WO1998023754A1 - Procedimiento para la expresion de genes de los virus del dengue - Google Patents
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Abstract
La presente invención se relaciona con la rama de la biotecnología y con las técnicas de ADN recombinante y en particular con un procedimiento para la expresión del gen que codifica para la proteína de la envoltura de los virus del dengue serotipos 2 y 4 en levaduras metilotróficas del género Pichia. El objetivo es obtener un inmunógeno para vacunación en humanos. Para el virus dengue serotipo 2 se partió de la secuencia génica que codifica para la proteína E del virus, a partir de la cepa A 15 aislada durante la epidemia de fiebre del dengue y dengue hemorrágico ocurrida en Cuba en el año 1981. En el caso del virus dengue serotipo 4 se partió de la secuencia génica que codifica para la proteína E del virus, a partir de la cepa 814669 aislada durante la epidemia de fiebre del dengue ocurrida en Dominica en el año 1981.
Description
PROCEDIMIENTO PARA LA EXPRESIÓN DE GENES DE LOS VIRUS DEL
DENGUE .
Sector Técnico
La presente invención se relaciona con la rama de la biotecnología y con las técnicas de ADN recombinante y en particular con un procedimiento para la expresión eficiente del gen que codifica para la proteina de la envoltura del virus dengue serotipo 2 y serotipo 4 en levaduras metilotróficas recombinantes del género Pichia. Técnica anterior
El problema de obtener el agregado correcto de la proteina de la envoltura del virus dengue es la gran preocupación en el desarrollo de vacunas recombinantes para este virus y es el sistema de expresión empleado quien en primera instancia lleva el peso mayor de este problema (Masón P W, Me Ada P C, Dalrymple J M, Fournier M J y Masón T L. Expression of Japanese Encephalitis virus antigens in Escherichia coli. Virology 1987; 158: 361). Con este objetivo, se han utilizado diversos sistemas de expresión para producir las distintas proteínas recombinantes de este Flavivirus . Entre estas proteínas se encuentran tanto proteínas estructurales como no estructurales tales como C- prM-E-NSl-NS2A-NS2B (Tolou H, Pisano M R, Deubel V y Nicole J. Problémes et perspectives en matiére de vaccination contre les Flavivirus. bull Inst. Pasteur 1992; 90: 11-29, Zhang Y M, Hayes E P, Me Carthy T C y col. Immunization of mice ith dengue structural protein y nonstructural protein NS1 expressed by baculovirus recombinant induces resistance to dengue virus encephalitis. J Virol 1988; 62:3027-3031) . Para la elección del sistema apropiado, se tienen en cuenta factores como las posibilidades que ofrece el mismo en la expresión y procesamiento del producto recombinante, como modificaciones post-traduccionales : glicosilación,
proteólisis, secreción al medio, capacidad de preservar estructuras secundarias entre otras, con el objetivo de obtener un producto lo más similar posible al nativo. Es muy importante también considerar los porcientos de producción del antigeno que ofrece el sistema en términos de rendimiento .
Las bacterias constituyeron el primer sistema de expresión utilizado en la expresión de proteínas de Flavivirus recombinantes, utilizando a Escherichia coli. La expresión de dichas proteínas resulta fácil y se alcanzan altos rendimientos (10-20% de la proteina total celular), no obstante este sistema de expresión tiene algunas limitaciones . El problema principal radica en que muchas proteínas recombinantes son acumuladas en forma inactiva e insoluble formando cuerpos de inclusión. Resultan costosas y sofisticadas las técnicas necesarias para la desnaturalización y reensamblaje de tales proteínas, que permitan su recobrado en la forma activa (Marston FAO . The purification of eukaryotic polypeptides expressed in E.coli. Biochemical Journal 1986; 240: 1-12). Otra dificultad se encuentra cuyo al expresar polipéptidos de pequeña talla, estos son generalmente degradados rápidamente y solo pueden ser producidos como proteínas de fusión, siendo necesario su posterior clivaje "in vitro" que incluye otra ronda de purificación (Itakura y cois . 1978). Sin embargo la principal limitación que presenta este sistema radica en su incapacidad de realizar el procesamiento post-traduccional del producto recombinante. No obstante, algunas proteínas expresadas mostraron epitopos que indujeron anticuerpos (Acs) neutralizantes, aunque se reconoce su poca utilidad como inmunógenos comparados con otros sistemas de expresión (Masón P W, Zogel M V, Semproni A R, Fournier M J y Masón T L. The antigenic structure of dengue type 1 virus envelope y NS1
protein expressed in Escherichia coli.J Gen Virol 1990; 71: 2107-2114) .
Las células de insectos constituyen un sistema de expresión efectivo en la obtención de altos niveles de expresión de diversos genes de origen viral (incluyendo aquellos que requieren procesamiento proteolitico, glicosilación o secreción) . Este sistema utiliza el virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) (Feighny R, Burrous J y Putnak R. Dengue type-2 envelope protein made using recombinant baculovirus protects mice against virus challenge. Am J Trop Med Hyg; 1994: 50 (3): 322-328). Proteínas recombinantes obtenidas muestran similitud en talla, estado de glicosilación y antigenicidad respecto a las proteínas auténticas y ratones inmunizados con ellas desarrollaron Acs neutralizantes (Matswra Y, Miyamoto M, Soto T y col. Characterization of Japanese Encephalitis Virus Envelope Protein Expresed by Recombinant Baculoviruses . Virology 1989; 173: 674-682) . El nivel de protección en ratones depende de la dosis de antigeno (Ag) recombinante con que se inmunizó, pero no siempre las proteínas recombinantes con auténtica antigenicidad y presencia de epitopos protectores proveen protección contra la infección viral cuyo son usados como inmunógenos (Shiu SY , Reid HW y Gould EA. Louping ill virus envelope protein expressed by a recombinant baculovirus y Vaccinia virus fails to stimulate protective immunity. Virus Res 1992; 26: 213) .
Estudios con baculovirus recombinantes a DI (E) y virus de la encefalitis japonesa (VEJ-E) muestran una correlación positiva entre la presencia de Acs neutralizantes contra el virus y la protección (Me Cown J, Cochnam M y Putnak R. Protection of mice against lethal Japanese encephalitis with a recombinant baculovirus vaccine . Am J Trop Med Hyg 1990; 42: 491-499). Este sistema de expresión es prometedor para la producción de vacunas de subunidad debido a que utiliza virus
de insectos que no son patógenos para el hombre y tiene la capacidad de realizar un correcto procesamiento de las proteínas eucarióticas .
Los sistemas de expresión que utilizan células de mamíferos tienen además la ventaja de amplificar el producto génico foráneo durante la infección, incrementando la exposición del Ag . De esta forma se han utilizado construcciones genéticas en adenovirus, herpesvirus y poxvirus como cyidatos a vacunas, teniendo en cuenta siempre el gran potencial de oncogenicidad que ellos encierran (Green M. Transformation y oncogenesis : DNA viruses. En : Virology Ed. Field, B.N, Raven Press, New York 1985: 183). El virus Vaccinia (VV) ha sido la elección ideal, por sus características biológicas definidas y su uso exitoso a lo largo de la historia como inmunógeno. Al igual que Baculovirus las proteínas expresadas utilizando el VV son altamente inmunógenas (Behbehami AM. The smallpox story: Lite y death of a disease. Microbiol. Rev. 1983; 47: 455) . No obstante, para el caso especifico del dengue la expresión de proteínas en VV no ha dado los resultados esperados, ya que se ha obtenido un alto titulo de anticuerpos contra las proteínas del VV pero no para las proteínas del dengue. Otra dificultad de este sistema es que no produce cantidades suficientes de proteínas como para lograr un eficiente proceso de purificación (Zhao B, Prince G, Horswood R, Eckels K, Suramer P, Chanock R, Lai C-J. Expression of dengue virus structural proteins y nonstructural protein by a recombinant Vaccinia virus. J Virology 1987; 61:4019-4022) Otros sistemas de expresión ofrecen amplia potencialidad para su uso como vacunas . Metodologías avanzadas como el uso de partículas tipo virus, que pueden actuar como portadores de epitopos antigénicos de Flavivirus tienen amplia perspectiva, ejemplo de ello es el uso de partículas defectivas del poliovirus, el Ag de superficie y el Ag core
del virus de la hepatitis B (Belyaev y cois . 1992) . Igualmente se plantea la posibilidad de la utilización de la cepa atenuada de Mycobacterium bovis que no es más que el Bacillus Calmatte-Guérin (BCG) , usado como inmunógeno contra la tuberculosis, sistema probado exitosamente en la expresión de proteínas del virus de la inmunodeficiencia humana (Aldovini A y Young R A. Humoral y all mediated immune responses to live recombinant BCG-HIV vaccines . Nature 1991; 351: 479.) . El uso de las plantas transgénicas para la producción de vacunas de bajo costo constituye una perspectiva no distante si se tiene en cuenta que proteínas del virus de la hepatitis B y el virus de la enfermedad de manos y pies han sido expresadas en estos sistemas (Masón H S, Lam D M y Arntzen C J. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants. Proc Nati Acad Sci USA 1992; 89: 11745, Usha R, Rohll JB, Spall VE y col. Expression of an animal virus antigenic site on the surface of plant virus partióle. Virology 1993; 197: 366) .No obstante, este sistema se encuentra en un estado de incipiente desarrollo y la falta de conocimientos de los procesos básicos que operan en este sistema no lo hacen, en el momento actual, el sistema de elección para la expresión de proteínas con fines inmunogénicos en humanos. Divulgación de la invención El objetivo técnico de la misma consiste en lograr un sistema para la expresión eficiente del gen que codifica para la proteina de la envoltura del virus dengue serotipo 2 y 4, con el propósito de obtener un inmunógeno para vacunación en humanos, empleándose como hospedero un mutante auxotrófico his3 de la cepa BKM-90 de Pichia pastoris , el cual se denominó MP-36 (Pub.No.EP-A 438200) .
La novedad de la presente invención radica en la utilización de la levadura Pichia pastoris como sistema para la expresión de la proteina E del virus D2 y D4. Este sistema tiene
determinadas ventajas con relación a sistemas de tipo procariotas. Entre estas ventajas se pueden citar la capacidad de crecer a altas densidades y por tanto de adaptar sus cultivos a sistemas continuos (Pub. No. US 4414329, asignada a la Phillips Petroleum Co.) . Además las levaduras pueden excretar las proteínas al medio de cultivo en cantidades considerablemente superiores en comparación con E. coli y los medios de cultivos empleados para fermentaciones de levaduras generalmente son más económicos que los que son empleados en bacterias (Lemoine Y. "Heterologous Expression in Yeast", 8th International Biotechnology Symposium, Paris, July 17-22, 1988) . Por otra parte estos sistemas pueden llevar a cabo modificaciones post-traduccionales como la glicosilación que está ausente en los sistemas bacterianos (Fiers . "Engineering Maximal Expression of Heterologous Genes in Microorganisms" , 8th International Biotechnology Symposium, Oaris, July 1988; 17-22) y además pueden exhibir determinadas preferencias por los codones utilizados por células de organismos superiores, lo que conlleva a una mayor expresión de genes provenientes de mamíferos (Kigsman S M y col. Heterologous Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 1990; (3) Ed Russell G.E.) En los últimos años las levaduras metilotróficas, y dentro de estas específicamente Pichia pastoris, ha sido utilizada exitosamente para el clonaje y expresión de genes heterológos (Solicitud de Patente de la Phillips Petroleum Co . , Australia No.581107), lo que la convierte en un hospedero atractivo por un conjunto de características ventajosas sobre la tradicionalmente empleada para estos fines Saccharomyces cerevisiae . Entre estas ventajas se encuentran la capacidad de crecer a muy altas densidades celulares y de utilizar como sustrato para la inducción de los genes clonados, una fuente de carbono barata obtenida como material de desecho como es
el caso del metanol . Por otra parte, el sistema de expresión génica de P. pastoris es más fuertemente regulable comparado con los sistemas de expresión descritos para Saccharomyces, lo cual es ventajoso para la obtención de productos que pueden causar efectos deletéreos en los hospederos que los producen
Para el virus dengue serotipo 2 se partió de la secuencia génica que codifica para la proteina E del virus, a partir de la cepa A 15 aislada durante la epidemia de fiebre del dengue y dengue hemorrágico ocurrida en Cuba en el año 1981. Esta secuencia fue empleada para la construcción del vector de expresión en levaduras, para el cual se utilizó el plasmidio pNAO-407, el promotor para la transcripción del gen de la enzima Alcohol Oxidasa 1 (AOX) de la levadura P. pastoris, el terminador de la transcripción del gen de la enzima Gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa (GAP-T) de S . cerevisiae, el marcador de selección HIS-3 que le confiere a la levadura la capacidad de crecer en un medio mínimo deficiente en el aminoácido histidina, asi como la señal 3" AOX de la levadura P. pastoris . Este plasmidio es una modificación del plasmidio pTAO-10 reportado anteriormente (Solicitud de Patente Europea EP 480525A2)
El primer paso seguido para la utilización de dicho plasmidio pNAO-407 fue su digestión con las enzimas Ncol y EcoRI y luego se purificó por el método de LGT, separándose de la banda de 0.678 Kb codificante para el antigeno de superficie del virus de la Hepatitis B.
A continuación los extremos fueron tratados con la enzima de modificación Klenow para rellenar sus extremos y convertirlos en romos, para facilitar el clonaje de la banda de PCR. Finalmente se procedió a su desfosforilación con la enzima fosfatasa alcalina (CIP) .
Una vez purificado el plasmidio se procedió a la reacción de ligazón del plasmidio pNAO/407 NcoI/EcoRI/LGT/Klenow/CIP con
la banda de PCR purificada en presencia de la enzima T4 ADN ligasa .
El producto de la ligazón fue transformado en células de E . Coli , cepa K-12/XL-1 Blue, las que posteriormente fueron plaqueadas sobre medio LB con ampicillin y el pesquisaje de los recombinantes se realizó por el método de hibridación de colonias. Los clones positivos fueron seleccionados para su análisis por chequeo de restricción, utilizándose para ello la banda de 1.485 Kb correspondiente a la proteina E. De esta forma se obtuvo el plasmidio pDE2-21.
Se procedió a la electroporación de las células hospederas de P. pastoris, y los recombinantes posteriormente fueron seleccionados por crecimiento en medio mínimo. Una vez caracterizados los clones se escogió el clon 14 (YDE221-14) para los estudios de expresión. La producción de la proteina E del virus D2 por este clon se evidenció mediante ELISA y técnicas inmunológicas como Dot-ELISA y estern-Blot . En el caso del virus Dengue serotipo 4 se partió de la secuencia génica que codifica para la proteina E del virus, a partir de la cepa 814669 aislada en Dominica durante la epidemia de fiebre del dengue ocurrida en el año 1981 y gentilmente donada por el Dr . Robert Shope de Yale University, USA, el 24 de Noviembre de 1992. Mediante PCR, se realizó la amplificación de 1202pb correspondientes a la envoltura del dengue 4 truncada en sus últimos 53 aminoácidos la que se utilizó en el clonaje en un vector de expresión en levaduras (pFAO) . Este vector es esencialmente igual al vector pPS-7 reportado anteriormente
(Pub.No. EP-A 438200) pero con la señal de secreción del alfa factor de Saccharomyces cerevisiae. De esta forma se creó el plasmidio pDFE4-47.
Luego de obtener este plasmidio todo el procedimiento se desarrolló esencialmente como se ha descrito para el dengue 2. Luego de la electroporación y caracterización se eligió el
clon 61 para su fermentación, obteniendo de esta forma el clon de levaduras YDE447-61.
Luego del testaje se determinó la presencia de las 2 proteínas en los sobrenadantes de la ruptura celular y en menor cantidad se detectó la proteina de la E de dengue 4 en el sobrenadante de cultivo. De esta forma se puede plantear que las dos proteínas se obtienen fundamentalmente de forma no soluble y que la de dengue 4 se obtiene también de forma libre en el medio de cultivo como una proteina de secreción pero en menor cuantía.
Los estudios cuantitativos demostraron que ambas proteínas se obtienen entre un 1% y un 2% de la proteina total de la célula . De esta forma se puede decir que las construcciones genéticas objeto de esta patente son funcionales.
Para la construcción del vector de expresión en levaduras, que contiene el gen de la envoltura truncada del virus serotipo 2 se partió del vector de expresión pDE2-21 descrito anteriormente . Esta modificación consistió en cortar el gen en la posición 1407 utilizo para ello un sitio EcoRI que se encontraba en esa posición. Luego los extremos fueron rellenados con la enzima Klenow y por último fueron ligados con la enzima T4 ligasa. El producto de la ligazón fue transformado en células de E. coli, cepa K-12/XL-1 Blue (Bullok WO, Fernández TM, Shote JM. XL-blues a high efficiency plasmid transforming rec A Echerichia coli strain with Beta-galactosidase selection. Biothec 1987; 5:376-379). Los clones que resultaron positivos por este procedimiento se seleccionaron para verificar la secuencia nucleotidica de la región luego de la modificación. Para ello se utilizó un kit comercial (Sequenase Versión 2.0 ADN Sequencing Kit, USB, USA) .
Una vez establecida la secuencia de la región modificada se verificó la deleción del sitio EcoRI, asi como la incorporación de un codón de parada TTA en la posición 1407 del gen, por lo que la envoltura quedó truncada en 79 pares de base y por tanto en sus últimos 27 aminoácidos. De esta forma quedó constituido el plasmidio pDE2-2lΔEcoRI-7 , el cual se purificó de forma masiva y se almacenó para su posterior utilización . Posteriormente 10 ug de este plasmidio fueron digeridos con 10 u de la enzima EcoRV para obtener la banda de la envoltura completa, pero truncada funcionalmente como se describió. Luego de purificar este fragmento por el método de LGT sé clonó en el vector para la expresión en levaduras pPS-7 de 8.5 Kb (Solicitud de Patente Europea EP 438200) y que contiene el promotor del gen de la enzima Alcohol Oxidasa 1 (AOX) de la levadura P. pastoris seguido de la señal de secreción de S . cerevisiae para la Sucrosa invertasa (SucII), el Terminador de la transcripción del gen de la enzima Gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa (GAP-T) de S . cerevisiae, el marcador de selección HIS-3.
Para la realización de este clonaje, 10 ug del pPS-7 fueron digeridos durante 1 hora a 37 °C con la enzima de restricción Ncol (Promega) y a continuación sus extremos modificados con la enzima Mung-Bean nucleasa. Posteriormente se tomaron 5 ug del pPS-7/NcoI y se incubaron durante una hora a 25 °C con 10 u de enzimas por 1.14 pmol de extremos 5' . Una vez modificados los extremos se procedió a la desfosforilación de los mismos utilizo la enzima fosfatasa alcalina (CIP) . A continuación se tomaron 100 ng del pPS-7/NcoI/MB/CIP y se pusieron a incubar con 30 ng de la banda EcoRV procedente del pDE2-21ΔEcoRI-7 en presencia de la enzima T4 ADN ligasa.
El producto de la ligazón fue transformado en células de E. coli, cepa K-12/XL-1 Blue (Bullok WO, Fernández TM, Shote JM. XL-blues a high efficiency plasmid transforming rec A Echerichia coli strain with Beta-galactosidase selection. Biothec 1987; 5:376-379). A los clones que resultaron positivos se le extrajo el ADN por el método de minialcalinos (Guilles, 1989) y se les realizó un análisis de restricción con la enzima EcoRI para determinar los clones con la orientación correcta de la banda. Una vez seleccionados los clones adecuados, se procedió a la secuenciación del extremo 5' de la banda de la Envoltura en la región de unión al extremo 3' del SucII.
De esta forma quedó constituido el plasmidio pDSE2-34, el cual se purificó de forma masiva y se almacenó para su posterior utilización en la electroporación de las levaduras. El proceso de electroporación se realizó esencialmente según Martínez y col.1993 (Martínez E, García C y Morales-Grillo J. Rapid transformation of non Sacharomyces yeast by electroporation. Biotech Techn 1993; 7: 895-896). Una vez seleccionados y caracterizados los clones de levadura estos fueron denominados YDSE234-1 , 2, 3, 4 y posteriormente utilizados para los estudios de expresión.
La expresión de la proteina recombinante fue demostrada mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA) especifico. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN. Ejemplo 1:
Todas las manipulaciones del material genético de no señalarse referencia especifica fueron realizadas de acuerdo a Sambrook y cois . 1989 (Sa brook J, Frissch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2 nd. Edition. New York, Cold Spring Harbord Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989) .
Para el aislamiento del gen a expresar se utilizó la cepa A 15 (aislada en ratón lactante inoculado intracerebralmente con suero de un paciente con Fiebre del dengue tomado durante la fase aguda de la enfermedad) durante la epidemia de fiebre del dengue y dengue hemorrágico ocurrida en Cuba en el año 1981 (Kouri G, Mas P, Guzman MG, Soler M, Goyenechea A, Morier L. Dengue hemorrhagic fever in Cuba, 1981. Rapid diagnosis of the etiologic agent . Bull Pan Am Health Organ 1982; 93: 414-420). Parte de la secuencia nucleotidica del gen que codifica para la proteina E de esta cepa ha sido publicado recientemente (Guzmán MG, Rosario D, Marrero M, Pelegrino J, Sariol C, Kouri G. Partial nucleotide y amino acid sequence of the envelope gene junction of four dengue 2 strains isolated during the 1981 DHF/DSS Cuban epidemic. Am J Trop. Med. Hyg 1995; 52 (3) : 45-50) . La misma con 4 pases en cerebro de ratón, fue propagada una vez en AP61 (Aedes pseudoscutellaris) a una m=l-5 UFP\ml en medio L-15 hasta que las células mostraron un efecto citopático de 2 o 3 cruces y una inmunofluorescencia especifica frente a liquido ascitico hiperinmune a dengue 2 de mas del 50% de las células.
El RNA de las células infectadas fue extraído según se ha descrito por otros autores (Deubel V, Laille M, Hugnot J, Chungue E, Gueston J, Drovet MT, Bassot S, Chevrier D. Identification of Dengue sequences by genomic amplification : rapid diagnosis of Dengue virus serotypes in peripheral blood. J. Virol. Methods 1990; 30: 41-54). Brevemente, las células fueron lavadas en buffer TNE y Usadas en TNE 0. lx conteniendo 0.5% de NP40 y deoxicolato de sodio al 0.5% a 4 C. Los núcleos celulares fueron peleteados a 2000 rpm\min durante 10 minutos y el extracto citoplasmático fue desproteinizado con 2 tratamientos de fenol en presencia de 1% de SDS . El RNA fue precipitado con etanol y acetato de amonio .
Para llevar a cabo la síntesis del cADN se tomaron 10 ul de RNA (aproximadamente 100 ng) , se le adicionaron 32 ng de iniciador y se desnaturalizó por 2 minutos a 95°C colocándolo rápidamente en hielo por no más de 1 minuto. Posteriormente es añadida la mezcla formada por dNTP 5 mM (luí) buffer RT 10X (2 ul) , RNAsin 40 unidades (1 ul), Reverso Transcriptasa 12 unidades (1 ul) y H20 bidestilada estéril hasta completar un volumen total de 20 ul dejándolo 1 hora a 42°C. La secuencia antigenómica del iniciador utilizado para obtener el cADN es:
2421 5' GGCCTGCTCCATAGCTCCC 3' 2403
Para la amplificación del cADN, ésta se realizó según Saiki y cois 1988 (Saiki PK, Grify DH, Stoffel S, Scharf SJ, y col Primers-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polimerasa. Science 1988; 239: 487-491) .
Para el PCR se usaron 5ul del cADN producido y se llevo a un volumen final de 50 ul, conteniendo buffer de la enzima TAQ pol 10X (5 ul) , dNTP 5 mM ( 5 ul), 320 ng de cada uno de los iniciadores (+\-) y H20 bidestilada estéril. La secuencia de los iniciadores utilizados es la siguiente:
Iniciador positivo: 928 5 TCAGATATCATGCGTTGCATAGGAATATC 3^ 956.
Iniciador negativo: 2432 5^ CAGATATCTTAAGCCTGCACCATAGCTCCC 3^ 2403 En cada uno de ellos se incluyó un sitio de corte para la enzima de restricción (ER) EcoRV (GATATC) , en el positivo se incluyó un codón de iniciación o ATG, y en el negativo un codón de parada o TTA. Los números flanqueando a cada iniciador se corresponden con la posición en la secuencia nucleotidica de acuerdo a resultados publicados previamente (Deubel V, Kinney RM, Trent DW. Nucleotide sequence y deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: comparative analysis of the full-length genome . Virology 1988; 165:234-244). La secuencia
amplificada consta de 1485 pares de bases (pb) y se corresponde exactamente con la secuencia del gen de la envoltura excepto por las modificaciones incluidas en los iniciadores y descritas anteriormente. Se realizó una desnaturalización de los híbridos RNA-cADN a 95°C por 5 minutos y posteriormente se añadieron 2.5 unidades de TAQ polimerasa (Bohering Mamnhein) y la reacción se mantuvo a 72°C por 45 segundos. La amplificación se logró en 30 ciclos de: desnaturalización (95°C, 45 segundos), hibridación (55°C 90 segundos) y extensión (72°C 45 segundos) . Después del último ciclo se mantuvo a 72°C durante 10 minutos.
Para el testaje del PCR: Se tomaron 5 μL de cada mezcla de reacción, 4 μL de H20 y 4 μL de colorante y se aplicaron en un gel de agarosa al 0.8% en buffer TBE teñido con 2 μL de Bromuro de Etidium (10 mg/mL) para su visualización . Como marcador de peso molecular se utilizó el ADN del fago λ digerido con la enzima Hind III. El producto de la amplificación fue tratado con la enzima proteinasa K en un volumen de 100 μL, con el objetivo de eliminar los restos de la enzima Taq Pol, utilizada previamente para el PCR. Posteriormente se trató con fenol/cloroformo y se realizó una precipitación etanólica durante una noche a -70 °C . Luego se centrifugó (Hettich, D-7200) a 12000 r.p.m. por 15 minutos a 4°C, el pellet fue lavado con etanol al 70 % y centrifugado en iguales condiciones. Este material fue resuspendido en 30 ul de buffer TE lx 0.1 M y posteriormente fue purificado por el método de la agarosa de bajo punto de fusión (LGT) .
Para la construcción del vector de expresión en levaduras, se utilizó el plasmidio pNAO-407, de 10 KB el cual contiene el promotor del gen de la enzima Alcohol Oxidasa 1 (AOX) de la
levadura P. pastoris, el Terminador de la transcripción del gen de la enzima Gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa (GAP-T) de S . cerevisiae, el marcador de selección HIS-3 que le confiere a la levadura la capacidad de crecer en un medio mínimo deficiente en el aminoácido histidina, asi como la señal 3 AOX de la levadura P. pastoris . Ubicada después del promotor y antes del terminador, entre los sitios Ncol y EcoRI se encuentra clonada una banda de 0.678 Kb correspondiente al antigeno de superficie del virus de la Hepatitis B (Pub. No. E.P 480525 A2) . Por ello el primer paso fue la digestión con las enzimas Ncol y EcoRI y luego se purificó por el método de LGT, separándose de la banda de 0.678 Kb. A continuación los extremos fueron tratados con la enzima de modificación Klenow para rellenar sus extremos y convertirlos en romos, para facilitar el clonaje de la banda de PCR. Finalmente se procedió a su desfosforilación con la enzima fosfatasa alcalina (CIP) . Una vez purificado el plasmidio se procedió a la reacción de ligazón para lo cual se tomaron 100 ng del plasmidio pNAO/407 NcoI/EcoRI/LGT/Klenow/CIP y se pusieron a incubar con 30 ng de la banda de PCR purificada en presencia de la enzima T4 ADN ligasa El producto de la ligazón fue transformado en células de E. coli, cepa K-12/XL-1 Blue (Bullok WO, Fernández TM, Shote JM . XL-blues a high efficiency plasmid transforming rec A Echerichia coli strain with Beta-galactosidase selection. Biothec 1987; 5:376-379) las que posteriormente fueron plaqueadas sobre medio LB con ampicillin. Todas las colonias que crecieron fueron parchadas de forma independiente para el pesquisaje de los recombinantes por el método de hibridación en colonias. Los clones positivos fueron seleccionados para su análisis por chequeo de restricción. Para este último procedimiento, se utilizó la banda de 1.485 Kb
correspondiente a la E, que luego de purificarse por el método de LGT, fue marcada con isótopo radioactivo (Fósforo alfa 32, Amersham International, Amersham, UK) . De esta forma se obtuvo el plasmidio pDE2-21 (Figura 1) , el cual se purificó de forma masiva y se almacenó para su posterior utilización .
Para chequear que la inserción de la banda de la E quedó en fase bajo el promotor AOX, se procedió a la secuenciación de la unión entre los dos genes. Para la secuenciación plasmidio pDE2-21 purificado se utilizó un kit comercial (Sequenase Versión 2.0 ADN Sequencing Kit, USB, USA). La secuencia del iniciador utilizado para este procedimiento es: 1241 5 'CCCCATCCTCTGTCTACCATG 3' 1220. Este iniciador habia sido utilizado previamente por otros (Deubel V, Laille M, Hugnot J, Chungue E, Gueston J, Drovet MT, Bassot S, Chevrier D. Identification of Dengue sequences by genomic amplification : rapid diagnosis of Dengue virus serotypes in peripheral blood. J. Virol . Methods 1990; 30: 41-54) . La secuenciación confirmó la correcta orientación de la banda de la E en la construcción genética.
El proceso de electroporación se realizó esencialmente según Martínez y col.1993 (Martínez E, García C y Morales-Grillo J. Rapid transformation of non Sacharomyces yeast by electroporation. Biotech Techn 1993; 7: 895-896). Luego de la reactivación de la cepa de P. pastoris procedente de un "stock" en glicerol, conservado a la temperatura de -70 °C, la misma fue estriada sobre una placa de medio rico YPG e incubada durante 72 h a 28 °C . Transcurrido el tiempo se tomaron 20 colonias de aproximadamente 3 mm de diámetro en condiciones de esterilidad y sé resuspendieron en 1 mL de agua destilada estéril en un tubo eppendorf de 1.5 mL . Las células fueron centrifugadas a 3200 r.p.m. durante 3 min. y a 4 °C en una microcentrifuga refrigerada (Hettich D-7200
Tuttligen, Japan) . El sobrenadante fue desechado y el pellet se resuspendió en 200 μL de tampón Sorbitol 1M para electroporación, transfiriéndose a cubetas de electroporación de 0.2 cm (Gene-Pulser Cuvette, Bio-Rad, USA). En una de las cubetas se adicionaron 5 μL conteniendo 500 ng del plasmidio pDE2-21 digerido con 10 u de la enzima PvuII (Amersham, UK) . Todo el procedimiento se realizó en frió. Se utilizó un equipo de electroporación comercial (Gene- Pulser-Transfection Apparatus, Bio-Rad, USA) . Los parámetros del proceso fueron los siguientes: resistencia 200 W, capacidad 125 μF y voltaje 2 Kv., obteniéndose un tiempo de descarga de 3.4 MS, condiciones ajustadas según las recomendaciones del fabricante. Las células electroporadas fueron resuspendidas en 1 mL de tampón Sorbitol frió. Volúmenes de 500 μL fueron vertidos sobre placas de medio mínimo YNB (Yeast Nitrogen Base, Difco, USA) libre de aminoácidos con glucosa al 2%. Las placas fueron incubadas durante 96 h a 28 °C. Las colonias crecidas fueron aisladas mediante parcheo a placas YNB frescas con glucosa al 2% que se incubaron nuevamente a 28 °C durante 72 h.
Para realizar el análisis por Southern-blot se procedió según Ferbeyre y cois . 1993 (Ferbeyre G, Villareal A, Morales- Grillo J. A Rapid procedure for preparing high molecular weight DNA from yeast for Southern analysis. BioTechniques 1993; 14:386) . Se escogieron 10 clones al azar, se inocularon precultivos de 5 mL de medio YPG y fueron incubados durante 16 h a 28°C con agitación circular de 250 r.p.m. utilizando una zaranda (Blanc-LaBo S.A., CH-1131, Switzerly) . Las células crecidas se centrifugaron a 3200 r.p.m. durante 3 min . a 4°C (Jouan, GR 41-11, France) y se eliminó el sobrenadante. Luego de un lavado con agua estéril se volvió a centrifugar en iguales condiciones. El pellet fue resuspendido en buffer lisis (Anexo 1) y se agregaron 25 μL
de Zimolaza a 20 mg/mL (Seikagaku Corporation, Japan) , 25 μL de pronasa a 20 mg/mL (Merck, Germany) y 10 μL de RNasa a 16 mg/mL (Boehringer, GmbH, Germany) . Esta mezcla fue incubada durante 1 hora a 37°C. A continuación se realizó una extracción con fenol-cloroformo (Sambrook J, Frissch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2 nd. Edition. New York, Cold Spring Harbord Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989), se colectó la fase superior y se precipitó con etanol absoluto (Merck, Germany) durante 1 hora a -70°C.
Pasado el tiempo las muestras se centrifugaron a 12000 r.p.m. por un tiempo de 15 min. a 4°C en una microcentrifuga refrigerada . A continuación el ADN extraído se lavó con etanol al 70% y nuevamente fue centrifugado en iguales condiciones. El ADN se secó al vacio (Speed-Vac ALPHA, Zwitzerly) durante 15 min. y luego fue resuspendió en 100 μL de TE procediéndose a testar la calidad de la extracción. Para determinar las características de la integración, fueron digeridos 20 μg de ADN con 10 unidades de la enzima de restricción EcoRV (Amershan, UK) a 37°C por 12 h. Posterior a la digestión, se procedió a realizar el Southern- Blot . La reacción de hibridación fue realizada de acuerdo al protocolo de hibridación y "blotting" de ácidos nucleicos (Hybond-N+ Protocols, Amershan, UK) . Se utilizó como sonda una banda del plásmido pDE2-21 producto de la digestión del mismo con la enzima de restricción EcoRV, previamente purificada por LGT. Esta sonda se corresponde con la secuencia del gen de la proteina E del VD cepa A15. Como marcador de peso molecular se utilizó ADN de fago lambda digerido con la enzima de restricción Hind III. Como control negativo se utilizó ADN extraído de la misma cepa de P. pastoris sin electroporar (Figura 2) . Una vez
caracterizados los clones se escogió el clon 14 (YDE221-14) para los estudios de expresión. Estudios de expresión del clon YDE221-14
De una placa de medio sólido YPG, inoculada con una alícuota de un stock en glicerol del clon YDE221-14 se tomó una colonia con la cual se inoculó un precultivo de 10 mL de medio salino ( (NH4)2S0422 g/L, K2HP0418.2 g/L, MgS04x7H20 7.5 g/L, CaCl2 0.5 g/L, glicerol 3%, solución de vitaminas 400X 5 mL, solución de sales trazas 1 mL) se incubó 12 h a 250 rpm y a 30°C. De este precultivo se utilizaron 500 μL para inocular un erlenmeyer conteniendo 50 mL de igual medio, el cual se incubó durante 24 h a 30°C y 250 rpm en zaranda. Los 50 mL fueron utilizados a su vez para inocular un erlenmeyer que contenia 500 mL de medio salino. Se incubó durante 12h a 30°C y 250 rpm en zaranda. Este volumen fue utilizado como inoculo de un fermentador de 5 L (Marubisshi, Japan) con medio salino suplementado con extracto de levadura al 20%. Las condiciones de la fermentación fueron las siguientes : 24 horas de crecimiento a 30°C, 500 rpm y 3 vvm de aereación. Se procedió a la inducción del promotor AOX 1 con metanol (BDH, Germany) cuyo el cultivo en crecimiento agotó el glicerol como fuente carbonada, registrado por un incremento del pH cuyo el peso húmedo alcanza aproximadamente los 70 g/L. El flujo de metanol se ajustó teniendo en cuenta el incremento del peso húmedo del cultivo, tomando la experiencia de fermentaciones anteriores con el clon de P. pastoris que expresa el HBsAg (Pub. No. EP 480525 A2 ) . Se incrementó a su vez la agitación hasta 750 rpm y la aereación hasta 5 vvm. A las 48 h de fermentación se suministró un suplemento de vitaminas y sales trazas en un % similar al % del medio ya referido, las sales trazas fueron nuevamente suministradas a las 90 h de fermentación a la mitad del % anteriormente empleado. Tras 120 h de fermentación, se colectó la biomasa por centrifugación de todo el volumen en
tubos de 1 L a 3000 rpm a 4°C durante 30 min., desechándose el sobrenadante correspondiente al medio de cultivo. La biomasa húmeda obtenida fue lavada con buffer PBS (pH 7.2) y se pesó para determinar el rendimiento en g/L del proceso fermentativo (aproximadamente 170 g/L) . A continuación fue resuspendida con un volumen de buffer lisis 2X (sacarosa 20 g/L, Tris 4.82 g/L, NaCl 30 g/L, EDTA 3.71g/L) igual al peso húmedo obtenido, completándose a dos veces el volumen con H20 destilada. La ruptura se realizó por trituración mecánica, pasándose seis veces por un molino celular (DynoMill, USA) y el material obtenido se centrifugó a 3000 rpm durante 30 min. El sobrenadante fue centrifugado nuevamente a 15000 rpm por 30 min. en una ultracentrifuga (Hitachi CSP70H, rotor RP 45T, Japan) . Se tomó el precipitado, el cual fue lavado dos veces con buffer lisis IX.
Con el fin de solubilizar la proteina detectada en el precipitado, se realizó un tratamiento del mismo con buffer de extracción (PBS, urea 8M) en una proporción de 60 g/L e incubándose toda la noche en agitación a 4°C. El material obtenido fue centrifugado a 15000 rpm durante 30 min., se tomó el sobrenadante y se desalinizó con buffer PBS IX con el fin de renaturalizar la proteina. La proteina pudo visualizarse débilmente a través de una electroforésis en gel de poliacrilamida al 10%, en presencia de SDS, condiciones reductoras y no reductoras (Figura 4) .
La probable proteina de envoltura del virus Dengue-2 (VD2) recombinante fue detectada en este precipitado mediante la técnica de Western-blot , utilizando un liquido ascitico murino hiperinmune anti VD2. La talla de la proteina detectada (aproximadamente 38 KDa) no se correspondió con la talla esperada Se utilizó como control negativo, una
preparación similar, partiendo de un clon de levadura transformado con el vector pNAO. (Figura 3).
Se pudo comprobar que en el precipitado remanente a la extracción no quedó proteina recombinante detectable por SDS- PAGE y Western-blot. El estimado del peso molecular indicó una talla inferior a la proteina de envoltura nativa del VD2, aproximadamente 38 KDa, calculada en condiciones reductoras respecto a un patrón de peso molecular. Se confirmó nuevamente la presencia de la proteina recombinante por Western-blot, en el extracto desalinizado .
Este resultado también se obtuvo a través de un ELISA tipo sywich amplificado, utilizando inmunoglobulinas de sueros humanos (infección secundaria) como recubrimiento, liquido ascitico hiperinmune anti VD2 como segundo anticuerpo detectado por un tercer anticuerpo anti ratón conjugado a la enzima peroxidasa. Este sistema detectó actividad VD especifica hasta la cantidad 50 μg de extracto desalinizado. Se utilizó como control negativo una preparación idéntica partiendo del precipitado de ruptura de la levadura clonada con el vector pNAO y como criterio de positividad se estableció como positivo, muestras cuya DO fuese mayor o igual al doble de la DO de la muestra control negativo. Ejemplo 2: Para la obtención del gen de la envoltura de Dengue 4 se partió de la secuencia génica que codifica para la proteina E del virus, a partir de la cepa 814669 aislada durante la epidemia de fiebre del dengue ocurrida en Dominica en el año 1981 y gentilmente donada por el Dr . Robert Shope de Texas University, USA. Mediante PCR, se realizó la amplificación de 1202pb correspondientes a la envoltura del dengue 4 truncada en sus últimos 53 aminoácidos la que se utilizó en el clonaje en un vector de expresión en levaduras (pFAO) . Este vector es esencialmente igual al vector pPS-7 reportado anteriormente
(EP: Solicitud de Patente Europea EP 438200) pero con la señal de secreción del alfa factor de S . cerevisiae . De esta forma se creó el plasmidio pDFE4-47.
La amplificación del ácido nucleico se realizó según Saiki y col. 1988 (Saiki PK, Grify DH, Stoffel S, Scharf SJ, y cois . Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polimerasa. Science 1988; 239: 487-491) con la utilización de los siguientes iniciadores: Iniciador positivo 5' GG GAATTCT ATG CGA TGC TTA GGA GTA GGA 3'
Iniciador negativo 5' GG GAATTC TTA AAA CAT CCT GCC AAT GGA ACT 3'
En cada uno de ellos se incluyó un sitio de corte para la enzima de restricción (ER) EcoRI (GAA TTC) en el positivo se incluyó un codón de iniciación ATG y en el negativo un codón de parada TTA . Los números flanqueando a cada iniciador se corresponden con la posición en la secuencia nucleotidica de acuerdo a resultados previamente publicados (Zhao B, Mackow E, Buckler-White A, Markoff L, Chanock RM, Lai C-J, Makino Y. Cloning full-length dengue type 4 viral DNA sequences: analysis of genes coding for structural proteins. Virology 1986; 155:77-78) y gentilmente donada por el Dr . Robert Shope de Texas University, USA) .
La secuencia amplificada cuenta de 1202 pb y se corresponde con la secuencia del gen de la envoltura del virus Dengue 4 truncada en 53 aa en su extremo C-terminal, además de las modificaciones incluidas en los iniciadores y descritas anteriormente
Primero se realizó una desnaturalización de los híbridos RNA- cADN a 95 °C por 5 minutos. Posteriormente se añadieron 2.5 unidades de TAQ polimerasa (Bohering Mamnhein) y la reacción se mantuvo a 72 °C por 45 segundos. La amplificación se logró en 30 ciclos de: desnaturalización (95 °C, 45 segundos),
annealing (55 °C 90 segundos) y extensión (72 °C 45 segundos) . Después del último ciclo se mantuvo a 72 °C durante 10 minutos.
Testaje del PCR: Se tomaron 5 μL de cada mezcla de reacción, 4 μL de H20 y 4 μL de colorante y se aplicaron en un gel de agarosa al 0.8% en buffer TBE teñido con 2 μL de Bromuro de Etidium (10 mg/mL) para su visualización . Como marcador de peso molecular se utilizó el ADN del fago λ digerido con la enzima Hind III. El producto de la amplificación fue tratado con la enzima proteinasa K en un volumen de 100 μL, con el objetivo de eliminar los restos de la enzima Taq Pol, utilizada previamente para el PCR. Posteriormente se trató con fenol/cloroformo y se realizó una precipitación etanólica durante una noche a -70 °C .
Luego se centrifugó (Hettich, D-7200) a 12000 r.p.m. por 15 minutos a 4 °C, el pellet fue lavado con etanol al 70 % y centrifugado en iguales condiciones. Este material fue resuspendido en 30 ul de buffer TE lx 0.1 M y posteriormente fue purificado por el método de la agarosa de bajo punto de fusión (LGT) .
Para la construcción del vector de expresión en levadura se utilizó el plásmido pFaO de lOkb el cual contiene el promotor para la transcripción del gen de la enzima alcohol oxidasa 1 (AOX) de la levadura P. pastoris, el terminador de la transcripción del gen de la enzima gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa (GAP-T) de S . cerevisiae, el marcador de selección His-3, la señal de secreción del factor α de S . cerevisiae de 364 pb asi como la región 3 AOX de la levadura P. pastoris (Solicitud de Patente Europea EP 438200) . El primer paso lo constituyó la digestión del vector con la enzima EcoRI, posteriormente se procedió a la desfosforilación con la enzima fosfatasa alcalina (CIP) . A
continuación se realizó la ligazón, para lo cual se tomaron 75 ng del vector pFAO/EcoRI/ CIP y se pusieron a incubar con 100 ng de banda "E" purificada en presencia de la enzima T4 ADN ligasa. El producto de la ligazón fue transformado en células E . coli cepa Mc-1061. Los clones positivos fueron seleccionados por hibridación de colonias utilizando la banda de 1203pb correspondiente a la E. De esta forma fue obtenido el plásmido pDE4-47 (Figura 5) el cual se purificó de forma masiva y se almacenó para su posterior utilización . Para chequear que la inserción de la banda de la E quedó bajo el PAOX se procedió a la secuenciación de ácidos nucleicos, utilizado para este procedimiento el iniciador:
ACT ATT GCC AGC ATT GCT .
el cual híbrida en la región del alfa factor, cadena arriba del sitio de unión de la banda al vector.
Electroporación.
El proceso de electroporación se realizó esencialmente según (Martínez E, García C y Morales-Grillo J. Rapid transformation of non Sacharomyces yeast by electroporation . Biotech Techn 1993; 7: 895-896). Luego de la reactivación de la cepa de P. pastoris procedente de un "stock" en glicerol, conservado a la temperatura de -70 °C, la misma fue estriada sobre una placa de medio rico YPG e incubada durante 72 h a 28 °C . Transcurrido el tiempo se tomaron 20 colonias de aproximadamente 3 mM de diámetro en condiciones de esterilidad y se resuspendieron en 1 mL de agua destilada estéril en un tubo eppendorf de 1.5 mL . Las células fueron centrifugadas a 3200 r.p.m. durante 3 min. y a 4 °C en una microcentrifuga refrigerada (Hettich D-7200 Tuttligen,
Japan) . El sobrenadante fue desechado y el pellet se resuspendió en 200 μl de tampón Sorbitol 1M para electroporación, transfiriéndose a cubetas de electroporación de 0.2 cm (Gene-Pulser Cuvette, Bio-Rad, USA). En una de las cubetas se adicionaron 5 μL conteniendo 500 ng del plásmido digerido con 10 U de la enzima Clal (Promega) y 10 U de la enzima Salí (Promega) .
Se utilizó un equipo de electroporación comercial (Gene- Pulser-Transfection Apparatus, Bio-Rad, USA) . Los parámetros del proceso fueron los siguientes: resistencia 200 W, capacidad 125 μF y voltaje 2 Kv., obteniéndose un tiempo de descarga de 3.4 MS, condiciones ajustadas según las recomendaciones del fabricante. Las células electroporadas fueron resuspendidas en 1 mL de tampón Sorbitol frió. Volúmenes de 500 μL fueron vertidos sobre placas de medio mínimo YNB (Yeast Nitrogen Base, Difco, USA) libre de aminoácidos con glucosa al 2%. Las placas fueron incubadas durante 96 h a 28 °C. Las colonias crecidas fueron aisladas mediante parcheo a placas YNB frescas con glucosa al 2% que se incubaron nuevamente a 28 °C durante 72 h.
Para realizar el análisis por Dot Blot se procedió según protocolo de Amershan. Se escogieron 92 colonias con señal positiva para determinar las características de integración Para ello, 20 μg de ADN, previamente extraído, fueron digeridos con lOu de la enzima EcoRV (Amershan) a 37° C durante 12h .Para realizar el análisis por Southern-blot se procedió según Ferbeyre y cois. (Ferbeyre G, Villareal A, Morales-Grillo J. A Rapid procedure for preparing high molecular weight DNA from yeast for Southern analysis . BioTechniques 1993; 14:386).
Se escogieron 20 clones al azar, se inocularon precultivos de 5 mL de medio YPG y fueron incubados durante 16 h a 28°C con
agitación circular de 250 r.p.m. utilizando una zaranda (Blanc-LaBo S.A., CH-1131, Switzerly) .
Las células crecidas se centrifugaron a 3200 r.p.m. durante 3 min. a 4°C (Jouan, GR 41-11, France) y se eliminó el sobrenadante. Luego de un lavado con agua estéril se volvió a centrifugar en iguales condiciones. El pellet fue resuspendido en buffer lisis (Anexo 1) y se agregaron 25 μL de Zimolaza a 20 mg/mL (Seikagaku Corporation, Japan) , 25 μL de pronasa a 20 mg/mL (Merck, Germany) y 10 μL de RNasa a 16 mg/mL (Boehringer, GmbH, Germany) . Esta mezcla fue incubada durante 1 hora a 37°C. A continuación se realizó una extracción con fenol-cloroformo (), se colectó la fase superior y se precipitó con etanol absoluto (Merck, Germany) durante 1 hora a -70°C. Pasado el tiempo las muestras se centrifugaron a 12000 r.p.m. por un tiempo de 15 min. a 4°C en una microcentrifuga refrigerada .
A continuación el ADN extraído se lavó con etanol al 70% y nuevamente fue centrifugado en iguales condiciones. El ADN se secó al vacio (Speed-Vac ALPHA, Zwitzerly) durante 15 min. y luego fue resuspendió en 100 μL de TE procediéndose a testar la calidad de la extracción
Para determinar las características de la integración, fueron digeridos 20 μg de ADN con 10 unidades de la enzima de restricción EcoRV (Amershan, UK) a 37°C por 12 h. Como sonda se utilizó una banda EcoRI del plasmidio BSK que contenia la "E" del virus D4 clonada anteriormente en el sitio EcoRI (Figura 6) . Una vez caracterizados los clones se escogió el clon 61 (YDE447-61) para los estudios de expresión .
Estudios de expresión del clon YDFE447-6I.
De una placa de medio sólido YPG, inoculada con una alícuota de un stock en glicerol del clon YDFE447-61 se tomó una
colonia con la cual se inoculó un precultivo de 10 mL de medio salino ( (NH4)2S0422 g/L, K2HP0418.2 g/L, MgS04x7H20 7.5 g/L, CaCl2 0.5 g/L, glicerol 3%, solución de vitaminas 400X 5 mL, solución de sales trazas 1 mL) se incubó 12 h a 250 rpm y a 30°C. De este precultivo se utilizaron 500 μL para inocular un erlenmeyer conteniendo 50 mL de igual medio, el cual se incubó durante 24 h a 30°C y 250 rpm en zaranda. Los 50 mL fueron utilizados a su vez para inocular un erlenmeyer que contenia 500 mL de medio salino. Se incubó durante 12h a 30°C y 250 rpm en zaranda. Este volumen fue utilizado como inoculo de un termentador de 5 L (Marubisshi, Japan) con medio salino suplementado con extracto de levadura al 20%. Las condiciones de la fermentación fueron las siguientes: Se creció 24 horas a 30°C, 500 rpm y 3 vvm de aereación. Se procedió a la inducción del promotor AOX 1 con metanol (BDH, Germany) cuyo el cultivo en crecimiento agotó el glicerol como fuente carbonada, registrado por un incremento del pH cuyo el peso húmedo alcanza aproximadamente los 70 g/L. El flujo de metanol se ajustó teniendo en cuenta el incremento del peso húmedo del cultivo, tomando la experiencia de fermentaciones anteriores con el clon de P. pastoris que expresa el HBsAg (Pub. No. E.P 480525 A2 ) . Se incrementó a su vez la agitación hasta 750 rpm y la aereación hasta 5 vvm. A las 48 h de fermentación se suministró un suplemento de vitaminas y sales trazas en un % similar al % del medio ya referido, las sales trazas fueron nuevamente suministradas a las 90 h de fermentación a la mitad del % anteriormente empleado. Tras 120 h de fermentación, se colectó la biomasa por centrifugación de todo el volumen en tubos de 1 L a 3000 rpm a 4°C durante 30 min., desechándose el sobrenadante correspondiente al medio de cultivo. La biomasa húmeda obtenida fue lavada con buffer PBS (pH 7.2) y se pesó para determinar el rendimiento en g/L del proceso fermentativo (aproximadamente 200 g/L) . A continuación fue resuspendida
con un volumen de buffer lisis 2X (sacarosa 20 g/L, Tris 4.82 g/L, NaCl 30 g/L, EDTA 3.71 g/L) igual al peso húmedo obtenido, completándose a dos veces el volumen con H20 destilada. La ruptura se realizó por trituración mecánica, pasándose seis veces por un molino celular (DynoMill, USA) y el material obtenido se centrifugó a 3000 rpm durante 30 min. El sobrenadante fue centrifugado nuevamente a 15000 rpm por 30 min. en una ultracentrifuga (Hitachi CSP70H, rotor RP 45T, Japan) . Se tomó el precipitado, el cual fue lavado dos veces con buffer lisis IX.
La proteina de envoltura del virus Dengue-4 (VD4) recombinante fue detectada en este precipitado mediante la técnica de Western-blot, utilizando un liquido ascitico murino hiperinmune anti VD4. Se utilizó como control negativo, una preparación similar, partiendo de un clon de levadura transformado con el vector pFAO. (Figura 7) . Con el fin de solubilizar la proteina detectada en el precipitado, se realizó un tratamiento del mismo con buffer de extracción (PBS, urea 8M) en una proporción de 60 g/L e incubándose toda la noche en agitación a 4°C. El material obtenido fue centrifugado a 15000 rpm durante 30 min., se tomó el sobrenadante y se desalinizó con buffer PBS IX con el fin de renaturalizar la proteina. La proteina pudo visualizarse a través de una electroforésis en gel de poliacrilamida al 10%, en presencia de SDS y condiciones reductoras. (Figura 8).
El estimado del peso molecular indicó una talla similar a la proteina de envoltura nativa del VD4, aproximadamente 60 kDa, calculada en condiciones reductoras respecto a un patrón de peso molecular. Se confirmó nuevamente la presencia de la proteina recombinante por Western-blot, en el extracto desalinizado, siendo reconocida además por sueros humanos de individuos que sufrieron infección secundaria con el virus Dengue .
Estos resultados también se obtuvieron a través de ELISA:
• Ensayo tipo sywich utilizando inmunoglobulinas provenientes de sueros humanos (infección secundaria) como recubrimiento y conjugadas a la enzima peroxidasa, detectó actividad VD especifica hasta una cantidad de 8 μg de extracto desalinizado .
• Ensayo tipo sywich amplificado, utilizando inmunoglobulinas de sueros humanos (infección secundaria) como recubrimiento, líquidos asciticos hiperinmunes y anticuerpos monoclonales murinos como segundos anticuerpos detectados por un tercer anticuerpo anti ratón conjugado a la enzima peroxidasa. Este sistema detectó actividad VD especifica hasta concentraciones inferiores a 500 ng de extracto desalinizado, empleando anticuerpos monoclonales anti complejo Dengue y anti VD4 seroespecifico . Utilizando líquidos asciticos murinos hiperinmunes anti VD4 y VD2 se obtuvo una menor sensibilidad.
En estos ensayos se utilizó como control negativo una preparación idéntica partiendo del precipitado de ruptura de la levadura clonada con el vector pFAO.
Como criterio de positividad se estableció como positivo muestras cuya DO fuese mayor o igual al doble de la DO de la muestra control negativo.
Un estimado del rendimiento de la proteina recombinante fue realizado por SDS-PAGE donde la concentración relativa de la banda fue referida a una curva patrón de la proteina Glutamato deshidrogenasa (55.4 kDa) igualmente incluida en el gel (Deubel V, Laille M, Hugnot J, Chungue E, Gueston J, Drovet MT, Bassot S, Chevrier D. Identification of Dengue sequences by genomic amplification : rapid diagnosis of Dengue virus serotypes in peripheral blood. J. Virol. Methods 1990; 30: 41-54) paralelamente se determinó por la técnica de tinción con Amidoblack referida a una curva de la proteina BSA (Analytical Biochemestry 166: 49-54(1987). En ambos casos
se obtuvo un rendimiento aproximado del 1.2% de proteina recombinante con relación a la concentración total de proteínas extraídas del precipitado.
Utilización de la proteina recombinante como inmunógeno: Utilizamos grupos de veinte ratones (Balb-C, hembras, de cuatro semanas de vida) por cada esquema realizado. Se ensayaron dos concentraciones de inmunógeno 200 μg y 400 μg de extracto desalinizado por dosis, incluyéndose grupos de ratones controles negativos en el esquema de inmunización, utilizando iguales concentraciones del extracto obtenido de la levadura control. El inmunógeno se administró por las vías intraperitoneal, subcutánea e intramuscular, dado en tres dosis con frecuencia semanal, utilizando adyuvante completo (I) e incompleto (II y III) de Freund. El nivel de anticuerpos anti VD4 , detectado en los sueros individuales de los ratones por ELISA (sistema tipo sywich amplificado descrito anteriormente) , resultó incrementado tras una cuarta dosis, utilizando proteina recombinante parcialmente purificada por precipitación con 50% de saturación con sulfato de amonio. La reactividad de los sueros se obtuvo entre las diluciones 1/500 y 1/1000 de los mismos. Por la técnica de Western-blot se comprobó que dicha reactividad está dirigida específicamente contra la proteina de envoltura nativa del VD4 (Figura 9) . En los experimentos iniciales de protección donde los ratones fueron retados con 100 LD50 del VD4 cepa 814669, se evidenció una protección del 53% de los ratones inmunizados con 400 μg de proteina recombinante, resultado estadísticamente significativo (0.0025). La producción de la proteina recombinante fue detectada también por microscopía e inmunomicroscopia electrónica. Con estas técnicas fue posible apreciar la presencia de la proteina recombinante en dos formas . Una como grandes
agregados en el citoplasma de las levaduras (Figura 10 a) y otra de forma particulada (Figura 10 b) .
El hecho de la particulación es un fenómeno interesante, puesto que anteriormente no se ha descrito la formación de partículas en ningún sistema de expresión cuando se ha expresando solo el gen de la. De esta forma las partículas una vez purificadas pudieran jugar un importante papel en estimular la respuesta inmune, haciendo de la Pichia pastoris un sistema más atractivo para la expresión de este tipo de proteínas .
Ejemplo 3:
Para la construcción del vector de expresión en levaduras, que contiene el gen de la envoltura truncada del virus serotipo 2 se partió del vector de expresión pDE2-21 descrito en el ejemplo de realización 1 de este documento, que como se ha mencionado contiene la información genética para la expresión en la levadura metilotrófica Pichia pastoris del producto del gen de la Envoltura (E) , de la cepa A/15, representante del serotipo 2 de los virus del Dengue y que fue aislada durante la epidemia de Dengue en Cuba en el año 1981.
Para ello, a este plasmidio se le realizó una modificación al gen de la Envoltura. Esta modificación consistió en cortar el gen en la posición 1407 utilizando para ello un sitio EcoRI que se encontraba en esa posición. Luego los extremos fueron rellenados con la enzima Klenow y por último fueron ligados con la enzima T4 ligasa. El producto de la ligazón fue transformado en células de E. coli, cepa K-12/XL-1 Blue (Bullok WO, Fernández TM, Shote JM . XL-blues a high efficiency plasmid transforming rec A Echerichia coli strain with Beta-galactosidase selection. Biothec 1987; 5:376-379) las que posteriormente fueron plaqueadas sobre medio LB con ampicillina. Se seleccionaron 20 colonias al azar y se les
realizó extracción de ADN por el método de minialcalinos (Guilles, 1989) . Una vez extraído el ADN se procedió a realizar un análisis de restricción utilizando para ello las enzimas EcoRV y EcoRI . Los clones que resultaron positivos por este procedimiento se seleccionaron para verificar la secuencia nucleotidica de la región luego de la modificación. Para ello se utilizó un kit comercial (Sequenase Versión 2.0 ADN Sequencing Kit, USB, USA) y dos iniciadores, uno 5' a la - región modificada y otro 3' a dicha región, este último utilizado previamente para la amplificación de la banda de la Envoltura como se ha descrito en el ejemplo de realización 1. La secuencia del iniciador 5' utilizado para este procedimiento es: 2290 5' TCATGGACTATGAAAATCCT 3' 2309, y la del otro es la siguiente:
2432 5S CAGATATCTTAAGCCTGCACCATAGCTCCC 3 2403
Como en los ejemplos anteriores, los números flanqueando a las secuencias de los iniciadores se corresponden con la posición en la secuencia nucleotidica de acuerdo a resultados publicados previamente (Deubel V, Kinney RM, Trent D . Nucleotide sequence y deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: comparative analysis of the full-length genome . Virology 1988; 165:234-244). Una vez establecida la secuencia de la región modificada se verificó la deleción del sitio EcoRI, asi como la incorporación de un codón de parada TTA en la posición 1407 del gen, por lo que la envoltura quedó truncada en 79 pares de base y por tanto en sus últimos 27 aminoácidos. De esta forma quedó constituido el plasmidio pDE2-21ΔEcoRI-7 (Figura 11) , el cual se purificó de forma masiva y se almacenó para su posterior utilización. Posteriormente 10 ug de este plasmidio fueron digeridos con 10 u de la enzima EcoRV para obtener la banda de la envoltura completa, pero truncada funcionalmente como se describió.
Luego de purificar este fragmento por el método de LGT se clonó en el vector para la expresión en levaduras pPS-7 de 8.5 Kb (Solicitud de Patente Europea EP 438200). Este plasmidio contiene el promotor del gen de la enzima Alcohol Oxidasa 1 (AOX) de la levadura P. pastoris seguido de la señal de secreción de S . cerevisiae para la Sucrosa invertasa (SucII), el Terminador de la transcripción del gen de la enzima Gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa (GAP-T) de S. cerevisiae, el marcador de selección HIS-3 que le confiere a la levadura la capacidad de crecer en un medio mínimo deficiente en el aminoácido histidina, asi como la señal 3S AOX de la levadura P. pastoris . A continuación del SucII se encuentra el sitio Ncol como único sitio de clonaje. Para la realización de este clonaje, 10 ug del pPS-7 fueron digeridos durante 1 hora a 37 °C con la enzima de restricción Ncol (Promega) y a continuación sus extremos modificados con la enzima Mung-Bean nucleasa (Biolabs) . Posteriormente se tomaron 5 ug del pPS-7/NcoI y se incubaron durante una hora a 25 °C con 10 u de enzimas por 1.14 pmol de extremos 5' . Una vez modificados los extremos se procedió a la desfosforilación de los mismos utilizando la enzima fosfatasa alcalina (CIP) .
A continuación se tomaron 100 ng del pPS-7/NcoI/MB/CIP y se pusieron a incubar con 30 ng de la banda EcoRV procedente del pDE2-21ΔEcoRI-7 en presencia de la enzima T4 ADN ligasa.
El producto de la ligazón fue transformado en células de E. coli, cepa K-12/XL-1 Blue (Bullok WO, Fernández TM, Shote JM. XL-blues a high efficiency plasmid transforming rec A Echerichia coli strain with Beta-galactosidase selection. Biothec 1987; 5:376-379) las que posteriormente fueron plaqueadas sobre medio LB con ampicillin. Todas las colonias que crecieron fueron parchadas de forma independiente para el pesquisaje de los recombinantes por el método de hibridación en colonias . Los clones positivos fueron seleccionados para
su análisis por chequeo de restricción. Para este último procedimiento, se utilizó la banda de 1.485 Kb correspondiente a la Envoltura purificada anteriormente por el método de LGT a partir del plasmidio pDE2-21 como se describe en el ejemplo de realización 1. Esta banda fue marcada con isótopo radioactivo (Fósforo alfa 32, Amersham
International, Amersham, UK) .
A los clones que resultaron positivos se le extrajo el ADN por el método de minialcalinos (Guilles, 1989) y se les realizó un análisis de restricción con la enzima EcoRI para determinar los clones con la orientación correcta de la banda
(Figura 12) .
Una vez seleccionados los clones adecuados, se procedió a la secuenciación del extremo 5' de la banda de la Envoltura en la región de unión al extremo 3' del SucII.
Para este propósito se utilizó un cebador con la siguiente secuencia :
1241 5'CCCCATCCTCTGTCTACCATG 3' 1220.
De esta forma quedó constituido el plasmidio pDSE2-34 (Figura 13) , el cual se purificó de forma masiva y se almacenó para su posterior utilización en la electroporación de las levaduras .
El proceso de electroporación se realizó esencialmente según Martínez y col.1993 (Martínez E, García C y Morales-Grillo J. Rapid transformation of non Sacharomyces yeast by electroporation. Biotech Techn 1993; 7: 895-896). Luego de la reactivación de la cepa de P. pastoris procedente de un "stock" en glicerol, conservado a la temperatura de -70 °C, la misma fue estriada sobre una placa de medio rico YPG e incubada durante 72 h a 28 °C . Transcurrido el tiempo se tomaron 20 colonias de aproximadamente 3 mm de diámetro en condiciones de esterilidad y se resuspendieron en 1 mL de agua destilada estéril en un tubo eppendorf de 1.5 mL . Las
células fueron centrifugadas a 3200 r.p.m. durante 3 min. y a 4 °C en una microcentrifuga refrigerada (Hettich D-7200 Tuttligen, Japan) . El sobrenadante fue desechado y el pellet se resuspendió en 200 μL de tampón Sorbitol 1M para electroporación, transfiriéndose a cubetas de electroporación de 0.2 cm (Gene-Pulser Cuvette, Bio-Rad, USA).
En una de las cubetas se adicionaron 5 μL conteniendo 500 ng del plasmidio pDSE2-34 digerido previamente con 30 u de la enzima Clal y 40 u de Salí (Amersham, UK) . Todo el procedimiento se realizó en frió.
Se utilizó un equipo de electroporación comercial (Gene- Pulser-Transfection Apparatus, Bio-Rad, USA). Los parámetros del proceso fueron los siguientes: resistencia 200 W, capacidad 125 μF y voltaje 2 Kv., condiciones ajustadas según las recomendaciones del fabricante, obteniéndose un tiempo de descarga de 3.5 MS .
Las células electroporadas fueron resuspendidas en 1 mL de tampón Sorbitol frió. Volúmenes de 500 μL fueron vertidos sobre placas de medio mínimo YNB (Yeast Nitrogen Base, Difco, USA) libre de aminoácidos con glucosa al 2%. Las placas fueron incubadas durante 96 h a 28 °C.
Las colonias crecidas fueron aisladas mediante parcheo a placas YNB frescas con glucosa al 2% que se incubaron nuevamente a 28 °C durante 72 h.
Para realizar el análisis por Southern-blot se procedió según Ferbeyre y cois . 1993 (Ferbeyre G, Villareal A, Morales- Grillo J. A Rapid procedure for preparing high molecular weight DNA from yeast for Southern analysis. BioTechniques 1993; 14:386) . Se escogieron 15 clones al azar, se inocularon precultivos de 5 mL de medio YPG y fueron incubados durante 16 h a 28°C con
agitación circular de 250 r.p.m. utilizando una zaranda (Blanc-LaBo S.A., CH-1131, Switzerly) .
Las células crecidas se centrifugaron a 3200 r.p.m. durante 3 min. a 4°C (Jouan, GR 41-11, France) y se eliminó el sobrenadante. Luego de un lavado con agua estéril se volvió a centrifugar en iguales condiciones. El pellet fue resuspendido en buffer lisis (Anexo 1) y se agregaron 25 μL de Zimolaza a 20 mg/mL (Seikagaku Corporation, Japan) , 25 μL de pronasa a 20 mg/mL (Merck, Germany) y 10 μL de RNasa a 16 mg/mL (Boehringer, GmbH, Germany) . Esta mezcla fue incubada durante 1 hora a 37°C. A continuación se realizó una extracción con fenol-cloroformo (), se colectó la fase superior y se precipitó con etanol absoluto (Merck, Germany) durante 1 hora a -70°C. Pasado el tiempo las muestras se centrifugaron a 12000 r.p.m. por un tiempo de 15 min. a 4°C en una microcentrifuga refrigerada .
A continuación el ADN extraído se lavó con etanol al 70% y nuevamente fue centrifugado en iguales condiciones. El ADN se secó al vacio (Speed-Vac ALPHA, Zwitzerly) durante 15 min. y luego fue resuspendió en 100 μL de TE procediéndose a testar la calidad de la extracción.
Para determinar las características de la integración, fueron digeridos 15 μg de ADN con 10 unidades de la enzima de restricción EcoRI (Figura 14) y otros 15 ug con las enzimas
EcoRI y EcoRV (Figura 15) (Amershan, UK) a 37 °C por 12 h.
Posterior a la digestión, se procedió a realizar un análisis por Southern-blot de acuerdo a Sambrook y cois. 1989
(Sambrook J, Frissch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2 nd . Edition. New York, Cold Spring Harbord Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989). La reacción de hibridación fue realizada de acuerdo al protocolo de hibridación y "blotting" de ácidos nucleicos (Hybond-N+ Protocols, Amershan, UK) . Se utilizaron como sondas, una
banda del plásmido pDE2-21 producto de la digestión del mismo con la enzima de restricción, Clal/SALI previamente purificada por LGT. Esta sonda se utilizó para hibridar con el ADN digerido con las dos enzimas, mientras que para hibridar con el ADN cortado con la enzima EcoRI se utilizó una banda Ncol/Clal del plasmidio pPS-7 luego de ser purificada por LGT y que contiene la secuencia del promotor de la AOX 1. Como marcador de peso molecular se utilizó ADN de fago lambda digerido con las enzimas de restricción Hind III y EcoRI .
Como controles positivo del experimento donde el ADN fue sometido a la doble digestión se utilizaron el plásmido pDSE2-34 digerido con las enzimas Clal/SALI y la cepa de levadura YDE221-14 descrita en el ejemplo de realización 1. Como control negativo se utilizó el ADN extraído de la misma cepa de P. pas toris sin electroporar (MP-36) . En el Southern- blot donde el ADN fue digerido solo con EcoRI se utilizaron como controles la cepa MP-36 y el clon YDE221-14. Como marcador de peso molecular se utilizó ADN de fago lambda digerido con la enzima de restricción Hind III.
Una vez caracterizados los clones se escogieron los clones 1,2,3 y 4 denominados YDSE234-1 , 2 , 3 , 4 para los estudios de expresión . Estudios de expresión del clon YDFE447-61. De una placa de medio sólido YPG, inoculada con una alícuota de un stock en glicerol de los clones YDSE234-1, 2 , 3 y 4 se tomó una colonia de cada clon con las que se inocularon precultivos de 10 mL de medio salino ( (NH4)2S0422 g/L, K2HP0 18.2 g/L, MgS04x7H20 7.5 g/L, CaCl2 0.5 g/L, glicerol 3%, solución de vitaminas 400X 5 mL, solución de sales trazas 1 mL) se incubó 12 h a 250 rpm y a 30°C. De estos precultivos se utilizaron 500 μL para inocular erlenmeyer conteniendo 50 mL de igual medio, los que se incubaron durante 24 h a 30°C y 250 rpm en zaranda. Para cada clon los 50 mL fueron
utilizados a su vez para inocular un erlenmeyer que contenia 500 mL de medio salino. Se incubó durante 12h a 30°C y 250 rpm en zaranda. Este volumen fue utilizado como inoculo de un termentador de 5 L (Marubisshi, Japan) con medio salino suplementado con extracto de levadura al 20%. Las condiciones de la fermentación fueron las siguientes: Se creció 24 horas a 30°C, 500 rpm y 3 vvm de aereación. Se procedió a la inducción del promotor AOX 1 con metanol (BDH, Germany) cuyo el cultivo en crecimiento agotó el glicerol como fuente carbonada, registrado por un incremento del pH cuyo el peso húmedo alcanza aproximadamente los 70 g/L. El flujo de metanol se ajustó teniendo en cuenta el incremento del peso húmedo del cultivo, tomando la experiencia de fermentaciones anteriores con el clon de P. pastoris que expresa el HBsAg (European Patent Application, E.P 480525A2) . Se incrementó a su vez la agitación hasta 750 rpm y la aereación hasta 5 vvm. A las 48 h de fermentación se suministró un suplemento de vitaminas y sales trazas en un % similar al % del medio ya referido, las sales trazas fueron nuevamente suministradas a las 90 h de fermentación a la mitad del % anteriormente empleado. Tras 120 h de fermentación, se colectó la biomasa por centrifugación de todo el volumen en tubos de 1 L a 3000 rpm a 4°C durante 30 min, desechándose el sobrenadante correspondiente al medio de cultivo. La biomasa húmeda obtenida fue lavada con buffer PBS
(pH 7.2) y se pesó para determinar el rendimiento en g/L del proceso fermentativo (aproximadamente 200 g/L) . A continuación fue resuspendida con un volumen de buffer lisis 2X (sacarosa 20 g/L, Tris 4.82 g/L, NaCl 30 g/L, EDTA 3.71 g/L) igual al peso húmedo obtenido, completándose a dos veces el volumen con H20 destilada. La ruptura se realizó por trituración mecánica, pasándose seis veces por un molino celular (DynoMill, USA) y el material obtenido se centrifugó a 3000 rpm durante 30 min. El sobrenadante fue centrifugado
nuevamente a 15000 rpm por 30 min en una ultracentrifuga (Hitachi CSP70H, rotor RP 45T, Japan) . Se tomó el precipitado, el cual fue lavado dos veces con buffer lisis IX. La reactividad especifica para la proteina recombinante fue determinada en el sobrenadante de cultivo mediante un ELISA especifico como se describe a continuación: Ensayo tipo sandwich amplificado, utilizando inmunoglobulinas de sueros humanos (infección secundaria) como recubrimiento, líquidos asciticos hiperinmunes y anticuerpos monoclonales murinos como segundos anticuerpos detectados por un tercer anticuerpo anti ratón conjugado a la enzima peroxidasa. Como resultado se detectó actividad especifica en los cuatro clones testados (Figura 16) . Breve descripción de las figuras
Figura 1: Esquema general de la construcción del plasmidio pDE2-21.
Figura 2: Southern-Blot del Clon de D2. En la figura se aprecian las bandas obtenidas con la digestión EcoRV. La cepa MP-36 fue utilizada como control negativo. Como sonda se utilizó la banda de la envoltura del virus D2. En todos los clones se aprecia unabanda cerca de 1485 pb .
Figura 3: Proteina de envoltura recombinante de VD2 detectada en el precipitado de ruptura por Western Blott utilizando un liquido ascitico hiperinmune anti VD2. Se utilizó como control negativo una preparación similar a partir de un clon transformado con el vector pNAO . A: Precipitado correspondiente al clon de levadura control negativo, B: Precipitado correspondiente al clon de la levadura pDYE2-14, C: Patrón de peso molecular.
Figura 4: Proteina de envoltura de VD2 solubilizada a partir del precipitado utilizando una solución de extracción (PBS urea 8M) detectada por Western Blott utilizando MIAF anti VD2 , A: Proteínas solubles (correspondiente al clon de
levadura control negativo reducida), B: Proteínas solubles (reducidas ) correspondiente al clon de levadura pDYE2-14, C: Proteínas solubles ( no reducidas) correspondiente al clon pDYE2-14, D: Patrón de peso molecular. Figura 5: Esquema general de la construcción del plasmidio pDE4-47.
Figura 6: Southern-Blot del clon YDFE447-61. El ADN fue digerido con la enzima EcoRI y como sonda se utilizó una banda Clal/Sac procedente del plasmidio I pDE4-47. En todos los clones se puede apreciar una banda de aproximadamente 1.203 Kb . En el control utilizado la cepa MP-36 se puede apreciar la banda esperada de 5.5 Kb .
Figura 7 : Western Blott detectando la proteina de envoltura combinante de VD4 en el precipitado utilizando un MIAF anti - VD4 Se utilizó como control negativo una preparación similar a partir de un clon transformado con el vector pFAO . Figura 8: Proteina de envoltura recombinante de VD4 solubilizada a partir del precipitado de extracción (PBS, urea 8M) obtenida a diferentes tiempos durante la fermentación La detección se llevó a cabo por western Blott utilizando un MIAF anti VD4
Figura 9: Western-Blot utilizando como muestra procedente de la precipitación con 50 % de sulfato de amonio. La reactividad se obtuvo con diluciones de 1/500 y 1/1000. En la figura se puede apreciar una reactividad especifica hacia la envoltura nativa del virus .
Figura 10: Antigeno recombinante detectado por immunomicroscopia electrónica en el interior de la levadura. La proteina recombinante se observa formando grandes agregados en el citoplasma de la célula (a) y también de forma particulada (b) . Los puntos negros dispersos indican la inmunodetección especifica. Las partículas se señalan con una flecha .
Figura 11: Esquema general de la construcción del plasmidio pDE2-21ΔEcoRI-7.
Figura 12: Esquema general de la construcción del plasmidio pDSE2-34. Figura 13: Detalles del plasmidio pDSE2-34.
Figura 14: Southern-Blot de los clones YDSE234-1, 2 , 3 , 4. El ADN fue digerido EcoRI . Como sonda se utilizó una banda Ncol/Clal procedente del plasmidio pPS-7. El marcador de peso molecular utilizado fue el ADN del fago lambda digerido Hind III/EcoRI. En el clon 1 se observan bandas cerca de 11 Kb y otra entre 4.6 y 4.9 Kb lo cual confirma la posibilidad de un evento multiintegrativo en este clon. En los otros clones se aprecia una banda de 9.5 Kb (AOXl-SucII-Env-Gapt-His3-3'AOX y los segmentos genómicos a ambos lados del locus AOX1) .En la MP-36 se aprecia la banda esperada de 5.5 Kb .
Figura 15: Southern-Blot de los clones YDSE234-1, 2, 3, 4. El ADN fue digerido con las enzimas EcoRI/EcoRV. Como sonda se utilizó una banda Clal/Sall procedente del plasmidio pDSE2- 34. Como controles se utilizaron el mismo plasmidio digerido Clal/Sall asi como la secuencia de la envoltura del virus D2. El marcador de peso molecular utilizado fue el ADN del fago lambda digerido Hind III/EcoRI. Desde arriba hacia abajo las bandas observadas son: 8.1 kb (AOXl-SucII-Env-Gapt-His3- 3'AOX) , 3 Kb en clon 1 (banda no esperada probablemente debido a un evento multiintegrativo) y en la MP-36 (esperada), 1.1 Kb también en el clon 1 y en la MP-36.
Figura 16: ELISA utilizando una inmunoglobulina humana para detectar la proteina de la envoltura en el sobrenadante de la fermentación .
LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE:
(A) NOMBRE: CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA
(B) DIRECCIÓN: Ave.31 entre 158 y 190
(C) CIUDAD: Ciudad de La Habana (E) PAÍS: CUBA
(F) CÓDIGO POSTA1 (ZIP) : 10600
(G) TELEFONO: 53 7 218466
(H) TELEFAX: 53 7 218070/336008 (A) NOMBRE: INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL PEDRO
KOURI
(B) DIRECCIÓN: Autopista Novia del Mediodia Km 6
(C) CIUDAD: Ciudad de La Habana (E) PAÍS: Cuba (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 11100
(G) TELEFONO: 53 7 220633/220657 (H) TELEFAX: 53 7 335061
(ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA LA EXPRESIÓN DE GENES DE LOS VIRUS DEL DENGUE.
(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 12
(iv) FORMA DE LECTURA COMPUTARIZADA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible
(B) COMPUTADOR: IBM PC compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO)
(vi) DATOS DE SOLICITUD DE PRIORIDAD:
(A) NUMERO DE SOLICITUD: CU 107/96
(B) FECHA DE SOLICITUD: 25-NOV-1996 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 19 bases pares
(B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: Simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia antigenómica del iniciador utilizado para obtener el cADN del viru D2. "
(iv) ANTI-SENTIDO: SI
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO. 1: GGCCTGCTCC ATAGCTCCC 19
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 29 bases pares
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: Simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia del iniciador positivo utilizado para la amplificación de la envoltura del virus D2"
(iv) ANTI-SENTIDO: NO
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO. 2: TCAGATATCA TGCGTTGCAT AGGAATATC 29
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO. 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 30 bases pares
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: Simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia del primer negativo utilizado para la amplificación de la envoltura del virus D2"
(iv) ANTI-SENTIDO: NO
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO. 3: CAGATATCTT AAGCCTGCAC CATAGCTCCC 30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 21 bases pares
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: Simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia del iniciador utilizado para secuenciar la envoltura del virus D2" (iv) ANTI-SENTIDO: SI
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO. 4:
CCCCATCCTC TGTCTACCAT G 21
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 5:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1492 bases pares
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: Doble
(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Dengue virus 2
(B) CEPA: A15
(ix) RASGOS:
(A) NOMBRE/CLAVE: miscelánea
(B) LOCALIZACION:l..1492
( D ) OTRA INFORMACIÓN : /nota= " Secuencia de la envoltura de la cepa A15 del virus del dengue serotipo 2 . "
( xi ) DESCRI PCIÓN DE LA SEC I D NO . 5 : ATGACAATGC GTTGCATAGG AATATCAAAT AGAGACTCTG TAGAAGGGGT TTCAGGAGGA 60
AGCTGGGTTG ACATAGTCTT AGAACATGGA AGCTGTGTGA CGACGATGGC AAAAAACAAA 120
CCAACATTGG ATTTTGAACT GATAAAAACA GAAGCCAAAC AACCTGCCAC TCTAAGGAAG 180 TACTGTATAG AGGCAAAGCT GACCAACACA ACAACAGAAT CTCGCTGCCC AACACAAGGA 240
GAACCCAGCC TAAATGAAGA GCAGGACAAA AGGTTCGTCT GCAAACACTC CATGGTAGAC 300
AGAGGATGGG GAAATGGATG TGGACTATTT GGAAAAGGAG GCATTGTGAC CTGTGCTATG 360
TTCACATGCA AAAAGATCAT GAAAGGAAAA GTCGTGCTGC CAGAAAACTT GGAATACACC 420 ATTGTGATAA CACCTCACTC AGGGGAAGAG CATGCAGTCG GAAATGATAC AGGAAAACAT 480
GGCAAGGAAA TCAAAATAAC ACCACAGAGT TCCATCACAG AAGCAGAGTT GACAGGCTAT 540
GGCACTGTCA CGATGGAGTG CTCTCCGAGA ACGGGCCTCG ACTTCAATGA GATGGTGTTG 600
CTGCAAATGG AAAATAAAGC TTGGCTGGTG CAAAGGCAAT GGTTCCTAGA CCTGCCGTTG 660
CCATGGCTGC CCGGAGCGGA CACACAAGGA TCAAATTGGA TACAGAAAGA GACATTGGTC 720 ACTTTCAAAA ATCCCCACGC GAAGAAACGA GATGTTGTTG TTTTGGGATC CCAAGAAGGG 780
GCCATGCACA CAGCACTCAC AGGGGCCACA GAAATCCAGA TGTCATCAGG AAACGTACTG 840
TTCACAGGAC ATCTCAAGTG CAGGCTGAGG ATGGACAAAC TACAGCTCAA AGGAATGTCA 900
TACTCTATGT GCACAGGAAA GTTTAAAGTC GTGAAGGAAA TAGCAGAAAC ACAACATGGA 960
ACAATAGTTA TCAGAGTACA ATATGAAGGG GACGGCTCTC CATGTAAGAT CCGTTTTGAG 1020 ATAATGGATT TGGAAAAAAG ACATGTTTTA GGTCGCCTGA TTACAGTCAA CCCAATCGTA 1080
ACAGGAAAAG ATAGCCCAGT CAACATAGAA GCAGAACCTC CATTCGGAGA CAGCTACATC 1140
ATCATAGGAG TAGAGCCGGG ACAATTGAAG CTCAACTGGT TTAAGAAAGG AAGTTCTATC 1200
GGCCAAATGT TTGCGACAAC AATGAGGGGA GCGAAGAGAA TGGCCATTTT AGGTGACACA 1260
GCTTGGGATT TTGGATCCCT GGGAGGAGTG TTTACATCTA TAGGAAAGGC TCTCCACCAA 1320 GTTTTCGGAG CAATCTATGG GGCTGCCTTC AGTGGGGTCT CATGGACTAT GAAAATCCTC 1380
ATAGGAGTCA TTATCACATG GATAGGAATG AATTCACGCA GCACCTCACC GTCTGTGTCA 1440
CTAGTATTGG TGGGAGTCGT AACGCTGTAT TTGGGAGTTA TGGTGCAGGC CG 1492
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO .6
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 bases pares
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: Simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia del iniciador positivo utilizado para amplificar la envoltura del virus D4"
(iv) ANTI-SENTIDO: NO
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO. 6: GGGAATTCTA TGCGATGCTT AGGAGTAGGA 30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 7:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 bases pares (B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLEUCLA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia del iniciador negativo utilizado para amplificar la envoltura del virus D4"
(iv) ANTI-SENTIDO: SI (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO. 7:
GGGAATTCTT AAAACATCCT GCCAATGGAA CT 32
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 8:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 18 bases pares
(B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: Simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia del iniciador utilizado para verificar por secuenciación la unión de la envoltura de D4 al vector de expresión"
(iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO. 8:
ACTATTGCCA GCATTGCT 18
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 9:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 1203 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: Doble
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Dengue virus 4
(B) CEPA: 814669
(ix) RASGOS: (A) NOMBRE/CLAVE: miscelánea
(B) LOCALIZACION:l..1203
(D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Secuencia de la envoltura del virus D4 utilizado." (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO. 9:
ATGCGATGCG TAGGAGTAGG AAACAGAGAC TTTGTGGAAG GAGTCTCAGG TGGAGCATGG 60 GTCGACCTAG TGCTAGAACA TGGAGGATGC GTCACAACCA TGGCCCAAGG AAAACCAACC 120
TTGGATTTTG AACTGACTAA GACAACAGCC AAGGAAGTGG CTCTGTTAAG AACCTATTGC 180
ATTGAAGCCT CAATATCAAA CATAACTACG GCAACAAGAT GTCCAACGCA AGGAGAGCCT 240 TATCTGAAAG AGGAACAGGA CCAACAGTAC ATTTGCCGGA GAGATGTGGT AGACAGAGGG 300
TGGGGCAATG GCTGTGGCTT GTTTGGAAAA GGAGGAGTTG TGACATGTGC GAAGTTTTCA 360
TGTTCGGGGA AGATAACAGG CAATTTGGTC CGAATTGAGA ACCTTGAATA CACAGTGGTT 420
GTAACAGTCC ACAATGGAGA CACCCATGCA GTAGGAAATG ACACATCCAA TCATGGAGTT 480
ACAGCCATGA TAACTCCTAG GTCACCATCG GTGGAAGTCA AATTGCCGGA CTATGGAGAA 540 CTAACACTCG ATTGTGAACC AGGTCTGGAA TTGTACTTTA ATGAGATGAT TCTGATGAAA 600
ATGAAAAAGA AAACATGGCT CGTGCATAAG CAATGGTTTT TGAATCTGCC TCTTCCATGG 660
ACAGCAGGAG CAGACACATC AGAGGTTCAC TGGAATTACA AAGAGAGAAT GGTGACATTT 720
AAGGTTCCTC ATGCCAAGAG ACAGGATGTG ACAGTGCTGG AATCTCAGGA AGGAGCCATG 780
CATTCTGCCC TCGCTGGAGC CACAGAAGTG GACTCCGGTG ACGGAAATCA CATGTTTGCA 840 GGACATCTTA AGTGCAAAGT CCGTATGGAG AAATTGAGAA TCAAGGGAAT GTCATACACG 900
ATGTGTTCAG GAAAGTTTTC AATTGACAAA GAGATGGCAG AAACACAGCA TGGGACAACA 960
GTGGTGAAAG TCAAGTATGA AGGTGCCGGA GCTCCGTGTA AAGTCCCCAT AGAGATAAGA 1020
GATGTAAACA AGGAAAAAGT GGTTGGGCGT ATCATCTCAT CCACCCCTTT GGCTGAGAAT 1080
ACCAACAGTG TAACCAACAT AGAATTAGAA CGCCCTTTGG ACAGCTACAT AGTGATAGGT 1140 GTTGGAAACA GCGCATTAAC ACTCCATTGG TTCAGGAAAG GGAGTTCCAT TGGCAAGATG 1200
TTT 1203
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 10:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 bases pares (B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: Simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia del iniciador utilizado para verificar por secuenciación la modificación de la envoltura D2. "
(iv) ANTI-SENTIDO: NO
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO. 10: TCATGGACTA TGAAAATCCT 20
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 11:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1416 bases pares (B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: Doble
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Dengue virus 2
(B) CEPA: A15 (ix) RASGOS:
(A) NOMBRE/CLAVE: miscelánea
(B) LOCALIZACION:l..1416
( D ) OTRA INFORMACIÓN : /nota= " Secuencia de la envoltura de la cepa A15 del virus dengue serotipo 2 truncada . "
( xi ) DESCRI PCIÓN DE LA SEC I D NO . 11 : ATGACAATGC GTTGCATAGG AATATCAAAT AGAGACTCTG TAGAAGGGGT TTCAGGAGGA 60
AGCTGGGTTG ACATAGTCTT AGAACATGGA AGCTGTGTGA CGACGATGGC AAAAAACAAA 120
CCAACATTGG ATTΪTGAACT GATAAAAACA GAAGCCAAAC AACCTGCCAC TCTAAGGAAG 180 TACTGTATAG AGGCAAAGCT GACCAACACA ACAACAGAAT CTCGCTGCCC AACACAAGGA 240
GAACCCAGCC TAAATGAAGA GCAGGACAAA AGGTTCGTCT GCAAACACTC CATGGTAGAC 300
AGAGGATGGG GAAATGGATG TGGACTATTT GGAAAAGGAG GCATTGTGAC CTGTGCTATG 360
TTCACATGCA AAAAGATCAT GAAAGGAAAA GTCGTGCTGC CAGAAAACTT GGAATACACC 420
ATTGTGATAA CACCTCACTC AGGGGAAGAG CATGCAGTCG GAAATGATAC AGGAAAACAT 480
GGCAAGGAAA TCAAAATAAC ACCACAGAGT TCCATCACAG AAGCAGAGTT GACAGGCTAT 540 GGCACTGTCA CGATGGAGTG CTCTCCGAGA ACGGGCCTCG ACTTCAATGA GATGGTGTTG 600
CTGCAAATGG AAAATAAAGC TTGGCTGGTG CAAAGGCAAT GGTTCCTAGA CCTGCCGTTG 660
CCATGGCTGC CCGGAGCGGA CACACAAGGA TCAAATTGGA TACAGAAAGA GACATTGGTC 720
ACTTTCAAAA ATCCCCACGC GAAGAAACGA GATGTTGTTG TTTTGGGATC CCAAGAAGGG 780
GCCATGCACA CAGCACTCAC AGGGGCCACA GAAATCCAGA TGTCATCAGG AAACGTACTG 840 TTCACAGGAC ATCTCAAGTG CAGGCTGAGG ATGGACAAAC TACAGCTCAA AGGAATGTCA 900
TACTCTATGT GCACAGGAAA GTTTAAAGTC GTGAAGGAAA TAGCAGAAAC ACAACATGGA 960
ACAATAGTTA TCAGAGTACA ATATGAAGGG GACGGCTCTC CATGTAAGAT CCGTTTTGAG 1020
ATAATGGATT TGGAAAAAAG ACATGTTTTA GGTCGCCTGA TTACAGTCAA CCCAATCGTA 1080
ACAGGAAAAG ATAGCCCAGT CAACATAGAA GCAGAACCTC CATTCGGAGA CAGCTACATC 1140 ATCATAGGAG TAGAGCCGGG ACAATTGAAG CTCAACTGGT TTAAGAAAGG AAGTTCTATC 1200
GGCCAAATGT TTGCGACAAC AATGAGGGGA GCGAAGAGAA TGGCCATTTT AGGTGACACA 1260
GCTTGGGATT TTGGATCCCT GGGAGGAGTG TTTACATCTA TAGGAAAGGC TCTCCACCAA 1320
GTTTTCGGAG CAATCTATGG GGCTGCCTTC AGTGGGGTCT CATGGACTAT GAAAATCCTC 1380
ATAGGAGTCA TTATCACATG GATAGGAATG AATTAA 1 16
[ 2 ] INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO. 12
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases pares (B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: Simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) MOLECULE TYPE : otra ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia del iniciador utilizado para la secuenciación del extremo 5' de la banda de la envoltura en la región al extremo 3' del SucII."
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID NO. 12:
CCCCATCCTC TGTCTACCAT G 21
Claims
1. Polinucleótidos recombinantes caracterizados porque comprenden esencialmente una secuencia nucleotidica que contenga al menos una parte la proteina E de Flavivirus además de una secuencia nucleotidica de un vector de clonación o expresión para levaduras.
2. Polinucleótidos recombinantes caracterizados porque comprende esencialmente una secuencia nucleotidica o de por lo menos una parte de las secuencias nucleotidicas codificantes para la proteina E proveniente de los virus del dengue de tipo 2 de la cepa A15 identificadas con los Id. No. 5 y No. 11, y de tipo 4 de la cepa 814669 identificada con el Id. No. 9 en el listado de secuencias.
3. Polinucleótidos recombinantes según la reivindicación 1 caracterizados porque son los vectores de expresión pDE2-21, pDFE4-47 y pDSE2-34.
4. Microorganismos transformados caracterizados porque contienen los polinucleótidos recombinantes de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 y 3, y expresan la proteina E recombinante los virus de dengue de tipo 1, 2, 3 y 4 respectivamente .
5. Microorganismo transformado de acuerdo con la reivindicación 4 caracterizado porque es la cepa de levadura P. pastoris, MP-36, transformada con el vector de expresión pDE2-21.
6. Microorganismo transformado según reivindicación 4 caracterizado porque es la cepa de levadura P. pastoris, MP- 36, transformada con el vector de expresión pDFE -47.
7. Microorganismo transformado según reivindicación 4 caracterizado porque es la cepa de levadura P. pastoris, MP- 36, transformada con el vector de expresión pDSE2-34.
8. Microorganismo transformado de acuerdo con la reivindicación 5 caracterizado porque es la cepa de levadura YDE221 clones 13,14, 21 y 22 que expresan la proteina E del virus del dengue de tipo 2.
9. Microorganismo transformado según reivindicación 6 caracterizado porque es la cepa de levadura YDFE447 clones 61, 74 y 75 que expresan la proteina E del virus del dengue de tipo 4.
10. Microorganismo transformado de acuerdo con la reivindicación 7 caracterizado porque es la cepa de levadura YDSE 34, clones 1,2,3,4, que expresan una forma truncada de la proteina E del virus del dengue de tipo 2.
11. Sustancia proteinácea de acuerdo con la reivindicación 8 caracterizada porque es el producto de expresión de la cepa de levadura YDE221 clones 13,14, 21 y 22.
12. Sustancia proteinácea de acuerdo con la reivindicación 9 caracterizada porque es el producto de expresión de la cepa de levadura YDFE447 clones 61, 74 y 75.
13. Sustancia proteinácea de acuerdo con la reivindicación 10 caracterizada porque es el producto de expresión de la cepa de levadura YDSE234, clones 1,2,3,4.
14. Sustancia proteinácea según la reivindicación 11, caracterizada porque comprende una secuencia aminoacidica que corresponde esencialmente con la secuencia de aminoácidos o de por lo menos una parte de la proteina E proveniente del virus del dengue de tipo 2 obtenida por via recombinante, identificada con el Id. No. 5 en el listado de secuencias.
15. Sustancia proteinácea según la reivindicación 12, caracterizada porque comprende una secuencia aminoacidica que corresponde esencialmente con la secuencia de aminoácidos o de por lo menos una parte de la proteina E proveniente del virus del dengue de tipo 4 obtenida por via recombinante identificada con el Id. No. 9 en el listado de secuencias
16. Sustancia proteinácea según la reivindicación 13, caracterizada porque comprende una secuencia aminoacidica que corresponde esencialmente con la secuencia de aminoácidos o de por lo menos una parte de la proteina E proveniente del virus del dengue de tipo 2 obtenida por via recombinante identificada con el Id. No. 11 en el listado de secuencias.
17. Sustancia proteinácea particulada según la reivindicación 11, caracterizada porque comprende una secuencia aminoacidica que corresponde esencialmente con la secuencia de aminoácidos o de por lo menos una parte de la proteina E proveniente del virus del dengue de tipo 2 obtenida por via recombinante, identificada con el Id. No. 5 en el listado de secuencias.
18. Sustancia proteinácea particulada según la reivindicación
12, caracterizada porque comprende una secuencia aminoacidica que corresponde esencialmente con la secuencia de aminoácidos o de por lo menos una parte de la proteina E proveniente del virus del dengue de tipo 4 obtenida por via recombinante identificada con el Id. No. 9 en el listado de secuencias.
19. Sustancia proteinácea particulada según la reivindicación
13, caracterizada porque comprende una secuencia aminoacidica que corresponde esencialmente con la secuencia de aminoácidos o de por lo menos una parte de la proteina E proveniente del virus del dengue de tipo 2 obtenida por via recombinante identificada con el Id. No. 11 en el listado de secuencias.
20. Una preparación farmacéutica que comprende un vehículo, diluyente o adyuvante apropiado caracterizado porque contiene una o la combinación de las sustancias proteináceas de las reivindicaciones 14, 15 16, 17, 18 y/o 19.
21. Una preparación diagnóstica que comprende un vehículo o diluyente apropiado caracterizado porque contiene una o la combinación de las sustancias proteináceas de las reivindicaciones 14, 15 16, 17, 18 y/o 19.
22. Un procedimiento para preparar la sustancia proteinácea recombinante de las reivindicaciones 14, 15 16 17, 18 y 19 caracterizado porque comprende las etapas de transformar una levadura con cualquiera de los polinucleótidos recombinantes de la reivindicación 1, cultivar los microorganismos transformados para obtener la expresión de dichas proteínas y purificar dichos productos de expresión.
23. Un procedimiento para aislar y expresar el gen que codifica para la proteina E, completa o truncada proveniente del virus del dengue 2, caracterizado porque el gen que codifica para esta proteina es aislado a partir de ARN total de la cepa A 15 de virus del dengue de tipo 2 utilizando el primer identificado con el Id. No. 1 en el listado de secuencias, y a partir de una reacción de PCR se amplifica dicho gen utilizando los primers identificados con No. 2 y No. 3 en el listado de secuencias, siendo posteriormente clonado para obtener un ADN recombinante el cual es transformado en el mencionado hospedero.
24. Un procedimiento para aislar y expresar el gen que codifica para la proteina E proveniente del virus del dengue de tipo 4, y su uso en preparaciones vacunales caracterizado porque el gen que codifica para esta proteina es aislado a partir la cepa 814669 utilizando las sondas identificadas con No. 6 y No. 7 en el listado de secuencias por una reacción de PCR de acuerdo con lo descrito para el aislamiento del gen que codifica para dicha proteina, y dicho gen es clonado para obtener un ADN recombinante el cual es transformado en el mencionado hospedero.
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