JP2001508457A - デング熱ウイルスのプレm/mエピトープ、合成ペプチド、キメラタンパク質およびその用途 - Google Patents

デング熱ウイルスのプレm/mエピトープ、合成ペプチド、キメラタンパク質およびその用途

Info

Publication number
JP2001508457A
JP2001508457A JP53348698A JP53348698A JP2001508457A JP 2001508457 A JP2001508457 A JP 2001508457A JP 53348698 A JP53348698 A JP 53348698A JP 53348698 A JP53348698 A JP 53348698A JP 2001508457 A JP2001508457 A JP 2001508457A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
virus
dengue
peptide
peptides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP53348698A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3647048B2 (ja
Inventor
ラムド,スサーナ バスケス
ティラド,グアダルペ グスマン
ニエト,ヘラルド エンリケ ギジェン
ラソ,オルランド ルイス パルド
サンティアゴ,グライ チネア
ディアス,アナ ベアトリス ペレス
アントゥネス,マリッサ プポ
ロチェ,ロスマリ ロドリゲス
アコスタ,オスバルト レイエス
ペレス,イルダ エリサ ガライ
パロマレス,ガブリエル パドロン
ベラ,マイリン アルバレス
ディアス,ルイス モリエル
インスイタ,オマイダ ペレス
マルティネス デ ラ コテラ,ホセ ルイス ペレグリノ
Original Assignee
セントロ デ インヘニエリア ヘネティカ イ ビオテクノロヒア(セーイーヘーベー)
インスティトゥト デ メディシナ トロピカル“ペドロ コウリ”
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by セントロ デ インヘニエリア ヘネティカ イ ビオテクノロヒア(セーイーヘーベー), インスティトゥト デ メディシナ トロピカル“ペドロ コウリ” filed Critical セントロ デ インヘニエリア ヘネティカ イ ビオテクノロヒア(セーイーヘーベー)
Publication of JP2001508457A publication Critical patent/JP2001508457A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3647048B2 publication Critical patent/JP3647048B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/24011Flaviviridae
    • C12N2770/24111Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08RNA viruses
    • G01N2333/18Togaviridae; Flaviviridae
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明はデング熱2ウイルスタンパク質のアミノ酸配列2〜31、45〜67、57〜92、69〜93および103〜124に対応するプレM/Mに関係する5種の合成ペプチドに関する。該ペプチドに対する免疫応答をラットで評価した。プレM/M領域を含む組換え融合タンパク質を構築した。デング熱ウイルスタンパク質プレM/Mのペプチド中にラットおよびヒトのB細胞に対するエピトープの存在が証明された。ペプチド3〜31および103〜124はデング熱ウイルスの4種の血清型に対し中和性抗体を誘導した。ペプチド57〜92および3〜31によるリンパ球増殖の研究で、ウイルスに対しペプチド特異的であるT細胞の交差認識を証明した。デング熱2ウイルスで試験したラットは、防御がペプチド3〜31、57〜92および69〜93により誘導されることを証明した。かくして、デング熱2ウイルスタンパク質プレM/Mにおける連続的エピトープの存在と当該フラビウイルスに対する免疫応答において恐らく同じであるという関連性が証明される。

Description

【発明の詳細な説明】 デング熱ウイルスのプレM/Mエピトープ、合成ペプチド、 キメラタンパク質およびその用途 発明の分野 本発明は生物工学分野のものであり、組換えDNA技術、特に、デング熱ウイル スの血清型2のプレM/Mタンパク質をコードする合成ペプチドの産生、および デング熱ウイルス血清型2および4のプレM/Mタンパク質エピトープを含むキ メラタンパク質に関する。 技術上の目的は、デング熱ウイルスの血清型すべてに対して交差反応性を有す るプレM/M中和および防御エピトープを同定し、ヒト予防接種用免疫原を入手 することにある。 発明の背景 デング熱ウイルスはフラビウイルス科のフラビウイルス属に属する(ウエスタ ウエイ(Westaway,E.G.)ら、1985、Flaviviridae.Intervirol.24、 183ページ)。このものは遺伝物質として陽極性の単鎖RNA鎖を有するエン ベロープウイルスであり、該RNA鎖は細胞性およびウイルス性プロテアーゼに より共同一および後−形質導入加工処理されたポリタンパク質をコードする。 ウイルス膜には2つの構造タンパク質、E(エンベロープ)およびM(膜)が あるが、一方で、異性体ヌクレオカプシドを形成する他の構造タンパク質C(カ プシド)のいくつかのコピーがある。他にも、少なくとも7種の非構造タンパク 質が同定されている(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)。 糖タンパク質EおよびNS1は、それぞれがデング熱ウイルスの相同血清型に対 し能動的および受動的防御作用を提供することができるが、 一方で、関連するエピトープの高度な高次構造の複雑さを保持している。このよ うな理由で、組換え真核細胞系がこれらタンパク質の免疫学的評価のために主に 選択されている。例えば、ワクチンウイルス(ブレイ(Bray,M.)ら、1989 。非構造タンパク質NS1を有するもしくは有しないデング熱−4構造タンパク質 を発現する組換えワクチニアウイルスにより免疫したマウスは致死的デング熱ウ イルス脳炎に対し防御的である。J.Virol.63、2853ページ)およびバキ ュロウイルス(ツアン(Zhang,Y.M.)ら、1988。デング熱構造タンパク質 および組換えバキュロウイルスにより発現された非構造タンパク質NS1でマウス を免疫すると、デング熱ウイルス脳炎に対する抵抗性を誘発する。J.Virol.6 2、3027ページ)である。 小タンパク質M(8kDa)はプレ−M(約22kDa)と呼ばれる糖化前駆体同様に 合成されるが、このものは感染細胞がウイルスを放出する直前または直後に後期 エンドタンパク質分解切断を受ける(マーレイ(Murray,J.M.)ら、1993 。デング熱ウイルス2型タンパク質prMおよびC−prMの加工処理。J.Gen.Virol .74、175ページ)。恐らく細胞性プロテアーゼによりなされるこの切断は ゴルジ後酸性小胞にて起こり、この小胞の低pH値を不安定とする試薬により阻害 されると思われる(ランドルフ(Randolph,V.B.)ら、1990。好酸性アミ ンはフラビウイルスprMタンパク質のタンパク質分解過程を阻害する。Virol.1 7、450ページ)。プレ−断片は細胞外媒体においてのみin vitroで同定され ているが、そのin vivoでの命運は未知である(マーレイ(Murray,J.M.)ら、 1993。デング熱ウイルス2型タンパク質prMおよびC−prMの加工処理。J.Ge n.Virol.74、175ページ)。 フラビウイルスのエキソサイトーシスに際してのプレM/Mの機能は、酸性pH 環境によるEの融合誘導膜の活性化を回避することである(ランドルフ(Randol ph,V.B.)ら、1990。好酸性アミンはフラ ビウイルスprMタンパク質のタンパク質分解過程を阻害する。Virol.17、45 0ページ)。もしこの事象が起きるならば、そのときはウイルスの放出が防止さ れる。事実、プレ−MおよびEは未熟な細胞内ビリオン内で相互作用していること が決定されており(ウエングラーおよびウエングラー(Wengler,G.y Wengler ,G.)、1989。細胞介在ウエストナイル・フラビウイルスは、ウイルスが放 出された際にタンパク質分解切断により破壊され、認識されるE+プレ−Mタン パク質ヘテロ二量体により被覆されている。J.Virol.63、2521ページ) 、また、Eの未変性コンホメーションはプレ−Mの存在下においてのみ獲得され ることが決定されている(小西およびマソン(Konishi,E.y Mason,P.W.)1 993。日本脳炎ウイルス・エンベロープ糖タンパク質の適切な成熟には前膜タ ンパク質との共同合成を必要とする。J.Virol.67、1672ページ)。更に 、すでに放出されたビリオンは、その膜中にプレ−Mを有するのみであるが、そ れは一般に完全に成熟したビリオンよりも低い感染性を示し(ウエングラーおよ びウエングラー(Wengler,G.y Wengler,G.)、1989。細胞介在ウエスト ナイル・フラビウイルスは、ウイルスが放出された際にタンパク質分解切断によ り破壊され、認識されるE+プレ−Mタンパク質ヘテロ二量体により被覆されて いる。J.Virol.63、2521ページ)、そこではMとプレ−Mが存在するが、 前者が優位である。 プレ−MおよびMはそれらが組替えワクチニアウイルスにおいて発現された場合 、能動的な防御を提供するが、この防御はプレ−断片では起きないが(ブレイお よびレイ(Bray,M.y Lai,C.-J.)1991。デング熱ウイルス前膜および膜 タンパク質は防御的免疫応答を引き出す。Virol.185、505ページ)、プ レ−MまたはMを同じ組換えワクチニアウイルスの糖タンパク質Eと組合わせると 、一般に、各個々のタンパク質が到達する防御レベルよりも高いレベルとなる。 同様に、プレM/Mに対する特定の抗体は、マウスで受動的に防御する ことができる(カウフマン(Kaufman,B.M.)ら、1989。デング熱ウイルスp rM糖タンパク質用のモノクローナル抗体は致死的デング熱感染からマウスを防御 する。Am.J.Trop.Med.& Hyd.41、576ページ)。 合成ペプチドの使用は、関与する抗原の空間的コンホメーションおよび免疫学 的性質に従って、抗原性の分子的基礎を確立することを可能としている[アーノ ンおよびセラ(Arnon,R.y Sela,M.)1985。合成ワクチン:現状と未来。 Ann.Inst.Pasterur/Immunol.136D、271〜282]。抗デング熱ワクチ ン・サブユニットとしての合成ペプチドは、最終の形態において、免疫増幅を引 起こさない防御エピトープのみ包含することを可能とし(ハルシュテッドおよび オー‘ルアーク(Halstead,S.B.y O'Ruourke,E.J.)1977。デング熱ウイ ルスおよび単核食細胞、I。非中和性抗体による感染増強。J.Exp.Med.146 、201ページ;ハルシュテッド(Halstead,S.B.)1979。受動的に移入し た抗体によるアカゲザルのデング熱ウイルス感染症のin vivo増強。J.Infect. Dis.140、527ページ)、またあるいは、4つの血清型のそれぞれの防御 的ペプチドを包含することを可能とする。EおよびNS1の抗原性決定子の特性 化は成功裏に実施されている。しかし、この重要なタンパク質プレM/Mに関す る同様な研究はなく、それが何故本報告の結果がその方向性の第一段階であるか の理由である。 フラビウイルス・タンパク質プレM、MおよびEを大腸菌で発現する努力が常に 成功するとは限らない(チャンバー(Chambers,T.J.)ら、1990。感染細 胞での黄熱病ウイルスの生産:領域特異ポリクローナル抗血清を用いる個別ポリ タンパク質の同定と切断速度の分析。Virol.177、159ページ;ヤン(Yan ,B.−S.)ら、1994。推定膜関連領域の末端切除が、大腸菌でのC型肝炎ウ イルスタンパク質E1発現の難しさを回避する。J.Virol.Meths.49、343 ペー ジ)。明らかに、これらのタンパク質がc−末端領域にもつ疎水性領域が、低い または検出不能の非相同発現レベルの原因である(ヤン(Yan,B.−S.)ら、1 994。推定膜関連領域の末端切除が、大腸菌でのC型肝炎ウイルスタンパク質 E1発現の難しさを回避する。J.Virol.Meths.49、343ページ)。 E.coliにおける上記蛋白質の発現は(NS1と同様)、一般的に、他の細菌タンパ ク質、例えば、β-ガラクトシダーゼ(Cane,P.A.およびGould,E.A.1988 yel low fever mouse neurovirulence by immunization with a bacteriall y synthesized non-structural protein(NS1)fragment.J.Gen.Virol.6 9p1241)、TRPE(Megret,F.et al.1992.Use of recombinant fusion pr oteins and monoclonal antibodies to define linear and discontinuous ant igenic sites on the Dengue envelope glycoprotein.Virol.187p.480.)、お よび黄色ブドウ球菌のタンパク質A(Murray,J.M.et al.1993 processing of the dengue virus type 2 proteins prM and C-prM.J.Gen.Virol.74p.175 .)に融合すること(フラグメントまたは非フラグメント)で得られる。これら の融合タンパク質において、適切な立体配座エピトープは存在せず、なぜならそ れらに対して生じた抗血清が全てのウイルスを認識できるとしても、それを中和 させたり、血球凝集を抑制することはできないためである(Megret,F.et al. 1992.Use of recombinant fusion proteins and monoclonal antibodies to de fine linear and discontinuous antigenic siteson the Dengue envelope glyc oprotein.Virol.187p.480)。しかしながら、最近の報告では、融合タンパク 質の溶解度と、結果としてその精製のために非変性方法を使用することで、変性 (Seif,S.A.et al.1995.Finer mapping of neutralizing epitope(s)on the C-terminal of Japanese encephalitis virus E-protein expressed in recomb inant Escherichia coli system.Vaccine 13 p.1515.)とそれ らが持つ防御エピトープ(Srivastava,A.K.et al.1995.Miceimmunized with a dengue type 2 virus E and NS1 fusion protein made in Escherichia coli are protected against lethal dengue virus infection.Vaccine 13p.1251. )の多くを保存することができることが示されている。 プレM/Mの場合には、そのプレードメインが3つのジスルフィドブリッジに 関与する6つのシステイン、ならびにアスパラギン69にN−グリコシル化部位 をもつ。EおよびNS1の構造は更により複雑である。このもは6つのジスルフィ ドブリッジと幾つかのN−グリコシル化部位をもつ。しかし、Mの小さなエクトド メインは、システインをもたず、その天然型はグリコシル化されていないので、 明らかにこれらのコンホメーションの複雑さがない。 免疫原タンパク質の可能な領域に非相同断片を挿入することは、そのトポロジ ーも多少知られており、また、これらの融合物での免疫は、合成ペプチドの使用 に補足的に替わり得るものである。双方の戦略は連続的なB細胞の存在、ならび にT細胞エピトープの明確化を可能とする。これらエピトープの生物学的重要性 は実験的に評価し、所定のワクチン製剤の何処にそれらを含まれせるかを決定す ることが可能である。 発明の開示 アミノ酸配列(97/166AA)の58%に及ぶデング熱2ウイルスのプレM/Mタン パク質からの5種のペプチドを化学的に合成した。そのペプチドは3−31、4 5−67、57−92、69−93および103−124であり、それぞれ、B1 9-6、B20-2、B19-5、B20-1、B20-3と命名した。 これらのペプチドを担体タンパク質に結合させ、あるいは結合させずにBalb/c マウスに接種した。複合ペプチドでの免疫後得られた血清 をin vitroで中和して、プラーク数の減少およびELISAにより試験した。我々は また、免疫したマウスについてデング熱2ウイルスの感染に対する能動的防御を 検討した。 非複合ペプチドで免疫したマウスの場合には、抗体応答をELISAにより評価し 、デング熱2ウイルスに対する脾臓Tリンパ球の増殖性応答も評価した。 融合タンパク質を取得し、ペプチドによりカバーされる4つの領域の内、2つ の領域(1〜42および92〜133)をそれらに挿入し、大腸菌中で発現させ た。これらの融合物での免疫が、合成ペプチドにより得られた結果を補足するだ ろう。 マウスおよびヒトの双方においてB細胞エピトープが存在することは、該ペプ チドが免疫したマウスからの抗体により、また、デング熱ウイルスにつき臨床診 断および血清学診断を受けた患者の血清により認識されたことで証明したが、こ れらには両方ともELISAを使用した。ペプチド19−6および20−3は4種の デング熱ウイルス血清型に対し中和性抗体の産生を誘導することができる。 ウイルス特異的増殖応答は、非複合ペプチド19−6および19−5で免疫し たマウスにて証明した。複合ペプチド19−6、20−1および19−5で免疫 したマウスは、デング熱2ウイルスで感染させたとき、統計的に有意な防御レベ ルを示した。 かくして、デング熱2ウイルスのプレM/Mタンパク質に連続的エピトープの 存在することが証明された。同時に、それらのフラビウイルスに対する免疫応答 における関連性も証明された。 発明の実施の形態 実施例1 デング熱ウイルスのプレM/Mタンパク質の抗原性領域とT細胞エ ピトープの予測 理論的に異なる方法を、D2ウイルスのプレM/Mタンパク質におけ る抗原性領域を予測するために適用した。これらの領域は、恐らく、該ウイルス タンパク質に対して得られた抗体により認識されるものであり、同時に、原タン パク質を認識する抗体を産生するものである。T細胞エピトープを予測する幾つ かの方法を適用した。 可能なB−およびT−細胞エピトープを有する5種の原ペプチドを見出した(プレ -で4種、Mで1種)。これらタンパク質の抗原性構造および可能な免疫学的に重 要なペプチドの実験的決定の研究はこの知見に基づいている。 1.1. 体液性抗原性の予測 抗原性を予測するのに使用した方法はアミノ酸配列に基づいた。その理由はデ ング熱ウイルスのプレM/Mタンパク質の三次元構造が実験的に決められず、ま た、既知三次元構造のいずれのタンパク質についても配列レベルで有意な同一性 がないからである。 1981年にキューバで単離されたデング熱2のA15株(クーリ(Kouri,G .)ら、1986。キューバでの出血性デング熱;伝染病流行の歴史。Bull.P. A.H.020、24ページ)をこの実験の実施のために用いた。潜在的抗原性領 域を以下の基準に従って選択した。 a)親水性に基づく異なる予測方法に従い高い抗原性を有する領域(フープお よびウッド(Hoop,T.P.y Woods,K.R.)1981。アミノ酸配列からタンパク 質抗原性決定子を予測。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78、3824ページ; パーカー(Parker,J.M.R.)ら、1986。HPLCペプチド保持データから誘導さ れる新しい親水性:予測される表面残基と抗原性との相関およびX線誘導接近可 能部位、Biochemistry 25、5425ページ)、たわみ性(カープラスおよび シュルツ(Karplus,P.A.y Schultz,G.E.)1985。タンパク質における鎖 可撓性の予測。ペプチド抗原の選択手段。Naturwissenschaften 72、212ペ ージ)および接近可能性(エミニ(Emini,E.A.)ら、1985。ウイルス特異 合成ペプチドによるA 型肝炎ウイルス中和抗体の誘導。J.Virol.55、836ページ)。 b)PHDを使用する二次構造の予測に従いループおよび折り返し形成の高い 可能性をもつ領域(ロストおよびサンダー(Rost,B.y Sander,C.)1993 。70%以上の確かさでタンパク質二次構造を予測。J.Mol.Biol.232、5 84ページ;ロストおよびサンダー、1994。タンパク質二次構造を予測させ る進化論的情報および中立のネットワークを組合わせること。Proteins 19、 55ページ;ロストおよびサンダー、1994。タンパク質類における溶媒の接 近可能性の保存と予測。Proteins 20、216ページ)。 c)他のフラビウイルスに関して挿入/抑制を含む、または含まない高次可変 性の領域、ならびにデング熱ウイルスにおいて用いられる、または用いられない 他のフラビウイルスにおけるグリコシル化の潜在的領域。 a) 抗原性のプロフィール 図1は抗原性に関係するアミノ酸の4つの性質をプレ−およびMセグメントに 適用するとき得られるプロフィールを示す。 該プレ−領域には、残基6〜9、16〜21、28〜31、42〜47、58 〜65および82〜91を有する領域に高い親水性と接近可能性値がある。注目 すべきことは、残基41〜76間の広範な疎水性領域の存在であり、この領域は 免疫系に露出されていないと考えられる経膜ラセンに相当することである。Mの 小さなエクトドメイン(残基1〜40)には、主要親水性/接近可能性の領域が アミノ酸の13〜31の間、とりわけ、その始まり(AA13〜16)にある。 b) 二次構造の予測 図2はPHDプログラムによるプレ−およびMセグメントの二次構造と接近可 能性の予測を示す。予測の結果は、多くの潜在的に抗原性の領域(図1のプロフ ィールによる)が、タンパク質表面の露出された残基をもつループ/b−折り返し を形成するように仕向けることを示 している。タンパク質Mのアミノ酸41〜76の領域には経膜ラセンの形成が予 測され、このことはこの領域の疎水性と調和し、Mの抗原性ペプチドが主にエク トドメイン(1〜40)にあることを示唆している。 c) デング熱タンパク質および他のフラビウイルスタンパク質のプレ−およ びMのアライメント。可変性およびグリコシル化。 一般に、溶媒に露出されていない領域は相同タンパク質類に大きな保存部分を 有する。従って、高次可変性領域は露出されるべき高い確率を有する。 ウイルスの場合には、可変性が免疫圧に対する逸脱メカニズムでもある;勿論 、このことが、一部の保存領域が抗原性であること、あるいはその表面に保存領 域が存在することの可能性を排除するものではない。 デング熱ウイルスの4種の血清型においける15種分離株のプレ−およびM領 域の配列について分析すると、少なくとも69%の残基が完全に保存されている ことが分かる。より重要な可変残基はプレーの28〜30、55〜59、69〜 72、および80〜83位、ならびにMの27〜30位にある。一般に、これら のゾーンは、図1の抗原性プロフィールの最大値に匹敵する。 30種以上のフラビウイルス分離株でのこれら領域の配列を比較すると、プレ の1〜33の領域が高度に可変性であり、(8位と30位に)挿入/抑制に方向 づけられた可能なループとN−グリコシル化の幾つかの潜在的部位をもつことが 分かる。これに対し、プレーのドメイン33〜91では可変性が低い;すべての フラビウイルスには幾つかの完全に保存された部位がある;例えば、3つのジス ルフィドブリッジを形成する6個のシステイン、40〜65の領域における少な くとも5つの酸残基、ならびに塩基性配列87〜91があって、その後で内タン パク質分解切断が成熟ウイルス放出の直前またはその間に起こ る(図3)。 抗原性デング熱複合体の保存残基であるAsn−69は、複合体のプレM/Mタ ンパク質において唯一N−グリコシル化されている。しかし、フラビウイルス科 ではこの領域が高次可変性をもつ恐らく露出したループ内にある。同時に、他の フラビウイルスの潜在的N−グリコシル化部位(例えば、JE、SLE、MVE、YFのAA 14、およびLI、LAN、YF TBEのAA32)に匹敵するデング熱ウイルスのプレM /M残基は抗原性と考えられるゾーンに近接したb−折り返しである。 1.2. T細胞エピトープの予測 当該予測は2つの独立した方法により実施した:ロットバード−テイラーのパ ターン法(Rothbard,J.B.y Taylor,W.R.,1988、T細胞エピトープに共 通の配列パターン。EMBO J.7、93ページ)およびアルファ−ヘリックス構造 を形成する傾向をもつ断片の決定(AMPHI7および11)(マルガリット(Marga lit,H)ら、1987。免疫優性ヘルパーT細胞抗原性部位を一次配列から予測 。J.Immunol.138、2213ページ)。結果を図4に示す。 1.3 関連エピトープの同定用に提案されたペプチド 一般に、中和性および防御性ペプチドの決定は、より有効なワクチン開発のた めに非常に重要であり、高い抗原性を有する領域からのペプチド、とりわけ、直 鎖性のものはそれらを同定するために非常に有用である。 表1は(本実施例に用いた幾つかの予測方法に従い)D2ウイルスプレM/M タンパク質について、B細胞およびT細胞エピトープをもつように仕向けた領域 を含むペプチドセットを示す。もしその予測の有効性が実験的に証明されるなら ば、各領域の免疫的に重要なエピトープが、それぞれにおいて小サイズのペプチ ドを設計することにより正確に置き換えられるだろう。 表1:デング熱ウイルスのプレーM/Mタンパクに提案された抗原性ペプチド 実施例2 オリゴペプチドとオリゴヌクレオチドの化学合成 1.オリゴペプチドの合成 ペプチドは全て、p−メチルベンズヒドリルアミン樹脂(p-methyl-benzhydri lamine resin)(resin MBHA,BACHEM,Switzerland)によって、固相中で、B ocアプローチによって合成された。 保護されたアミノ酸は、BACHEMによって提供された。アミノ酸鎖の反応 性基の保護は、Arg(Tos)、Asp(OBzl)、Cys(4−Me−B ZL)、Glu(OBzl)、Lys(2−Cl−Z)、Trp(CHO)、T yr(Cl2−Bzl)、Thr(Bzl)であった。Asn、GlnおよびP roは、側鎖を保護せずに使用された。 Bocアミノ保護基の脱保護は、37.5%トリフルオロ酢酸/ジクロロメタ ン溶液を用いて実施された。ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)のin sit uでの活性化は、各残基のカップリング反応に使用されたが、アミノ酸Asnと Glnについては、N,N−ジメチルホルムアミド中で、DICと1−ヒドロキ シベンゾトリアゾールを用いて活性化された。 最終的な脱保護と樹脂からのペプチドの遊離は、特殊な装置で達成された。使 用した手順は、Low−High HFとして知られている。 この手順の第1の部分(Low HF)の間、保護された樹脂系は、HF(2 5%):DMS(65%):p−クレゾール(10%)で、 120分間、0℃で処理された。該混合物は、Trp含有ペプチドの場合、HF (25%):DMS(60%):EDT(10%):p−クレゾール(5%)に よって代替した。次に、該樹脂ペプチドを、ジエチルエーテル、ジクロロメタン 、2−プロパノールで数回洗浄し、真空乾燥を行った。 この手順の第2の部分(High HF)の間、該樹脂ペプチドは、HF(9 0%):アニソール(10%)で、60分間、0℃で処理された。 該生成物は、エタノールで洗浄され、30%の酢酸水溶液で抽出され、最後に 凍結乾燥された。 ペプチドは、BAKER C−18(4.6×100mm)カラムにおけるR P−HPLCとJEOL HX−110 HF装置における電離方法としてFA B(高速原子衝撃)を使用する質量分析により特徴づけた。 アミノ酸配列およびそのデング熱ウィルスのプレM/Mタンパク質中での位置 が表1に示されている。 2.2. オリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミド法に従って、Gene Assembler Plus装 置で自動合成された。 6つのオリゴヌクレオチドの配列を表2に示す。 その後の操作のために各端に作成されたXba IおよびEcoR I部位は、それぞれ 一重および二重の下線が引かれている。コードされるタンパク質のリーディング フレームは3塩基コドンによって示されている。 表2:合成オリゴヌクレオチドの配列と位置 実施例3 担体タンパク質へのペプチドの結合、および免疫方法 3.1 ペプチドのBSAへの結合 ペプチドの結合は以下の方法でおこなわれた。 1.BSAの活性化:ウシアルブミン分画V(BSA)2.8mgをPBS250μlに溶解 した溶液に、ジメチルホルムアミドに溶解した5μg/μl濃度のm-マレイミド ベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルの溶液80μlを一滴ずつ攪 拌して加えた。室温で30分間かき混ぜて、PD10カラムに混合物を通した。 2.ペプチドの活性化BSAへのカップリング:1mgのペプチドが300m lのPBSに溶解した溶解液を、振とうしながら、活性化BSA溶液に1滴ずつ 加えた。それを室温で3時間放置し、ローリー(Lowry)法によって濃度を測定 した。 3.2免疫方法 BSAに結合させたペプチドの免疫方法は以下の通りである。 4〜6週齢の雄性バルブシーマウスを、50mgのペプチド−BSA複合体を 用いて腹膜腔内免疫した。さらに、BSAおよびPBSをそれぞれ用いた、2つ の免疫方法を行った。全体として4回の接種を、それぞれ15日間の間隔を空け て行った。最初の投与にはフロイント(Freund)のコンプリートアジュバントを 用い、その他の投与にはフロイント(Freund)のインコンプリートアジュバント を用いた。最後の接種から7日後に、血液試料をレトローオービタル(retro- orbital)静脈から採取した。 各方法で得られた血清を、後で用いるために−20℃で保存した。 実施例4 in vitroプラーク減少中和試験(PRNT) 中和は、モーレンス(Morens)(Morens,D.M.et al.,1905,BHK−21 細胞中におけるセミミクロ法によるデング熱ウイルスの簡単なプラーク減少中和 アッセイ:標準的なプラーク減少中和とのBHK懸濁試験の比較J.Clin.Micro biol.22p.250)に従って行った。 抗ペプチド血清および抗BSAコントロールおよびネガティブ血清の、10〜 640倍希釈液を調製した。各血清の希釈液と15〜20PFU/50mlの、 ウイルス(デング熱2の株A15)の希釈液とを合わせた。 その混合物を、37℃で1時間インキュベートした。総量50mlの各混合物 を、24ウエルのプレート中のBHK−21細胞に対して3倍の量で加え、それ らをCO2インキュベータ中で、37℃で4時間インキュベートした。次に、0 .5mlのカルボキシメチルセルロースを含有する培地を加え、それを、用いた ウイルス性の血清型を考慮して、さらに数日間インキュベートした。その後、染 色と、ウイルスによって産生された、溶解したプラークの計数とを行った。 どの場合においても、力価は50%のプラーク数の減少が観測される希釈度と して表した。 結果を表3に示す。 表3:19−6および20−3に対する抗ペプチド血清のPRNT 実施例5 T細胞エピトープの単離 プレMのペプチドにおけるT細胞エピトープの存在は、免疫されたマウスの遊離 ペプチド(非結合)から引き出された抗ペプチド抗体の反応の研究を通して調べ られた。壮年期の動物は、実験を受けたことのない動物と比較して、抗原のブー スター量に反応して高い血清抗体生成を示した。これらの結果は、これらのペプ チドにおけるB細胞エピトープの存在を実証し、またこれらの配列がT細胞エピ トープを含み、in vivoでのTh活性を刺激して、抗体反応の力価を向上させる ことができることを示す。 脾臓Tリンパ球のウイルス特異的増殖反応は、ペプチド免疫されたBALB/ cマウスにおいて実証された。19−6と19−5の免疫されたマウスからのT 細胞は、デング熱2ウイルスと培養された場合、in vitro幼若化アッセイにおい て増殖した。しかしながら、20−2ペプチドは、ウイルスに対して有為な増殖 応答を引き起こさなかった。それは、遊離した形のペプチドにおいて認められる が、免疫優性のエピトープの提示および自然感染でのウイルスのプロセシングの 結果においては認められないため、T細胞クリプティックエピトープが含まれる と思われた。 実施例6 保護アッセイ マウスは、生の、マウスに適合したデング熱2ウイルス(株A15)の250 0倍の希釈液での頭蓋内注射による最後の免疫の、7日間後から試験した。病的 状態および死亡率について、マウスを21日間まで観察した。データを、フィッ シャー(Fisher)の試験を用いて統計上の有意性についてテストした。ペプチド 免疫された動物およびコントロールの動物における生存百分率を図6に示す。ペ プチド19−5,19−6および20−1に対して誘導された保護のレベルは、 統計上有意である(p<0.05)。 実施例7 抗ペプチド抗体を検出するための間接ELISA ヒト血清: ペプチド19−6,20−1,20−2,20−3を、コーティングバッファ ー中10mg/mlの濃度でプレートに固定し、それを4℃で一晩インキュベー トした。PBS−Tween20中200倍に希釈された血清を加えた。最後に 、全ヒト/ペルオキシダーゼ抗免疫グロブリン複合体を加え、続いて、基質(オ ルトフェニレンジアミン、H22、0.05Mリン酸クエン酸緩衝液、pH5) を加えた。読取は、ELISA読取装置において492nmにて行い、各ペプチド のカットオフ値が測定された。 使用された血清は、全ての抗デング熱抗体にっいて、血球凝集阻止実験(Clar ke,D.H.y Casals,J.1958.節足動物媒介ウイルスを用いた血球凝集実験およ び血球凝集阻止実験 Am.J.Trop.Med.Hyg.7 p.561)と阻止のELISA( Vazquez,S.,Fernandez,R.1989.Utilizacion de un metodo de ELISA de In hibicion en el diagnostico serologico de dengue.Rev.Cub.Med.Trop.41 (1)p18-26)によって血清学的にデング熱と診断されたウイルスに臨床感染してい る被験者由来であった。 1981年キューバ、1994年パナマ、および1994年コスタリカで発生 した流行病の患者からの118の血清を調べた。コスタリカでの血清型1および 4に加えて、デング熱ウイルス2が、これらの流行病において単離され、それら は、血球凝集阻止の阻止抗体の力価に従って、初感染および2次感染の症例に分 類された。 血清の46.6%は、使用された4ペプチドに対して陽性であった。ペプチド B 19−6、20−1、20−2、および20−3に対する陽性率56.8% 、79.6%、77.1%、および83.1%がそれぞれ得られた。 各ペプチドについて、試料/カットオフ値の光学濃度値で計算された反応指数 の平均値は、それぞれ1.07、1.52、1.57、お よび1.49であった。 マウスの血清: 使用された間接ELISAは、上述のようであったが、ペルオキシダーゼに接合 した抗マウスIgを使用した。抗ペプチド血清中で得られた抗体の力価は、概し て1/10000以上であった。 実施例8 Neisseria meningtidisのP64kタンパク質中へのプレM/M断 片の挿入 本実施例においては、デング熱2(A15株)およびデング熱4(81466 9株)のプレタンパク質の断片を、我々のグループにおいて以前にキャラクタリ ゼーションを行ったN.meningtidisタンパク質(Silva,R.et al.1992.Neisse ria meningitidis由来の外膜タンパク質をコードする塩基配列およびワクチン調 製における該タンパク質の用途。欧州特許第0474313号、1997年)、 すなわちP64kタンパク質に挿入して発現させた(Zhao,B.et al.1986.タ イプ4デング熱ウィルスの全長DNA配列のクローニング。構造タンパク質をコ ードする遺伝子の解析。Virol.155 p.77)。前記P64kは、いくつかの動物 モデルにおいて高い免疫原性を示した。そのうえ、大腸菌(E.coli)におけるP 64kの発現レベルは、菌体の全タンパク質の30%を越える。 P64kタンパク質(64kDa)は2量体を形成する性質を有し、それぞれ のサブユニット内に2つの機能性ドメインを有する。一方のドメイン(1〜10 0)は、リポ酸結合活性を有し、他方のドメイン(117〜594)は、リポア ミド−デヒドロゲナーゼ活性を有する。いずれのドメインも、X線結晶構造解析 によって、相互に独立した配座ドメインであると同定されている(Li de laSier ra,I.et al.1994.,Neisseria meningitidis由来の組換え型外膜タンパク質 の結晶化と予備的X線調査。J.Mol.Biol.235 p.1154、および、Neisseria me ningitidis由来の表面抗原のリポアミドデヒドロゲナー ゼドメインの分子構造。J.Mol.Biol.269p.129)。 プレM/Mタンパク質の断片1〜42および断片92〜133の挿入を行うに あたって、前記一方のドメイン(アミノ酸位置45において)を選択した。とい うのも、この小さなドメインは露出度がより高く、2量体形成に関与していない と考えられるためである。このことは、天然のP64kに対するキメラタンパク 質の全体構造の変化が、挿入部位を2量体の形成に直接関与するドメイン117 〜594に選んだ場合よりも、小さいことを示唆した。 融合タンパク質の産生に使用されるP64k遺伝子の、リポ酸結合領域を含む 、アミノ酸44〜53(TLETDKATMD)をコードする領域を、予めTL DLEMDに改変しておいた。この改変は、原発性肝硬変を有する患者の血清に よってP64kが認識されることを阻止するために行ったものであり、これらの 患者は、ヒトジヒドロリポアミドアセチル基転移酵素ミトコンドリア内に存在す る相同エピトープに対する自己抗体を有する(Tuaillon,N.et al.1992.原発 性胆汁性肝硬変内の抗M2自己抗体によって特異的に認識されるジヒドロリポア ミドアセチル基転移酵素のリポイル合成オクトデカペプチド。J.Immunol.148 p.445) 2つのクローンを作製するための戦略を以下に説明する。 断片Pre−2、M−2、およびM−4は、それぞれ、オリゴヌクレオチド1 と2、3と4、および5と6を用い(図2を参照)、鋳型としてpD−5プラス ミドを用いて、鎖長延長反応によって増幅した。このpD−5プラスミドは、p ブルースクリプト(pBluescript)ベクター(stratagene)中にクローン化され たデング熱2ウィルス(A−15株)由来のプレM/M遺伝子のコピーを含む。 それぞれの場合で得られたDNAバンド(120bp)を、XbaI(Pre− 2およびM−2)またはXbaI/EcoRI(M−4)によって消化し、ベク ターpM−92にクローン化されたP64k遺伝子の135〜1 45位に人工的に作成された対応部位に、クローン化した。さらに、三種連結反 応により、前記XbaIおよびEcoRI部位内にM−2およびM−4バンドを 含むキメラクローンを作製した。順方向の挿入箇所を有する組換え型クローンは 、制限酵素分析およびDNA配列決定によって同定した。 Pre−2(pD31)、M−2(pD30)、M−2/M−4(pD33) およびM−4(pD34)のクローンによって産生される融合タンパク質を、ト リプトファンオペロン(ptrp)のプロモータ作用下に、大腸菌MM294株 (F-endA1 hsdR17(rk -mk +)supE44 thi-1 relAl? RfbD1? SpoT1?)内で発現さ せた。すべての場合について、予想どおりのサイズのタンパク質が得られ、それ らの発現レベルは、細菌の全タンパク質の30%に達したが、PD31タンパク 質は非常に不安定であった(図7)。すべての融合タンパク質は、ELISA( 図示せず)およびウェスタンブロッティング(図8)において、いくつかの抗P 64kマウスモノクローナル抗体によって認識され、全細胞抽出液中においては 顕著な分解が認められた。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、配列リストに 示した。 非変性プロトコールによって粗精製したPD33およびPD34融合タンパク 質によるマウス免疫化の結果、ELISAにおいてこれらのタンパク質に対する 高い力価(1/100000)が認められ、同時にELISAにおいて1/40 00の力価を有する合成ペプチドに対する抗体が得られた。 図面の説明 図1.デング熱ウィルスのプレタンパク質(A)およびMタンパク質(B)の 、疎水性、接近可能性、および、たわみ(フレキシビリティ)プロファイル。 図2.プレタンパク質(A)およびMタンパク質(B)の2次構造および接近 可能性予測。AA:アミノ酸、PHD sec:2次構造予 測(E=ベータ、H=ヘリックス、L=ループ)、P−3 acc:接近可能性 予測(e=露出、b=非露出)、Sub sec(Subacc):2次構造( 接近可能性)予測が82.4%(70%)有効である残基。 図3.プレタンパク質およびMタンパク質の可変性プロファイル。可変性は、 3組のフラビウィルス配列を考慮して算出した。Dengue:15のデング熱 単離体の配列、MBV:デング熱ウィルスを保有する蚊によって伝達されたフラ ビウィルス配列(Kunjin,West Nile Virus,Murray Valley Encephalitis and Sait Louis Encephalitis)、Flavivirus:30より多くの異なるフ ラビウィルス単離体の配列(MBV+黄熱病(FA)、Langat(LAN) 、Louping III(L1)、ダニ媒介脳炎(ETG)) 図4.プレタンパク質(A)およびMタンパク質(B)のT細胞エピトープの 予測。AMPHI 7(11):7(11)残基の両親媒性セグメントの予測であり、両親 媒性ブロックの中央のアミノ酸残基(+印を付した)が潜在的に抗原性を有する 。RT4(5):4(5)残基の抗原プロファイルの予測であり、+印を付した 残基はプロファイルを満たす残基である。 図5.ペプチド19−6,19−5および20−2によって免疫化されたマウ スの脾臓T細胞のデング熱ウィルス抗原(濃度:10,20,および40μg/ml)に対する 増殖応答である。 図6.ペプチドによって免疫化されたマウスおよび対照のマウスの生存百分率 。ペプチド19−5,19−6および20−1に対して誘導された防御のレベル は統計上有意であった。 図7.融合タンパク質およびP64kタンパク質(プラスミドpM−92)に よって形質転換した大腸菌MM294株の10% SDS−PAGEである。レ ーン1:形質転換されていないMM294株、レーン2:pM−92/MM29 4、レーン3:pD−30/MM2 94、レーン4:pD−31/MM294、レーン5:pD−33/MM294 、レーン6:pD−34/MM294。 図8.融合タンパク質およびP64kタンパク質(pM−92プラスミド)で形 質転換した大腸菌MM294株のAcM114を用いたウェスタンブロット。レ ーン1:形質転換されていないMM294株、レーン2:pM−92/MM29 4、レーン3:pD−30/MM294、レーン4:pD−31/MM294、 レーン5:pD−33/MM294、レーン6:pD−34/MM294。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 15/09 C12N 15/00 A // A61K 39/12 A61K 37/02 (72)発明者 バスケス ラムド,スサーナ キューバ国 11500 ハバナ市 ラ リサ レパルト フラガ アベニダ 31 # 31607 エントレ 316 イ 318 (72)発明者 グスマン ティラド,グアダルペ キューバ国 11300 ハバナ市 プラヤ カジェ 28 #116 エ/プリメーラ イ テルセラ (72)発明者 ギジェン ニエト,ヘラルド エンリケ キューバ国 10400 ハバナ市 プラサ ベダド リネア ヌメロ 6 エ/エネ イ オ アパルタメント 4 (72)発明者 パルド ラソ,オルランド ルイス キューバ国 10700 ハバナ市 10 デ オクトゥブレ ラウトン % ベアレス イ 11 フォントス #125 (72)発明者 チネア サンティアゴ,グライ キューバ国 10600 ハバナ市 プラヤ % 31 イ 33 カジェ 186 #3115 アパルタメント 4セー (72)発明者 ペレス ディアス,アナ ベアトリス キューバ国 10400 ハバナ市 プラサ ベダド カジェ ヘー #301 エントレ 13 イ 15 (72)発明者 プポ アントゥネス,マリッサ キューバ国 11000 ハバナ市 サン ミ ゲル デル パドロン バリオ オブレロ カジェ メルカド #14511 エ/テル セラ イ フィナル (72)発明者 ロドリゲス ロチェ,ロスマリ キューバ国 32400 ラバナ バウタ レ パルト アリグアナボ エディフィシオ 6 アパルタメント 18 (72)発明者 レイエス アコスタ,オスバルト キューバ国 10700 ハバナ市 10 デ オクトゥブレ ラウトン % サン ラサ ロイ サン アナスタスィオ カルメン #54 (72)発明者 ガライ ペレス,イルダ エリサ キューバ国 ハバナ市 アバナ デル エ ステ コヒマル % イ イ アチェ カ ジェ 26 #8408 (72)発明者 パドロン パロマレス,ガブリエル キューバ国 10600 ハバナ市 プラヤ アベニダ 31 #18207 エ/182 イ 184 (72)発明者 アルバレス ベラ,マイリン キューバ国 10700 ハバナ市 10 デ オクトゥブレ ルヤノ カジェ ペレス #208 エ/ルイス イ ビジャヌエバ (72)発明者 モリエル ディアス,ルイス キューバ国 11900 ハバナ市 アロヨ ナランホ カジェ プリメーラ ヌメロ 5 エ/2 イ 4 レパルト アルカサ ル (72)発明者 ペレス インスイタ,オマイダ キューバ国 11500 ハバナ市 ラ リサ カジェ 310 #2938 エ/29 イ 31 レパルト “フラガ" (72)発明者 ペレグリノ マルティネス デ ラ コテ ラ,ホセ ルイス キューバ国 11500 ハバナ市 ラ リサ カジェ 310 ヌメロ 2934 エ/29 イ 31 レパルト “フラガ"

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.アミノ酸領域3〜31,57〜92,69〜93、および103〜124 の間で構成され、いずれかのデング熱ウィルス血清型と反応する少なくとも1つ の交差反応エピトープを含むことを特徴とするデング熱ウィルスのプレM/Mタ ンパク質に関係する合成ペプチドまたは疑似化合物。 2.アミノ酸領域3〜31,57〜92,69〜93、および103〜124 を有する、デング熱ウィルスのプレM/Mタンパク質に関係する合成ペプチドで あって、それぞれ配列表におけるペプチド19−6,19−5,20−1および 20−3であることを特徴とする請求項1記載の合成ペプチド。 3.使用されるアジュバントまたは伝達体とは関係なく、タンパク質または他 の担体に結合されているか、あるいは結合されていない、請求項1および2記載 のペプチドまたはその一部を含むことを特徴とする、抗フラビウィルス診断試薬 または製剤。 4.請求項1および2に記載の配列を認識することを特徴とするフラビウィル ス特異的抗体またはその一部。 5.請求項4記載の抗体またはその一部を含むことを特徴とする抗フラビウィ ルスワクチンまたは治療用製剤、または診断試薬。 6.アミノ酸領域1〜42および92〜134の間で構成され、担体タンパク 質に融合された、デング熱2および4ウィルスのプレM/Mタンパク質のエピト ープを含むことを特徴とする遺伝子構築物。 7.配列リストにPD31(Pre−2)、PD30(M−2)、PD34( M−4)、およびPD33(M−2/M−4)として記載される、Neisseria me ningitidisのP64kタンパク質に融合されていることを特徴とする請求項6記 載の遺伝子構築物。 8.フラビウィルスのプレM/Mタンパク質の少なくとも1つのエピトープを 含むことを特徴とする請求項6および7に記載の遺伝子構 築物。 9.請求項6,7および8に記載の少なくとも1つの遺伝子構築物の産物、ま たはその一部を含むことを特徴とする診断試薬または製剤。 10.請求項6および7に記載の配列を認識することを特徴とする抗体または 該抗体の一部分。 11.請求項10記載の抗体または該抗体の一部分を含むことを特徴とする抗 フラビウィルス製剤または診断試薬。
JP53348698A 1997-01-15 1998-01-13 デング熱ウイルスのプレm/mエピトープ、合成ペプチド、キメラタンパク質およびその用途 Expired - Fee Related JP3647048B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU13/97 1997-01-15
CU1997013A CU22683A1 (es) 1997-01-15 1997-01-15 Epítopes de la proteína pre-m/m del virus del dengue, péptidos sintéticos, proteínas quiméricas y sus usos
PCT/CU1998/000001 WO1998031814A1 (es) 1997-01-15 1998-01-13 Epitopes de la proteina pre-m/m del virus del dengue, peptidos sinteticos

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2001508457A true JP2001508457A (ja) 2001-06-26
JP3647048B2 JP3647048B2 (ja) 2005-05-11

Family

ID=5459193

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP53348698A Expired - Fee Related JP3647048B2 (ja) 1997-01-15 1998-01-13 デング熱ウイルスのプレm/mエピトープ、合成ペプチド、キメラタンパク質およびその用途

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6383488B1 (ja)
EP (1) EP0966535B1 (ja)
JP (1) JP3647048B2 (ja)
CN (1) CN1198933C (ja)
AT (1) ATE284444T1 (ja)
AU (1) AU743414B2 (ja)
BR (1) BR9807486A (ja)
CA (1) CA2277816A1 (ja)
CU (1) CU22683A1 (ja)
DE (1) DE69828032T2 (ja)
ES (1) ES2235310T3 (ja)
HK (1) HK1025999A1 (ja)
MY (1) MY120971A (ja)
NO (1) NO993468L (ja)
WO (1) WO1998031814A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009507864A (ja) * 2005-09-16 2009-02-26 セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア デングウイルスのカプシドタンパク質を有する、デングウイルスに対する防御反応を誘導することができる医薬品組成物

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU23245A1 (es) * 2001-07-16 2007-10-17 Inst De Medicina Tropical Pedr CADENAS QUIMéRICAS CODIFICANTES PARA PROTEINAS INDUCTORAS DE EFECTOS CONTRA VIRUS. PREPARADOS UTILIZANDO PROTEINAS QUIMéRICAS
AU2002356690B2 (en) * 2001-12-04 2008-07-24 Bavarian Nordic A/S Flavivirus NS1 subunit vaccine
EP1454988A1 (en) * 2003-03-03 2004-09-08 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Infectious flavivirus pseudo-particles containing functional prM-E envelope proteins
US7281274B2 (en) * 2003-10-16 2007-10-09 Lmp Media Llc Electronic media distribution system
IN2012DN03294A (ja) * 2004-07-27 2015-10-23 Government Of The Us Secretary Of The Dept Of Health And Human Services Ct S For Disease Control And
CU23630A1 (es) 2006-10-30 2011-02-24 Ct Ingenieria Genetica Biotech Moléculas peptídicas quiméricas con propiedades antivirales contra los virus de la familia flaviviridae
WO2009024534A2 (en) * 2007-08-17 2009-02-26 Intercell Ag Japanese encephalitis virus (jev) and tick-borne encephalitis virus (tbev) peptides stimulating human t cell responses
CU20080028A6 (es) 2008-02-29 2011-02-24 Ct Ingenieria Genetica Biotech Compuestos químicos obtenidos in silico para la preparación de composiciones farmacéuticas para atenuar o inhibir la infección por virus dengue y otros flavivirus
CN108610416B (zh) * 2008-10-13 2022-01-14 生物医学研究所 登革热病毒中和抗体及其用途
CN101921310B (zh) * 2009-06-15 2014-03-12 温州医学院 登革病毒特异性hla-a2限制性表位肽及应用
WO2011133112A1 (en) * 2010-04-20 2011-10-27 National University Of Singapore Cell penetrating peptide derived from the premembrane protein of flavivirus
BR112013030637A2 (pt) * 2011-05-26 2018-06-12 Inst De Medicina Molecular peptídeo derivado do vírus da dengue (denv) e métodos para a inibição da replicação de flavivírus
CU24188B1 (es) * 2012-12-27 2016-07-29 Ct De Ingeniería Genética Y Biotecnología Composición vacunal contra el virus dengue
KR20160027019A (ko) * 2013-06-26 2016-03-09 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 뎅기 바이러스 백신에 대한 방법 및 조성물
TWI769185B (zh) 2016-10-27 2022-07-01 海樂源有限公司 登革熱類病毒顆粒、抗登革熱病毒抗體、及含其之組合物
CN116082499B (zh) * 2021-11-08 2023-10-27 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗登革ns1蛋白的抗体及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996040933A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Infectious dengue 2 virus pdk-53 as quadravalent vaccine

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009507864A (ja) * 2005-09-16 2009-02-26 セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア デングウイルスのカプシドタンパク質を有する、デングウイルスに対する防御反応を誘導することができる医薬品組成物

Also Published As

Publication number Publication date
DE69828032T2 (de) 2005-12-01
EP0966535A1 (en) 1999-12-29
AU5649998A (en) 1998-08-07
ATE284444T1 (de) 2004-12-15
JP3647048B2 (ja) 2005-05-11
CN1198933C (zh) 2005-04-27
ES2235310T3 (es) 2005-07-01
DE69828032D1 (de) 2005-01-13
NO993468L (no) 1999-09-14
AU743414B2 (en) 2002-01-24
US6383488B1 (en) 2002-05-07
MY120971A (en) 2005-12-30
CN1249781A (zh) 2000-04-05
WO1998031814A1 (es) 1998-07-23
CA2277816A1 (en) 1998-07-23
CU22683A1 (es) 2001-07-20
NO993468D0 (no) 1999-07-14
EP0966535B1 (en) 2004-12-08
HK1025999A1 (en) 2000-12-01
BR9807486A (pt) 2000-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bray et al. Mice immunized with recombinant vaccinia virus expressing dengue 4 virus structural proteins with or without nonstructural protein NS1 are protected against fatal dengue virus encephalitis
US8728488B2 (en) Methods of inducing an immune response in a host by administering flavivirus immunogens comprising extracellular viral particles composed of the premembrane (prM) and envelope (E) antigens
ES2237115T3 (es) Particulas de proteinas de la envoltura del hcv: uso para la vacunacion.
JP3647048B2 (ja) デング熱ウイルスのプレm/mエピトープ、合成ペプチド、キメラタンパク質およびその用途
US7238356B2 (en) Core-glycosylated HCV envelope proteins
EP1005363B1 (en) Recombinant dimeric envelope vaccine against flaviviral infection
AU2002257392A1 (en) Core-glycosylated hcv envelope proteins
KR20040030056A (ko) 바이러스에 대한 효과를 유도하는 단백질을 코딩하는키메라 사슬
WO1998023754A1 (es) Procedimiento para la expresion de genes de los virus del dengue
MXPA99006629A (en) Epitopes of the protein pre-m/m of the dengue virus, synthetic peptides
HRP20030946A2 (en) Core-glycosylated hcv envelope proteins
MXPA00001022A (en) Recombinant dimeric envelope vaccine against flaviviral infection
CZ20004802A3 (cs) Částice obsahující obalové proteiny HCV a jejich použití pro očkování

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20040330

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20040630

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20040817

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20041117

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20050111

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20050208

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees