CZ291097A3 - Expresní systém heterologních proteinů jako fúzovaných proteinů - Google Patents

Expresní systém heterologních proteinů jako fúzovaných proteinů Download PDF

Info

Publication number
CZ291097A3
CZ291097A3 CZ972910A CZ291097A CZ291097A3 CZ 291097 A3 CZ291097 A3 CZ 291097A3 CZ 972910 A CZ972910 A CZ 972910A CZ 291097 A CZ291097 A CZ 291097A CZ 291097 A3 CZ291097 A3 CZ 291097A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
protein
proteins
coli
polypeptides
neisseria meningitidis
Prior art date
Application number
CZ972910A
Other languages
English (en)
Inventor
Cano Carlos Antonio Duarte
Nieto Gerardo Enrique Guillén
Acosta Anabel Alvarez
Muňoz Emilio Luis Carpio
Vázquez Diogénes Quintana
Rodríguez Carmen Elena Gómez
Rodríguez Ricardo De La Caridad Silva
Gálvez Consuelo Nazábal
Angulo Maria De Jesús Leal
Dunn Alejandro Miguel Martín
Original Assignee
Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia (Cigb)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=5459182&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ291097(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia (Cigb) filed Critical Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia (Cigb)
Publication of CZ291097A3 publication Critical patent/CZ291097A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Oblast techniky
Předložený vynález se týká oblasti biotechnologie a genetického inženýrství zejména exprese heterologních proteinů (bílkovin) v mikrobiálních hostitelích pomocí jejich fúze s bakteriálními peptidy použitím technologie rekombinatní DNA.
Dosavadní stav techniky
Užitečnost technologie rekombinantní DNA pro produkci proteinů jakéhokoliv původu v E. coli byla široce prokázána. Pro toto bylo vyvinuto důležité množství vektorů, ačkoliv jsou nové varianty nezbytné vzhledem ke skutečnosti, že každý gen ke klonování a k expresi často representuje individuální případ (Denhardt, D.T. a Colasanti, J.; Vectors, Butterworths, Stoneham, M, pp. 1791987 a Lukacsovich, T a kol., Journal of Biotechnology, 13, 2431990).
Intracelulární syntézy byly nejpoužívanější strategií pro získání heterologních proteinů v E. coli vzhledem k dosažitelným vysokým úrovním exprese (Goeddel, D.V., Methods Enzymol., 185, 3-7, 1990) . Avšak faktory jako například senzitivnost k proteásám hostitele nebo toxicita exprimovaných proteinů může významně snížit řečené úrovně nezávisle na použití regulátorových sekvencí vysoké účinnosti (Reads, C.A. a Saier, M.H.,
J. Bacteriol., 153, 685-692; Gwyn, G.W., Membrane Protein Expression Systems: To User's Guide, Portland Press, London, UK, 29-82).
Klonování nukleotidových sekvencí, které kódují proteiny v zájmu vhodných vektorů, v rámci Sekvencí nukleových kyselin, které kodifikují stabilní polypeptidy v hostujících buňkách, dává vzniknout , 2 • · · · · ·· ···· expresi hybridních produktů v cytoplazmě, která je známa jako fúze proteinů (Marston, F.A.O., Biochem. J. 240, 11986).Takové polypeptidy jsou obecně méně senzitivní k proteolytické degradaci hostujícími buňkami nebo méně toxické vzhledem k tvorbě inkluzních tělísek, které jsou výsledkem vyšších úrovní exprese získaných bez použití stabilizujícího peptidu (Itakura, K. a kol., Science, 198, 10561977) . Kromě toho tento druh exprese usnadňuje a zlevňuje počáteční kroky čištění, jestliže jsou k dispozici odlišné metody pro následující renaturaci rekombinantního produktu (Fisher, B., Sumner, I. a Goodenough, P., Biotechnol. Bioeng., 41, 3 -13) .
Inkluzní tělíska jsou nerozpustné proteiny agregátů, které se objevují jako elektrodenzní tělíska v cytosolu během exprese mnoha rekombinantních proteinů v E. coli (Rinas, Or. a Bailey, J., Appl. Microbiol. Biotechnolog., 37, 609-614). Toto jsou výsledky interakce mezi částečně uzavřenými polypeptidy , jejichž agregace je termodynamicky zvýhodněna vzledem k exposici uvnitř jejich hydrofobních zbytků k rozpouštědlu (Kiefhaber, T., Rudolph, R. a kol., Biotechnology, 9, 825-829). Pomalé rozkládání mnoha eukaryotických proteinů v bakteriálním cytosolu vzhledem k velkému množství disirných aminokyselin tvořících můstky (cystein) nebo aminokyselin tvořících beta-turns (prolin), stimulovalo jejich hojné použití jako stabilizujících peptidů. Příklad dříve jmenovaného použití za tímto účelem polypeptidů s vazebnou aktivitou k protilátkám vychází z globulinu tuku lidského mléka (HMFG), podle mezinárodní patentové přihlášky PCT číslo WO 9207939 A2 920514; z konstnantních oblastí imunoglobulinů, jak je popsáno v evropské patentové přihlášce číslo EP 0464533 Al 920108; z lidských angiogeninů (evropská patentová přihláška EP číslo EP 0423641 A2 910424), růstových ·· ···· ·· ·· ···· • · · · · • · · · • · ·t· · • ~W · • · · · · · * hormonů (EP 0429586 Al 910605), glutation-S-transferasy (WO 8809372 Al 881201) a prasečího adenylátu quinasy (EP 0423641 A2 910424 a EP 0412526 A2 910213).
Avšak použití stabilizujících polypeptidú, které vytvářejí významnou část fúze proteinů má některé nevýhody, jestliže je dříve jmenovaný vakcinovým kandidátem, nebot přítomnost cizích sekvencí může pozměnit přirozené uspořádání buněčných epitopů B a T (Denton, G., Hudecz, F., Kajtár, J. a kol., Peptide Research, 7, 258-264) nebo zpracování stejného pomocí buněk obsahujících protilátky (Del Val, Μ., Schlicht,
H., Ruppert, T., a kol, Cell, 66, 1145-1153) a může být schopné případně podstatně zapůsobit na immunogenicitu tohoto kandidátu pomocí fenoménu potlačení specifického epitopů (Etlinger, H., Immunol. Today, 13, 52-55).
Jako výsledek shora zmíněného fenoménu, v některých případech,byly činěny pokusy o definici malých fragmentů, které ještě stabilizují expresi. Například německá patentová přihláška číslo 3541856 Al (Hoechst AG) popisuje možnost použití stabilizovaného peptidu upraveného pomocí alespoň prvních 95 aminokyselin Nterminálních lidského proteinu Interleukinu (IL-2) k získání fúzovaných proteinů syntetizované v E. coli v nerozpustné formě. Podobně v evropské patentové přihlášce číslo 0416673 A2 a číslo 229998 od stejné společnosti, je používán stabilizovaný peptid, který obsahuje v prvních 58 nebo 38 aminokyselinách řečený protein. V evropském patentu číslo 416673 Bl je používáno také prvních 58 aminokyselin IL-2 a následuje podobná strategie za tímto účelem v případě použití Nterminálních fragmentů lidského serumalbuminu (evropská patentová přihláška číslo EP 0423641 Al 920212); aktivátoru peptidu III lidského kallikreinu (EP 0381433 Al 900808). Tyto vynálezy poskytují řešení předcházejícího problému, ale získané fúzované polypeptidy nemohou být zahrnuté do vakcínových ·· ··· · přípravků pro použití u lidí, nebot vzniká možnost vzniku autoimunních chorob pro přítomnost v těchto vakcínách homologních nebo identických sekvencí k lidským proteinům.
Alternativní použití stabilizovaných polypeptidů bakteriálního původu -- a tudíž bez křížové reaktivity s protilátkami lidského původu -- pro intracelulární expresi, bylo také prozkoumáno a s úspěchem. Jedním z nejvíce používaných proteinů s tímto koncem byl protein beta galaktosidasy E. coli (Itakura, K. a kol., Science, 198, 10561977) nebo jeho části (německá patentová přihláška číslo EP 0235754 A2 870909, společnosti Hoechst AG). Zásadní nevýhodou tohoto systému je velká velikost tohoto proteinu, která vyvolá to, že požadovaný peptid representuje pouze malou část celkového hybridního proteinu (Flowers, N. a kol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 25, 2671986; Goeddel, D.V. a kol., P.N.A.S. USA, 76, 106). Podobné problémy představovalo použití C fragmentu tetanového toxoidu a exotoxinu
Pseudomonas sp. (mezinárodní patentová přihláška PCT WO 9403615 Al 940217 a evropská patentová přihláška EP 0369316 A2 900523). Velmi slibnou expresní variantou je použití fúzí s tiorredoxinem E. coli (PCT patentová přihláška číslo PCT WO 9402502 Al 940203), které využívají jejich schopnosti uvolnit se z buněk pomocí osmotického tlaku (Elyaaqoubi, A., Kohiyama, Μ., Richarme, G., J. Bacteriol., 176, 7074-7078) k usnadnění čištění. Avšak tento návrh není funkční pro získání inkluzních tělísek, protože se tyto stejné tímto způsobem neuvolňuj í.
Mnoho těchto problémů bylo vyřešeno pomocí návrhu modulu fúzovaných proteinů. V těchto návrzích je stabilizovaný peptid oddělen od proteinu v zájmu nosiče, který dovolí nezávislost obou dvou následujících a jehož aminokyselinová sekvence mu umožní přijmout útok specifických endopeptidas. Jestliže je zde ligand, který rozpozná vybraný stabilizátor, je možnost čistit fúzované proteiny pomocí afinitní chromatografie a nakonec jej oddělit od stabilizátoru během zpracování s různými
proteásami (Cress, D., Shultz, J. a Breitlow, S., Promega you Notě, 42, 2-7). Další výhodou je možnost využívat toto molekulární interakci pro podporování pomocných kroku čištění bez potřeby protilátek pro každý protein k expresi. Dobře známým příkladem tohoto je využití afinity histidinu (His) k některým kovům jako např. niklu (Ni) a zinku (Zn) v systémech složených ze stabilizátoru s 6 His dohromady a afinitní matrice niklového chelátu, podle kterého je to popsáno v PCT patentové přihlášce číslo WO 9115589 Al 911017 The Upjohn Co. Naproti všem těmto, tento druh expresního systému není funkční ve všech případech, nebot - mezi jinými důvody - zajímavý protein může mít restrikční místa pro vybrané proteásy nebo muže být složen tak, že nosič je přístupný k rozpouštědlu (Uhlen, M. a Moks, T., Meth. Enzymol. 185, 129-140;
Cress, D., Shultz, J. a Breitlow, S., Promega you Notě, 42, 2-7), ke bránění vazby mezi stabilizátorem a afinitní matricí (New England Biolabs, The NEB Transcript, 3, 14) nebo jednoduše k požadovaným podmínkám pro jeho čištění, které způsobují jeho biologickou aktivitu. Pro tyto důvody je požadováno mít různé varianty, nebot každý protein vhodný k expresi může předstatovat zvláštní případ. Za tímto účelem byly vyvíjeny stabilizované peptidy založené na maltoze, která váže protein E. coli (MalE) , který má afinitu pro amylosové pryskyřice (evropská patentová přihláška EP 0426787 Al 910515); v enzymech chloramfenikol acetyl transferasy (evropská patentová přihláška EP 0131364 Al 850116) nebo v glutation-S-transferase (evropská patentová přihláška číslo EP 0293249 Al 88130, spol. Amrad Corp., Ltd.) získatelné na matrici s imobilizovaným substrátem; v proteinu A Staphylococcus, podle patentové přihlášky PCT WO 9109946 Al 910711; a v podjednotce komplexu transkarboxylasy Proprionbacterium shermanii, která je biotinylovaná in vivo a umožňuje čištění Založené na afinitě biotinu k avidinu (Cress, D., Shultz, J. a
Breitlow, S., Promega Notes, 42, 2-7, patentová přihláška číslo EP 0472658 Al 920304 nebo WO 9014431 A901129). Zvláště zajímavé výsledky vyplývají z metody popsané v evropské patentové přihlášce EP 0472658 Al 920304 nebo WO 9014431 Al 901129, vyvíjené pomocí Biotechnology and Research and Development Corporation současně s University of Illionis, USA. V této přihlášce je popsán expresní systém, který využívá lipoovou kyselinu, která váže doménu dihydrolipoamidu acetyl transferasy (EC 2.3.1.12), také známou jako E2 podjednotka komplexu pyruvát dehydrogenasy E. coli. Tato doména je modifikována posttranslačně in vivo pomocí přídavku molekuly lipoové kyseliny k dusíku jednoho z jeho lysinů (Guest, J.R., Angier, J.S. a Russel, G.C., Ann. N.Y.
Acad. Sci., 57 3, 76 -99) ., která je využívána pro čištění a identifikaci fúzovaných proteinu pomocí použití protilátky, která rozpozná jenom doménu lipolyátu.
Tato metoda ale má množství nedostatků. Prvním ze všech je známé, že přehnaná exprese proteinů obsahujících vazebné domény k lipoové kyselině převyšuje kapacitu celulární lipolyace, takže se neprodukují tímto následkem žádné lipolyátované domény (Thousands, J.S. a Guest,
J.R., Biochem. J., 245, 869-874; Ali, S.T. a Guest, J.R., 271, 139-145) nebo oktanoyláty (Ali, S.T., Moir, A.J., Ashton, P.R. a kol., Mol. Microbiol., 4, 943-950; Dardel, F., Packman, L.C. a Perham, R.N., Febs Lett. 295, 13-16), který může snížit výtěžek během čištění pomocí imunoafinity. Na druhém místě existuje skupina nemocí hypotetického autoimunního původu, které mají jako společný faktor přítomnost protilátek, které specificky rozpoznají lipoovou kyselinu v kontextu těchto domén.
Mezi těmito jsou primární žlučové cirhosy, což je chronická nemoc charakterizovaná pomocí zánětu a postupným ucpáním žlučových kanálků uvnitř jater (Tuaillon, N., André, C., Briand, J.P. a kol., J. Immunol., 148, 445-450); a zánět jater vyvolaný halotanem, což je anestetikum širokého použití, které • · · · ·· ····
derivatizuje některé proteiny při tvorbě trifluoroacetylu lysinu (Gut, J., Christen, Or., Frey, N. a kol., Toxicology, 97, 199-224). Sérum pacientů s touto nemocí rozpoznává tyto komplexy, jejichž molekulární struktura je podobná lipoové kyselině v souvislosti s dihydrolipoamidem acetyl transferasou (Gut, J., Christen, Or., Frey, N. a kol., Toxicology, 97, 199-224). Pro tento důvod je žádoucí se vyhnout přítomnosti lipoové kyseliny v těchto peptidech, jestliže fúzované proteiny, které ji obsahují vytvářejí kandidáty vakcíny pro použití u lidí.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je způsob pro expresi vysokých úrovní heterologních proteinů jako fúzovaných polypeptidů v E. coli, které jsou založené na použití stabilizované sekvence odvozené z prvních 47 aminokyselin antigenu P64K N. meningitidis B:4:P1.15 (evropská patentová přihláška číslo 0474313 A2), která jim uděluje schopnost být exprimovány jako inkluzní tělíska. Řečená sekvence, ačkoliv představuje homologii s částí domény, která váže lipoovou kyselinu, dihydrolipoamidu acetyl transferasy, je geneticky manipulována tak, aby byla vyloučena možnost její samotné modifikace a představuje výhodu nízké imunogenicity. Tento způsob také zahrnuje použití monoklonální protilátky, která specificky rozpoznává zmíněný stabilizátor, který dovoluje imunodetekci jakéhokoliv stejně fúzovaného proteinu.
V předloženém vynálezu je používán zejména rekombinantní plasmid jako expresní vektor, který nese řečenou sekvenci pod kontrolou promotoru tryptophanu (ptrip) E. coli, po kterém následují restrikční místa Xbal, EcoRV a BamHI. Tato místa dovolují v rámci klonování fragmentů DNA kódování odpovídajících polypeptidů. Tento vektor také zahrnuje terminátor transkripce genu 32 bakteriofágu T4 a rezistentní gen pro ampicilin jako selekční markér (signální znak).
·· ···· • · • · · ·
Tento způsob poskytuje také možnost zahrnutí fúzovaných polypeptidů získaných ve vakcínových přípravcích určených pro použití u lidí a využívaný přírodní stabilizátor peptidů dovoluje vytvoření ochranné imunní odpovědi proti cizí bílkovině nebo proti multiepitopickému peptidů, který se na ní váže.
Založení novosti předloženého vynálezu se týká genetické manipulace a použití homologního stabilizujícího peptidů, aby byla rozlišena doména vázající lipoovou kyselinu dihydrolipoamid acetyl transferas pro přípravu fúzovaných proteinů pomocí rekombinatní DNA technologie v E. coli. Zejména jsou vytvořené novosti podle předloženého vynálezu podle předchozího předmětu a to použití stabilizujícího peptidů odvozeného od prvních 47 aminokyselin antigenu P64K N. meningitidis B:4:P1.15 (evropská patentová přihláška číslo 0474313 A2) a monoklonální protilátka, která specificky rozpozná stabilizátor.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1: Nukleotidová sekvence genu lpdA, který kodifikuje P64K. Je ukázána (tištěno kurzivou) přidaná sekvence v plasmidu pM-6 (evropská patentová přihláška číslo 0474313 A2) původně chybějící v genu lpdA.
Obrázek 2: Reaktivita polyklonálního séra myši proti peptidům P64K. Minimální hodnota jednotek 0,4 optické hustoty byla vybrána jako pozitivní k požadovanému výsledku.
Obrázek 3: Aminokyselinová sekvence stabilizátoru, odvozená od DNA sekvence amplifikována pomocí metody PCR z plasmidu pM-6. Podtržené sekvence odpovídají nukleotidovým primerům.
Obrázek 4: Strategie pro konstrukci plasmidu pM-83. Obrázek 5: Výsledky výzkumu homologie mezi sekvencemi a stabilizátorem ('Query') a těmi přítomnými v bási SWISSPROT ('Sbjcť) pomocí programu BLASTP. Odpovídající
-7·· ···· • · · • · · · · ·· ··· ·· ····
příjem pro lidské bílkoviny nebo savčí bílkoviny (proteiny) je pouze ukázán. P(N) představují pravděpodobnost nalezení N stejných připojení uvnitř base složené z náhodných sekvencí; smysl homologie se zmenšuje s hodnotou P(N) . Stejné zbytky jsou představené s jejich kódy jednoho písmena; konzervativní substituce s '+' a jinými rozdíly není označeny.
Obrázek 6: Výsledky výzkumu homologie mezi sekvencemi stabilizátoru ('Query') a všemi možnými translacemi sekvencí EMBL Data Library ('Sbjct') použitím programu TBLASTN. Odpovídající příjem lidských proteinů nebo savčích proteinů je pouze ukázán. P(N) představují pravděpodobnost nalezení N stejných připojení uvnitř base složené z náhodných sekvencí; smysl homologie se zmenšuje s hodnotou P(N). Stejné zbytky jsou představené s jejich kódy jednoho písmena; konservativní substituce s 'a jiné rozdíly nejsou označeny.
Obrázek 7: Strategie pro konstrukci plasmidů pTAB4 a pTAB9.
Obrázek 8: Nukleotidové a aminokyselinové sekvence MEP TAB9 .
Obrázek 9: A: Obecná struktura MEP TAB4 a TAB9 .
B: Obecná struktura MEP TAB13.
Obrázek 10: Srovnání exprese genů porA, ope a MEP pod stabilizujícími deriváty z lidských IL-2 nebo prvních 47 aminokyselin P64K antigenů.
A: Srovnávací tabulka. hIL2-58 zmiňuje prvních 58 aminokyselin lidského IL-2; hIL2-22 uvádí prvních 22 aminokyselin a P64K stabilizující derivát z prvních 47 aminokyselin P64K antigenů.
B: Srovnávací analýza pomocí SDS-PAGE exprese MEP v plasmidech TAB4 a TAB9 . Line A: Molekulární váha markérů (signálních znaků); Line B: Celkové proteiny kmene W3110 trpA905; Linie C: Celkové proteiny W3110 trpA905 + pTAB4; Linie D: Čištěný TAB4; Linie E: Celkové proteiny W3110 trpA905 pTAB9; Linie F: Čištěný TAB9.
·· ····
C: Exprese TAB9 v inkluzních tělískách . Linie A: Rozpustné proteiny vzorku; Linie B: Nerozpustné proteiny nebo membrána.
Obrázek 11: Použití westernového přenosu MAb 448/30/7 s celkovým proteinem vzorků E. coli MM294 transformované s: 1: negativní kontrola, 2: pM-6 (P64K) , 3: pM-82 (P64K + porA), 4: pTAB13 (P64k-47 + MEP), 5: pFP15 (IL-2), 6: pM134 (P64K-120), 7: pILM-28 (IL2-58 + porA). Molekulární váha markérů je označena na levé straně.
Obrázek 12: Reciproční hodnoty titru pomocí testu ELISA imunizovaných králíků s TAB4 a TAB9. MG: Geometrický průměr recipročních titrů anti V3;
R: Procentuální reaktivita s V3 peptidy.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1:
LpdAO antigen N. meningitidis (P64K, LpdA) je bílkovina o 594 aminokyselin, která patří k rodině dihydrolipoamid dehydrogenas (EC 1.8.1.4) a specificky k nové skupině uvnitř těchto, která je charakterizovaná vlastnictvím domény vázající lipoovou kyselinu, která je analogická jedné z přítomných v dihydrolipoamidu acetyl transferase v její N-terminální části (Kruger, N., Oppermann, F. B., Lorenzl, H. a Steinbuchel, A., J. Bacteriol., 176, 36143630, 1994; Hein, S. a Steinbuchel, A., J. Bacteriol., 176, 4394-4408, 1994). LpdA protein byl klonován a přeexprimován v E. coli s přídavkem pěti aminokyselin (MLDRK) v jeho N-terminálním konci (evropská patentová přihláška číslo 0474313 A2; obrázek 1). Ačkoliv jsou kategorie LpdA a P64K ekvivalentní, bude použito označení P64K pro přiřazení k rekombinantnímu proteinu.
Za účelem stanovení imunogenicity různých fragmentů z řečeného antigenu a pro analýzu možnosti použití méně imunogenního stabilizujícího peptidů, byly epitopy pro B • ·
-44buňky přítomné v P64K umístěné pro vyhodnocení reaktivity polyklonálního séra anti-P64K proti syntetickým peptidúm. Pro tento cíl byla bílkovina P64K vyčištěna (evropská patentová přihláška číslo 0474313 A2) pomocí hydrofobní chromatografie v Butyl-TSK a pomocí gelové filtrace. Dále byla denaturována pomocí srážení v kyselině trichloroctové (TCA), neutralizována hydroxidem sodným a ' pufrována fosfátovým tamponem pomocí gelové chromatografie. Tento přípravek byl použit k imunizaci třiceti myší Balb/c pomocí subkutánní cesty s dávkami 20 pg za přídavku 2 pg hydroxidu hlinitého jako adjuvants (den 0), který byl potom podpořen v sedmém a jednadvacátém dni později. Séra byla sebrána dvacátýosmý den po první exrakci. Získaná séra byla kombinována a výsledná směs byla oddělena a skladována při minus 20 °C. Dále ještě 59 peptidů 20 aminokyselin (a.a.), kde každá pokrývá celou sekvenci rekombinantního proteinu a částečně se překrývá pomocí 10 (a.a.), bylo syntetizováno použitím komerční jednotky pro syntézu v pevné fázi (Multipin Peptide Synthesis System, Chairon Mimotope Pty., Ltd., USA) v 96 jamkových uspořádáních destičky a následovaly podmínky za istrukcí podle výrobce. Tyto byly následovně počítány Z N-terminálních konců bílkoviny. Reaktivita sera anti-P64K proti těmto peptidúm byla stanovena pomocí použití stejného zředění 1:2000 a uspořádání používané imunní zkoušky bylo stejné jako ty, které byly doporučeny výrobcem u předcházející komerční jednotky.
Výsledky jsou ukázány na obrázku 2, kde jsou popsány hodnoty absorbance pro každý peptid. Je evidentní, že prvních 110 aminokyselin (představené pomocí peptidů 1 až 11) tvoří slabě imunogenní segment s ohledem na denaturaci imunogenu, která může dokonce odkrýt skryté epitopy. Tento segment zahrnuje v podstatě doménu vázající lipoovou kyselinu a intergenovou sekvenční oblast bohatou na prolin a alanin, které jí vážou ke zbytku bílkoviny. Tento výsledek ukazuje, že ·
«· ·♦·· * · · • 9 9 99
9 » • 9 · • · ·-« • · · • · · · “•Ml · • · »
- 42' stabilizující peptid (nebo z něj odvozené fragmenty) mohou být použité výhodně jako stabilizující peptidy vzhledem k malému vlivu, který by mohly mít na imunogenicitu polypeptidů ke kterým jsou fúzovány. Tato výhoda je zejména důležitá, jestliže fúzovaný peptid tvoří vakcinový kandidát.
Příklad 2:
Za účelem exprimování různých heterologních bílkovin v E. coli pomocí jejich fúze k doméně vázající lipoovou kyselinu antigenu P64K N. meningitidis B:4:P1.15, byl konstruován expresní vektor pM-83, v kterém byla zavedena kodifikující sekvence pro stabilizující peptid odvozený od prvních 47 aminokyselin řečené bílkoviny (Sequence Identification number, SEQ ID NO: 1). Tato sekvence je klonována pod kontrolou tryptofanového promotoru E. coli, který zahrnuje terminátor bakteriofágu T4 jako signál pro transkripční terminaci a gen rezistentní k ampicilinu jako selekční markér (signální znak).
Aby byl získán expresní vektor PM-83, byl stabilizující peptid nejprve amplifikován použitím polymerásové řetězové reakce (PCR), (Randall, K. a kol., Science, 42394, 487-491, 1988) z plasmidu pM-6, který nese nukleotidovou sekvenci kodifikující pro P64K antigen (evropská patentová přihláška číslo 0474313 A2, obrázek 1). Pro tento účel byly použité oligonukleotidové primery 1573 a 1575, které zavádějí Ncol a Xbal restrikční místa do amplifikovaného fragmentu DNA, což odpovídá amino a karboxylovým terminačním koncům stabilizátoru kodifikovaného pomocí tohoto:
Ncol
1573: 5' TTCCATGGTAGATAAAAG 3'(SEQ ID NO: 2)
Xbal
1575: 5' TTTCTAGATCCAAAGTAA 3'(SEQ ID NO: 3)
Aminokyselinová sekvence kodifikována pomocí výsledného stabilizátoru je ukázána na obrázku 3 (SEQ NO: 6).
0 •· 0··· 0 · · • · ··· • · ···»
- Ί3Zavedení restrikčního místa Ncol zaměňuje leucin 2 za valin a primer 1575 eliminuje sekvenci ETD pozice 45-47), zavedením na její místo sekvenci DLE. V tomto případě vázaný lysin lipoové kyseliny (pozice 48) netvoří část stabilizátoru a jeho blízké okolí, které je vysoce zachované v těchto doménách je změněno (Russel, G.C., Guest, J.R., Biochim. Biophys. Record, 1076, 225-232, 1991). Všechny tyto záruky eliminují možnosti posttranslační lipoylace fúzovaných bílkovin, které obsahují tyto domény a tvorbu auto protilátek podobné specifity k těmto představitelům během imunizace s těmito bílkovinami v pacientech s cirhosou žlučovodu (Tuaillon, N., André, C., Briand, J.P. a kol., J. Immunol., 148, 445-450).
Plasmid pM-83 byl konstruován pomocí klonování tohoto fragmentu (SEQ ID NO: 5), který byl předtím spojený s pomocí Xbal/Ncol v plasmidu pILM-29 (Guillén, G., Loyal,
M. , Alvarez, A. a kol., Acta Biotenologica, 15, 97-106, 1995). Plasmid pILM29 obsahuje gen pro bílkovinu Ope (5c)
N. menigitidis, který je fúzovaný do stabilizujícího peptidu ve shodě s prvními 58 aminokyselinami lidského IL-2 tak, že toto klonování odstraňuje fragment IL-2 a fúzuje bílkovinu Ope k stabilizujícímu proteinu P64K (obrázek 4). Z výsledného plasmidu, označeného pM-80, byl vyříznut ope gen použitím enzymů Xbal a BamHI a v tomto místě byl klonován adaptér tvořený hybridizací oligonukleotidu 1576 a 1577, které zahrnují restrikční místa Xbal, EcoRV a BamHI v nejvzdálenějším místě 3'stabilizujícího fragmentu:
1576 5'CTAGATTTGATATCAG 3'(SEQ ID NO: 7)
1577 3'TAAACTATAGTCCTAG 5'(SEQ ID NO: 8)
Tento plasmid byl označen jako pM-83 (obrázek 4). Vložení všech fragmentů DNA a oligonukleotidů, jakož též zachování správného čtecího rámce, bylo zkontrolováno pomocí DNA sekvence podle Sanger, F. a kol.', (PNAS, USA, 74 : 54631977) .
Příklad 3:
Je důležité, že stabilizátor neobsahuje oblasti vysoké homologie s lidskými bílkovinami, jestliže výsledná fúzovaná bílkovina je kandidátem vakcíny. Stanovení podobnosti stabilizujícího peptidů pM-83 (příklad 2) s lidskou bílkovinou bylo provedeno pomocí výzkumu homologie podle základních údajů EMBL DATA LIBRARY v.38 (Curi, C.M., Fuchs, R., Higgins, D.G. a kol., Nucl. Acids Beast. 21, 2967-2971, 1993) nukleotidových sekvencí a SWISS-PROT v.38 (Bairoch, A. a Boeckraann, B., Nucl. Acids Beast. 21, 3093-3096, 1993) aminokyselinových sekvencí obě dvě březnovými verzemi roku 1994 . Pro tento výzkum byly použité dva programy BLAST (Altschul, S.F., Gish,
W., Miller, W., Myers, And.W. a Lipman, D.J., J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990): BLASTP, který srovnává jednu aminokyselinovou sekvenci proti základním sekvencím bílkoviny (v tomto případě SWISS-PROT) a TBLASTN, který srovnává aminokyselinovou sekvenci proti všem translacím v obou směrech a ve všech čtecích rámcích základních nukleotidových sekvencí jako v tomto případě EMBL Data Library; v obou dvou případech bylo použito zhodnocení dle matrice PAM120 (Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. a Orcutt, B.B., v: Dayhoff, M.Or. (of.), Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, supi. 3, 345-352, Natn.
Biomed. Beast. Found., Washington, 1978).
Výsledek může být pozorován na obrázku 5 a 6, v kterých jsou ukázány plochy vlastních výsledků BLASTP a TBLASTN (homologní sekvence prokaryotů nebo vnitřních eukaryotů byly vynechány pro lepší porozumnění). Je zřejmé, že žádná lidská bílkovina nebo z jakýchkoliv jiných savců nepředstavuje významný smysl v podobnostech se stabilizátorem odvozeným od P64K, nebot homologie detekované pomocí obou algoritmů (v lidských a krysích pyruvátech kinasy a C-terminálním konci lidských a psích mucinech) představuje nejvyšší pravděpodobnost příčinného vlivu (jako srovnávací hledisko, stejné pravděpodobnosti • · · • · ··· ·· ···· • · ·· ··«
- yrpro případ dihydrolipoamidu acetyl transferasy
Azotobacter vinelandii, je to 3,7xl0'5).
Přes všechno to co bylo zmíněno výše může být shrnuto, že použití řečených stabilizátorů ve vakcinových kandidátech je absolutně jisté.
Příklad 4:
Byla vypočítána kapacita přítomného stabilizátoru v pM83, který usnadňuje intracelulární syntézy ve vysokých úrovních a tvoří inkluzní tělíska a to pomocí srovnání exprese několika bílkovin fúzovaných do prvních 22 nebo 58 aminokyselin lidského interleukinu-2 (IL-2), fúzovaný peptid byl používaný s tímto koncem, nebo fúzovaných do prvních 47 aminokyselin antigenu P64K, který byl modifikován podle postupu popsaném v příkladě 2.
Pro tento účel byly klonovány geny kodifikující vnější membránu bílkovin N. menigitidis B:4:P1.15 PorA a Ope do vektorů pFP15 (hIL2-58: evropský patent číslo 416673 Bl) nebo pM-83 (P64K-47) a ve vektorech pISL31 (hIL2-22, Castellanos-Sierra, L.R., Hardy, E., Ubieta, R. a kol., předložený papír) nebo pM-83 geny kodifikující multiepitopický polypeptid (MEP), který zahrnuje imunogenní oblasti několika izolátů virů HIV. Výsledná exprese plasmidú je: pILM-28 (IL2-58 PorA, Guillén, G., Alvarez, A., Lion, L. a kol., 494-498 v : Conde-Gondález, C.J., Morse, S., Rice, P. a kol. (eds.)., Pathobiology and Immunobiology of Neisseriaceae, Instituto de Sálu Publica Nacionál, Cuernavaca, Mexico, 1994), pM-82 (P64K47, Niebla, O., Alvarez, A., González, S. a kol., 85-86 v: Evans, J.S., Yost, S. a Madien, M.C.J. a kol. (eds.)., Neisseria 94: Proceeding of the IX Internacionál Pahtogenic Neisseria Conference, Winchester, England, 1994), pILM-29 (IL2-58 Ope, Guillén, G., Leal, M., Alvarez, A. a kol., Acta Biotechnologica, 15, 97-106, 1955), pM-80 (příklad 2, obrázek 4), pTAB4 (IL2-22 + MEP) a pTAB9 (P64K-47 MEP).
• •44
444
Bílkoviny TAB4 a TAB9 jsou multiepitopické polypeptidy (MEP), které obsahují několik kopií centrální části variabilní oblasti 3 (V3) bílkoviny gp!20 viru HIV-1. Pro konstrukci těchto MEP bylo vybráno 15 centrálních aminokyselin oblasti V3 následujících isolátů:
LR150: SRGIRIGPGRAILAT (SEQ ID NO: 9)
JY1: RQSTPIGLGQALYTT (SEQ ID NO: 10)
RF: RKSITKGPGRVIYAT (SEQ ID NO: 11)
MN: RKRIHIGPGRAFYTT (SEQ ID NO: 12)
BRVA: RKRITMGPGRVYYTT (SEQ ID NO: 13)
IIIB: SIRIQRGPGRAFCTI (SEQ ID NO: 14)
Tyto oblasti jsou navázány pomocí intergenové sekvence peptidů pěti aminokyselin sekvence AGGGA (SEQ ID NO: 17). Tiby bylo toto dosáhnuto, byla získána DNA sekvence, která kodifikuje V3 epitopy vazbou intergenové sekvence peptidů, chemickou syntézou (SEQ ID NO: 21) a byla klonována pod kontrolou tryptofanového promotoru, který byl fúzován k prvním 22 aminokyselinám lidského IL-2 (obrázek 7). Z výsledného plasmidu označeného jako pTAB3 byl vyříznut fragment obsahující gen pro MEP, tryptofanový promotor a terminátor T4 pomocí enzymů Seal a HindlII a byl klonován do pUC19 (Yanisch-Perron, C. akol., 1985, Gene 33, 103-119), aby byl získán plasmid pTAB4 (obrázek 7). Na konec byl plasmid pTAB9 konstruován eliminací sekvence kodifikující stabilizátor odvozený od lidského IL-2 pomocí štěpení enzymy Ncol a Xbal a klonováním v tomto místě fragmentu, který kodifikuje prvních 47 aminokyselin antigenů P64K získaného pomocí polymerásové řetězové reakce (PCR), jak je popsáno v příkladě 2. Sekvence výsledných MEP je ukázána na obrázku 8 a jeho organizace na obrázku 9 A.
Hostujícími kmeny E. coli K-12 použité pro všechny tyto plasmidy byly W3110 (Hill, C.W. a Hamish, B.W. Proč.
Nati. Acad. Sci., 78, 7069, 1981, Jensen, K.F., J. Bacteriol., 175, 3401-3407, 1993) propILM-'28, pILM-2 9, pM-80 a pM-82 a W3110 trpA905 pro pTAB4 a pTAB9. Exprese byla dosáhnuta ve všech případech inokulací kultury 5 mL LB media (Sambrook, J., Fritsch, Y.F. a Maniatis, T., Molecular Cloning: To Manual Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, New York, USA) s ampicilinem (Ap) do 50 μρ/πιΐ a tryptofanem (W) do 100 μ g/ml, která byla pěstována po 12 hodin při 37 °C. Řečená kultura byla použita k inokulaci kultury 50 ml LB-Ap (pTAB4 a pTAB9) nebo definovaného media složeného ze solí M9 (Miller, J.H., Experiments in Molcular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972, New York, USA), glukosy do 1%, hydrolyzátu kaseinu do 1% , CaCl2 0,1 mM, MgCl2 lmM a Ap do 50 μg/ml (pILM-28, pILM-29, pM-80), které bylo pěstováno po 12 hodin při 37 °C a při otáčkách 50 ot/min.. Po této době byly sebrány všechny vzorky bílkovin a analyzovány pomocí denaturovaného polyakrylamidu gelové elektroforézy (SDS-PAGE, Laemli, O.K., Nátuře, 277, 680, 1970s) a obarveny s modrou Coomasssie Brilliant Blue R-250. Expresní procenta byla analyzována v densiometru laserem Bromma-LKB. Jejich buněčné umístění bylo stanoveno pomocí lyse buněk pomocí zpracování kombinace s lysosymem a ultrazvukem, po určité době potom byly rozpustné bílkoviny separovány z nerozpustného podílu pomocí centrifugace. Nerozpustná bílkovina byla použita jako kriterium, aby byla předpokládána její exprese jako inkluzních tělísek, protože ostatní podmínky pod kterými mohla vykazovat řečené vlastnosti (spojování k membránám nebo k peptidovému glykanu) jsou v tomto případě nepravděpodobné.
Shrnutí těchto výsledků může být viditelné na obrázku 10 A. Ve všech těchto případech je exprese pod kontrolou stabilizátoru odvozeného od P64K srovnána s expresí získané, když se fúzované peptidy IL-2 týkají vztahu heterologních bílkovin: celková buněčná bílkovina ( viz obrázek 10 B pro případ MEP), upevňuje kapacitu pM-83, aby byl použitý jako vektor pro expresi fúzovaných peptidú. Je bezcenné, když tyto polypeptidy jsou těžce exprimovatelné v E. coli, jestliže nejsou fúzovány bud kvůli jejich malé velikosti a senzibilitě k proteásám hostitele nebo kvůli jejich toxicitě v případě proteinu PorA a bakteriálnímu porinu obecně (Carbonetti, N.H. a Sparling, P.F., Proč. Nati. Acad. Sci. USA., 84,90849088). Ve všech těchto případech byl získán produkt jako inkluzní tělísko jak je doloženo příkladem pro plasmid pTAB9 (obrázek 10 C).
Na závěr je možné naznačit, že použití stabilizátoru odvozeného od prvních 47 aminokyselin P64K antigenu N. raeningitidis (P64K-47) vyplývá ve schopnost exprese heterologních bílkovin jako inkluzních tělísek, které jsou srovnatelné s ostatními systémy (evropská patentová přihláška číslo 416673 A2 a číslo 229998, Hoechst AG, evropský patent číslo 416673 Bl, Castellanos-Sierra,
L.R., Hardy, E., Ubieta, R. a kol., předložený rukopis), s přídavnou výhodou pro produkt, který je používán přímo ( t.j. bez jeho separace od stabilizátoru) vzhledem k absenci smysluplné homologie k protilátkám lidského původu.
Příklad 5:
Dosažitelnost ligandu, který specificky rozpozná stabilizátor (například protilátka, enzymový kofaktor atd.) je požadovanou charakteristikou v jakémkoliv expresním systému rekombinantních bílkovin. To je vzhledem k tomu, že předcházející mohou usnadnit, například návrh schopnosti plánování účinnosti čištění, jetliže řečený ligand je imobilizovaný v chromatografické pryskyřici a dokonce - v případě protilátek - další sledování pomocných kroků čištění pomocí imunologických technik nezávisle na identitě exprimované heterologní bílkoviny.
Takový předmět byl dosáhnut imunizací myši s proteinem TAB13 (SEQ ID NO: 20) , aby byly získány mónoklonální protilátky (MAb) proti tomuto stabilizátoru. Protein TAB13 je MEP odvozený od TAB9, který je odlišný od
předcházejícího pomocí přítomnosti dvou přídavných V3 souhlasných oblastí (obrázek 9 B):
-C6: TSITIGPGQVFYRTG (SEQ ID NO: 15)
-C8: RQRTSIGQGQALYTT (SEQ ID NO: 16)
Tento MEP byl exprimovaný (příklad 4) a čištěný (příklad 6) analogickou cestou, jak je popsána pro proteiny TAB4 a TAB9 .
Potom byl myší Balb/c imunizován pomocí subkutánní cesty s třemi dávkami 20 gg TAB13 rozpuštěného v hydroxidu hlinitém v patnáctidenním intervalu. Zvířata byla povzbuzena intraperitoneální cestou pomocí 20 gg stejného antigenu ve fosfátovém pufru, dvacet dní po poslední dávce. Splecnocyty byly fúzovány s myelomem X63 Ag8 653 a výsledné hybridomy byly isolovány a testovány podle zavedených metod (Gavilondo, J.V. (ed) ., Monoclonal Antibodies: Theory and Practical, Elfos Scientiae, 1995, The Havana, Cuba).
Reaktivita protilátek vyměšovaných pomocí isolovaných hybridomů byla ohodnocena pomocí testu ELISA, potažením ploten s MEP TAB13, bílkovinou P64K nebo syntetickými peptidy, které jsou představené různými oblastmi V3 přítomnými v TAB13. Celkově bylo získáno 18 positivních klonů jeden z nich, označovaný jako 448/30/7, rozpoznává protein TBA13 jakož i protein P64K, ale nerozeznává žádné peptidy z gpl20.
Specifita těchto Mab pomocí stabilizujícího peptidů pM-83 a možnost jejího použití pro imunologickou detekci bílkovin, které to obsahují, byla stanovena pomocí westernového přenosu použitím různých vzorků, heterologních proteinů fúzovaných ke stabilizátoru odvozeném od P64K (P64K-47) nebo stejný fúzovaný protein nebo k prvním 58 aminokyselinám IL-2 (IL2 -58) .Aby toto bylo provedeno, byl kmen E. coli MM294 transformován (Sambrook, J., Fritsch, E.F. a Maniatis, T., Molecular Cloning: To Manual Laboratory, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA) s následujícími plasmidy: pILM-28 (IL258 + porA), pM-82 (P64K-47 +porA),
• · · · ·· ···· • · • ··· ·· ♦··
-2.0pTAB13 (P64K-47 + ΜΕΡ), ρΜ-6 (Ρ64Κ a pFP15 (IL-2). Expresní plasmid pM-134 byl také použitý, který obsahuje prvních 120 aminokyselin P64K, které zahrnují vazebnou doménu k lipoové kyselině pod kontrolou stejných regulátorových signálu jako v předcházejících plasmidech. Tento segment byl amplifikován pomocí PCR metody použitím primeru 1573 (SEQ ID NO: 2) a 2192 (SEQ ID NO: 4) byl dále štěpen s enzymy Ncol a BamHI a klonován v plasmidu pFP15 (viz obrázek 4) štěpený jednotlivě. Exprese těchto transformantů byla dosáhnuta za růstových podmínek specifických pro plasmidy pTAB4 a pTAB9 (obrázek 4). Získané výsledky jsou uvedeny na obrázku 11. Jak může být oceněno, MAb 448/30/7 rozpoznávající pravděpodobně lineární epitop uvnitř stabilizátoru P64K, vzhledem k jeho reaktivitě se vzorky plasmidů pM-6 pM-82, pTAB13 a pM134 ,je na vzdory od všech ostatních bílkovin antigenně odlišný. Tento experiment ukazuje, že tato reaktivita v žádném případě není vzhledem k bílkovině fúzována ke stabilizátoru (např. plasmidy pILM-28 a pM-82: oba dva nesou gen porA pod odlišným stabilizátorem), který dokazuje specifitu rozpoznání tohoto MAb.
Na závěr lze říct, že expresní systém formovaný pomocí stabilizátoru (64K-47), plasmidy, které jej obsahují a MAb 448/30/7, dovoluje účinnou syntézu a v tvorbě inkluzních tělísek velkou různost bílkovin a jejich detekci bez předcházející použitelnosti imunologických nukleotidových sond proti každému polypeptidů k expresi.
Př íklad 6:
Absence škodlivých účinků na imunní odpověd proti polypeptidů fúzovanému ke stabilizátoru je důležitým faktorem, když bereme v úvahu pod zvoleným expresním systémem vakcinové kandidáty. Jednou z výhod expresního systému založeného na stabilizátoru P64K je'jeho naprosto správně zvýšená imunogenicita (příklad 1), která garantuje předcházející. Nicméně vliv stabilizátoru P64K ·· ··· • ·· ·
- 27v imunní odpovědi proti fúzovanému proteinu byla zhodnocena kvalitativně přes srovnání odpovědí protilátek proti různým peptidům V3 oblasti přítomné v MEP TAB4 (IL2-22) a TAB9 (P64K).
Pro expresi a čištění peptidů TAB4 a TAB9 byla biomasa kmene W3110 trpA905 + pTAB4 a W3110 trpA905 + pTAB9 získána jak je popsáno v příkladě 4. Tato biomasa byla narušená kombinací zpracováním s lysosymem a s ultrazvukem v přítomnosti fluoridu fenyl metyl sulfonylu (PMSF) a neiontovým detergentem Tritón-X-100, inkluzní tělíska byla získána pomocí diferenciální centrifugace a MEP byly částečně čištěny a rozpuštěny pomocí dvou po sobě jdoucích mycích cyklů inkluzních tělísek s kaotrofickými činidly a detergenty (TAB4: 1. Urea 4 Tritón-X-100 1%, 2. Urea 8 Μ. TAB9: 1. Urea 8 M Tritón-X100 1%, 2. ganidin chloridu 6 M) .
Získané supernatanty byly nakonec vyčištěny pomocí vzestupného gradientu od 20 do 80 % acetonitrilu v koloně C4 VYDAC vysoce výkonné kapalné chromatografie (HPLC ) při dosáhnutí přibližně 90% čistoty.
Čištěný rokombinantní protein byl adjustován v gelu hydroxidu hlinitého použitím poměru 60 mg adjuvantu na 1 mg proteinu. Tyto přípravky byly použité k imunizaci pěti skupin králíků pomocí subkutánní cesty s 200 gg/ dávku. Imunní odpověď byla vyhodnocena pomocí testu ELISA použitím polystyrénových plátků 96 jamek (High binding, Costar, USA), dobře potaženými s MEP použitým pro imunizaci nebo s peptidy, kterým odpovídají vždy jeden přítomných na oblastech V3. Titry byly vypočítány jako maximální zředění každého séra s hodnotou absorbance dvakrát vyšší než u směsi předchozího imunního séra. Všechna séra byla analyzována pomocí duplikátu.
Získané hodnoty (obrázek 12) ukazují, že titry proti oblastem V3 jsou podobné mezi střídajícími se IL2-22+MEP (TAB4) a P64K-47+MEP (TAB9). Ačkoliv frekvence rozpoznávání peptidů je mírně větší pro TAB9, není tento rozdíl statisticky významný (p < 0,05). Na závěr lze • · · shrnout, že imunogenicita heterologních bílkovin je postižená pomocí stabilizátoru P64K minimálním způsobem i ve srovnávní s ostatními expresními systémy v současné době používanými.

Claims (19)

  1. Patentové nároky
    1. Fúzovaný protein, který obsahuje stabilizující peptid odvozený od prvních 47 aminokyselin Nterminálního konce antigenu P64K Neisseria meningitidis B:4:P1.15 fúzovaného do heterologního proteinu.
  2. 2. Fúzovaný protein podle nároku 1, kde heterologní protein je protein vnější membrány Neisseria meningitidis.
  3. 3. Fúzovaný protein podle nároku 2, kde heterologní protein je Ope(5) protein Neisseria meningitidis nebo PorA protein Neisseria meningitidis.
  4. 4. Fúzovaný protein podle nároku 1, kde heterologními proteiny jsou multiepitopické polypeptidy, které zahrnují několik kopií centrální části variabilní oblasti 3 (V3) z gp 120 proteinu z HIV-1.
  5. 5. Fúzovaný protein podle nároku 4, kde multiepitopickými polypeptidy jsou polypeptidy TAB4 a/nebo TAB9.
  6. 6. Způsob přípravy heterologních proteinů jako fúzovaných polypeptidů v E. coli, vyznačený tím, že peptid odvozený od prvních 47 aminokyselin Nterminálního konce antigenu P64K Neisseria meningitidis B:4:P1.15 je použitý jako stabilizátor pro expresi řečeného heterologního proteinu a monoklonální protilátka specifická pro stabilizátor je použitá pro imunodetekci jakéhokoliv k němu fúzovanému proteinu.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, žé aminokyselinová sekvence stabilizujícího peptidů odpovídá v podstatě sekvenci, SEQ ID NO: 6:
    10 20 30 40 47
    MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE
  8. 8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že monoklonální protilátka použitá pro čištění fúzovaného proteinu je označena jako 448/30/7 .
  9. 9. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že exprimovaný heterologní protein je jakýkoliv protein, který může být použitý jako imunogen ve vakcínovém přípravku.
  10. 10. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že exprimovanými heterologními proteiny jsou multiepitopické polypeptidy TAB4 a/nebo TAB9 nebo proteiny vnější mambrány Ope(5) nebo Porc Neisseria meningitidis.
  11. 11. Monklonální protilátka 448/30/7, která je specifická pro stabilizující peptid odvozený od prvních 47 aminokyselin N-terminálního konce P64K antigenu Neisseria meningitidis B:4:P1.15 a je použitý pro imunodetekci a čištění jakéhokoliv proteinu fúzovaného do řečeného stabilizujícího peptidu.
  12. 12. Expresní vektor fúzovaných proteinů v E. coli, který obsahuje sekvenci kódující stabilizátorový peptid odvozený od prvních 47 aminokyselin N-teminálního konce P64K antigenu Neisseria meningitidis B:4:P1.15 pod kontrolou tryptofanového promotoru E. coli, po kterém následují restrikční místa Xbal, Eco a BamHI pro klonování DNA fragmentů v rámci kódování důležitých polypeptidů a fágový terminátor T4 jako transkripční terminační signál jakož též gen ampicilinové rezistence jako selekční markér.
  13. 13. Expresní vektor podle nároku 12 pro klonování fragmentů DNA v rámci kódování proteinů vnější membrány Neisseria meningitidis.
  14. 14. Expresní vektory podle nároku 13 pojmenované pM-80 a pM-82.
  15. 15 Expresní vektor podle nároku 12 pro klonování fragmentů DNA v rámci kódování multiepitopického polypeptidů, který zahrnuje kopie centrální části variabilní oblasti 3 (V3) patřící k gpl20 proteinu z HIV-1.
  16. 16. Expresní vektory podle nároku 15 pojmenované pTAB4 a pTAB9.
  17. 17. Rekombinantní kmen E. coli, který je výsledkem transformace jakéhokoliv kmene E. coli K12 s jakýmikoliv expresními vektory podle nároků 12 až 16.
    • ·
    - 2599 9999
    9 9 9
    9 9 999
    9 9 ·
    9 9 ·
    99 · *·
    999 9
  18. 18 Použití fúzovaného proteinu podle nároků 1 až 8 ve vakcínových přípravcích pro použití u lidí nebo zvířat.
  19. 19. Vakcínový přípravek, který obsahuje fúzovaný protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 jako i vhodný nosič.
CZ972910A 1996-01-17 1997-01-17 Expresní systém heterologních proteinů jako fúzovaných proteinů CZ291097A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU1996010A CU22559A1 (es) 1996-01-17 1996-01-17 Sistema de expresión de antígenos heterologos en e. coli como proteínas de fusión

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ291097A3 true CZ291097A3 (cs) 1998-11-11

Family

ID=5459182

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ972910A CZ291097A3 (cs) 1996-01-17 1997-01-17 Expresní systém heterologních proteinů jako fúzovaných proteinů

Country Status (22)

Country Link
US (2) US6146635A (cs)
EP (1) EP0816506B1 (cs)
JP (1) JP4071282B2 (cs)
KR (1) KR100500782B1 (cs)
CN (1) CN1107115C (cs)
AR (1) AR005651A1 (cs)
AT (1) ATE198491T1 (cs)
AU (1) AU722317B2 (cs)
BR (1) BR9704641B1 (cs)
CA (1) CA2214840A1 (cs)
CU (1) CU22559A1 (cs)
CZ (1) CZ291097A3 (cs)
DE (1) DE69703813T2 (cs)
DK (1) DK0816506T3 (cs)
EA (1) EA000307B1 (cs)
ES (1) ES2157060T3 (cs)
GR (1) GR3035690T3 (cs)
HU (1) HUP9800730A3 (cs)
IL (1) IL121614A (cs)
MX (1) MX9707071A (cs)
PT (1) PT816506E (cs)
WO (1) WO1997026359A1 (cs)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9726398D0 (en) 1997-12-12 1998-02-11 Isis Innovation Polypeptide and coding sequences
WO1999036544A2 (en) 1998-01-14 1999-07-22 Chiron S.P.A. Neisseria meningitidis antigens
GB9808866D0 (en) * 1998-04-24 1998-06-24 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9810276D0 (en) * 1998-05-13 1998-07-15 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9818004D0 (en) * 1998-08-18 1998-10-14 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
ES2299276T3 (es) 1998-12-31 2008-05-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Polipeptidos env del vih modificados.
US7935805B1 (en) * 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
JP2003523721A (ja) * 1998-12-31 2003-08-12 カイロン コーポレイション 抗原性ｈｉｖｃ型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびそれらの使用
CA2360347C (en) * 1998-12-31 2013-05-07 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
AUPQ347199A0 (en) * 1999-10-15 1999-11-11 Csl Limited Novel polypeptide fragments
ATE429643T1 (de) 2000-07-12 2009-05-15 Agensys Inc Neues tumor antigen das für diagnose und therapie von blasen-, eierstock-, lungen- und nierenkrebs verwendet werden kann
EP1313850B1 (en) 2000-08-28 2008-08-06 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 85p1b3 useful in treatment and detection of cancer
US6924358B2 (en) 2001-03-05 2005-08-02 Agensys, Inc. 121P1F1: a tissue specific protein highly expressed in various cancers
US7271240B2 (en) 2001-03-14 2007-09-18 Agensys, Inc. 125P5C8: a tissue specific protein highly expressed in various cancers
CA2443123A1 (en) 2001-04-10 2002-10-24 Agensys, Inc. Nuleic acids and corresponding proteins useful in the detection and treatment of various cancers
US20030191073A1 (en) 2001-11-07 2003-10-09 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
US7211659B2 (en) 2001-07-05 2007-05-01 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic HIV type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP2280074A3 (en) * 2001-07-05 2011-06-22 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Polynucleotides encoding antigenic HIV type B and/or type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
CU23245A1 (es) * 2001-07-16 2007-10-17 Inst De Medicina Tropical Pedr CADENAS QUIMéRICAS CODIFICANTES PARA PROTEINAS INDUCTORAS DE EFECTOS CONTRA VIRUS. PREPARADOS UTILIZANDO PROTEINAS QUIMéRICAS
KR100447530B1 (ko) * 2001-08-14 2004-09-08 한국과학기술원 ＯｍｐＦ를 이용하여 목적 단백질을 대장균 세포외로분비생산하는 방법
EP1427806A4 (en) * 2001-08-31 2006-04-26 Chiron Corp ANTIGENIC HIV-TYPE B POLYPEPTIDE-CODING POLYNUCLEOTIDES, POLYPEPTIDES, AND USES THEREOF
US20030170614A1 (en) * 2001-08-31 2003-09-11 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2003022995A2 (en) 2001-09-06 2003-03-20 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled steap-1 useful in treatment and detection of cancer
MX339524B (es) * 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
US20040081653A1 (en) 2002-08-16 2004-04-29 Raitano Arthur B. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 251P5G2 useful in treatment and detection of cancer
CA2503346C (en) 2002-11-27 2014-03-18 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 24p4c12 useful in treatment and detection of cancer
AU2004210975B2 (en) 2003-02-10 2008-04-10 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein named 158P1D7 useful in the treatment and detection of bladder and other cancers
DK1629088T3 (da) 2003-05-30 2012-05-07 Agensys Inc Varianter af prostatastamcelleantigen (psca) og undersekvenser deraf
US20050040037A1 (en) * 2003-08-20 2005-02-24 Walton Scott G. Electron beam enhanced large area deposition system
CU23237A1 (es) * 2003-12-03 2007-09-26 Ct Ingenieria Genetica Biotech PROTEINA NMB1125 Y SU USO EN FORMULACIONES FARMACéUTICAS
CU23236A1 (es) * 2003-12-03 2007-09-26 Ct Ingenieria Genetica Biotech PROTEINA NMB0928 Y SU USO EN FORMULACIONES FARMACéUTICAS P
MXPA06013834A (es) 2004-05-28 2007-03-01 Agensys Inc Anticuerpos y moleculas relacionadas que enlazan a proteinas psca.
CN100518818C (zh) * 2004-11-15 2009-07-29 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种预防和/或治疗消化系统肿瘤的疫苗
EP1863848A4 (en) 2005-03-31 2009-09-23 Agensys Inc CORRESPONDING ANTIBODIES AND MOLECULES THAT ATTACH PROTEINS 161P2F10B
CU23578A1 (es) 2005-09-16 2010-09-30 Ct Ingenieria Genetica Biotech Proteína de la cápsida del virus dengue inductora de respuesta protectora y composición vacunal
CU23630A1 (es) 2006-10-30 2011-02-24 Ct Ingenieria Genetica Biotech Moléculas peptídicas quiméricas con propiedades antivirales contra los virus de la familia flaviviridae
WO2009056535A2 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 Genimmune N.V. Methods and kits for inducing a ctl response using a prime boost regimen
WO2011119920A2 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
EP2530159A1 (en) * 2011-06-03 2012-12-05 Sandoz Ag Transcription terminator sequences
HUE037408T2 (hu) 2011-06-10 2018-08-28 Univ Oregon Health & Science CMV glikoproteinek és rekombináns vektorok
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2586461A1 (en) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Viral particles derived from an enveloped virus
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
EP2848937A1 (en) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel HIV-1 immunogens
US10058604B2 (en) 2013-10-07 2018-08-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
US10174292B2 (en) 2015-03-20 2019-01-08 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
US9931394B2 (en) 2015-03-23 2018-04-03 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
CU24705B1 (es) 2020-10-22 2024-06-11 Ct Ingenieria Genetica Biotecnologia Antígeno quimérico que comprende el dominio extracelular de pd-l1

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0472658A4 (en) * 1989-05-19 1992-08-26 Biotechnology Res & Dev Fusion proteins having an in vivo post-translational modification site and methods of manufacture and purification
CU22302A1 (es) * 1990-09-07 1995-01-31 Cigb Secuencia nucleotidica codificante para una proteina de la membrana externa de neisseria meningitidis y uso de dicha proteina en preparados vacunales

Also Published As

Publication number Publication date
EP0816506B1 (en) 2001-01-03
ES2157060T3 (es) 2001-08-01
US6146635A (en) 2000-11-14
AR005651A1 (es) 1999-07-14
PT816506E (pt) 2001-06-29
DE69703813T2 (de) 2001-08-09
IL121614A (en) 2006-10-31
CN1107115C (zh) 2003-04-30
HUP9800730A2 (hu) 1998-07-28
BR9704641B1 (pt) 2010-03-09
IL121614A0 (en) 1998-02-08
US6921809B1 (en) 2005-07-26
EP0816506A1 (en) 1998-01-07
EA000307B1 (ru) 1999-04-29
CA2214840A1 (en) 1997-07-24
EA199700244A1 (ru) 1998-02-26
ATE198491T1 (de) 2001-01-15
KR100500782B1 (ko) 2005-11-25
GR3035690T3 (en) 2001-07-31
KR19980703043A (ko) 1998-09-05
DE69703813D1 (de) 2001-02-08
AU722317B2 (en) 2000-07-27
DK0816506T3 (da) 2001-05-21
JPH11503617A (ja) 1999-03-30
CU22559A1 (es) 1999-05-03
HUP9800730A3 (en) 1999-07-28
AU1539697A (en) 1997-08-11
MX9707071A (es) 1997-11-29
WO1997026359A1 (es) 1997-07-24
CN1177982A (zh) 1998-04-01
JP4071282B2 (ja) 2008-04-02
BR9704641A (pt) 1998-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ291097A3 (cs) Expresní systém heterologních proteinů jako fúzovaných proteinů
JP2665359B2 (ja) 免疫親和性による精製方法
JP3253327B2 (ja) 髄膜炎菌外層膜蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドおよびワクチン組成物
JP2981286B2 (ja) 破傷風トキシンフラグメントｃの発現
Carlson et al. Antibody assisted protein refolding
US5817318A (en) Synthetic peptides for an HIV-1 vaccine
JP2001510039A (ja) 診断および治療に有用な呼吸器多核体ウイルスエピトープならびにそれらを含んでなる抗体
CROTTET et al. Expression, purification and biochemical characterization of recombinant murine secretory component: a novel tool in mucosal immunology
AU714423B2 (en) Carrier protein having an adjuvant effect, immunogenic complex containing same, preparation method therefor, nucleotide sequence and vaccine
US5858369A (en) Anti-acids secretory recombinant BCG vaccine
JP2887238B2 (ja) ポリペプチド
US20190337994A1 (en) Production of soluble hiv envelope trimers in planta
AU729592B2 (en) Secretory immunoglobulin A as a mucosal vaccine delivery system
Bäckström et al. Characterization of an internal permissive site in the cholera toxin B-subunit and insertion of epitopes from human immunodeficiency virus-1, hepatitis B virus and enterotoxigenic Escherichia coli
WO2008152652A2 (en) A dengue envelope domain iii-based tetravalent protein vaccine
EP1806142B1 (en) Method for the production of (poly)peptides by using truncated variants of the SV 40 large T antigen with an intact N terminus
JPH10508479A (ja) 天然疎水性ペプチドアナログとしての組換えペプチドの産生
Santhanam et al. Dog Zona Pellucida Glycoprotein-3 (ZP3): Expression inEscherichia coliand Immunological Characterization
EP1304375B1 (en) Method of preparing antibody by gene immunization
Stockley et al. [34] Use of fusions to viral coat proteins as antigenic carriers for vaccine development
EP0588750A2 (en) Method for the production of recombinant polypeptides bearing epitopes from different hiv isolates, and their uses as immunogens and in the detection of antibodies against hiv
Algate et al. Antigens
CA2575000A1 (en) Synthetic hiv-1 and hiv-2 envelope genes that lead to optimized expression in bacteria for use in hiv antibody immunoassays

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic