 단백질의 아미노산 286번 내지 426번에 대한 코딩 서열에 의해 형성됨을 특징으로 하는 키메라 누클레오티드 사슬.
  4. 제1항에 있어서, SEQ ID No.26으로 확인되는 MDH 단백질의 45개 아미노산을 코딩하는 3' 단부 영역에 융합된, 뎅기 바이러스(Dengue virus)의 각각의 혈청형 1, 2, 3 및 4로부터의 E 단백질의 아미노산 286번 내지 426번에 대한 코딩 서열에 의해 형성됨을 특징으로 하는 키메라 누클레오티드 사슬.
  5. 제1항에 있어서, SEQ ID No.29로 확인되는 MDH 단백질을 코딩하는 3' 단부 영역에 융합된, 뎅기 바이러스(Dengue virus)의 각각의 혈청형 1, 2, 3 및 4로부터의 E 단백질의 아미노산 286번 내지 426번에 대한 코딩 서열에 의해 형성됨을 특징으로 하는 키메라 누클레오티드 사슬.
  6. 제1항에 있어서, 뎅기 바이러스(Dengue virus)의 두 가지 상이한 혈청형으로부터의 E 단백질의 아미노산 286번 내지 426번을 코딩하는 누클레오티드 서열과 MDH 의 서열의 조합으로서, E 단백질에 상응하는 서열 중 하나가 MDH 단백질의 45개 아미노산을 코딩하는 영역에 삽입되어 있고 나머지 하나가 SEQ ID No.29로 확인되는 동일한 MDH 서열의 3' 영역에 융합되어 있음을 특징으로 하는 키메라 누클레오티드 사슬.
  7. 제1항, 제3항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 누클레오티드 사슬의 발현 생성물이며, 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기 바이러스(Dengue virus)의 각각의 혈청형에 대해 혈청형 특이적인 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 재조합 키메라 단백질.
  8. 제1항 또는 제6항의 누클레오티드 사슬의 발현 생성물이며, 수용자에게서 뎅기 바이러스(Dengue virus)의 두 가지 동종의 혈청형에 대해 특이적인 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 재조합 키메라 단백질.
  9. 제3항에 있어서, SEQ ID No.25의 키메라 단백질을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.24로 확인되는 키메라 누클레오티드 서열.
  10. 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.25로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.24의 발현 생성물이며, SEQ ID No.25의 키메라 단백질이 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-2 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제7항에 따른 키메라 단백질.
  11. SEQ ID No.28의 키메라 단백질을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.27로 확인되는 제4항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
  12. 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.28로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.27의 발현 생성물이며, SEQ ID No.28의 키메라 단백질이 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-2 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제7항에 따른 키메라 단백질.
  13. SEQ ID No.31의 키메라 단백질을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.30으로 확인되는 제5항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
  14. 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.31로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.30의 발현 생성물이며, SEQ ID No.31의 키메라 단백질이 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-2 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제7항에 따른 키메라 단백질.
  15. SEQ ID No.34의 키메라 단백질을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.33으로 확인되는 제3항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
  16. 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.34로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.33의 발현 생성물이며, SEQ ID No.34의 키메라 단백질이 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-1 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제7항에 따른 키메라 단백질.
  17. SEQ ID No.36의 키메라 단백질을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.35로 확인되는 제4항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
  18. 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.36으로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.35의 발현 생성물이며, SEQ ID No.36의 키메라 단백질이 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-1 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제7항에 따른 키메라 단백질.
  19. SEQ ID No.38의 키메라 단백질을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.37로 확인되는 제5항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
  20. 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.38로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.37의 발현 생성물이며, SEQ ID No.38의 키메라 단백질이 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-1 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제7항에 따른 키메라 단백질.
  21. SEQ ID No.41의 키메라 단백질을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.40으로 확인되는 제3항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
  22. 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.41로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.40의 발현 생성물이며, SEQ ID No.41의 키메라 단백질이 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-3 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제7항에 따른 키메라 단백질.
  23. SEQ ID No.43의 키메라 단백질을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.42로 확인되는 제4항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
  24. 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.43으로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.42의 발현 생성물이며, SEQ ID No.43의 키메라 단백질이 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-3 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제7항에 따른 키메라 단백질.
  25. SEQ ID No.45의 키메라 단백질을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.44로 확인되는 제5항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
  26. 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.45로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.44의 발현 생성물이며, SEQ ID No.45의 키메라 단백질이 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-3 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제7항에 따른 키메라 단백질.
  27. SEQ ID No.48의 키메라 단백질을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.47로 확인되는 제3항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
  28. 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.48로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.47의 발현 생성물이며, SEQ ID No.48의 키메라 단백질이 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-4 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제7항에 따른 키메라 단백질.
  29. SEQ ID No.50의 키메라 단백질을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.49로 확인되는 제4항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
  30. 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.50으로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.49의 발현 생성물이며, SEQ ID No.50의 키메라 단백질이 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-4 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제7항에 따른 키메라 단백질.
  31. SEQ ID No.52의 키메라 단백질을 코딩함을 특징으로 하는, 본질적으로 SEQ ID No.51로 확인되는 제5항에 따른 키메라 누클레오티드 사슬.
  32. 본질적으로 서열목록에서 SEQ ID No.52로 확인되는 아미노산 서열을 지니고, SEQ ID No.51의 발현 생성물이며, SEQ ID No.52의 키메라 단백질이 약제학적 제제에 존재하는 경우에 수용자에게서 뎅기-4 바이러스에 대한 중화 및 방어 항체의 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 특징으로 하는 제7항에 따른 키메라 단백질.
  33. 제7항에 기재된 둘 이상의 키메라 단백질을 20 내지 35㎍의 양으로 포함함을 특징으로 하는, 수용자에게서 뎅기 바이러스(Dengue virus)에 대해 특이적인 방어 면역반응을 유도할 수 있는 약제학적 제제.
  34. 제33항에 있어서, 경구, 근내, 피하, 점막 또는 정맥내 투여용의 뎅기 바이러스(Dengue virus)에 대한 예방제 또는 치료제임을 특징으로 하는 약제학적 제제.
  35. 뎅기 바이러스(Dengue virus)의 진단에 사용하기 위한, 제7항에 기재된 하나 이상의 단백질을 지님을 특징으로 하는 진단 수단.
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