MXPA99006629A - Epitopes de la proteina pre-m/m del virus del dengue, peptidos sinteticos - Google Patents

Abstract

La presente invención trata de cinco péptidos sintéticos pertenecientes a la proteína pre-M/M del virus Dengue-2 correspondientes a las secuencias aminoacídas 3-31, 45-67, 57-92, 69-93, 103-124;la respuesta inmune a los péptidos fue evaluada en ratones;se construyeron también proteínas de fusión recombinantes que incluyen regiones de pre-M/M;se comprobóla presencia de epítopes para células B de ratones y de humanos en los péptidos de la proteína pre-M/M del virus Dengue;los péptidos 3-31, y 103-124 indujeron anticuerpos neutralizantes contra los cuatro serotipos del virus Dengue;los estudios de linfoproliferación con los péptidos 57-92, y 3-31 mostraron reconocimiento cruzado de células T péptido específicas al virus;los ratones con el virus Dengue-2 mostraron protección inducida por los péptidos 3-31, 57-92, y 69-93;así, la presente de epítopes secuenciales en la proteína pre-M/M del virus Dengue-2 y la posible relevancia de los mismos en la respuesta inmune contra dicho flavivirus quedo demostrada.

Description

EPITOPES DE LA PROTEINA PRE-M/M DEL VIRUS DEL DENGUE, PEPTIDOS SINTENTICOS SECTOR TÉCNICO La presente invención se relaciona con la rama de la biotecnología y con las técnicas de ADN recombinante y en particular con la obtención de péptidos sintéticos que codifican para la proteína pre-M/M del virus dengue serotipo 2 y proteínas quiméricas que contiene epítopes de la proteína pre-M/M del virus dengue serotipo 2 y 4. El objetivo técnico de la misma consiste en identificar epítopes neutralizantes y protectores de la proteína pre-M/M, reactivo cruzado para todos los sero-tipos del virus de Dengue, con el objetivo de obtener un inmunógeno para vacunación en humanos.

TÉCNICA ANTERIOR El virus Dengue pertenece al género Flavivirus de la familia Flaviviridae [Westaway, E.G. y otros 1985. Flaviviridae. Intervirol. 24 p. 183.]. Es un virus envuelto cuyo material genético, una cadena sencilla de A.R.N. de polaridad positiva, codifica para una poliproteína procesada co- y post-transduccionalmente por proteasas celulares y del propio virus.

En la membrana viral están ancladas dos de las proteínas estructurales del virus: E (envoltura) y M (membrana), mientras que conformado la nucleocápsida ¡sométrica se encuentran múltiples copias de la otra proteína estructural: C (cápsida). Además, se han identificado al menos siete proteínas no estructurales (NS1 , NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, y NS5). Las glicoproteínas E y NS1 son capaces individualmente de conferir protección activa y pasiva contra el serotipo homólogo del virus Dengue, siempre que la alta complejidad conformacional de sus epítopes relevantes sea preservada. Por esta causa, para la evaluación inmunológica de ambas proteínas se han seleccionado fundamentalmente sistemas recombinantes de células eucarióticas, por ejemplo: virus vaccinia [Bray, M. y otros 1989. Mice immunized with recombinant vaccinia virus expressing dengue-4 structural proteins with or without nonstructural protein NS1 are protected against fatal dengue virus encephalitis J. Viro!. 63 p. 2853.] y baculovirus [Zhag, Y. M. y otros 1988. Immunization of mice with dengue structural protein and nonstructural protein NS1 expressed by baculovirus recombinant induces resistance to dengue virus encephalitis. J. Virol. 62 p. 3027.]. La pequeña proteína M (8 kDa) es sintetizada como un precursor glicosilado denominado pre-M (22 kDa aprox.), el cual sufre un corte endoproteolítico tardío justo antes o durante la liberación del virus de la célula infectada [Murray, J. M. y otros 1993. Processing of the dengue virus type 2 proteins prM and C-prM. J. Gen. Virol. 74 p. 175.]. El corte en cuestión, realizado probablemente por una proteasa celular, parece ocurrir en las vesículas acídicas de post-Golgi, siendo inhibido por agentes que desestabilicen el bajo pH de las mismas [Randolph, V. B. y otros 1990. Acidotropic amines inhibit proteolytic processing of flavivirus prM proteín. Virol. 174 p. 450.]. El fragmento pre- ha sido identificado in vitro sólo en el medio extracelular, desconociéndose su destino in vivo [Murray, J. M. y otros 1993. Processing of the dengue virus type 2 proteins prM and C-prM. J. Gen. Virol. 74 p. 175.]. La función de pre-M durante la vía exocítica que recorren los flavivirus, se supone sea evitar que el dominio fusogénico de membranas que posee E se active ante el pH acídico del entorno [Randolph, V. B. y otros 1990. Acidotropic amines inhibit proteolytic processing of flavivirus prM proteín. Virol. 174 p. 450.], evento que de ocurrir ahora aboliría la liberación viral. De hecho, se ha detectado que pre-M y E ¡nteractúan en los viriones inmaduros intracelulares [Randolph, V. B. y otros 1990. Acidotropic amines inhibit proteolytic processing of flavivirus prM protain. Virol. 174 p. 450.], así como que la conformación nativa de E sólo se adquiere en presencia de pre-M [Konishi, E. y Masón, P.W. T993. Proper maturation of the Japanese encephalitis virus envelope glycoprotein requires cosynthesis with the premembrane proteín. J. Virol. 67 p. 1672.]. Además, los viriones ya liberados que sólo posean pre-M en sus membranas presentan por lo general una infectividad menor que los viriones completamente maduros [Randolph, V. B. y otros 1990. Acidotropic amines inhibit proteolytic processing of flavivirus prM protein. Virol. 174 p. 450], en los cuales M predomina sobre pre-M, si bien ambas están presentes. Tanto pre-M como M confieren protección activa cuando se han expresado en virus vaccinia recombinante, no así el fragmento pre- [Bray, M. y Lai, C.-J. 1991. Dengue virus premembrane and membrane proteins elicit a protective immune response, Virol. 185 p. 505.], destacándose además que la combinación de pre-M o M con la glicoproteína E en un mismo virus vaccinia recombinante confiere en general niveles de protección muy superiores a los alcanzados por cada proteína individualmente. Asimismo, determinados anticuerpos contra pre-M/M son capaces de proteger pasivamente en ratones [Kaufman, B. M. y otros 1989. Monoclonal antibodies for dengue virus prM glycoprotein protect mice against lethal dengue infection. Am. J. Trop. Med. & Hyg. 41 p. 576.]. El empleo de péptidos sintéticos ha permitido el estudio de las bases moleculares en la determinación de las propiedades antigénicas basadas en su conformación espacial así como el conocimiento de las propiedades inmunológicas del antígeno involucrado (Arnon, R. y Sela, M. 1985. Synthetic Vaccines: present and future. Ann. Inst. Pasteur/lrnmunol 136 D, 271-282]. Los péptidos sintéticos como subunidades vacunales anti-Dengue permitirán incluir en la formulación final solamente aquellos epítopes protectores que no desaten el fenómeno de la inmunoamplificación [Halstead, S.B., y O'Ruourke, E.J. 1977. Dengue viruses and mononuclear phagocytes, I.

Infection enhancement by non-neutralizing antibody, J. Exp. Med. 146 p. 201 ; Halstead, S.B. 1979. In vivo enchancement of dengue virus ¡nfection in rhesus monkeys by passively transferred antibody. J. Infect. Dis. 140 p. 527.]. o, alternativamente, incluir epítopes protectores a cada uno de los cuatro serotipos. La caracterización de los determinantes antigénicos de E y NS1 ya se acomete con éxito [Roehrig, J. T. y otros 1994. T-helper cell epitopes on the E-glycoprotein of dengue-2 Jamaica virus. Virol. 198 p. 31.], pero aún no existen estudios similares sobre la no menos importante proteína pre-M/M, constituyendo los resultados del presente trabajo un primer paso en este sentido. Los intentos de sobre-expresar en E. coli las proteínas flavivirales preM, y E no siempre han resultado exitosos [Chambers, T. J. y otros 1990. Production of yellow fever virus proteins in infected cells: identificación of discrete polyprotein species and analysis of cleavage kinetics using region-specific polyclonal antisera. Virol. 177 p. 159; Yan, B. S. y otros 1994. Truncating the putative membrane association región circumvents the difficulty of expressing hepatitis C virus protein E1 in Escherícia coli. J. Virol. Meths. 49 p. 343.]. Al parecer, las regiones hidrofóbicas que estas proteínas poseen en el C-terminal son la causa de que los niveles de expresión heteróloga san Ínfimos o nulos [Yan, B. S. y otros 1994. Truncating the putative membrane association región circumvents the difficulty of expressing hepatitis C virus protein E1 in Escherícia coli. J. Virol. Meths. 49 p. 343.].

Por lo general, la expresión de dichas proteínas (así como de NS1 ) en E. coli, se ha logrado fusionándolas (fragmentadas o no) a otras proteínas bacterianas, por ejemplo: ß-galactosidasa [Cañe, P.A. y Gould, E.A. 1988. Reduction of yellow fever mouse neurovirulence by immunization with a bacterially synthesized non-structural protein (NS1 ) fragment. J. Gen. Virol. 69 p. 1241.], TRPE [Megret, F. y otros 1992. Use of recombinant fusión proteins and monoclonal antibodies to define linear and discontinuos antigenic sites on the Dengue envelope glycoprotein. Virol. 187 p. 480.] y la proteína A de Staphylococcus aureus [Murray, J. M. y otros, 1993. Processing of the dengue virus type 2 proteins prM and C-prM. J. Gen. Virol. 74 p. 175.]. En estas proteínas de fusión la mayoría de los epítopes conformacionales relevantes están ausentes, pues aunque los antisueros generados contra las mismas pueden reconocer al virus completo, no son capaces de neutralizarlo ni de inhibir sus propiedades hemaglutinantes [Megret, F. y otros 1992. Use of recombinant fusión proteins and monoclonal antibodies to define linear and discontinuous antigenic sites on the Dengue envelope glycoprotein. Virol. 187 p. 480.]. Sin embargo, existen reportes recientes que indican que la solubilidad de las proteínas de fusión, y consecuentemente, el empleo de métodos no desnaturalizantes para su purificación, pueden preservar muchos de los epítopes neutralizantes [Seif, S.A. y otros 1995. Finer mapping of neutralizing epitope(s) on the C-terminal of Japenese encephalitis virus E-protein expressed ¡n recombinant Escherichia coli system. Vaccine 13 p. 1515.]. y protectores [Srivastava, A.K. y otros 1995. Mice immunized with a dengue type 2 virus E and NS1 fusión protein made in Escherichia coli are protected against lethal dengue virus ínfection. Vaccine 13 p. 1251.] presentes en las mismas. En el caso de pre-M, su dominio pre- posee 6 cisternas involucradas en 3 puentes disulfuro, así como un sitio de N-glicosilación en la asparagina 69. La estructura de E y NS1 es mucho más complicada aún, involucrando 6 puentes disulfuro y varios sitios de N-glicosilación. Sin embargo, el pequeño ectodominio que posee M está libre en apariencia de tales complejidades conformacionales al no presentar cisteínas ni estar glicosilado en su forma natural. Las inserciones de fragmentos heterólogos en zonas permisivas de proteínas inmunogénicas cuya topología sea más o menos conocida, y la inmunización con dichas fusiones, es una alternativa complementaria al empleo de los péptidos sintéticos. Ambas estrategias permiten definir la presencia de epítopes de células B secuenciales, así como epítopes T. La importancia biológica de dichos epítopes puede ser evaluada experimentalmente para decidir su inclusión o no en determinada preparación vacunal.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN Cinco péptidos pertenecientes a la proteína pre-M/M del virus Dengüe-2 correspondientes a las secuencias aminoacídicas 3-31 , 45-67, 57-92, 69-93 y 103-124 denominados B19-6, B20-2, B19-5, B20-1 y B20-3 respectivamente y que cubren el 58% de su secuencia aminoacídica (97/166 AA), fueron sintetizados químicamente. Los péptidos fueron inoculados en ratones Balb/c conjugados o no conjugados a una proteína carrier. Los sueros obtenidos tras la inmunización con los péptidos conjugados fueron evaluados mediante la técnica de neutralización in vitro por reducción del número de placas y por ELISA. Se estudió también la protección activa frente al reto con el virus Dengue 2 en los ratones inmunizados. Se determinó la respuesta de anticuerpos por ELISA y la capacidad de los esplenocitos murinos de reconocer de forma cruzada al virus en un ensayo de linfoproliferación en el grupo de ratones inmunizados con los péptidos no conjugados. También se construyeron proteínas de fusión en las cuales se insertaron independientemente dos de las cuatro regiones cubiertas por los péptidos (1-42 y 92-133), y se expresaron en la bacteria Escherichia coli. La inmunización con cada una de estas fusiones permitirá complementar los resultados obtenidos con los péptidos sintéticos. Se comprobó la presencia de epítopes para células T de ratones y de humanos al ser reconocidos los péptidos por anticuerpos séricos de animales inmunizados y de individuos con diagnostico clínico y serológico de infección por dengue por la técnica ELISA. Los péptidos B19-6 y B20-3 (3-31 y 103-124) resultaron capaces de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes contra los cuatro serotipos del virus Dengue. Los estudios de linfoproliferación realizados a los ratones inmunizados con los péptidos 19-5 y 19-6 mostraron reconocimiento cruzado de células T péptido-específicas al virus. Por otra parte los ratones retados con el virus dengue 2 mostraron un nivel de protección inducido por los péptidos 19-6, 19-5 y 20-1. De esta manera, la presencia de epítopes secuenciales en la proteína pre-M/M del virus Dengue-2 queda demostrada, así como la posible relevancia de los mismos en la respuesta inmune contra dicho flavivirus.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN •10 EJEMPLO 1 "Predicción de regiones antigénicas y epítopes de células-T de la proteína pre-M/M del virus Dengue".

Se aplicaron diferentes métodos teóricos para la predicción de regiones antigénicas en la proteína pre-M/M del virus Dengue-2, que son aquellas de mayor probabilidad de ser reconocidas por anticuerpos obtenidos contra las proteínas virales, así como de generar anticuerpos que reconozcan las proteínas originales en cuestión. También se aplicaron métodos para la predicción de epítopes de células T. Como resultado se encontraron cinco péptidos iniciales (cuatro pertenecientes a pre- y uno a M) que contienen posibles epítopes de células B y T, que sirvieron de base para el estudio de la estructura antigénica de estas proteínas y la determinación experimental de posibles epítopes importantes inmunológicamente. 1.1.- Predicciones de antigenicidad humoral Dado que la estructura tridimensional de la proteína pre-M/M del virus Dengue no ha sido determinada experimentalmente, ni existe similitud significativa a nivel de secuencia con ninguna proteína de estructura tridimensional conocida, los métodos usados para la predicción de antigenicidad se basaron únicamente en la secuencia aminoacídica, tomándose para nuestro ejemplo la correspondiente a la cepa A15 de Dengue-2 aislada en Cuba en 1981 [Kouri, G. y otros 1986. Haemorrhagic dengue in Cuba: history of an epidemic. Bull. P.A.H.PO. 20 p. 24.]. Las regiones potencialmente antigénicas fueron seleccionadas de acuerdo a los siguientes criterios: a) Regiones de alta propensión antigénica de acuerdo a diferentes métodos de predicción basados en escalas de hidrofilicidad [Hoop, T.P. y Woods, K.B. 1981. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78 p. 3824; Parker, J.M.R. y otros 1986. New hydrophility sale derived from HPLC peptide retention data: correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-ray derived accessible sites. Biochemistry 25 p. 5425.], flexibilidad [Karplus, P.A. y Schultz, G.E. 1985. Prediction of chain flexibility in proteins. A tool for the selection of peptide antigens. Naturwissenschaften 72 p. 212.] y accesibilidad [Emini, E.A. y otros 1985. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus specific synthetic peptide. J. Virol. 55 p. 836.]. b) Regiones con alta probabilidad de formar lazos y giros de acuerdo a predicciones de estructura secundaria que emplean PHD (Rost, B. y Sander, C. 1993. Prediction of protein secondary structure at better than 70% accuracy. J. Mol. Biol. 232 p. 584; Rost, B. y Sander, C. 1994. Combining evolutionary information and neural networks to predict protein secondary structure. Proteins 19 p. 55; Rost, B. y Sander, C. 1994. Conservation and prediction of solvent accesibility in protein families. Proteins 20 p. 216.]. c) Regiones de alta variabilidad que incluyen o no inserciones/supresiones respecto a otros flavivirus, así como regiones potenciales de glicosilación en otros flavivirus que sean usadas como tales o no en el virus Dengue. a) Perfiles de antigenicidad La figura 1 muestra los perfiles que se obtienen al aplicar a los segmentos pre- y M cuatro propiedades de los aminoácidos relacionados con la antigenicidad. En la región pro- existen máximos de hidrofilicidad/accesibilidad en las zonas que comprenden los residuos 6-9, 16-21 , 28-31 , 42-47, 58-65 y 82-91. En la proteína M se destaca la existencia de una extensa región hidrofóbica entre los residuos 41-76, la cual corresponde a las hélices transmembranarias que se suponen no expuestas al sistema inmune. En el pequeño ectodominio de M (residuos 1-40) la región de mayor hidrofilicidad/accesibilidad se extiende entre los aminoácidos 13-31 , existiendo un máximo significativo al inicio de la misma (AA 13-16). b) Predicción de estructura secundaria La figura 2 muestra las predicciones de estructura secundaria y accesibilidad de los segmentos pre- y M de acuerdo al programa PHD. Los resultados de estas predicciones indican que varias regiones potencialmente antigénicas (según los perfiles de la figura 1 ) son propensas a formar lazos/giros-ß con residuos expuestos en la superficie de la proteína. Para la zona comprendida entre los amino ácidos 41-76 de la proteína M se predice la formación de hélices transmembranarias, lo cual concuerda con el carácter hidrofóbico de esta región y sugiere que los péptidos antigénicos de M estarán comprendidos fundamentalmente en el ectodominio (1-40). c) Alineamientos de secuencias de las proteínas pre- y M de Dengue y otros flavivirus. Variabilidad y glicosilación En general, las regiones no expuestas al solvente presentan una mayor conservación dentro de familias de proteínas homologas, por lo que las zonas más variables tienen cierta probabilidad de encontrarse expuestas. En el caso específico de los virus, la variabilidad constituye también un mecanismo de escape ante la presión inmunológica. Naturalmente, esto no excluye que algunas regiones conservadas sean antigénicas ni que existan regiones conservadas en la superficie. El análisis de las secuencias de las regiones pre- y M de 15 aislamientos de los cuatro serotipos de virus Dengue muestra que no menos del 69% de los residuos son estrictamente conservados. Los residuos variables más importantes se encuentran localizados en las posiciones 28-30, 55-59, 69-72 y 80-83 de pre-, así como en 27-30 de M. Estas zonas coinciden por lo general con los máximos de los perfiles antigénicos de la figura 1. La comparación de las secuencias de estas regiones en más de 30 aislamientos flavivirales muestra que la región 1-33 de pre- es altamente variable, con probables lazos propensos a inserciones/supresiones (en el entorno de las posiciones 8 y 30), y varios sitios potenciales de N-glicosilación. En cambio, en el dominio 33-91 de pre- la variabilidad es mucho menor, existiendo varias posiciones estrictamente conservadas en todos los flavivirus, por ejemplo: 6 cisteínas formadoras de 3 enlaces disulfuro, al menos 5 residuos ácidos comprendidos en la región 40-65, así como la secuencia básica 87-91 tras la que ocurre un corte endoproteolítico justo antes o durante de la liberación del virus maduro (ver figura 3). La Asn-69, residuo conservado en el complejo antigénico Dengue, posee la única N-glicosilación existente en la proteína pre-M/M de dicho complejo. Sin embargo, dentro de la familia Flavivirídae esta zona se encuentra en un posible lazo expuesto de alta variabilidad. Asimismo, los residuos de la pre-M/M del virus Dengue que se corresponden con sitios potenciales de N-glicosilación en otros flavivirus (por ejemplo: alrededor de 14 en EJ, ESL, EVM y FA; y 32 en Ll, LAN, FA y ETG), son giros-ß aledaños a zonas predichas como antigénicas. 1.2.- Predicción de epítopes de células-T La predicción se realizó por dos métodos independientes: el método de patrones de Rothbard y Taylor (RT) (Rothbard, J.B. y Taylor, W.R. 1988. A sequence pattern common to T-cell epítopes. EMBO J. 7 p. 93.], y mediante la predicción de segmentos con propensión a formar estructura de hélice alfa antipática (AMPHI 7 y 11) [Margalit, H. y otros 1987. Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence. J. Immunol. 138 p. 2213.]. Los resultados se muestran en la figura 4. 1.3.- Péptidos propuestos para la identificación de epítopes relevantes La determinación de epítopes neutralizantes y en general protectores es de vital importancia para el desarrollo de vacunas de eficacia superior, siendo los péptidos de regiones con alta propensión antigénica muy útiles en la identificación de los mismos, especialmente los de naturaleza lineal. El cuadro 1 muestra un conjunto de péptidos que incluyen regiones propensas a poseer epítopes de células B y T (según los múltiples métodos predictivos empleados en este ejemplo) de la proteína pre-M/M del virus Dengue-2. Si experimentalmente se demuestra la validez de dicha predicción, los epítopes inmunológicamente importantes de cada región serán ubicados con precisión mediante el diseño de péptidos de menor longitud dentro de cada una de ellas.

CUADRO 1 Péptidos antigénicos propuestos de la proteína pre-M/M de Dengue-2 EJEMPLO 2 "Síntesis química de oligopéptidos y oligonucleótidos" 2.1.- Síntesis de oligopéptidos Todos los péptidos fueron sintetizados usando la estrategia Boc-en fase sólida sobre la resina p-metil-benzhidrilamina (resina MBHA de la casa comercial BACHEM, Suiza). Los aminoácidos protegidos fueron suministrados por BACHEM. La protección de los grupos reactivos de las cadenas laterales de los aminoácidos fue la siguiente: Arg (Tos), Asp (Obzl), Cys (4-Me-Bzl), Glu (OBzl), Lys (2-CI-Z), Trp (CHO), Tyr (Cl2-Bzl), Thr (Bzl), y Ser (Bzl). La Asn, la Gln, y la Pro se utilizaron sin protección en las cadenas laterales.

La eliminación del grupo amino protector Boc- se realizó en todos los casos con ácido trifluoroacético (TCA) al 37.5% en diclorometano (DCM). Para la reacción de acoplamiento de cada residuo se utilizó la activación con diisipropilcarbodiimida (DIC) in situ, a excepción de los aminoácidos Asn y Gln, que fueron activados con DIC y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) en N,N-dimetilformamida (DMF). La desprotección final y la liberación del péptido de la resina se realizaron en un equipo especial para este fin. El procedimiento empleado fue el conocido como "Low-High" HF. En la primera parte del procedimiento ("Low HF") el sistema péptido protegido-resina se trató con la mezcla HF (25%): DMS (65%): p-Cresol (10%) durante 120 minutos a 0°C. En el caso de los péptidos con Trp en la secuencia, la mezcla se substituyó por HF (25%): DMS (60%): EDT (10%): p-Cresol (5%). Posterior a este tratamiento, el péptido-resina se lavó con éter dietílico, diclorometano y 2-propanol varias veces, y se secó al vacío. En la segunda parte del procedimiento, ("High HF") el péptido-resina se trató con la mezcla HF (90%): Anisol (10%) durante 60 minutos a 0o. El producto crudo se lavó con éter, se extrajo con una solución de ácido acético al 30% en agua, y se liofilizó. Los péptidos se caracterizaron finalmente por RP-HPLC en una columna BAKER C-18 (4.6 x 100 mm), y por espectrometría de masas usando el FAB como método de ionización en un equipo JEOL HX-110HF.

La secuencia aminoacídica de los mismos, así como su ubicación en la proteína pre-M/M del virus Dengue, aparecen relacionadas en el cuadro 1. 2.2.- Síntesis de oligonucleótidos Los oligonucleótidos fueron sintetizados automáticamente en un equipo Gene Assembler Plus, siguiéndose el método del fosforamidito. La secuencia de los seis oligonucleótidos aparece en el cuadro 2, estando subrayados y doble-subrayados (respectivamente) los sitios Xba I y EcoR I que se crean en cada extremo para la posterior manipulación, y quedando la fase de la proteína codificada definida por los tripletes de bases.

CUADRO 2 Secuencia v posición de los oliqosacáridos sintetizados Posición del Secuencia del oligonucleótido oligonucleótido 1 ) 5' pre DEN-2 5'-TTT CTA GAT TTC CAT TTAACC ACÁ CGTT-3' 2) 3' pre DEN-2 5'-TTTC TAG ACC AAG GTC CAT GGC CAT GAG-3' 3) 5' M DEN-2 5'-TTT CTA GAATCA GTG GCA CTC GTT CCA CAT G-3' 4) 3' M DEN-2 5'-TTTC TAG AAA GCC TGG ATG TCT CAÁ GAT CCA-3' ) 5' M DEN-4 5'-TTT CTA GAT TCA GTA GCT TTAACÁ CCA C-3' 6) 3' M DEN-4 5'-T TGAATT CGC GAA TCT TGG GTT TCT GAG-3' EJEMPLO 3 "Acoplamiento de los péptidos a una proteína carrier y esguema de inmunización 3.1.- Acoplamiento de los péptidos a la BSA El acoplamiento de los péptidos se realizó de la siguiente manera: 1 ) Activación de la BSA: A una disolución de 2.8 mg de albúmina bovina fracción V (BSA) en 250 µl de PBS se le agregaron, gota a gota y con agitación, 80 µl de una solución de reactivo bifuncional éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) 5 µg/µi en dimetii-formamida. Se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos, y se pasó la mezcla por una columna PD10. 2) Acoplamiento del péptido a la BSA activada: Una disolución de 1 mg de péptido disuelto en 300 µl de PBS se añadió, gota a gota y con agitación, a la solución de BSA actividad. Se mantuvo a temperatura ambiente durante 3 horas, determinándose luego la concentración por el método de Lowry. 3.- Esguema de inmunización El esquema de inmunización de los péptidos acoplados a la BSA fue el siguiente: Se inmunizaron ratones Balb/c machos, de 4-6 semanas de nacidos, con 50 µg del conjugado péptido-BSA por vía intraperitoneal. Se realizaron en total 4 inoculaciones, separadas cada una por 15 días. En la primera dosis se empleó el Adjuvante Completo de Freund, y en las otras tres el Adjuvante Incompleto de Freund. A los 7 días de la última inoculación, se extrajo la muestra de sangre de los animales por la vena retro-orbital. Los sueros obtenidos correspondientes a cada péptido fueron conservados a — 20°C hasta su posterior utilización. Se realizaron además dos esquemas de inmunización como control, uno con BSA y otro con PBS.

EJEMPLO 4 Técnica de neutralización in vitro por reducción del número de placas Se realizó la técnica de neutralización según el método reportado por Morens [Morens, D.M. y otros 1985. Simplifield plaque reduction neutralization assay for dengue viruses by semimicro methods in BHK-21 cells: Comparison of the BHK suspensión test with standard plaque reduction neutralization. J. Clin. Microbiol. 22 p. 2590.]. Se prepararon diluciones de cada mezcla de sueros anti-péptido, y de los controles anti-BSA y suero negativo, desde 1/10 hasta 1/640. Cada dilución de suero se puso en contacto con una dilución del virus (cepa A15 de Dengue-2) conteniendo 15-20 UFP/50 µl. La mezcla se incubó a 37° durante 1 hora. Se adicionaron 50 µl de cada mezcla (por triplicado) a las células BHK- 21 contenidas en placas de 24 pozos. Se incubó a 37° durante 4 horas, en una atmósfera de CO2. Se añadieron entonces 0.5 mi de medio con carboximetilcelulosa, dejándose nuevamente en incubación durante varios días en dependencia del serotipo viral empleado, al término de los cuales se realizó la tinción y el conteo de las placas de lisis generadas por el virus. El título se expresó en cada caso como la dilución a la cual se obtuvo un 50% de reducción del número de placas. Los resultados obtenidos son mostrados en el siguiente cuadro 3.

CUADRO 3 NTRP en los sueros anti-péptidos 19-6 y 20-3 EJEMPLO 5 Identificación de epítopes para células T en las secuencias peptídicas Se evaluó el reconocimiento in vivo de los péptidos 19-5, 19-6 y 20-2 por las células T cooperadoras murinas de ratones Balb/c, por la inducción de la producción de anticuerpos. Para esto se inmunizaron los péptidos no conjugados en cuatro dosis de 60 µg/ml con adyuvante de Freund por vía subcutánea y sin adyuvante por vía intraperitoneal. Fueron sangrados los animales después de la segunda y cuarta inmunización y detectados los títulos de anticuerpos anti-péptidos desarrollados. Asimismo se estudió el reconocimiento cruzado de las células T péptido-específicas por el virus a través de un ensayo de linfoproliferación in vitro, para lo cual fueron enfrentados los esplenocitos murinos a antígenos del virus dengue 2 a diferentes concentraciones. Los tres péptidos indujeron respuesta de anticuerpos en los animales inmunizados, siendo incrementados los títulos de anticuerpos tras una cuarta dosis de inmunización, particularmente mayor en el caso del 20-2. Las células T específicas a los péptidos 19-5 y 19-6 reaccionaron de forma cruzada con el virus, no así para el 20-2. Nuestros resultados sugieren que los péptidos 19-5 y 19-6 contienen epítopes para células T cooperadoras de ratones Balb/c, siendo dianas del reconocimiento y la inducción de la respuesta inmune celular frente al virus. El péptido 20-2 parece contener un criptotope de células T, al no haber sido reconocido de forma cruzada en el virus (ver figura 5).

EJEMPLO 6 Ensayo de protección Los ratones fueron retados siete días después de la última inmunización por vía intra-cerebral con una dilución de 1/2500 correspondiente a 100 DL50 del virus dengue 2 (cepa A15 adaptada en ratón). Fue observada la morbilidad y mortalidad en los ratones durante 21 días postinoculación, aplicando el test de Fisher a los resultados obtenidos. El porciento de supervivencia en los animales inmunizados con péptidos y el control son presentados en la figura 6. El nivel de protección inducido a los péptidos 19-5, 19-6 y 20-1 fue estadísticamente significante para una p<0.05.

EJEMPLO 7 ELISA INDIRECTO para detección de anticuerpos anti-péptidos Sueros humanos: Los péptidos 19-6, 20-1 , 20-2 y 20-3 se fijaron a la placa en concentración de 10 µg/ml en regulador de pH de recubrimiento, incubándose a 4°C durante toda la noche. Los sueros se añadieron diluidos 1/200 en PBS- Tween 20. Finalmente se adicionó un conjugado anti-lnmunoglobulinas totales humanas/peroxidasa, y se reveló mediante la adición del substrato (orthophenilendiamine, H2O2, regulador de pH fosfato citrato 0.05 M, pH 5). La lectura se realizó en un lector de ELISA a 492 nm, determinándose el valor de corte para cada péptido. Los sueros utilizados procedían de individuos con infección viral clínica y serológicamente diagnosticada como dengue por las técnicas de Inhibición de la Hemaglutinación (Clarke, D.H. y Casáis, J. 1958. Techniques for hemagglutination and hemagglutation - inhibition with Arthropod Borne Virus. Am. J. Trop. Med. Hyg. 7 p. 561.) y ELISA de Inhibición (Vázquez, S., Fernández, R. 1989. Utilización de un método de ELISA de Inhibición en el diagnóstico serológico de dengue. Rev. Cub. Med. Trop. 41 (1 ) p. 18-26.) para anticuerpos totales antidengue. El estudio incluyó 1 18 sueros de pacientes de las epidemias de Cuba 1981 , Panamá 1994 y Costa Rica 1994; en las que se aisló el virus dengue 2, además de los serotipos 1 y 4 en el caso de Costa Rica, clasificados según los títulos de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación en casos de infección primaria o secundaria. Un 46.6% de los sueros resultaron positivos a los cuatro péptidos empleados. Se obtuvieron porcientos de positividad de 56.8, 79.6, 77.1 y 83.1 % para los péptidos B19-6, 20-1 , 20-2 y 20-3 respectivamente. La media del índice de reactividad, calculado por el cociente DO de la muestra/valor de corte para cada péptido fue de 1.07, 1.52, 1.57 y 1.49 para los cuatro péptidos respectivos.

Sueros murinos: Se realizó la detección y titulación de los anticuerpos por un ELISA indirecto similar al anterior pero revelando con un conjugado anti-lg de ratón con peroxidasa. Los sueros brindaron títulos de anticuerpos de 10 000 o más en la mayoría de los casos.

EJEMPLO 8 Inserción de fragmentos de pre-M/M en la proteína P64K de N. meningitidis En el presente ejemplo hemos expresado fragmentos de la proteína pre-M/M de Dengue-2 ([CEPA A15]) y Dengue-4 (cepa 814669 [) Zhao, B. y otros 1986. Cloning full-length dengue type 4 viral DNA sequences: analysis of genes coding for structural proteins. Virol. 155 p. 77.]) insertados en una proteína de Neisseria meningitidis caracterizada con anterioridad en nuestro grupo [Silva, R. y otros 1992. Nucleotide sequence coding for an outer membrane protein from Neisseria meningitidis and use of said protein in vaccine preparations. European Patent Application 0 474 313 A2.[: P64K, la cual ha demostrado ser altamente inmunogénica en varios modelos animales. Además, el nivel de expresión de P64K en E. coli alcanza más del 30% de las proteínas totales de la bacteria. La proteína P64K (64 kDa), de naturaleza dimérica, posee dos dominios funcionales en cada subunidad: uno de unión a ácido lipoico (1-100) y otro con actividad lipoamida-deshidrogenasa (1 17-594). Ambos han sido identificados como dominios conformacionales relativamente independientes por cristalografía de rayos X [Li de la Sierra, I. y otros 1994. Crystallization and preliminar/ X-ray investigation of a recombinant outer membrane protein from Neissería meningitidis. J. Mol. Biol. 235 p. 1 154; Li de la Sierra, I y otros 1997. Molecular structure of the lypoamide dehidrogenase domain of a surface antigen from Neisseria meningitidiis. J. Mol. B?ol. 269 p. 129.]. Se seleccionó el primero de ellos (en la posición aminoacídica 45) para realizar las inserciones de los fragmentos 1-42 y 92-133 de pre-M/M, por poseer este pequeño dominio una conformación menos rígida que la del segundo, lo que nos sugirió que la estructura global de la proteína quimérica, respecto a la de P64K natural, resultaría menos alterada que si se hubiera empleado un sitio de inserción en el dominio 1 17-594, el cual además participa directamente en la formación del dímero. Al gen P64K empleado en la construcción de las proteínas de fusión se le alteraron preliminarmente sus codones codificantes para los aminoácidos 44-53 (..TLETDKATMD.. ? ..TLDLEMD..), que incluyen la región de unión al ácido lipoico. Con esta modificación se pretendió eliminar el reconocimiento de P64K por los sueros de pacientes con cirrosis biliar primaria, los que poseen auto-anticuerpos contra un epítope homólogo presente en la dihidrolipoamida acetil-transferasa mitocondrial humana [Tuaillon, N. y otros 1992. A lipoyl synthetic octadecapeptide of dihydrolipoamide acetyl - transferase specifically recognized by anti-M2 autoantibodies in primary billary cirrhosis. J. Immunol. 148 p. 445.]. La estrategia seguida para la construcción de los dos clones aparece a continuación: Se amplificaron los fragmentos Pre-2, M-2 y M-4 mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), empleando las combinaciones de oligonucleótidos 1 y 2, 3 y 4, y 5 y 6, respectivamente (ver cuadro 2), y el plásmido pD-5 como molde. Este plásmido incluye el gen de la proteína pre-M/M de la cepa A-15 de Dengue-2, clonado en el vector pBluescript (Stratagene). Las bandas de A.D.N obtenidas en cada caso (120 pb) fueron digeridas con Xba I (Pre-2 y M-2) o con Xba l/EcoR I (M-4), y clonadas en los sitios Xba I o Xba l/EcoR I defosforilados que se crearon artificialmente en la posición 135-145 del gen P64K clonado en el vector pM-92. Adicionalmente, mediante una triple ligazón se generó un clon quimérico que incluye las bandas M-2 y M-4 entre los sitios Xba I y EcoR I ya mencionados. Los clones recombinantes que portaban el inserto en la orientación correcta fueron identificados por análisis de restricción y secuencia de A.D.N. Las proteínas de fusión generadas por los clones de Pre-2 (pD31 ), M-2 (pD30), M-2/M-4 (pD33), y M-4 (pD34) se expresaron bajo el promotor del operón triptófano (ptrp) en la cepa de E. coli MM294 (F" endA1 hsdR17 (rk- mk+) supE44 thi-1 re1A1? RfbD1 ? SpoT1?), obteniéndose todas en la talla esperada y con niveles de expresión de hasta un 30% de las proteínas totales de la bacteria, si bien la proteína PD31 mostró gran inestabilidad (figura 7). Todas las proteínas de fusión fueron reconocidas por varios anticuerpos monoclonales de ratón anti-P64K en ELISA (datos no mostrados) y Westem-blotting (figura 8), donde se detectó notable degradación de las mismas. La secuencia aminoacídica de dichas proteínas aparece en la Lista de Secuencias. La inmunización de ratones con las proteínas de fusión PD-33 y PD-34, semipurificadas mediante un protocolo no desnaturalizante, ha rendido altos títulos contra las mismas en ELISA (hasta 1/100 000), a la vez que se han obtenido anticuerpos de títulos hasta 1/4 000 en ELISA contra los péptidos sintéticos correspondientes.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Perfiles de hidrofilicidad, accesibilidad y flexibilidad de las proteínas pre- (A) y M (B) del virus Dengue. Figura 2. Predicción de estructura secundaria y accesibilidad de la proteína pre- (A) y M (B). AA: aminoácidos. PHD sec: predicción de estructura secundaria (E=beta, H=hélice, L=lazo). P_3 acc: predicción de accesibilidad (e=expuesto, b=no expuesto). SUB sec (SUB acc): residuos para los cuales la predicción de estructura secundaria (accesibilidad) tiene una eficacia de al menos 82.4% (70%).

Figura 3. Perfiles de variabilidad de las proteínas pre- y M. La variabilidad fue calculada considerando tres conjuntos de secuencias de flavivirus. Dengue: secuencias de 15 aislamientos de Dengue. MBV: secuencias de flavivirus transmitidos por mosquitos que incluye virus Dengue, Kunjin, Nilo Oeste, Encefalitis japonesa (EJ), Encefalitis del Valle Murray (EVM) y Encefalitis de Saint Louis (ESL). Flavivirus: secuencias de más de 30 aislamientos flavivirales diferentes: (MBV más Fiebre amarilla (FA), Langat (LAN), Louping III (Ll) y Encefalitis transmitidas por garrapatas (ETG)). Figura 4. Predicción de epítopes de células T de las proteínas pre- (A) y M (B). AMPHl 7 (1 1 ): predicción de segmentos antipáticos de 7 (11 ) residuos, los residuos + son los aminoácidos centrales de un bloque antipático potencialmente antigénico. RT 4 (5): predicción de patrones antigénicos de 4 (5) residuos, los residuos + son exactamente los que cumplen los patrones. Figura 5. Respuesta Proliferativa a antígeno del virus dengue 2 (concentraciones de 10, 20 y 40 µg/ml) de células de bazo de ratón inmunizado con los péptidos 19-6, 19-5 y 20-2. Figura 6. Porciento de ratones sobrevivientes inmunizados con los péptidos y control después de retados con le virus dengue 2. Para los péptidos 19-6, 19-5 y 20-2 fue estadísticamente significativo. Figura 7. SDS-PAGE 10% de la cepa MM294 de E. coli, transformada con las proteínas de fusión y la proteína P64K (plásmido pM-92). Orden de aplicación: 1- Cepa MM294 sin transformar, 2-pM-92/MM294, 3-pD-30/MM294, 4- pD-31/MM294, 5- pD-33/MM294, 6- pD-34/MM294.

Figura 8. Westem-blot utilizando el AcM 114 de la cepa MM294 de E. coli transformada con las proteínas de fusión y la proteína P64K (plásmido pM-92). Orden de aplicación:1 - Cepa MM294 sin transformar, 2-pM-92/MM294, 3- pD-30/MM294, 4- pD-31/MM294, 5- pD-33/MM294, 6- pD-34/MM294.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA (B) DIRECCIÓN: Ave. 31 entre 158 y 190, Playa (C) PROVIDENCIA: Ciudad de La Habana (E) PAÍS: Cuba (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 10600 (G) TELEFONO: 53 7 218466 (H) TELEFAX: 53 7 218070/336008 (A) NOMBRE: INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL "PEDRO KOURI" (B) DIRECCIONES: Autopista Novia del Mediodía Km 6, La Lisa (C) PROVINCIA: Ciudad de La Habana (E) PAÍS: Cuba (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1 1 100 (G) TELEFONO: 53 7 220633 (H) TELEFAX: 53 7 335061 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: EPITOPES DE LA PROTEINA PRE-M/M DEL VIRUS DEL DENGUE, PEPTIDOS SINTENTICOS, PROTEÍNAS QUIMÉRICAS Y SUS USOS. (iii) NUMERO DE SECUENCIA: 9 (iv) FORMA DE LECTURA COMPUTARIZADA: (A) TIPO DE MEDIO: Floppy disk (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (vi) DATOS DE SOLICITUD DE PRIORIDAD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: CU 13/97 (B) FECHA DE SOLICITUD: 15-ENE-1997 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA No. 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 aminiácidos (B) TIPO: aminoacídica (C) CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: SI (iv) ANTI-SENTIDO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Dengue virus (B) CEPA: Dengue-2 (C) AISLAMIENTO: A-15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO. 1 : Leu Thr Thr Arg Asn gly Glu Pro His Met lie Val Met Arg Gln Glu 1 5 10 15 Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Gly Asp Gly Val 20 25 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO. 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoacídica (C) CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: SI (iv) ANTI-SENTIDO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Dengue virus (B) CEPA: Dengue-2 (C) AISLAMIENTO: A-15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO. 2: Cys Gly Asp Thr lie Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu 1 5 10 Pro Glu Asp lie Asp Cys Trp 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO. 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 36 aminoácidos (B) TIPO: aminoacídica (C) CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: SI (iv) ANTI-SENTIDO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Dengue virus (B) CEPA: Dengue-2 (C) AISLAMIENTO: A-15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO. 3: Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp lie Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser 1 5 10 15 Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg 20 25 30 Glu Lys Arg Ser 35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO. 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 aminoácidos (B) TIPO: aminoacídica (C) CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: SI (iv) ANTI-SENTIDO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Dengue virus (B) CEPA: Dengue-2 (C) AISLAMIENTO: A-15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO. 4: Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Thr Gly 1 5 10 15 Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val 20 25 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO. 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 aminoácidos (B): TIPO: aminoacídica (C) CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (¡ii) HIPOTÉTICA: SI (¡v) ANTI-SENTIDO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Dengue virus (B) CEPA: Dengue-2 (C) AISLAMIENTO: A-15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO. 5: Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys 5 10 15 His Ala Gln Arg lie Glu 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO. 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 635 aminoácidos (B) TIPO: aminoacídica (C) CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: SI (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Proteína de Fusión (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: PD31 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO. 6: Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp lie Gly Gly His Glu Asn 1 5 10 15 Val Asp lie lie Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr lie Ala Val 20 25 30 Asp Asp Thr Leu He Thr Leu Asp Leu Asp Phe His Leu Thr Thr Arg 30 40 45 Asn Gly Glu Pro His Met He Val Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser 50 55 60 Leu Leu Phe Lys Thr Gly Asp Gly Val Asn Met Cys Thr Leu Met Ala 65 70 75 80 Met Asp Leu Gly Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val 85 90 95 Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys He Ser Glu Gly Gly 100 105 110 Leu lie Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala 1 15 120 125 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro 130 135 140 Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp 145 150 155 160 Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala 165 170 175 Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala He Val Glu Arg Tyr Lys Thr 180 185 190 Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Me Pro Ser Lys Ala Leu 195 200 205 Leu His Asn Ala Ala Val He Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn 210 215 220 Gly lie Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp lie Asp Met Leu Arg Ala 225 230 235 240 Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met 245 250 255 Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Me Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu 260 265 270 Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu 275 280 285 Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys He Val Ala Phe Lys Asn Cys 290 295 300 He He Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe He Pro Glu 305 310 315 320 Asp Pro Arg He lie Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val 325 330 335 Pro Gly Lys Leu Leu lie He Gly Gly Gly He lie Gly Leu Glu Met 340 345 350 Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met 355 360 365 Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp 370 375 380 Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn He Met Val Asn Thr Lys 385 390 395 400 Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu 405 410 415 Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val 420 425 430 Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu He Ser Ala Glu Lys Ala 435 440 445 Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe He Glu Val Asp Lys Gln Met 450 455 460 Arg Thr Asn Val Pro His He Tyr Ala He Gly Asp lie Val Gly Gln 465 470 475 480 Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu 485 490 495 Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val He Pro Gly 500 505 510 Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu 515 520 525 Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys lie Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp 530 535 540 Ala Ala Ser Gly Arg Ala He Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr 545 550 555 560 Lys Leu lie Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg lie He Gly Gly Gly He 565 570 575 Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met He Gly Glu Val Cys Leu Ala He 580 585 590 Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp He Gly Lys Thr lie His Pro His 595 600 605 Pro Thr Leu Gly Glu Ser He Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly 610 615 620 Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys 625 630 635 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO. 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 635 aminoácidos (B)TIPO: aminoacídica (C) CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: SI (iv) ANTI-SENTIDO: NO (v) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Proteína de Fusión (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: PD30 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO. 7: Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp He Gly Gly His Glu Asn 1 5 10 15 Val Asp He He Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr He Ala Val 20 25 30 Asp Asp Thr Leu He Thr Leu Asp Leu Glu Ser Val Ala Leu Val Pro 40 45 His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser 50 55 60 Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg lie Glu Thr Trp He Leu Arg 65 70 75 80 His Pro Gly Phe Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val 85 90 95 Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys He Ser Glu Gly Gly 100 105 1 10 Leu He Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala 115 120 125 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro 130 135 140 Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp 145 150 155 160 Val Val Val Leu Gly. Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala 165 170 175 Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala lie Val Glu Arg Tyr Lys Thr 180 185 190 Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys He Pro Ser Lys Ala Leu 195 200 205 Leu His Asn Ala Ala Val He Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn 210 215 220 Gly He Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp lie Asp Met Leu Arg Ala 225 230 235 240 Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met 245 250 255 Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val He Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu 260 265 270 Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu 275 280 285 • Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys He Val Ala Phe Lys Asn Cys 290 295 300 He He Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe He Pro Glu 305 310 315 320 Asp Pro Arg He He Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val 325 330 335 Pro Gly Lys Leu Leu He He Gly Gly Gly lie He Gly Leu Glu Met 340 345 350 Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met 355 360 365 Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp 370 375 380 Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn He Met Val Asn Thr Lys 385 390 395 400 Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu 405 410 415 Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val 420 425 430 Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu He Ser Ala Glu Lys Ala 435 440 445 Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe He Glu Val Asp Lys Gln Met 450 455 460 Arg Thr Asn Val Pro His He Tyr Ala lie Gly Asp lie Val Gly Gln 465 470 475 480 Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu 485 490 495 Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val lie Pro Gly 500 505 510 Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu 515 520 525 Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys He Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp 530 535 540 Ala Ala Ser Gly Arg Ala He Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr 545 550 555 560 Lys Leu He Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg lie He Gly Gly Gly lie 565 570 575 Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met lie Gly Glu Val Cys Leu Ala He 580 585 590 Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp He Gly Lys Thr He His Pro His 595 600 605 Pro Thr Leu Gly Glu Ser lie Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly 610 615 620 Thr Cys ThrAsp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys 625 630 635 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO. 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 677 aminoácidos (B) TIPO: aminoacídica (C) CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: SI (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Proteína de Fusión: (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: PD34 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO. 8: Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp lie Gly Gly His Glu Asn 1 5 10 15 Val Asp He He Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr He Ala Val 20 25 30 Asp Asp Thr Leu He Thr Leu Asp Leu Asp Phe His Leu Thr Thr Arg 40 45 Asn Gly Glu Pro His Met He Val Ser Arg GIn Glu Lys Gly Lys Ser 50 55 60 Leu Leu Phe Lys Thr Gly Asp Gly Val Asn Met Cys Thr Leu Met Ala 65 70 75 80 Met Asp Leu Gly Ser Val Ala Leu Val Pro His Val Gly Met Gly Leu 85 90 95 Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His 100 105 110 Ala Gln Arg lie Glu Thr Trp lie Leu Arg His Pro Gly Phe Leu Glu 1 15 120 125 Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val 130 135 140 Lys Val Gly Asp Lys He Ser Glu Gly Gly Leu He Val Val Val Glu 145 150 155 160 Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro 165 170 175 Ala GIn Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln 180 185 190 Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly 195 200 205 Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu 210 215 220 Lys Val Ala lie Val Glu Arg Tyr Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu 225 230 235 240 Asn Val Gly Cys He Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val 245 250 255 lie Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn Gly lie Lys Tyr Pro Glu 260 265 270 Pro Glu Leu Asp He Asp Met Leu Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val 275 280 285 Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val 290 295 300 Asp Val lie Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu 305 310 315 320 Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly 325 330 335 Glu Lys Lys He Val Ala Phe Lys Asn Cys lie lie Ala Ala Gly Ser 340 345 350 Arg Val Thr Lys Leu Pro P?e He Pro Glu Asp Pro Arg He lie Asp 355 360 365 Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu He 370 375 380 lie Gly Gly Gly lie He Gly Leu Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr 385 390 395 400 Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln 405 410 415 Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr 420 425 430 Arg Phe Asp Asn lie Met Val Asn Thr Lys Thr Val Ala Val glu Pro 435 440 445 Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys 450 455 460 Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro 465 470 475 480 Asn Gly Lys Leu He Ser Ala Glu Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp 485 490 495 Arg Giy Phe Me Glu Val Asp Lys GLn Met Arg Thr Asn Val Pro His 500 505 510 He Tyr Ala He Gly Asp lie Val Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys 515 520 525 Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys 530 535 540 Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val lie Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro 545 550 555 560 Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly 565 570 575 Arg Lys lie Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala 580 585 590 He Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr Lys Leu lie Phe Asp Ala 595 600 605 Glu Thr Gly Arg He He Gly Gly Gly lie Val Gly Pro Asn Gly Gly 610 615 620 Asp Met lie Gly Glu Val Cys Leu Ala He Glu Met Gly Cys Asp Ala 625 630 635 640 Ala Asp lie Gly Lys Thr lie His Pro His Pro Thr Leu GLy Glu Ser 645 650 655 lie Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys Thr Asp Leu Pro 660 665 670 Pro Gln Lys Lys Lys 675 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NO. 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 635 aminoácidos (B) TIPO: aminoacídica (C) CADENA: (D): TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (¡ii) HIPOTÉTICA: SI (iv) ANTI-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Proteína de Fusión (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: PD33 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID NO. 9: Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp lie GLy Gly His Glu Asn 1 5 10 15 Val Asp lie He Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr lie Ala Val 20 25 30 Asp Asp Thr Leu He Thr Leu Asp Leu Glu Ser Val Ala Leu Thr Pro 40 45 His Ser Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Ala Glu Thr Trp Met Ser Ser 50 55 60 Glu Giy Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Val Glu Ser Trp He Leu Arg 65 70 75 80 Asn Pro Arg Phe Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val 85 90 95 Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys lie Ser Glu Gly Gly 100 105 1 10 Leu He Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala 1 15 120 125 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro 130 135 140 Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly GLy Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp 145 150 155 160 Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala 165 170 175 Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala lie Val Glu Arg Tyr Lys Thr 180 185 190 Leu Gly GLy Val Cys Leu Asn Val Gly Cys He Pro Ser Lys Ala Leu 195 200 205 Leu His Asn Ala Ala Val lie Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn 210 215 220 Gly He Lys Trp Pro Glu Pro Glu Leu Asp lie Asp Met Leu Arg Ala 225 230 235 240 Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met 245 250 255 Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val He Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu 260 265 270 Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu 275 280 285 Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys He Val Ala Phe Lys Asn Cys 290 295 300 lie lie Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe He Pro Glu 305 310 315 320 Asp Pro Arg lie He Asp Ser Ser Giy Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val 325 330 335 Pro Gly Lys Leu Leu He lie Gly Gly Gly lie He Gly Leu Glu Met 340 345 350 Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met 355 360 365 Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp 370 " 375 380 Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn lie Met Val Asn Thr Lys 385 390 395 400 Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu 405 410 415 Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val 420 425 430 Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn G?y Lys Leu He Ser Ala Glu Lys Ala 435 440 445 Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe He Glu Val Asp Lys Gln Met 450 455 460 Arg Thr Asn Val Pro His He Tyr Ala lie Gly Asp lie Val Gly Gln 465 470 475 480 Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu 485 490 495 Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val lie Pro Gly 500 505 510 Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu 515 520 525 Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys He Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp 530 535 540 Ala Ala Ser Gly Arg Ala He Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr 545 550 555 560 Lys Leu lie Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg lie lie Gly Gly Gly He 565 570 575 Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met He Gly Glu Val Cys Leu Ala He 580 585 590 Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp He Gly Lys Thr lie His Pro His 595 600 605 Pro Thr Leu Gly Glu Ser He Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly 610 615 620 Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro GIn Lys Lys Lys 625 630 635

Claims (11)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Péptidos sintéticos o compuestos miméticos de la proteína pre-M/M del virus Dengue caracterizados por estar comprendidos entre las regiones del aminoácido 3 al 31 , 57 al 92, 69 al 93 y 103 al 124 y poseen al menos un epítope cros-reactivo con cualquiera de los serotipos del virus de Dengue.

2.- Péptidos sintéticos de la proteína pre-M/M del virus Dengue comprendido entre las regiones del aminoácido 3 a 31 , 57 al 92, 69 al 93 y 103 al 124, según la reivindicación 1 , caracterizados porque son los péptidos descritos en el listado de secuencia como péptido 19-6, 19-5, 20-1 y 20-3, respectivamente.

3.- Sistema diagnóstico o formulación farmacéutica contra flavivirus, caracterizados por contener los péptidos o partes de estos descritos en las reivindicaciones 1 , 2, conjugados o no a proteínas u otros portador e independientemente del adyuvante o vehículo utilizado.

4.- Anticuerpos específicos para Flavivirus o parte de estos, caracterizados porque reconozcan las secuencias mencionadas de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2.

5.- Preparaciones vacunales o terapéuticas contra flavivirus, o sistemas diagnósticos, caracterizados porque contengan los anticuerpos o partes de estos descritos en la reivindicación 4.

6.- Construcciones genéticas caracterizadas porque contienen los epítopes de la proteína pre-M/M del virus Dengue 2 y Dengue 4 comprendido entre las regiones del aminoácido 1 al 42 y 92 al 134 fusionadas a una proteína carrier.

7.- Construcciones genéticas según la reivindicación 6, caracterizadas por estar fusionadas a la proteína P64K de Neisseria meningitidis descritas en el listado de secuencias como PD31 (Pre-2), PD30 (M-2), PD34 (M-4), y PD33 (M-2/M-4).

8.- Construcciones genéticas según las reivindicaciones 6 y 7, caracterizadas porque incluyen al menos un epítope de la proteína pre-M/M de flavivirus.

9.- Sistemas diagnósticos o formulaciones farmacéuticas, caracterizadas por contener el producto o parte de este, de al menos una de las construcciones genéticas descritas según las reivindicaciones 6, 7 y 8.

10.- Anticuerpos o partes de estos, caracterizados porque reconozcan las secuencias mencionadas según las reivindicaciones 6 y 7.

11.- Formulaciones farmacéuticas contra flavivirus o sistemas r diagnósticos, caracterizados porque contengan los anticuerpos o partes de estos descritos en la reivindicación 10. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención trata de cinco péptidos sintéticos pertenecientes a la proteína pre-M/M del virus Dengue-2 correspondientes a las secuencias aminoacídicas 3-31 , 45-67, 57-92, 69-93, 103-124; la respuesta inmune a los péptidos fue evaluada en ratones; se construyeron también proteínas de fusión recombinantes que incluyen regiones de pre-M/M; se comprobó la presencia de epítopes para células B de ratones y de humanos en los péptidos de la proteína pre-M/M del virus Dengue; los péptidos 3-31 , y 103-124 indujeron anticuerpos neutralizantes contra los cuatro serotipos del virus Dengue; los estudios de linfoproliferación con los péptidos 57-92 y 3-31 mostraron reconocimiento cruzado de células T péptido específicas al virus; los ratones retados con el virus Dengue-2 mostraron protección inducida por los péptidos 3-31 , 57-92, y 69-93; así, la presencia de epítopes secuenciales en la proteína pre-M/M del virus Dengue-2 y la posible relevancia de los mismos en la respuesta inmune contra dicho flavivirus quedó demostrada. CIGB/amm*ald* P99/940F HIDROFIUCIDAD (PARKER ETAL) ET AL) FLEXIBILIDAD FLEXIBILIDAD FIG.1 1 2 3....,....4.... 5 6 AA (pre)|FHLTTRGGEPTLIVSKQERGKSLLFKTSAGVNMCTLIAMD GELCEDTMtYKCPR TEAE| PHD sec | EEEE EEEEEEEE EEEEE EEEEEEEE EEEE | SUB sec |LEE...LL.EEEEEEE..LL.EEEEE.LLLL.EEEEEE.LLLL.LLEE..LLLLLLL| ACCESIBILIDAD P _3 acc |eebeeeebee bbbeeeeebeebbbebeebebbbbbbbbbbbebbeebbebebbebeeee| SUB acc |.e...ee.e..b.b..eee.e....e..e....b.b.b..b..bbe..b...b.e.eee.| ....7 8 ....9 10 11 1 AA(pre)|PDDVDCWCNATDTWVT?GTCSQTGEHRRD R| PHD sec | E EEEEEEEE | SUB sec |LLL LLEEEEEEE...LLLLLLLLL| ACCESIBILIDAD P_3 acc | SUB acc |.e.b.bbbe.ee..b..b.b.eéeee..eee| 1 2 3 4....,....5 6 AA (M) |SVALDPHVGLGLETRTETWMSSEGAWKQIQKVETWALRHPGFTVIGLFLAHAIGTSITQK| PHD sec | HHH HHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHH HHHH| SUB sec |L...LLLLLLL.L....L.HHHHHHHHHHHHHHHH.LHHHHHHHHHHHHLLHHHH| ACCESIBILIDAD P_3 acc |ebbbbebbebbbee eeebbebeebeeebeeb bbbb bebbbbbbbbbbbbbee bbe| SUB acc |e..b e..e..,b..eeb.e ...b..bb b.bbbbbbb..bb.e....| 7 8 9 10.. ,....11. AA (M) |GIIFILLMLVrPSMAM| PHD sec |HHHHHHHHHHHH | SUB sec |HHHHHHHHH....LLL| ACCESIBILIDAD P_3 acc |bbbbbbbbbbbbebee| SUB acc |.bbbbbbbbb | FIG.2 VARIABILIDAD PRE- DENGUE VARIABILIDAD PRE- MTV VARIABILIDAD M MTV VARIABILIDAD PFÍE- FLAVIVIRUS VARIABILIDAD PRE- FLAVIVIRUS FIG.3 10 20 30 40 50 60 AA FHLTTRNGEPHMIVMRQEKGKSLLFKTGDGVN CTLMA DLGELCEDTITYKCPLLRQNE AMPHl 7 ++++++ AMPHl 11 ++++++++ +++++++ RT 4 ++++ ++++ RT 5 +++++ 70 80 90 AA PEDIDCWCNSTSTWVTYGTCTTTGEHRREKR AMPHl 7 AMPHl 11 RT 4 RT 5 10 20 30 40 50 60 AA SVALVPHVGMGLETRTETWMSSEGAWKHAQRIETWILRHPGFTIVAAILAYTIGTTHFQR AMPHl 7 ++++ AMPHl 11 ++++++ ++++ RT 4 ++++ ++++ RT 5 +++++ 70 AA ALIFILLTAVAPSMT AMPHl 7 AMPHl 11 RT 4 RT 5 Figura 4. 1 2 3 índice de Esßmulación FIG.5 FIG.7 FIG.8