BR9704641B1 - proteìna de fusão, vetor de expressão de proteìnas de fusão em e. coli, cepa recombinante e composição de vacina. - Google Patents
proteìna de fusão, vetor de expressão de proteìnas de fusão em e. coli, cepa recombinante e composição de vacina. Download PDFInfo
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"PROTEÍNA DE FUSÃO, VETOR DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE FU-SÃO EM E.COLI, CEPA RECOMBINANTE E COMPOSIÇÃO DE VACINA".
Setor Técnico
A presente invenção refere-se ao campo da Bio-tecnologia e à engenharia genética, particularmente à ex-pressão de proteínas heterólogas em hospedeiros microbia-nos através de sua fusão aos peptídios das bactérias, u-sando a tecnologia do DNA recombinante.
Técnica Anterior
A utilidade da tecnologia do DNA recombinantepara produzir proteínas de qualquer origem na E. coli temsido extensivamente demonstrada. Para isto, uma quantida-de importante de vetores têm sido .desenvolvidos, emboranovas variantes sejam necessárias devido ao fato que,freqüentemente cada gene a clonar e a expressar represen-ta um caso individual (Denhardt, D.T. e Colasanti, J.;Vectors, Butterworths, Stoneham, M, páginas 1791987 e Lu-kacsovich, T. e col., Journal of Biotechnology, 13,2431990).
A síntese intracelular tem sido a êstratégiamais usada para a obtenção de polipeptídios heterólogosna E. coli, devido aos altos níveis de expressão atingí-veis (Goeddel, D.V. Methods Enzymol., 185, 3-7, 1990).Entretanto, os fatores tais como a sensibilidade às pro-teases do hospedeiro ou a toxicidade da proteína expres-sa, podem reduzir significativamente os ditos níveis, in-dependentemente do uso de seqüências reguladoras de altaeficiência (Reads, C.A. e Saier, M.H., J. Bacteriol.,153, 685-692; Gwyn, G.W., Membrane Protein ExpressionSystems: To User's Guide, Portland Press, London., UK, 29- 82).
A clonagem das seqüências de nucleotideos codi-ficando para as proteínas de interesse em vetores adequa-dos, no quadro com as seqüências de ácido nucléico quecodificam os polipeptídios estáveis na célula hospedeira,dá surgimento à expressão de produtos híbridos no cito-plasma, conhecidos como proteínas de fusão (Marston,F.A.O., Biochem. J. 240, 11986). Tais polipeptídios sãogeralmente menos sensíveis a degradação proteolítica pelohospedeiro ou menos tóxicos devido à formação de corposde inclusão, o que resulta em níveis de expressão maioresdo aqueles obtidos sem o uso do peptídio estabilizador(Itakura, K. e col., Science, 198, 10561977). Ademais,este tipo de expressão facilita e barateia as etapas ini-ciais da purificação se diferentes métodos para o resta-belecimento da natureza subseqüente do produto recombi-nante estiverem disponíveis (Fischer, B., Sumner, I. eGoodenough, P., Biotechnol. Bioeng., 41, 3-13).
Os corpos de inclusão são agregados de proteínasinsolúveis que aparecem como corpos eletrodensos no ci-tossol durante a expressão de muitas proteínas recombi-nantes na E. coli (Rinas, Or. e Bailey, J., Appl. Micro-biol. Biotechnol., 37, 609-614). Eles são o resultado dainteração entre os polipeptídios parcialmente dobrados,cuja agregação é termodinamicamente favorecida devido àexposição, dentro deles, dos resíduos hidrofóbicos aosolvente (Kiefhaber, T., Rudolph, R. e col., Biotechnolo-gy, 9, 825-829). O lento dobramento no citossol bacteria-no de muitas proteínas eucarióticas, devido à abundânciade aminoácidos que formam pontes de dienxofre (Cisteína)ou aminoácidos que formam curvas beta (Prolina), estimu-lou o uso abundante das mesmas como peptídios estabiliza-dores. Exemplo daqueles é o uso, com este propósito, dospolipeptídios com atividade de ligação aos anticorpos,procedendo da globulina da gordura do leite humano(HMFG), de acordo com o pedido de patente internacionalPCT N2 WO 9207939 A2 920514; das regiões constantes dasimunoglobulinas, conforme descrito no pedido de patenteeuropeu Ne EP 0464533 Al 920108; da angiogenina humana(pedido de patente europeu N^ EP 0423641 A2 910424), dohormônio de crescimento (EP 0429586 Al 910605), a -S-transferase de glutação (WO 8809372 Al 881201) e da ade-nilato quinase suína (EP 0423641 A2 910424 e EP 0412526A2 910213).
Entretanto, o uso de polipeptídios estabilizado-res, os quais constituem uma parte significativa da pro-teína de fusão, têm algumas desvantagens se o primeirofor um candidado à vacina, uma vez que a presença das se-qüências exógenas pode alterar a ordem natural dos epíto-pos das células BeT (Denton, G., Hudecz, F., Kajtár, J.e col., Peptide Research, 7, 258-264) ou o processamentodos mesmos pelas células apresentando antígenos (Del Vai,M., Schlicht, H., Ruppert, T.,. e col., Cell, 66, 1145-1153), sendo capazes de até afetarem seriamente a imuno-genicidade do candidato pelo fenômeno da supressão espe-cifica para epitopo (Etlinger, H., Immunol. Today, 13,52-55).
Como um resultado do fenômeno anteriormente men-cionado, em alguns casos, pequenos fragmentos que aindaestabilizam a expressão têm sido experimentados paradefinir. Por exemplo, o pedido de patente alemão Ns35 41 856 Al (Hoechst AG) relata a possibilidade de uti-lizar um peptidio estabilizador conformado por pelo menosos primeiros 9 5 aminoácidos da extremidade N da proteínahumana Interleucina (IL-2) para obter as proteínas de fu-são em uma forma insolúvel sintetizada na E. coli. Simi-larmente, nos Pedidos de Patente Europeus Ns 0 416 67 3 A2e N2 229 998 da mesma empresa, um peptidio estabilizadorconsistente nos primeiros 58 ou 38 aminoácidos da ditaproteína, é usado. Na patente européia Ne 416 673 BI, osprimeiros 58 aminoácidos da IL-2 são também usados, e umaestratégia similar é seguida, com este propósito, no casodo uso de fragmentos com N terminal de soro albumina hu-mana (pedido de patente europeu Ns EP 0423641 Al 920212);o peptidio ativador III do tecido conjuntivo (W0 90136647Al 901115) e os fragmentos da calicreína humana (EP0381433 Al 900808). Estas invenções dão solução ao pro-blema anterior, porém os polipeptídios de fusão obtidosnão podem ser incluídos nas preparações de vacina paraserem usadas no ser humano, devido à possibilidade de in-dução das doenças autoimunes pela presença neles de se-qüências homólogas ou idênticas às proteínas humanas.
A alternativa de utilizar polipeptídios estabi-lizadores de origem bacteriana - e portanto, sem a reati-vidade cruzada com os antígenos de origem humana - para aexpressão intracelular, também tem sido explorada com su-cesso. Uma das proteínas mais usadas com esta finalidadetem sido a β-galactosidase da E. coli (Itakura,' K. ecol., Science, 198, 10561977) òu porções da mesma (pedidode patente alemão Ns EP 0235754 A2 870909, da empresa Ho-echst AG) . A desvantagem principal deste sistema é ogrande tamanho desta proteína, o que provoca que" o peptí-dio desejado somente represente uma pequena porção daproteína híbrida total (Flowers, N. e col., Appl. Micro-biol. Biotechnol. 25, 2671986; Goeddel, D.V. e col.,P.N.A.S. USA, 76, 106)/ Problemas similares tem apresen-tado o uso do fragmento C do toxóide do tétano e da exo-toxina da Pseudomonas sp. (Pedido de Patente Internacio-nal PCT WO 9403615 Al 940217 e Pedido de Patente EuropeuEP 0369316 A2 900523) . Uma variante de expressão muitopromissora é o uso de fusões com a tiorredoxina da E. co-li (pedido de Patente PCT N2 WO 9402502 Al 940203) , queusa a propriedade de ser liberada da célula por tensãoosmótica (Elyaagoubi, A., Kohiyama, M., Richarme, G., J.Bacteriol., 176, 7074 -7078) para facilitar a purifica-ção. Entretanto, este esquema não é funcional para a ob-tenção de corpos de inclusão, uma vez que os mesmos nãosão liberados através deste procedimento.
Muitos destes problemas têm sido resolvidos como modelo de proteínas de fusão modulares. Nestes, opeptídio estabilizador é separado da proteína de interes-se por um espaçador que permite o dobramento independentede ambos, e cuja seqüência de aminoácidos torna-o susce-tível ao ataque das endopeptidases específicas. Se houverum ligante que identifique o estabilizador escolhido, épossível purificar o polipeptídio de fusão através decromatografia por afinidade do e finalmente separá-lo doestabilizador através do tratamento com diferentes prote-ases (Cress, D., Shultz, J. e Breitlow, S., Promega youNote, 42, 2-7). Uma vantagem adicional é a possibilidadede explorar esta interação molecular para o acompanhamen-to das etapas intermediárias da purificação, sem a neces-sidade de anticorpos para cada proteína a expressar. Umexemplo bem conhecido daqueles é o uso da afinidade dahistidina (Hys) com alguns metais como o níquel (Ni) e ozinco (Zn) em sistemas compostos por um estabilizador com6 Hys em série e uma matriz de afinidade dos quelatos deníquel, de acordo com o que é descrito no pedido de Pa-tente PCT N2 WO 9115589 Al 911017 da The Upjohn Co. Ape-sar de tjudo isto, este tipo de sistema de expressão nãofunciona em todos os casos, uma vez que, entre outras ra-zões, a proteína de interesse pode ter sítios de restri-ção para a protease escolhida, ou estar dobrada de modoque o espaçador esteja disponível para o solvente (Uhlen,M. e Moks, T., Meth. Enzymol. 185, 129-140; Cress, D.,Shultz, J. e Breitlow, S., Promega you Note, 42, 2-7),para interferir com a ligação entre o estabilizador e amatriz de afinidade (New England Biolabs, The NEB Trans-cript, 3, 14), ou simplesmente requerer, para a sua puri-ficação, condições que afetem a sua atividade biológica.Por estas razões, é desejável ter diferentes variantes,uma vez que cada proteína a expressar pode representar umcaso particular. Com este propósito, eles desenvolverampeptídios estabilizadores baseados na proteína de ligaçãoà maltose da E. coli (MalE) , que têm afinidade pelas re-sinas de amilose (Pedido de Patente Europeu EP 0426787 Al910515) ; nas enzimas de cloranfenicol acetil transferase(Pedido de Patente Europeu N^ EP 0131363 Al 850116) ou naS-transferase por glutação (Pedido de Patente Europeu NsEP 0293249 Al 88130, da Amrad Corp., Ltd.) obtenível commatrizes de substrato imobilizado; na proteína A do Sta-phvlococcus aureus, de acordo com o pedido de patente PCTWO 9109946 Al 910711; e na subunidade de 12,5 kDa do com-plexo de transcarboxilase do Proprionibacterium sherma-nii, que é biotinilado in vivo e permite a purificaçãobaseada na afinidade da biotina pela avidina (Cress, D.,Shultz, J. e BreitloW, S., Promega Notes, 42, 2-7, pedidode patente N^ EP 0472658 Al 920304 ou WO 9014431 Al901129).
De interesse particular resulta o método descri-to no Pedido de Patente Europeu EP 0472658 Al 920304 ouWO 9014431 Al 901129, desenvolvido pela Biotechnology Re-search and Development Corporation, juntamente com a Uni-versidade de Illinois, USA. Neste pedido, um sistema deexpressão é descrito que utiliza o domínio de ligação aoácido lipóico da diidrolipoamida acetil transferase (EC2.3.1.12), também conhecido como subunidade E2 do comple-xo de piruvato desidrogenase da E. coli. Este domínio émodificado após a tradução in vivo pela adição de uma mo-lécula de ácido lipóico ao nitrogênio de uma de suas Ii-sinas (Guest, J.R., Angier, J.S. e Russell, G.C., Ann. N.Y. Acad. Sci., 573, 76-99), que é utilizado para a puri-ficação e a identificação das proteínas fundidas ao mesmoatravés do uso de um anticorpo que identifica somente osdomínios de lipoilato.
Este método, entretanto, tem diversas desvanta-gens. Primeira de todas, é sabido que a superexpressãodas proteínas contendo domínios de ligação ao ácido li-póico excede a capacidade da lipoilação celular, produ-zindo como conseqüência, não domínios de lipoilatos(Thousands, J.S. e Guest, J.R., Biochem. J., 245, 869-874; Ali, S.T. e Guest, J.R., Biochem. J., 271, 139-145)ou octanoilatos (Ali, S.T., Moir, A.J., Ashton, P.R. ecol., Mol. Microbiol., 4, 943-950; Dardel, F., Packman,L. C. e Perham, R.N., FEBS Lett. 295, 13-16), que podemreduzir o rendimento durante a purificação por imunoafi-nidade. Em segundo lugar, há um grupo de doenças de umaorigem autoimune suposta que têm, como fator comum, apresença de anticorpos que identificam especificamente oácido lipóico no contexto destes domínios. Entre elas es-tão a cirrose biliar primária, uma doença crônica carac-terizada pela inflamação e obstrução progressiva dos due-tos biliares intra-hepáticos (Tuaillon, N., André, C.,Briand, J.P. e col., J. Immunol., 148, 445-450); e a he-patite provocada pelo halotano, um anestésico de amplouso que derivou algumas proteínas pela formação de tri-fluoracetil lisina (Gut, J., Christen, Or., Frey, N. ecol., Toxicology, 97, 199-224). O soro dos pacientes comesta doença identifica os ditos complexos, cuja estruturamolecular é copiada pelo ácido lipóico no contexto dasdiidrolipoamida acetil transferases (Gut, J. , Christen,Or., Frey, N. e col., Toxicology, 97, 199-224). Por estarazão é desejável evitar a presença do ácido lipóico emtais peptídios se as proteínas de fusão que o contêmconstituírem candidadas à vacina para serem usadas no serhumano.
Divulgação da Invenção
É um objetivo da presente invenção um procedi-mento para a expressão até altos níveis de proteínas he-terólogas como polipeptídios de fusão na E. coli, queseja baseado no uso de um# derivado da seqüência de esta-bilizador a partir dos primeiros 47 aminoácidos do antí-geno P64K do N. meningitidis B:4:PI.15 (pedido de Patenteeuropeu N2 0 474 313 A2) que confira aos mesmos a capaci-dade de serem expressos como corpos de inclusão. A ditaseqüência, embora apresente homologia com parte do domí-nio de ligação ao'ácido lipóico das diidrolipoamida ace-til transferases, foi geneticamente manipulada para eli-minar a possibilidade de modificação por si mesma e apre-senta a vantagem de ser modestamente imunogênica. Esteprocedimento também inclui o uso de um anticorpo monoclo-nal que especificamente identifique o estabilizador men-cionado, permitindo a imunodetecção de qualquer proteínafundida ao mesmo.
Particularmente, na presente invenção, um plas-mídio recombinante como um vetor de expressão é usado, oqual carrega a dita seqüência sob o controle do promotorde triptofano (ptrip) da E. coli, seguido pelos sítios derestrição XbaI, EcoRV e BamHI. Estes permitem a clonagemno~ quadro dos fragmentos de DNA codificando para os poli-peptídios de interesse. Este vetor também inclui um ter-minador da transcrição do gene 32 do bateriófago T4 e umgene de resistência à ampicilina como o marcador de sele-ção.
Este procedimento torna possível também a inclu-são do polipeptídio de fusão obtido nas preparações devacina destinadas a serem usadas nos seres humanos; e anatureza do peptídio estabilizador empregado permite ageração de uma resposta imune protetora contra a proteínaexógena ou o peptídio multiepitópico ligado à mesma.
Constitui uma novidade da presente invenção amanipulação genética e o uso de um peptídio estabilizadorhomólogo à parte do domínio de ligação ao ácido lipóicodas diidrolipoamida acetil transferases, para a produçãode proteínas de fusão pela tecnologia do DNA recombinantena E. coli. Particularmente, constituem as novidades dapresente invenção o uso, com o objetivo anterior, de umderivado de peptídio estabilizador dos primeiros 47 ami-noácidos do antígeno P64K do N. meningitidis B:4:PI.15(pedido de Patente europeu Ns 0 474 313 A2) , e um anti-corpo monoclonal que especificamente identifique o esta-bilizador.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1:
O antigeno LpdA do N. meningitidis (P64K, LpdA)é uma proteína de 594 aminoácidos que pertence à famíliadas diidrolipoamida desidrogenases (EC 1.8.1.4) e especi-ficamente, a um novo subgrupo dentro delas, caracterizadopor possuir um domínio de ligação ao ácido lipóico, aná-logo ao presente nas diidrolipoamida acetiltransferases,em sua porção com N terminal (Kruger, N., Oppermann, F.B., Lorenzl, H. e Steinbüchel, A., J. Bacteriol., 176,3614-3630, 1994; Hein, S. e Steinbüchel, A., J. Bacteri-ol., 176, 4394-4408, 1994). A proteína LpdA foi clonada esuperexpressa na E. coli, com a adição de 5 aminoácidos(MLDKR) em sua extremidade com N terminal (pedido de Pa-tente Europeu N^ 0 474 313 A2; Figura 1). Embora as deno-minações LpdA e P64K sejam equivalentes, será usado onome P64K para referir-se à proteína recombinante.
A fim de determinar a imünogenicidade dos dife-rentes fragmentos a partir do dito antigeno e analisar apossibilidade de utilizar o menos imunogênico como opeptídio estabilizador, os epítopos para as células Bpresentes no P64K foram localizados através da avaliaçãoda reatividade de um antiP64k do soro policlonal contraos peptídios sintéticos.
Com este objetivo, a proteína P64K foi purifica-da (pedido de Patente europeu N^ 0 474 313 A2) através decromatografia por hidrofobicidade em Butil-TSK e filtra-ção em gel; e ela foi desnaturada por precipitação comácido tricloroacético (TCA), neutralizando-os com NaOH eequilibrando em tampão de fosfato por cromatografia defiltração em gel. Esta preparação foi usada para imunizar30 camundongos Balb/c por rota subcutânea com doses de 20μg realçadas a 2 μg de hidróxido de alumínio (dia 0), queforam então reforçadas com o mesmo antígeno 7 e 21 diasmais tarde. Os soros foram coletados 28 dias após a pri-meira extração. Os soros obtidos foram combinados, e amistura resultante foi transformada em alíquota e armaze-nada à -20°C.
Ademais, 59 peptídios de 20 aminoácidos (a.a.),cada um cobrindo toda a seqüência da proteína recombinan-te e sobreposto por 10 a.a., foram sintetizados usando umkit comercial para a síntese na fase sólida (MultipinPeptide Synthesis System, Chairon Mimotope Pty, Ltd. ,USA) em formato de placas com 9 6 cavidades e seguindo asinstruções dadas pelo fabricante. Estes foram subseqüen-temente numerados a partir da extremidade com N terminalda proteína. A reatividade do antiP64k do soro contra es-tes peptídios foi determinada usando uma dilução a 1:2000dos mesmos, e o formato do imunoensaio usado era o mesmoque o recomendado pelo fabricante do kit comercial ante-rior.
Os resultados são mostrados na Figura 2, em queos valores de absorbância para cada peptídio são repre-sentados. É evidente que os primeiros 110 aminoácidos(representados pelos peptídios 1 até o 11) formam um seg-mento insatisfatoriamente imunogênico apesar da desnatu-ração do imunógeno, que pode até expor os epitopos críp-ticos. Este segmento inclui essencialmente o domínio deligação ao ácido lipóico e a região espaçadora rica emProlina e Alanina que o ligam ao restante da proteína.Este resultado demonstra que o peptídio estabilizador (oufragmentos derivados do mesmo) pode ser usado vantajosa-mente como peptídios estabilizadores, devido à pequenainfluência que teria sobre a imunogenicidade dos poli-peptídios aos quais é fundido. Esta vantagem é especial-mente importante se o polipeptídio de fusão constituir umcandidato à vacina.
EXEMPLO 2:
A fim de expressar diferentes proteínas heteró-logas na E. coli através de sua fusão ao domínio de liga-ção ao ácido lipóico. do ..antígeno P64K do N. menincritidisB:4:PI. 15, o vetor de expressão pM-83 foi construído, emque a seqüência codificando para um peptídio'estabiliza-dor, derivado dos primeiros 47 aminoácidos da dita prote-ína, foi introduzida (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊN-CIA: 1). Esta seqüência é clonada sob o controle do pro-motor de triptofano da E. coli, incluindo o terminador dobacteriófago T4 como sinal para a terminação da transcri-ção, um gene de resistência à ampicilina como o marcadorde seleção.
Para obter o vetor de expressão PM-83, o peptí-dio estabilizador foi primeiramente amplificado usando aReação em Cadeia por Polimerase (PCR) (Randall, K. ecol., Science, 42394, 487-491, 1988) a partir do plasmi-dio pM-6, o qual carrega a seqüência de nucleotideos co-dificando para o antígeno P64K (pedido de Patente europeuN2 O 474 313 A2, Figura 1). Para este propósito, os pri-mers de oligonucleotideo 1573 e 1575 foram usados, osquais introduzem os sítios de restrição NcoI e XbaI nofragmento de DNA amplificado que correspondem com as ex-tremidades terminais amino e carboxila do estabilizadorcodificado por ele:
NcoI
1573: 5' TTCCATGGTAGATAAAAG 3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃODA SEQÜÊNCIA: 2)
XbaI
1575: 5' TTTCTAGATCCAAAGTAA 3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃODA SEQÜÊNCIA: 3)
A seqüência de aminoácidos codificada pelo esta-bilizador resultante é mostrada na Figura 3 (NÚMERO DEIDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 6). A introdução do sítio derestrição NcoI altera a Leucina 2 pela Valina; e o primer1575 elimina a seqüência ETD (posição 45-47), introduzin-do em seu lugar a seqüência DLE. Nesta forma, a Lisina deligação do ácido lipóico (posição 48) não forma parte doestabilizador, e a vizinhança dela, que é altamente con-servada nestes domínios (Russel, G.C., Guest, J.R., Bio-chim, Biophys. Record, 1076, 225-232, 1991) é alterada.Tudo isto garante a eliminação das possibilidades de li-poilação após a tradução das proteínas de fusão que con-têm estes domínios, e a geração, durante a imunização comestas proteínas, dos auto-anticorpos de especificidadesimilar àqueles presentes nos pacientes de cirrose biliarprimária (Tuaillon, N., André, C., Briand, J.P. e col. ,J. Immunol., 148, 445-450).
0 plasmídio pM-83 foi construído através da clo-nagem deste fragmento (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊN-CIA: 5) anteriormente digerido com Xbal/Ncol no plasmídiopILM-29 (Guillén, G., Loyal, M., Alvarez, A e col., ActaBiotecnológica, 15, 97-106, 1995). 0 plasmídio pILM29contém o gene para a proteína Opc (5c) do N. meningitidisfundida ao um peptídio estabilizador consistente nos pri-meiros 5 8 aminoácidos da IL-2 humana, de modo que talclonagem remove o fragmento da IL-2 e funde a Opc ao es-tabilizador da proteína P64K (Figura 4) . A partir doplasmídio resultante, designado pM-80, o gene de opc foiexcisado usando as enzimas XbaI e BamHI, e em seu lugarfoi clonado um adaptador formado pela hibridização dosoligonucleotídeos 1576 e 1577, que introduzem os sítiosde restrição XbaI, EcoRV e BamHI no extremo 3' do frag-mento estabilizador:
1576 5' C TAGATT T GATAT CAG 3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DASEQÜÊNCIA: 7)
1577 3' TAAACTATAGTCCTAG 5' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DASEQÜÊNCIA: 8)
Este plasmídio foi designado pM-83 (Figura 4). Ainserção de todos os fragmentos de DNA e oligonucleotí-deos, bem como a conservação do quadro de leitura corre-to, foram verificadas pela seqüência de DNA de acordo comSanger, F. e col., (PNAS, USA, 74: 54631977).
EXEMPLO 3:
É importante que o estabilizador não contenharegiões de alta homologia com as proteínas humanas se aproteína de fusão resultante for uma candidata à vacina.A determinação da similaridade do peptídio estabilizadordo pM-83 (EXEMPLO 2) com as proteínas humanas foi efetua-da através de uma busca de homologia nas bases de dadosEMBL Data Library v.38 (Curl, C.M., Fuchs, R., Higgins,D.G. e col., Nucl. Acids Beast. 21, 2967-2971, 1993) dasseqüências de nucleotídeos, e SWISS-PROT v.38 (Bairoch,
A. e Boeckmann, B., Nucl. Acids Beast. 21, 3093-3096,1993) das seqüências de aminoécidos; ambos, versões demarço de 1994. Para esta busca, dois dos programas BLASTforam usados (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W.,Myers, And. W. e Lipman, D.J., J. Mol- Biol., 215:403-410, 1990): BLASTP, que compara uma seqüência de aminoá-cidos contra uma base de seqüências de proteína (nestecaso, SWISS-PROT) e TBLASTN, que compara uma seqüência deaminoácidos contra todas as traduções em ambas as dire-ções e em todos os quadros de leitura de uma base de se-qüência de nucleotídeos, como neste caso, a EMBL Data Li-brary; em ambos os casos foi usada uma matriz de valori-zação PAM120 [Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. e Orcutt,
B.B., em: Dayhoff, M.Or. (of.), Atlas of Protein Sequenceand Structure, 5, supl. 3, 345-352, Natn. Biomed. Beast.Found., Washington, 1978].
O resultado pode ser observado nas Figuras 5 e6, em que as folhas dos resultados respectivos do BLASTPe do TBLASTN são mostradas (as seqüências homólogas dosprocariotos ou eucariotos inferiores foram omitidas paraum melhor entendimento). É óbvio que nenhuma proteína deser humano ou de quaisquer outros mamíferos apresenta assimilaridades significativas com o estabilizador derivadodo P64K; uma vez que as homologias detectadas por ambosos algoritmos (nas piruvato cinases humanas e dos ratos;e na extremidade com C terminal das mucinas humanas e ca-ninas) apresentam uma probabilidade de ocorrência alta-mente casual (como um ponto de comparação, a mesma proba-bilidade, para o caso da diidrolipoamida acetiltransfera-se do Azotobacter vinelandii, é de 3,7 X 10 ) .
De tudo acima mencionado, pode-se concluir que ouso do dito estabilizador nos candidatos à vacina é abso-lutamente certo.
EXEMPLO 4:
A capacidade do presente estabilizador no pM-83de permitir a síntese intracelular em altos níveis e naforma de corpos de inclusão foi avaliada, comparando aexpressão de diversas proteínas fundidas aos primeiros 22ou 58 aminoácidos da Interleucina-2 (IL-2) humana, umpeptídio de fusão .muito usado com esta finalidade, oufundidas aos primeiros 47 a.a. do antígeno P64K modifica-do de acordo com o que é descrito no EXEMPLO 2.
Para este propósito, os genes codificando paraas proteínas da membrana externa do N. meningitidisB: 4:PI.15 PorA e Opc foram clonados nos vetores pFP15(hIL2-58, Patente Européia N^ 416 673 BI) ou pM-83 (P64K-47); e nos vetores pISL31 (hIL2-22, Castellanos-Sierra,L.R., Hardy, E., Ubieta, R., e col., documento submetido)ou pM-83, os genes codificando para um polipeptídio mul-tiepitópico (MEP) que inclui as regiões imunogênicas dediversos isolados do Vírus da Imunodeficiência Humana,HIV. Os plasmídios de expressão resultantes são: pILM-28(IL2-58 PorA; Guillén, G., Alvarez, A., Lionf L., e col.,494-498 em: Conde-González, C.J., Morse, S., Rice, P. ecol. (eds)., Pathobiology and Immunobiology of Neisseria-ceae, Instituto de Salud Pública Nacional, Cuernavaca,México, 1994), pM-82 (P64K-47 PorA; Niebla, O., Alvarez,A., Gonzáleζ, S. e col., 85-86 em: Evans, J.S., Yost, S.e Maiden, M.C.J. e col. (eds.)., Neisseria 94: Procee-dings of the IX International Pathogenic Neisseria Confe-rence, Winchester, Inglaterra, 1994), pILM-29 (IL2-58Opc.; Guillén, G., Leal, M., Alvarez, A. e col., Acta Bio-tecnológica, 15, 97-106, 1995), pM-80 (EXEMPLO 2, Figura4), ρTAB4 (IL2-22 + MEP) e pTAB9 (P64K-47 MEP).
As proteínas TAB4 e TAB9 são polipeptídios mul-tiepitópicos (MEP) que incluem diversas cópias da partecentral da região variável 3 (V3) da proteína gpl20 doHIV-1. Para a construção destes MEP, .15 aminoácidos cen-trais da região V3 dos seguintes isolados foram selecio-nados :
LR150: SRGIRIGPGRAILAT (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 9)JYl: RQSTPIGLGQALYTT (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 10)RF: RKSITKGPGRVIYAT (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 11)MN: RKRIHIGPGRAFYTT (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 12)BRVA: RKRITMGPGRVYYTT (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 13)IIIB: SIRIQRGPGRAFVTI (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 14)
Estas regiões são ligadas por um peptidio espa-çador de cinco aminoácidos, da seqüência AGGGA (NÚMERO DEIDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 17) . Para obter isto, a se-qüência de DNA codificando para os epítopos V3 ligadospelo peptidio espaçador foi obtida por síntese química(NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 21) e foi clonadasob o controle do promotor de triptofano, fundido aosprimeiros 22 aminoácidos da IL-2 humana (Figura 7) . Apartir do plasmídio resultante, designado pTAB3, um frag-mento contendo o gene para o MEP, o promotor de triptofa-no e o terminador T4, foi excisado por digestão com asenzimas ScaI e HindIII, e é clonado no pUC19 (Yanisch-Perron, C. e col., 1985, Gene 33, 103-119) para obter oρTAB4 (Figura 7). Finalmente, o ρTAB9 foi construído eli-minando a seqüência codificando para o estabilizador de-rivado da IL-2 humana por digestão com as enzimas NcoI eXbaI, e clonando, em seu lugar, um fragmento codificandopara os primeiros 47 aminoácidos do antígeno P64K obtidopor reação em cadeia por polimerase (PCR) , conforme édescrito no EXEMPLO 2. A seqüência do MEP resultante émostrada na Figura 8, e sua organização na Figura 9 A.
As cepas hospedeiras de E. coli K-12 usadas paratodos estes plasmídios eram a W3110 (Hill, C.W., e Ha-mish, B. W. Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 7069, 1981; Jen-sen, K.F., J. Bacteriol., 175, 3401-3407, 1993) parapILM-28, pILM-29, pM-80 e pM-82; e a W3110 trpA905, parapTAB4 e pTAB9. A expressão foi obtida em todos os casosinoculando-se uma cultura de 5 ml de meio LB (Sambrook,J., Fritsch, Y. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: ToManual Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989, New York, USA) com ampicilina (Ap) a 50 μς/πιΐ etriptofano (W) a 10 0 μα/πιΐ, que foi cultivada 12 h a37°C. A dita cultura foi usada para inocular uma culturade 5 0 ml de LB-Ap (pTAB4 e pTAB 9) ou um meio definidocomposto pelos sais de M9 (Miller, J.H., Experiments inMolecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1972, New York, USA), glicose a 1%, hidrolisado de caseí-na a 1%, CaCl2 0,1 mM, MgCl2 1 mM e Ap para 5 0 ug/ml(pILM-28, pILM-29, pM-80, pM-82), os quais foram cultiva-dos 12 h para 37°C e 250 r.p.m. Após este tempo, as amos-tras de proteínas totais foram tiradas e analisadas poreletroforese em gel de poliacrilamida desnaturada (SDS-PAGE, Laemmli, 0. K. Nature, 277, 680, 1970s) e tingimen-to com Azul Brilhante de Coomassie R-250. A percentagemde expressão foi analisada em um densitômetro de laserBromma-LKB. Sua posição celular foi determinada por Iisedas células através do tratamento combinado com lisozimae ultra-som, após algo, então, as proteínas solúveis fo-ram separadas das insolúveis por centrifugação. A insolu-bilidade da proteína foi usada como critério para assumirsua expressão como corpos de inclusão, uma vez que outrascondições sob as quais elas possam exibir o dito compor-tamento (associação às membranas ou ao glicano do peptí-dio) são improváveis neste caso.
Um resumo dos resultados pode ser visto na Figu-ra 10 A. Em todos os casos a expressão sob o estabiliza-dor derivado do P64K é comparável à expressão obtidaquando fundido aos peptídios da IL-2 com referência à re-lação da proteína heteróloga: proteína total celular (vera Figura 10 B para o caso do MEP), que confirma a capaci-dade do pM-83 de ser usado como vetor para a expressãodos peptídios de fusão. Não vale nada que estes poli-peptídios sejam muito difíceis de expressar na E. coli seeles não forem fundidos, ou pelo seu pequeno tamanho esensibilidade às proteases do hospedeiro, como o MEP, oupor sua toxicidade no caso da proteína PorA e as porinasbacterianas em geral (Carbonetti, N.H. e Sparling, P.F.;Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 84, 9084-9088). Em todosos casos, o produto foi obtido como corpos de inclusão,conforme é exemplificado para o pTAB9 (Figura 10 C).
Concluindo, é possível descrever em linhas ge-rais que o uso do derivado de estabilizador dos primeiros47 aminoácidos do antígeno P64K de N. meningitidis(P64K-47) resulta em uma eficiência de expressão de pro-teínas heterólogas como corpos de inclusão, comparávelàquela de outros sistemas (pedidos de patentes europeusNs 0 416 673 A2 e N^ 229 998, Hoechst AG; patente euro-péia Ns 0 416 673 BI; Castellanos-Sierra, L.R., Hardy,E., Ubietar R., e col., manuscrito submetido), com o be-nefício adicional para o produto de ser usado diretamente(isto é, sem separá-lo do estabilizador) devido à ausên-cia de homologia significativa com os antígenos de origemhumana.
EXEMPLO 5:
A disponibilidade de um ligante que identifiqueespecificamente o estabilizador (p.ex., um anticorpo, umcofator enzimático, etc.) é uma caracterísitca desejávelem qualquer sistema de expressão de proteínas recombinan-tes. Isto é devido a que o precedente pode permitir, porexemplo, o projeto de planos eficientes de purificaçãopor afinidade se o dito ligante for imobilizado em umaresina cromatográfica; e até - no caso dos anticorpos - oseguimento das etapas intermediárias da purificação atra-vés de técnicas imunológicas, independentemente da iden-tidade da proteína heteróloga expressa.
Um tal objetivo foi obtido imunizando-se camun-dongos com a proteína TAB13 (N^ DE IDENTIFICAÇÃO DA SE-QÜÊNCIA: 20) a fim de obter os anticorpos monoclonais(MAb) contra este estabilizador. A TAB13 é um MEP deriva-do da TAB9 que é diferente da primeira pela presença deduas regiões de consenso V3 adicionais (Figura 9 B):-C6: TSITIGPGQVFYRTG (Ne DE IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 15)-C8: RQRTSIGQGQALYTT (N^ DE IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 16)
Este MEP foi expresso (EXEMPLO 4) e purificado(EXEMPLO 6) em uma forma análoga àquela descrita para aTAB4 e TAB9.Então, os camundongos Balb/c foram imunizadospor rota subcutânea com 3 doses de 20 de TAB13 realça-da em hidróxido de alumínio em um intervalo de 15 dias.
Os animais foram reforçados por rota intraperitoneal com20 μg do mesmo antígeno em tampão de fosfato, 20 diasapós a última dose. Os esplenócitos foram fundidos com omieloma X6 3 Ag8 65 3 e os hibridomas resultantes foramisolados e testados de acordo com os métodos estabeleci-dos (Gavilondo, J.V. (ed.), Monoclonal Antibodies: Theoryand Practical, Elfos Scientiae, 1995, The Havana, Cuba).
A reatividade dos anticorpos secretados peloshibridomas isolados foi avaliada por ELISA, revestindo asplacas com a TAB13 do MEP, a proteína P64K ou os peptí-dios sintéticos representando as diferentes regiões V3presentes na TAB13. No total, 18 clones positivos foramobtidos, um dos quais, designado 448/30/7, identificou aTAB13, bem como o 64K, porém nenhum dos peptídios dagpl20.
A especificidade deste MAb pelo peptídio estabi-lizador do pM-83 e a possibilidade de seu uso para a-de-tecção imunológica das proteínas que o contém, foram de-terminadas por Western blotting, usando diferentes amos-tras, proteínas heterólogas fundidas ao estabilizador de-rivado de P64K (P64K-47), ou a mesma proteína fundida ouaos primeiros 58 aminoácidos da IL-2 (IL2-58). Para efe-tuar isto, a cepa de E. coli MM294 foi transformada(Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., MolecularCloning: To Manual Laboratory, 1989, Cold Spring HarborLaboratory Press, New York, USA) com os seguintes plasmí-dios: pILM-28 (IL2-58 + porA), pM-82 (P64K-47 + porA),pTAB 13 (P64K-47 + MEP) , pM-6 (P64K) e pFP15 (IL-2) . Oplasmídio de expressão pM-134 foi também usado, o qualcontém os primeiros 120 aminoácidos do P64K, que inclui odomínio de ligação ao ácido lipóico sob o controle dosmesmos sinais reguladores que nos plasmídios anteriores.Este segmento foi amplificado por PCR usando o primer157 3 (Ns DE IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 2) e 2192 (N^ DEIDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 4) ; ele foi digerido com asenzimas NcoI e BamHI, e foi clonado no plasmídio pFP15(ver o EXEMPLO 4) digerido identicamente. A expressãodestes transformantes foi obtida nas condições de cultivoespecificadas no EXEMPLO 4 para o ρTAB4 e o ρTAB9.
Os resultados obtidos são representados na Figu-ra 11. Conforme pode ser apreciado, o MAb 448/30/7 iden-tifica um epítopo provavelmente linear dentro do estabi-lizador P64K-47, devido à sua reatividade com as amostrasdos plasmídios pM-6, pM-82, pTAB13 e pM134 apesar de to-das estas proteínas serem antigenicamente diferentes.Esta experiência demonstra que em nenhum caso esta reati-vidade é devida à proteína fundida ao estabilizador(ρ.ex., os plasmídios pILM-28 e pM-82: ambos carregam ogene porA sob estabilizador diferente) o que evidencia aespecificidade de identificação deste MAb.
Conclusão, o sistema de expressão formado peloestabilizador P64K-47, os plasmídios que contêm o mesmo eο MAb 448/30/7 permitem a síntese eficiente, e na formade corpos de inclusão, de uma grande variedade de proteí-nas, e a sua detecção sem a disponibilidade prévia desondas imunológicas contra cada polipeptídio a expressar.
EXEMPLO 6:
A ausência de efeitos deletérios sobre a respos-ta imune contra o polipeptídio fundido ao estabilizador éum fator importante a considerar na seleção de um sistemade expressão para os candidatos à vacina. Uma das vanta-gens do sistema de expressão baseado no estabilizadorP64K-47 é precisamente a sua imunogenicidade diminuída(EXEMPLO 1) , a que garante o precedente. Todavia, a in-fluência do estabilizador P64K-47 na resposta imune con-tra a proteína fundida foi avaliada qualitativamenteatravés da comparação da resposta dos anticorpos ^ contraos diferentes peptídios da região V3 presente na TAB 4(IL2-22) e TAB9 (P64K-47) do MEP.
Para a expressão e a purificação da TAB4 e daTAB9, a biomassa da cepa W3110 trpA905 + ρTAB4 e W3110trpA905 + pTAB9 foi obtida conforme descrito no EXEMPLO4. Esta biomassa foi quebrada, combinando-se o tratamentocom lisozima e com ultra-som em presença de fluoreto defenil metil sulfonila (PMSF) e do detergente não-iônicoTritón-X-100; os corpos de inclusão foram obtidos porcentrifugação diferencial, e os MEP foram parcialmentepurificados e solubilizados por dois ciclos de lavagemsucessivos dos corpos de inclusão com agentes caotróficos("caotrophic") e detergentes (TAB4: 1. Uréia 4 M Tritón-X-IOO a 1%; 2. Uréia 8 Μ. TAB9: 1. Uréia 8 M Tritón-X-100a 1%, 2. cloreto de guanidio 6 M). Os sobrenadantes obti-dos foram finalmente purificados através de um gradientede 20 a 80% de acetonitrilo em uma coluna C4 VYDAC decromatografia líquida com alto desempenho (HPLC), sendoobtida uma pureza de 90% aproximadamente.
As proteínas recombinantes purificadas foram re-alçadas em gel de hidróxido de alumínio usando uma rela-ção de 60 mg de adjuvante por mg de proteína. Estas pre-parações foram usadas para imunizar 5 grupos de coelhos
por rota subcutânea com 200 μg/dose. A resposta imune foiavaliada por ELISA, usando placas de poliestireno de 96cavidades (High binding, Costar, USA), bem revestidas como MEP usado para a imunização, ou com os peptídios cor-respondendo a cada uma das regiões V3 presentes sobreele. Os títulos foram calculados como a diluição máximade cada soro com um valor de absorbância duas vezes maiordo que aquele de uma mistura dos soros pré-imunes. Todosos soros foram analisados em duplicata.
Os valores obtidos (Figura 12) mostram que ostítulos contra as regiões V3 são semelhantes entre o IL2-22 + MEP (TAB4) e o P64K-47 + MEP (TAB9) variados. Emboraa freqüência de identificação dos peptídios seja ligeira-mente maior para a TAB9, esta diferença não é estatisti-camente significativa (p < 0,05). Concluindo, a imunoge-nicidade da proteína heteróloga é afetada pelo estabili-zador P64K-47 em uma forma mínima, e comparável a outrossistemas de expressão atualmente em uso.Descrição das Figuras:
Figura 1: Seqüência de nucleotídeo do gene IpdAcodificando para P64K. É mostrada em itálico a seqüênciaadicionada no plasmidio pM-6 (pedido de Patente europeuNs 0 474 313 A2), ausente originalmente no gene IpdA.
Figura 2: Reatividade do soro policlonal do ca-mundongo contra os peptidios do P64K. Um valor mínimo de0,4 unidade de densidade óptica para considerar o resul-tado como positivo foi escolhido.
Figura 3: Seqüência de aminoácidos do estabili-zador, deduzida da seqüência de DNA amplificada por PCR apartir do plasmidio pM-6. As seqüências sublinhadas cor-respondem aos primers de oligonucleotideo.
Figura 4: Estratégia para a construção do plas-mídio pM-83.
Figura 5: Resultados da busca de homologia entreas seqüências do estabilizador ('Query') e aquelas pre-sentes na base SWISS-PROT ('Sbjct'), usando o programaBLASTP. A entrada correspondente para as proteínas huma-nas ou para as proteínas de mamíferos é somente mostrada.P(N) representa a probabilidade de encontrar N alinhamen-tos iguais dentro de uma base composta de seqüências ale-atórias; o significado da homologia diminui com o valorde P(N). Os resíduos idênticos são representados com seuscódigos de uma letra; as substituições conservadoras comum "+", e as diferenças não são indicadas.
Figura 6: Resultados da busca de homologia entreas seqüências do estabilizador ('Query*) e todas as tra-duções possíveis das seqüências da EMBL Data Library('Sbjct'), usando o programa TBLASTN. A entrada corres-pondente para as proteínas humanas ou proteínas de mamí-feros é somente mostrada. P(N) representa a probabilidadede encontrar N alinhamentos iguais dentro de uma basecomposta de seqüências aleatórias; o significado da horno-logia diminui com o valor de P(N). Os resíduos idênticossão representados com seu código de uma letra; as substi-tuições conservadoras com um "+", e as diferenças não sãoindicadas.
Figura 7: Estratégia para a construção dos plas-mídios ρTAB4 e pTAB9.
Figura 8: Seqüências de nucleotídeos e aminoáci-dos da TAB9 do MEP.
Figura 9: A: Estrutura geral da TAB4 e da TAB9do MEP. B: Estrutura geral da TAB13 do MEP.
Figura 10: Comparação da expressão dos genes po-rA, opc e o MEP sob derivados de estabilizador a partirda IL-2 humana ou a partir dos primeiros 47 aminoácidosdo antígeno P64K.
A: Tabela comparativa. hIL2-58 é referido aosprimeiros 58 aminoácidos da IL-2 humana, hIL2-22 aos pri-meiros 22, e P64K-47 ao derivado de estabilizador a par-tir dos primeiros 47 aminoácidos do antígeno P64K.
B: Análise comparativa por SDS-PAGE da expressãodo MEP nos plasmídios TAB4 e TAB9. Caminho A: Marcadoresde peso molecular; B: Proteínas totais da cepa W3110trpA90 5; C: Proteínas totais de.W3110 trpA90 5 + pTAB4; D:TAB 4 purificada; Ε: Proteínas totais de W3110 trpA905pTAB9; F: TAB9 purificada.
C: Expressão da TAB9 nos corpos de inclusão. A:Proteínas solúveis da amostra. B: Proteínas insolúveis ouda membrana.
Figura 11: Western blotting usando MAb 448/30/7com amostras de proteínas totais de E. coli MM294 trans-formadas com: 1: Controle negativo, 2: pM-6 (P64K) , 3:pM-82 (P64K-47 + porA) , 4: pTABl3 (P64K-47 + MEP) , 5:pFPl5 (IL-2) , 6: pM-134 (P64K-120), 7: pILM-28 (IL2-58 +porA). Os marcadores de peso molecular são indicados naesquerda.
Figura 12: Recíproca do valor do título porELISA dos coelhos imunizados com TAB4 e TAB9. MG: Médiageométrica da recíproca dos títulos anti-V3; R: Percenta-gem de reatividade com os peptídios V3.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 1TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 47 aminoácidosTIPO DE MOLÉCULA: fragmento de proteína
PROPRIEDADES: Primeiros 47 aminoácidos da proteína recombi-nante p64k de N. meningitidis
MLDKRMALVELKVPDIGGHENVDi IAVEVNVGDTIAVDDTLITLETD 44
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 2TIPO DA SEQÜÊNCIA: nucleotídeoCOMPRIMENTO: 29 bases
TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleotídeo sintéticoPROPRIEDADES: Iniciador 5' Ns 1573 para amplificação porPCR dos primeiros 44 aminoácidos do antígeno P64k de N. me-ningitidis.
TTCCATGGTAGATAAAAGAATGGCTTTAG 29
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 3TIPO DA SEQÜÊNCIA: nucleotídeoCOMPRIMENTO: 29 basesTIPO DE MOLÉCULA: oligonucleotídeo sintético
PROPRIEDADES: Iniciador 3' Ns 1575 para amplificação porPCR dos primeiros 44 aminoácidos do antígeno P64k de N. me-ningitidis
TTTCTAGATCCAAAGtAATCAGGGTATCG 29
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 4TIPO DA SEQÜÊNCIA: nucleotídeoCOMPRIMENTO: 2 6 bases
TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleotídeo sintéticoPROPRIEDADES: Iniciador 3' N2 2192 para amplificação porPCR dos primeiros 12 0 aminoácidos do antígeno P64k de N.meningitidis.
GGCGGTTCTGCCGATTAAGGATCCGA
26
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 5TIPO DA SEQÜÊNCIA: nucleotídeoCOMPRIMENTO: 146 pares de base
TIPO DE MOLÉCULA: fragmento amplificado
PROPRIEDADES: Fragmento derivado dos primeiros 47 aminoá-cidos do antígeno P64k de N. meningitidis. Sítios de Res-trição NcoI (posições 3 a 8) e XbaI (posições 139 a 144)
TTCCATGGTAGATAAAAGAATGGCTTTAGTTGAATTGAAAGTGCCCGACATTGGCGGACA 60CGAAAATGTAGATATTATCGCGGTTGAAGTAA ACGTGGGCGACACTATTGCTGTGGACGA 120
TACCCTGATTÁCTTTGGATCTAGAAA146
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 6 'TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 47 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Fragmento estabilizador derivado dosprimeiros 47 aminoácidos do antígeno P64k de N. meningiti-dis
PROPRIEDADES: Este fragmento tem as seguintes modificaçõesem relação ao P64k: L2 v2 -> D45; T46 L46; D47 E47
MVDKRMALVELKVPDIGGHENVDIIAVEVNVGDTIAVDDTLITLDLE
47
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 7TIPO DA SEQÜÊNCIA: nucleotídeoCOMPRIMENTO: 16 bases
TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleotídeo sintético
CTAGATTTGATATCAG
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 8TIPO DA SEQÜÊNCIA: nucleotídeo
16
COMPRIMENTO: 16 bases
TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleotídeo sintético
GATCCTGATATCAAAT
16IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 9TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 15 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: região central do laço V3 da proteínagpl2 0 de HIV-I, isolado LR150
SRGIRIGPGRAILAT 15
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 10TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 15 aminoácidosTIPO DE MOLÉCULA: região central do laço V3 da proteínagpl2 0 de HIV-I, isolado JY-IRQSTPIGLGQALYTT 15
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 11TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 15 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: região central do laço V3 da proteínagpl2 0 de HIV-I, isolado RFRKSITKGPGRVIYAT 15
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 12TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 15 aminoácidos
TIPO DE . MOLÉCULA: região central do laço V3 da proteínagpl2 0 de HIV-I, isolado MNRKRIHIGPGRAFYTT 15
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 13TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 15 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: região central do laço V3 da proteínagpl20 de HIV-I, isolado BRVARKRITMGPG RVYYTT 15IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 14TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 15 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: região central do laço V3 da proteínagpl20 de HIV-I, isolado IIIB
SIRIQRGPGRAFVTI 15
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 15TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 15 aminoácidosTIPO DE MOLÉCULA: Seqüência de consenso da região centraldo laço V3 da proteína gpl2 0 de isolados de HIV-I, posição
7 dentro de MEP TABl3TSITIGPGQVFYRTG 15IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 16
TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 15 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: Seqüência de consenso da região centraldo laço V3 da proteína gpl2 0 de isolados de HIV-I, posição
8 dentro de MEP TABl3RQRTSIGQGQALYTT 15
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 17TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 5 aminoácidos
TIPO DE MOLÉCULA: ligante flexível que divide os epítoposV3 em MEP TAB3, TAB4, TAB9 e TAB13AGGGA 5
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 18TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 141 aminoácidosTIPO DE MOLÉCULA: polipeptídeo muitiepitópico (MEP) TAB4MAPTSSSTAQTQLQLEHLLLDLQIFLSRGIRIGPGRAILATAGGGARQSTPIGLGGALYT 60TAGGGARKSITKGPGRVfYATAGGGARKRIHIGPGRAFYTTAGGGARKRITMGPGRVYYT 120
TAGGGASIRIQRGPGRAFVTI 141
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 19TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 162 aminoácidosTIPO DE MOLÉCULA: polipeptídeo multiepitópico (MEP) TAB9
MVDKRMALVELKVPDIGGHENVDIIAVEVNVGDTIAVDDTLITLDLDSRGIRÍGPGRAIL 60ATAGGGARQSTPIGLGGALYTTAGGGARKSITKGPGRVIYATAGGGARKRIHIGPGRAFY 120TTAGGGARKRITMGPGRVYYTTAGGGASIRIQRGPGRAFVTi 162
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 2 0TIPO DA SEQÜÊNCIA: aminoácidoCOMPRIMENTO: 202 aminoácidosTIPO DE MOLÉCULA: polipeptídeo multiepitópico (MEP) TAB13
IVIVDKRMALVELKVPDIGGNENVDIiAVEVNVGDTIAVDDTLITLDLDSRGIRIGPGRAIL 60ATAGGGAROSTPlfeLGOALYTTAGGGARKSnKGPGRVIYATAGGGARKRIHJGPGRAFY 120TTAGGGARKRITMGPGRVYYTTAGGGARORTSIGOGOALYTTAGGGATSmGPGOVFYR 180TGAGGGASIRIQRGPGRAFVTI 202
IDENTIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA: 21TIPO DA SEQÜÊNCIA: nucleotídeoCOMPRIMENTO: 3 68 pares de baseTIPO DE MOLÉCULA: Fragmento de nucleotídeo que codifica pa-ra os epítopos V3 ligado por um espaçador AGGGA em MEPTAB9. Sítios de Restrição XbaI (posições 1 a 6) e BamHI(posição 368) são introduzidos
TCTAGACTCGAGAGGCATTCGTATCGGCCCAGGTCGCGCAATTTTAGCAACAGCTGGCGG 60TGGCGCÁCGTGAATCTACCCCTATTGGTTTAGGTCAGGCTCTGTATACGACTGCCGGCGG 120TGGTGCGCGCAAAAGTATCACCAAGGGTCCAGGCCGCGTCATTTACGCCACCGCGGGCGG 180CGGTGCCCGTAAGCGTATCCACATTGGCCCAGGCCGTGCATTCTATACTACAGCAGGTGG 240TGGCGCACGTAAACGCATCACTATGGGTCCTGGTCGCGTGTATTACACGACCGCTGGCGG 300CGGTGCTAGCATTCGCATCGAACGCGGCCCTGGTCGTGCATTTGTGACCATATGATAACG 360CGGGATCC 368
Claims (7)
1. Proteína de fusão a qual contém um peptídioestabilizador fundido a uma proteína heteróloga de inte-resse, o dito peptídio estabilizador sendo derivado dosprimeiros 47 aminoácidos da extremidade N terminal do an-tígeno P64K de Neisseria meninaitidis, caracterizada pelofato de que apresenta a seqüência (SEQ ID NO: 6):MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE
2. Proteína de fusão de acordo com a reivindica-ção 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de inte-resse é uma proteína de membrana externa de Neisseria me-ninqitidis.
3. Proteína de fusão de acordo com a reivindica-ção 2, caracterizada pelo fato de que a proteína de inte-resse é a proteína de membrana externa Opc(5c) ou a pro-teína de membrana externa PorA de Neisseria meningitidis.
4. Proteína de fusão de acordo com a reivindica-ção 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de inte-resse é um polipeptídio multiepitópico que inclui diver-sas cópias da parte central da região variável 3 (V3) daproteína gp 12 0 do HIV-I, correspondendo às seqüências dopolipeptídio multiepitópico TAB4 (SEQ ID NO. 18) ou TAB9(SEQ ID NO 19).
5. Vetor de expressão de proteínas de fusão emE. coli que contém uma seqüência codificando para um pep-tídio estabilizador sob o controle do promotor de tripto-fano da E. coli seguido pelos sítios de restrição XbaI,EcoRV e BamHI para a clonagem no quadro dos fragmentos deDNA codificando para os polipeptídios de interesse e oterminador do fago T4 como o sinal de terminação datranscrição, bem como o gene de resistência à ampicilinacomo o marcador de seleção, sendo derivado dos primeiros- 47 aminoácidos da extremidade com N terminal do antígenoP64K de Neisseria meninqitidis, caracterizado pelo fatode que compreende a seqüência (SEQ ID NO: 6):- 10 20 30 40 47MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE
6. Cepa recombinante de E. coli que compreendeum vetor de expressão, como definido na reivindicação 5,que produz uma proteína de fusão contendo um peptídio es-tabilizador fundido a uma proteína de interesse, o ditopeptídio estabilizador sendo derivado dos primeiros 47aminoácidos da extremidade N terminal do antígeno P64K deNeisseria meninqitidis, caracterizada pelo fato de queapresenta a seqüência (SEQ ID NO: 6):- 10 20 30 40 47MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLEsendo que a proteína de interesse é a proteína de membra-na externa Opc(5c), ou a proteína de membrana externa Po-rA de Neisseria meninqitidis ou um polipeptídio multiepi-tópico que inclui diversas cópias da parte central da re-gião variável 3 (V3) da proteína gp 120 do HIV-I, corres-pondendo às seqüências do polipeptídio multiepitópicoTAB4 (SEQ ID NO. 18) ou TAB9 (SEQ ID NO 19).
7. Composição de vacina, caracterizada pelo fatode compreender uma proteína de fusão, como definida emqualquer uma das reivindicações 1 a 4, bem como um adju-vante adequado.
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| B22O | Other matters related to patents and certificates of addition of invention: legal action concerning patent |
Free format text: INPI-52400.061162/2013 ORIGEM: JUIZO DA 013A VARA FEDERAL DO RIO DE JANEIRO PROCESSO NO 0132252-414.2013.4.02.5101 ACAO DE NULIDADE DAS PATENTES SUBMETIDAS AO MAILBOX (ART. 229, PARAGRAFO UNICO DA LPI); ALTERNATIVAMENTE, A DECRETACAO DA NULIDADE PARCIAL PARA CORRECAO DO PRAZO DE VIGENCIA; SUBSIDIARIAMENTE, CASO SE ENTENDA NAO SER O CASO DE NULIDADE, A CORRECAO DO ATO ADMINISTRATIVO PARA ADEQUACAO DA VIGENCIA DAS PATENTES. AUTOR: INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL - INPI REU: ASTELLAS PHARMA INC., AVENTIS PHARMA S.A, BIOCREA GMBH, BRACCO S.P.A, CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA |
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| B24H | Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi) |
Free format text: EXTINCAO DEFINITIVA - ART. 78 INCISO IV DA LPI |
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| B24F | Patent annual fee: publication cancelled |
Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 24.8 NA RPI NO 2234 DE 29/10/2013 POR TER SIDO INDEVIDA. |
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| B21F | Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time |
Free format text: REFERENTE A 14A, 15A, 16A, 17A, 18A, 19A E 20A RETRIBUICAO ANUAL. |