MXPA00001022A

MXPA00001022A - Vacuna de envoltura dimerica recombinante contra infeccion flaviviral

Info

Publication number: MXPA00001022A
Application number: MXPA/A/2000/001022A
Authority: MX
Inventors: John M Ivy; Iain D Peters; Bethann G Coller; Michael Mcdonnell; Kent E Harada
Original assignee: Hawaii Biotechnology Group Inc
Priority date: 1997-07-31
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2001-12-04

Abstract

La presente invención se refiere a vacunas que contienen, como un ingrediente activo, una forma dimérica, recombinantemente producida, secretada de una proteína de envoltura, flaviviral, truncada. Las vacunas son capaces de provocar la producción de anticuerpos neutralizadores contra los flavivirus. Las formas diméricas de la proteína de envoltura flaviviral, truncada se forma 1) al ligar directamente dos copias en tándem de 80%E de una manera de cabeza a extremidad y a una atadura flexible;2) vía la formación de un dominio de cremallera de zipper de leucina a través de la asociación homodimérica de dos hélices de zipper de leucina cada una fusionada al término carboxi de un monómero 80%E;ó3) vía la formación de un dominio de manojo de cuatro hélices, no covalentemente asociado, formado en asociación de dos porciones de hélice-vuelta-hélice cada una unida al término carboxi de un monómero 80%E. Todos los productos se expresan como una poliproteína que incluye prM y los productos de monómero 80%E modificados se secretan a partir de células Schneider-2 de Drosophila melanogaster usando la secuencia de la señal de secreción del activador de plasminógeno de tejido humano (TpaL). Losproductos secretados se purifican en general más fácilmente que aquéllos expresados intracelularmente, facilitando la producción de la vacuna. Una modalidad de la presente invención se dirige a una vacuna para la protección de un sujeto contra la infección por un virus del dengue. La vacuna contiene, como ingrediente activo, la forma dimérica de la proteína de envoltura truncada de un serotipo del virus del dengue. La E truncada, dimérica se secreta como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas. La vacuna puede contener adicionalmente proporciones de las proteínas de E, diméricas, de serotipo del virus del dengue adicional, producidas de manera similar. Otra modalidad de la presente invención se dirige a métodos para utilizar la forma dimérica de la proteína de envoltura del dengue, truncada para el diagnóstico de la infección en individuos en riesgo de la enfermedad. El diagnóstico contiene, como ingrediente activo, la forma dimérica de la proteína de envoltura, truncada de un serotipo del virus del dengue. La E truncada, dimérica se secreta como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas. El diagnóstico puede contener adicionalmente porciones de las proteínas de E diméricas, del serotipo del virus del dengue adicional producido de manera similar.

Description

VACUNA DE ENVOLTURA DIMERICA RECOMBINANTE CONTRA INFECCIÓN FLAVIVIRAL CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere a la protección contra la infección flaviviral, y a el diagnóstico de la misma. De manera más específica, la invención se refiere a dímeros recombinantemente producidos de la proteína de envoltura flaviviral, truncada, secretada como proteínas maduras a partir de células eucarióticas y que induce anticuerpos neutralizadores del virus, en alto título que se cree que son importantes en la protección contra la infección flaviviral y que son útiles en el diagnóstico de infección con el virus.

ANTECEDENTES DK LA INVENCIÓN Los cuatro serotipos del virus del dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3, y DEN-4) corresponden a la familia Flaviviridae que también incluye el virus de la encefalitis japonesa (JE) , el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE) , el Virus del Oeste del Nilo (WN) y la familia de los virus de la fiebre amarilla, prototipo (YF) . Los flavivirus son virus envueltos, pequeños que contienen un ARN genómico, de hebra positiva individual. La envoltura de los flavivirus se deriva de la membrana de la célula hospedera y se decora con la membrana (M) y envoltura (E) de las proteínas de transmembrana viralmente P1036/00MX codificadas. En tanto que la proteína E madura y el precursor a M, prM, se glucosilan, no lo hace la proteína de M madura, mucho más pequeña. La glucoproteína E, que es la proteína estructural viral más grande, contiene dominios funcionales responsables de la unión de la superficie celular y las actividades de fusión intraendosomal . También es un objetivo principal inducir anticuerpos neutralizadores del virus, inmunidad protectora, así como anticuerpos que inhiben hemoaglutinación, en el sistema inmunitario del hospedero. Los virus del dengue se transmiten al hombre por mosquitos del género Aedes , principalmente A . aegipti y A . albopi ctus . Los virus provocan una enfermedad manifestada por alta fiebre, jaqueca, dolor de músculos y articulaciones y salpullido. Algunos casos, típicamente en niños, dan por resultado una forma más severa de infección, la fiebre hemorrágica del dengue y el síndrome de ataque del dengue (DHF/DSS) , marcado por hemorragia severa, permeabilidad vascular o ambas, que conducen a la conmoción. Sin diagnóstico y sin una pronta intervención médica, el comienzo súbito y progresión rápida del DHF/DSS puede ser fatal . Los flavivirus son el grupo más significativo de virus transmitido por artrópodos en términos de la morbilidad global y mortalidad con cien millones de casos estimados de fiebre de dengue que se presentan anualmente (Halstead, 1988) . Con el incremento global en la población y urbanización especialmente a lo largo de los trópicos, y la carencia de medidas de control sostenidas del mosquito, los vectores del mosquito de los flavivirus se han distribuido a todo lo largo de los trópicos, sub-trópicos y algunas áreas templadas, provocando el riesgo de infección flaviviral sobre más de la mitad de la población mundial. Los viajes modernos en aviones a reacción y la emigración humana han facilitado la distribución global de los serotipos del dengue de tal forma que los nuevos serotipos múltiples del dengue son endémicos en muchas regiones. Acompañando a esto en los últimos 15 años ha habido un incremento en la frecuencia de epidemias de dengue y la incidencia de DHF/DSS. Por ejemplo, en el sureste de Asia, el DHF/DSS es una causa principal de hospitalización y muerte entre los niños (Hayes y Gubler, 1992) . El genoma flaviviral es una molécula de ARN, de homosentido de hebra individual, de aproximadamente 10,500 nucleótidos de longitud que contiene las regiones no traducidas en 5 ' y 3', cortas, un marco de lectura abierto, largo, individual, un tope 5' y un término en 31 no poliadenilado. La secuencia completa de nucleótidos de numerosos genomas flavivirales , incluyendo los cuatro serotipos de DEN y el virus de YF se han reportado (Fu et al., 1992; Deubel et al., 1986; Hahn et al., 1988: Osatomi et al., 1990; Zhao et al., P1O36/O0MX 1986; Mackow et al., 1987; Rice et al., 1985). Los diez productos génicos codificados por el marco de lectura abierto, individual se traducen como una poliproteína organizada en el orden, cápsida (C) , premembrana/membrana (prM/M) , envoltura (E) , proteína no estructural (NS)1, NS2a. NS2b, NS3 , NS4a, NS4b, y NS5 (Chambers, et al., 1990) . El procesamiento de la poliproteína codificada se inicia co-trasduccionalmente y la maduración completa requiere tanto las proteasas del hospedador como las viralmente codificadas. Los sitios de escisión proteolítica en el virus de YF se han determinado al comparar las secuencias de nucleótidos y las secuencias amino-terminales de las proteínas virales. Subsiguiente al procesamiento inicial de la poliproteína, el prM se convierte a M durante la liberación viral ( engler, G, et al., 1989, J. Virol 63: 2521-2526) y la C fijada se procesa durante la maduración de virus (Nowak et al., 1987. Viroloqy 156; 127-137) . En tanto que todos los virus del dengue están antigénicamente relacionados, existen distinciones antigénicas que definen los cuatro serotipos del virus del dengue. La infección de un individuo con un serotipo no proporciona aparentemente inmunidad a largo plazo contra los otros serotipos. En realidad, las infecciones secundarias con los serotipos heterólogos están llegando a ser recientemente prevalentes puesto que múltiples serotipos co-circulan en un área P1036/00MX geográfica. En general, las infecciones primarias producen principalmente anticuerpos IgM dirigidos contra los determinantes específicos del tipo. Por otra parte, la infección secundaria por un serotipo heterólogo se caracteriza por anticuerpos de IgG que son de reactividad cruzada con el flavivirus. El desarrollo de la vacuna del virus del dengue es complicado por la observación que la inmunidad adquirida por la infección con un serotipo puede intensificar en realidad la patogenicidad por el virus del dengue de otros tipos. Halstead (1982) demostró que los anticuerpos anti -dengue pueden aumentar la efectividad del virus in vi tro y propone que los anticuerpos no neutralizantes de reactividad cruzada al serotipo A intensifican la infección in vivo dando por resultado el DHF/DSS (Halstead, 1981) . Este punto de vista sin embargo no es universalmente aceptado (Rosen, 1989) . Por ejemplo, Kurane et al., (1991) propone que las células T citotóxicas CD4+ CD8" de reactividad cruzada al serotipo (CTL) específicas para NS3 pueden contribuir a la patogénesis del DHF/DSS al producir IFN-? y alisar los monocitos infectados por el virus del dengue . Evidencia reciente que demuestra que las CTL específicas para E no son de reactividad cruzada con el serotipo, puede sugerir que el uso de las vacunas de la sub-unidad E no inducirá la respuesta de las CTL de reactividad cruzada potencialmente peligrosa (Livingston et al., 1994) . A pesar del mecanismo para P1036/00 X la patogenicidad mejorada de una infección viral de dengue heteróloga secundaria, las estrategias que emplean una vacuna tetravalente deben evitar estas complicaciones. Las revisiones útiles de la naturaleza de las enfermedades flavivirales, la historia de los intentos para desarrollar vacunas adecuadas, y las características estructurales de los flavivirus en general así como las características estructurales moleculares de la proteína de envoltura de los flavivirus están disponibles (Halstead 1988; Brandt 1990; Chambers et al., 1990; Mandl et al., 1989: Henchal y Putnak, 1990; Putnak 1994; Rey et al., 1995). Aunque se han seguido muchos planteamientos para las vacunas del virus de dengue, no hay una vacuna aceptable, corrientemente disponible. Hasta recientemente, el bajo título del virus del dengue desarrollado en cultivo ha hecho impráctica una vacuna inactiva, y las cepas de vacuna de dengue, atenuadas con vida, candidatas, aprobadas a la fecha han probado ser insatisfactorias (ver, por ejemplo, Eckels et al., 1984; Bancroft et al., 1984: McKee et al., 1987), aunque las cepas de vacuna, candidatas, atenuadas en vida continúan desarrollándose y probándose (Hoke et al., 1990; Bhamarapravati et al., 1987). La construcción de varios clones de flavivirus infecciosos de longitud completa (Rice et al., 1989: Lai et al., 1991; Sumiyoshi et al., 1992) han facilitado los estudios tendientes a identificar los determinantes de P1036/00MX la virulencia en los flavivirus (Bray y Lai, 1991; Chen et al., 1995; Kawano et al., 1993). Sin embargo, estos estudios están en etapas preliminares y se ha obtenido poca información de la virulencia. Ha tomado años un planteamiento similar para el desarrollo de la vacuna en el sistema de poliovirus, mientras es extremadamente informativo . En la ausencia de vacunas de flavivirus atenuados en vida o muertos, eficaces se ha invertido un esfuerzo significativo en el desarrollo de una unidad flaviviral recombinante o vacunas con vectores virales. Muchos de los esfuerzos de vacuna que usan un planteamiento de ADN recombinante se han enfocado en la glicoproteína de E. Esta glicoproteína es una elección lógica para una vacuna de sub-unidades puesto que se expone en la superficie del virus y se cree que es responsable de la producción de la inmunidad protectora puesto que los anticuerpos monoclonales dirigidos contra las proteínas de E, flavivirales, purificadas se neutralizan in vi tro y se ha mostrado que algunos contienen protección pasiva in vivo (Henchal et al., 1985: Heinz et al., 1983; Mathews et al., 1984; Hawkes et al., 1988; Kimuro-Kuroda y Yasui, 1988). Aunque las secuencias primarias de aminoácidos de glicoproteínas de E flavivirales están disponibles (45-80% de identidad), todas tienen doce residuos de cisteína conservados, formando seis puentes de disulfuro, y perfiles de hidrofilicidad estrechamente P1O36/O0MX sobrepuestos, sugiriendo que probablemente tienen estructuras secundarias y terciarias similares. Recientemente, la estructura de un fragmento soluble de la glicoproteína de la envoltura del virus de la encefalitis transmitido por garrapatas (TBE) se resolvió a una resolución de 2 Á (Rey et al., 1995) . Este análisis demostró que la glicoproteína de envoltura en su forma nativa es un homodímero que se extiende presumiblemente paralelo a la superficie del virión. Este dímero se forma por una asociación antiparalela de las dos glicoproteínas de envoltura estabilizadas por interacciones polares a lo largo de la región central del dímero, y por interacciones no polares en cualquier extremo (Figura 1) . El dímero está ligeramente curvado con relación a la superficie del virión, quizá debido a que se ajusta a la forma de la envoltura del lípido. La superficie externa, convexa contiene los principales sitios inmunogénicos y las cadenas laterales de carbohidratos. El término carboxi se extiende desde la superficie interna cóncava hacia abajo hacia la membrana. Basándose en las alineaciones de la secuencia y la conservación de los residuos de cisteína comprendidos en los puentes de disulfuro, los autores sugieren que la estructura de TBE sirve como un buen modelo para todas las envolturas de flavivirus. Por lo tanto, la E del dengue, soluble, recombinante expresada como un dímero puede inducir una respuesta antiviral más potente que la E monomérica P1036/00MX debido a que se asemeja más estrechamente a la glicoproteína de la estructura natural. La glicoproteína de E del flavivirus, recombinante se ha expresado en varios sistemas a la fecha (ver Putnak, 1994, para revisión reciente). En general, los sistemas han probado ser insatisfactorios para la producción de una vacuna de flavivirus redituable debido a las limitaciones en la calidad del antígeno, cantidad, o a ambos. Los siguientes párrafos resaltan los principales esfuerzos de las vacunas de flavivirus y resumen los resultados obtenidos hasta la fecha . La mayoría de los esfuerzos que usan Escherichia coli han producido un inmunógeno pobre incapaz de producir anticuerpos neutralizantes en ratones. Esto puede reflejar la conformación no nativa de las proteínas flavivirales expresadas por bacterias y la necesidad de procesar las proteínas virales mediante la ruta de secreción a fin de lograr una formación apropiada de puentes de disulfuro y una glicosilación apropiada. La expresión de proteínas del dengue usando levaduras eucarióticas Saccharomices cerevi siae y Pichia pas tori s da por resultado cantidades menos que deseables del producto recombinante, inmunogénico, obtenido. Los niveles de expresión E del dengue logrados en sus sistemas están muy por debajo de lo que se requeriría para producir una vacuna de flavivirus, redituable (John Ivy et al., P1O36/00MX datos no publicados) . El uso del sistema de expresión de baculovirus para la producción de una vacuna de sub-unidades flavivirales se ha encontrado con un éxito limitado (revisión en Putnak, Modern Vaccinology, 1994) . En contraste con los altos niveles de expresión reportados para varias proteínas heterólogas en el sistema de baculovirus, los niveles de expresión de las proteínas estructurales del flavivirus son completamente bajos (por ejemplo 5-10µg DEN-2E/106 células, Deubel et al., 1991) y la reactividad contra un panel de anticuerpos monoclonales anti-flavivirales (MAb) indicó que muchos epítopes conformacionalmente sensibles no están presentes (Deubel et al., 1991). Esto sugiere que el pliegue de la E recombinante producida en el sistema de baculovirus puede diferir de la proteína de E, natural, viral. Adicionalmente, la inmunización con la proteína de envoltura recombinante expresada por baculovirus a partir de DEN-1 (Putnak et al., 1991), virus de encefalitis japonesa (McCown et al., 1990), o virus de fiebre amarilla (Despres et al., 1991) fallaron en producir títulos sustanciales de anticuerpos neutralizadores de virus o protección contra estimulación viral en ratones. Varios reportes han descrito proteínas de envoltura de expresión, recombinantes, de flavivírus de vaccinia como parte de una poliproteína. Los resultados más consistentemente exitosos en la P1036/00MX expresión de vaccinia de proteínas flavivirales se ha obtenido co-expresando prM y E. Los ratones inmunizados con vaccinia recombinante que expresan la prM y E del virus de la encefalitis japonesa (JE) desarrollaron mayores títulos de anticuerpos neutralizantes y sobrevivieron mayores dosis de estímulos de virus (>10,000 LD50; Konishi et al., 1992) que los ratones inmunizados con virus de vaccinia recombinante que expresan E solo (>10 LD50; Masón et al., 1991). De manera similar, los ratones inmunizados con un virus recombinante de vaccinia- fiebre amarilla (YF) que expresan prM-E se protegieron de la estimulación del virus a niveles equivalentes a aquéllos de la vacuna YVF-17D atenuada, mientras que los virus recombinantes de vaccinia que expresan E-NS1, C-prM-E-NSl o NS1 fallaron en proteger a los ratones (Pincus et al., 1992). Las recombinantes de vaccinia-DEN-1 que expresan prM-E produjeron anticuerpos de inhibición de hemoaglutinación y neutralización en ratones, mientras que los recombinantes que expresan DEN-1 C-prM-E-NSl-NS2a-NS2b produjeron una respuesta inmunitaria no específica a E (Fonseca et al., 1994). La síntesis coordinada de prM y E parece ser importante en la obtención de la conformación nativa de E. La expresión de E en la ausencia de prM da por resultado un producto recombinante que presenta un conjunto diferente de epítopes que aquéllos del virión nativo (Konishi y Masón 1993; Heinz et al., 1994; P1036/00MX Matsuura et al., 1989) . La correlación de los epítopes de la E expresada con prM sugiere que la proteína coexpresada se asemeja estrechamente al virus nativo. Conforme aparecen prM y E para formar heterodímeros durante la maduración viral y E se somete a un cambio conformacional inducido por un pH ácido, Heinz et al., (1994) han sugerido que la asociación de prM y E se requiere para prevenir los cambios conformacionales inducidos por el pH, y reversibles durante el tránsito a través de la ruta secretoria. Sin embargo, se ha mostrado que las formas truncadas por carboxi de la E de flavivirus expresadas en ausencia de prM producen protección de la estimulación (Men et al., 1991; Jan et al., 1993; Coiler et al., en preparación) sugiriendo que la expresión E en ausencia de prM puede dar por resultado la exhibición de los epítopes protectores. En los últimos diez años, un sistema de expresión eucariótico, alternativo que usa la línea de células Schneider-2 (S2) de Drosophila melanogaster se ha desarrollado y usado para expresar eficazmente la glicoproteína de envoltura del virus de inmunodeficiencia humana (Ivey-Hoyle et al., 1991; Culp et al., 1991; van der Straten et al., 1989). Se ha aplicado este sistema a la producción de polipéptidos de sub-unidades de flavivirus recombinantes y se ha encontrado que el sistema puede producir fácilmente de medio se ha enfocado a la mayoría de los presentes esfuerzos, es una forma soluble de la E flaviviral, que está truncada en el extremo carboxi terminal dando por resultado un polipéptido que presenta aproximadamente 80% de la molécula de E de longitud completa (aminoácidos 1-395; 80%E) . Se ha expresado 80%E como un cuadro de lectura abierto, individual con prM para mejorar el plegado de secreción apropiada como se describe con anterioridad. Los niveles de expresión logrados usando esta combinación de sistema de expresión y construcción de ADN recombinante exceden aquellos logrados en otros sistemas y proporcionan una fuente rediatuable de antígeno flaviviral para la producción de vacuna. Además, se ha demostrado que el producto de 80%E es recombinante secretado y por estas células es capaz de inducir anticuerpos neutralizantes y protección en ratones (Coiler et al., en preparación). En tanto que el uso de esta combinación de células S2 de Drosophila y prM80%E ha permitido el progreso significativo hacia la producción de una vacuna de flavivirus, eficaz, se puede limitar la capacidad de un pequeño polipéptido con complejidad antigénica limitada, para inducir inmunidad protectora a largo plazo en una población cruzada, grande. Numerosos estudios han demostrado que la inmunogenicidad se relaciona directamente tanto al tamaño del inmunógeno como a la complejidad antigénica del inmunógeno. De esta manera, en general, antígenos P1036/00MX más grandes hacen mejores inmunógenos. Además la estructura de la proteína de envoltura de TBE se solucionó recientemente (Rey et al., 1995) y este análisis reveló que la forma nativa de la proteína E encontrada en la superficie del virión es un homodímero (Figura 1) . Nuestra proteína de E flaviviral, recombinante analizada con anterioridad es monomérica y por lo tanto no es idéntica a la proteína E viral, natural. De esta manera, en un intento para producir una vacuna de flavivirus recombinante con inmunogenicidad mejorada se manejaron genéticamente varias construcciones diseñadas para promover la dimerización de 80%E soluble que se produce de este modo de manera eficaz en las células de Drosophila . Al intensificar la dimerización, se incrementó la potencia de la vacuna al incrementar la similitud estructural a la E viralmente expresada, nativa, así como al incrementar el tamaño y la complejidad antigénica del inmunógeno . Varios de los planteamientos que se han adoptado para mejorar la dimerización de 80%E soluble se desarrollaron originalmente para la manipulación genética de anticuerpos. Los ligadores peptídicos flexibles se han usado para ligar los polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada variable en el manejo genético de los Fv de cadena individual (scFv; Huston et al., 1988; Bird et al., 1988). Estos ligadores, que frecuentemente son unidades GlyGlyGlyGlySer (Gly4Ser) P1036/00MX repetidas, exhiben restricciones torsionales limitadas en los polipéptidos ligados, y por lo tanto ofrecen una opción razonable para la conexión covalente del extremo carboxi de una porción de 80%E al término amino de la porción de 80%E. Basándose en la distancia del término carboxi de una sub-unidad y del término amino de la otra en la estructura de cristal de los dímeros 80%E de TBE (F. Heinz, comunicación personal), se diseñó un ligador peptídico, elaborado predominantemente de repeticiones Gly4Ser, para ligar las dos moléculas de 80%E. El ligador de diseñó para ser ligeramente más largo que la distancia en la molécula nativa, a fin de evitar la restricción torsional en asociación de las dos porciones de 80%E. El segundo y tercer planteamientos para manipular genéticamente dímeros de 80% E usó estrategias desarrolladas para manejar mini-anticuerpos de scFv de auto-asociación. Para la expresión de mini-anticuerpos de homodímeros, Pack et al., (1992; 1993) expresó el scFv como una fusión con una articulación de ligador flexible y uno de los dos dominios de dimerización (figura 2). Un dominio de dimerización fue una hélice espiral enrollada en paralelo de una cremallera de leucina a partir del producto génico de GCN4 de levadura (Landschulz et al., 1988; O ' Shea et al., 1989) . El otro dominio fue dos alfa-hélices separadas por una vuelta aguda que las asocia para formar un manojo de cuatro hélices homodimérico (Ho y P1036/00MX DeGrado, 1987) . La región de articulación usada para ligar los dominios de dimerización al scFv se tomó de una región de articulación de anticuerpo para lograr una flexibilidad rotacional al máximo. Cuando estas 5 construcciones de anticuerpo-articulación-hélice se expresaron en E. coli , se formaron espontáneamente mini-anticuerpos homodiméricos y se pudieron extraer de la fracción de proteína soluble de los lisados celulares. Estos anticuerpos fueron indistinguibles de LO los anticuerpos completos en afinidad funcional. Para expresar el 80% E secretado que se puede dimerizar espontáneamente, se han usado estos dominios de dimerización conectados a los dominios de 80%E por una atadura Gly4Ser flexible. L5 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención describe y reivindica vacunas que contienen, un ingrediente activo, una forma dimérica recombinantemente producida, secretada de la 0 proteína de envoltura flaviviral, truncada. Las vacunas son capaces de provocar la producción de anticuerpos neutralizantes contra flavivirus. En las ilustraciones posteriores, las formas diméricas de la proteína de envoltura flaviviral, truncada se forman 1) 5 al ligar directamente dos copias en tándem de 80%E en una forma de cabeza de extremidad vía una atadura flexible; 2) vía la formación de un dominio de cremallera de leucina a través de la asociación P1036/00 X homodimérica de dos hélices de cremallera de leucina cada una fusionada al término carboxi de una molécula de 80%E; o 3) vía la formación de un dominio de manojo de cuatro hélices no covalentemente asociado formado en asociación de dos porciones de hélice-vuelta-hélice cada una unida al término carboxi de una molécula de 80%E. Todos los productos se expresan como una poliproteína que incluye prM y los productos de 80%E modificados se secretan a partir de células Schneider 2 de Drosophila melanogas ter usando la secuencia de señal de secreción (tPAL) del activador de plasminógeno de tejido humano . Los productos secretados se purifican en general más fácilmente que aquéllos expresados de manera intracelular facilitando la producción de la vacuna . Una modalidad de la presente invención se dirige a una vacuna para la protección de un sujeto contra la infección por un Flavivirus . La vacuna contiene, como el ingrediente activo, la forma dimérica de la proteína de envoltura (E) truncada de un serotipo flaviviral, por ejemplo un serotipo de virus de dengue. La E truncada dimérica se secreta como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas. La vacuna puede contener adicionalmente porciones de las proteínas de E diméricas del serotipo flaviviral adicional, producida de manera similar. Una modalidad preferida de la presente invención se refiere a una vacuna para la protección de un sujeto contra la P1036/00MX infección por un virus de dengue. La vacuna contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un 80%E dimérico, donde el 80%E se ha secretado como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas tales como células de Drosophila . Adicionalmente, la "80%E" se refiere en un caso a un polipéptido que abarca desde Met 1 a Gly 395 de la proteína de envoltura de DEN-2. Las secuencias descritas en la presente solicitud representan la proteína de envoltura del virus tipo 2 del dengue; tres serotipos de dengue distintos adicionales se han reconocido. Por lo tanto, "80%E" también se refiere a la región peptídica correspondiente de la proteína de envoltura de estos serotipos y a muchas variantes que se presentan de forma natural, así como las regiones peptídicas correspondientes de la proteína de envoltura (E) y a otros flavivirus. Por ejemplo, los serotipos del virus del dengue tales como: DEN-1; DEN-2; DEN-3; y DEN-4, así como los serotipos de: virus de encefalitis japonesa, (JE), virus de encefalitis transmitida por garrapatas (TBE) , virus del oeste del Nilo (WN) , y el prototipo de la familia, el virus de la fiebre amarilla (YF) . Otras modalidades de la presente invención se dirigen a tres planteamientos básicos para la construcción de moléculas de 80%E diméricas. (Ver infra) . Éstos incluyen: dímero de 80%E ligado, Cremalleral de 80%E, Cremallerall de 80%E; y Manojo de P1036/00MX 80%E. Aún otras modalidades de la presente invención se dirigen a vacunas que contienen la proteína de envoltura truncada de 80%E dimérico de más de un serotipo para formar vacunas multivalentes, (es decir divalentes, trivalentes, tetravalentes, etcétera) . Por ejemplo, estas modalidades de la presente invención incluyen: una vacuna que contiene un primer producto de 80%E dimérico de un serotipo flaviviral y un segundo producto de 80%E dimérico de un segundo serotipo flaviviral, y un tercer producto de 80%E dimérico de un tercer serotipo flaviviral y un cuarto producto de 80%E dimérico de un cuarto serotipo flaviviral, así como en combinación con otro 80%E dimérico, cada uno de un serotipo separado entre sí donde todos los 80%E diméricos se han secretado como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas, tal como células de Drosophila . Se considera que la presente invención incluye claramente vacunas que están comprendidas de la proteína multivalente truncada de 80%E dimérico, que abarcan dos, tres, cuatro o más serotipos. Por ejemplo, estos serotipos pueden incluir los siguientes serotipos del virus del dengue: DEN-1; DEN-2; DEN-3; y DEN-4 así como otros serotipos de flavivirus de: virus de encefalitis japonesa (JE), virus de encefalitis transmitida por garrapatas (TBE) , virus del oeste del Nilo (WN) , y el prototipo de la familia, el virus de la fiebre amarilla P1036/00MX (YF) . Las modalidades adicionales de la presente invención contemplan composiciones de anticuerpos que consisten esencialmente en anticuerpos generados en un sujeto mamífero, administrado con una cantidad inmunogénica de una vacuna que contiene 80%E dimérico así como que contiene un primer 80%E dimérico y un segundo 80%E dimérico, donde ambos del primero y segundo 80%E dimérico se ha secretado como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas, tal como células de Drosophila . Estas vacunas podrían incluir la proteína de envoltura truncada, multivalente de 80%E dimérico, que abarcan dos, tres, cuatro o más serotipos. Estos serotipos pueden incluir serotipos del virus del dengue DEN-1; DEN-2; DEN-3; y DEN-4, así como los serotipos de: virus de encefalitis japonesa (JE) , virus de encefalitis transmitido por garrapatas (TBE) virus del oeste del Nilo (WN) , y el prototipo de la familia, el virus de la fiebre amarilla (YF) . Aún otras modalidades de la presente invención se dirigen a líneas de células B inmortalizadas donde las células B se han generado en respuesta a la administración a un sujeto humano de una cantidad inmunogénica de una vacuna que contiene la proteína de envoltura, truncada de 80%E dimérico de más de un serotipo para formar vacunas multivalentes, (es decir divalentes, trivalentes, tetravalentes, etcétera). Por P1036/00MX ejemplo, estas modalidades de la presente invención incluyen: una vacuna que contiene un primer producto dimérico de 80%E de un serotipo flaviviral y un segundo producto dimérico de 80%E de un segundo serotipo flaviviral y un tercer producto dimérico de 80%E de un tercer serotipo flaviviral y un cuarto producto dimérico de 80%E de un cuarto serotipo flaviviral, así como en combinación con otro 80%E dimérico, cada uno de un serotipo separado entre sí, donde todos los 80%E diméricos se han secretado como proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas tales como células de Drosophila . Estas vacunas pueden incluir la proteína de envoltura, truncada, multivalente de 80%E dimérico, que abarcan dos, tres, cuatro o más serotipos. Estos serotipos pueden incluir serotipos del virus del dengue DEN-1; DEN-2; DEN-3; y DEN-4, así como los serotipos de: virus de la encefalitis japonesa (JE) , virus de la encefalitis transmitido por garrapatas (TBE) virus del oeste del Nilo (WN) , y el prototipo de la familia, el virus de la fiebre amarilla (YF) . Las modalidades adicionales de la presente invención se dirigen a anticuerpos monoclonales secretados por estas líneas de células B inmortalizadas . Las modalidades aún adicionales de la presente invención se dirigen a métodos para proteger a un sujeto contra un Flavi virus . Estos métodos incluyen el P1036/00MX paso de administrar de una manera adecuada a un sujeto en necesidad de protección una cantidad eficaz de una vacuna que contiene 80%E dimérico en un programa óptimo para producir una respuesta inmunoreactiva, protectora. Otra modalidad de la presente invención se dirige a métodos para utilizar la forma dimérica de la proteína de envoltura de flavivirus, truncada para el diagnóstico de la infección en individuos en riesgo de la enfermedad. El diagnóstico contiene, como el ingrediente activo, la forma dimérica de la proteína de envoltura, truncada de un serotipo de flavivirus. La E truncada se secreta como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas. El diagnóstico puede contener adicionalmente porciones de las proteínas de E diméricas del serotipo de flavivirus adicionales, producidas de manera similar. Una modalidad preferida de la presente invención se refiere a un inmunodiagnóstico para la detección de un Flavi virus, en donde el diagnóstico contiene, un 80%E dimérico que se ha secretado como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas, tales como células de Drosophila . De manera específica, una modalidad preferida de la presente invención se refiere a un inmunodiagnóstico para la detección de un flavivirus. Las modalidades de la presente invención incluyen inmunodiagnósticos para la detección de un Flavivirus , en donde el P1036/00MX inmunodiagnóstico contiene, 80%E dimérico de más de un serotipo para formar inmunodiagnósticos multivalentes (es decir, divalentes, trivalentes, tetravalentes, etcétera) . Por ejemplo, estas modalidades de la presente invención incluyen: inmunodiagnósticos que contienen un primer producto dimérico de 80%E de un serotipo flaviviral y un segundo producto dimérico de 80%E de un segundo serotipo flaviviral y un tercer producto dimérico de 80%E de un tercer serotipo flaviviral y un cuarto producto dimérico de 80%E de un cuarto serotipo flaviviral, así como en combinación con otro 80%E dimérico, cada uno de un serotipo separado entre sí, donde todos los 80%E diméricos se han secretado como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas tales como células de Drosophila . La presente invención incluye las modalidades de equipos de inmunodiagnóstico para la detección de un Flavivirus , en un sujeto de prueba. Estos equipos de inmunodiagnóstico contienen (a) 80%E dimérico en donde el 80%E dimérico se ha secretado como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas tales como células de Drosophila ; (b) una fase de soporte sólida, adecuada, revestida con 80%E dimérico; y (c) anticuerpos marcados inmuno-reactivos a anticuerpos a partir del sujeto de prueba. Otras modalidades de los equipos de inmunodiagnóstico de la presente invención incluyen P1O36/O0MX 80%E dimérico equivalente a más de un serotipo para formar inmunodiagnósticos multivalentes, (es decir, divalentes, trivalentes, tetravalentes, etcétera). Por ejemplo, estas modalidades de la presente invención incluyen: un inmunodiagnóstico que contiene un primer producto dimérico de 80%E de un serotipo flaviviral y un segundo producto dimérico de 80%E de un segundo serotipo flaviviral y un tercer producto dimérico de 80%E de un tercer serotipo flaviviral y un cuarto producto dimérico de 80%E de un cuarto serotipo flaviviral, así como en combinación con otros productos diméricos de 80%E, cada uno de un serotipo separado entre sí, donde todos los productos diméricos de 80%E se han secretado como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas, tales como células de Drosophila . Las modalidades adicionales de la presente invención se refieren a composiciones de materia, que incluyen un sistema de expresión de ADN recombinante hospedado en un vector, que contiene (a) una célula hospedadora, eucariótica, adecuada; (b) un vector de expresión de ADN, recombinante, adecuado; (c) ADN que codifica para 80%E dimérico, ligado operablemente y bajo el control de un promotor adecuado; y (d) en donde el ADN que codifica para el 80%E dimérico también se enlaza operablemente a una secuencia guía de señal secretoria. La presente invención incluye adicionalmente modalidades de un sistema de ADN P1036/00MX recombinante hospedado en un vector, donde el 80%E dimérico se selecciona a partir de un grupo que consiste de: dímero ligado de 80%E, Cremalleral de 80%E; Cremallerall de 80%E y manojo de 80%E. Una modalidad preferida de la presente invención se refiere a un sistema de ADN recombinante, hospedador, de vector donde la célula hospedadora eucariótica es una célula de Drosophila . Otras composiciones de materia incorporadas en la presente invención incluyen secuencias de ADN que codifican para: 80%E dimérico, que incluyen específicamente secuencias de ADN que codifican para: dímero ligado de 80%E, Cremalleral de 80%E; Cremallerall de 80%E y manojo de 80%E.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un dibujo reproducido a partir de Rey et al., que muestra la estructura de cristal de la proteína de envoltura del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas. La Figura 2 es un dibujo reproducido a partir de Pack et al . , que muestra dos de los planteamientos usados para manejar genéticamente mini -anticuerpos aplicados a la formación del Dímero de 80%E. La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos, parcial y la secuencia de aminoácidos deducida del genoma de la cepa DEN-2 PR159/S1. La Figura 4 es un dibujo que ilustra la P1036/00MX estrategia usada para generar el ADNc que codifica para las copias en tándem del 80%E ligado por una atadura flexible . La Figura 5 es un dibujo que ilustra la estrategia de clonación usada para introducir la porción carboxi -terminal del primer 80%E-ligador- y la porción amino-terminal de la segunda molécula de 80%E en un clon de ADNc de prM80%E. La Figura 6 es un dibujo que ilustra la estrategia de clonación usada para introducir las copias en tándem ligadas de 80%E en un vector de expresión de Drosophila . La Figura 7 ilustra la estrategia de clonación usada para introducir los oligonucleótidos que codifican para la cremallera de leucina y los dominios de dimerización del manojo de cuatro hélices en el clon de ADNc del dímero ligado de 80%E. La Figura 8 es un dibujo que ilustra la estrategia de clonación usada para introducir los fragmentos de ADNc que codifican para el dímero ligado de 80%E, Cremalleral de 80%E, Cremallerall de 80%E, y del Manojo de 80%E de un vector de expresión de Drosophila . La Figura 9 muestra el análisis de SDS-PAGE de los productos diméricos expresados de 80%E secretados a partir de células S2 transfectadas. La Figura 10 demuestra la glicosilación de los productos de 80%E diméricos, secretados por el análisis P1036/00MX de SDS-PAGE de los dímeros de 80%E digeridos con endoglicosidasa . La Figura 11 demuestra la aplicación de técnicas de inmunoafinidad a la purificación de los productos de 80%E, diméricos, secretados.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN La invención proporciona, por primera vez, una vacuna de subunidades con inmunogenicidad incrementada que se puede producir y secretar de manera eficaz usando un sistema de expresión recombinante y que es eficaz en la inducción de una fuerte respuesta de neutralización del virus a los flavivirus. Aunque se han hecho muchos intentos para obtener esta vacuna de subunidades, los estudios previos se plagaron con ya sea bajos niveles de expresión de un inmunógeno eficaz o producción eficiente de un candidato ineficaz de vacuna. Los presentes solicitantes han encontrado que las formas médicas, recombinantemente manejadas de una proteína de envoltura flaviviral, carboxi-terminalmente truncada, que corresponde a los aminoácidos 1-395, se secretan eficientemente por ciertos hospedadores recombinantes, eucarióticos , convenientes, en una forma que permite procesar para imitar la conformación nativa de la proteína. La secreción eficiente de las proteínas en el medio de cultivo facilita el desarrollo. Adicionalmente, las formas secretadas son capaces, inicialmente cuando se administran en la P1O36/O0MX presencia del adyuvante, de aumentar los anticuerpos neutralizantes del virus a alto título en animales. De esta manera, estas proteínas representan un componente útil de una vacuna para proteger a los sujetos contra la infección flaviviral . Como se usa en la presente, "80%E" se refiere en un caso a un polipéptido que abarca desde el Met 1 a Gly 395 de la proteína de envoltura de DEN-2. Las secuencias descritas en la presente solicitud representan la proteína de envoltura del virus tipo 2 del dengue; tres serotipos de dengue distintos, adicionales se han reconocido. Por lo tanto, "80%E" también se refiere a la región peptídica correspondiente de la proteína de envoltura de estos serotipos, y a cualquiera de las variantes que se presenten de forma natural, así como a las regiones peptídicas correspondientes de la proteína de envoltura (E) de otros flavivirus. Por ejemplo, los serotipos de los virus del dengue tales como: DEN-1; DEN-2; DEN-3; y DEN-4, así como los serotipos de: virus de la encefalitis japonesa (JE) , virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE) , Virus del Oeste del Nilo (WN) , y el prototipo de la familia, el virus de la fiebre amarilla (YF) . Las modificaciones hechas a los productos de 80%E por la adición de secuencias carboxi-terminales que codifican para ligadores flexibles, dominios de Cremallera de leucina, o dominios de manojo de cuatro hélices, diseñados para mejorar la P1036/00MX dimerización de las moléculas de 80%E, que se describen en detalle posteriormente. Todas estas proteínas diméricas de 80%E se producen a partir de vectores que contienen el ADN que codifica para la prM de flavivirus como una fusión con las proteínas maduras que dan por resultado la secreción de las proteínas diméricas maduras de 80%E, procesadas, a partir de las cuales se ha removido la proteína de prM. Se han usado tres planteamientos básicos para construir las moléculas de 80%E, diméricas. El primer planteamiento comprende el uso de copias en tándem de 80%E unidas covalentemente entre sí por un ligador flexible. Como se usa en la presente, "Dímero ligado de 80%E" se refiere en un caso a un polipéptido que codifica para DEN-2 80%E-GGGSGGGGSGGGTGGGSGGGSGGGG-DEN-2 80%E. El tramo de aminoácidos que enlazan covalentemente las dos copias de DEN2 80%E se diseña para servir como una atadura flexible que permite que las dos moléculas de 80%E se asocien en una orientación dimérica natural de cabeza a extremidad, mientras que mantengan su unión covalente entre sí . Las secuencias descritas en la presente solicitud representan la proteína de envoltura del virus tipo 2 del dengue; se han reconocido tres serotipos distintos adicionales del dengue. Por lo tanto, "Dímero Ligado de 80%E" también se refiere a la región peptídica correspondiente de la proteína de envoltura de estos serotipos, y a cualquiera de las variantes que se presenten de forma P1036/0OMX natural, así como a las regiones peptídicas correspondientes de la proteína de envoltura (E) de otros flavivirus. Por ejemplo, los serotipos del virus de dengue tales como DEN-1; DEN-2; DEN-3 y DEN-4, así como los serotipos de: virus de la encefalitis japonesa (JE) , Virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE) , Virus del Oeste del Nilo (WN) , y el prototipo de la familia, el virus de la fiebre amarilla (YF) . Será fácilmente evidente por un experto en la técnica seleccionar también otras secuencias ligadoras. La presente invención no se limita a los ligadores descritos, específicos, sino a cualquier secuencia de aminoácido que permita que las dos moléculas de 80%E se asocien en una orientación dimérica de cabeza a extremidad, nativa mientras que mantengan su unión covalente entre sí. El segundo planteamiento comprende la adición de un dominio deseado de leucina carboxi-terminal al 80%E monomérico, para mejorar la dimerización entre las dos moléculas de 80%E-Cremallera de leucina. Se han adoptado dos versiones de este planteamiento. Una versión incluye un enlace de sulfuro que enlaza los dominios de Cremallera de leucina dando por resultado un producto dimérico covalentemente enlazado, mientras que la otra se basa en la asociación no covalente de los dominios de Cremallera de leucina. Como se usa en la presente "Cremalleral de 80%E" se refiere en un caso ) P1036/00MX a un polipéptido que codifica para DEN-2 80%E-GGGSGGGGSGGGTGGGSGGGSPRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER Los primeros 22 aminoácidos que se extienden sobre el término carboxi del 80%E sirven como la atadura flexible entre 80%E y el dominio adyacente de Cremallera de leucina. El dominio de Cremallera de leucina se diseña para dimerizarse con la secuencia idéntica de otra molécula de Cremallera de 80%E. La formación de una cremallera de leucina ligado de manera no covalente mejorará la dimerización de las moléculas de 80%E, que pueden asociarse en la conformación de cabeza a extremidad, nativa en virtud del ligador flexible que conecta la molécula de 80%E con el dominio de Cremallera de leucina. Las secuencias descritas en la presente solicitud representan la proteína de envoltura del virus tipo 2 del dengue; se han reconocido tres serotipos distintos, adicionales del dengue . Por lo tanto, "Cremalleral de 80%E" también se refiere a la región peptídica correspondiente de la proteína de envoltura de estos serotipos, y a cualquier variante que se presente de forma natural, así como las regiones peptídicas correspondientes de la proteína de envoltura (E) de otros flavivirus. Por ejemplo, los serotipos del virus de dengue tales como DEN-1; DEN-2; DEN-3; y DEN-4, así como los serotipos de: virus de la encefalitis japonesa (JE), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE) , Virus del Oeste del Nilo (WN) , y el prototipo de la familia, el virus de la P1036/00MX fiebre amarilla (YF) . Será fácilmente evidente para un experto en la técnica seleccionar también otras secuencias de Cremallera de leucina. La presente invención no se limita a las secuencias de Cremallera de leucina, descritas, específicas, sino a cualquier secuencia de aminoácidos que permita la dimerización entre las secuencias idénticas de otra molécula de Cremallera de 80%E. Como se usa en la presente "Cremallerall de 80%E" se refiere en un caso a un polipéptido que codifica para DEN-2 80%E-GGGSGGGGSGGGTGGGSGGGSP-RMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERGGCGG. Los primeros 22 aminoácidos que se extienden después del término carboxi de 80%E sirven como una atadura flexible entre 80%E y el dominio adyacente de Cremallera de leucina. El dominio de Cremallera de leucina se diseña para dimerizarse con la secuencia idéntica de otra molécula de Cremallera de 80%E. El dominio de Cremallera de leucina de Cremallerall de 80%E finaliza en una secuencia GGCGG que facilita la formación de enlaces de disulfuro entre las dos hélices de Cremallera de leucina. De esta manera, una vez que se dimeriza la cremallera de leucina, un enlace de sulfuro se forma entre los dos extremos, dando por resultado un producto dimérico covalentemente enlazado. La formación de una cremallera de leucina covalentemente enlazado mejorará la dimerización de las moléculas de 80%E, que pueden P1036/00MX asociarse en la conformación de cabeza a extremidad, nativa en virtud del ligador flexible que conecta a las moléculas de 80%E con el dominio de Cremallera de leucina. Las secuencias descritas en la presente solicitud representan la proteína de envoltura del virus tipo 2 del dengue, se han reconocido tres serotipos distintos, adicionales del dengue. Por lo tanto, "Cremallerall de 80%E" también se refiere a la región peptídica correspondiente de la proteína de envoltura de estos serotipos, y a cualquier variante que se presente de manera natural, así como a las regiones peptídicas correspondientes de la proteína de envoltura (E) de otros flavivirus. Por ejemplo, los serotipos del virus de dengue tal como: DEN-1; DEN-2; DEN- 3; y DEN-4, así como los serotipos de: virus de encefalitis japonesa (JE) , virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE) , Virus del Oeste del Nilo (WN) , y el prototipo de la familia, el virus de la fiebre amarilla (YF) . Será fácilmente evidente para un experto en la técnica seleccionar también otras secuencias de Cremallera de leucina. La presente invención no se limita a las secuencias de leucina, descritas, específicas, sino a cualquier secuencia de aminoácidos que permita la dimerización con una secuencia idéntica de otra molécula de cremallera de 80%E. Adicionalmente, el experto en la técnica será fácilmente capaz de determinar otras secuencias que P1036/00MX facilitarán la formación del enlace de disulfuro entre las dos hélices de cremallera de leucina. El planteamiento final usado para mejorar la dimerización del 80%E y la adición de un dominio hélice-vuelta-hélice al extremo carboxi terminal de 80%E. El dominio de hélice-vuelta-hélice de una molécula de 80%E modificada se asociará con aquella de otra para formar un dominio dimérico de manojo de cuatro hélices. Como se usa en la presente "manojo de 80%E" se refiere en un caso a un polipéptido que codifica para DEN-2 80%E-GGGSGGGGSGGGTGGGSGGGSP-GELEELLKHLKELLKG-PRK-GELEELLKHLKELLKGEF. Los primeros 22 aminoácidos que se extienden desde el término carboxi del 80%E sirven como una atadura flexible entre el dominio de 80%E y el dominio de hélice-vuelta-hélice que sigue. La formación de un dominio de manojo de cuatro hélices, asociado de manera no covalente mejorará la dimerización de las moléculas de 80%E que pueden asociarse en la conformación cabeza a extremidad, nativa en virtud de los ligadores flexibles que conectan el 80%E al manojo de hélices. Las secuencias descritas en la presente solicitud representan la proteína de envoltura del virus del tipo 2 del dengue; se han reconocido tres serotipos distintos, adicionales del dengue. Por lo tanto, "manojo de 80%E" también se refiere a la región peptídica correspondiente de la proteína de envoltura de estos serotipos, y a cualquiera de las variantes que P1036/00MX se presenten de forma natural, así como a las regiones peptídicas correspondientes de la proteína de envoltura (E) de otros flavivirus. Por ejemplo, los serotipos de los virus del dengue tal como: DEN-1; DEN-2; DEN- 3; y DEN-4, así como los serotipos de: virus de la encefalitis japonesa (JE), virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE) , Virus del Oeste del Nilo (WN) , y el prototipo de la familia, el virus de la fiebre amarilla (YF) . Será fácilmente evidente para un experto en la técnica el seleccionar otras secuencias de aminoácidos que formarán la atadura flexible que se extiende después de la terminal carboxi del 80%E y que comprenden también un dominio de hélice-vuelta-hélice. La presente invención no se limita a los dominios de hélice-vuelta-hélice . descritos, específicos, sino a cualquier secuencia de aminoácidos que permitirá la dimerización de una molécula de 80%E modificada a través de una asociación no covalente con una segunda molécula de 80%E, modificada. Adicionalmente, el experto en la técnica será fácilmente capaz de determinar otras secuencias que facilitarán la asociación no covalente de las hélices. Las técnicas recombinantes proporcionan el planteamiento más práctico para la producción a gran escala, práctica, de estas subunidades para propósitos de vacuna y diagnóstico. Sin embargo, para ser eficaz, sus proteínas deben someterse al procesamiento correcto P1036/00MX y asumir una conformación similar a aquella de la proteína de envoltura flaviviral, nativa. A fin de lograr esto, la producción recombinante se debe llevar a cabo en células eucarióticas, preferentemente células de Drosophila melanogas ter. Otras células eucarióticas que incluyen levadura, células de mamífero, tal como células de ovario de hámster chino, o tipos adicionales de células de insecto también se pueden usar. Sin embargo, para hacer factible una vacuna efectiva en el costo, los productos de 80%E diméricos se deben secretar eficientemente con procesamiento y plegado correcto . Se ha encontrado, como se demuestra posteriormente en la presente, que la secreción particularmente eficiente de la proteína madura biológicamente activa se logra más fácilmente usando la línea de células Schneider-2 de Drosophila melanogaster. La expresión de los productos diméricos se impulsa por un promotor de células de insecto, eficiente (promotor de metalotioneína de Drosophila) y la secreción se busca usando una guía de secreción eucariótica (guía de secreción del activador de plasminógeno del tejido humano) así como la proteína de prM flaviviral que contiene la señal de secreción para E. También se pueden usar otros componentes y guías de secreción. En general, la invención incluye el sistema de expresión y se pueden operar en células eucarióticas y que dan por resultado la secreción de las proteínas P1036/00 X de envoltura, flavivirales, truncadas, diméricas en el medio. De esta manera, útiles en la invención son las células y cultivos celulares que contienen un sistema de expresión que da por resultado la producción y secreción de las proteínas de envoltura, flavivirales, truncadas, diméricas, maduras. Las proteínas de E, truncadas, diméricas, apropiadamente procesadas se recuperan a partir del medio de cultivo celular, se codifican y se formulan en vacunas . La purificación y formulación de vacunas emplea técnicas normales y son materias de optimización de rutina. Se encuentran las formulaciones adecuadas, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences , última edición, Mack Publishing Company, Easton, PA. En particular, las formulaciones incluirán un adyuvante, tal como alum u otro adyuvante eficaz. De manera alternativa, el ingrediente activo del adyuvante se puede co-administrar en formulaciones separadas. Las vacunas activas de la invención se pueden usar solas o en combinación con otras vacunas activas tales como aquéllas que contienen formas atenuadas o muertas del virus, o aquéllas que contienen otras subunidades activas al grado que lleguen a ser disponibles. Las vacunas pueden contener sólo una subunidad como un ingrediente activo, o componentes activos adicionales, aislados se pueden adicionar. Las subunidades correspondientes o diferentes de uno o varios serotipos se pueden incluir en una formulación P1036/00MX particular. Para inmunizar sujetos contra la infección flaviviral, las vacunas que contienen cantidades terapéuticamente eficaces en la subunidad se administran al sujeto en protocolos de inmunización convencionales que comprenden, usualmente, administraciones múltiples de la vacuna. La administración típicamente es por inyección, normalmente inyección intramuscular o subcutánea; sin embargo, también se pueden emplear otros modos sistémicos de administración. Usadas con menor frecuencia, las formulaciones transmucósicas y transdérmicas se incluyen dentro del alcance de la invención ya que son un medio eficaz para la administración oral. La eficacia de estas formulaciones es una función del desarrollo de la tecnología de formulación en lugar de la contribución de la presente invención. Además del uso en vacunas, las proteínas de E truncadas, diméricas, recombinantes de la invención se pueden usar como reactivos analíticos en la valoración de presencia o ausencia de anticuerpos anti-flavivirales en muestras. Estos usos incluyen de manera enunciativa: diagnosis de la infección con cualquier flavivirus, tal como dengue, monitoreo de la respuesta a la infección flaviviral, o uso de inmunoensayos como parte de los procedimientos de laboratorio normales en el estudio del progreso de la P103G/00MX formación de anticuerpos o en la correlación de los epítopes y similares. Los antígenos se emplean en formatos de inmunoensayo normales con sistema de detección normales tales como sistemas de detección basados en enzimas, basados en fluorescencia, y basados en isótopos. De manera preferente, el antígeno se usa acoplado a un soporte sólido o en ensayos de intercalación, pero es posible una multiplicidad de protocolos y estándares en la técnica. De esta manera, las proteínas diméricas, secretadas, el dímero ligado de 80%E, Cremalleral de 80%E, Cremallerall de 80%E o Manojo de 80%E, se pueden absorber en el soporte sólido y el soporte luego se trata con una muestra que se va a probar para la presencia de anticuerpos anti-flavivirales . Se remueve la muestra no unida, y cualquier anticuerpo unido se detecta usando sistemas de detección normales, por ejemplo, al tratar el soporte con un anticuerpo antiespecie acoplado a un reactivo de detección, por ejemplo, peroxidasa de rábano (HRP), con la especificidad de la especie del anticuerpo determinada por la muestra que se prueba. La presencia del anticuerpo anti -especie conjugado con HRP luego se detecta al suministrar un substrato cromogénico, adecuado . Además, las proteínas diméricas se pueden usar para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos de varios isotipos, incluyendo los isotipos de IgG e IgM al alterar simplemente la especificidad de P103S/00MX los anticuerpos de detección. Esto puede ser particularmente significativo puesto que los anticuerpos de IgM a los flavivirus se consideran diagnóstico de una infección flaviviral primaria. De manera alternativa, el anticuerpo anti -subunidad o anti-flaviviral se puede absorber al soporte sólido y detectar al tratar el soporte sólido con las proteínas diméricas recombinantes, ya sea marcadas directamente, o marcadas con un anticuerpo adicional en un ensayo tipo intercalación. En otra modalidad, esta invención se refiere a equipos de diagnóstico que comprenden un antígeno fijado a una fase de soporte sólido y un sistema de detección inmunológico . El antígeno de esta invención es un producto dimérico secretado usado junto con un sistema de detección inmunológica. El antígeno incluye la proteína E truncada, dimérica, recombinante en la forma de un dímero ligado de 80%E o una cremalleral de 80%E o una cremallerall de 80%E o un manojo de 80%E. La fase de soporte sólida de esta invención se refiere a cualquiera de aquéllos encontrados en la técnica, incluyendo placas de microtítulo. El sistema de detección de esta invención se refiere a cualquiera de aquéllos encontrados en la técnica que incluyen anticuerpos anti -humanos conjugados con una marca de enzima detectable. En los ejemplos posteriores, la expresión, secreción, procesamiento e inmunogenicidad de las P1036/00MX proteínas diméricas secretadas, el dímero ligado de 80%E, Cremalleral de 80%E, Cremallerall de 80%E y manojo de 80%E se demuestran. Los productos se producen recombinantemente como funciones de prM-80%E y se procesan eficientemente para remover la porción prM y se secretan a partir de células de Drosophila . Los productos de 80%E diméricos, secretados se secretan a altos niveles, hasta 10 µg/ml en células no seleccionadas, y exhiben un patrón complejo de glicosilación típico de sistemas de expresión de células de mamífero e insecto. Adicionalmente, con base en la reactividad de los anticuerpos monoclonales conformacionalmente sensibles, los productos diméricos de 80%E secretados tienen conformación tipo nativa y la inmunización de ratones con 80%E dimérico, ya sea crudo o purificado, produce una inmunorrespuesta neutralizadora del virus, potente. Con los siguientes ejemplos se pretende ilustrar pero no limitar la invención.

EJEMPLO 1 Construcción del vector de expresión pMttD2prM2X80E para la secreción del Dímero Ligado de 80%E La cepa PR159/S1 de DEN-2 sirvió como la fuente para todos los genes DEN-2 usados en la invención. Esta cepa tiene un fenotipo sensible a la temperatura, de placa pequeña y difiere de la cepa PR159 de DEN-2 tipo silvestre en sólo un aminoácido en P1036/00MX las regiones de codificación de prM y E. Un clon de ADNc, pC8 (Hahn et al., 1988), derivado de la cepa PR159/S1 de DEN-2 se usó como material de inicio para la clonación de los subclones descritos posteriormente. La secuencia del clon se ha publicado previamente (Hahn et al., 1988), sin embargo, la secuenciación completa del clon de pC8, así como los subclones derivados de pC8, en este laboratorio han identificado un número de discrepancias con la secuencia publicada. La secuencia de nucleótidos completa y la secuencia de aminoácidos reducida del ADNc que codifica para la cápside viral, prM, E y los genes NS1 para PR159/S1 se incluye en la Figura 3. Mostrado en negritas (e indicado con un *) en los nucleótidos 103, 1940, 1991 y 2025 son correcciones de la secuencia publicada por Hahn. El clon de ADNc de pC8 se usó para generar varios subclones típicos para la construcción de los clones de 80%E diméricos incluidos en esta invención. El primer subclón codifica para los aminoácidos 1-395 de E (80%E) . Los cebadores D2E937p y D2E2121m, mostrados posteriormente, se usaron para amplificar el fragmento de ADNc que se extiende desde el nucleótido 937 al 2121 y que corresponde al 80%E. Estos cebadores incluyen sitios de restricción convenientes para la clonación y el cebador D2E2121m incluye dos codones finalizadores después del 395-avo codón de E . La secuencia de los cebadores se lista posteriormente con una secuencia de dengue listada con letras mayúsculas y P1036/00MX la secuencia no de dengue listadas en letras minúsculas .

Bql II D2E937p 5' - cttctagatctcgagtacccqggacc ATG CGC TGC ATA GGA ATA TC - 3' Xbal Xhol Smal Met Arg Cys lie sly He Ser Sal I D2E2121m 5' - qctctagagtcga cta tta TCC TTT CTT GAA CCA G - 3' Xbal END END Gly Lys Lys Phe Trp El fragmento de ADNc de 80%E, amplificada se digirió con Xbal y se clonó en el sitio Nhel de pBR322 para obtener el plásmido p29D280E. La secuencia de nucleótidos completa del clon se determinó y una ] 0 mutación inducida por PCR, ausente, individual, en el nucleótido 2001 (AAC/Asn a AAT/Asn) se identificó. La porción del genoma que codifica para prM y E se subclonó a partir de pC8 usando la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) . Los cebadores de 315 oligonucleótidos se diseñaron para amplificar la región del genoma, los nucleótidos 439 a 2421, que corresponden a los aminoácidos 1-66 de prM y 1-495 de E con los sitios de restricción convenientes manejados en los cebadores para facilitar la clonación. Además, el cebador usado para amplificar t el término amino de la poliproteína prM incluye un codón de metionina (ATG) que precede inmediatamente el primer codón (fenilalanina) de la secuencia de codificación de prM.

La secuencia de los cebadores se listan posteriormente P1036/00MX con la secuencia de dengue listada en letras mayúsculas y las secuencias no de dengue listadas en letras minúsculas .

Bgl II D2prM439p 5' - attctagatctcgagtacccgggacc atg TTT CAT CTG ACC ACÁ CGC -3' Xbal Xhol Smal Met Phe His Leu Thr Thr Arg Sal I D2E2421m 5' tctctagagtcga cta tta GGC CTG CAC CAT AAC TCC Xbal END END Ala Glp Val Met Val Gly El fragmento de ADNc de prM100%E generado por PCR se digirió con endonucleasa de restricción Xbal y se ligó en el sitio Xbal de pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) para obtener el plásmido p29prME13. El análisis de la secuencia de ADN del clon de ADNc generado por PCR identificó dos diferentes nucleótidos inducidos por PCR entre pC8 y p29prME13 en la región de codificación de prM- 80%E. La primera mutación comprende una transición de T a C en el nucleótido 1255 que está silencioso, y el segundo cambio comprende una transición de A a G en el nucleótido 1117 que da por resultado la substitución conservadora de aminoácidos de una valina por una isoleucina de posición 61 de E. Esta mutación se repara al reemplazar un fragmento de AflII que contiene la mutación con el fragmento de AflII correspondiente de pC8 que codifica para la secuencia correcta. Para generar un subclon de ADNc que represente P1036/OOMX prM80%E, un fragmento de BamHI-SalI de 794 pb, que representa el extremo caboxi-terminal de E, se removió de p29prME13 y se reemplazó con el fragmento de BamHI-Sall de 431 pb a partir de p29D280E, que codifica para el extremo carboxi -terminal de 80%E. El sitio de BamHI es un sitio que se presenta de manera natural dentro del ADNc de envoltura, y el sitio Salí es un sitio manejado por ingeniería que sigue inmediatamente los codones finalizadores purificados por los cebadores de PCR. El clon de ADNc truncado, resultante, pBsD2prM80E, se confirmó por digestión por restricción y análisis de secuencia de ADN para codificar los aminoácidos de 1 a 166 de prM y de 1 a 395 en la envoltura . Para manejar el dímero de 80%E, ligado, el ADNc que codifica 80%E se amplificó por PCR en dos "mitades" a partir de pC8 usando cebador/adaptadores que incluyen el ligador flexible y un sitio de endonucleasa de restricción Kpnl para facilitar la ligación de las dos mitades. Una mitad, designada PCR 1, codificó el término carboxi de ligador flexible del término amino de 80%E. La otra mitad, designada PCR 2 codificó el término carboxi de 80%E y el término amino del ligador flexible. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores usados para amplificar los ADNc de PCR 1 y PCR 2 se enlistan posteriormente. En cada caso, los fragmentos de ADNc abarcaron un sitio de BamHI único, que se presenta de forma natural, dentro de la región P1036/0OMX de codificación de 80%E. La estrategia para generar y clonar los fragmentos se resumen en la Figura 4. Los productos de PCR se digirieron con PstI y BamHI y se clonaron individualmente en vectores de plásmido pUC cortados con las mismas dos encimas, dando por resultado los plásmidos pUC18PCRl y pUC13PCR2 que se confirmaron por análisis de secuencia de ADN. El fragmento que codifica para el término amino de 80%E se liberó a parir del subclon pUCldPCRl por digestión con Kpnl y se clonó en pUC13PCR2 linealizado con Kpnl para generar el clon pUC13PCR2+l que codifica para el término carboxi de 80%E-ligador flexible-término amino de 80%E. Los cebadores usados para generar el fragmento PCR1 de ADNc fueron: Pa Kpnl DX80E-2N 5' AsTCCTGCAGGTACCGGTsstssTGsTTCTGGTsG7GGTTCTGGTGGTGGTATGCGTTGCATA a . a . secuencia T G G G G S G G G S G G G M R C I GGAATATCAAATACG G 1 S N R D2S2007W 5r CTATGATGATGTAGCTGTCTCC a.a. secuencia i i i Y s D G Los cebadores usados para generar el producto de PCR2 de ADNc fueron: P1O36/O0MX PstI Kpnl DI80K-1C 5 ' GCT(?GCTGCAGGTACCACCACCAGAAC(?CCACC?CCAl3AACCACCACCACCpTCTT a . . secuencia G G G S G G G G S G G G G K K GAACCAGTCCAGC F W D L D2E1642P 5 ' GACACTGGTCACCTT a.a. secuencia L V T P Para generar la secuencia que codifica para prM más las copias ligadas en tándem de 80%E, el fragmento de ADNc que codifica para el término carboxi de 80%E-ligador flexible-término amino de 80%E se liberó a partir del clon pUC13PCR2+l por digestión con BamHI . Este fragmento de BamHI luego se ligó con pBsD2prM80E digerido con BamHI para producir pBsD2prM2X80E (Figura 5) . Para facilitar las manipulaciones del plásmido de expresión del dímero de 80%E, ligado, se modificó el vector de expresión de Drosophila melanogas ter pMttbns (SmithKline Beecham) . Un sitio Xhol en el nucleótido 885 se borró al remover un fragmento de BamHI de 19 pares de bases que contiene el sitio Xhol. El plásmido pMtt-Xho resultante contuvo un sitio Xhol único en los nucleótidos 730 que precede a la señal de poliadenilación de SV40 y es útil para introducir genes para los estudios de expresión. El plásmido pMtt-Xho se modificó adicionalmente para suprimir un sitio Kpnl justo en la dirección corriente arriba del promotor de metalotioneína de modo que en la introducción de las secuencias del dímero de 80%E ligado, el sitio Kpnl en P1036/OOMX 48 el ligador será único en el clon. Para lograr esto, el plásmido pMtt-Xho se digirió con la endonucleasa de restricción Acc65I. Esta encima tiene la misma secuencia de reconocimiento como Kpnl pero en la 5 digestión da como resultado una saliente en 5 ' que se puede hacer al ras en la incubación con el fragmento Klenow del ADN-polimerasa I y los desoxirribonucleótidos . De esta manera, la digestión de pMtt-Xho con Acc65I seguido con el tratamiento Klenow y la ligación dio por resultado, el pMtt-HBG, que carece del sitio Kpnl (Figura 6) . Para introducir el dímero de 80%E, y ligado en el plásmido de expresión de pMtt-HBG, pBsD2prM2X80E se digirió con BglII y Salí para liberar el fragmento de .15 codificación de prM-80% del E-ligador-80%E . Este fragmento se ligó en pMtt-HBG digerido con BglII/SalI (Figura 6) . El análisis de la secuencia de ADN del plásmido resultante pMttHBGD2prM2X80E, confirmó que el clon contuvo la secuencia de codificación completa de prM2X80E pero carece de la señal de poliadenilación de SV40. Este clon es útil para introducir los oligonucleótidos que codifican para la cremallera de leucina y los dominios de manojo de cuatro hélices (Ejemplos 2,3, y 4) pero no es útil para los estudios de expresión, puesto que ninguna extremidad de poli A está asociada con bajos niveles de expresión. Para restaurar la señal de poli-adenilación, el fragmento de BglII/SalI que contiene prM2X80E se removió del clon P1036/00MX pMttHBGD2prM2X80E y se ligó en el plásmido pMtt-Xho digerido con Bgl11 y Xhol (Figura 8) . El plásmido resultante, el pMttD2prM2X80E, se usó para la transfección de células de Drosophila y los estudios de expresión.

EJEMPLO 2 Construcción del vector de expresión pMttD2prM80ECremalleraI para la secreción de la cremalleral de 80%E, ligado de manera no covalente El plásmido pMttHBGD2prM2X80E se usó como la estructura para la introducción de oligonucleótidos que codifican para una mitad del ligador Gly4Ser flexible y la hélice de espiral enrollada día cremallera de leucina. Como se ilustra en la Figura 7, este plásmido e digirió con Kpnl y Salí para remover un fragmento que contiene la mitad carboxi -terminal del ligador flexible y la segunda copia de 80%E. Cuatro oligonucleótidos de traslape, que codifican para la mitad carboxi -terminal del ligador y la hélice día cremallera de leucina se fijaron entre sí, generando un sitio Kpnl en el extremo 5' y el sitio Salí en el extremo 3' . El nucleótido y la secuencia de aminoácidos codificada de los oligonucleótidos de traslape se enlistan posteriormente . Los oligos fijados se ligaron en el vector digerido Kpnl/Sall para generar el plásmido de expresión pMttHBGprM80EZipI . La identidad del clon pMttHBGprM80EZipI se confirmó por digestión por P1036/00MX restricción y análisis de secuencia limitada. Sin embargo, como se describe con anterioridad, el pMttHBGD2prM2X80E usado como la estructura para esta construcción carece de la secuencia de poliadenilación de SV40. Por lo tanto, el fragmento de BglII/SalI de pMttHBGprM80EZipI , codifica para prM80%E-CremalleraI , se removió del plásmido pMttHBGprMdOEZipI y se clonó en el vector pMtt-Xho digerido con BglII/XhoI para restaurar la señal de poliadenilación en la dirección corriente abajo (Figura 8). El plásmido resultante pMttD2prM80EZipI , se confirmó por digestión por restricción de análisis de secuencia y se usó para transfectar células de Drosophila para estudios de expresión.

Secuencias de Oligonucleótidos: GT?CCGGCGGTGGCTCOßßC8TßßCTCCCCCCaC?T^^ 3' GCCGC??CCGAGGCCGCCACCGAGGGGGGCGTACTTVGTCGACGTCCTGTTCCACCTC CGACGA a. a. T G s s S G G G S P R M K Q L E D K V E E L L GtCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCCGCCTGAAGAAGCTGGTGGGCGAGCGCTAATAGG 3' CAGGTTCTTC?TGGrGGACCTC.rTGCrCCACCGGßC^ 5' K N Y H L N V A R K L V G E P1036/OOMX EJEMPLO 3 Construcción del vector pMttD2prM80ECremalleraII para la secreción de Cremallerall de 80%E, covalentemente ligado El plásmido pMttHBGD2prM2X80E se usó como la estructura para la introducción de oligonucleótidos que codifican para una mitad del ligador Gly4Ser flexible y la hélice de espiral enrollada día cremallera de leucina con un residuo de cisteína cerca al término carboxi . Como se ilustra en la Figura 7, este plásmido se digirió con Kpnl y Salí para remover un fragmento que contiene la mitad carboxi-terminal del ligador y la segunda copia de 80%E. Cuatro oligonucleótidos de traslape, que codifican para la mitad carboxi-terminal del ligador y la hélice de cremallera de leucina que contiene cisteína se fijaron entre sí, generando un sitio Kpnl en el extremo 5' y el sitio Salí en el extremo 3'. El nucleótido y la secuencia de aminoácidos codificada de los oligonucleótidos de traslape se enlistan posteriormente. Los oligos fijados se ligaron en el vector digerido con Kpnl/Sall para generar el plásmido de expresión pMttHBGprM80EZipII . La identidad del clon pMttHBGprM80EZipII se confirmó por digestión por restricción de análisis de secuencia limitado. Sin embargo, como se describe con anterioridad el pMttHBGD2prM2X80E usado como la estructura para esta construcción carece de la secuencia de poliadenilación P1036/00MX SV40. Por lo tanto, el fragmento BglII/SalI de pMttHBGprM80EZipII, que codifica para prM80%E Cremallerall, se removió del plásmido pMttHBGprM80EZipII y se clonó en el vector pMtt-Xho digerido con BglII/XhoI para restaurar la señal de poliadenilación en la dirección corriente abajo (Figura 8) . El plásmido resultante, pMttD2prM80EZipII se confirmó por digestión por restricción y análisis de la secuencia y se usó para transfectar células de Drosophila para los estudios de expresión.

Secuencias de Oligonucleótidos GTACCGGCGGTGGCTCCGGCGGtsS?TCCCCCCs?TßrAAt3CAgCTGGAGt^CAAsGT(MAßGAGCTOCT 3' GCCGCCACCGAGGCCGCCACCGAGGGGGGCGTACTTCGTCGACCTCCTGTTCCACCTCCTCGACGA a-a- T G G G S G G G S P R M K Q L E D K V E E L L ßtccAAsAACTACCAcctssAG.AACGAGGrsscccsccrsAAGAAscrssrssGCGAs s sGcssttscss CGG cAssttcrtcArssts(Mcctcttsc^ S K N Y H L E N E V A R L K K L V G E R G G C G GGAAGAGG > AATTATCCAGCT S' EJEMPLO 4 Construcción del vector de expresión pMttD2prM80EMano o , para la secreción del manojo de 80%E no ligado covalentemente El plásmido pMttHBGD2prM2X80E se usó como la P1036/00MX estructura para la introducción de oligonucleótidos que codifican para una mitad del ligador Gly4Ser flexible y el dominio del hélice-vuelta-hélice. Como se ilustra en la Figura 7, este plásmido se digirió con Kpnl y Salí para remover un fragmento que contiene la mitad de carboxi-terminal del ligador y la segunda copia de 80%E. Cuatro oligonucleótidos de traslape, que codifican para la mitad carboxi-terminal del ligador y el dominio hélice-vueltas-hélice se fijaron entre sí, generando un sitio Kpnl en el extremo 5' y el sitio Salí en el extremo 3'. El nucleótido y las secuencias de aminoácidos codificadas y los oligonucleótidos de traslape se enlistan posteriormente. Los oligos fijados se ligaron en el vector digerido con Kpnl/Sall para generar el plásmido de expresión pMttHBGprMdOEManojo. La identidad del clon pMttHBGprM80EManojo se confirmó por digestión por restricción y análisis de secuencia, limitada. Sin embargo, como se describe con anterioridad, el pMttHBGD2prM2X80E usado como la estructura para esta construcción carece de la secuencia de poliadenilación de SV40. Por lo tanto, el fragmento de BglII/SalI de pMttHBGprM80EManojo, que codifica para el manojo de prM60%E, se removió del plásmido pMttHBGprMdOEManojo y se clonó en el vector pMtt-Xho digerido por Bglll/Xhol para restaurar la señal de poliadenilación en la dirección corriente abajo (Figura 8) . El plásmido resultante, P1036/00MX pMttD2prM80EManojo, se confirmó por digestión por restricción y análisis de secuencia y se usó para transfectar células de Drosophila para los estudios de expresión.

Secuencias de Oligonucleótidos GTACCGGCGGTßGCTCCGGCßßTGGCTCCCCCGGCGAGCTGGAGGAGCTGCTGAAGCACCTG??GG?G 3' GCCGCCACCGAGGCCGCCACCGAGGGGGCCGCTCGACCTCCrCGACGACTTCGTGGACTTCC C a. a. T G G G S G G G S P G E L E E L L K H L K E CTG TGAAGssCCC CGCAAGGsCGAG rsGAsGAsCrscrGAAsCACCTsAAssAsCTGCTGAAGGGCGAG GACGACTTCCCsssGGCGTTCCCGCTCGACCTCCTCGACGACTTCGTGGACrrTCCTCsACßACT CCCGCTC L L K G P R K G E L E E L L K H L K E L L K G E TTCTAATAGG 3' AAß?TT?TCC?GCT 5' F EJEMPLO 5 Expresión v Secreción de Dímero de 80%E Ligado, Cremalleral de 80%E, Cremallerall de 80%E y Manojo de 80%E a partir de células S2 de DrosoOhila me lanosas ter Se co-transfectaron células Schneider-2 de Drosophila melanogaster (S2; ATCC, Rockville, MD) con cada uno de los plásmidos de expresión descritos en detalle con anterioridad (pMttD2prM2X80Ef , pMttD2prM80ECremalleraI, pMttD2prMd0ECremalleraII , o pMttD2prM80EManojo) y el plásmido de selección, pCoHygro, a una relación en peso de 20:1 usando el método de co-precipitación con fosfato de calcio P1036/00MX (Wigler et al., 1979; Gibco BRL, Grand Island, NY) . El plásmido en selección pCoHygro (van der Straten et al . , 19d9; SmithKline Beecham) codifica para el gen de fosfotransferasa de higromicina B de E. Coli bajo el control transcripcional thr de la repetición terminal larga del elemento transponible de copia de D. Melanogas ter y copia de resistencia a higromicina B. Se seleccionaron los transfectantes para crecer más en el medio de Schneider (Gibco BRL) complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Hyclone) y 300 µg/ml de higromicina B (Boerhinger Mannheim) . Después del crecimiento significativo, los transfectantes se colocaron en placa a una densidad celular de 2 X 10 células/ml en el medio IPL-41 libre de suero complementado con lípidos, yeastolato, y Pluronic F66 (Gibco BRL) e inducido con CuS04 200 µM. Los medios se recolectaron después de 7 días de inducción. Las proteínas secretadas en el medio de cultivo se separaron por SDS-PAGE, y se analizaron por tensión con azul de Coomassie y se inmunosondearon de transferencias Western con un dominio B anti-DEN2 policlonal (el dominio B corresponde a los aminoácidos 296-395 de E) . Bajo condiciones no reductoras, los tamaños esperados del dímero de d0%E ligado, Cremalleral de d0%E, Cremallerall de 80%E, y Manojo de 80%E son de 69.1 kD, 49.2 kD, 99.5 kD, y 49.5 kD respectivamente. Una banda inmunoreactiva de peso molecular apropiado detectó en el medio de cultivo a P1036/00MX partir de las cuatro construcciones (Figura 9A) . Este análisis confirma que la cremallerall de dO%E, que se diseñó con residuos de cisteína cerca del extremo terminal carboxi de las alfa-hélices día cremallera de leucina para facilitar la formación de enlace de sulfuro, se dimeriza covalentemente por el enlace de disulfuro. Esto es en contraste al Cremalleral de 80%E no covalentemente asociado y los productos de manojo de 80%E que migran como monómeros bajo condiciones desnaturalizantes pero no reductoras. La tinción con azul de Coomassie de los medios crudos reveló una banda única que es simplemente visible en las sendas de Cremalleral de 80%E, Cremallerall de dO%E, y Manojo de dO%E (Figura 9B) . Las bandas co-emigradoras de tamaño similar hacen más difícil la visualización de la banda del dímero de 60%E y ligado. Basándose en la tinción de los estándares de proteína, se estimaron las concentraciones de las proteínas diméricas para estar entre 5 y 15 µg/ml dependiendo de la construcción y las condiciones de crecimiento. De esta manera, las cuatro proteínas de 60%E diméricas expresan altos niveles y se secretan eficientemente a partir de cultivos de S2 de Drosophila transfectados.

EJEMPLO 6 Productos de 80%E Diméricos. Secretados se Glicosilan La E viral de dengue nativa es una P1036/00MX glicoproteína que exhibe un patrón complejo de glicosilación típico de las proteínas expresadas por células de mamífero e insecto. Los análisis adicionales de los productos de 80%E diméricos recombinantes, secretados demostraron que se glicosilan los cuatro productos. Los medios crudos que contienen dímero de 80%E y ligado, Cremalleral de 80%E, o Manojo de 80%E o Cremallerall de 80%E purificado se desnaturalizaron en tratamiento térmico con SDS y 2-mercaptoetanol antes de la digestión con endoglicosidasa H (EndoH) o péptido :N-glicosidasa F(PNGasa F) . Se separaron las preparaciones de control no digeridas y digeridas en geles de SDS-PAGE y se analizaron por tinción con azul de Coomassie o análisis de transferencia Western. Las transferencias Western se sondearon con fluido de ascitis de ratones hiper-inmunitarios (HMAF) , anti-DEN2 policlonales demuestran que todos los productos diméricos son resistentes a la digestión con EndoH pero sensibles a la digestión con PNGasa F consistente con un patrón de complejo de glicosilación (Figura 10) . De esta manera, el patrón de glicosilación de los cuatro productos de 80%E, diméricos, recombinantes, es similar a aquel del dengue nativo E. Además, esta transferencia demuestra que bajo condiciones reductoras, la cremallerall de 80%E corre como un monómero similar en tamaño al Cremalleral de 80%E y el Manojo de 80%E. Esto nuevamente está consistente con la formación de un enlace de sulfuro P1036/00MX entre la cisteína localizada cerca del extremo carboxi-terminal de las hélices día cremallera de leucina.

EJEMPLO 7 Productos de 80%E Diméricos, Recombinantes, se Reconocen por Anticuerpos Monoclonales Conformacionalmente Sensibles La reactividad de los productos de 80%E, diméricos, recombinantes, con anticuerpos monoclonales, conformacionalmente sensibles (Mab) se valoró usando ensayos de inmunofluorescencia indirectos (IFA) . Se colocaron en placa células S2 transfectadas en porta objetos y se fijaron con acetona enfriada con hielo. Las células luego se trataron con varios anticuerpos policlonales y monoclonales diluidos con PBS que contienen FBS al 20%. Después de lavado el anticuerpo no unido, el anticuerpo unido se detectó al hacer reaccionar las células con inmunoglobulina anti-ratón de cabra marcada con isotiocianato de fluoresceína y observando en un microscopio fluorescente después de la excitación a 470 nm. Las células transfectadas con el Dímero Ligado de 80%E, Manojo de 80%E, Cremalleral de 80%E, y Cremallerall de 80%E se reconocieron eficazmente por los Mab 9D12 y 4G2 conformacionalmente sensibles (Henchal et al., 1992; Masón et al., 1989) . Además se reconocieron todos los transfectantes por el Mab 5A2 que se une a un epítope lineal localizado en la región del dominio B de E (Megret et P1036/00MX al., 1992) . Estos datos sugieren que estos productos diméricos recombinantes son antihigiénicamente similares a la E viral nativa y por lo tanto pueden servir como un inmunógeno de vacuna, útil.

EJEMPLO 8 Inducción de anticuerpos neutralizantes del virus del dengue en la inmunización de ratones con 80%E dimérico secretado producido por células S2 transfectadas Las células S2 que expresan Dímero Ligado de 80%E, Manojo de 80%E, Cremalleral de 80%E, y Cremallerall de 80%E se cultivaron en el medio libre de suero (IPL-41 complementado; Gibco BRL) e inducido por la adición de CuS04 a una concentración final de 0.2 mM en el medio de cultivo (ver ejemplo 5 para más detalle en las condiciones de cultivo) . Las células se mantuvieron en el medio de inducción durante siete días antes de la recolección. Las células se removieron por centrifugación a 1000 X G en una centrífuga refrigerada Beckman TJ-6 y los medios se filtraron a través de un filtro de acetato de celulosa 0.2 µm (Nalgene). Los medios que contienen los productos diméricos de 80%E, recombinantes, secos entraron aproximadamente diez veces y se intercambiaron con amortiguador con PBS. La concentración total de proteínas del medio se determinó usando un ensayo de unión de tinte (Biorad) . Se inmunizaron intraperitonealmente ratones Balb/c P1036/00MX (Jackson Laboratories) con 100 µg de proteína total de cada medio concentrado (de los cuales sólo -5-10% fue la proteína del dengue) en el adyuvante completo de Freund. Los ratones se reforzaron dos veces, a intervalos de dos semanas, con 50 µg de cada medio en el adyuvante completo de Freund. Diez días después del último refuerzo, se sacrificaron los animales y se obtuvo su sangre para la prueba. Los sueros de los ratones inmunizados se probaron para la presencia de anticuerpos que se unen al DEN-2 80%E recombinante usando un ensayo de ELISA, indirecto. En resumen, se revistieron placas con DEN-2 80%E recombinantes, purificado, se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) , y luego se incubaron diluciones en serie de los sueros de ratón con el antígeno de revestimiento. Se usó la IgG anti-ratón de cabra marcada con fosfatasa alcalina como el anticuerpo de detección secundario, y se monitoreó el desarrollo del color de una adición de un sustrato cromogénico de fosfatasa alcalina. El título de ELISA es recíproco de la dilución más alta del suero que dio por resultado una densidad óptica de dos veces por arriba del fondo (reactividad del suero ultra BSA únicamente) . Los sueros también se probaron para anticuerpos neutralizantes del virus usando una prueba de neutralización de reducción de placa (PRNT) . En el ensayo de PRNT, los sueros de ratones se diluyeron en serie en el medio esencial mínimo de Eagles (EMEM; Bio P1036/0OMX Whittaker) complementado con FBS al 10% (Hyclone) y se mezclaron con 100 unidades formadoras de placa del virus de DEN-2 Vero-adaptado (de Robert Putnak, WRAIR) . Después de una hora para la neutralización del virus, las mezclas se colocaron en placa en monocapas de riñon de mono susceptible (células Vero, de Robert Putnak, WRAIR) colocadas en placa en EMEM que contiene FBS al 10% en cajas de cultivo de tejido de 6 pozos (Costar) . Después de dos horas para que el virus se uniera, las células se revistieron con agarosa al 0.9% (Fisher) en EMEM complementado con FBS al 5%. Se permitió que se desarrollará el efecto citopático viral durante 6-7 días y se tiñeron las placas virales con rojo neutral al 0.012% (Sigma) en agarosa al 1%. El número de placas en cada aglomeración se contó y se comparó con un control viral no sérico. El título de PRNT80 fue recíproco de la dilución más alta del suero que dio por resultado al menos 80% de la reducción en el número de placas en comparación al control viral no sérico. Los resultados de los ensayos de ELISA y PRNT se resumen en la Tabla 1. Todos los medios indujeron una respuesta de neutralización y unión al virus en los ratones, demostrando que todos los inmunógenos de 80%E diméricos son capaces de funcionar como inmunógenos eficientes.

P1036/00MX 036/00MX EJEMPLO 9 Los Productos Diméricos, Recombinantes, Secretados de 80%E se Pueden Purificar de Manera Eficiente Usando Cromatografía de Inmunoafinidad El MAb 9D12 conformacionalmente sensible se ha usado previamente en nuestro laboratorio para purificar de manera eficiente el DEN-2 80%E monomérico. Este MAb se une al epítope conformacional en la región del dominio B (aminoácidos 296-395) de E DEN-2. El MAb 9D12 se acopló covalentemente a una columna HiTrap (Pharmacia) y se usó para purificar por inmunoafinidad cada una de las moléculas de 80%E diméricas, recombinantes, el Dímero de 80%E Ligado, Cremalleral de 80%E, Cremallerall de 80%E, y el manojo de 80%E. El medio crudo que contiene los productos se aplicó a la columna y se removió el material no unido con lavado extensivo con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . El material unido se eluyó con Glicina 0.1 M- HCl, pH 2.5 y se neutralizó inmediatamente con fosfato 1.0 M, pH 7.4. Los productos se concentraron y se intercambiaron con amortiguador en PGS antes del P1036/00MX análisis en geles de SDS-PAGE. Cada uno de los productos se purificó de manera eficiente usando esta columna (Figura 11) . En todos los casos, la basta mayoría del 80%E dimérico se unió a la columna y se eluyó eficientemente en un volumen relativamente pequeño . De esta manera, este método ofrece un medio eficiente para generar productos de 80%E diméricos, purificados para prueba animal.

EJEMPLO 10 Inducción de anticuerpos neutralizantes del virus del dengue de alto título de la inmunización de ratones con 80%E dimérico, secretado, purificado Los medios de cultivo de las células S2 expresan el Dímero de 80%E Ligado, Manojo de 80%E, Cremalleral de 80%E, y Cremallerall de 80%E, preparado como se describe en el Ejemplo 8, se usaron con una fuente de antígeno para estudios adicionales de inmunización de ratones. Cada uno de los productos se purificó utilizando cromatografía de inmunoafinidad (IAC) como se describe en el Ejemplo 9. El Dímero de 80%E Ligado, purificado, Cremalleral de 80%E, Cremallerall de 80%E, y productos de Manojo de 80%E se valoraron usando un ensayo de ELISA, de Intercalación, cuantitativo, análisis de SDS-PAGE y transferencia Western. En el ensayo de ELISA de Intercalación, el MAb 9D12 se revistió según las placas, que luego se bloquearon con BSA. Diluciones en P1036/00MX serie de una norma del dominio B de DEN-2 cuantificado a los productos que se van a ensayar se aplicaron en triplicado en cada cavidad. Se detectó el antígeno unido usando un anticuerpo del dominio B anti-DEN-2 de conejo policlonal e inmunoglobulina anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano. El substrato cromogénico para la peroxidasa de rábano se adicionó y monitoreó el desarrollo del color. La absorbancia generada por el antígeno de prueba se comparó a la curva normal y la cantidad del antígeno presente en los equivalentes del dominio B se determina. Para convertir desde los equivalentes del dominio B a 80%E dimérico, la relación en peso (~4.5 para la mayoría de los productos) se determinó al comparar el peso molecular relativo del 80%E dimérico al dominio B y dividir el número de regiones del dominio B presentes en el producto de 80%E dimérico, se usó. Cada producto dimérico por triplicado se cuantificó usando este ensayo para inmunizaciones de ratón. Se inmunizaron ratones Balb/c (Jackson Laboratories) con 1 µg de cada producto de 80%E dimérico, secretado, purificado. Las inmunizaciones se dieron subcutáneamente usando el adyuvante Iscomatris (Iscotech) . Se dieron dos inmunizaciones a intervalos de 4 semanas. Diez días después de la inmunización final los ratones se sacrificaron y su suero se probó para la unión los anticuerpos de neutralización de unión al virus por ELISA y PRNT como se describe en el P1036/00MX Ejemplo 8. Los resultados se resumen en la Tabla 2. Como es claramente evidente, todos los productos de 80%E diméricos indujeron una respuesta de neutralización de virus de alto título. Estos títulos son mayores que cualquier título previamente reportado en la literatura y sugieren que estos productos de 80%E diméricos son candidatos de vacuna esencialmente eficaces .

P1036/00MX O0MX

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES 1. Una vacuna para la protección de un sujeto contra la infección por Flavivirus , en donde la vacuna comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un 80%E dimérico, el 80%E dimérico que se ha secretado como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas. 2. La vacuna según la reivindicación 1, en donde el 80%E dimérico se selecciona a partir del grupo que consiste de: dímero ligado de 80%E, Cremalleral de 80%E, Cremallerall de 80%E; y Manojo de 80%E. 3. La vacuna según la reivindicación 2, en donde el dímero 80%E ligado es una proteína de envoltura truncada del serotipo DEN-1. 4. La vacuna según la reivindicación 2, en donde el dímero ligado de 80%E es una proteína de envoltura, truncada del serotipo DEN-2. 5. La vacuna según la reivindicación 1, en donde el dímero ligado de 80%E es una proteína de envoltura, truncada del serotipo DEN-3. 6. La vacuna según la reivindicación 1, en donde el dímero ligado de 80%E es una proteína de envoltura, truncada del serotipo DEN-4. 7. Una vacuna multivalente para la P1036/00MX protección de un sujeto contra la infección por un Flavivirus , en donde la vacuna comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un primer producto de 80%E dimérico de un serotipo flaviviral; un segundo producto de 80%E dimérico de un segundo serotipo flaviviral; un tercer producto de 80%E dimérico de un tercer serotipo flaviviral; y un cuarto producto de 80%E, dimérico de un cuarto serotipo flaviviral; en donde todos los productos diméricos de 80%E se han secretado como una proteína recombinantemente producida a partir de una célula eucariótica. 8. Una vacuna según la reivindicación 7, en donde los productos de 80%E diméricos son proteínas de envoltura de los serotipos seleccionados a partir del grupo que consiste de: DEN-1; DEN-2; DEN-3; y DEN-4. 9. Una composición de anticuerpos que consiste esencialmente de anticuerpos generados en un sujeto mamífero administrado con una cantidad inmunogénica de la vacuna según la reivindicación 1. 10. Una composición de anticuerpos que consiste esencialmente de los anticuerpos generados en un sujeto mamífero administrado con una cantidad inmunogénica de la vacuna según la reivindicación 2. 11. Una composición de anticuerpos que consiste esencialmente de los anticuerpos generados en un sujeto mamífero administrado con una cantidad inmunogénica de la vacuna según la reivindicación 7. 12. Una composición de anticuerpos que P1036/0OMX consiste esencialmente de los anticuerpos generados en un sujeto mamífero administrado con una cantidad inmunogénica de la vacuna según la reivindicación 8. 13. Una línea de células B, inmortalizadas, en donde las células B se han generado en respuesta a la administración en un sujeto mamífero de una cantidad inmunogénica de la vacuna según la reivindicación 1. 14 Una línea de células B, inmortalizadas, en donde las células B se han generado en respuesta a la administración en un sujeto mamífero de una cantidad inmunogénica de la vacuna según la reivindicación 2. 15. Una línea de células B, inmortalizadas, en donde las células B se han generado en respuesta a la administración en un sujeto mamífero de una cantidad inmunogénica de la vacuna según la reivindicación 7. 16. Una línea de células B, inmortalizadas, en donde las células B se han generado en respuesta a la administración en un sujeto mamífero de una cantidad inmunogénica de la vacuna según la reivindicación 8. 17. Anticuerpos monoclonales secretados por la línea de células B, inmortalizada según la reivindicación 13. 18. Anticuerpos monoclonales secretados por la línea de células B, inmortalizada según la reivindicación 14. 19. Anticuerpos monoclonales secretados por la línea de células B, inmortalizada según la reivindicación 15. P1036/0OMX 20. Anticuerpos monoclonales secretados por la línea de células B, inmortalizada según la reivindicación 16. 21. La vacuna según la reivindicación 1, en donde el Flavivirus es un virus del dengue. 22. La vacuna según la reivindicación 2, en donde el Flavivirus es un virus del dengue. 23. La vacuna según la reivindicación 7, en donde el Flavivirus es un virus del dengue. 24. La vacuna según la reivindicación 8, en donde el Flavivirus es un virus del dengue. 25. Un método para proteger un sujeto contra un Flavivirus , el método comprende administrar a un sujeto en necesidad de esta protección una cantidad eficaz de la vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-8. 26. Un inmunodiagnóstico para la detección de un Flavivirus , en donde el inmunodiagnóstico comprende, un 80%E dimérico que se ha secretado como una proteína recombinante producida a partir de células de Drosophila . 27. El inmunodiagnóstico según la reivindicación 26, en donde el Flavivirus es un virus del dengue . 28. Un inmunodiagnóstico multivalente para la detección de un Flavivirus, en donde el inmunodiagnóstico comprende, un primer producto de 80%E dimérico de un serotipo flaviviral, un segundo producto P1036/00MX de 80%E dimérico de un segundo serotipo flaviviral; un tercer producto de 80%E dimérico de un tercer serotipo flaviviral; y un cuarto producto de 80%E dimérico de un cuarto serotipo flaviviral; en donde todos los productos de 80%E diméricos se han secretado como una proteína recombinantemente producida a partir de una célula eucariótica. 29. El inmunodiagnóstico según la reivindicación 28, en donde el Flavivirus es un virus de dengue . 30. Un equipo de inmunodiagnóstico para la detección un Flavivirus, en un sujeto de prueba en donde el equipo de inmunodiagnóstico comprende: a) 80%E dimérico en donde, el 80%E dimérico se ha secretado como una proteína recombinantemente producida a partir de células de Drosophila ; b) una fase de soporte sólida, adecuada revestida con 80%E dimérico; y c) anticuerpos marcados inmunor eactivos a anticuerpos a partir de un sujeto de prueba. 31. Un equipo de inmunodiagnóstico para la detección de un Flavivirus , en un sujeto de prueba, en donde el equipo de inmunodiagnóstico comprende: a) un primer producto de 80%E dimérico de un serotipo flaviviral; un segundo producto de 80%E dimérico de un segundo serotipo flaviviral; un tercer producto de 80%E dimérico de un tercer serotipo flaviviral, un cuarto producto de 80%E dimérico de un P1036/00MX cuarto serotipo flaviviral, en donde todos los productos de 80%E diméricos se han secretado como una proteína recombinantemente producida a partir de una célula eucariótica; b) una fase de soporte sólida adecuada revestida con los productos de 80%E diméricos; y c) anticuerpos marcados inmunorreactivos a anticuerpos del sujeto de prueba. 32. El equipo de inmunodiagnóstico según la reivindicación 30, en donde el Flavivirus es un virus del dengue. 33. El equipo de inmunodiagnóstico según la reivindicación 31, en donde el Flavivirus es un virus del dengue. 34. Un sistema de expresión de ADN recombinante hospedado en un vector, que comprende: a) una célula hospedadora, eucariótica, adecuada; b) un vector de expresión de ADN, recombinante, adecuado; c) ADN que codifica para 80%E dimérico, enlazado operablemente y ba o el control de un promotor adecuado; y d) el ADN que codifica para el 80%E dimérico enlazado operablemente a una secuencia guía de señal secretoria . 35. El sistema de ADN recombinante, hospedador de vector según la reivindicación 34, en P1036/OOMX donde el 80%E numérico se selecciona a partir del grupo que consiste de: dímero ligado de 80%E; Cremalleral 80%E; Cremallerall de 80%E; y Manojo de 80%E. 36. El sistema de ADN recombinante, hospedador, de vector según la reivindicación 35, en donde la célula hospedadora eucariótica es una célula de Drosophila . 37. Una secuencia de ADN que codifica para 80%E dimérico. 38. La secuencia de ADN según la reivindicación 37, en donde el 80%E dimérico se selecciona del grupo que consiste de: dímero ligado de 80%E; Cremalleral 80%E; Cremallerall de 80%E; y Manojo de 80%E. P1036/00MX LISTADOS DE SECUENCIAS (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: VACUNA DE ENVOLTURA DIMÉRICA RECOMBINANTE CONTRA INFECCIÓN FLAVIVIRAL (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 33 (iv) DOMICILIO PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: MORRISON & FOERSTER (B) CALLE: 2000 Pennsylvania Avenue, NW, suite 5500 (C) CIUDAD: Washington (D) ESTADO: DC (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 20006-1888 (v) FORMA PARA LA LECTURA EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disquete (B) COMPUTADORA: IBM Compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: Windows (D) SOFTWARE: FastSEQ para Windows Versión 2.0b (vi) DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD (A) NÚMERO DE SOLICITUD: 08/904,227 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 31-JUL-1997 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD (A) NÚMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE (A) NOMBRE: Murashige, Kate H (B) NÚMERO DE REGISTRO: 29,959 (C) REFERENCIA/EXPEDIENTE: 247332000500 (ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN (A) TELÉFONO : 2 02 - 8 87 - 150 0 ( B ) TELEFAX : 2 02 - 82 2 - 0168 6 / 00MX (C) TELEX: (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 3381 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ix) CARACTERÍ STI CAS : (A) NOMBRE/CLAVE : Secuencia de Codi f icación ( B ) LOCALI ZACIÓN : 1 . . . 33 8 1 (D ) OTRA INFORMACIÓN : (xi ) DESCRI PCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 2 : ATG AAT AAC CAA CGG AAA AAG GCG AGA AAC ACG CCT TTC AAT ATG CTG 48 Met Asn Asn Gln Arg Lys Lys Ala Arg Asn Thr Pro Phe Asn Met Leu 1 5 10 15 AAA CGC GAG AGA AAC CGC GTG TCA ACT GTA CAA CAG TTG ACÁ AAG AGA 96 Lys Arg Glu Arg Asn Arg Val Ser Thr Val Gln Gln Leu Thr Lys Arg 20 25 30 TTC TCA CTT GGA ATG CTG CAG GGA CGA GGA CCA CTA AAA TTG TTC ATG 144 Phe Ser Leu Gly Met Leu Gln Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met 35 40 45 GCC CTG GTG GCA TTC CTT CGT TTC CTA ACÁ ATC CCA CCA ACÁ GCA GGG 192 Ala Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu Thr lie Pro Pro Thr Ala Gly P1036/OOMX 50 55 60 ATA TTA AAA AGA TGG GGA ACÁ ATT AAA AAA TCA AAG GCT ATT AAT GTT 240 lie Leu Lys Arg Trp Gly Thr He Lys Lys Ser Lys Ala He Asn Val 65 70 75 80 CTG AGA GGC TTC AGG AAA GAG ATT GGA AGG ATG CTG AAT ATC TTA AAC 288 Leu Arg Gly Phe Arg Lys Glu He Gly Arg Met Leu Asn He Leu Asn 85 90 95 AGG AGA CGT AGA ACT GCA GGC ATG ATC ATC ATG CTG ATT CCA ACÁ GTG 336 Arg Arg Arg Arg Thr Ala Gly Met He He Met Leu He Pro Thr Val 100 105 110 ATG GCG TTT CAT CTG ACC ACÁ CGC AAC GGA GAA CCA CAC ATG ATC GTC 384 Met Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met He Val 115 120 125 AGT AGA CAA GAA AAA GGG AAA AGC CTT CTG TTT AAG AC AAG GAC GGC 432 Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Lys Asp Gly 130 135 140 ACG AAC ATG TGT ACC CTC ATG GCC ATG GAC CTT GGT GAG TTG TGT GAA 480 Thr Asn Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu 145 150 155 160 GAC ACÁ ATC ACG TAT AAA TGT CCC TTT CTC AAG CAG AAC GAA CCA GAA 528 Asp Thr He Thr Tyr Lys Cys Pro Phe Leu Lys Gln Asn Glu Pro Glu 165 170 175 GAC ATA GAT TGT TGG TGC AAC TCC ACG TCC ACÁ TGG GTA ACT TAT GGG 576 Asp He Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly 180 185 190 ACÁ TGT ACC ACC ACÁ GGA GAG CAC AGA AGA GAA AAA AGA TCA GTG GCG 624 Thr Cys Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala 195 200 205 CTT GTT CCA CAC GTG GGA ATG GGA TTG GAG ACÁ CGA ACT GAA ACÁ TGG 672 Leu Val Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp 210 215 220 ATG TCA TCA GAA GGG GCC TGG AAA CAT GCC CAG AGA ATT GAA ACT TGG 720 Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg He Glu Thr Trp 225 230 235 240 ATT CTG AGA CAT CCA GGC TT ACC ATA ATG GCC GCA ATC CTG GCA TAC 768 He Leu Arg His Pro Gly Phe Thr He Met Ala Ala He Leu Ala Tyr P1036/00MX 245 250 255 ACC ATA GGA ACG ACG CAT TTC CAA AGA GTC CTG ATA TTC ATC CTA CTG 816 Thr He Gly Thr Thr His Phe Gln Arg Val Leu He Phe He Leu Leu 260 265 270 ACA GCC ATC GCT CCT TCA ATG ACA ATG CGC TGC ATA GGA ATA TCA AAT 864 1 0 Thr Ala He Ala Pro Ser Met Thr Met Arg Cys He Gly He Ser Asn 275 280 285 AGG GAC TTT GTG GAA GGA GTG TCA GGA GGG AGT TGG GTT GAC ATA GTT 912 1 5 Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser Gly Gly Ser Trp Val Asp He Val 290 295 300 TTA GAA CAT GGA AGT TGT GTG ACG ACG ATG GCA AAA AAT AAA CCA ACA 960 20 Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr 305 310 315 320 CTG GAC TTT GAA CTG ATA AAA ACA GAA GCC AAA CAA CCC GCC ACC TTA 1008 25 Leu Asp Phe Glu Leu He Lys Thr Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu 325 330 335 AGG AAG TAC TGT ATA GAG GCT AAA CTG ACC AAC ACG ACA ACA GAC TCG 1056 2 0 Arg Lys Tyr Cys He Glu Ala Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Asp Ser 340 345 350 CGC TGC CCA ACA CAA GGG GAA CCC ACC CTG AAT GAA GAG CAG GAC AAA 1104 !:, 5 Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro Thr Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys 355 360 365 AGG TTT GTC TGC AAA CAT TCC ATG GTA GAC AGA GGA TGG GGA AAT GGA 1152 40 Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly 370 375 380 TGT GGA TTA TTT GGA AAA GGA GGC ATC GTG ACC TGT GCC ATG TTC ACA 1200 ¡15 Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly He Val Thr Cys Ala Met Phe Thr 385 390 395 400 TGC AAA AAG AAC ATG GAG GGA AAA ATT GTG CAG CCA GAA AAC CTG GAA 1248 50 Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys He Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu 405 410 415 TAC ACT GTC GTT ATA ACA CCT CAT TCA GGG GAA GAA CAT GCA GTC GGA 1296 55 Tyr Thr Val Val He Thr Pro His Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly 420 425 430 AAT GAC ACA GGA AAA CAT GGT AAA GAA GTC AAG ATA ACA CCA CAG AGC 1344 60 Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys Glu Val Lys He Thr Pro Gln Ser P1036/00MX 435 440 445 TCC ATC ACA GAG GCG GAA CTG ACA GGC TAT GGC ACT GTT ACG ATG GAG 1392 Ser He Thr Glu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu 450 455 460 TGC TCT CCA AGA ACG GGC CTC GAC TTC AAT GAG ATG GTG TTG CTG CAA 1440 1 0 Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln 465 470 475 480 ATG AAA GAC AAA GCT TGG CTG GTG CAC AGA CAA TGG TTC CTA GAC CTA 1488 15 Met Lys Asp Lys Ala Trp Leu Val His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu 485 490 495 CCG TTG CCA TGG CTG CCC GGA GCA GAC ACA CAA GGA TCA AAT TGG ATA 1536 20 Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp He 500 505 510 CAG AAA GAG ACA CTG GTC ACC TTC AAA AAT CCC CAT GCG AAA AAA CAG 1584 25 Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln 515 520 525 GAT GTT GTT GTC TTA GGA TCC CAA GAG GGG GCC ATG CAT ACA GCA CTC 1632 2 0 Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu 530 535 540 ACA GGG GCT ACG GAA ATC CAG ATG TCA TCA GGA AAC CTG CTG TTC ACA 1680 :., 5 Thr Gly Ala Thr Glu He Gln Met Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr 545 550 555 560 GGA CAT CTT AAG TGC AGG CTG AGA ATG GAC AAA TTA CAA CTT AAA GGG 1728 40 Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly 565 570 575 ATG TCA TAC TCC ATG TGC ACA GGA AAG TT AAA GTT GTG AAG GAA ATA 1776 '15 Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys Glu He 580 585 590 GCA GAA ACA CAA CAT GGA ACA ATA GTC ATT AGA GTA CAA TAT GAA GGA 1824 50 Ala Glu Thr Gln His Gly Thr He Val He Arg Val Gln Tyr Glu Gly 595 600 605 GAC GGC TCT CCA TGC AAG ATC CCT TTT GAG ATA ATG GAT CTG GAA AAA 1872 55 Asp Gly Ser Pro Cys Lys He Pro Phe Glu He Met Asp Leu Glu Lys 610 615 620 AGA CAT GTT TTG GGC CGC CTG ATC ACA GTC AAC CCA ATT GTA ACA GAA 1920 60 Arg His Val Leu Gly Arg Leu He Thr Val Asn Pro He Val Thr Glu P1036/00MX 625 630 635 640 AAG GAC AGC CCA GTC AAC ATA GAA GCA GAA CCT CCA TC GGA GAC AGC 1968 Lys Asp Ser Pro Val Asn He Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser 645 650 655 TAC ATC ATC ATA GGA GTG GAA CCA GGA CAA TTG AAG CTG GAC TGG TTC 2016 Tyr He He He Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asp Trp Phe 660 665 670 AAG AAA GGA AGT TCC ATC GGC CAA ATG TTT GAG ACA ACA ATG AGG GGA 2064 Lys Lys Gly Ser Ser He Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly 675 680 685 GCG AAA AGA ATG GCC ATT TTG GGC GAC ACA GCC TGG GAT TTT GGA TCT 2112 Ala Lys Arg Met Ala He Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser 690 695 700 CTG GGA GGA GTG TTC ACA TCA ATA GGA AAG GCT CTC CAC CAG GTT TTT 2160 Leu Gly Gly Val Phe Thr Ser He Gly Lys Ala Leu His Gln Val Phe 705 710 715 720 GGA GCA ATC TAC GGG GCT GCT TTC AGT GGG GTC TCA TGG ACT ATG AAG 2208 Gly Ala He Tyr Gly Ala Ala Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys 725 730 735 ATC CTC ATA GGA GTT ATC ATC ACA TGG ATA GGA ATG AAC TCA CGT AGC 2256 He Leu He Gly Val He He Thr Trp He Gly Met Asn Ser Arg Ser 740 745 750 ACA TCA CTG TCT GTG TCA CTG GTA TTA GTG GGA ATC GTG ACA CTG TAC 2304 Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly He Val Thr Leu Tyr 755 760 765 TTG GGA GTT ATG GTG CAG GCC GAT AGT GGT TGC GTT GTG AGC TGG AAG 2352 Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys Val Val Ser Trp Lys 770 775 780 AAC AAA GAA CTA AAA TGT GGC AGT GGA ATA TTC GTC ACA GAT AAC GTG 2400 Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly He Phe Val Thr Asp Asn Val 785 790 795 800 CAT ACA TGG ACA GAA CAA TAC AAG TTC CAA CCA GAA TCC CCT TCA AAA 2448 His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro Glu Ser Pro Ser Lys 805 810 815 CTG GCT TCA GCC ATC CAG AAA GCT CAT GAA GAG GGC ATC TGT GGA ATC 2496 Leu Ala Ser Ala He Gln Lys Ala His Glu Glu Gly He Cys Gly He 1036/00MX 820 825 830 CGC TCA GTA ACA AGA CTG GAA AAT CTT ATG TGG AAA CAA ATA ACA TCA 2544 Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp Lys Gln He Thr Ser 835 840 845 GAA TTG AAT CAT ATT CTA TCA GAA AAT GAA GTG AAA CTG ACC ATC ATG 2592 3 0 Glu Leu Asn His He Leu Ser Glu Asn Glu Val Lys Leu Thr He Met 850 855 860 ACA GGA GAC ATC AAA GGA ATC ATG CAG GTA GGA AAA CGA TCT CTG CGG 2640 3.5 Thr Gly Asp He Lys Gly He Met Gln Val Gly Lys Arg Ser Leu Arg 865 870 875 880 CCT CAA CCC ACT GAG TTG AGG TAT TCA TGG AAA ACA TGG GGT AAA GCG 2688 20 Pro Gln Pro Thr Glu Leu Arg Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala 885 890 895 AAA ATG CTC TCC ACA GAA CTC CAT AAT CAG ACC TTC CTC ATT GAT GGT 2736 2 5 Lys Met Leu Ser Thr Glu Leu His Asn Gln Thr Phe Leu He Asp Gly 900 905 910 CCC GAA ACA GCA GAA TGC CCC AAC ACA AAC AGA GCT TGG AAT TCA CTA 2784 2 0 Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu 915 920 925 GAA GTT GAG GAC TAC GGC TTT GGA GTA TTC ACT ACC AAT ATA TGG CTA 2832 :., 5 Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr Thr Asn He Trp Leu 930 935 940 AGA TTG AGA GAA AAG CAG GAT GCA TTT TGT GAC TCA AAA CTC ATG TCA 2880 40 Arg Leu Arg Glu Lys Gln Asp Ala Phe Cys Asp Ser Lys Leu Met Ser 945 950 955 960 GCG GCC ATA AAG GAC AAC AGA GCC GTC CAT GCT GAT ATG GGT TAT TGG 2928 45 Ala Ala He Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp 965 970 975 ATA GAA AGC GCA CTC AAT GAT ACA TGG AAG ATA GAG AAA GCT TCT TTC 2976 50 He Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys He Glu Lys Ala Ser Phe 980 985 990 ATT GAA GTC AAA AGT TGC CAC TGG CCA AAG TCA CAC ACT CTA TGG AGT 3024 55 He Glu Val Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser 995 1000 1005 AAT GGA GTG CTA GAA AGC GAG ATG GTA ATT CCA AAG AAT TTC GCT GGA 3072 60 Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Val He Pro Lys Asn Phe Ala Gly P1036/00MX 1010 1015 1020 CCA GTG TCA CAA CAT AAT AAC AGA CCA GGC TAT CAC ACA CAA ACA GCA 3120 Pro Val Ser Gln His Asn Asn Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln Thr Ala 1025 1030 1035 1040 GGA CCT TGG CAT CTA GGC AAG CTT GAG ATG GAC TTT GAT TTC TGC GAA 3168 Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp Phe Asp Phe Cys Glu 1045 1050 1055 GGG ACT ACA GTG GTG GTA ACC GAG GAC TGT GGA AAC AGA GGG CCC TCT 3216 Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser 1060 1065 1070 TTA AGA ACA ACC ACT GCC TCA GGA AAA CTC ATA ACG GAA TGG TGT TGT 3264 Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu He Thr Glu Trp Cys Cys 1075 1080 1085 CGA TCT TGC ACA CTA CCA CCA CTA AGA TAC AGA GGT GAG GAT GGA TGC 3312 Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Cys 1090 1095 1100 TGG TAC GGG ATG GAA ATC AGA CCA TTG AAA GAG AAA GAA GAA AAT CTG 3360 Trp Tyr Gly Met Glu He Arg Pro Leu Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu 1105 1110 1115 1120 GTC AGT TCT CTG GTC ACA GCC 3381 Val Ser Ser Leu Val Thr Ala 1125 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1127 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 : Met Asn Asn Gln Arg Lys Lys Ala Arg Asn Thr Pro Phe Asn Met Leu 1 5 10 15 Lys Arg Glu Arg Asn Arg Val Ser Thr Val Gln Gln Leu Thr Lys Arg 20 25 30 P1036/00MX Phe Ser Leu Gly Met Leu Gln Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met 35 40 45 Ala Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu Thr He Pro Pro Thr Ala Gly 50 55 60 He Leu Lys Arg Trp Gly Thr He Lys Lys Ser Lys Ala He Asn Val 65 70 75 80 Leu Arg Gly Phe Arg Lys Glu He Gly Arg Met Leu Asn He Leu Asn 85 90 95 Arg Arg Arg Arg Thr Ala Gly Met He He Met Leu He Pro Thr Val 1 0 100 105 110 Met Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met He Val 115 120 125 Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Lys Asp Gly 130 135 140 3 5 Thr Asn Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu 145 150 155 160 Asp Thr He Thr Tyr Lys Cys Pro Phe Leu Lys Gln Asn Glu Pro Glu 165 170 175 Asp He Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly 20 180 185 190 Thr Cys Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala 195 200 205 Leu Val Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp 210 215 220 25 Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg He Glu Thr Trp 225 230 235 240 He Leu Arg His Pro Gly Phe Thr He Met Ala Ala He Leu Ala Tyr 245 250 255 Thr He Gly Thr Thr His Phe Gln Arg Val Leu He Phe He Leu Leu 260 265 270 Thr Ala He Ala Pro Ser Met Thr Met Arg Cys He Gly He Ser Asn 275 280 285 Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser Gly Gly Ser Trp Val Asp He Val 290 295 300 35 Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr 305 310 315 320 Leu Asp Phe Glu Leu He Lys Thr Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu 325 330 335 Arg Lys Tyr Cys He Glu Ala Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Asp Ser 4 0 340 345 350 Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro Thr Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys 355 360 365 Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly 370 375 380 4 5 Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly He Val Thr Cys Ala Met Phe Thr 385 390 395 400 Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys He Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu 405 410 415 Tyr Thr Val Val He Thr Pro His Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly ? . O 420 425 430 Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys Glu Val Lys He Thr Pro Gln Ser 435 440 445 Ser He Thr Glu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu 450 455 460 i , 5 Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln 465 470 475 480 Met Lys Asp Lys Ala Trp Leu Val His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu 485 490 495 Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp He (. 0 500 505 510 P1036/00 X Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln 515 520 525 Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu 530 535 540 Thr Gly Ala Thr Glu He Gln Met Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr 545 550 555 560 Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly 565 570 575 Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys Glu He 580 585 590 Ala Glu Thr Gln His Gly Thr He Val He Arg Val Gln Tyr Glu Gly 595 600 605 Asp Gly Ser Pro Cys Lys He Pro Phe Glu He Met Asp Leu Glu Lys 610 615 620 Arg His Val Leu Gly Arg Leu He Thr Val Asn Pro He Val Thr Glu 625 630 635 640 Lys Asp Ser Pro Val Asn He Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser 645 650 655 Tyr He He He Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asp Trp Phe 660 665 670 Lys Lys Gly Ser Ser He Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly 675 680 685 Ala Lys Arg Met Ala He Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser 690 695 700 Leu Gly Gly Val Phe Thr Ser He Gly Lys Ala Leu His Gln Val Phe 705 710 715 720 Gly Ala He Tyr Gly Ala Ala Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys 725 730 735 He Leu He Gly Val He He Thr Trp He Gly Met Asn Ser Arg Ser 740 745 750 Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly He Val Thr Leu Tyr 755 760 765 Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys Val Val Ser Trp Lys 770 775 780 Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly He Phe Val Thr Asp Asn Val 785 790 795 800 His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro Glu Ser Pro Ser Lys 805 810 815 Leu Ala Ser Ala He Gln Lys Ala His Glu Glu Gly He Cys Gly He 820 825 830 Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp Lys Gln He Thr Ser 835 840 845 Glu Leu Asn His He Leu Ser Glu Asn Glu Val Lys Leu Thr He Met 850 855 860 Thr Gly Asp He Lys Gly He Met Gln Val Gly Lys Arg Ser Leu Arg 865 870 875 880 Pro Gln Pro Thr Glu Leu Arg Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala 885 890 895 Lys Met Leu Ser Thr Glu Leu His Asn Gln Thr Phe Leu He Asp Gly 900 905 910 Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu 915 920 925 Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr Thr Asn He Trp Leu 930 935 940 Arg Leu Arg Glu Lys Gln Asp Ala Phe Cys Asp Ser Lys Leu Met Ser 945 950 955 960 Ala Ala He Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp 965 970 975 He Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys He Glu Lys Ala Ser Phe 980 985 990 P1036 /O0MX He Glu Val Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser 995 1000 1005 Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Val He Pro Lys Asn Phe Ala Gly 1010 1015 1020 Pro Val Ser Gln His Asn Asn Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln Thr Ala 025 1030 1035 1040 Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp Phe Asp Phe Cys Glu 1045 1050 1055 Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser 1060 1065 1070 Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu He Thr Glu Trp Cys Cys 1075 1080 1085 Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Cys 1090 1095 1100 Trp Tyr Gly Met Glu He Arg Pro Leu Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu 105 1110 1115 1120 Val Ser Ser Leu Val Thr Ala 1125 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 4 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi ) DESCRI PCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 4 : Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 55 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi ) DESCRI PCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 5 : Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Ser Pro Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu 20 25 30 Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu 35 40 45 P103 6 / 00MX Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg 50 55 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 6 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 60 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi ) DESCRI PCI ÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 6 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Ser Pro Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu 20 25 30 Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu 35 40 45 Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg Gly Gly Cys Gly Gly 50 55 60 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 7 : Gly Gly Cys Gly Gly 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 8 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 59 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 8 : Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly P1036/00MX 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Leu Glu Glu Leu Leu Lys His Leu 20 25 30 Lys Glu Leu Leu Lys Gly Pro Arg Lys Gly Glu Leu Glu Glu Leu Leu 35 40 45 Lys His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly Glu Phe 50 55 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 9 : 0 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 46 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal 5 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Secuencia de Codificación (B) LOCALIZACIÓN: 27...44 (D) OTRA INFORMACIÓN: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 9 : ¡0 CTTCTAGATC TCGAGTACCC GGGACC ATG CGC TGC ATA GGA ATA TC 46 Met Arg Cys He Gly He 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal 0 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10 Met Arg Cys He Gly He Ser S 5 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: P1036/00MX (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: GCTCTAGAGT CGACTATTAT CCTTTCTTGA ACCAG 35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: Gly Lys Lys Phe Trp 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 47 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Secuencia de Codificación (B) LOCALIZACIÓN: 27...47 (D) OTRA INFORMACIÓN: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: P1036/00MX Ü9"'-' ATTCTAGATC TCGAGTACCC GGGACC ATG TTT CAT CTG ACC ACA CGC 47 Met Phe His Leu Thr Thr Arg 1 5 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple 0 (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14

1.5 Met Phe His Leu Thr Thr Arg 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 0 (A) LONGITUD: 37 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: 5 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15 TCTCTAGAGT CGACTATTAG GCCTGCACCA TAACTCC 37 :¡0 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple :¡5 (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína P103ß/00MX (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: Ala Gln Val Met Val Gly 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 78 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Secuencia de Codificación (B) LOCALIZACIÓN: 13...78 (D) OTRA INFORMACIÓN: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: AGTCCTGCAG GT ACC GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT 51 Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 ATG CGT TGC ATA GGA ATA TCA AAT AGG 78 Met Arg Cys He Gly He Ser Asn Arg 15 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Met Arg Cys P1036/00MX 1 5 10 15 He Gly He Ser Asn Arg 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19 CTATGATGAT GTAGCTGTCT CC 22 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 20 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 20 He He He Tyr Ser Asp Gly 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 72 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: P1036/00MX (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 21 : GCTCAGCTGC AGGTACCACC ACCAGAACCA CCACCACCAG AACCACCACC ACCTTTCTTG 60 AACCAGTCCA GC 72 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Lys Lys Phe 1 5 10 15 Trp Asp Leu (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23 GACACTGGTC ACCTT 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple 1O36/00MX (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24: Thr Leu Val Thr 1 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 138 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Secuencia de Codificación (B) LOCALIZACIÓN: 3...131 (D) OTRA INFORMACIÓN: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 25 : GT ACC GGC GGT GGC TCC GGC GGT GGC TCC CCC CGC ATG AAG CAG CTG 47 Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Arg Met Lys Gln Leu 1 5 10 15 GAG GAC AAG GTG GAG GAG CTG CTG TCC AAG AAC TAC CAC CTG GAG AAC 95 Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn 20 25 30 GAG GTG GCC CGC CTG AAG AAG CTG GTG GGC GAG CGC TAATAGG 138 Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg 35 40 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 26 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 43 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple P1036/00MX ( D ) TOPOLOGÍA : l ineal ( i i ) TI PO DE MOLÉCULA : prote ína (v) TI PO DE FRAGMENTO : interno ( xi ) DESCRI PCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 26 Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Arg Met Lys Gln Leu Glu 1 5 10 15 Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu 20 25 30 Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg 35 40 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 138 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 27 : TCGACCTATT AGCGCTCGCC CACCAGCTTC TTCAGGCGGG CCACCTCGTT CTCCAGGTGG 60 TAGTTCTTGG ACAGCAGCTC CTCCACCTTG TCCTCCAGCT GCTTCATGCG GGGGGAGCCA 120 CCGCCGGAGC CACCGCCG 138 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 28 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 153 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Secuencia de Codificación (B) LOCALIZACIÓN: 3...146 (D) OTRA INFORMACIÓN: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 28 : P1036/00MX GT ACC GGC GGT GGC TCC GGC GGT GGC TCC CCC CGC ATG AAG CAG CTG 47 Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Arg Met Lys Gln Leu 1 5 10 15 GAG GAC AAG GTG GAG GAG CTG CTG TCC AAG AAC TAC CAC CTG GAG AAC 95 Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn 20 25 30 GAG GTG GCC CGC CTG AAG AAG CTG GTG GGC GAG CGC GGC GGT TGC GGC 143 Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg Gly Gly Cys Gly 35 40 45 GGT TAATAGG 153 Gly (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 29 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 29 : Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Arg Met Lys Gln Leu Glu 1 5 10 15 Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu 20 25 30 Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg Gly Gly Cys Gly Gly 35 40 45 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 30 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 153 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 30 1O36/O0MX TCGACCTATT AACCGCCGCA ACCGCCGCGC TCGCCCACCA GCTTCTTCAG GCGGGCCACC 60 TCGTTCTCCA GGTGGTAGTT CTTGGACAGC AGCTCCTCCA CCTTGTCCTC CAGCTGCTTC 120 ATGCGGGGGG AGCCACCGCC GGAGCCACCG CCG 153 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 31 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 150 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Secuencia de Codificación (B) LOCALIZACIÓN: 3...143 (D) OTRA INFORMACIÓN: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 31 : GT ACC GGC GGT GGC TCC GGC GGT GGC TCC CCC GGC GAG CTG GAG GAG 47 Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Leu Glu Glu 1 5 10 15 CTG CTG AAG CAC CTG AAG GAG CTG CTG AAG GGC CCC CGC AAG GGC GAG 95 Leu Leu Lys His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly Pro Arg Lys Gly Glu 20 25 30 CTG GAG GAG CTG CTG AAG CAC CTG AAG GAG CTG CTG AAG GGC GAG TTC T 144 Leu Glu Glu Leu Leu Lys His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly Glu Phe 35 40 45 AATAGG 150 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 47 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal P1036/00MX (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32 Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Leu Glu Glu Leu 1 5 10 15 Leu Lys His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly Pro Arg Lys Gly Glu Leu 20 25 30 Glu Glu Leu Leu Lys His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly Glu Phe 35 40 45 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 150 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33: TCGACCTATT AGAACTCGCC CTTCAGCAGC TCCTTCAGGT GCTTCAGCAG CTCCTCCAGC 60 TCGCCCTTGC GGGGGCCCTT CAGCAGCTCC TTCAGGTGCT TCAGCAGCTC CTCCAGCTCG 120 CCGGGGGAGC CACCGCCGGA GCCACCGCCG 150 P1036/00MX RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención describe y reivindica vacunas que contienen, como un ingrediente activo, una forma dimérica, recombinantemente producida, secretada de una proteína de envoltura, flaviviral, truncada. Las vacunas son capaces de provocar la producción de anticuerpos neutralizadores contra los flavivirus. Las formas diméricas de la proteína de envoltura flaviviral, truncada se forman 1) al ligar directamente dos copias en tándem de 80%E de una manera de cabeza a extremidad y a una atadura flexible; 2) vía la formación de un dominio de cremallera de leucina a través de la asociación homodimérica de dos hélices de cremallera de leucina cada una fusionada al término carboxi de una molécula de 80%E; ó 3) vía la formación de un dominio de manojo de cuatro hélices, no covalentemente asociado, formado en asociación de dos porciones de hélice-vuelta-hélice cada una unida al término carboxi de una molécula 80%E. Todos los productos se expresan como una poliproteína que incluye prM y los productos de 80%E modificados se secretan a partir de células Schneider-2 de Drosophila melanogaster usando la secuencia de la señal de secreción del activador de plasminógeno de tejido humano (TpaL) . Los productos secretados se purifican en general más fácilmente que aquéllos expresados intracelularmente, facilitando la producción de la vacuna . Una modalidad de la presente invención se P1036/00MX dirige a una vacuna para la protección de un sujeto contra la infección por un virus del dengue. La vacuna contiene, como ingrediente activo, la forma dimérica de la proteína de envoltura truncada de un serotipo del virus del dengue. La E truncada, dimérica se secreta como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas. La vacuna puede contener adicionalmente porciones de las proteínas de E, diméricas, de serotipo del virus del dengue adicional, producidas de manera similar. Otra modalidad de la presente invención se dirige a métodos para utilizar la forma dimérica de la proteína de envoltura del dengue, truncada para el diagnóstico de la infección en individuos en riesgo de la enfermedad. El diagnóstico contiene, como ingrediente activo, la forma dimérica de la proteína de envoltura, truncada de un serotipo del virus del dengue. La E truncada, dimérica se secreta como una proteína recombinantemente producida a partir de células eucarióticas. El diagnóstico puede contener adicionalmente porciones de las proteínas de E diméricas, del serotipo del virus del dengue adicional producido de manera similar. P1036/00MX