ES2235310T3 - Epitopos de la proteina pre-m/m del virus del dengue, peptidos sinteticos. - Google Patents
Epitopos de la proteina pre-m/m del virus del dengue, peptidos sinteticos.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DE CINCO PEPTIDOS SINTETICOS PERTENECIENTES A LA PROTEINA PRE - M/M DEL VIRUS DENGUE - 2 CORRESPONDIENTES A LAS SECUENCIAS AMINOACIDAS 3-31-, 45-67, 57-92, 69-93 Y 103-124. LA RESPUESTA INMUNE A LOS PEPTIDOS FUE EVALUADA EN RATONES. SE CONSTRUYERON TAMBIEN PROTEINAS DE FUSION RECOMBINANTES QUE INCLUYEN REGIONES DE PRE - M/M. SE COMPROBO LA PRESENCIA DE EPITOPES PARA CELULAS B DE RATONES Y DE HUMANOS EN LOS PEPTIDOS DE LA PROTEINA PRE - M/M DEL VIRUS DENGUE. LOS PEPTIDOS 3-31 Y 103-124 INDUJERON ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES CONTRA LOS CUATRO SEROTIPOS DEL VIRUS DENGUE. LOS ESTUDIOS DE LINFOPROLIFERACION CON LOS PEPTIDOS 57-92 Y 3-31 MOSTRARON RECONOCIMIENTO CRUZADO DE CELULAS T PEPTIDO - ESPECIFICAS AL VIRUS. LOS RATONES RETADOS CON EL VIRUS DENGUE - 2 MOSTRARON PROTECCION INDUCIDA POR LOS PEPTIDOS 3-31, 57-92 Y 69-93. ASI, LA PRESENCIA DE EPITOPES SECUENCIALES EN LA PROTEINA PRE - M/M DEL VIRUS DENGUE - 2 Y LA POSIBLE RELEVANCIA DE LOS MISMOS EN LA RESPUESTA INMUNECONTRA DICHO FLAVIVIRUS QUEDA DEMOSTRADA.
Description
Epítopos de la proteína pre-M/M
del virus del dengue, péptidos sintéticos.
La presente invención pertenece al campo de la
biotecnología y se refiere a técnicas de DNA recombinante, en
particular, a la producción de péptidos sintéticos que codifican la
proteína pre-M/M del serotipo 2 del virus del Dengue
y proteínas quiméricas que contienen epítopos de la proteína
pre-M/M de los serotipos 2 y 4 del virus del
Dengue.
El objetivo técnico es identificar epítopos
protectores y neutralizantes de Pre-M/M, que
presentan reacciones cruzadas con todos los serotipos del virus del
dengue, para obtener un inmunógeno para vacunación humana.
El virus del dengue pertenece al género
Flavivirus, familia Flaviviridae (Westaway, E.G. y
col., 1985. Flaviviridae. Intervirol. 24, pág. 183).
Es un virus encapsulado con una sola cadena de RNA de polaridad
positiva como material genético, que codifica una poliproteína
procesada de manera cotransduccional y postransduccional por acción
de proteasas celulares y víricas.
Existen dos proteínas estructurales en la
membrana vírica: la proteína E (de la Envoltura) y la proteína M (de
la Membrana), aunque existen varias copias de la otra proteína
estructural, proteína C (de la Cápside) que constituyen la
nucleocápside isométrica. Además, se han identificado al menos siete
proteínas no estructurales (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b,
NS5).
Las glicoproteínas E y NS1 son capaces de ofrecer
individualmente una protección activa y pasiva frente al serotipo
homólogo del virus del Dengue, al mismo tiempo que se preserva la
complejidad altamente conformacional de los epítopos relevantes.
Por esta razón, los sistemas de células eucarióticas recombinantes
se han seleccionado principalmente para la evaluación inmunológica
de estas proteínas, por ejemplo, de virus de la viruela vacuna
(Bray, M. y col., 1989, Mice immunized with recombinant Vaccinia
virus expressing dengue-4 structural proteins with
or without nonstructural protein NS1 are protected against fatal
dengue virus encephalitis. J. Virol., 63, pág. 2853) y de
baculovirus (Zhang, Y.M. y col., 1988. Immunization of mice with
dengue structural proteins and non-structural
protein NS1 expressed by baculovirus recombinant induces resistence
to dengue virus encephalitis. J. Virol. 62, pág.
3027).
La pequeña proteína M (8 kDa) se sintetiza en
forma de un precursor glicosilado denominado pre-M
(de aproximadamente 22 kDa, que experimenta una escisión
endoproteolítica posterior, justo antes o después de la liberación
del virus por la célula infectada (Murray, J. M. y col. 1993.
Processing of the dengue virus type 2 proteins prM and
C-prM. J. Gen. Virol. 74, pág. 175). La
escisión que probablemente realiza una proteasa celular, parece
tener lugar en las vesículas ácidas del post-Golgi,
siendo inhibida por agentes que desestabilizan el bajo pH de estas
vesículas (Randolph, V.B. y col. 1990. Acidotropic amines
inhibit proteolytic of Flavivirus prM protein. Virol.
174, pág. 450). El pre-fragmento se ha identificado
in vitro únicamente en el medio extracelular, y su destino
in vivo permanece desconocido (Murray, J.M. y col., 1993.
Processing of the dengue virus type 2 proteins prM and
C-prM. J. Gen. Virol. 74, pág. 175).
Se piensa que la función de pre-M
durante el transporte exocítico del Flavivirus es evitar la
activación del dominio de membrana fusogénico de E con el pH ácido
del entorno (Randolph, V.B. y col. 1990. Acidotropic amines
inhibit proteolytic of Flavivirus prM protein. Virol.
174, pág. 450); si este evento tiene lugar, se prevendrá la
liberación vírica. De hecho, se ha determinado que
pre-M y E interaccionan en los viriones inmaduros
intracelulares (Wengler, G. y Wengler, G. 1989.
Cell-associated West Nile flavivirus is covered
with E+pre-M protein heterodimers which are
destroyed and reorganized by proteolytic cleavage during virus
release. J. Virol. 63, pág. 2521), y que la conformación
natural de E se adquiere solamente en presencia de
pre-M (Konishi, E. y Mason, P.W. 1993. Proper
maturation of the Japanese encephalitis virus envelope glycoprotein
requires cosynthesis with the premembrane protein. J. Virol.
67, pág. 1672). Además, los viriones ya liberados que únicamente
llevan pre-M en sus membranas, muestran, en general,
una infectividad menor que los viriones completamente maduros
(Wengler, G. y Wengler, G. 1989. Cell-associated
West Nile flavivirus is covered with E+pre-M
protein heterodimers which are destroyed and reorganized by
proteolytic cleavage during virus release. J. Virol. 63,
pág. 2521), en los que, aunque M y pre-M están
presentes, la primera de ellas es predominante.
Las proteínas Pre-M y M ofrecen
una protección activa cuando han sido expresadas en el virus
recombinante de la viruela vacuna, pero esto no sucede con el
pre-fragmento (Bray, M. y Lai, C.-J. 1991. Dengue
virus premembrane and membrane proteins elicit a protective immune
response. Virol. 185, pág. 505), aparte de que la
combinación de pre-M o M con la glicoproteína E en
el mismo virus recombinante de la viruela vacuna, produce niveles
generales de protección mayores que los alcanzados con cada una de
las proteínas de manera individual. De manera similar, algunos
anticuerpos dirigidos contra pre-M son capaces de
ejercer una protección pasiva en ratones (Kaufman, B.M. y col. 1989.
Monoclonal antibodies for dengue virus prM glycoprotein protect
mice against lethal dengue infection. Am. J. Trop. Med.
& Hyg. 41, pág. 576).
El uso de péptidos sintéticos ha permitido
establecer la base molecular de la antigenicidad de acuerdo con la
conformación espacial y las propiedades inmunológicas del antígeno
implicado (Arnon, R. y Sela, M. 1985. Synthetic Vaccines:
present and future. Ann. Inst. Pasteur/Immunol. 136 D,
271-282]. Los péptidos sintéticos en forma de
subunidades vacunales anti-dengue permiten incluir
en la formulación final solamente los epítopos protectores que no
producen inmuno-amplificación (Halstead, S.B. y
O'Rourke, E.J. 1977. Dengue viruses and momonuclear phagocytes.
I. Infection enhancement by non-neutralizing
antibody. J. Exp. Med. 146, pág. 201; Halstead, S.B.
1979. In vivo enhancement of dengue virus infection in rhesus
monkeys by passively transferred antibody. J. Infect.
Dis. 140, pág. 527), o como alternativa, permiten incluir
péptidos protectores de cada uno de los cuatro serotipos. La
caracterización de los determinantes antigénicos de E y NS1 se ha
llevado a cabo con éxito. Sin embargo, no existen estudios
similares sobre la también importante proteína
pre-M/M, y ese es el porqué los que los resultados
de esta publicación constituyen un primer paso en esa
dirección.
Los intentos realizados para expresar las
proteínas pre-M, M y E de Flavivirus en E.
coli no siempre han dado resultados (Chambers, T.J. y col.
1990. Production of yellow fever virus proteins in infected
cells: identification of discrete polyprotein species and analysis
of cleavage kinetics using region-specific
polyclonal antiserum. Virol. 177, pág. 159; Yan, B.-S. y
col. 1994. Truncating the putative membrane association region
circumvents the difficulty of expressing hepatitis C virus protein
E1 in Escherichia coli. J. Virol. Meths. 49, pág. 343).
Al parecer, las regiones hidrófobas que estas proteínas tienen en la
parte C-terminal son la causa de los niveles bajos
o indetectables de expresión heteróloga (Yan, B.-S. y col. 1994.
Truncating the putative membrane association region circumvents
the difficulty of expressing hepatitis C virus protein E1 in
Escherichia coli. J. Virol. Meths. 49, pág. 343).
La expresión de estas proteínas (así como de NS1)
en E. coli, en general se ha obtenido mediante fusión
(fragmentada o no fragmentada) con otras proteínas bacterianas [p.
ej. con \beta-galactosidasa (Cane, P.A. y Gould,
E.A. 1988. Reduction of yellow fever mouse neurovirulence by
immunizatión with a bacterially synthesized
non-structural protein (NS1) fragment. J.
Gen. Virol. 69, pág. 1241), TRPE (Megret, F. y col., 1992.
Use of recombinant fusion proteins and monoclonal antibodies to
define linear and discontinuous antigenic sites on the Dengue
envelope glycoprotein. Virol. 187, pág. 480) y con la
proteína A de Staphylococcus aureus (Murray, J.M. y col.
1993. Processing of the dengue virus type 2 proteins prM and
C-prM. J. Gen. Virol. 74, pág. 175)]. En
estas proteínas de fusión la mayoría de los epítopos
conformacionales relevantes están ausentes, porque aunque los
antisueros generados frente a ellas son capaces de reconocer el
virus completo, no son capaces de neutralizarlo o de inhibir sus
propiedades hemaglutinantes (Megret, F. y col. 1992. Use of
recombinant fusion proteins and monoclonal antibodies to define
linear ans discontinuous antigenic sites on the Dengue envelope
glycoprotein. Virol. 187, pág. 480). Sin embargo,
publicaciones recientes muestran que la solubilidad de las proteínas
de fusión, y como consecuencia de ello, el uso de métodos no
desnaturalizantes para su purificación, puede conservar muchos de
los epítopos neutralizantes (Seif, S.A. y col. 1995. Finer
mapping of neutralizing epitope(s) on the
C-terminal of Japanese encephalitis virus
E-protein expressed in recombinant Escherichia coli
systems. Vaccine 13, pág. 1515) y protectores
(Srivastava, A.K. y col., 1995. Mice immunized with a dengue
type 2 virus E and NS1 fusion protein made in Escherichia coli are
protected against lethal dengue virus infection. Vaccine 13,
pág. 1251) que estas proteínas poseen.
En el caso de pre-M, su
pre-dominio contiene 6 cisteínas implicadas en 3
puentes disulfuro, así como un sitio de glicosilación en la
asparagina 69. La estructura de E y NS1 es aún más complicada;
incluye 6 puentes disulfuro y varios sitios de
N-glicosilación. Sin embargo, el pequeño ectodominio
de M está aparentemente libre de esas complejidades
conformacionales porque no contiene cisteínas, y está no
glicosilado en su forma natural.
La inserción de fragmentos heterólogos en áreas
permisivas de proteínas inmunogénicas cuya topología es más o menos
conocida, y la inmunización con estos productos de fusión es una
alternativa complementaria al uso de péptidos sintéticos. Ambas
estrategias permiten definir la presencia de epítopos secuenciales
de células B así como de células T. La importancia biológica de
estos epítopos puede ser evaluada experimentalmente para decidir si
incluirlos o no en determinadas preparaciones de vacunas.
Cinco péptidos de la proteína
Pre-M/M del virus Dengue 2, que cubren el 58% de la
secuencia de aminoácidos (97/166 AA) se sintetizaron por métodos
químicos. Estos péptidos corresponden a las secuencias de
aminoácidos 3-31; 45-67;
57-92; 69-93; y
103-124, que posteriormente fueron denominados B
19-6; B 20-2; B
19-5; B 20-1; y B
20-3 respectivamente.
Los péptidos conjugados o no conjugados con una
proteína transportadora, se inocularon en ratones Balb/c. Los sueros
obtenidos después de la inmunización con los péptidos conjugados,
se ensayaron mediante neutralización in vitro, reducción del
número de calvas, y ELISA. También se estudió la protección activa
frente a una provocación de una respuesta inmunológica con el virus
Dengue 2 en los ratones inmunizados.
En el caso de los ratones inmunizados con los
péptidos no conjugados, la respuesta de los anticuerpos se evaluó
mediante el ensayo ELISA y también se evaluó la respuesta
proliferativa de linfocitos T esplénicos frente al virus Dengue
2.
También se obtuvieron proteínas de fusión, y dos
de las cuatro regiones abarcadas por los péptidos
(1-42 y 92-133) se insertaron en
ellas y se expresaron en bacterias E. coli. La inmunización
con estas fusiones complementa los resultados obtenidos con los
péptidos sintéticos.
Se demostró la presencia de epítopos para las
células B tanto en ratones como en seres humanos ya que los péptidos
fueron reconocidos por anticuerpos procedentes de ratones
inmunizados y por sueros de pacientes que presentaban el diagnóstico
clínico y serológico del virus del Dengue, usando el ensayo ELISA en
ambos casos. Los péptidos 19-6 y
20-3 fueron capaces de inducir la producción de
anticuerpos neutralizantes frente a los cuatro serotipos del virus
del Dengue.
Se mostraron respuestas proliferativas
específicas del virus en ratones inmunizados con los péptidos
19-6 y 19-5 no conjugados. Los
ratones inmunizados con los péptidos 19-6,
20-1 y 19-5 conjugados mostraron un
nivel de protección estadísticamente significativo cuando se
sometieron a la provocación de una respuesta inmunológica con el
virus Dengue 2.
De esta manera quedó demostrada la presencia de
epítopos secuenciales en la proteína pre-M/M del
virus Dengue-2, así como la relevancia de estos
epítopos en la respuesta inmunológica frente a estos flavivirus.
Se aplicaron diferentes métodos teóricos para
predecir las regiones antigénicas en la proteína
pre-M/M del virus Dengue-2. Estas
regiones son las que tienen más probabilidad de ser reconocidas por
los anticuerpos obtenidos contra las proteínas víricas, así como de
generar anticuerpos que reconozcan las proteínas originales. Se
aplicaron algunos de los métodos utilizados para predecir epítopos
para células T.
Se encontraron cinco péptidos iniciales que
contenían posibles epítopos para células B y para células T (4 en
pre-M y 1 en M). El estudio de la estructura
antigénica de estas proteínas y la determinación experimental de los
posibles péptidos inmunológicamente importantes se basó en este
descubrimiento.
Los métodos usados para predecir la antigenicidad
se basaron en la secuencia de aminoácidos, ya que ni la estructura
tridimensional de la proteína pre-M/M del virus del
Dengue ha sido determinada experimentalmente, ni existe una
similitud significativa a nivel de secuencia con alguna otra
proteína de estructura tridimensional conocida.
La cepa A 15 del virus Dengue 2, aislada en Cuba
en 1.981 (Kourí, G. y col. 1986. Hemorrhagic dengue in Cuba:
history of an epidemic. Bull. P.A.H.O. 20, pág, 24) se
usó para llevar a cabo este ejemplo. Las regiones potencialmente
antigénicas se seleccionaron conforme a los siguientes
criterios:
a) regiones de alta predisposición antigénica
conforme a diferentes métodos de predicción basados en el carácter
hidrófilo (Hoop, T.P. y Woods, K.R. 1981. Prediction of protein
antigenic determinants from aminoacid sequences. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 78, pág. 3824; Parker, J.M.R. y col., 1986.
New Hydrophility sale derived from HPLC peptide retention data:
correlation of predicted surface residues with antigenicity and
X-ray derived accesible sites. Biochemistry 25,
pág. 5425), en la flexibilidad (Karplus, P.A. y Schultz, G.E. 1985.
Prediction of chain flexibility in proteins. A tool for the
selection of peptide antigens. Naturwissenschaften 72,
pág. 212) y en la accesibilidad (Emini, E.A. y col., 1985.
Induction of hepatitis A virus-neutralizing
antibody by a virus specific synthetic peptide. J. Virol.
55, pág. 836).
b) regiones con alta posibilidad de formar bucles
y giros conforme a predicciones de estructura secundaria que usan
PHD (Rost, B. y Sander, C. 1993. Prediction of protein secondary
structure at better than 70% accuracy. J. Mol. Biol.
232, pág. 584); Rost, B. y Sander, C. Combining evolutionary
information and neural networks to predict protein secondary
structure. Proteins 19, pág. 55; Rost, B. y Sander, C.
1994. Conservation and prediction of solvent accessibility in
protein families. Proteins 20, pág. 216).
c) regiones con una alta variabilidad que
incluyen o no inserciones/supresiones con respecto a otros
flavivirus, así como regiones de glicosilación potenciales,
presentes en otros flavivirus, que se usan o no en el virus del
Dengue.
La Figura 1 muestra los perfiles que se obtienen
al aplicar a segmentos de pre-M y M 4 propiedades de
los aminoácidos relacionadas con la antigenicidad
(Pre-M a la izquierda, M a la derecha). En la región
de pre-M existe un alto carácter hidrófilo y unos
altos valores de accesibilidad en las regiones que contienen los
residuos 6-9, 16-21,
28-31, 42-47, 58-65
y 82-91. En la proteína M, existe una extensa
región hidrófoba entre los residuos 41-76, que
corresponde a las hélices de la región de transmembrana que se cree
que están expuestas al sistema inmunológico. En el pequeño
ectodominio de M (residuos (1-40) la región de
mayor carácter hidrófilo/accesibilidad se extiende entre los
aminoácidos 13-31, especialmente en su comienzo (AA
13-16).
La Figura 2 muestra las predicciones de la
estructura secundaria y la accesibilidad de los segmentos de
pre-M y M conforme al programa PHD. Los resultados
de las predicciones muestran que muchas regiones potencialmente
antigénicas (conforme a los perfiles de la Figura 1) tienen
predisposición para formar bucles/giros \beta con residuos
expuestos en la superficie de la proteína. La formación de las
hélices de la región de transmembrana se pronostica para la región
situada entre los aminoácidos 41-76 de la proteína
M, y esto está de acuerdo con el carácter hidrófobo de esta región
y sugiere que los péptidos antigénicos de M se encuentran
principalmente en el ectodominio (1-40).
En general, las regiones que no están expuestas
al disolvente están más conservadas en las familias de proteínas
homólogas. Por lo tanto, las regiones de mayor variabilidad tienen
una mayor probabilidad de estar expuestas.
En el caso de los virus, la variabilidad es
también un mecanismo de escape para la presión inmunológica; por
supuesto que esto no excluye que algunas regiones conservadas
pudieran ser antigénicas o que pueda haber regiones conservadas
situadas en la superficie.
El análisis de las secuencias de regiones de
pre-M y M de 15 cepas aisladas de los 4 serotipos
del virus del Dengue muestra que al menos el 69% de los residuos
está estrictamente conservado. Los residuos variables más
importantes se encuentran en las posiciones 28-30,
55-59, 69-72 y 80-83
de pre-M, así como en las posiciones
27-30 de M. En general, estas zonas corresponden a
los máximos de los perfiles antigénicos de la Figura 1.
La comparación de las secuencias de estas
regiones en más de 30 cepas aisladas de flavivirus muestra que la
región 1-33 de pre-M es altamente
variable, con posible bucles predispuestos a experimentar
inserciones /supresiones (en las posiciones 8 y 30) y con varios
sitios potenciales de N-glicosilación. Por el
contrario, la variabilidad es menor en el dominio
33-91 de pre-M; hay algunas
posiciones estrictamente conservadas en todos los flavivirus, por
ejemplo: 6 cisteínas que forman 3 puentes disulfuro, al menos 5
residuos ácidos en la región 40-65, así como la
secuencia básica 87-91, detrás de la cual tiene
lugar la escisión endoproteolítica justo antes o durante la
liberación de los virus maduros (Figura 3).
La Asn-69, residuo conservado en
el complejo antigénico del virus del Dengue, es el único sitio de
N-glicosilación de la proteína
pre-M/M del complejo. Sin embargo, en la familia
Flaviviridae esta región está en un posible bucle expuesto
de alta variabilidad. Al mismo tiempo, los residuos de
pre-M/M del virus del Dengue correspondientes a los
sitios de N-glicosilación potenciales de otros
Flavivirus (por ejemplo, AA 14 en JE, SLE, MVE YF y AA 32 en LI,
LAN, YF TBE) son giros \beta situados cerca de zonas consideradas
antigénicas.
La predicción se realizó mediante dos métodos
independientes: el método del patrón de Rothbard y Taylor (Rothbard,
J.B. y Taylor, W.R. 1988. A sequence pattern common to
T-cell epitopes. EMBO J. 7, pág. 93) y la
determinación de fragmentos con predisposición a formar estructuras
en hélice alfa (AMPHI 7 y 11) (Margalit, H. y col. 1987.
Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from
the primary sequence. J. Immunol. 138, pág. 2213). Los
resultados se muestran en la Figura 4.
La determinación de péptidos neutralizantes y
protectores en general es muy importante para el desarrollo de
vacunas más eficaces, y los péptidos de regiones de alta
predisposición antigénica son muy útiles para su identificación; en
especial, la de los péptidos de naturaleza lineal.
La Tabla 1 muestra un conjunto de péptidos que
incluyen regiones predispuestas a contener epítopos para células B y
T (de acuerdo con los métodos de predicción usados en este ejemplo)
de la proteína pre-M/M del virus D2. Si la validez
de esa predicción se demuestra experimentalmente, los epítopos
inmunológicos importantes de cada región serán localizados de manera
precisa mediante el diseño de péptidos más pequeños de cada una de
las regiones.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los péptidos se sintetizaron usando una
estrategia que utiliza Boc en fase sólida sobre la resina de
p-metil-benzhidrilamina (resina
MBHA, BACHEM, Suiza).
Los aminoácidos protegidos se obtuvieron
procedentes de BACHEM. La protección de los grupos reactivos de la
cadena de aminoácidos fue: Arg (Tos), Asp (OBzl), Cys
(4-Me-Bzl), Glu (OBzl), Lys
(2-Cl-Z), Trp (CHO), Tyr
(Cl_{2}-Bzl), Thr (Bzl). Asn, Gln y Pro se
utilizaron sin protección en las cadenas laterales.
La retirada del grupo protector
Boc-amino se llevó a cabo utilizando ácido
trifluoroacético al 37,5% en diclorometano. La activación in
situ con diisopropil-carbodiimida (DIC) se
utilizó para la reacción de acoplamiento de cada uno de los
residuos, excepto en el caso de los aminoácidos Asn y Gln, que se
activaron utilizando DIC y 1-hidroxibenzotriazol en
N,N-dimetilformamida.
La desprotección final y la liberación del
péptido de la resina se realizaron en un equipo especial. El
procedimiento utilizado se conoce como procedimiento de HF a
concentración baja y alta (Low-High HF).
Durante la primera parte del procedimiento (HF a
concentración baja) (Low HF), el sistema formado por el
péptido protegido-resina se trató con HF (25%): DMS
(65%): p-cresol (10%) durante 120 minutos a 0ºC.
Esta mezcla se reemplazó por HF(25%): DMS(60%):
EDT(10%): p-cresol(5%) en el caso de
los péptidos que contienen Trp. Seguidamente, el péptido unido a la
resina se lavó varias veces con dietil-éter, diclorometano y
2-propanol, y se secó al vacío.
Durante la segunda parte del procedimiento (HF a
concentración alta) (High HF) el péptido unido a la resina se
trató con HF (90%): anisol (10%) durante 60 minutos a 0ºC.
El producto en crudo se secó con éter, después se
extrajo con ácido acético al 30% y por último se liofilizó. Los
péptidos fueron caracterizados mediante RT-HPLC en
una columna BAKER C-18 (4,6 mm x 100 mm) y mediante
espectrometría de masas utilizando FAB como método de ionización en
un equipo de HF, JEOL HX- 110.
La secuencia de aminoácidos así como su
localización en la proteína pre-M/M del virus del
Dengue se muestran en la Tabla 1.
Los oligonucleótidos se sintetizaron de manera
automática en el equipo Gene Assembler Plus, conforme al
método de la fosforamidita.
La secuencia de los seis oligonucleótidos se
muestra en la Tabla 2.
Los sitios Xba I y EcoR I que se crean en cada
extremo para su posterior manipulación están con subrayado sencillo
y con doble subrayado respectivamente. El marco de lectura de la
proteína codificada está definido por los tripletes de bases.
El acoplamiento de los péptidos se realizó de la
siguiente manera:
1. Activación de BSA: Gota a gota y con
agitación, 80 \mul de una disolución del reactivo bifuncional
éster de
maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida
(MBS) (5 \mug/ml) en dimetilformamida, se añadieron a una
disolución de 2,8 mg de albúmina bovina fracción V (BSA) en 250
\mul de PBS. A continuación, la mezcla se mantuvo en agitación a
temperatura ambiente durante 30 minutos, y la mezcla se hizo pasar a
través de una columna PD10.
2. Acoplamiento del péptido a la BSA
activada: una disolución 1 mg de péptido disuelto en 300 \mul
de PBS se añadió a la disolución de BSA activada gota a gota y con
agitación. Esta disolución se mantuvo a temperatura ambiente
durante 3 horas y la concentración se determinó mediante el método
de Lowry.
El esquema de inmunización con los péptidos
ligados a BSA es el siguiente:
Ratones Balb/c, machos, de 4-6
semanas de edad, fueron inmunizados con 50 \mug del conjugado
péptido-BSA por vía intraperitoneal. Además, se
realizaron dos esquemas de inmunización, uno con BSA y el otro con
PBS. Se llevaron a cabo un total de 4 inoculaciones separadas entre
sí 15 días. Se utilizó adyuvante completo de Freund en las primeras
dosis, y adyuvante incompleto de Freund en las demás dosis. Una
muestra de sangre se extrajo de la vena
retro-orbital siete días después de la última
inoculación.
Los sueros obtenidos en cada esquema se situaron
a -20ºC para su uso posterior.
La técnica de neutralización se llevó a cabo
conforme Morens (Morens, D.M. y col., 1985. Simplified plaque
reduction neutralization assay for dengue viruses by semimicro
methods in BHK-21 cells: Comparison of the BHK
suspension test with standard plaque reduction neutralization. J.
Clin. Microbiol. 22, pág. 250).
Se prepararon diluciones de los sueros
anti-péptido y de controles
anti-BSA, y de sueros negativos, desde 1/10 hasta
1/640. Cada una de las diluciones de los sueros se puso en contacto
con una dilución del virus (cepa A 15 del virus Dengue 2) que
contenía 15-20 PFU/50 \mul.
Esta mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora. Un
total de 50 \mul de cada mezcla se añadió por triplicado a células
BHK-21 dispuestas en placas de 24 pocillos, y las
placas se incubaron en un incubador en presencia de CO_{2} a 37ºC
durante 4 horas. A continuación, se añadieron 0,5 ml de medio que
contenía carboximetilcelulosa, y esta mezcla se incubó de nuevo
durante varios días teniendo en cuenta el serotipo vírico
utilizado. Pasados estos días, se llevó a cabo la tinción y el
recuento de las calvas de lisis producidas por el virus.
El título se expresó en cada uno de los casos en
forma de la dilución a la que se obtenía una disminución del 50% en
el número de calvas.
Los resultados se muestran en la Tabla 3.
La presencia de los epítopos para células T en
los péptidos de pre-M se evaluó a lo largo del
estudio de la respuesta de anticuerpos anti-péptido
inducida en ratones inmunizados con péptidos libres (no conjugados).
Los animales sensibilizados inmunológicamente mostraron una
producción de anticuerpos séricos más alta en respuesta a una dosis
de refuerzo de antígeno cuando se compararon con la respuesta
obtenida en los animales sin estimular. Estos resultados confirman
la existencia de epítopos para células B en estos péptidos y
muestran que estas secuencias contienen epítopos para células T, que
son capaces de estimular la actividad in vivo de Th para
mejorar los títulos de la respuesta de los anticuerpos.
Se manifestaron respuestas proliferativas de los
linfocitos T esplénicos, específicas del virus, en ratones Balb/c
inmunizados con los péptidos. Las células T procedentes de ratones
inmunizados con los péptidos 19-6 y
19-5, proliferaron en un ensayo in vitro de
blastogénesis cuando se cultivaron con el virus Dengue 2. Sin
embargo, el péptido 20-2 no indujo una respuesta
proliferativa significativa contra el virus. Este péptido pudiera
contener un epítopo críptico para células T, que sería reconocido
en la forma libre del péptido, pero no como resultado de la
presentación de los epítopos inmunodominates ni del procesamiento
del virus en una infección natural (Figura
5).
5).
Se provocó en los ratones una respuesta
inmunológica 7 días después de la última inmunización mediante una
inyección intracraneal con una dilución 1/2.500 (que corresponden a
una dosis letal LD50 100) de virus dengue-2 vivo,
adaptado a ratón (cepa A15). Los ratones estuvieron en observación
durante un máximo de 21 días para determinar su morbimortalidad.
Los datos se sometieron a pruebas de significación estadística
utilizando la prueba de Fisher. Los porcentajes de supervivencia de
los animales inmunizados con los péptidos y de los animales de
control se muestran en la Figura 6. El nivel de protección inducido
por los péptidos 19-5, 19-6 y
20-1 fue estadísticamente significativo (p<
0,05).
Los péptidos 19-6,
20-1, 20-2 y 20-3 se
fijaron a las placas en concentración de 10 \mug/ml en tampón de
revestimiento y a continuación se incubaron a 4ºC durante la noche.
Se añadieron los sueros diluidos 1/200 en PBS-Tween
20. Por último, se añadió un conjugado de inmunoglobulina total
anti-seres humanos y peroxidasa, y seguidamente el
sustrato (ortofenilendiamina, H_{2}O_{2}, tampón de
fosfato-citrato 0,05 M, pH 5). La lectura se llevó a
cabo en un lector de ELISA, a 492 nm y se determinó el valor de
exclusión correspondiente a cada péptido.
Los sueros usados procedieron de pacientes que
presentaban una infección clínica de tipo vírico que se había
diagnosticado serológicamente como dengue mediante técnicas de
inhibición de la hemaglutinación (Clarke, D.H. y Casals, J. 1958.
Thecniques for hemagglutination and
hemagglutination-inhibition with Arthropod Borne
Virus. Am. J. Trop. Med. Hyg. 7. pág. 561) y ELISA de
inhibición (Vázquez, S. Fernández, R. 1989. Utilización de un
método de ELISA de inhibición en el diagnóstico serológico de
dengue. Rev. Cub. Med. Trop. 41(1), pág.
18-26) para determinar los anticuerpos totales
anti-dengue.
El estudio incluyó 118 sueros de pacientes de las
epidemias ocurrida en Cuba 1981, Panamá 1994 y Costa Rica 1994. El
virus Dengue 2 fue aislado en estas epidemias, además de los
serotipos 1 y 4 aislados en Costa Rica; los sueros se clasificaron
de acuerdo con los títulos de los anticuerpos inhibidores de la
hemaglutinación en los casos de infecciones primarias y
secundarias.
El 46,6% de los sueros dio un resultado positivo
frente a los 4 péptidos utilizados. Se obtuvieron porcentajes de
positividad del 56,8%, 79,6%, 77,1% y 83,1% frente a los péptidos B
19-6, 20-1, 20-2 y
20-3 respectivamente.
El valor medio del índice de reactividad,
calculado por medio del cociente de las densidades ópticas de la
muestra/valor de exclusión, correspondiente a cada uno de los
péptidos, fue 1,07, 1,52, 1,57 y 1,49 respectivamente.
El ensayo ELISA indirecto utilizado fue como el
anteriormente descrito pero usando una Ig anti-ratón
conjugada con peroxidasa. Los títulos de los anticuerpos obtenidos
en los sueros anti-péptido fueron por lo general
superiores a 1/10.000.
En este ejemplo se expresaron fragmentos de la
proteína pre-m/M del virus Dengue 2 (cepa A 15) y
del virus Dengue 4 (cepa 814669) (Zhao, B. y col. 1986. Cloning
full-length dengue type 4 viral DNA sequences:
analysis of genes coding for structural proteins. Virol. 155,
pág. 77) insertados en una proteína de N. meningitidis
previamente caracterizada por los autores de la invención (Silva,
R. y col. 1992. Nucleotide sequence coding for an outer membrane
protein from Neisseria meningitidis and use of said protein in
vaccine preparations. Patente europea 0 474 313, 1997):
la proteína P64k, que ha demostrado ser altamente inmunogénica en
varios modelos animales. Además, el nivel de expresión de P64k en
E. coli llega a más del 30% de la proteína total de la
bacteria.
La proteína P64k (de 64 kDa) de naturaleza
dimérica, posee dos dominios funcionales en cada subunidad: un
dominio con actividad de unión a ácido lipoico
(1-100) y otro dominio con actividad de
lipoamida-deshidrogenasa (117-594).
Ambos dominios han sido identificados como dominios conformacionales
relativamente independientes mediante cristalografía de rayos X (Li
de la Sierra, I. y col. 1994. Crystallization and preliminary
X-ray investigation of a recombinant outer membrane
protein from Neisseria meningitidis. J. Mol. Biol. 235,
pág. 1154; Li de la Sierra, I. y col. 1997. Molecular structure
of the lypoamide dehydrogenase domain of a surface antigen from
Neisseria meningitidis. J. Mol. Biol. 269, pág. 129).
El primero de los dominios mencionados se
seleccionó (en las posiciones de aminoácidos 40-45)
para realizar las inserciones de los fragmentos 1-42
y 92-133 de la proteína pre-M/M,
porque este pequeño dominio está más expuesto y no parece estar
implicado en la formación del dímero. Esto sugería que la
estructura global de la proteína quimérica con respecto a la
proteína P64k natural estaría menos alterada que si se hubiera
hecho un sitio de inserción en el dominio 117-594,
que además participa directamente en la formación del dímero.
La región que codifica los aminoácidos
38-47 (TLETDKATMD), que incluye la región de unión a
ácido lipoico del gen P64k usado en la producción de las proteínas
de fusión, se cambió de manera preliminar a TLDLEMD. Esta
modificación se llevó a cabo para evitar el reconocimiento de P64k
por los sueros de pacientes que presentan cirrosis biliar primaria,
quienes poseen autoanticuerpos contra epítopos homólogos presentes
en la deshidrolipoamida-acetiltransferasa
mitocondrial humana (Tuaillon, N. y col. 1992. A lipoyl
synthetic octadecapeptide of dihydrolipoamide acetyl transferase
specifically recognized by anti-M2 autoantibodies in
primary biliary cirrhosis. J. Immunol. 148, pág.
445).
La estrategia para producir los dos clones se
explica a continuación:
Los fragmentos Pre-2,
M-2 y M-4 se amplificaron mediante
la reacción en cadena de la polimerasa, usando la combinación de
oligonucleótidos 1 y 2, 3 y 4, y 5 y 6 respectivamente (véase la
Tabla 2), y usando como molde el plásmido pD-5.
Este plásmido pD-5 incluye una copia del gen de
pre-M/M del virus Dengue-2 (cepa
A-15), clonado en el vector pBluescript
(Stratagene). Las bandas de DNA obtenidas en cada uno de los casos
(120 pb) se digirieron con Xba I (Pre-2 y
M-2) o con Xba I/EcoR I (M-4), y se
clonaron en los correspondientes sitios que se habían creado
artificialmente en la posición 135-145 del gen de
P64k, clonado en el vector pM-92. Por otra parte,
se generó un clon quimérico que incluía las bandas de
M-2 y M-4 en los sitios Xba I y EcoR
I ya mencionados, mediante una triple ligación. Los clones
recombinantes que portaban los insertos en la orientación correcta
fueron identificados mediante análisis de restricción y
secuenciación de DNA.
Las proteínas de fusión generadas por los clones
de Pre-2 (pD31), M-2 (pD30),
M-2/M-4 (pD33) y M-4
(pD34) se expresaron bajo el control del promotor del operón
triptófano (ptrp) en la cepa MM294 de E. coli (F^{-} end A1
hsdR17 (r_{k}^{-}m_{k}^{+}) sup E44 thi-1
relA1? RfbD1? SpoT1?). Todas las proteínas de fusión se obtuvieron
con IN los tamaños esperados y con niveles de expresión de hasta el
30% de las proteínas totales de la bacteria, aunque la proteína
PD31 mostró una inestabilidad elevada (Figura 7). Todas las
proteínas de fusión fueron reconocidas por algunos anticuerpos
monoclonales anti-P64k de ratón en ensayos ELISA
(datos no mostrados) y en ensayos de transferencia Western (Figura
8), en los que se detectó una notable degradación en el extracto de
las células completas. La secuencia de aminoácidos de estas
proteínas se muestra en el Listado de Secuencias.
La inmunización de ratones con las proteínas de
fusión PD33 y PD34 semipurificadas mediante un protocolo no
desnaturalizante, ha inducido la producción de títulos altos contra
ellas en el ensayo ELISA (de hasta 1/100.000) y al mismo tiempo se
han obtenido anticuerpos con títulos de hasta 1/4.000 en el ensayo
ELISA, inducidos contra los péptidos sintéticos.
Figura 1. Perfiles de carácter hidrófilo, de
accesibilidad y de flexibilidad de las proteínas
pre-M (A) y M (B) del virus del Dengue.
Figura 2. Predicción de la estructura secundaria
y de la accesibilidad de pre-M (A) y M (proteínas).
AA: aminoácidos. PHD sec: predicción de la estructura secundaria (E
= \beta, H = hélice, L = bucle). P- 3 acc: Predicción de la
accesibilidad (e = expuesto, b = no expuesto). Sub sec (Sub acc):
residuos en los que la predicción de la estructura secundaria
(accesibilidad) tiene una eficacia del 82,4% (70%).
Figura 3. Perfiles de variabilidad de las
proteínas pre-M y M. La variabilidad se calculó
considerando 3 conjuntos de secuencias de Flavivirus. Dengue:
secuencias de 15 cepas aisladas del virus del Dengue. MBV:
secuencias de Flavivirus transmitidas por mosquitos que incluyen
virus del dengue, Kunji, Virus West Nile, Encefalitis de Murray
Valley y Encefalitis de Saint Louis. Flavivirus: secuencias de más
de 30 cepas aisladas Flavivirus diferentes: (MBV + Fiebre Amarilla,
Langat, Louping I11 y Encefalitis de
Tick-Borne).
Figura 4. Predicción de epítopos para células T
de las proteínas pre-M (A) y M (B): AMPHI 7 (11):
predicción de segmentos anfipáticos de 7 (11) residuos, los
residuos positivos se encuentran en los aminoácidos centrales de un
bloque anfipático potencialmente antigénico. RT 4 (5): predicción de
los perfiles antigénicos de 4 (5) residuos, los residuos positivos
son los que satisfacen los perfiles.
Figura 5. Respuesta proliferativa frente a los
antígenos del virus dengue-2 (a concentraciones de
10, 20 y 40 \mug/ml) de células T esplénicas procedentes de
ratones inmunizados con los péptidos19-6,
19-5 y 20-2.
Figura 6. Porcentajes de supervivencia de
animales inmunizados con los péptidos y de los animales de control.
El nivel de protección inducido por los péptidos
19-5, 19-6 y 20-1
fue estadísticamente significativo.
Figura 7. SDS-PAGE al 10% de la
cepa MM294 de E. coli transformada con las proteínas de
fusión y con la proteína P64k (plásmido pM-92).
Pistas: 1- cepa MM294 no transformada, 2-
pM-92/mm294, 3- pD-30/MM294, 4-
pD-31/MM294, 5- pD-33/MM294, 6-
pD-34/MM294.
Figura 8. Transferencia Western utilizando el mAb
114. Pistas: 1- cepa MM294 no transformada, 2-
pM-92/
MM294, 3- pD-30/MM294, 4- pD-31/MM294, 5- pD-33/MM294, 6- pD-34/MM294.
MM294, 3- pD-30/MM294, 4- pD-31/MM294, 5- pD-33/MM294, 6- pD-34/MM294.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Ave. 31 entre 158 y 190, Playa
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Ciudad de La Habana
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Cuba
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 10600
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 53 7 218466
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 53 7 218070 / 336008
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL "PEDRO KOURI"
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Autopista Novia del Mediodía km 6, La Lisa
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Ciudad de La Habana
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Cuba
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 11100
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 53 7 220633
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 53 7 335061
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: EPÍTOPOS DE LA PROTEÍNA PRE-M/M DEL VIRUS DEL DENGUE, PÉPTIDOS SINTÉTICOS Y SU USO.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release n.º 1.0, Versión n.º 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS PREVIOS DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: CU 13/97
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 15 de Junio de 1997
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE EL SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus del Dengue
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Dengue-2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA AISLADA INDIVIDUAL: A-15
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE EL SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus del Dengue
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Dengue-2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA AISLADA INDIVIDUAL: A-15
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE EL SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus del Dengue
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Dengue-2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA AISLADA INDIVIDUAL: A-15
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE EL SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus del Dengue
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Dengue-2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA AISLADA INDIVIDUAL: A-15
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE EL SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus del Dengue
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Dengue-2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA AISLADA INDIVIDUAL: A-15
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE EL SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 635 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Proteína de fusión
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: PD31
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE EL SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 635 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Proteína de fusión
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: PD30
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE EL SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 677 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Proteína de fusión
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: PD33
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE EL SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 635 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Proteína de fusión
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: PD34
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
Claims (10)
1. Un péptido específico del virus del dengue,
que comprende un epítopo de la proteína Pre-M/M de
al menos uno de los serotipos del virus del dengue, en el que dicho
péptido corresponde a los aminoácidos Núms. 3-31, a
los aminoácidos Núms. 69-93 o a los aminoácidos
Núms. 103-124, de Pre-M/M.
2. Un péptido específico del virus del dengue
según la reivindicación 1, en el que dicho péptido comprende una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido
por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
3. Una proteína de fusión que comprende una
proteína transportadora y una secuencia de aminoácidos específica
del virus del dengue que comprende un epítopo del virus
dengue-2 y/o del virus dengue-4, en
la que dicha secuencia de aminoácidos específica del virus del
dengue corresponde a los aminoácidos Núms. 1-42 o a
los aminoácidos Núms. 92-134 de la proteína
Pre-M/M de dicho virus.
4. Una proteína de fusión según la
reivindicación 3, en la que la proteína transportadora es P64k de
Neisseria meningitidis y la secuencia de aminoácidos
específica del virus del dengue está insertada detrás del aminoácido
Núm. 42 de P64k.
5. Una proteína de fusión según la
reivindicación 4, que comprende una secuencia del grupo constituido
por SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.
6. Un anticuerpo específico del virus del dengue
que se une a un epítopo de la proteína Pre-M/M de un
virus del dengue, siendo dicho epítopo como el definido en la
reivindicación 1 ó 2.
7. Una composición farmacéutica contra el
dengue, que comprende un anticuerpo específico del virus del dengue
según la reivindicación 6.
8. Una composición farmacéutica que comprende un
péptido específico del virus del dengue según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, opcionalmente conjugado con una sustancia
transportadora, o que comprende una proteína de fusión según una
cualquiera de las reivindicaciones 3-5.
9. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 8, que contiene un adyuvante.
10. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 8 ó 9, que es una vacuna contra el dengue.
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|---|---|---|---|
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| CU1997013A CU22683A1 (es) | 1997-01-15 | 1997-01-15 | Epítopes de la proteína pre-m/m del virus del dengue, péptidos sintéticos, proteínas quiméricas y sus usos |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98900843T Expired - Lifetime ES2235310T3 (es) | 1997-01-15 | 1998-01-13 | Epitopos de la proteina pre-m/m del virus del dengue, peptidos sinteticos. |
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