KR19980703043A - 융합단백질로서의 비정형 항원 압출시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 E.coli에서의 유전자재조합 DNA 기술에 의한 융합단백질의 생산을 위하여 다이히드로리포아미드 아세틸의 리포산 결합영역에 대한 정형의 안정제 펩티드의 사용과 유전자조작을 통한 비정형 항원의 압출시스템에 관한 것으로 특히 본 발명의 신규성을 구성하는 것은 앞서 언급한 목적과 함께 N. meninggitidis B:4:P1.15의 P64K의 최초 47 아미노산의 유도한 안정제 펩티드 및 그 안정제를 인식하는 모노크로널 항체의 사용이다.

Description

융합단백질로서의 비정형 항원 압출시스템
E.coli에서는 어떤 종의 단백질을 생산하기 위하여 유전자재조합 DNA의 기술 사용이 광범위하게 시사되어 왔다. 이를 위하여 상당한 양의 벡터(숙주의 체내에서 발육하여 비로소 병원균으로 되는 것)가 개발되어 왔는 데 그럼에도 불구하고 종종 클론을 만들고 압출을 하기 위한 유전자가 개별적인 경우를 나타내는 경우가 허다하므로 새로운 변종이 필요하게 되었다.(Denhardt, D.T. and Colasanti, J.; Vectors, Butterworths, Stoneham, M, pp. 1791987 and Lukacsovich, T.et al., Journal of Biotechnology, 13, 2431990).
세포내합성은 높은 압출수준에 도달할 수 있기 때문에 E.coli에서 비정형의 폴리펩티드를 얻기 위해 가장 많이 사용되어 오고 있다(Goeddel, D.V, Methods Enzymol., 185, 3/7, 1990). 그런데 압출된 단백질의 유독성 또는 숙주의 프로테아제(단백질 분해효소)에 대한 민감성과 같은 요소는 고효율의 규제적 시퀀스의 사용과는 별도로 상기 압출수준을 심하게 감소시킨다(Reads, C.A. and Saier, M.H., J.Bacteriol., 153, 685-692; Gwyn, G.W., Membrane Protein Expression Systems: To User's Guide, Portland Press, London, UK, 29-82).
숙주세포에서 안정된 폴리펩타이드를 코드하고 있는 뉴클레오산의 시퀀스와 짝을 이루는 적당한 벡터에서의 원하는 단백질을 위한 코딩하고 있는 뉴클레오티드 시퀀스의 클론닝은 융합단백질이라고 알려져 있는 세포질에서의 혼성제품의 압출을 증가시킨다. 그러한 폴리펩타이드는 일반적으로 봉입체의 형성에 근거한 적은 독소나 숙주 때문에 단백질의 변성(복잡한 화합물이 단순한 구조로 변화하는 것)에 대하여 그리 민감하지 못한데 이는 안정제 펩티드의 사용없이 얻어진 것에 대하여 더 높은 고압출수준을 달성케 한다.
나아가 이러한 종류의 압출은 만약 연속적인 유전자재조합의 제품의 변성에 대한 다른 방법이 가능하다고 한다면 순수화의 최초단계를 용이하게 할 뿐만 아니라 그 비용도 절감하게 한다.(Fischer, B., Sumner, I. and Goodenough, P., Biotechnol. Bioeng., 41, 3-13).
봉입체는 E.coli에 많은 유전자재조작 단백질(아미노산을 기초로 한 복잡한 고분자화합물)의 압출동안 시토솔에서 전기적으로 비전도체로서 나타나는 비용해성 단백질 집합체이다.(Rinas, Or. and Bailey, J., Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, 609-614). 그들은 부분적으로 접혀진 폴리펩티드들 사이의 상호작용의 결과로 나타나는 것이며 이들집합체는 그들안에 있는 히드로포빅(hydrofobic) 잔여물의 용제에 대한 노출 때문에 열동적인(Thermodynamically)성향을 갖는다(Kiefhaber, t., Rudolph, R. et al., Biotechnology, 9, 825-829). 디설퍼 브리지-형성 아미노산(Cystein) 또는 베타-turns 형성 아미노산(Proline) 때문에 많은 성숙핵세포 단백질의 박테리아의 시토졸(citosol)에서 낮은 속도의 접힘이 일어나는데 이것은 안정제 펩티드로서 그들의 풍부한 사용을 자극하게 된다.
이러한 목적으로 예를 들면 항체와 결합활동을 하는 폴리펩티드의 사용은 국제 특허 출원 PCT 제 WO 9207939 A2 20514에 따라 인체 우유(HMFG)의 지방의 글로블린으로부터 나오는 전자의 보기 ; 유럽특허출원 제 EP 0464533 A1 920108으로부터 면역글로블린의 일정한 영역으로부터 ; 인체 성장호르몬(EP 0429586 A1 910605)의 혈관(유럽특허출원 제 EP 0423641 A2 910424), 글루테이션 -S- 트랜스페라제(WO 8809372 A1 881201) 그리고 더러운 아데닐퀴나제(EP 0423641 A2 910424 및 EP 0412526 A2 910213).
그런데 융합단백질의 중요한 부분을 점유하는 안정제 폴리펩티드(2종 이상의 아미노산 혹은 1종 이상의 펩티드를 가진 화합물)의 사용은 만약 전자가 백신용이라면 여러가지 단점을 가지게 되는데 이는 왜냐하면 외부의 시퀀스의 존재가 B와 T 세포 에피토프(분자상의 특이항원 결정부위 또는 장소)의 원래의 질서를 변경시킬 수 있거나(Denton, G., Hedecz, F., Kajtar, J. et al., Peptide Research, 7, 258-264) 또는 특정에피토프폐쇄현상(Etlinger)에 의하여 심각하게 벡신의 면역유전에 영향을 줄 수 있는 같은 작용이 세포의 항원에 의하여 일어날 수 있기 때문이다.
위에서 설명한 바와 같은 현상의 결과로 어떤 경우에 압출을 안정화시키고 있는 조그만 조각들은 경계를 한정하려는 경향을 가지게 된다. 예를 들면 독일 특허 출원 제. 35 41 856은 E.COLI에서 합성된 비용해형태의 합성단백질을 얻기 위해서 적어도 인체단백질 중간백혈구(IL-2)의 N-터미널의 최초 95 아미노산에 의하여 합치하는 안정제 펩티드를 사용할 수 있는 가능성을 제시하였다.
이와 유사한 것으로서 유럽특허출원 제0 416 673 A2와 같은 회사가 출원인인 제 229 998 호에서는 상기 단백질의 최초 58 또는 38 아미노산과 밀착된 안정제 펩티드가 사용되었다. 유럽특허 제416 673 B1에서도 역시 IL-2의 최초 58 아미노산이 사용되었으며 이러한 목적으로서 인체 혈청알부민(유럽특허출원 제 EP 0423641 A1 920212) N-터미널의 사용 즉 연결조직(WO 90136647 A1 901115)의 활성체 펩티드 Ⅲ와 인체의 칼리크레인(췌장, 혈액, 요, 타액 등에서 추출되는 순환계호르몬으로 강압작용을 한다)(EP 0381433 A1 900808)과 같은 경우에 이와 유사한 방법이 뒤따랐다.
이들 발명들은 앞서 제시한 문제점에 대한 해결책을 제시하고 있으나 이렇게 얻어진 융합폴리펩티드는 인체단백질과 서로 같거나 동일한 것의 존재 때문에 자기면역병의 유발가능성이 있어서 인체에 사용될 수 있는 백신조제안에 포함될 수는 없었다.
박테리아종(種)의 안정제 폴리펩티드의 사용의 대안은 -- 그러므로 인류종의 항원과의 교차상호작용없이 --- 세포내 압출을 위해서 성공적으로 연구되어 오고 있다. 이러한 목적을 가진 가장 많이 사용되는 단백질 중의 하나는 E.COLI의 β-갈라토시다제(Itakura, K. et al., Science, 198, 10561977) 또는 그것의 일부분이다(Hoechst AG사의 독일 특허출원 번호 EP 0235754 A2 870909). 그러나 이러한 시스템의 주요 단점은 이러한 단백질의 크기가 매우 크다는 것인데 이는 바람직한 펩티드는 단지 전체 혼성 단백질의 작은 부분이라는 것을 알려주고 있다.(Flowers, N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 25, 2671986; Goeddel, D.V. et al., P.N.A.S. USA, 76, 106).
이와 동일한 문제점은 Pseudomonassp의 근육경력 변성독소와 균체외독소의 C조각의 사용에도 현재한다.(국제출원번호 PCT WO 9403615 A1 940217과 유럽특허출원 EP 0369316 A2 900523).
여러 가지의 아주 바람직한 압출은 E.COLI의 티오레독신(Tiorredoxin과)과의 융합 사용인데 이는 순수화를 용이하게 하기 위하여 삼투압력에 의하여 세포로부터 자유로워지는 성질을 사용하는 것이다.(Elyaagoubi, A., Kohiyama, M., Richarme, G., J. Bacteriol., 176, 7074-7078). 그러나 이러한 방법은 봉입체를 얻는데 기능적이지 못한데 이는 이 절차를 통해서 자유스럽지 못하기 때문이다.
이러한 문제점들의 대부분은 모듈라 융합단백질의 설계로서 해결될 수 있다. 여기에서 안정제 펩티드는 원하는 단백질로부터 양자의 독립적인 접힘을 가능토록 하는 공간자에 의하여 분리되며 이것의 안정제 펩티드의 아미노산은 안정제 펩티드를 특정 엔도펩티다제의 공격에 상당히 민감하게 반응토록 한다.
만약 선택된 안정제를 인식하는 리간드가 있다면 그의 친화력 있는 크로마토그래피에 의하여 융합폴리펩티드를 순수하게 하는 것이 가능하며 각각 다른 프로테아제 처리를 통해서 결국 그것을 안정제로부터 분리하는 것이 가능할 것이다(Cress, D., Shultz, J. and Breitlow, S., Promega you Note, 42, 2-7).
추가의 이점은 순수화의 추가의 중간처리단계를 위해서 압출하기 위한 각각의 단백질에 대한 항체의 필요없이도 분자 상호작용을 이용할 수 있는 가능성이다. 이러한 것으로서 잘 알려진 예로는 Upjohn사의 PCT출원 번호 제 WO 9115589 A1 911017에 묘사된 바에 따라 니켈 키레이트(킬레이트화합물과 같은 착염의)의 친화매트릭스 그리고 탄템에서 6 Hys를 가진 안정제로 구성된 시스템에서 니켈(Ni)이나 아연(Zn)같은 금석과 함께 히스티딘(Hys)을 사용하는 것이다.
이러한 모든 것에도 불구하고 이러한 종류의 압출시스템은 모든 경우에 다 기능하지는 않는다.
왜냐하면 다른 이유들 중에서 원하는 단백질은 선택된 프로테아제를 위한 한정사이트를 가질 수 있거나 접혀지는데 그래서 안정제나 혹은 친화매트릭스(New England Biolabs, The NEB Transcript, 3, 14) 사이의 결합에 간섭하거나 혹은 단순히 그 순수화를 위한 목적으로 그 생물학적 활동에 영향을 미치는 조건을 요구하기 위해서 공간자는 용제(Uhlen, M. and Moks, T., Meth. Enzymol. 185, 129-140; Cress, D., Schulz, J. and Breitlow, S., Promega you Note, 42, 2-7)에 반응하게 된다. 이러한 이유로 각각 다른 변종을 가지는 것이 바람직하다. 왜냐하면 압출하는 각각의 단백질은 특별한 경우가 보통이기 때문이다.
이러한 목적에서 그들은 E. coli의 말토즈결합단백질(MalE)에 근거한 안정제 펩티드를 개발하였는데 이것은 아밀로즈수지(유럽특허출원 EP 0426787 A1 910515)에 친화력을 가지고 있다. 즉 크로람페티콜 아세틸 전이효소(유럽특허출원 제 EP 0131363 A1 850116) 또는 글루테이션-S-전이효소(Amrad Corp., Ltd의 유럽특허출원 제 EP 0293249 A1 88130) 고정된 기질(효소의 작용을 받아서 화학반응을 일으키는 물질)의 매트릭스로서 얻을 수 있음 ; 즉 특허출원 PCT WO 9109946 A1 910711에 따라 staphylococcus aureus의 단백질 A에서 ; Proprionibacterium shermani의 트랜스카르복실라제 복합체의 12.5kDa 단일체에서 이는 생체내에서 비타민 B 복합체의 결정성 비타민이 되며 아비딘(avidin)(Cress, D., Shultz, J. and Breitlow, S., Promega Notes, 42, 2-7, 특허출원 번호 제 EP 0472658 A1 920304 또는 WO 9014431 A1 901129)에 의한 비오틴의 친화력에 기초한 순수화를 가능케 한다.
특별히 흥미를 끄는 것 중에는 유럽특허 EP 0472658 A1 920304 또는 WO 9014431 A1 901129에서 묘사된 방법이 있는데 이는 바이오테크놀로지 리서치 디벨로프먼트 회사(Biotechnology Research and Development Corporation)에 의하여 개발되었다. 이 출원에서의 익스프레션시스템은 E.coli의 디시드로제나제복합체의 E2 단일체라고 알려진 다이히드로리코아미다 아세틸 전이효소(EC 2.3.1.12)의 리포산 결합영역을 사용하는 것으로 기술되어 있다.
이 영역은 그 리신들(Guest, J.R., Angier, J.S. and Russell, G.C., Ann. N.Y. Acad. Sci., 573, 76-99) 중의 하나의 니트로겐에 리포산 분자의 추가로서 생체에서 전병진(竝進)으로 변형되는데 이것은 순수화를 위하여 그리고 오직 리포산의 영역을 인식하는 항체의 사용을 통하여 그것에 융합된 단백질의 식별을 위해서 이용된다.
그런데 이러한 방법은 여러 가지 단점을 가지고 있다. 우선, 그것은 리포산에 대한 결합영역을 포함하는 단백질의 과압출이 세포의 리포화의 능력을 초과하여 그래서 결과로서 리포화가 아닌 영역을 발생시키거나 (Thousands, J. S. and Guest, J. R., Biochem. J., 245, 869-874; Ali, S.T. and Guest, J.R., Biochem. J., 271, 139-145) 또는 옥타노이레이트를 발생시키는데(Ali, S.T., Moir, A.J., Ashton, P.R. et al. Mol. Microbiol., 4,, 943-950; Dardel, F., Packman, L. C. and Perham, R.N., FEBS Lett. 295, 13-16), 이는 면역친화에 의하여 순수화 동안 산출량을 감소시킨다.
두번째로, 이러한 영역의 내용에서 특별히 리포산을 인식하는 항체의 존재를 통상의 요소로 가지는 자기면역종류의 다수의 질병이 있다. 그들 중에는 담즙경화증, 염증과 간장내 담증도관의 진행성차단 등으로 특징지워지는 만성질병이 있다(Tusillon, N., Andre, C., Briand, J.P. et al., J. Immunol., 148, 445-450) ; 그리고 할로테인(halotane)에 의해서 야기되는 간염, 트리플루오로아세틸 리신의 형성에 의하여 야기되는 단백질의 과다사용의 마비(Gut, J., Christen, Or., Frey, N. et al, Toxicology, 97, 199-224) 등이 있다. 이러한 질병을 가진 환자의 혈청은 상기의 복합체를 인식하는 데 그 분자구조는 다이히드로리포아미드 아세틸 전이효소의 배경에 리포산이 복제되어 있다.
이러한 이유로 만약 리포산을 포함하는 융합단백질이 인체에 사용되는 백신용으로 사용되는 것이라면 그러한 펩티드에서는 리포산의 존재를 피하는 것이 바람직하다.
본 발명은 생물공학 및 유전공학분야에 관련된 것으로 특히 유전자재조합 DNA기술을 사용하여 미생물숙주에 있는 비정형 단백질의 압출과 그들의 박테리아 펩티드로의 접합에 관한 것이다.
제 1 도는 P64K를 코딩하고 있는 유전자 1pdA유전자의 뉴클레오티드 시퀀스이다.
원래 유전자 1pdA에 없는 플라스미드 pM-6(유럽특허출원 No. 0474313A2)에서 추가된 시퀀스가 이탤릭체로 보이고 있다.
제 2 도는 P64K의 펩티드에 대한 쥐의 폴리클로널 혈청의 반응이다. 양성적으로 결과를 관찰하기 위해서 0.4 광밀도 유니트의 최소값이 선택되었다.
제 3 도는 플라스미드 pM-6으로부터 PCR에 의하여 확대된 DNA 시퀀스로부터 추출된 시퀀스의 아미노산 시퀀스. 밑줄친 시퀀스는 올리고뉴클레오티드 프리머르에 해당한다.
제 4 도는 플라스미드 PM-83의 구축을 위한 전략도이다.
제 5 도는 BLASTP 프로그램을 이용한 안정제('Query)의 시퀀스와
SWISS-PROT('Sbject')의 그것들 사이에 상동의 조사결과도이다.
인체 단백질 또는 포유동물 단백질의 해당 인컴이 보이고 있다.
P(N)의 랜덤 시퀀스로 구성된 베이스내에 N 동등물 배열을 찾을 수 있는 가능성을 나타낸다.; 유사한 것의 중요성은 P(N)의 값과 함께 감소한다. 동일한 잔류물은 하나의 글자로 된 그들의 코드로 표시된다. 보존치환은 '+' 그리고 차이는 나타나지 않았다.
제 6 도는 TBLASTN 프로그램을 사용하여 안정제의 시퀀스('Query') 및 EMBL 데이터 라이브러리('Subject')의 시퀀스의 모든 가능한 번역 사이의 상동 조사표이다. 인체 단백질이나 포유동물 단백질에 대한 해당 인컴이 표시되어 있다. P(N)은 랜덤시퀀스로 구성되어 있는 베이스 내에 N 동등물 정렬을 발견하는 가능성을 나타낸다. ; 유사한 것의 중요성은 P(N)의 값과 함께 감소한다. 동일한 잔류물은 하나의 클자 코드로 표시된다.: 보존치환은 '+'로 그리고 차이는 나타나지 않았다.
제 7 도는 플라스미드 pTAB4와 pTAB9의 구축전략표이다.
제 8 도는 MEP TAB9의 아미노산 시퀀스와 뉴클레오티드이다.
제 9 도는 A: MEP TAB4와 TAB9의 일반 구조이다. B: MEP TABLE13의 일반구조이다.
제 10 도는 인체 IL-2 또는 P64K 항원의 최초 47 아미노산으로부터 유도된 안정제 하에서 유전자 porA, opc 그리고 MEP의 압출비교표이다.
A: 비교테이블, hIL-58 그것은 인체 IL-2의 최초 58 아미노산을, hIL2-22는 최초 22 그리고 P64K는 P64K 항원의 최초 47 아미노산으로부터 유도된 안정제를 지칭한다.
B: 플라스미드 TAB4 및 TAB9에서 MEP 압출의 SDS-PAGE에 의한 비교분석표이다. 줄 A: 분자량 표시기; B: 스트레인 W 3100 trpA905의 총 단백질; C: W3100 trpA905+ pTAB4; D: 순수화된 TAB4;
E: 총3110 trpA905 pTAB 9의 총 단백질 F: 순수화된 TAB9
C: 봉입체에서의 TAB9의 압출. A: 실시예의 용해가능한 단백질 B: 멤 브레인의 비용해의 단백질
제 11 도는 E.coli MM294 변형된 전체 단백질샘플로 Mab 448/30/7를 사용하여 한 웨스턴블로팅으로서 1: 음성조절, 2:pM-6(P64K), 3: pM-82(P64K-47 + porA), 4: pTAB13(P64K-47 + MEP), 5: pFP15(IL-2), 6: pM-134(P64K-120), 7: pILM-28(IL2-58 + porA) 분자량 표시기는 왼쪽에서 나타내고 있다.
제 12 도는 TAB4와 TAB9로 면역된 토기의 ELISA에 의한 농도값의 상호성. MG: 농도 항 V3의 상호의 구조적 수단: R: V3펩티드와의 상호작용 퍼센트
본 발명의 목적은 E.coli에서 융합 폴리펩티드(아미노산의 다중결합물)로서의 고수준 비정형의 단백질 압출을 위한 절차로서 이는 그들에게 봉입체로서 압출될 수 있는 능력을 부여하는 N. meningitidis B:4:P1.15의 P64K 항원의 최초 47 아미노산으로부터 유도된 안정제 시퀀스의 사용에 기초를 두고 있다.
상기의 시퀀스는 다이히드로리포아미드 아세틸 전이효소의 리포산 결합영역의 부분과 상동함이 존재할지라도 유전자공학에 의하여 스스로 변형될 가능성이 제거되도록 조작되었으며 낮은 면역유전자의 이점을 나타내고 있다.
이러한 절차는 또한 특히 모노클로널 항체에 융합하는 어떠한 단백질의 면역탐지를 가능하게 하는 전술한 안정제를 인식하는 모노크로널(단일세포에서 유래하는 세포로 만들어지는)항체의 사용을 포함한다.
특히 본 발명에서는 유전자 재조합형의 플라스미드(염색체와는 따로 증식할 수 있는 유전인자)가 압출벡터로서 사용되는데 이는 E.coli의 트리토판 유전프로모터(유전자를 구성하는 3대 요소중의 하나임)(ptrip)의 통제하에서 한정사이트인 XbaI, EcoRV 그리고 BasmHI를 따라서 상기의 시퀀스를 나르게 된다.
이 벡터는 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 조각의 프레임별 클로닝을 가능케 한다. 이 벡터는 또한 박테리오파지 T4의 유전자 32의 전사(유전정보의)의 종료자와 선택표시기로서의 암피실린에 대한 저항유전자를 포함한다.
이 절차는 또한 생체내에서 사용되도록 예정된 백신조제에서 얻어지는 융합 폴리펩티드의 봉입을 가능케 한다. 또한 고용된 안정자펩티드의 특성은 외부단백질 또는 거기에 부속되는 다수의 에피토픽에 대한 보호면역반응의 발생은 가능케 한다.
본 발명의 신규성을 구성하는 것은 E.coli에서의 유전자재조합 DNA 기술에 의한 융합단백질의 생산을 위하여 다이히드로리포아미드 아세틸의 리포산 결합영역에 대한 정형의 안정제 펩티드의 사용과 유전자조작이다. 특히 본 발명의 신규성을 구성하는 것은 앞서 언급한 목적과 함께 N. meninggitidis B:4:P1.15의 P64K의 최초 47 아미노산의 유도한 안정제 펩티드 및 그 안정제를 인식하는 모노크로널 항체의 사용이다.
[실시예 1]
N. menigitides(P64K, LpdA)의 LpdA 항원은 다이히드로리포아미드 디시드로제나제(EC 1.8.1.4)의 계열에 속하는 594 아미노산의 단백질이며 특히 디히드로리포아미드 아세틸 전이효소안에 존재하는 것과 같은 것으로 그것의 N-터미널(Kruger, N., Oppermann, F. B.., Lorenzl, H. and Steinbuchel, A., J. Bactriol., 176, 361 4-3630, 1994; Hein, S. and Steinbuchel, A., J. Bactoriol., 176, 4394-4408, 1994)에 리포산 결합부위를 소유하고 있음을 특징으로 하는 새로운 하위그룹에 속하는 것이다.
LpdA 단백질은 E.coli에서 그 N-터미널 끝에 5아미노산(MLDKP)의 첨가와 함께 클론닝되고 과압출된다.(유럽특허출원 제0 474 313 A2; 제 1 도). 비록 LpdA와 P64K는 동등물이기는 하지만 P64K는 특히 유전자재조합의 단백질을 가리키기 위해서 사용될 것이다.
상기의 항원으로부터 각각 다른 조각의 면역유전을 결정하고 또 안정제 펩티드로서 적은 면역유전을 사용할 가능성을 분석하기 위해서 P64K에 현존하는 B세포를 위한 에피토프(분자상의 특이항원결정부위 또는 장소)는 합성펩티드에 대한 폴리크로널 혈청 항 P64K의 상호작용에 대한 평가를 통해 위치된다.
이러한 목적을 가지고, P64K 단백질은 Butyl-TSK와 젤-침투의 히드로포비서티 크로마토그래프를 통해서 순수화되며 (유럽특허출원 제 0 474 313 A2), 트리클로로아세틱산(TCA)를 가진 촉진제에 의하여 성질이 바뀌어지며 수산화나트륨(NaOH)로서 중화되고 젤-침투 크로마토그래프에 의하여 인산염솜뭉치에서 평형상태가 된다.
이러한 방법은 30마리 쥐들 Balb/c를 면역시키기 위해서 사용되는데 피하층에 알루미늄 히드록사이드의 2㎍에 20㎍의 복용량을 투입하며 그리고 7일과 21일 후에 같은 항체로 늘린다. 혈청은 최초 추출 후 28일 이후에 수거된다. 얻어진 혈청은 화학처리되고 그 결과로 생긴 혼합물은 아리큐오티드(alicuoted)되고 그리고 영하 20도에서 저장된다.
나아가 각각 유전자재조합 단백질의 전체 시퀀스를 카바하는 그리고 10(a.a.)에 의하여 중첩된 20 아미노산(a.a)의 59 펩티드는 고체단계에서의 합성을 위한 상업적 키드를 사용하여 96 wells-plate 형식으로 제조자의 지시에 따라 합성된다(Multipin peptide synthests system, chairon Mimotope Pty., Ltd., USA).
이들은 연속적으로 단백질의 N-터미널의 끝에서부터 번호가 매겨진다. 이들 펩티드들에 새한 혈청 항 P64Kk의 상호작용은 같은 것의 1 : 2000의 희석율을 사용하여 결정되며 사용되는 면역분석의 형식은 전술한 상업키드의 제조자에 의하여 추천되는 것과 동일하다.
제 2 도에서 그 결과가 보이고 있는데 여기에 각 펩티드에 대한 흡광도(물질의 빛에 대한 투과율의 역수의 상용대수)값이 나타나 있다. 최초 110 아미노산들(펩티드 1에서 11까지로 표시됨)은 면역원의 변성에도 불구하고 매우 빈약한 면역유전 조각을 형성하였으며 심지어 비밀의 에피토프에도 노출할 수 있었다.
이러한 조각들은 필수적으로 리포산 결합영역과 그것을 나머지 단백질에 연결시키는 Proline과 Alanine에 풍부하게 존재하는 공간자 영역을 포함한다. 이 결과는 그것에 융합되는 폴리펩티드의 면역유전에 작은 영향만을 준다는 것 때문에 안정제 펩티드(또는 그것으로부터 유도된 조각)이 유효하게 안정제 펩티드로 사용될 수 있음을 시사해 준다.
[실시예 2]
E.coli에서의 N. meningitidis B:4:P1.5의 P64K 항원의 리포산 결합영역에의 그들의 융합을 통한 다른 비정형 단백질을 압출하기 위하여 압출백터 pM-83이 구축되었는데 여기에서 상기의 단백질의 최초 47 아미노산으로부터 유도된 안정제 폴리펩티드를 코딩하는 시퀀스가 소개되었다(시퀀스 식별 번호: 1). 이 시퀀스는 E.coli의 트리토판유전프로모터의 통제하에서 유전정보의 전사 종료의 신호로서 박테리오파지 T4의 터미널과 선택표시기로서의 암피실린 저항유전자를 포함하면서 클론된다.
PM-83압출벡터를 얻기 위해서 안정제 펩티드는 P64K 항원을 코딩하고 있는 뉴클레오티드시퀀스를 이동시키는 플라스미드 pM-6으로부터 먼저 Polimerase Chain 반응(PCR)(Randall, K. et al., Science, 42394, 487-491, 1988)을 사용하여 먼저 확장된다.
이러한 목적으로 올리고뉴클레오티드 프라이머 1573 및 1575호가 사용되는데 이것은 그것에 의하여 코딩된 안정제의 아미노 그리고 카르복실기와 교류하는 확장된 DNA 조각에 NcoI 및 Xbai 제한사이트를 끼워넣는다;
NcoI
1573: 5 'TTCCATGGTAGATAAAAG 3' (시퀀스식별 번호 2)
Xbai
1575: 5 'TTTCTAGATCCAAAGTAA 3' (시퀀스식별 번호 3)
결과로서 나타나는 안정제에 의하여 코드된 아미노산 시퀀스는 제 3 도에 나타나 있다(시퀀스식별 번호: 6). 제한사이트 NcoI의 끼워넣기는 발린(단백질이 분해되어 생기는 아미노산)을 위한 로이신 2를 변화시킨다 ; 그리고 프라이머 1575는 시퀀스 ETD(위치 45-47)를 제거하면서 그 자리에 시퀀스 DLE를 끼워넣는다. 이러한 방법으로 리포산(위치 48)의 결합리신은 안정제의 부분을 형성하지 않으며 이들지역에 높게 보존된 이 부근지역이 변하게 된다. 이러한 모든 것들은 이러한 지역을 포함하는 융합단백질의 리포산 가능성이 없음을 보장하며 이러한 단백질로서의 면역 동안 담즙의 간장경화증의 환자에게서 존재하는 것들에 대한 자동항체의 발생을 보장한다.(Tuaillon, N., Andre, C., Briand, J.P. et al., J. Immunol., 148, 445-450).
플라스미드 pM-83은 플라스미드 pILM-29안에 미리 증해된 XbaI/NcoI 이러한 조각(시퀀스 식별번호: 5)들의 클로닝을 통해서 구축된다. pILM29 플라스미드(Guillen, G., Loyal, M., Alvarez, A. et al., Acta Biotecnologica, 15, 97-106, 1995)는 인체 IL-2의 최초 58 아미노산과 일치하는 안정제 펩티드에 융합된 N. meningitidis 단백질 Opc(5c)의 유전자를 포함하므로 그래서 그러한 클로닝은 IL-2의 조각을 제거하고 Opc를 P64K단백질의 안정제에 융합하도록 한다(제 4 도). 결과로서 나타나는 플라스미드 pM-80로 지정된 Opc 유전자는 효소 XbaI와 BamHI를 사용하여 삭제되며 그 자리에는 올리고뉴클레오티드 1576과 1577의 교차에 의해 형성된 아탑터가 클론되는데 이는 안정제 조각의 극단 3 '안의 제한사이트 XbaI, EcoRV 그리고 BamHI에 끼어 넣는다.
1576 5 ' CTAGATTTGATATCAG 3' (시퀀스식별 번호: 7)
1577 3 ' TAAACTATAGTCCTAG 5' (시퀀스식별 번호: 8)
이러한 플라스미드는 pM-83으로 지정되었다(제 4 도). 모든 DNA 조각과 올리고뉴클레오티드의 삽입은 정확한 리딩 프레임과 마찬가지고 Sanger, F. et al(PNAS, USA, 74: 54631977)에 따른 DNA시퀀스에 의하여 검증된다.
[실시예 3]
만약 결과로 얻을 융합단백질이 백신용이라면 안정제가 인체단백질과 고도로 유사한 영역을 포함하지 않는 것이 중요하다. pM-83(실시예 2)의 안정제 펩티드의 인체 단백질과의 유사성 결정은 뉴클레오티드 시퀀스의 데이터베이스 EMBL데이타 라이브러리 v.38(Curl, C.M., Fuchs, R., Higgins, D.G. et al., Nucl. Acid Beast. 21, 2967-2971, 1993) 그리고 아미노산 시퀀스의 SWISS-PROT v.38(Bairoch, A. and Boeckmann, B., Nucl. Acids Beast. 21, 3093-3096, 1993)에서의 상동의 조사를 통해서 달성할 수 있다.; 둘다 1994년 3월 버전임
이러한 조사를 위해서는 두개의 프로그램 BLAST가 사용되는데 (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, And, W. and Lipman, D.J., J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990): 즉 하나의 아미노산 시퀀스를 단백질 시퀀스와 비교하는 BLASTP(이 경우 SWISS-PROT) 그리고 모든 양방향에서 그리고 모든 뉴클레오티드 시퀀스의 기본의 모든 읽기 프레임에서의 해석과 아미노산 시퀀스를 비교하는 TBLASTN인데 이 경우 EMBL 데이터 라이브러리와 같이 양자의 경우에서 표준 매트릭스 PAM120이 사용된다(Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. and Orcutt, B.B., in: Dayhoff, M.Or.(of.), Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, supl.3, 345-352, Natn. Biomed, Beast. Found., Washington, 1978).
결과는 도면 제 5 도와 제 6 도에서 관찰되는데 여기서 각 BLASTP와 TBLASTN의 개별 결과표가 보여진다(원핵 또는 내부 세포핵의 같은 시퀀스는 보다 나은 이해를 위해서 여기서는 생략하였음). 어떤 인체의 단백질이나 또는 어떤 포유동물로부터의 단백질도 P64K로부터 추출한 안정제와 의미 있는 유사성이 없다는 것이 명백하다 ; 왜냐하면 두개의 알고리즘(인간과 토끼의 키나제에서; 그리고 인간과 개의 C-터미널에서)에 의하여 탐지된 유사성 고도의 통상 발생 확률(비교점으로서 같을 확률은 Azotobacter vinelandii의 다이히드로리포아미드 아세틸 전이효소의 경우 그것은 3.5 X 10-5이다)을 나타내기 때문이다.
위에서 설명한 모든 것으로부터 백신으로서의 상기 안정제의 사용은 절대적으로 확실하다고 결론지을 수 있다.
[실시예 4]
봉입체 형식의 그리고 고수준에서의 세포내 합성을 허용하는 pM-83에서의 현재의 안정제의 성능이 이런 목적으로 자주 사용되는 융합펩티드인 인간생체 INTERLEUKINE-2(IL-2)의 최초 22 또는 58 아미노산에 융합된 몇개의 단백질 또는 실시예 2에서 묘사한 바와 따른 변형된 P64K 항원의 최초 47 a.a.에 융합된 단백질과 비교하여 평가되었다.
이러한 목적을 위하여 N. meningitidis B:4:P1.5 PorA AND Opc의 외부멤브레인단백질을 코딩하는 유전자는 벡터 pFP15(hIL-58 ; 유럽특허 제 416 673 B1) 또는 pM-83(P64K-47)로 클로닝되었다. ; 즉 벡터 pISL31(hIL2-22, Castellanos-Sierra, L.R., Hardy, E., Ubieta, R., et al., paper submitted) 또는 pM-83에 인체면역결핍바이러스인 HIV의 격리된 몇개의 유전영역을 포함하는 멀티에피토픽 폴리펩티드(MEP)을 코딩하는 유전자. 결과로서 나타나는 압출플라스미드는: pILM-28(IL2-58 PorA; Guillen, G., Alvarez, A., Lion, L., et al., 494-498 in: Conde-Gonzalez, C.J., Morse, S., Rice, P. et al.(eds)., Pathobiology and Immunobiology of Neisseriaceae, Instituto de Salud Publica Nacional, Cuernavaca, Mexico, 1994), PM-82(P64k-47 PorA; Niebla, O., Alvarez, A., Gonzalez, S. etal., 85-86 in: Evans, J.S., Yost, S. and Maiden, M.C.J. et al. (eds.)., Neisseria 94: Proceedings of the IX International Pathogenic Neisseria Conference, Winchester, England, 1994), pILM-29(IL2-58 Opc; Guillen, G., Leal, M., Alvarez, A. et al., Acta Biotecnologica, 15, 97-106, 1995), pM-80(실시예 2, 제 4 도), pTAB4(IL2-22+MEP) 그리고 pTAB9(P64K-47 MEP).
TAB4와 TAB9 단백질은 HIV-1의 gp120 단백질의 변수지역 3(V3)의 중앙부분의 몇가지 복제를 포함하고 있는 멀티에피토픽 폴리펩티드(MEP)이다. 이러한 MEP의 구축을 위하여 아래와 같은 격리자의 지역 V3의 15 중앙아미노산이 선택되었다.
LR150: SRGIRIGPGRAILAT (시퀀스 식별번호 : 9)
JY1: RQSTPIGLGQALYTT (시퀀스 식별번호 : 10)
RF: RKSITKGPGRVIYAT (시퀀스 식별번호 : 11)
MN: RKRIHIGPGRAFYTT (시퀀스 식별번호 : 12)
BRVA: RKRITMGPGRVYYTT (시퀀스 식별번호 : 13)
IIIB: SIRIQRGPGRAFVTI (시퀀스 식별번호 : 14)
이러한 지역은 시퀀스 AGGGA(시퀀스번호: 17)의 5개의 아미노산 공간자펩티드에 의하여 결합되어 있다. 이를 달성하기 위하여 공간자 펩티드에 의하여 묶여 있는 V3에피토프를 코딩하는 DNA시퀀스가 화학합성으로 얻어지고(시퀀스 식별 번호 21) 인체 IL-2(제 7 도)의 최초 22 아미노산에 융합된 트리토판(동물의 영양에 필요한 무색아미노산)유전프로모터의 통제하에서 클로닝된다.
결과로서 생기는 pTAB3로 지정된 플라스미드로부터, MEP을 위한 유전자를 포함하는 조각, 트립토판 프로모터 그리고 T4종료기는 효소 ScaI 및 Hing에 의하여 소화에 의해 함께 제거되며 pTAB4(제 7 도)를 얻기 위해서 pUC19(Yanisch-Perron, C. et al., 1985, Gene 33, 103-119)로 복제된다.
마지막으로 pTAB9는 효소 NcoI 및 XbaI로서 소화에 의하여 인간 IL-2로부터 유도되어진 안정제를 코딩하는 시퀀스를 제거하면서 구축되며 그 자리에는 제 2 도에 묘사된 바와 같이 폴리메라제 체인반응(PCR)에 의하여 얻어진 P64K 항원의 최초 47 아미노산을 코딩하는 조각이 자리한다.
결과로서 나타나는 MEP의 시퀀스는 제 8 도에 나타나 있으며 그 조직은 제 9 도의 A에 나타나 있다. 이러한 모든 플라스미드를 위해 사용되는 E.COLI K-12의 호스트 스트레인은 pILM-29, pM-80 그리고 pM-82를 위한 W3110(Hill, C.W., and Hamish, B,W. Proc. Natl. Acad.Sci., 78, 7069,1981; Jensen, K.F., J. Bacteriol., 175, 3410-3407, 1993)이고 또 pTAB4 및 pTAB9를 위한 W3100 trpA905이다.
압출은 모든 경우에 LB 매체(Sambrook, J., Fritsch, Y. F. 그리고 Maniatis, T., Molecular 클로닝: manual Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, New York, USA)의 5mL의 배양 50㎍/mL까지의 암피실린(Ap) 100㎍/mL까지의 트리토판을 접종함으로서 달성되는데 이는 37℃에서 12시간 동안 배양된다. 이러한 배양은 LB-Ap(pTAB4 그리고 pTAB9)의 50mL의 배양 또는 M9염분에 의하여 복합된 한정된 매체(Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Harbor Laboratory Press, 1972, New York, USA), 글루코스 1%, 카세인 히드로리제이트 1%, CaCl2 1mM 그리고 Ap 50ug/mL(pILM-28, pILM-29, pM-=80, pM-82)를 접종하기 위해 사용되는데 이것은 250 r.p.m.으로 37℃에서 저장된다.
이렇게 한 다음 전체 단백질 샘플은 수거되어 변성 폴리아크릴아미드 젤 일렉트로호레시시(SDS-PAGE, Laemmli, O.K., Nature, 277, 680, 1970s)와 Coomassien Brilliant Blue R-250을 가진 스테이닝에 의하여 분석된다. 압출퍼센트는 레이저 Bromma-LKB의 덴시오메터(densiometre)에서 분석된다.
그들의 세포위치는 리소자임(박테리아 분해효소의 일종)과 초음파처리를 통해서 세포를 용해함으로서 결정된다. 그리고 나서 용해할 수 있는 단백질이 원심력에 의하여 용해 불가능한 것으로부터 분리된다. 단백질의 비용해성은 봉입체로서의 그 압출을 가늠하기 위한 잣대로서 사용된다. 왜냐하면 그러한 행태(펩티드 글리간에나 멤브레인에의 연합)를 나타낼 수 있는 다른 조건하에서는 이 경우와 다르기 때문이다.
결과에 대한 요약은 제 10 도의 A에서 볼 수 있다. 모든 경우에 있어서 P64K로부터 추출된 안정제 하에서의 압출은 비정형의 단백질관계와 관련해서 IL-2의 펩티드에 결합되었을 때 얻어진 압출과 비교되었다. : 즉 전체 세포단백질(MEP인 경우에 제 10 도 B 참조), 이는 융합펩티드의 압출을 위한 백터로서 사용될 수 있는 pM-83의 성능을 확인시키고 있다. 이러한 폴리펩티드가 만약 융합되지 않는다면 그들의 작은 사이즈로서나 또는 MEP으로서 숙주의 프로테아제에 대한 민감성으로서나 또는 일반적으로 단백질 PorA 그리고 박테리아의 포린의 경우에 그들의 독성으로 볼 때나 E.coli에서 폴리펩티드를 압출하는 것은 아무런 가치가 없다(Carbonetti, N.H. and Sparling, P.F.; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 9084-9088). 모든 경우에 있어서 제품은 봉입체로서 얻어지는데 pTAB9 경우가 예시되었다(도면 제 10 도 C).
결론적으로 다른 시스템의 것과 비교하여(유럽특허출원 제 0,416 673 A2 및 제 229 998, Hoechst AG; European patent No. 0 416 673 B1; Castellanos-Sierra, L. R.., Hardy, E., Ubieta, R., et al., manuscript submitted), N. meningitidis(P64K-47)의 P64K 항원의 최초 47 아미노산으로부터 유도된 안정제의 사용은 봉입체로서 비정형의 단백질 압출의 효율성을 가져다 준다고 함이 가능하며 또 인체항원과의 심각한 상동이 없기 때문에 직접적으로 사용될 수 있는 제품이라는 이점을 가진 것 또한 가능하다.
[실시예 5]
특별히 안정제(예를 들면 항체, 효소보조자, 등)를 인식하는 리간드의 유용성은 유전자재조합 단백질의 압출시스템에 있어서 아주 바람직한 특성이다. 이것은 왜냐하면 예를 들어 나아가서 만약 상기 리간드가 크로마토그래픽수지에서 움직이지 않는다면 친화순수화의 효과적인 계획설계가 가능하기 때문이다. 심지어 항체의 경우 압출된 비정형의 단백질의 동일성과는 독립적으로 면역기술을 통한 순수화의 중간단계가 가능하다.
그러한 목적은 안정제에 대한 (Mab) 모노크로널항체를 얻기 위해서 쥐들을 단백질 TAB13(시퀀스 식별번호 : 20)으로 면역시키면 이러한 목적은 달성된다. TAB13 그것은 두 개의 추가의 V3 교감 지역(제 9 도 B)의 존재에 의해 전자로부터 구분되는 TAB 9로부터 유도된 MEP이다. 즉,
-C6: TSITIGPGQVFYRTS(시퀀스식별 번호: 15)
-C8: RQRTSIGQGQALYTT(시퀀스식별 번호: 16)
이러한 MEP은 TAB4와 TAB9에서 묘사한 것과는 유사한 방법으로 압출되고(실시예 4) 그리고 순수화된다.(실시예 6)
그리고 나서 쥐들 BALB/C는 피하층에 15일 간격으로 알루미늄 히드록사이드에서 아듀우뷰드(adyuved)된 TAB13의 20㎍ 3 복용량을 피하층에 투여하여 면역을 시킨다. 동물은 마지막 투여 후 20일 후에 복강내에 인산염안의 같은 항원 20㎍을 추가한다.
스프렉노사이트(Splecnocytes)는 골수종 X63 AG8 653과 결합하고 결과로서 나타나는 히브리도마스는 격리되고 정해진 방법으로 테스트된다.(Gavilondo, J.V.(ed.), Monoclonal Antibodies: Theory and Practical, Elfos Scientiase, 1995, The Havana, Cuba).
격리된 히브리도마스에 의하여 숨겨진 항체의 반응은 TAB13에 현재하는 각각 다른 V3 지역을 나타내는 MEP TAB13, P64K 단백질 또는 합성펩타이드로 코팅된 ELISA에 의하여 평가된다.
전부 18 양성클론이 얻어졌는데 이 중의 하나로 448/30/7로 지정된 64K와 마찬가지로 TAB13을 인식하는데 그러나 gp120으로부터는 아무런 펩티드도 인식하지 않는다.
pM-83의 안정제 펩티드에 의한 이 MAb의 특수성 그리고 그것을 포함하는 단백질의 면역탐지를 위한 그 사용의 가능성은 P64K(P64K-47)로부터 추출한 안정제 또는 같은 융합된 단백질에게 융합된 비정형의 단백질 혹은 IL-2(IL2-58)의 최초 58 아미노산에게 융합된 비정형의 단백질은 각각 같은 융합된 단백질인 각각 다른 보기를 사용하면서 웨스턴블로팅(Western Blotting)에 의하여 결정된다.
이것을 하기 위해서 E.coli 스트레인 MM294는 아래의 플라스미드와 함께 변형된다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: To Manual Laboratory, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA). 즉 플라스미드는 : pILM-28(IL2-58 + porA), pM-82(P64K-47 + porA), pTAB13(P64K-47 + MEP), pM-6(P64K) 그리고 pFP15(IL-2).
압출플라스미드 pM-134는 역시 사용되는데 이는 P64K의 최초 120 아미노산을 함유하고 있으며 이는 전술한 플라스미드에서와 같은 규제신호의 조절 아래에서 리포산에 결합영역을 포함하고 있다.
이 조각은 프라이머 1573(시퀀스 식별 번호: 2) 그리고 2192(시퀀스 식별 번호 4)를 사용하여 PCR에 의하여 확대된다. 그것은 효소 NcoI와 BamHI에 의하여 소화되고 그리고 동일하게 소화된 플라스미드 pFP15(실시예 4 참조)에서 클론된다.
얻어진 결과는 제 11 도에 표시되어 있다. 여기에 잘 나타나 있는 바와 같이, MAB 448/30/7은 항원적으로 서로 다른 모든 이러한 단백질에도 불구하고 플라스미드 pM-6, pM-82, pTAB 13 pM134의 보기와의 상호작용에 기하여 아마도 안정제 P64K-47안에 선형 에피토프를 인식한다.
이러한 실험은 어떤 경우에도 이러한 상호작용이 안정제(예를 들면 플라스미드 pILM-28 및 pM-82 : 양자는 각각 다른 안정제하에서 유전자 porA를 나른다)에 융합된 단백질에 기초하고 있는 것이 아니라는 것을 시사하고 있는데 이는 MAb의 인식의 특수성을 증명하고 있다.
결론적으로, 안정제 P64K-47에 의하여 형성된 압출시스템과 그것을 포함하고 있는 플라스미드 그리고 MAB 448/30/7은 효율적인 합성을 허용하며 여러 가지 단백질로 된 봉입체형성을 허용한다. 그리고 압출할 각각의 폴리펩티드에 대한 면역증거의 사전반응 없이도 그들의 탐색을 가능케 한다.
[실시예 6]
안정제에 융합된 폴리펩티드에 대한 면역답신에 대한 유해한 효과의 없음은 백신용을 위한 압출시스템을 선택하는데 고려해야 할 아주 중요한 요소이다. 안정제 P64K에 기초한 압출시스템의 이점 중 하나는 명백히 그의 저하된 면역유전(실시예 1)인데 이는 이는 더 나은 진행을 보장한다. 그럼에도 불구하고 융합단백질에 대한 면역반응에서의 안정제 P64K-47의 영향은 MEP TAB4(IL2-22)와 TAB9(P64K-47)에 현존하는 V3지대의 각각 다른 펩티드에 대하여 항체반응의 비교를 통해 질적으로 평가되었다.
TAB4와 TAB9의 압출과 순수를 위하여 스트레인 W3100 TRPA905+PTAB4 그리고 W3100 TRPA905+PTAB9의 바이오매스가 실시예 4에 묘사한 바와 같이 얻어졌다. 이 바이오매스는 리조좀 처리와 페닐메틸설포닐(PMSF)의 불화불 그리고 비이온의 합성세제 Triton-X-100에서의 초음파처리로서 부서진다 ; 봉입체는 별개의 원심력으로서 얻어지며 MEP는 부분적으로 순수해지고 카오트로픽 매체와 합성세제로서 의 봉입체 2번의 연속세척사이클에 의하여 용해된다(Tab4 : 1, Urea 4 M Triton-X-100 1%, 2. Urea 8 M. Tab9: 1. Urea 9 M Triton-x-100%,2 guanidium chloride 6 M). 얻어진 상청액은 결국 고실행 액체 크로마토그래프(HPLC)의 칼럼 C4 VYDAC에서 아세토니트리로의 20%에서 80%의 기울기를 통해서 순수해진다. 그래서 대략 순도 90%를 달성할 수 있다.
순수한 유전자재조합의 단백질은 단백질의 ㎎마다 adyuvant의 60㎎의 관계로서 알루미늄 수산화물의 젤 안에 아디유베이트(adyuvated)된다. 이러한 조제는 피하층루트에 200㎍/복용량으로 5그룹의 토끼를 면역시키기 위하여 사용되었다. 면역반응은 면역예방을 위해서 사용되는 MEP가 코팅된 또는 그 위에 현존하는 V3 영역의 각 하나에 해당하는 펩티드가 코팅된 well의 96well(고수준의 결합, Costar, USA)의 폴리스틸렌 플레이트를 사용하여 ELISA에 의하여 평가되었다. 농도는 각혈청의 최대 침투로서 계산된다. 모든 혈청은 이중으로 분석되었다.
얻어진 값은(제 12 도) V3영역에 대한 농도가 변화하는 IL2-22 + MEP(TAB4)와 P64K-47 + MEP(TAB9) 사이에 유사함을 보여주고 있다. 펩티드의 인식횟수가 TAB9에서 약간 크기는 하지만 이러한 차이는 통계적(p0.05)으로 그리 심각한 것은 아니다. 결론적으로 비정형 단백질의 면역유전성은 안정제 P64K-47에 의하여 최소한의 영향을 받으며 현재 사용되는 다른 압출시스템과 대조된다.

Claims (19)

  1. 비정형 단백질에 융합된 Neisseria meningitidis B: 4: P1.15의 P64K 항원의 N-터미널의 최초 47 아미노산으로부터 추출한 안정제 펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    비정형 단백질은 Neisseria meningitidis의 외부 멤브레인 단백질인 융합단백질.
  3. 제 2 항에 있어서,
    비정형 단백질은 Neisseria meningitidis의 Opc(5c)단백질이거나 Neisseria meningitidis의 PorA 단백질인 융합단백질.
  4. 제 1 항에 있어서,
    비정형 단백질은 HIV-1로부터 gp 120 단백질로부터의 변수영역 3(V3)의 중앙부의 몇 개의 복제를 포함하는 멀티 에피토픽 폴리펩티드인 융합단백질.
  5. 제 4 항에 있어서,
    멀티에피토픽 폴리펩티드는 폴리펩티드 TAB4 그리고/또는 TAB9인 융합단백질.
  6. Neisseria meningitidis B: 4: P1.15의 P64K 항원의 N-터미널의 최초 47 아미노산으로부터 추출한 펩티드는 상기 비정형 단백질의 압출을 위해서 안정제로서 사용되며 안정제에 사용되는 모노클러놀 항체는 그것에 융합된 모든 단백질의 면역탐지를 위해 사용되는 E. coli에서 융합폴리펩티드로서 비정형 단백질을 생산하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    안정제 펩티드의 아미노산 시퀀스는 필수적으로 시퀀스 식별 번호 6에 해당되는 방법.
    1020304047
    MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE
  8. 제 6 항에 있어서,
    융합단백질의 순수화를 위해서 사용되는 모노크로널 항체는 448/30/7로서 지정되는 방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    압출된 비정형 단백질은 백신조제에서 면역유전자로서 고용될 수 있는 모든 단백질인 방법.
  10. 제 6 항에 있어서,
    압출된 비정형 단백질은 멀티에피토픽 폴리펩티드 TAB4 그리고/또는 TAB9 또는 Neisseria meningitidis의 PorA 또는 외부 멤브레인 단백질 Opc(5c)인 방법.
  11. Neisseria meningitidis B: 4: P1.15의 P64K 항원의 N-터미널의 최초 47 아미노산으로부터 추출한 안정제 펩티드를 위하여 특정되어 있으며 상기 안정제 펩티드에 융합된 어떤 단백질의 순수화와 면역탐지를 위해 사용되는 모노클로널 항체 448/30/7.
  12. 선택표시기로서의 암피실린 저항유전자 뿐만 아니라 전사종료신호로서의 파지 T4 종료기와 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 조각 프레임을 클로닝하기 위한 한정된 사이트 Xbai, EcoRV 그리고 BamHI를 따라 트리토판 프로모터의 통제하에서 Neisseria meningitidis B: 4: P1.15의 P64K 항원의 N-터미널의 최초 47 아미노산으로부터 추출한 안정제 펩티드를 코딩하는 시퀀스를 포함하고 있는 E.coli에서의 융합단백질의 압출벡터.
  13. 제 12 항에 있어서,
    Neisseria meningitidis의 외부 멤브레인 단백질을 코딩하는 DNA 조각의 프레임 클로닝을 위한 압출벡터.
  14. 제 13 항에 있어서,
    pM-80 pM-82로 이름 붙여진 압출벡터.
  15. 제 12 항에 있어서,
    HIV-1로부터의 gp 120 단백질에 속하는 변수영역 3(V3)의 중앙부분의 복제를 포함하는 멀티 에피토픽 폴리펩티드를 코딩하는 DNA조각의 프레임으로 클로닝하기 위한 압출벡터.
  16. 제 15 항에 있어서,
    pTAB4 그리고 pTAB9라고 이름 붙여진 압출벡터.
  17. 청구항 12에서 16까지의 압출벡터 어떤 것으로도 E. coli K12 스트레인의 변형을 결과하는 E. coli의 유전자재조합 스트레인.
  18. 인체 그리고 동물에서 사용되는 백신 제조에서 청구항 1-8항의 융합단백질의 사용.
  19. 적당한 아디우번트(adyuvant) 뿐만 아니라 청구항 1에서 8까지에 기재한 어떤 융합단백질을 포함하는 백신조제.
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