WO1997026359A1 - Sistema de expresion de antigenos heterologos como proteinas de fusion - Google Patents

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WO1997026359A1
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Gerardo Enrique Guillen Nieto
Anabel Alvarez Acosta
Emilio Luis CARPIO MUÑOZ
Diógenes Quintana Vazquez
Carmen Elena Gomez Rodriguez
Ricardo De La Caridad Silva Rodrigez
Consuelo Nazabal Galvez
María de Jesús LEAL ANGULO
Alejandro Miguel Martin Dunn
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Definitions

  • the present invention is related to the branch of biotechnology and genetic engineering, particularly with the expression of heterologous proteins in microbial hosts by fusion, using recombinant DNA technology, to bacterial peptides.
  • Intracellular synthesis has been the most used strategy for obtaining heterologous polypeptides in E. coli, due to the high levels of expression attainable (Goeddel, DV, Methods Enzymol., 185, 3-7, 1990).
  • factors such as host protease sensitivity or expressed protein toxicity can significantly decrease these levels, regardless of the use of high efficiency regulatory sequences (Lee, CA and Saier, MH, J. Bacteriol., 153, 685 -692; Gwyn, GW, Membrane Pi otein Expression Systems: A User's Guide, Portland Press, London, UK, 29-82).
  • Inclusion bodies are insoluble protein aggregates that appear as electrodense bodies in the cytosol during the expression of many recombinant proteins in E. coli (Ri ⁇ as, U. and Bailey, J., Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, 609-614 ).
  • WO 9207939 A2 920514 of constant regions of immunoglobulins, as described in European Patent Application No. EP 0464533 to 920108; of human angiogenin (European patent application No. EP 0423641 A2 910424), of growth hormone (EP 0429586 Al 910605), glutathione-S-transferase (WO 8809372 Al 881201) and of porcine adenylate kinase (EP 0423641 A2 910424 and EP 0412526 A2 910213).
  • stabilizing polypeptides that constitute a significant part of the fusion protein has some disadvantages if the former is a vaccine candidate, since the presence of foreign sequences can alter the natural order of the B and T cell epitopes (Denton , G., Hudecz, F., Kajtár, J. et al, Peptide Research, 7, 258-264) or their processing by antigen presenting cells (Del Val, M., Schlicht, H., Ruppert , T., et al, Cell, 66, 1 145-1 153), and may even seriously affect its immunogenicity by the epitopo-specific suppression phenomenon (Etlinger, H., Immunol. Today, 13, 52 -55).
  • German patent application No. 35 41 856 Al reports the possibility of using a stabilizing peptide consisting of at least the first 95 amino acids of the N-terminal end of the human protein Interleukin-2 (IL-2) to obtain fusion proteins insolubly synthesized in E. cali.
  • IL-2 Interleukin-2
  • European patent applications No. 0 416 673 A2 and No. 229 998 of the same firm a stabilizing peptide consisting of the first 58 or 38 amino acids of said protein is used, respectively.
  • the first 58 residues of IL-2 are also used in European Patent No.
  • the stabilizing peptide is separated from the protein of interest by a spacer that allows independent folding of both, and whose amino acid sequence makes it susceptible to attack by specific endopeptidases. If there is a ligand that recognizes the chosen stabilizer, it is then possible to purify the fusion polypeptide by affinity chromatography and finally separate it from the stabilizer by treatment with certain proteases (Cress, D., Shultz, J. and Breitlow, S., Promega Notes, 42, 2-7).
  • An additional advantage is the possibility of taking advantage of this molecular interaction for the follow-up of intermediate purification steps without the need to have antibodies for each protein to be expressed.
  • EP 0131363 Al 850116 or in glutathione-S-transferase (patent application No. EP 0293249 Al 88130, from Amrad Corp., Ltd.) purifiable with substrate matrices immobilized; in Staphylococcus aureus protein A, according to patent application No. WO 9109946 Al 91071 1; and in the 12.5 kDa subunit of the Proprionibacte ⁇ um shermanii transcarboxylase complex, which is biotinylated in vivo and allows purification based on the affinity of biotin for avidin (Cress, D., Shultz, J. and Breitlow, S ., Promega Notes, 42, 2-7, patent applications No. EP 0472658 Al 920304 or WO 9014431 Al 901 129).
  • the object of the present invention is a process for the expression at high levels of heterologous proteins as fusion polypeptides in E. coli; which is based on the use of a stabilizing sequence derived from the first 47 amino acids of the P64k antigen of N. meningitidis B: 4: P1.15 (European Patent Application No. 0 474 313 A2) which confers on them the capacity of expressing oneself as inclusion bodies.
  • This sequence although it has homology with part of the lipoic acid binding domain of dihydrolipoamide acetyl transferases, has been genetically engineered to eliminate the possibility of modification by it and has the advantage of being poorly immunogenic.
  • This procedure also includes the use of a monoclonal antibody that specifically recognizes said stabilizer, allowing immunodetection of any protein fused thereto.
  • a recombinant plasmid is used as an expression vector, which carries said sequence under the control of the tryptophan (ptrip) promoter of E. coli, followed by Xbal, EcoRV and BamHI restriction sites that allow cloning into phase of DNA fragments encoding polypeptides of interest.
  • This vector also includes terminator of transcription of gene 32 of bacteriophage T4, and of an ampicillin resistance gene as a selection marker.
  • This procedure also makes possible the inclusion of the fusion polypeptide obtained in vaccine preparations intended for use in humans; and the nature of the stabilizing peptide used allows the generation of an effective immune response against the foreign protein or multi-epitope peptide bound thereto.
  • the LpdA antigen of N. meningitidis is a 594 amino acid protein that belongs to the dihydrolipoamide dehydrogenase family (EC 1.8.1.4) and specifically, to a new subgroup within them characterized by having a domain of binding to lipoic acid, analogous to that present in dihydrolipoamide acetyl transferases, in its arninoterrninal portion (Kruger, N., Oppermann, FB, Lorenzl, H. and Steinbüchel, A., J. Bacteriol., 176, 3614-3630, 1994 ; Hein, S. and Steinbüchel, A., J. Bacteriol., 176, 4394-4408, 1994).
  • the LpdA protein has been cloned and overexpressed in E. coli, with the addition of 5 amino acids (MLDKR) at its aminoterrninal end (European Patent Application No. 0 474 313 A2; Figure 1). Although the designations LpdA and P64k are equivalent, the name P64k will be used to refer to the recombinant protein.
  • LpdA and P64k are equivalent, the name P64k will be used to refer to the recombinant protein.
  • the epitopes for B cells present therein were located by evaluating the reactivity of an anti-P64k polyclonal serum. against synthetic peptides.
  • P64k European Patent Application No. 0 474 313 A2 was purified by hydrophobicity chromatography in Butyl-TSK and gel filtration; and denatured by precipitating it with trichloroacetic acid (TCA), neutralizing with NaOH and equilibrating in phosphate buffer by gel filtration chromatography.
  • TCA trichloroacetic acid
  • This preparation was used to immunize 30 Balb / c mice with doses of 20 mg adjuvant with 2 mg of aluminum hydroxide subcutaneously, at 0, 7 and 21 days; and after 28 days the final extraction was done. The sera obtained were combined, and the resulting mixture was aliquoted and stored at -20 ° C.
  • 59 peptides of 20 amino acids (a. A.) Were synthesized that cover the entire recombinant protein sequence and overlap by 10 a. a., using a set of reagents for solid phase synthesis (Multipin Peptide Synthesis System, Chairon Mimotope Pty., Ltd., USA) in 96-well plate format and following the manufacturer's instructions. These were numbered consecutively from the aminoterminal end of the protein. The reactivity of the antiP64k serum against these peptides was determined using a 1: 2000 dilution thereof, and the immunoassay format used was that recommended by the manufacturer of the above reagent kit.
  • the expression vector pM-83 was constructed, into which it was introduced the coding sequence for a stabilizing peptide derived from the first 47 amino acids of said protein (NO. SEQUENCE IDENTIFICATION: 1). This sequence was cloned under the control of the tryptophan promoter of E. coli, this vector also presenting the terminator of the bacteriophage T4 as a signal of transcription termination and the ampicillin resistance gene as a selection marker.
  • the stabilizer was first amplified using the Polymerase Chain Reaction (PCR) (Randall, K. et al, Science, 42394, 487-491, 1988) from plasmid pM-6, which carries the sequence nucleotide coding for the P64k antigen (European Patent Application No. 0 474 313 A2, Figure 1).
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • oligonucleotide primers 1573 and 1575 were used, which introduce Ncol and Xbal restriction sites in the amplified DNA fragment that correspond to the amino- and carboxyl-terminal ends of the stabilizer encoded therein:
  • the amino acid sequence encoded by the resulting stabilizer is shown in Figure 3 (NO. SEQUENCE IDENTIFICATION: 6).
  • the introduction of the Ncol restriction site exchanges Leucine 2 for a Valine; and primer 1575 removes the ETD sequence (position 45-47), introducing instead the DLE sequence.
  • Lysic acid-binding Lysine position 48 is not part of the stabilizer, and its vicinity, which is highly conserved in these domains (Russell, GC, Guest, JR, Biochim. Biophys Acta, 1076, 225-232, 1991) is altered.
  • Plasmid pM-83 was constructed by cloning this fragment (NO. SEQUENCE IDENTIFICATION: 5) previously digested Xbal / Ncol in plasmid pILM-29 (Guillen, G., Leal, M., Alvarez, A. et al , Biotechnology Act, 15, 97-106, 1995).
  • PILM29 contains the gene for N. meningitidis Opc protein (5c) fused to a stabilizing peptide consisting of the first 58 amino acids of human IL-2, so that said cloning removes the IL-2 fragment and fuses the Opc to the stabilizer of the P64k ( Figure 4).
  • the opc gene was in turn suppressed using the Xbal and BamHI enzymes and instead an adapter formed by the hybridization of oligonucleotides 1576 and 1577 was cloned, which introduces Xbal restriction sites, EcoRV and BamHI at the 3 'end of the stabilizer fragment:
  • This plasmid was named pM-83 ( Figure 4).
  • the similarity of the stabilizing peptide of pM-83 (EXAMPLE 2) with human proteins was determined by means of a homology search in the EMBL Data Library v.38 databases (Rice, CM, Fuchs, R., Higgins, DG et al, Nuc ⁇ Acids Res. 21, 2967-2971, 1993) of sequences nucleotides, and SWISS-PROT v.38 (Bairoch, A. and Boeckmann, B., Nuc ⁇ . Acids Res. 21, 3093-3096, 1993) of amino acid sequences; both versions of March 1994.
  • BLASTP which compares an amino acid sequence against a protein sequence base (in this case SWISS-PROT)
  • TBLASTN which compares an amino acid sequence against all translations in both directions and in all frames for reading a nucleotide sequence base, as in this case the EMBL Data Library
  • a PAM120 valuation matrix was used [Dayhoff, MO, Schwartz, RM and Orcutt, BB, in: Dayhoff, MO (de.), Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, Suppl. 3, 345-352, Natn Biomed.Res. Found., Washington, 1978].
  • the ability of the stabilizer present in pM-83 to allow intracellular synthesis at high levels and in the form of inclusion bodies was evaluated by comparing the expression of several fused proteins to the first 22 or 58 amino acids of human Interleukin-2 (IL- 2), which is a fusion peptide widely used for this purpose, or fused to the first 47 aa of the modified P64k antigen as described in EXAMPLE 2.
  • IL-2 human Interleukin-2
  • the coding genes for the outer membrane proteins of N. meningitidis B: 4: P1.15 were cloned into the vectors pFP15 (hIL2-58; European Patent No. 416 673 Bl) or pM-83 (P64k-47).
  • PorA and Opc in vectors pISL31 (hIL2-22, Castellanos-Serra, LR, Hardy, E., Ubieta, R., et al., Manuscript remitted) or pM-83, the genes coding for a multiepitopic polypeptide (PME) that includes immunogenic regions of various isolates of the Human Immunodeficiency Virus, HIV.
  • the resulting expression plasmids are: pILM-28 (IL2-58 + PorA; Guillen, G., Alvarez, A., León, L., et al, 494-498 in: Conde-González, CJ, Morse, S. , Rice, P.
  • pM-82 P64k-47 + PorA; Niebla, O., Alvarez, A ., González, S. et al, 85-86 in: Evans, JS, Yost, SE, Maiden, MCJ et al. (Eds.)., Neisseria 94: Proceedings of the IX International Pathogenic Neisseria Conference, Winchester, England, 1994), pILM-29 (IL2-58 + Opc; Guillen, G., Leal, M., Alvarez, A.
  • the TAB4 and TAB9 proteins are multi-epitope polypeptides (PME) that include several copies of the central part of the variable region 3 (V3) of the HIV-1 gpl20 protein.
  • PME multi-epitope polypeptides
  • SRGIRIGPGRAILAT NO. I DENTI SEQUENCE FICATION: 9, -JY1: RQSTPIGLGQALYTT (NO. I DENTI SEQUENCE FICATION: 1 Q -RF: RKSITKGPGRVIYAT (NO. I DENT I SEQUENCE FICACON: 11) RKRIHIGPGRAFYTT (NO. I DENTI SEQUENCE FICATION: 12> -BRVA: RKRITMGPGRVYYTT (NO. I DENTI SEQUENCE FICATION: 13 - II IB: SIRIQRGPGRAFVTI (NO.
  • pTAB3 From the resulting plasmid, called pTAB3, a fragment containing the gene for PME, tryptophan promoter and phage T4 terminator was extracted by digestion with the enzymes Seal and HindIII, and cloned into pUC19 (Yanisch-Perron, C. et al ., 1985, Gene 33, 103-1 19) to obtain pTAB4 ( Figure 7).
  • pTAB9 was constructed by eliminating the coding sequence for the stabilizer derived from human IL-2 by digestion with the Ncol and Xbal enzymes, and cloning instead a fragment encoding the first 47 amino acids of the P64k antigen obtained by Chain Reaction Polymerase (PCR), as described in EXAMPLE 2.
  • PCR Chain Reaction Polymerase
  • the E. coli K-12 host strains used for all these plasmids were W31 10 (Hill, CW, and Hamish, B, W. Proc.Natl. Acad. Sci., 78, 7069, 1981; Jensen, KF, J.Bacteriol., 175, 3401-3407, 1993) for pILM-28, pILM-29, pM-80 and pM-82; and W3110 trpA905, for pTAB4 and pTAB9.
  • Said culture was used to inoculate cultures of 50 mL of LB-Ap (pTAB4 and pTAB9) or of a defined medium composed of M9 salts (Miller, JH, Experiment in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972, New York, USA ), 1% glucose, 1% casein hydrolyzate, 0.1 mM CaCi2, lmM MgCb and Ap at 50 ug / mL ( ⁇ ILM-28, pILM-29, pM-80, pM-82), which grew 12 at 37 ° C and 250 rpm After this time, total protein samples were taken and analyzed by denaturing electrophoresis in polyacrylamide gels (SDS-PAGE, Laemmli, UK, Nature, 277, 680, 1970) and bright blue staining of Coomassie R-250; analyzing the percent of expression with a Bromma-LKB laser densitometer.
  • M9 salts M9 salt
  • Protein insolubility was used as a criterion to assume its expression as inclusion bodies, since other conditions under which it can exhibit such behavior (association with membranes or peptidoglycan) are unlikely in this case.
  • a ligand that specifically recognizes the stabilizer is a desirable feature in any expression system of recombinant proteins. This is because the above may allow, for example, the design of efficient affinity purification schemes if said ligand is immobilized in a chromatographic resin; and even - in the case of antibodies - monitoring the intermediate steps of purification by immunological techniques, regardless of the identity of the expressed heterologous protein.
  • TAB13 is a PME derived from
  • -C6 TSITIGPGQVFYRTG (NO. SEQUENCE IDENTIFICATION: 15)
  • -C8 RQRTSIGQGQALYTT (NO. SEQUENCE IDENTIFICATION: 16)
  • mice were immunized subcutaneously with 3 doses of 20 ⁇ g of TAB13 adjuvant in Al (OH) 3 with a 15 day interval; and an intraperitoneal reactivation with 20 ⁇ g of TAB13 in phosphate buffer, 20 days after the last dose.
  • Splecnocytes of this animal were fused with myeloma X63 Ag8 653 and the resulting hybridomas were isolated and investigated according to established methods (Gavilondo, JV (ed.), Monoclonal Antibodies: Theory and Practice, Elfos Scientiae, 1995, Havana, Cuba) .
  • the reactivity of the antibodies secreted by the isolated hybridomas was evaluated by ELISA, coating with the PME TAB13, the P64k protein or synthetic peptides representing the different V3 regions present in TAB13. In total, 18 positive clones were obtained, one of which, called 448/30/7, recognizes both TAB13 and P64k, but none of the gpl20 peptides.
  • coli strain MM294 (Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA) was transformed with the following plasmids: pILM-28 (IL2-58 + porA), pM-82 (P64k-47 + porA), pTAB13 (P64k-47 + PME), pM-6 (P64k) and pFP15 (IL-2).
  • the expression plasmid pM-134 was also used, which contains the first 120 amino acids of P64k (which comprise the lipoic acid binding site) under identical regulatory signals as above. This segment was amplified by PCR using primers Nos. 1573 (NO.
  • SEQUENCE IDENTIFICATION 2) and 2192 (NO. SEQUENCE IDENTIFICATION: 4); it was digested with the enzymes Ncol and BamHI, and cloned into plasmid pFP15 (See EXAMPLE 4) digested identically. The expression of these transformants was achieved under the growth conditions specified in EXAMPLE 4 for pTAB4 and pTAB9.
  • the expression system formed by the P64k-47 stabilizer, the plasmids that contain it and the MAb 448/30/7 allows the efficient synthesis and in the form of inclusion bodies of a large variety of proteins, and their detection without the previous availability of immunological probes against each polypeptide to be expressed.
  • EXAMPLE 6 The absence of deleterious effects on the immune response against the polypeptide fused to the stabilizer is an important factor to consider when selecting an expression system for vaccine candidates.
  • One of the advantages of the expression system based on the P64k-47 stabilizer is precisely its low immunogenicity (EXAMPLE 1), which guarantees the above.
  • the influence of the P64k-47 stabilizer on the immune response against the fused protein was assessed qualitatively by WO 97/26359 ⁇ '
  • biomass was obtained from strains W31 10 trpA905 + pTAB4 and W3110 trpA905 + pTAB9 as described in EXAMPLE 4. This biomass was broken by combining the treatment with lysozyme and with ultrasound in the presence of phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) and the non-ionic detergent Triton-X-100; the inclusion bodies were obtained by differential centrifugation, and the PMEs were partially purified and solubilized by two successive cycles of washing the inclusion bodies with 0 chaotropic agents and detergents (TAB4: 1. Urea 4 M + Triton-X-100 1 %, 2.
  • PMSF phenylmethyl sulfonyl fluoride
  • Titres were calculated as the maximum dilution of each serum with an absorbance value greater than double that of a mixture of preimmune sera; All sera were analyzed in duplicate.
  • Figure 1 Nucleotide sequence of the P64k gene. The sequence added in plasmid pM-6 is shown in italics (European Patent Application No. 0 474 313 A2), originally absent in the IpdA gene.
  • Figure 2 Polyclonal mouse serum reactivity against P64k peptides. A minimum value of 0.4 optical density units was chosen to consider the result as positive.
  • Figure 3 Stabilized amino acid sequence, deduced from the DNA sequence amplified by PCR from plasmid pM-6. The underlined sequences correspond to the oligonucleotide primers.
  • Figure 4 Construction strategy of plasmid pM-83.
  • Figure 5 Results of the homology search between the stabilizer sequences ('Query') and those present in the SWISS-PROT ('Sbjct') base, using the BLASTP program. Only entries corresponding to human or mammalian proteins are shown.
  • P (N) represents the probability of finding N equal alignments on a base composed of random sequences; the significance of homology decreases with the value of P (N). Identical waste is represented by its one letter code; Conservative substitutions with a '+', and differences are not noted.
  • Figure 6 Results of the homology search between the stabilizer sequences ('Query') and all possible translations of the sequences of the EMBL Data Library ('Sbjct'), using the TBLASTN program. Only entries corresponding to human or mammalian proteins are shown.
  • P (N) represents the probability of finding N equal alignments on a base composed of random sequences; the significance of homology decreases with the value of P (N). Identical waste is represented by its one letter code; Conservative substitutions with a '+', and differences are not noted.
  • Figure 7 Construction strategy of pTAB4 and pTAB9.
  • Figure 8 Nucleotide and amino acid sequence of PME TAB9.
  • Figure 9 A: General structure of PME TAB4 and TAB9.
  • B General structure of the PME TAB13.
  • Figure 10 Comparison- of the expression of the porA, opc and PME genes under stabilizers derived from human IL-2 or the first 47 amino acids of the P64k antigen.
  • hIL2-58 refers to the first 58 amino acids of human IL-2, hIL2-22 to the first 22, and P64k-47 to the stabilizer derived from the first 47 amino acids of the P64k antigen.
  • B Analysis compared by SDS-PAGE of PME expression in plasmids TAB4 and TAB9.
  • Lane A Molecular weight markers; B: Total proteins of strain W3110 trpA905; C: Total proteins of W3J 10 trpA905 + pTAB4; D: purified TAB4; E: Total W31 10 trpA905 + pTAB9 proteins; F:
  • TAB9 Expression of TAB9 in inclusion bodies.
  • A Soluble proteins of the sample.
  • B Insoluble or membrane proteins.
  • Figure 11 Western blotting 'using MAb 448/30/7 with samples of total E. coli MM294 proteins transformed with: 1: Negative control, 2: pM-6 (P64k), 3: pM-82 (P64k-47 + by A), 4: pTAB13 (P64k-47 + PME), 5: pFP15
  • IL-2 IL-2
  • 6 pM-134 (P64k-120)
  • 7 pILM-28 (IL2-58 + porA).
  • the migration of molecular weight patterns is represented on the left.
  • Figure 12 Reciprocal of the ELISA titre value of rabbits immunized with TAB4 and TAB9.
  • MG Geometric mean of the reciprocal of the anti V3 titles; A: Percentage of reactivity with V3 peptides.
  • TYPE OF MOLECULE First 47 amino acids of the recombinant protein P64k of N. menmgi tidis.
  • PROPERTIES Primer 5 'No. 1573 for PCR amplification of the first 44 amino acids of the P64k antigen of N. memngi tidis.
  • PROPERTIES 3 'No. 1575 primer for PCR amplification of the first 44 amino acids of the P64k antigen of N. meningi tidis.
  • PROPERTIES 3 'No. 2192 primer for PCR amplification of the first 120 amino acids of the P64k antigen of N. menmgi tidis.
  • PROPERTIES Derived from the first 47 amino acids of the antigen
  • TYPE OF MOLECULE Stabilizer derived from the first 47 amino acids of the P64k antigen from Neisse ⁇ a meningi tidis
  • PROPERTIES It has the following changes with respect to P64K: L2 ⁇ V2;
  • TYPE OF MOLECULE Synthetic oligonucleotide.
  • TYPE OF MOLECULE Central region of the V3 loop of HIV-1 gpl20, LR150 isolation
  • TYPE OF MOLECULE Central region of the V3 loop of HIV-1 gpl20, JY1 isolation.
  • TYPE OF MOLECULE Central V3 loop region of HIV-1 gpl20, RF isolation.
  • TYPE OF MOLECULE Central region of the V3 loop of HIV-1 gpl20, MN isolation.
  • TYPE OF MOLECULE Central region of the V3 loop of HIV-1 gpl20, BRVA isolation.
  • TYPE OF MOLECULE Central region of the V3 loop of HIV-1 gpl20, IIIB isolation.
  • TYPE OF MOLECULE Consensus sequence of the central region of the V3 loop of the gpl20 of different HIV-1 isolates, position within the PME TAB13.
  • V3 of the gpl20 of different isolates of HIV-1 position 8 within the PME TAB13.
  • TYPE OF MOLECULE Flexible spacer that separates epitopes V3 in PME TAB3, TAB4, TAB9 and TAB13
  • PROPERTIES Encodes for V3 epitopes linked by the spacer

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Abstract

La presente invención está relacionada con la rama de la biotecnología y la ingeniería genética, particularmente con la expresión de proteínas heterólogas en microorganismos mediante su fusión, usando la tecnología del ADN recombinante, a péptidos bacterianos. Mediante la presente invención se proporciona un procedimiento eficaz para la expresión en Escherichia coli de proteínas heterólogas como polipéptidos de fusión con vistas a su obtención con un alto grado de pureza, en cantidades comercialmente útiles, y de forma que permita su inclusión en preparados vacunales destinados al uso en humanos. Para ello se emplea esencialmente una secuencia estabilizadora derivada de los primeros 47 aminoácidos del antígeno P64k de Neisseria meningitidis B:4 :P1.15. En particular, se usa un plasmidio recombinante conteniendo dicha secuencia bajo el control del promotor triptófano de E. coli y del terminador de la transcripción del fago T4, incluyendo sitios de restricción que permiten la clonación en fase de fragmentos de ADN codificantes para polipéptidos de interés. El procedimiento objeto de la presente invención es aplicable en la industria farmacéutica, para el desarrollo de sistemas de diagnóstico, de preparados vacunales, y en cualquier situación donde sea necesaria la obtención en grandes cantidades de proteínas heterólogas como polipéptidos de fusión en E. coli.

Description

SISTEMA DE EXPRESIÓN DE ANTÍGENOS HETERÓLOGOS COMO PROTEÍNAS
DE FUSIÓN. Sector Técnico.
La presente invención está relacionada con la rama de la biotecnología y la ingeniería genética, particularmente con la expresión de proteínas heterólogas en hospederos microbianos mediante su fusión, usando la tecnología del ADN recombinante, a péptidos bacterianos. Técnica Anterior.
La utilidad de la tecnología del ADN recombinante para producir proteínas de interés de cualquier origen en E. coli ha sido extensivamente demostrada. Para ello una gran cantidad de vectores han sido desarrollados, aunque nuevas variantes son necesarias debido a que, frecuentemente cada gen a clonar y expresar representa un caso individual (Denhardt, D.T. y Colasantí, J.; Vectors, Butterworths, Stoneham, MA, pp. 179-204, 1987 y Lukacsovich, T. et al, Journal of Biotechnology, 13, 243-250, 1990).
La síntesis intracelular ha sido la estrategia más usada para la obtención de polipéptidos heterólogos en E. coli, debido a los altos niveles de expresión alcanzables (Goeddel, D.V, Methods Enzymol., 185, 3-7, 1990). Sin embargo, factores tales como la sensibilidad a proteasas del hospedero o toxicidad de la proteína expresada pueden disminuir significativamente dichos niveles, independientemente del uso de secuencias reguladoras de alta eficiencia (Lee, C. A. y Saier, M. H., J. Bacteriol., 153, 685-692; Gwyn, G. W., Membrane Pi otein Expression Systems: A User's Guide, Portland Press, Londres, UK, 29-82). La clonación en vectores apropiados de secuencias nucleotídicas codificantes para proteínas de interés, en fase con secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos estables en la célula hospedera, da lugar a la expresión de productos híbridos en el citoplasma celular conocidos como proteínas de fusión (Marston, F.A.O., Biochem. J. 240, 1-12, 1986). Dichos polípéptidos son generalmente menos sensibles a degradación proteolítica por el hospedero o menos tóxicos debido a la formación de cuerpos de inclusión, lo cual resulta en niveles de expresión superiores a los obtenidos sin el uso del péptido estabilizador (Itakura, K. et al, Science, 198, 1056- 1063, 1977). Adicionainente, esta forma de expresión facilita y abarata los pasos iniciales de la purificación si se dispone de métodos para la renaturalización posterior del producto recombinante (Fischer, B., Sumner, I. y Goodenough, P., Biotechnol. Bioeng., 41 , 3- 13). Los cuerpos de inclusión son agregados proteicos insolubles que aparecen como cuerpos electrodensos en el citosol durante la expresión de muchas proteínas recombinantes en E. coli (Riñas, U. y Bailey, J., Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, 609-614). Ellos son el resultado de la interacción entre polipéptidos parcialmente plegados, cuya agregación está termodinámicamente favorecida debido a la exposición en los mismos de residuos hidrofóbicos al solvente (Kiefhaber, T., Rudolph, R. et al, Biotechnology, 9, 825-829). El lento plegamiento en el citosol bacteriano de muchas proteínas eucarióticas, debido a la abundancia de aminoácidos formadores de puentes disulfuro (Cisteína) o formadores de giros beta (Prolina) ha estimulado el uso abundante de las mismas como péptido estabilizador. Ejemplo de lo anterior es el uso con este propósito de polipéptidos con actividad de unión a anticuerpos, provenientes de la globulina de la grasa de la leche humana (HMFG), según la solicitud de patente del PCT No. WO 9207939 A2 920514; de regiones constantes de las inmunoglobulinas, según se describe en la solicitud de patente europea No. EP 0464533 Al 920108; de la angiogenina humana (solicitud de patente europea No. EP 0423641 A2 910424), de la hormona del crecimiento (EP 0429586 Al 910605), la glutatión-S- transferasa (WO 8809372 Al 881201) y de la adenilato quinasa porcina (EP 0423641 A2 910424 y EP 0412526 A2 910213).
Sin embargo, el uso de polipéptidos estabilizadores que constituyen una parte significativa de la proteína de fusión tiene algunas desventajas si la anterior es un candidato vacunal, pues la presencia de secuencias foráneas puede alterar el orden natural de los epitopos de células B y T (Dentón, G., Hudecz, F., Kajtár, J. et al, Peptide Research, 7, 258-264) o el procesamiento de las mismas por las células presentadoras de antígeno (Del Val, M., Schlicht, H., Ruppert, T., et al, Cell, 66, 1 145- 1 153), pudiendo incluso llegar a afectar seriamente la inmunogenicidad de la misma por el fenómeno de supresión epitopo-específica (Etlinger, H., Immunol. Today, 13, 52-55). Es debido al fenómeno anterior que se ha tratado de definir, en algunos casos, fragmentos pequeños que aún estabilicen la expresión. Por ejemplo, la solicitud de patente alemana No 35 41 856 Al (Hoechst AG) reporta la posibilidad de utilizar un péptido estabilizador conformado por al menos los primeros 95 aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína humana Interleucina-2 (IL-2) para obtener proteínas de fusión de forma insoluble sintetizadas en E. cali. De igual forma en las solicitudes de patente europeas No. 0 416 673 A2 y No. 229 998 de la misma firma se usa un péptido estabilizador consistente en los primeros 58 ó 38 aminoácidos de dicha proteína, respectivamente. También se usan los primeros 58 residuos de la IL-2 en la patente europea No. 416 673 Bl, y una estrategia similar se sigue en el caso del uso con este propósito de fragmentos N-terminales de la seroalbúmina humana (solicitud de patente europea No. EP 0423641 Al 920212); del péptido III activador del tejido conectivo (WO 90136647 Al 901 1 15) y de fragmentos de la kallikreína humana (EP 0381433 Al 900808). Estas invenciones dan solución al problema anterior, pero los polipéptidos de fusión obtenidos no pueden incluirse en preparados vacunales para uso en humanos, debido a la posibilidad de inducción de enfermedades autoinmunes por la presencia en ellos de secuencias homologas o idénticas a proteínas humanas. La alternativa de utilizar polipéptidos estabilizadores de origen bacteriano —y por lo tanto, sin reactividad cruzada con antígenos de origen humano— para la expresión intracelular, también ha sido explorada con éxito. Una de las proteínas más usadas con este fin ha sido la β-galactosidasa de E. coli (Itakura, K. et al, Science, 198, 1056-1063, 1977) o porciones de ella (solicitud de patente alemana No. EP 0235754 A2 870909, de la firma Hoechst AG). La principal desventaja de este sistema es el gran tamaño de esta proteína, que trae como consecuencia que el péptido deseado sólo represente una pequeña porción de la proteína híbrida total (Flores, N. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 25, 267-271 , 1986; Goeddel, D.V. et al., P.N.A.S. USA, 76, 106- 1 10). Idénticos problemas ha presentado el uso del fragmento C de la toxina del tétanos y la exotoxina de Pseudomonas sp. (solicitudes de patentes Nos. WO 9403615 Al 940217 y EP 0369316 A2 900523). Una variante de expresión muy promisoria es el uso de fusiones con la tiorredoxina de E. coli (solicitud de patente No. WO 9402502 Al 940203), que usa la propiedad de la misma de ser liberada de la célula por estrés osmótico (Elyaagoubi, A., Kohiyama, M., Richarme, G., J. Bacteriol., 176, 7074-7078) para facilitar la purificación. Sin embargo, este esquema no es funcional para la obtención de cuerpos de inclusión, pues los mismos no son liberados mediante este procedimiento.
Muchos de estos problemas han sido solucionados con el diseño de proteínas de fusión modulares. En éstas, el péptido estabilizador está separado de la proteína de interés por un espaciador que permite el plegamiento independiente de ambos, y cuya secuencia aminoacídica le hace susceptible al ataque de endopeptidasas específicas. Si existe un ligando que reconoce el estabilizador escogido, es posible entonces purificar el polipéptido de fusión mediante cromatografía de afinidad y finalmente separarlo del estabilizador mediante el tratamiento con determinadas proteasas (Cress, D., Shultz, J. y Breitlow, S., Promega Notes, 42, 2-7). Una ventaja adicional es la posibilidad de aprovechar esta interacción molecular para el seguimiento de pasos intermedios de la purificación sin la necesidad de disponer de anticuerpos para cada proteína a expresar. Un ejemplo bien conocido de lo anterior es el uso de la afinidad del aminoácido histidina (Hys) con algunos metales como el níquel (Ni) y el zinc (Zn) en sistemas compuestos por un estabilizador con 6 Hys en tándem y una matriz de afinidad de quelatos de níquel, según lo descrito en la solicitud de patente No. WO 9115589 Al 911017 de The Upjohn Co. A pesar de todo esto, este tipo de sistema de expresión no funciona en todos los casos, pues entre otras razones la proteína de interés puede tener sitios de corte para la proteasa escogida, o plegarse de forma que el espaciador no esté accesible al solvente (Uhlen, M. y Moks, T., Meth. Enzymol. 185, 129-140; Cress, D., Shultz, J. y Breitlow, S., Promega Notes, 42, 2-7), interferir la unión entre el estabilizador y la matriz de afinidad (New England Biolabs, The NEB Transcript, 3, 14), o simplemente requerir, para su purificación, condiciones que afecten su actividad biológica. Por esta razón es deseable disponer de distintas variantes, pues cada proteína a expresar de esta forma puede representar un caso particular. Se han desarrollado con esta finalidad, entre otros, péptidos estabilizadores basados en la proteína de unión a maltosa de E. coli (MalE), los cuales tienen afinidad por resinas de amilosa (solicitud de patente EP 0426787 Al 910515); en las enzimas cloranfenicol acetil transferasa (solicitud de patente No. EP 0131363 Al 850116) o en la glutatión-S-transferasa (solicitud de patente No. EP 0293249 Al 88130, de la Amrad Corp., Ltd.) purificable con matrices del sustrato inmovilizado; en la pro teína A de Staphylococcus aureus, según la solicitud de patente No. WO 9109946 Al 91071 1; y en la subunidad de 12.5 kDa del complejo de la transcarboxylasa de Proprionibacteήum shermanii, la cual es biotinilada in vivo y permite la purificación basada en la afinidad de la biotina por la avidina (Cress, D., Shultz, J. y Breitlow, S., Promega Notes, 42, 2-7, solicitudes de patentes No. EP 0472658 Al 920304 ó WO 9014431 Al 901 129).
De particular interés resulta el método descrito en la solicitud patente EP 0472658 Al 920304 ó WO 9014431 Al 901129, desarrollada por la Biotechnology Research and Development Corporation, conjuntamente con la Universidad de Illinois, USA. En ella se describe un sistema de expresión que usa el dominio de unión al ácido lipoico de la dihidrolipoamida acetil transferasa (EC 2.3.1.12), también conocida como la subunidad E2 del complejo de la piruvato deshidrogenasa de E. coli. Este dominio es modificado postraduccionalmente in vivo mediante la adición de una molécula de ácido lipoico al nitrógeno e de una de sus lisinas (Guest, J.R., Angier, J.S. y Russell, G.C., Ann. N.Y. Acad. Sci., 573, 76-99), lo que es aprovechado para la purificación e identificación de proteínas fusionadas al mismo mediante el uso de un anticuerpo que reconoce sólo dominios lipoilados.
Este método, sin embargo, adolece de un número de inconvenientes. En primer lugar, es conocido que la sobrexpresión de proteínas conteniendo dominios de unión al ácido lipoico sobrepasa la capacidad de lipoilación celular, produciéndose como consecuencia dominios no lipoilados (Miles, J.S. y Guest, J.R., Biochem. J., 245, 869-874; Ali, S.T. y Guest, J.R., Biochem. J., 271, 139- 145) u octanoilados (Ali, S.T., Moir, A.J., Ashton, P.R. et al Mol. Microbiol., 4, 943-950; Dardel, F., Packman, L.C. y Perham, R.N., FEBS Lett. 295, 13-16), lo que puede disminuir el rendimiento durante la purificación por inmunoafinidad. En segundo lugar, existe una serie de enfermedades de origen supuestamente autoinmune que tienen como factor común la presencia de anticuerpos que reconocen específicamente al ácido lipoico en el contexto de estos dominios. Entre ellas están la cirrosis biliar primaria, una enfermedad crónica caracterizada por la inflamación y obstrucción progresiva de los conductos biliares intrahepáticos (Tuaillon, N., Andre, C, Briand, J.P. et al, J. Immunol., 148, 445-450); y la hepatitis provocada por el halotano, un anestésico de amplio uso que derivatiza algunas proteínas mediante la formación de trifluoroacetil lisina (Gut, J., Christen, U., Frey, N. et al, Toxicology, 97, 199-224). El suero de los pacientes de esta enfermedad reconoce dichos complejos, cuya estructura molecular es mimetizada por el ácido lipoico en el contexto de las dihidrolipoamida acetil transferasas (Gut, J., Christen, U., Frey, N. et al, Toxicology, 97, 199-224). Por esta razón es deseable evitar la presencia del ácido lipoico en dichos péptidos si las proteínas de fusión que los contienen constituyen candidatos vacunales para uso en humanos. Divulgación de la Invención.
Es objeto de la presente invención un procedimiento para la expresión a altos niveles de proteínas heterólogas como polipéptidos de fusión en E. coli; el cual está basado en el uso de una secuencia estabilizadora derivada de los primeros 47 aminoácidos del antígeno P64k de N. meningitidis B:4:P1.15 (solicitud de Patente Europea No. 0 474 313 A2) que confiere a los mismos la capacidad de expresarse como cuerpos de inclusión. Dicha secuencia, aunque presenta homología con parte del dominio de unión al ácido lipoico de las dihidrolipoamida acetil transferasas, ha sido manipulada genéticamente para eliminar la posibilidad de modificación por el mismo y presenta la ventaja de ser poco inmunogénica. Este procedimiento también comprende el uso de un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente el mencionado estabilizador, permitiendo la inmunodetección de cualquier proteína fusionada al mismo.
Particularmente, en la presente invención se usa un plasmidio recombinante como vector de expresión, el cual porta dicha secuencia bajo el control del promotor triptófano (ptrip) de E. coli, seguida por sitios de restricción Xbal, EcoRV y BamHI que permiten la clonación en fase de fragmentos de ADN codificantes para polipéptidos de interés. Este vector consta además del terminador de la transcripción del gen 32 del bacteriófago T4, y de un gen de resistencia a ampicilina como marcador de selección.
Este procedimiento hace posible además la inclusión del polipéptido de fusión obtenido en preparados vacunales destinados al uso en humanos; y la naturaleza del péptido estabilizador empleado permite la generación de una respuesta inmune eficaz contra la proteína foránea o péptido multiepitópico unido al mismo.
Constituye una novedad de la presente invención la manipulación genética y el uso de un fragmento estabilizador homólogo a parte del dominio de unión al ácido lipoico de las dihidrolipoamida acetil transferasas para la producción de proteínas de fusión por vía recombinante en E. coli. Particularmente, constituyen novedades de la presente invención el uso con el anterior objetivo de un péptido estabilizador derivado de los primeros 47 aminoácidos del antígeno P64k de N. meningitidis B:4:P1.15 (solicitud de Patente Europea No. 0 474 313 A2), y su detección mediante un anticuerpo monoclonal murino que lo reconoce específicamente .
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
EJEMPLO 1:
El antígeno LpdA de N. meningitidis (P64k, LpdA) es una proteína de 594 aminoácidos que pertenece a la familia de las dihidrolipoamida deshidrogenasas (EC 1.8.1.4) y específicamente, a un nuevo subgrupo dentro de las mismas caracterizado por poseer un dominio de unión al ácido lipoico, análogo al presente en las dihidrolipoamida acetil transferasas, en su porción arninoterrninal (Kruger, N., Oppermann, F. B., Lorenzl, H. y Steinbüchel, A., J. Bacteriol., 176, 3614-3630, 1994; Hein, S. y Steinbüchel, A., J. Bacteriol., 176, 4394-4408, 1994). La proteína LpdA ha sido clonada y sobrexpresada en E. coli, con la adición de 5 aminoácidos (MLDKR) en su extremo aminoterrninal (solicitud de Patente Europea No. 0 474 313 A2; Figura 1). Aunque las denominaciones LpdA y P64k son equivalentes, se usará el nombre P64k para referirse a la proteína recombinante. Para determinar la inmunogenicidad de diferentes fragmentos de dicho antígeno con el objetivo de analizar la posibilidad de usar los menos inmunogénicos como péptido estabilizador, se localizaron los epitopos para células B presentes en el mismo mediante la evaluación de la reactividad de un suero policlonal anti-P64k contra péptidos sintéticos.
Con este objetivo se purificó la P64k (solicitud de Patente Europea No. 0 474 313 A2) mediante cromatografía de hidrofobicidad en Butyl-TSK y gel filtración; y se desnaturalizó precipitándola con ácido tricloroacético (TCA), neutralizando con NaOH y equilibrando en tampón fosfato por cromatografía en gel filtración. Esta preparación se usó para inmunizar 30 ratones Balb/c con dosis de 20 mg adyuvadas con 2 mg de hidróxido de aluminio por vía subcutánea, a los 0, 7 y 21 días; y a los 28 días se hizo la extracción final. Los sueros obtenidos se combinaron, y la mezcla resultante se alicuotó y se guardó a -20°C.
A continuación se sintetizaron 59 péptidos de 20 aminoácidos (a. a.) que cubren toda la secuencia de la proteína recombinante y se sobrelapan por 10 a. a., usando un juego de reactivos para la síntesis en fase sólida (Multipin Peptide Synthesis System, Chairon Mimotope Pty., Ltd., USA) en formato de placas de 96 pocilios y siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos se numeraron consecutivamente a partir del extremo aminoterminal de la pro teína. La reactividad del suero antiP64k contra estos péptidos se determinó usando una dilución 1:2000 del mismo, y el formato de inmunoensayo usado fue el recomendado por el fabricante del juego de reactivos anterior.
Los resultados pueden apreciarse en la Figura 2, en la cual se representan los valores de absorbancia para cada péptido. Es evidente que los primeros 1 10 aminoácidos (representados por los péptidos 1 al 1 1) conforman un segmento pobremente inmunogénico a pesar de la desnaturalización del inmunógeno, que puede incluso exponer epitopos crípticos. Este segmento comprende en lo fundamental el dominio de unión al ácido lipoico y el espaciador rico en Prolina y Alanina que lo conecta al resto de la proteína. El resultado anterior demuestra que el mismo (o fragmentos de derivados de él) pueden utilizarse ventajosamente como péptidos estabilizadores, debido a la poca influencia que tendría sobre la inmunogenicidad de los polipéptidos a los que se fusione. Esta ventaja es especialmente importante si el polipéptido de fusión constituye un candidato vacunal.
EJEMPLO 2:
Para la expresión de diferentes proteínas heterólogas en E. coli mediante su fusión al dominio de unión al ácido lipoico del antígeno P64k de N. meningitidis B:4:P1.15 se construyó el vector de expresión pM-83, en el cual se introdujo la secuencia codificante para un péptido estabilizador derivado de los primeros 47 aminoácidos de dicha proteína (NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 1). Esta secuencia se clonó bajo el control del promotor triptófano de E. coli, presentando además este vector el terminador del bacteriófago T4 como señal de terminación de la transcripción y el gen de resistencia a la ampicilina como marcador de selección.
Para su construcción se amplificó primeramente el estabilizador usando la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Randall, K. et al, Science, 42394, 487-491, 1988) a partir del plasmidio pM-6, el cual porta la secuencia nucleotídica codificante para el antígeno P64k (solicitud de Patente Europea No. 0 474 313 A2, Figura 1). Con este fin se usaron los oligonucleótidos cebadores 1573 y 1575, los cuales introducen sitios de restricción Ncol y Xbal en el fragmento de ADN amplificado que corresponden con los extremos amino- y carboxilo-terminal del estabilizador codificado por el mismo:
Ncol
1573: 5' TTCCATGGTAGATAAAAGAATGGCTTTAG 31 (NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 2)
Xbal
1575 : 5 ' TTTCTAGATCCAAAGTAATCAGGGTATCG 3 ' ( NO . IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA : 3)
La secuencia aminoacídica codificada por el estabilizador resultante se muestra en la Figura 3 (NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 6). La introducción del sitio de restricción Ncol cambia la Leucina 2 por una Valina; y el cebador 1575 elimina la secuencia ETD (posición 45-47), introduciendo en su lugar la secuencia DLE. De esta forma la Lisina unidora del ácido lipoico (posición 48) no forma parte del estabilizador, y la vecindad de la misma, que es altamente conservada en estos dominios (Russell, G.C., Guest, J.R., Biochim. Biophys. Acta, 1076, 225-232, 1991) es alterada. Todo esto garantiza la eliminación de las posibilidades de lipoilación postraduccional de las proteínas de fusión que lo contengan, y de generación durante la inmunización con las mismas de autoanticuerpos de parecida especificidad a los presentes en los pacientes de cirrosis biliar primaria (Tuaillon, N., Andre, C, Briand, J.P. et al, J. Immunol., 148, 445-450).
El plasmidio pM-83 fue construido mediante el clonaje de este fragmento (NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5) previamente digerido Xbal/ Ncol en el plasmidio pILM-29 (Guillen, G., Leal, M., Alvarez, A. et al, Acta Biotecnológica, 15, 97- 106, 1995). El pILM29 contiene el gen para la proteína Opc (5c) de N. meningitidis fusionado a un péptido estabilizador consistente en los primeros 58 aminoácidos de la IL-2 humana, de forma que dicha clonación remueve el fragmento de IL-2 y fusiona la Opc al estabilizador de la P64k (Figura 4). Del plasmidio resultante, denominado pM-80, se suprimió a su vez el gen opc usando las enzimas Xbal y BamHI y en su lugar se clonó un adaptador formado por la hibridación de los oligonucleótidos 1576 y 1577, lo que introduce sitios de restricción Xbal, EcoRV y BamHI en el extremo 3' del fragmento estabilizador:
1576 5 ' CTAGATTTGATATCAG 3 ' ( NO . IDENTIFICACIÓN DE
SECUENCIA : 7) 1577 3 ' TAAACTATAGTCCTAG 5 ' (NO . IDENTI FICACIÓN DE
SECUENCIA : 8)
Este plasmidio se denominó pM-83 (Figura 4). La inserción de todos los fragmentos de ADN y oligonucleótidos, así como el mantenimiento del marco correcto de lectura, se verificaron mediante secuenciación del ADN según Sanger, F. et al, PNAS, USA, 74: 5463-5467, 1977.
EJEMPLO 3:
Es importante que el estabilizador no contenga regiones de alta homología con proteínas humanas si la proteína de fusión resultante es un candidato vacunal. La determinación de la similitud del péptido estabilizador del pM-83 (EJEMPLO 2) con proteínas humanas se realizó mediante una búsqueda de homología en las bases de datos EMBL Data Library v.38 (Rice, C.M., Fuchs, R., Higgins, D.G. et al, Nucí. Acids Res. 21 , 2967-2971 , 1993) de secuencias nucleotídicas, y SWISS-PROT v.38 (Bairoch, A. y Boeckmann, B., Nucí. Acids Res. 21 , 3093-3096, 1993) de secuencias aminoacídicas; ambas versiones de marzo de 1994. Para esta búsqueda se usaron dos de los programas BLAST (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. y Lipman, D.J., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990): BLASTP, que compara una secuencia de aminoácidos contra una base de secuencias de proteínas (en este caso SWISS-PROT) y TBLASTN, que compara una secuencia de aminoácidos contra todas las traducciones en ambas direcciones y en todos los marcos de lectura de una base de secuencias de nucleótidos, como en este caso la EMBL Data Library; en ambos casos se usó una matriz de valorización PAM120 [Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. y Orcutt, B.B., en: Dayhoff, M.O. (de.), Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, supl.3, 345-352, Natn. Biomed.Res. Found., Washington, 1978].
El resultado puede apreciarse en la Figura 5 y en la Figura 6, las cuales muestran las hojas de resultados respectivas del BLASTP y el TBLASTN (se han omitido secuencias homologas de procariotes o eucariotes inferiores para mayor claridad). Es obvio que ninguna pro teína humana o de mamíferos presenta similitudes significativas con el estabilizador derivado de la P64k; pues las homologías detectadas por ambos algoritmos (en las piruvato quinasas humanas y de rata; y el extremo C-terminal de las mucinas humanas y caninas) presentan una altísima probabilidad de ocurrencia casual (como punto de comparación, la misma probabilidad, para el caso de la dihidrolipoamida acetil transferasa de Azotobacter vinelandii, es de 3.7X10 5).
De todo lo anterior puede concluirse que el uso de dicho estabilizador en candidatos vacunales es absolutamente seguro.
EJEMPLO 4:
La capacidad del estabilizador presente en el pM-83 de permitir la síntesis intracelular a altos niveles y en forma de cuerpos de inclusión se evaluó comparando la expresión de varias proteínas fusionadas a los primeros 22 o 58 aminoácidos de la Interleucina-2 humana (IL-2), que es un péptido de fusión muy usado con este fin, o fusionadas a los primeros 47 a. a. del antígeno P64k modificado según se describe en el EJEMPLO 2. Para ello se clonaron en los vectores pFP15 (hIL2-58; Patente Europea No. 416 673 Bl) o pM-83 (P64k-47) los genes codificantes para la proteínas de membrana externa de N. meningitidis B:4:P1.15 PorA y Opc; y en los vectores pISL31 (hIL2- 22, Castellanos-Serra, L.R., Hardy, E., Ubieta, R., et al., Manuscrito remitido) o pM-83, los genes codificantes para un polipéptido multiepitópico (PME) que incluye regiones inmunogénicas de varios aislamientos del Virus de la Inmunodeficiencia Humana, VIH. Los plasmidios de expresión resultantes son: pILM-28 (IL2-58 + PorA; Guillen, G., Alvarez, A., León, L., et al, 494-498 en: Conde-González, C.J., Morse, S., Rice, P. et al. (eds)., Pathobiology and Immunobiology of Neisseήaceae, Instituto Nacional de Salud Pública, Cuernavaca, México, 1994), pM-82 (P64k-47 + PorA; Niebla, O. , Alvarez, A., González, S. et al, 85-86 en: Evans, J.S., Yost, S.E. , Maiden, M.C.J. et al. (eds.)., Neisseria 94: Proceedings of the IX International Pathogenic Neisseria Conference, Winchester, England, 1994), pILM-29 (IL2-58 + Opc; Guillen, G., Leal, M., Alvarez, A. et al, Acta Biotecnologica, 15, 97- 106, 1995), pM-80 (EJEMPLO 2, Figura 4), pTAB4 (IL2-22 + PME) y pTAB9 (P64k-47 + PME).
Las proteínas TAB4 y TAB9 son polipéptidos multiepitópicos (PME) que incluyen varias copias de la parte central de la región variable 3 (V3) de la proteína gpl20 del VIH- 1. Para la construcción de estos PME fueron seleccionados los 15 aminoácidos centrales de la región V3 de los aislamientos siguientes:
-LR150 : SRGIRIGPGRAILAT (NO . I DENTI FICACIÓN DE SECUENCIA : 9, -JY1 : RQSTPIGLGQALYTT ( NO . I DENTI FICACIÓN DE SECUENCIA : 1 Q -RF : RKSITKGPGRVIYAT (NO . I DENT I FICAC IÓN DE SECUENCIA : 11) -MN : RKRIHIGPGRAFYTT ( NO . I DENTI FICACIÓN DE SECUENCIA : 12> -BRVA : RKRITMGPGRVYYTT ( NO . I DENTI FICACIÓN DE SECUENCIA : 13 - I I IB : SIRIQRGPGRAFVTI (NO . I DENTI FICACIÓN DE SECUENCIA : 1 $ Estas regiones están unidas entre sí por un péptido espaciador de cinco aminoácidos, de secuencia AGGGA (NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 17). Para su obtención, la secuencia de ADN codificante para los epitopos V3 enlazados por el péptido espaciador se obtuvo por síntesis química (NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 21) y se clonó bajo el control del promotor triptófano, fusionada a los primeros 22 aminoácidos de la IL-2 humana (Figura 7). Del plasmidio resultante, llamado pTAB3, se extrajo un fragmento conteniendo el gen para el PME, el promotor triptófano y el terminador del fago T4 mediante digestión con las enzimas Seal y HindIII, y se clonó en pUC19 (Yanisch-Perron, C. et al., 1985, Gene 33, 103- 1 19) para obtener el pTAB4 (Figura 7). Finalmente, el pTAB9 se construyó eliminando la secuencia codificante para el estabilizador derivado de la IL-2 humana por digestión con las enzimas Ncol y Xbal, y clonando en su lugar un fragmento codificante para los primeros 47 aminoácidos del antígeno P64k obtenido por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), como se describe en el EJEMPLO 2. La secuencia del PME resultante se muestra en la Figura 8, y su organización en la Figura 9 A.
Las cepas hospederas de E. coli K- 12 usadas para todos estos plasmidios fueron la W31 10 (Hill, C.W., y Hamish, B,W. Proc.Natl. Acad. Sci., 78, 7069, 1981 ; Jensen, K. F., J.Bacteriol., 175, 3401-3407, 1993) para pILM-28, pILM-29, pM-80 y pM-82; y la W3110 trpA905, para pTAB4 y pTAB9. La expresión se logró en todos los casos inoculando un cultivo de 5 mL de medio LB (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, New York, USA) con ampicilina (Ap) a 50 μg/mL y triptófano (W) a 100 μg/mL, el cual se creció por 12 h a 37°C. Dicho cultivo se usó para inocular cultivos de 50 mL de LB-Ap (pTAB4 y pTAB9) o de un medio definido compuesto por sales M9 (Miller, J.H., Experimente in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972, New York, USA), glucosa al 1%, hidrolizado de caseína al 1%, CaCi2 0.1 mM, MgCb lmM y Ap a 50 ug/mL (ρILM-28, pILM-29, pM-80, pM-82), los cuales se crecieron 12 h a 37°C y 250 r.p.m. Al cabo de este tiempo se tomaron muestras de proteínas totales y se analizaron mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE, Laemmli, U.K., Nature, 277, 680, 1970) y tinción con Azul Brillante de Coomassie R-250; analizándose el porciento de expresión con un densitómetro de láser Bromma-LKB. Su localización celular se determinó lisando las células mediante tratamiento combinado con lisozima y ultrasonido, tras lo cual se separaron las proteínas solubles de las insolubles por centrifugación. La insolubilidad de la proteína se usó como criterio para asumir su expresión corno cuerpos de inclusión, pues otras condiciones bajo las cuales puede exhibir dicho comportamiento (asociación a membranas o al peptidoglucano) son improbables en este caso.
Un resumen de los resultados puede apreciarse en la Figura 10 A. En todos los casos la expresión bajo el estabilizador derivado de la P64k es comparable a la expresión fusionada a péptidos de la IL-2 en cuanto a la relación de proteína heteróloga: proteína celular total (Ver Figura 10 B para el caso del PME); lo que confirma la capacidad del pM-83 para ser usado como vector para la expresión de péptidos de fusión. Es de señalar que estos polipéptidos son de difícil expresión en E. coli si no se fusionan, ya sea por su pequeño tamaño y sensibilidad a proteasas del hospedero, como el PME, o por su toxicidad en el caso de la proteína PorA y las porinas bacterianas en general (Carbonetti, N.H. y Sparling, P.F.; Proa Nati. Acad. Sci. U.S.A., 84, 9084-9088). En todos los casos el producto se obtuvo como cuerpos de inclusión, como se ejemplifica para el pTAB9 (Figura 10 C).
En conclusión es posible plantear que el uso del estabilizador derivado de los primeros 47 aminoácidos del antígeno P64k de N. meningitidis (P64k-47) resulta en una eficiencia de expresión de proteínas heterólogas como cuerpos de inclusión comparable a la de otros sistemas (solicitudes de patentes europeas No. 0 416 673 A2 y No. 229 998, Hoechst AG; patente europea No. 0 416 673 Bl ; Castellanos-Serra, L.R., Hardy, E., Ubieta, R., et al., Manuscrito remitido), con el beneficio adicional de poder usarse el producto directamente (i.e., sin separarlo del estabilizador) debido a la ausencia de homología significativa con antígenos de procedencia humana. EJEMPLO 5:
La disponibilidad de un ligando que reconozca específicamente el estabilizador (Ej. un anticuerpo, un cofactor enzimático, etc.) es una característica deseable en cualquier sistema de expresión de proteínas recomδbinantes. Esto se debe a que lo anterior puede permitir, por ejemplo, el diseño de esquemas eficientes de purificación por afinidad si se inmoviliza dicho ligando en una resina cromatográfica; e incluso -en el caso de los anticuerpos- el seguimiento de los pasos intermedios de la purificación mediante técnicas inmunológicas, independientemente de la identidad de la proteina heteróloga expresada.
Dicho objetivo se alcanzó inmunizando ratones con la proteína TAB13 (NO.
IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 20) con la finalidad de obtener anticuerpos monoclonales (MAb) contra su estabilizador. TAB13 es un PME derivado del
TAB9 que se diferencia de este por la presencia de 2 regiones V3 consenso adicionales (Figura 9 B):
-C6 : TSITIGPGQVFYRTG (NO . IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA : 15 ) -C8 : RQRTSIGQGQALYTT ( NO . IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA : 16 )
Este PME fue expresado (EJEMPLO 4) y purificado (EJEMPLO 6) de manera análoga a la descrita para los TAB4 y TAB9.
A continuación se inmunizaron ratones Balb/c por vía subcutánea con 3 dosis de 20 μg de TAB13 adyuvado en Al(OH)3 con 15 días de intervalo; y una reactivación por vía intraperitoneal con 20 μg de TAB13 en solución tampón fosfato, 20 días después de la última dosis. Los esplecnocitos de este animal se fundieron con el mieloma X63 Ag8 653 y los hibridomas resultantes se aislaron y pesquisaron según métodos establecidos (Gavilondo, J.V. (ed.), Anticuerpos Monoclonales: Teoría y Práctica, Elfos Scientiae, 1995, La Habana, Cuba). La reactividad de los anticuerpos secretados por los hibridomas aislados se evaluó mediante ELISA, recubriendo con el PME TAB13, la pro teína P64k o péptidos sintéticos representando las diferentes regiones V3 presentes en TAB13. En total se obtuvieron 18 clones positivos, uno de los cuales, el denominado 448/30/7, reconoce tanto a TAB13 como a la P64k, pero a ninguno de los péptidos de la gpl20.
La especificidad de este MAb por el péptido estabilizador del pM-83 y la posibilidad de su uso para la detección inmunológica de proteínas que lo contengan se determinó mediante Western blotting, usando como muestras diferentes proteínas heterólogas fusionadas al estabilizador derivado de la P64k (P64k-47), o la misma proteína fusionada ya al P64k-47 o a los primeros 58 aminoácidos de la IL-2 (IL2-58). Para esto se transformó la cepa MM294 de E. coli (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA) con los siguientes plasmidios: pILM-28 (IL2-58 + porA), pM-82 (P64k-47 + porA), pTAB13 (P64k-47 + PME), pM-6 (P64k) y pFP15 (IL-2). También se usó el plasmidio de expresión pM-134, el cual contiene los primeros 120 aminoácidos de la P64k (los cuales comprenden el sitio de unión al ácido lipoico) bajo idénticas señales regulatorias a los anteriores. Este segmento se amplificó por RCP usando los cebadores Nos. 1573 (NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 2) y 2192 (NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 4); se digirió con las enzimas Ncol y BamHI, y se clonó en el plasmidio pFP15 (Ver EJEMPLO 4) digerido idénticamente. La expresión de estos transformantes se logró en las condiciones de crecimiento especificadas en el EJEMPLO 4 para el pTAB4 y el pTAB9.
En la Figura 1 1 se representan los resultados. Como puede apreciarse, el MAb 448/30/7 reconoce un epitopo probablemente lineal en el estabilizador P64k-47, debido a su reactividad con las muestras de los plasmidios pM-6, pM- 82, pTAB13 y pM 134 a pesar de ser todas estas proteínas antigénicamente disímiles. Este experimento demuestra que en ningún caso esta reactividad se debe a la proteína fusionada al estabilizador (ver Ej. los plasmidios pILM-28 y pM-82: ambos portan el gen porA bajo diferentes estabilizadores) y evidencia la especificidad de reconocimiento del MAb.
En conclusión, el sistema de expresión conformado por el estabilizador P64k- 47, los plasmidios que lo contienen y el MAb 448/30/7 permite la síntesis eficiente y en forma de cuerpos de inclusión de una gran variedad de proteínas, y su detección sin la disponibilidad previa de sondas inmunológicas contra cada polipéptido a expresar. EJEMPLO 6: La ausencia de efectos deletéreos sobre la respuesta inmune contra el polipéptido fusionado al estabilizador es un factor importante a tener en cuenta al seleccionar un sistema de expresión para candidatos vacunales. Una de las ventajas del sistema de expresión basado en el estabilizador P64k-47 es precisamente su baja inmunogenicidad (EJEMPLO 1), la cual garantiza lo anterior. No obstante, se evaluó cualitativamente la influencia del estabilizador P64k-47 en la respuesta inmune contra la proteína fusionada mediante la WO 97/26359 λ '
comparación de la respuesta- de anticuerpos contra los diferentes péptidos del V3 presentes en los PME TAB4 (IL2-22) y TAB9 (P64k-47).
Para la expresión y la purificación de TAB4 y TAB9, se obtuvo biomasa de las cepas W31 10 trpA905 + pTAB4 y W3110 trpA905 + pTAB9 como se describe en el 5 EJEMPLO 4. Esta biomasa se rompió combinando el tratamiento con lisozima y con ultrasonido en presencia de fluoruro de fenilmetil sulfonilo (PMSF) y el detergente no iónico Tritón-X-100; se obtuvieron los cuerpos de inclusión por centrifugación diferencial, y se purificaron parcialmente y solubilizaron los PME mediante dos ciclos sucesivos de lavados de los cuerpos de inclusión con agentes 0 caotrópicos y detergentes (TAB4: 1. Urea 4 M + Tritón-X-100 1%, 2. Urea 8 M. TAB9: 1. Urea 8 M + Tritón-X-100 1%, 2. cloruro de guanidinio 6 M). Los sobrenadantes obtenidos se purificaron finalmente usando un gradiente de 20 a 80% de acetonitrilo en una columna C4 VYDAC de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), lográndose aproximadamente un 90% de pureza. 5 Las proteínas recombinantes purificadas se adyuvaron en gel de hidróxido de aluminio usando una relación de 60 mg de adyuvante por mg de proteína, y con las mismas se inmunizaron 5 grupos de conejos por vía subcutánea con 200 μg/dosis. La respuesta se evaluó por ELISA, usando placas de poliestireno de 96 pocilios (High binding, Costar, USA), y recubriendo bien con el PME usado para o la inmunización, o con péptidos correspondientes a cada una de las regiones V3 presentes en el mismo. Los títulos se calcularon como la máxima dilución de cada suero con un valor de absorbancia mayor al doble del de una mezcla de sueros preinmunes; todos los sueros se analizaron por duplicado.
Los valores obtenidos (Figura 12) muestran que los títulos contra las regiones 5 V3 son similares entre las variantes IL2-22 + PME (TAB4) y P64K-47 + PME (TAB9). Aunque la frecuencia de reconocimiento de los péptidos es ligeramente mayor para el TAB9, esta diferencia no es estadísticamente significativa (p < 0.05). En conclusión, la inmunogenicidad de la proteína heteróloga es afectada por el estabilizador P64k-47 de forma mínima, y comparable a otros sistemas de expresión corrientemente en uso. Breve descripción de las Figuras:
Figura 1: Secuencia nucleotídica del gen P64k. Se muestra en itálicas la secuencia adicionada en el plasmidio pM-6 (solicitud de Patente Europea No. 0 474 313 A2), ausente originalmente en el gen IpdA.
Figura 2: Reactividad del suero policlonal de ratón contra péptidos de la P64k. Se escogió un valor mínimo de 0.4 unidades de densidad óptica para considerar el resultado como positivo.
Figura 3: Secuencia aminoacídica del estabilizador, deducida de la secuencia de ADN amplificada por RCP a partir del plasmidio pM-6. Las secuencias subrayadas corresponden a los oligonucleótidos cebadores. Figura 4: Estrategia de construcción del plásmido pM-83. Figura 5: Resultados de la búsqueda de homología entre las secuencias del estabilizador ('Query') y las presentes en la base SWISS-PROT ('Sbjct'), usando el programa BLASTP. Sólo se muestran las entradas correspondientes a proteínas humanas o de mamíferos. P(N) representa la probabilidad de encontrar N alineamientos iguales en una base compuesta de secuencias aleatorias; la significancia de la homología disminuye con el valor de P(N). Residuos idénticos se representan con su código de una letra; las sustituciones conservativas con un '+', y las diferencias no se señalan.
Figura 6: Resultados de la búsqueda de homología entre las secuenc.as del estabilizador ('Query') y todas la posibles traducciones de las secuencias de la EMBL Data Library ('Sbjct'), usando el programa TBLASTN. Sólo se muestran las entradas correspondientes a proteínas humanas o de mamíferos. P(N) representa la probabilidad de encontrar N alineamientos iguales en una base compuesta de secuencias aleatorias; la significancia de la homología disminuye con el valor de P(N). Residuos idénticos se representan con su código de una letra; las sustituciones conservativas con un '+', y las diferencias no se señalan. Figura 7: Estrategia de construcción de pTAB4 y pTAB9. Figura 8: Secuencia nucleotídica y aminoacídica del PME TAB9.
Figura 9: A: Estructura general de los PME TAB4 y TAB9. B: Estructura general del PME TAB13. Figura 10: Comparación- de la expresión de los genes porA, opc y del PME bajo estabilizadores derivados de la IL-2 humana o de los primeros 47 aminoácidos del antígeno P64k.
A: Tabla comparativa. hIL2-58 se refiere a los primeros 58 aminoácidos de la IL-2 humana, hIL2-22 a los primeros 22, y P64k-47 al estabilizador derivado de los primeros 47 aminoácidos del antígeno P64k.
B: Análisis comparado por SDS-PAGE de la expresión del PME en los plasmidios TAB4 y TAB9. Carril A: Marcadores de peso molecular; B: Proteínas totales de la cepa W3110 trpA905; C: Proteínas totales de W3J 10 trpA905 + pTAB4; D: TAB4 purificada; E: Proteínas totales de W31 10 trpA905 + pTAB9; F:
TAB9 purificada.
C: Expresión de TAB9 en cuerpos de inclusión. A: Proteínas solubles de la muestra. B: Proteínas insolubles o de membrana.
Figura 11: Western blotting' usando el MAb 448/30/7 con muestras de proteínas totales de E. coli MM294 transformada con: 1: Control negativo, 2: pM-6 (P64k), 3: pM-82 (P64k-47 + porA), 4: pTAB13 (P64k-47 + PME), 5: pFP15
(IL-2), 6: pM- 134 (P64k-120), 7: pILM-28 (IL2-58 + porA). A la izquierda se representa la migración de los patrones de peso molecular.
Figura 12: Recíproco del valor del título por ELISA de los conejos inmunizados con TAB4 y TAB9. MG: Media geométrica del recíproco de los títulos anti V3; R: Porciento de reactividad con los péptidos V3.
LISTA DE SECUENCIAS
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 1
TIPO DE SECUENCIA: Ammoacídica
LONGITUD: 47 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Primeros 47 aminoácidos de la proteina recombinante P64k de N. menmgi tidis .
MLDKRMALVELKVPDIGGHENVDIIAVEVNVGDTIAVDDTLITLETD 44
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 2
TIPO DE SECUENCIA: Nucleotídica
LONGITUD: 29 bases
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleotido sintético
PROPIEDADES: Cebador 5' No. 1573 para amplificación por RCP de los primeros 44 aminoácidos del antigeno P64k de N. memngi tidis .
TTCCATGGTAGATAAAAGAATGGCTTTAG 29
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 3
TIPO DE SECUENCIA: Nucleotidica
LONGITUD: 29 bases
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético
PROPIEDADES: Cebador 3' No. 1575 para amplificación por RCP de los primeros 44 aminoácidos del antigeno P64k de N. meningi tidis .
TTTCTAGATCCAAAGTAATCAGGGTATCG 29
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 4
TIPO DE SECUENCIA: Nucleotidica
LONGITUD: 26 bases
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleotido sintético
PROPIEDADES: Cebador 3' No. 2192 para amplificación por RCP de los primeros 120 aminoácidos del antigeno P64k de N. menmgi tidis .
GGCGGTTCTGCCGATTAAGGATCCGA 26 NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5
TIPO DE SECUENCIA: Nucleotidica
LONGITUD: 146 pares de bases
TIPO DE CADENA: Doble
TIPO DE MOLÉCULA: Fragmento amplificado por RCP
CARACTERÍSTICAS: Posición 3 a 8, sitio de restricción Ncol; 139 a
144, sitio de restricción Xbal
PROPIEDADES: Derivado de los primeros 47 aminoácidos del antigeno
P64k de N. memngi tidi s ; la introducción de los sitios de restricción provoca cambios en la secuencia nucleotidica del mismo.
TTCCATGGTAGATAAAAGAATGGCTTTAGTTGAATTGAAAGTGCCCGACATTGGCGGACA β0 CGAAAATGTAGATATTATCGCGGTTGAAGTAAACGTGGGCGACACTATTGCTGTGGACGA 120 TACCCTGATTACTTTGGATCTAGAAA 146
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 6
TIPO DE SECUENCIA: Aminoacidica
LONGITUD: 47 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Estabilizador derivado de los primeros 47 aminoácidos del antigeno P64k de Neisseπa meningi tidis
PROPIEDADES: Tiene los siguientes cambios respecto a P64K: L2→V2;
E45→D45; T46→L46; D47→E47
MVDKRMALVELKVPDIGGHENVDIIAVEVNVGDTIAVDDTLITLDLE 47
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 7
TIPO DE SECUENCIA: Nucleotidica
LONGITUD: 16 bases
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleotido sintético.
CTAGATTTGATATCAG 16
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 8
TIPO DE SECUENCIA: Nucleotidica
LONGITUD: 16 bases
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleotido sintético
GATCCTGATATCAAAT 16
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 9
TIPO DE SECUENCIA: Ammoacidica
LONGITUD: 15 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Región central del lazo V3 de la gpl20 del HIV-1, aislamiento LR150
SRGIRIGPGRAILAT 15 NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 10
TIPO DE SECUENCIA: Aminoacídica
LONGITUD: 15 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Región central del lazo V3 de la gpl20 del HIV-1, aislamiento JY1.
RQSTPIGLGQALYTT 15
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 11
TIPO DE SECUENCIA: Aminoacídica
LONGITUD: 15 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Región central del lazo V3 de la gpl20 del HIV-1, aislamiento RF.
RKSITKGPGRVIYAT 15
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 12
TIPO DE SECUENCIA: Aminoacídica
LONGITUD: 15 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Región central del lazo V3 de la gpl20 del HIV-1, aislamiento MN.
RKRIHIGPGRAFYTT 15
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 13
TIPO DE SECUENCIA: Aminoacídica
LONGITUD: 15 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Región central del lazo V3 de la gpl20 del HIV-1, aislamiento BRVA.
RKRITMGPGRVYYTT 15
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 14
TIPO DE SECUENCIA: Aminoacídica
LONGITUD: 15 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Región central del lazo V3 de la gpl20 del HIV-1, aislamiento IIIB.
OSIRIQRGPGRAFVTI 15
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 15 TIPO DE SECUENCIA: Aminoacídica LONGITUD: 15 aminoácidos"
TIPO DE MOLÉCULA: Secuencia consenso de la región central del lazo V3 de la gpl20 de diferentes aislamientos del HIV-1, posición dentro del PME TAB13.
TSITIGPGQVFYRTG 15
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 16
TIPO DE SECUENCIA: Ammoacídica
LONGITUD: 15 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Secuencia consenso de la región central del lazo
V3 de la gpl20 de diferentes aislamientos del HIV-1, posición 8 dentro del PME TAB13.
RQRTSIGQGQALYTT 15
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 17
TIPO DE SECUENCIA: Ammoacídica
LONGITUD: 5 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Espaciador flexible que separa los epitopos V3 en los PME TAB3, TAB4, TAB9 y TAB13
AGGGA 5
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 18
TIPO DE SECUENCIA: Aminoacídica
LONGITUD: 141 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Polipéptido multiepitópico (PME) TAB4
MAPTSSSTAQTQLQLEHLLLDLQIFLSRGIRIGPGRAILATAGGGARQSTPIGLGGALYT 60 TAGGGARKSITKGPGRVIYATAGGGARKRIHIGPGRAFYTTAGGGARKRITMGPGRVYYT 120 TAGGGASIRIQRGPGRAFVTI 141
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 19
TIPO DE SECUENCIA: Aminoacídica
LONGITUD: 162 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Polipéptido multiepitópico (PME) TAB9
MVDKRMALVELKVPDIGGHENVDIIAVEVNVGDTIAVDDTLITLDLDSRGIRIGPGRAIL 60 ATAGGGARQSTPIGLGGALYTTAGGGARKSITKGPGRVIYATAGGGARKRIHIGPGRAFY 120 TTAGGGARKRITMGPGRVYYTTAGGGASIRIQRGPGRAFVTI 162 NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 20
TIPO DE SECUENCIA: Aminoacídica
LONGITUD: 202 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Polipéptido multiepitópico (PME) TAB13
MVDKRMALVELKVPDIGGHENVDIIAVEVNVGDTIAVDDTLITLDLDSRGIRIGPGRAIL 60
ATAGGGAROSTPIGLGOALYTTAGGGARKSITKGPGRVIYATAGGGARKRIHIGPGRAFY 120
TTAGGGARKRITMGPGRVYYTTAGGGARORTSIGOGOALYTTAGGGATSITIGPGOVFYR 180
TGAGGGASIRIQRGPGRAFVTI 202
NO. IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 21
TIPO DE SECUENCIA: Nucleotídica
LONGITUD: 368 pares de bases
TIPO DE CADENA: Doble
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético
CARACTERÍSTICAS: Posición 1 a 6, sitio de restricción Xbal; posición 363 a 368, sitio de restricción BamHI
PROPIEDADES: Codifica para los epitopos V3 unidos por el espaciador
AGGGA en el PME TAB9
TCTAGACTCGAGAGGCATTCGTATCGGCCCAGGTCGCGCAATTTTAGCAACAGCTGGCGG 60 TGGCGCACGTCAATCTACCCCTATTGGTTTAGGTCAGGCTCTGTATACGACTGCCGGCGG 120 TGGTGCGCGCAAAAGTATCACCAAGGGTCCAGGCCGCGTCATTTACGCCACCGCGGGCGG 180 CGGTGCCCGTAAGCGTATCCACATTGGCCCAGGCCGTGCATTCTATACTACAGCAGGTGG 240 TGGCGCACGTAAACGCATCACTATGGGTCCTGGTCGCGTCTATTACACGACCGCTGGCGG 300 CGGTGCTAGCATTCGCATCCAACGCGGCCCTGGTCGTGCATTTGTGACCATATGATAACG 360 CGGGATCC 368

Claims

• REIVINDICACIONES
1.- Proteína de fusión caracterizada porque contiene un péptido estabilizador derivado de los primeros 47 aminoácidos del extremo N-terrninal del antí geno P64k de Neisseria meningitidis B:4:P1.15, la cual es fusionada a una proteína heterólcga.
2.- Una proteína de fusión según la reivindicación 1 caracterizada porque dicha proteína heteróloga es una proteína de la membrana externa de Neisseria meningitidis.
3.- Una proteína de fusión según la reivindicación 1 y 2 caracterizada porque dicha proteína heteróloga es la proteína Opc (5c) o la proteína PorA de Neisseria meningitidis.
4.- Una proteína de fusión según la reivindicación 1 caracterizada porque dicha proteína heteróloga es un polipéptido multiepitópico que incluye varias copias de la parte central de la región variable 3 (V3) de la proteína gpl20 del VIH-1.
5.- Una proteína de fusión según la reivindicación 1 y 4 caracterizada porque dicha proteína heteróloga son los polipéptidos TAB4 y /ó TAB9.
6.- Un método para la purificación de proteínas heterólogas caracterizado porque se basa en el empleo de polipéptidos de fusión en Escherichia coli mediante el uso de un péptido estabilizador derivado de los primeros 47 aminoácidos del extremo N- terminal del antígeno P64k de Neisseria meningitidis B:4:P1.15 y que emplea un anticuerpo monoclonal específico para dicho estabilizador que permite la inmunodetección de cualquier proteína fusionada al mismo.
7.- Un método según la reivindicación 6 caracterizado porque la secuencia arriinoacídica del péptido estabilizador se corresponde esencialmente con (NO. DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 6)
10 20 30 40 47
MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDI IAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE
8.- Un método según la reivindicación 6 caracterizado porque el anticuerpo monoclonal empleado para la purificación de la proteína de fusión es el denominado 448/30/7.
9.- Un método según la reivindicación 6 caracterizado porque la proteína heteróloga expresada es cualquier proteína que pueda ser empleada como inmunógeno en una preparación vacunal.
10.- Un método según la reivindicación 6 caracterizado porque la proteína heteróloga expresada son los polipéptidos multiepitópicos TAB4 y/ó TAB9 ó las proteínas de la membrana externa Opc (5c) o PorA de Neisseria meningitidis.
1 1.- El anticuerpo monoclonal 448/30/7 caracterizado porque es específico para el péptido estabilizador derivado de los primeros 47 aminoácidos del extremo N- terminal del antígeno P64k de Neisseria meningitidis B:4:P1.15 y es empleado para la inmunodetección y la purificación de cualquier proteína fusionada al mismo.
12.- Un vector de expresión para la expresión de proteínas de fusión en Escherichia coli caracterizado porque contiene una secuencia que codifica para un péptido estabilizador derivado de los primeros 47 aminoácidos del extremo N-terminal del antígeno P64k de Neisseria meningitidis B:4:P1.15, bajo el control del promotor triptófano de Escherichia coli, seguida por sitios de restricción Xbal, EcoRV y BamHI para la clonación en fase de fragmentos de ADN codificantes para polipéptidos de interés, y como terminador el de la transcripción del fago T4, así como un gen de resistencia a ampicilina como marcador de selección.
13.- Un vector de expresión para la expresión de proteínas de fusión en Escherichia coli según la reivindicación 12, caracterizado porque contiene una secuercia que codifica para un péptido estabilizador derivado de los primeros 47 aminoácidos del extremo N-terminal del antígeno P64k de Neisseria meningitidis B:4:P1.15, bajo el control del promotor triptófano de E. coli, seguida por sitios de restricción Xbal, EcoRV y BamHI para la clonación en fase de fragmentos de ADN codificantes para proteínas de la membrana externa de Neisseria meningitidis.
14.- Un vector de expresión para la expresión de proteínas de fusión en Escherichia coli según las reivindicaciones 12 y 13 caracterizado porque son los plasmidios pM- 80 y pM-82.
15.- Un vector de expresión para la expresión de proteínas de fusión en Escherichia coli según la reivindicación 12 caracterizado porque contiene una secuencia que codifica para un péptido estabilizador derivado de los primeros 47 aminoácidos del extremo N-terminal del antígeno P64k de Neisseria meningitidis B:4:P1.15, bajo el control del promotor triptófano de Escherichia coli, seguida por sitios de restricción Xbal, EcoRV y BamHI para la clonación en fase de fragmentos de ADN codificantes para polipéptidos multiepitópicos que incluyen varias copias de la parte central de la región variable 3 (V3) de la proteína gpl20 del VIH- 1.
16.- Un vector de expresión según las reivindicaciones 12 y 15 caracterizado porque son los plasmidios pTAB4 y pTAB9.
17.- Cepa de Escherichia coli recombinante caracterizada porque es obtenida como resultado de la transfomación de cualquier cepa de Escherichia coli K- 12 con los t- vectores pM-80, pM-82 así como pTAB4 y pTAB9 respectivamente, la cual exprese proteínas de fusión según las reivindicaciones 3 y 5.
18.- Uso de las proteínas de fusión según las reivindicaciones de la 1 a la 5 en preparados vacunales destinados al uso en humanos o animales.
19.- Composición vacunal caracterizada porque está constituida por la proteína de ^ Q fusión de las reivindicaciones de la 1 a la 5 que contiene un antígeno heterólogo formado por un péptido estabilizador derivado de los primeros 47 aminoácidos del extremo N-terminal del antígeno P64k de Neisseria meningitidis B:4:P1.15 fusionado a una proteína heteróloga, así como un adyuvante apropiado.
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