MXPA04000486A

MXPA04000486A - Cadenas quimericas codificantes para proteinas inductoras de efectos contra virus.

Info

Publication number: MXPA04000486A
Application number: MXPA04000486A
Authority: MX
Inventors: Valdes Prado Iris
Original assignee: Inst De Medicina Tropical Pedr
Priority date: 2001-07-16
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2005-03-07
Also published as: JP4417712B2; US8105606B2; WO2003008571A2; EP1418180B1; CA2453300A1; CN100378123C; CU23245A1; ZA200400289B; KR20040030056A; WO2003008571A3; DE60217129D1; US20070141081A1; US7279164B2; ES2278041T3; BR0211178A; US7566457B2; US7947281B2; MY138482A; CA2453300C; DK1418180T3

Abstract

Obtencion de cadenas quimericas codificantes para proteinas que inducen en el receptor efectos contra virus, las cuales estimulan la produccion de una respuesta humoral serotipo especifica y proteccion frente a la infeccion por los virus del Dengue, evitandose los efectos de amplificacion viral serotipo inespecificos causantes de las hemorragias y complicaciones clinicas descritas en este tipo de patologia. Estas cadenas de acidos nucleicos estan compuestas por la combinacion especifica de fragmentos pertenecientes al gen de una proteina mutante con actividad deshidrogenasa de N.meningitidis y fragmentos que codifican para una region de la proteina E de la envoltura de los virus del Dengue, las cuales al insertarse en un vector de expresion, dan como resultado las proteinas quimericas con caracteristicas especificas. Las moleculas quimericas resultantes de esta invencion son aplicables a la industria farmaceutica en la obtencion de preparados vacunales y diagnosticos de alta especificidad serotipica para uso en humanos.

Description

CADENAS QUIMERICAS CODIFICANTES PARA PROTEINAS INDUCTORAS DE EFECTOS CONTRA VIRUS CAMPO DE LA TECNICA La presente invención esta relacionada con el campo de la biotecnología y la industria farmacéutica, en particular con la obtención de cadenas nucleotídicas quiméricas las cuales al ser introducidas en un vector de expresión, dan como resultado proteínas capaces de inducir respuesta humoral serotipo específica y protección frente a la infección por el virus del Dengue, nombrado en lo adelante DEN, evitándose los efectos de amplificación viral serotipo inespecíficos causantes de las hemorragias y complicaciones clínicas descritas en este tipo de patología.

TECNICA ANTERIOR El virus del Dengue (DEN), es un virus envuelto cuya membrana lipídica contiene dos de sus tres proteínas estructurales: la proteína de la envoltura y la proteína de la membrana. Esta envoltura proteica rodea a una nucleocápsida icosaédrica compuesta por la tercera de sus proteínas estructurales, la proteína de la cápsida. Este virus pertenece a la familia Flaviviridae y existen cuatro serotipos diferentes. Su transmisión al hombre se realiza a través del mosquito Aedes aegypti, que pertenece a la familia Stegomia. La enfermedad producida en el humano por este virus fue considerada como benigna y se describió como Fiebre del Dengue o Dengue Clásico (FD) hasta la aparición de una modalidad más grave y a veces letal caracterizada por fiebre hemorrágica y choque, denominada: Fiebre Hemorrágica del Dengue y Síndrome de Choque por Dengue (FHD/SCD) (Hammon WMc. New haemorragic fever in children in the Philippines and Thailand. Trans Assoc Physicians 1960; 73: 140-155). Se han realizado varios estudios epidemiológicos evidenciándose como factor de riesgo la infección secuencial por dos serotipos virales diferentes (Kourí GP, Guzmán MG, Bravo JR. Why dengue hemorrhagic fever in Cuba? 2. An integral analysis. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1987; 72: 821-823). Este fenómeno se explica por la potenciación inmunológica, la cual se basa en un aumento de la infectividad viral por incremento en la entrada del complejo virus-anticuerpo a la célula a través de los receptores Fe de la célula diana (monocitos)(Halstead SB. Pathogenesis of dengue: challenges to molecular biology. Science 1988; 239: 476-481). Se han desarrollado tecnologías basadas en la generación de vacunas vivas atenuadas pero en la actualidad existen múltiples incógnitas sobre los posibles beneficios de estas ya que pueden revertir a la virulencia, interferencia viral y recombinaciones intergenómicas. Alternativamente, se han obtenido antígenos recombinantes como posibles componentes de una vacuna por subunidades (Feighny, R., Borrous, J. and Putnak R. Dengue type-2 virus envelope protein made using recombinant baculovirus protects mice against virus challenge. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1994. 50(3). 322-328; Deubel, V., Staropoli, I., Megret, F., et al. Affinity-purified dengue-2 virus envelope glycoprotein induces neutralising antibodies and protective ¡mmunity in mice. Vaccine. 1997. 15, 1946-1954). El principal antígeno lo constituye la proteína DENe de la envoltura del virus. Dicha proteína es el mayor componente de la superficie del virión y se plantea que media la unión del virus al receptor celular (A Heinz FX, Berge R, Turna W et al. A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies. Virology. 1983; 126: 525). Esta proteína presenta homología estructural con la del virus de la encefalitis mediada por garrapatas (TBE) (Rey, F.A., Heinz, F.X., Mandl, C, et al. The envelope glycoprotein from tick borne encephalitis virus at 2 A° resolution. Nature 1995; 375: 291-298) y entre los serotipos es estructuralmente conservada. Las células de insectos constituyen uno de los sistemas utilizados para la expresión de diversos genes foráneos que emplean los baculovirus como vectores. Estos vectores se han utilizado para la expresión de diferentes combinaciones de proteínas estructurales y no estructurales del virus de la Encefalitis japonesa (JEV), del DEN-1 , del DEN-2 y del DEN-4, (Matsuura Y, Miyamoto M, Soto T et al. Characterization of japanese encephalitis virus envelope protein expressed by recombinant baculoviruses. Virology 1989; 173: 677-682; Deubel V, Bordier M, Megret F et al. Processing, secretion and ¡mmunoreactivity of carboxy terminally truncated dengue-2 envelope proteins expressed in insect cell by recombinant baculoviruses. Virology 1991 ; 180: 440- 447; Putnak R, Feighny R, Burrous J et al. Dengue 1 virus envelope glycoprotein gene expressed in recombinant baculovirus elicit virus neutralization antibodies in mice and protects them from virus challenge. Am J Trop Med Hyg 1991 ; 45: 159-167; Feighny R, Burrous J, Putnak R. Dengue type 2 virus envelope protein made using recombinant baculovirus protects mice against virus challenge. Am J Trop Med Hyg 1994; 50: 322-328). Otro sistema utilizado ha sido las células de Drosophila melanogaster con diferentes variantes de proteína E recombinante (PCT/US96/07627). A pesar de obtenerse una respuesta funcional adecuada, al utilizar las proteínas expresadas en estos sistemas, ellos implican un alto costo para el desarrollo de procesos de producción a gran escala, por lo que la expresión en levaduras ha sido una alternativa para producir proteínas recombinantes estructurales de flavivirus. Sin embargo, en el caso de la proteína DENe, expresada en Pichia pastoris (PCT/US96/07627; Sugrue R.J., Fu H., Howe J„ Chan Y. Expression of the Dengue virus structural proteins in Pichia pastoris leads to the generation of virus-like partióles. J Virol. 1997. 78, 1861-1866) los niveles de expresión son bajos, tanto de forma secretada como intracelularmente, dificultándose así el proceso de purificación. Paralelamente, se han obtenido diferentes variantes de la proteína DENe en bacterias. Una de ellas fue la porción carboxilo-terminal de la proteína E del JEV fusionada a una proteína del metabolismo del Triptofano (TrpE) de E. coli. Ésta fue reconocida por anticuerpos monoclonales (AcM) neutralizantes en técnicas de inmuno-identificación y es producida de forma intracelular en cuerpos de inclusión; sin embargo, los preparados puros de esta proteína no fueron capaces de desarrollar en los animales receptores anticuerpos (Acs) neutralizantes, ni hubo protección durante el reto viral. (Masón P.W., Zogel M.V., Semproni A.R., et al. The antigenic structure of dengue type 1 virus envelope and NS1 protein expressed in E. co!i. J Gen Virol. 1990. 71 : 2107-2114). Adicionalmente, se desarrolló otra construcción (Srivastava A.K., Morita K., Matsuo S., et al. Japanese encephalitis virus fusión protein with protein A expressed in E. coli confers protection in mice. Microbiol Immunol. 1991. 35: 863-870), que contiene la proteína A de Staphylococus aurios fusionada al fragmento carboxilo-terminal de la proteína E, seguida del segmento amino-terminal de la proteína no estructural del JEV, la NS1. En este caso la proteína de fusión fue producida de forma soluble facilitando su purificación por cromatografía de afinidad. Al inmunizar ratones con esta proteína pura se desarrollaron altos títulos de anticuerpos neutralizantes e inhibidores de la hemaglutinación, y se logró protección ante el reto viral con el JEV. Resultados similares se obtuvieron empleando la región de la proteína DENe del DEN-2 fusionada a la proteína A de S. áureos (Srivastava A. K., Putnak R. J., Warren R. L, Hoke C. H. Mice immunized with a dengue type 2 virus E and NS1 fusión protein made in Escherichia coli are protected against lethal dengue virus infection. Vaccine.1995. 13: 1251-1258), sin embargo, no es posible utilizar estas preparaciones en humanos debido a la presencia de la proteína A, la cual se ha demostrado que tiene una gran afinidad por la ¡nmunoglobulina G humana.

Finalmente, se ha reportado la obtención de una proteína de fusión que comprende el Dominio B de la proteína DENe del DEN-2 y la proteína de unión a maltosa (MBP) de E. coli (Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G. Evaluation of the protective efficacy of a recombínant dengue envelope B domaín fusión protein against dengue 2 virus infection in mice. Am J Trop Med Hyg. 1998. 58: 655-662) llamada MBP-DomB. Esta variante proteica fue inmunogénica en ratones e indujo Acs neutralizantes. En nuestro caso, el objeto de esta invención trata sobre la obtención de secuencias quiméricas, como por ejemplo la primera de ellas formada por la secuencia que codifica para una región de la proteína DENe unida a la secuencia que codifica para el fragmento N-terminal de una proteína mutante con actividad deshidrogenase (MDH) de N.meningitidis, la segunda, por la secuencia que codifica para la región la proteína DENe, unida al gen completo de la proteína MDH en dos posiciones diferentes y la tercera de las secuencias quiméricas esta formada por dos fragmentos de la proteína DENe de dos serotipos virales diferentes fusionados en el mismo gen de la proteína MDH. Estas cadenas quiméricas al ser insertadas cada una en un vector apropiado, dan como resultado proteínas quiméricas obtenidas de forma insoluble en el citoplasma de la bacteria capaces de provocar una alta respuesta de anticuerpos neutralizantes contra DEN, inhibidores de la hemaglutinación viral y de proteger frente al reto viral en ratones inmunizados con dichas proteínas recombinantes. Teniendo en cuenta la insolubilidad de dichas proteínas, se logró un proceso de plegamiento in vitro fácilmente escalable así como los procesos de expresión y purificación, superando a los utilizados por Simmons et al, 1998. Por otra parte, se demuestra la especificidad serotípica de los anticuerpos, generados por la inmunización con dichas proteínas en ratones, al nivel de neutralización, inhibición de la hemaglutinación y ELISA, empleándose dosis más bajas que las reportadas por Simmons et al, 1998. Este constituye el primer reporte de proteínas insolubles en E. coli conteniendo regiones de la proteína DENe del virus dengue capaces de generar una respuesta inmune funcional. Adicionalmente, teniendo en cuenta los resultados obtenidos con la variante dimérica, es posible generar con una misma molécula anticuerpos serotipo específicos para dos serotipos de virus diferentes capaces de neutralizar la infectividad viral y proteger frente al reto con DEN en ratones. En cuanto a la proteína MDH, se ha realizado una búsqueda de homología con otras secuencias de la base de datos del EMBL y reveló que los primeros 10 aminoácidos son altamente similares a la región del dominio de unión al ácido lipóico y al brazo flexible de la dihidrolipoamida acetiltransferasa (enzima E2 de los complejos piruvato dehidrogenasa y a-cetoglutarato dehidrogenasa), y el resto de la proteína era altamente similar a la lipoamida dehidrogenasa (LPDH), enzima E3 de dichos complejos (Stephens, P. E; H. M. Darlinson, y J. R. Guest., 983. The Pyruvate. Se encontró además que en los enfermos de cirrosis biliar primaria se generaban autoanticuerpos antimitocondriales, específicos contra el sitio de unión al ácido lipóico, común entre estas proteínas (Gershwin ME, Mackay IR, Sturgess A, Coppel RL. Identification and specificity of a cDNA encoding the 70 KDa mitochondrial antigen recognized ¡n primary biliary cirrhosis. J Immunol 1987;138:3525-31). Por lo tanto, mutamos esta región de la proteína, previendo que al ser utilizada la misma como parte de nuestros antígenos vacunales quiméricos, esta pudiera generar reacciones autoinmunes. La proteína muíante MDH utilizada en nuesíra invención, ha sido utilizada en ensayos clínicos de fase I en humanos demostrándose la ausencia de reactogenicidad y por consiguiente su factibilidad de uso, además de no ser reconocida por el suero de enfermos con cirrosis biliar primaria (Pérez, A., F. Dickinson, Z. Cinza, A. Ruíz, T. Serrano, J. Sosa, S. González, Y. Gutiérrez, C. Nazábal, O. Gutiérrez, D. Guzmán, M. Díaz, M. Delgado, E. Caballero, G. Sardiñas, A. Alvarez, A. Martín, G. Guillén, R. Silva. Safety and preliminary immunogenicity of the recombinant outer membrane protein of Neissería meningitidis in human volunteers. Vaccine (enviada). Sin embargo la posibilidad del uso de la mencionada proteína MBP en humanos no ha sido demostrada. (Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J., Hayes C.G. Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengue envelope B domain fusión protein against dengue 2 virus infection in mice. Am J Trop Med Hyg. 1998. 58: 655-662).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En esta invención se describe la obtención de cadenas nucleotídica quiméricas las cuales al ser introducidas en un vector de expresión, dan como resultado proteínas quiméricas capaces de inducir una respuesta humoral serotipo específica y protección frente a la infección por el virus del Dengue, como por ejemplo la primera de estas cadenas esta formada por una secuencia que codifica para un fragmento de la proteína E (DENe) de cada uno de los serotipos virales de Dengue (DEN), unida a la secuencia que codifica para el N-terminal de una proteína muíante con actividad deshidrogenasa (MDH) de N.meningltidis, en una segunda cadena quimérica la secuencia que codifica para el fragmento de la proteína DENe de cada serotipo viral, se fusionó al gen completo de la proteína MDH en dos posiciones diferentes: en un sitio dentro de una secuencia que codifica para un dominio estructural de la proteína MDH (el dominio de unión a ácido lipoico y en el extremo 3' del gen), y en la tercera cadena quimérica se insertan las secuencias correspondientes a fragmentos de la proteína DENe de dos serotipos de virus diferentes, el DEN-2 y el DEN-4, en dos posiciones diferentes del gen MDH: en un sitio dentro de la secuencia que codifica para el dominio de unión a ácido lipoico (el serotipo 4) y en el extremo 3' del gen (el serotipo 2), la nombramos dimérica. Las proteínas quiméricas se obtuvieron de forma insoluble en el citoplasma de la bacteria. Se desarrolló un proceso de purificación fácilmente escalable por cromatografía de quelatos metálicos (IMAC) que permitió la obtención de las proteínas puras para el estudio de inmunogenicidad. Al analizar los resultados de antigenicidad se demostró un fuerte reconocimiento de todas las proteínas quiméricas recombinantes por los líquidos ascíticos hiperinmunes (LAHI) anti-DEN, siendo mayor los obtenidos en los casos de fusión al gen completo de la MDH, lo cual evidencia un efecto positivo en la conformación de la región proveniente de la proteína DENe dado por la MDH. En los casos donde se utilizó el serotipo 2, todas las proteínas recombinantes obtenidas son reconocidas por un anticuerpo neutralizante serotipo-específico (3H5), siendo también mayor en los casos de fusión al gen completo de la MDH, así como en la dimérica. Se observó además, que el reconocimiento por los líquidos ascíticos hiperinmunes (LAHI) del serotipo homólogo en cada caso superaba ostensiblemente el reconocimiento por los LAHI de serotipos heterólogos, demostrándose la exposición de epitopos serotipo específicos y permitiendo así su uso como diagnóstico de dengue y serotipaje. Al inmunizar con todas las proteínas quiméricas recombinantes se obtuvo respuesta neutralizante y protectora en ratones. Los mayores títulos neutralizantes se obtuvieron con las secuencias fusionadas al gen completo de la MDH y con la dimérica, independientemente de la posición del fragmento perteneciente la proteína DENe. Esto demostró un efecto potenciador de la respuesta inmune mediado por la MDH que puede ser explicado por la influencia en el plegamiento del fragmento de la proteína DENe reflejado en los resultados de antigenicidad. Se demostró además por primera vez, y contrario a lo descrito en el arte previo, que la insolubilidad de estas proteínas no influye en la capacidad de generar una adecuada respuesta inmune. La respuesta inmune generada en todos los casos fue serotipo específica (anticuerpos contra el serotipo homólogo inmunizado), en la neutralización viral, la inhibición de la hemaglutinación y ELISA. La generación de anticuerpos serotipo-específicos implica que no sean capaces de reconocer a determinantes antigénicos, provenientes de virus de serotipos heterólogos, que favorezcan el fenómeno de inmunopotenciación. Esta característica es de gran importancia para un candidato vacunal contra el Dengue ya que el reconocimiento de anticuerpos a serotipos heterólogos puede ser una de las causas del Dengue Hemorrágico (DHF). Se demostró además, la inducción de anticuerpos contra dos serotipos virales después de la inmunización con una sola de las proteínas quiméricas, lo cual posibilita la formulación de una vacuna contra los cuatro serotipos, utilizando sólo dos de nuestras proteínas quiméricas recombinantes. La obtención de la proteína muíante MDH, consistió en la eliminación del sitio de unión al ácido lipóico en la secuencia ETDKAT, que consiste en la unión covalente de este ácido graso con los grupos amino-epsilon de la lisina (K) (Tuaillon N, Andre C, Briand JP et al. A lipoyl synthetic octadecapeptide of dihydrolipoamide acetyltransferase specifically recognized by anti-M2 autoantibodies in Primary Biliary Cirrhosis. J Immunol 1992; 148:445-50). La mutagénesis se realizó empleando la técnica de PCR, utilizándose dos pares de cebadores para amplificar la región N-terminal (desde el inicio del gen IpdA hasta el sitio de unión a ácido lipóico, 135 pb) y el C-terminal de la proteína (a partir del sitio de unión a ácido lipóico y hasta el extremo 3' del gen), quedando eliminada la posibilidad de generar reacciones autoinmunes, como se demostró en los estudios clínicos en humanos.

Depósito de material biológico Los plásmidos PLL1 , PLL2, PLL3, PLH1 , PLH2, PLH3, PAZ1 , PAZ2, PAZ3, PID1 , PID2 y PID3 fueron depositados según el Tratado de Budapest en el Belgian Coordinated collection of Microorganism - BCCM™ , LMBP-COLLECTION, con fecha y bajo los números de acceso pendientes respectivamente BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Estrategia de clonación del fragmento de E2 para la obtención de PLL1. DENe2: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-2. N-term: Secuencia nucleotídica que codifica para la región de los primeros 45 aminoácidos de la MDH. Figura 2. Estrategia de clonación del fragmento de E2 para la obtención de PLL2. DENe2: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-2. MDH: muíante de deshidrogenasa.

Figura 3. Estrategia de clonación del fragmento de E2 para la obtención de PLL3. DENe2: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-2. MDH: muíante de deshidrogenasa. Figura 4 Estrategia de clonación del fragmento de E1 para la obtención de PLH1. DENel : Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-1. N-term: Secuencia nucleotídica que codifica para la región de los primeros 45 aminoácidos de la MDH. Figura 5. Estrategia de clonación del fragmento de E1 para la obtención de PLH2. DENel : Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-1. MDH: mutante de deshidrogenasa. Figura 6. Estrategia de clonación del fragmento de E1 para la obtención de PLH3. DENel : Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-1. MDH: mutante de deshidrogenasa. Figura 7. Estrategia de clonación del fragmento de E3 para la obtención de PAZ1. DENe3: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-3. N-term: Secuencia nucleotídica que codifica para la región de los primeros 45 aminoácidos de la MDH Figura 8. Estrategia de clonación del fragmento de E3 para la obtención de PAZ2. DENe3: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-3. MDH: mutante de deshidrogenasa. Figura 9. Estrategia de clonación del fragmento de E3 para la obtención de PAZ3. DENe3: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-3. MDH: mutante de deshidrogenasa.

Figura 10. Estrategia de clonación del fragmento de E4 para la obtención de PID1. DENe4: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-4. N-term: Secuencia nucleotídica que codifica para la región de los primeros 45 aminoácidos de la MDH Figura 11. Estrategia de clonación del fragmento de E4 para la obtención de PID2. DENe4: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-4. MDH: muíante de deshidrogenase. Figura 12. Estrategia de donación del fragmento de E4 para la obtención de PID3. DENe4: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-4. MDH: muíante de deshidrogenasa. Figura 13. Estrategia de clonación para la obtención de PD4D2. DENe4: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-4. DENe4: Fragmento de la proteína de la envoltura del DEN-4. MDH: muíante de deshidrogenasa.

EJEMPLOS DE REALIZACION EJEMPLO 1 Obtención de PLL1 La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-2 (Sec. Id. No. 22) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.1 y Secuencia No.2 a partir de la cepa viral de DEN-2 genotipo Jamaica (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative analysis of the full-length genome.Virology 1988.165:234-244) El vector se generó por digestión Xba l/Bam Hl del plasmidio PM108 His, el cual contiene la secuencia nucleotídica que codifica para la región N-terminal de la MDH y para una secuencia de 6 histidinas (Secuencia No.23). Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W31 10 (Hill C.W., Harnish B.W. 1982. Transposition of a chromosomal segment bounded by redundant rRNA genes in Escheríchia coli. J Bacteriology. 149:449-457) se transformaron con el clon seleccionado llamado pLL1 (Fig.1 y Secuencia No.24). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido Louria Bertani (LB), se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 25 kDa correspondiente al 10 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la región N-terminal de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-2. Esta banda fue reconocida con anticuerpos policlonales (AcP) anti-DEN-2 contenidos en un líquido ascítíco hiperinmune (LAHI). La proteína se denominó PLL1 (Secuencia No.25).

EJEMPLO 2 Purificación de la proteína PLL1 La biomasa obtenida de la cepa transformada con pLL1 y crecida a 37 °C se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo mayoritariamente de forma insoluble asociada al precipitado de ruptura celular. A partir del precipitado, se realizó una extracción con urea 6 M y el sobrenadante, conteniendo la proteína PLL1 , se aplicó en una columna de G-25 para eliminar el agente caotrópico. La fracción obtenida se aplicó en una columna de Quelating sepharose FF (Pharmacia, UK), en presencia de iones Cu++. La elución se realizó con Imidazol 50 mM y el volumen obtenido se aplicó en una columna de G-25 para obtener la proteína en el tampón de formulación NaCI 100 mM, KCI2 2 mM, Na2HP04 10 mM, pH 7.2, KH2P04 1 mM (PBS). Esta preparación se utilizó para los estudios inmunológicos.

EJEMPLO 3 Caracterización antigénica de PLL1 La fracción purificada de PLL1 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos así como por sueros humanos positivos a Dengue (cuadro 1 ).

CUADRO 1 Reactividad de la proteína PLL1 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales Acs** Especificidad*** PLL1* LAHI DEN-1 + L.AHI DEN-2 ++ LAHI DEN-3 - LAHI DEN-4 - LAHI EEE - LAHI YFV - LAHI SLV - AcM 3H5 NT + * Se aplicaron 10 ig de las proteínas purificada PLL1. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta ++.

** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000. *** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San Luis. NT: Neutralizante serotipo específico. Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el líquido ascítico hiperinmune anti-DEN-2. Este resultado es coincidente con el hecho de que la región clonada pertenece al serotipo 2. El reconocimiento por LAHI contra los otros serotipos fue menor, en orden decreciente: DEN-1 y DEN- 3 y por último DEN-4 que fue prácticamente imperceptible. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavlvirus como Fiebre Amarilla y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Por otra parte, también se observó reactividad con el monoclonal 3H5. Dicho reconocimiento por Western blotting fue dependiente de puente disulfuro ya que al reducir la muestra se perdía la señal. Por último se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto título y tres de bajo título a DEN-2, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting.

EJEMPLO 4 Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PLL1 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 35 ug i.p de la preparación purificada de PLL1 utilizando el adyuvante de Freud. Una parte de estos animales (10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-2 mientras que, frente al resto de los serotipos, no se obtuvo reactividad alguna (cuadro 2 y cuadro 5). Paralelamente se realizó el ensayo de Inhibición de la hemaglutinación (IHA) obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-2 (cuadro 3 y cuadro 5). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro evidenciándose títulos neutralizantes (1 :320) contra DEN-2 mientras que contra el resto de los serotipos no existió neutralización de la infectividad viral (cuadro 4 y cuadro 5). Estos resultados indican la gran serotipo-especificidad de los anticuerpos generados por PLL1.

CUADRO 2 Títulos de anticuerpos contra DEN-2 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PLL1 CUADRO 3 Títulos por IHA de los suéros de los animales inmunizados con la proteína PLL1 *Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.

CUADRO 4 Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PLL1 * Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

CUADRO 5 Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PLL1 Mezclas de IHA**anti-DEN-1 IHA anti-DEN-2 IHA anti-DEN-3 IHA anti-DEN-4 sueros * PLL1 < 1/ 5 >1/ 320 < 1/5 < 1/5 Mezclas de Títulos Títulos Títulos Títulos sueros* neutralizantes*** neutralizantes neutralizantes neutralizantes anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 1 (PLL1 ) < 1 : 5 1 : 320 < 1 : 5 < 1 : 5 2 (PLL1 ) < 1 : 5 1 : 160 < 1 : 5 < 1 : 5 * Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros. ** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales. *** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

EJEMPLO 5 Obtención de PLL2 La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-2 (Secuencia No.22), se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.1 y Secuencia No.3 a partir de la cepa viral de DEN-2 genotipo Jamaica (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative analysis of the full-length genome.Virology 988.165:234-244). El vector se generó por digestión Xba ¡/Eco Rl del plasmidio PM84 His, que contiene la secuencia nucleotídica de la MDH más la codificante para una cola de 6 histidinas (Secuencia No.26). Esta digestión permite la inserción del fragmento amplificado por PCR dentro de la región codificante para un dominio estructural de la MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes MM294 (Hanahan D. 1983. Studies on transformation of Escheríchia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166:557-580) se transformaron con el clon seleccionado llamado pLL2 (Fig. 2 y Secuencia No. 27). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 10% de las proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la talla de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-2. Esta banda fue reconocida por un LAHI anti-DEN2 y se denominó PLL2 (Secuencia No.28).

EJEMPLO 6 Purificación de la proteína PLL2 La biomasa obtenida de la cepa transformada con pLL2 y crecida a 37 °C se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo de forma insoluble. A partir de la fracción soluble se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz utilizada fue Quelatíng Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 15 mM y luego la elución se realizó con imidazol 100 mM. Por otra parte, la fracción insoluble de la proteína recombinante se extrajo con urea 8 M. Posteriormente se eliminó el agente caotrópico con una columna de G-25 y el eluato se aplicó en una columna de Quelating Sepharose FF (Pharmacia, UK) en presencia de iones Cu++. La elución se llevó a cabo con Imidazol 100 mM. Finalmente, la preparación pura de las dos proteínas, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerlas en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos.

EJEMPLO 7 Caracterización antigénica de PLL2 La fracción purificada de PLL2 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (cuadro 6). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-2. El reconocimiento por LAHI contra los otros serotipos fue menor, en orden decreciente: DEN-1 y DEN-3 y por último DEN-4, que fue prácticamente imperceptible. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Sin embargo, al analizar el reconocimiento por el monoclonal 3H5, se observó una gran reactividad (mayor que la obtenida con PLL1) tanto por Dot blotting como por Western blotting. Contrariamente a lo obtenido con PLL1 , el reconocimiento del monoclonal se mantiene aún en presencia de agentes reductores en la muestra, lo cual indica una diferencia conformacional entre ambas proteínas. Finalmente se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto título y tres de bajo título a DEN-2, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting .

CUADRO 6 Reactividad de la proteína PLL2 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales Acs** Especificidad*** PLL2 sol, ins* LAHI DEN-1 +÷ LAHI DEN-2 +++ LAHI DEN-3 - LAHI DEN-4 - LAHI EEE _ LAHI YFV - LAHI SLV - AcM 3H5 NT +++ * Se aplicaron 10 µg de la proteína purificada PLL2 soluble e insoluble (sol, ins).

La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++. ** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000. *** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.

EJEMPLO 8 Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PLL2 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PLL2 tanto soluble como insoluble, utilizando el Adyuvante de Freud. Una parte de los animales (10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-2 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obtuvo reactividad alguna (cuadro 7 y cuadro 10). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-2 (cuadro 8 y cuadro 10). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro alcanzándose títulos de 1/1280 contra DEN-2. Similar a lo obtenido con PLL1 , no se obtuvieron títulos neutralizantes contra el resto de los serotipos (cuadro 9 y cuadro 10). Los resultados de ambas variantes de PLL2 fueron similares, indicando que no influye el estado de solubilidad de la proteína en la capacidad de inducir anticuerpos funcionales.

CUADRO 7 Títulos de anticuerpos contra DEN-2 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PLL2 soluble e insoluble Acs Especificidad*** PLL2 sol, ins* LAHI DEN- ++ LAHI DEN-2 +++ LAHI DEN-3 LAHI DEN-4 LAHI EEE LAHI YFV LAHI SLV AcM 3H5 NT +++ CUADRO 8 Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PLL2 soluble e insoluble *l_os títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales. CUADRO 9 Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PLL2 soluble e insoluble * Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

CUADRO 10 Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA v neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PLL2 soluble e insoluble * Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros. ** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales. *** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas vírales.

EJEMPLO 9 Obtención de pLL3 La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-2 (Secuencia No.22) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.4 y Secuencia No.5 a partir de la cepa viral de DEN-2 genotipo Jamaica (Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative analysis of the full-length genome.Virology 1988.165:234-244). El vector se generó por digestión Bam Hl/Bam Hl del plasmidio pD4, el cual contiene el gen de la MDH con una secuencia de 6 histidinas sin codón de parada (Secuencia No.9). Esto permite la fusión de la secuencia del fragmento de la proteína de la envoltura de DEN a la secuencia del C-terminal de MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W31 0 se transformaron con el clon seleccionado llamado pLL3 (fig. 3 y Secuencia No.10). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 20 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-2. Esta banda fue reconocida con anticuerpos AcP anti-DEN-2 contenidos en un LAHI. La proteína se denominó PLL3 (Secuencia No.11).

EJEMPLO 10 Purificación de la proteína PLL3 La biomasa obtenida de la cepa transformada con pLL3 y crecida a 37 °C se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción ¡nsoluble, la proteína recombinante se extrajo con Urea 6M y luego se realizó una cambio de tampón por G-25. A partir de la muestra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz utilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 30 mM y luego la elución se realizó con imidazol 250 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos.

EJEMPLO 11 Caracterización antiqénica de PLL3 La fracción purificada de PLL3 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (cuadro 11). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-2. El reconocimiento por LAHI contra los otros serotipos fue menor, en orden decreciente: DEN-1 y DEN-3 y por último DEN-4, que fue prácticamente imperceptible. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Sin embargo, al analizar el reconocimiento por el monodonal 3H5, se observó una gran reactividad (similar a la obtenida con PLL2) tanto por Dot blotting como por Western blotting. Contrariamente a lo obtenido con PLL1 , el reconocimiento del monodonal se mantiene aún en presencia de agentes reductores en la muestra, lo cual indica una diferencia conformacional entre ambas proteínas. Finalmente se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto título y tres de bajo título a DEN-2, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting . Estos resultados fueron similares a los obtenidos con PLL2.

CUADRO 11 Reactividad de la proteína PLL3 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales Acs** Especificidad** * PLL3* LAHI DEN-1 ++ LAHI DEN-2 +++ LAHI DEN-3 - LAHI DEN-4 - LAHI EEE - LAHI YFV - LAHI SLV - AcM 3H5 NT +++ * Se aplicaron 10 µg de la proteína purificada PLL3. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.

** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 : 000. *** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.

EJEMPLO 12 Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PLL3 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PLL3 utilizando el Adyuvante de Freund. Una parte de los animales (10 ratones), se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-2 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obtuvo reactividad alguna (cuadro 12 y cuadro 15). Paralelamente se realizó el ensayo de Inhibición de la hemaglutinación obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-2 (cuadro 13 y cuadro 15). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro alcanzándose títulos de hasta 1/1280 contra DEN-2 (cuadro 14). No se obtuvieron títulos neutralizantes contra el resto de los serotipos (cuadro 15). En las tres técnicas ensayadas se observó una gran especificidad de serotipo en los anticuerpos generados similar a la obtenida con la inmunización con PLL2.

CUADRO 12 Títulos de anticuerpos contra DEN-2 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PLL3 CUADRO 13 Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PLL3 *Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales CUADRO 14 Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PLL3.

* Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

CUADRO 15 Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PLL3 Mezclas de IHA**ant¡-DEN-1 IHA ant¡-DEN-2 IHA ant¡-DEN-3 IHA anti-DEN-4 sueros * PLL3 < 1/ 5 >1/ 320 < 1/ 5 < 1/ 5 Mezclas de Títulos Títulos Títulos Títulos sueros* neutralizantes*** neutralizantes neutralizantes neutralizantes anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 KPLL3) < 1 : 5 >1 : 1280 < 1 : 5 < 1 : 5 2(PLL3) < 1 : 5 >1 : 1280 < 1 : 5 < 1 : 5 * Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros.

** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.

*** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

EJEMPLO 13 Obtención de pLH1 La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-1 (Secuencia No.32) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.6 y Secuencia No.7 a partir de la cepa viral de DEN-1 (Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.Genetic relatedness among structual protein genes of dengue 1 virus strains.J. Gen. Virol.1989. 70:1701-1712).

El vector se generó por digestión Xba l/Bam Hl del plasmidio PM108 His, el cual contiene la secuencia nucleotídica que codifica para la región N-terminal de la MDH y para una secuencia de 6 histidinas (Secuencia No.23). Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W31 10 se transformaron con el clon seleccionado llamado pLH1 (Fig. 4 y Secuencia No.33). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 25 kDa correspondiente al 10 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la región N-terminal de la DH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-1. Esta banda fue reconocida con AcP anti-DEN-1 contenidos en un LAHI. La proteína se denominó PLH1 (Secuencia No.34).

EJEMPLO 1 Purificación de la proteína PLH1 La biomasa obtenida de la cepa transformada con pLH1 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo mayoritariamente de forma insoluble asociada al precipitado de ruptura celular. A partir del precipitado, se realizó una extracción con urea 7 M y el sobrenadante, conteniendo la proteína PLL1 , se aplicó en una columna de G-25 para eliminar el agente caotrópico. La fracción obtenida se aplicó en una columna de Quelating sepharose FF (Pharmacia, UK), en presencia de iones Cu++y equilibrada con Tris 10 mM pH 8.0. La elución se realizó con Imidazol 60 mM y el volumen obtenido se aplicó en una columna de G-25 para obtener la proteína en el tampón de formulación (PBS). Esta preparación se utilizó para los estudios inmunológicos.

EJEMPLO 15 Caracterización anti énica de PLH1 Las fracción purificada de PLH1 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos así como por sueros humanos positivos a Dengue (cuadro 16). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el líquido ascítico hiperinmune anti-DEN-1. El reconocimiento por LAHI contra los otros serotipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Por último se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto título y tres de bajo título a DEN-1 , obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting .

Cuadro 16 Reactividad de la proteína PLH1 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales Acs** Especificidad*** PLH1 LAHI DEN-1 ++ LAHI DEN-2 + LAHI DEN-3 - LAHI DEN-4 - LAHI EEE - LAHI YFV - LAHI SLV - AcM 3H5 NT - * Se aplicaron 10 µ? de la proteína purificada PLH1. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.

** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000. *** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.

EJEMPLO 16 Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PLH1 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 35 ug i.p de la preparación purificada de PLH1 utilizando el Adyuvante de Freund. Una parte de estos animales (10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-1 mientras que, frente al resto de los serotipos, no se obtuvo reactividad alguna (cuadro 17 y cuadro 20). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-1 (cuadro 18 y cuadro 20). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización ¡n vitro evidenciándose títulos neutralizantes (1 :320) contra DEN-1 mientras que contra el resto de los serotipos no existió neutralización de la infectividad viral (cuadro 19 y cuadro 20). Estos resultados indican la gran serotipo-especificidad de los anticuerpos generados por PLH1.

CUADRO 17 Títulos de anticuerpos contra DEN-1 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PLL1 CUADRO 18 Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PLH1.

*Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.

CUADRO 19 Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PLH1 * Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

CUADRO 20 Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PLH1.

Mezclas de IHA**anti-DEN-1 IHA anti-DEN-2 IHA anti-DEN-3 IHA antí-DEN-4 sueros * PLH1 >1 : 320 < 1/ 5 < 1/ 5 < 1/ 5 Mezclas de Títulos Títulos Títulos Títulos sueros* neutralizantes*** neutralizantes neutralizantes neutralizantes anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 K PLH1 ) 1 : 160 < 1 : 5 < 1 : 5 < 1 : 5 2(PLH1 ) 1 : 320 < 1: 5 < 1 : 5 < 1 : 5 * Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros.

** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales. *** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

EJEMPLO 17 Obtención de pLH2 La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína déla envoltura del virus DEN-1 (Secuencia No.12) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.6 y Secuencia No.8 a partir de la cepa viral de DEN-1 (Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.Genetic relatedness among structual protein genes of dengue 1 virus strains.J. Gen. Virol.1989. 70:1701-1712). El vector se generó por digestión Xba l/Eco Rl del plasmidio PM84 His , que contiene la secuencia nucleotídica de la MDH más la codificante para una cola de 6 histidinas (Secuencia No.26) . Esta digestión permite la inserción del fragmento amplificado por PCR dentro de la región codificante para un dominio estructural de la MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes MM294 se transformaron con el clon seleccionado llamado pLH2 (Fig. 5 y Secuencia No.35). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 10% de las proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la talla de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-1. Esta banda fue reconocida por un LAHI anti-DEN-1 y se denominó PLH2 (Secuencia No.36).

EJEMPLO 18 Purificación de la proteína PLH2 La biomasa obtenida de la cepa transformada con pLH2 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la proteína se extrajo con Urea 7M y luego se realizó una cambio de tampón por G-25. A partir de la muestra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz utilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 40 mM y luego la elución se realizó con imidazol 200 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos.

EJEMPLO 19 Caracterización antiqénica de PLH2 La fracción purificada de PLH2 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (cuadro 21 ). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-1 (mayor que la obtenida con PLH1 ). El reconocimiento por LAHI contra los otros serotipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Finalmente se analizó la reactividad frente a cinco sueros humanos de alto título y tres de bajo título - a DEN-1 , obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting .

CUADRO 21 Reactividad de la proteína PLH2 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales. Acs** Especificidad*** PLH2 LAHI DEN-1 +++ LAHI DEN-2 + LAHI DEN-3 - LAHI DEN-4 - LAHI EEE - LAHI YFV - LAHI SLV - AcM 3H5 NT - * Se aplicaron 10 µ9 de la proteína purificada PLH2. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.

EJEMPLO 20 Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PLH2 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PLH2, utilizando el adyuvante de Freund. Una parte de los animales (10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-1 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obtuvo reactividad alguna (cuadro 22 y cuadro 25). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-1 (cuadro 23 y cuadro 25). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización ¡n vitro alcanzándose títulos de 1/1280 contra DEN-1 (cuadro 24). No se obtuvieron títulos neutralizantes contra el resto de los serotipos (cuadro 25).

CUADRO 22 Títulos de anticuerpos contra DEN-1 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PLH2 CUADRO 23 Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PLH2 *Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.

CUADRO 24 Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PLH2 * Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

CUADRO 25 Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PLH2.

Mezcla de ELISA (anti- ELISA (anti ELISA(anti- ELISA(anti- sueros* DEN-1) DEN-2) DEN-3) DEN- 4) 1 (PLH2) 1 : 64 000 < 1/100 < 1/100 < 1/100 2 (PLH2) > 1 : 128 000 < 1/100 < 1/100 < 1/100 Mezcla de IHA**anti-DEN- IHA anti-DEN-2 IHA anti-DEN-3 IHA anti-DEN-4 sueros * 1 PLH2 >1/ 320 < 1/ 5 < 1/ 5 < 1/ 5 Mezcla de Títulos Títulos Títulos Títulos sueros* neutralizantes** neutralizantes neutralizantes neutralizantes * anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 1 (PLH2) >1 : 1280 < 1 : 5 < 1 : 5 < 1 : 5 2(PLH2) >1 : 1280 < 1 : 5 < 1 : 5 < 1 : 5 * Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros. ** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales. *** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

EJEMPLO 21 Obtención de pLH3 La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286. al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-1 (Secuencia No.32) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.9 y Secuencia No.10 a partir de la cepa viral de DEN-1 (Chu M.C., O'Rourke E.J., Trent D.W.Genetic relatedness among structual protein genes of dengue 1 virus strains.J. Gen. Virol.1989. 70:1701-1712). El vector se generó por digestión Bam Hl/Bam Hl del plasmidio pD4, el cual contiene el gen de la MDH con una secuencia de 6 histidinas sin codón de parada (Secuencia No.29). Esto permite la fusión de la secuencia del fragmento de la E al extremo 3'del del gen de la MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W3110 se transformaron con el clon seleccionado llamado pLH3 (Fig. 6 y Secuencia No.37). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 20 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-2. Esta banda fue reconocida con AcP anti-DEN-1 contenidos en un LAHI. La proteína se denominó PLH3 (Secuencia No.38).

EJEMPLO 22 Purificación de la proteína PLH3 La biomasa obtenida de la cepa transformada con pLH3 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción ¡nsoluble, la proteína recombinante se extrajo con Urea 6M y luego se realizó una cambio de tampón por G-25. A partir de la muestra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz utilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 30 mM y luego la elución se realizó con imidazol 250 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos.

EJEMPLO 23 Caracterización antiqénica de PLH3 La fracción purificada de PLH3 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (cuadro 26). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-1 mientras que el reconocimiento con LAHI contra los otros serotipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Finalmente se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto título y tres de bajo título a DEN-1 , obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Dot blotting y Western blotting .

CUADRO 26 Reactividad de la proteína PLH3 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales Acs Especificidad*** PLH3 LAHI DEN-1 +++ LAHI DEN-2 + LAHI DEN-3 LAHI DEN-4 LAHI EEE LAHI YFV LAHI SLV AcM 3H5 NT * Se aplicaron 10 µ9 de la proteína purificada PLH3. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.

** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclona! 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000. *** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.

EJEMPLO 24 Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PLH3 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PLH3 utilizando el Adyuvante de Freund. Una parte de los animales (10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-1 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obtuvo reactividad alguna (cuadro 27 y cuadro 30). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-1 (cuadro 28 y cuadro 30). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización ¡n vitro alcanzándose títulos de 1/1280 contra DEN-1 (cuadro 29). No se obtuvieron títulos neutralizantes contra el resto de los serotipos (cuadro 30).

CUADRO 27 Títulos de anticuerpos contra DEN-1 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PLH3 CUADRO 28 Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PLH3 *Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales CUADRO 29 Ensayo de neutralización viral con los sueros de ios animales inmunizados con PLH3 * Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

CUADRO 30 Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PLH3 Mezclas de ELISA (anti- ELISA (anti ELISA (anti- ELISA (anti-sueros* DEN-1 ) DEN-2) DEN-3) DEN- 4) KPLH3) 1 : 128 000 < 1/100 < 1/100 < 1/100 2(PLH3) > 1 : 128 000 < 1/100 < 1/100 < 1/100 Mezclas de IHA**anti-DEN-1 IHA antí-DEN-2 IHA anti-DEN-3 IHA anti-DEN-4 sueros * PLH3 >1/ 320 < 1/ 5 < 1/ 5 < 1/ 5 Mezclas de Títulos Títulos Títulos Títulos sueros* neutralizantes*** neutralizantes neutralizantes neutralizantes anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 KPLH3) >1 : 1280 < 1 : 5 < 1 : 5 < 1 : 5 2(PLH3) >1 : 1280 < 1 : 5 < 1 : 5 < 1 : 5 * Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros. ** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales. *** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

EJEMPLO 25 Obtención de pAZ1 La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-3 (Secuencia No.19) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.11 y Secuencia No.12 a partir de la cepa viral de DEN-3 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology.1990. 176(2):643-647).

El vector se generó por digestión Xba l/Bam Hl del plasmidio PM108 His, el cual contiene la secuencia nucleotídica que codifica para la región N-terminal de la MDH y para una secuencia de 6 histidinas (Secuencia No.23). Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W3110 se transformaron con el clon seleccionado llamado pAZ1 (Fig. 7 y Secuencia No.40). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 25 kDa correspondiente al 10 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la región N-terminal de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-3. Esta banda fue reconocida con AcP anti-DEN-3 contenidos en un LAHI. La proteína se denominó PAZ1 (Secuencia No.41 ).

EJEMPLO 26 Purificación de la proteína PAZ1 La biomasa obtenida de la cepa transformada con pAZ1 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo mayoritariamente de forma insoluble asociada al precipitado de ruptura celular. A partir del precipitado, se realizó una extracción con urea 6 M y el sobrenadante, conteniendo la proteína PAZ1 , se aplicó en una columna de G-25 para eliminar el agente caotropico. La fracción obtenida se aplicó en una columna de Quelating sepharose FF (Pharmacia, UK), en presencia de iones Cu++ previamente equilibrada en Tris 10 mM pH 8.0. La elución se realizó con Imidazol 60 mM y el volumen obtenido se aplicó en una columna de G-25 para obtener la proteína en el tampón de formulación PBS. Esta preparación se utilizó para los estudios inmunológicos.

EJEMPLO 27 Caracterización antigénica de PAZ1 La fracción purificada de PAZ1 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos así como por sueros humanos positivos a Dengue (cuadro 31 ).

Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-3. Este resultado es coincidente con el hecho de que la región clonada pertenece al serotipo 3. El reconocimiento por LAHI contra los otros serotipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Por último se analizó ia reactividad frente a cuatro sueros humanos de alto título y tres de bajo título a DEN-3, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting y Dot blotting.

CUADRO 31 Reactividad de la proteína PAZ1 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales Acs** Especificidad*** PAZ1 LAHI DEN-1 - LAHI DEN-2 + LAHI DEN-3 ++ LAHI DEN-4 + LAHI EEE - LAHI YFV - LAHI SLV AcM 3H5 NT - * Se aplicaron 10 µ? de la proteína purificada PAZ1. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++. ** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000. *** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.

EJEMPLO 28 Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PAZ1 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 35 ug i.p de la preparación purificada de PAZ1 utilizando el adyuvante de Freund. Una parte de estos animales (10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-3 mientras que, frente al resto de los serotipos, no se obtuvo reactividad alguna (cuadro 32 y cuadro 35). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-3 (cuadro 33 y cuadro 35). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro evidenciándose títulos neutralizantes (1 :320) contra DEN-3 mientras que contra el resto de los serotipos no existió neutralización de la infectividad viral (cuadro 34 y cuadro 35). Estos resultados indican la gran serotipo-especificidad de los anticuerpos generados por PAZ1.

CUADRO 32 Títulos de anticuerpos contra DEN-3 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PAZ1 CUADRO 33 Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PAZ1 *Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.

CUADRO 34 Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PAZ3 * Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

CUADRO 35 Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PAZ1 Mezclas de IHA**anti-DEN-1 IHA anti-DEN-2 IHA anti-DEN-3 IHA anti-DEN-4 sueros * PAZ1 < 1/ 5 < 1/ 5 >1 : 320 < 1/ 5 Mezclas de Títulos Títulos Títulos Títulos sueros* neutralizantes*** neutralizantes neutralizantes neutralizantes anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 1 (PAZ1 ) < 1 : 5 < 1 : 5 1 : 320 < 1 : 5 2(PAZ1 ) < 1 : 5 < 1 : 5 1 : 320 < 1 : 5 * Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros. ** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales. *** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

EJEMPLO 29 Obtención de pAZ2 La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-3 (Secuencia No.29) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.11 y Secuencia No.13 a partir de la cepa viral de DEN-3 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology.1990. 176(2):643-647).

El vector se generó por digestión Xba ¡/Eco RI del plasmidio PM84 His, que contiene la secuencia nucleotídica de la MDH más la codificante para una cola de 6 histidinas (Secuencia No. 26). Esta digestión permite la inserción del fragmento amplificado por PCR dentro de la región codificante para un dominio estructural de la MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes M 294 se transformaron con el clon seleccionado llamado pAZ2 (Fig. 8 y Secuencia No.42). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 10% de las proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la talla de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-3. Esta banda fue reconocida por un LAHI anti-DEN-3 y se denominó PAZ2 (Secuencia No.43).

EJEMPLO 30 Purificación de la proteína PAZ2 La biomasa obtenida de la cepa transformada con pAZ2 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la proteína recombinante se extrajo con Urea 6M y luego se realizó una cambio de tampón por G-25. A partir de la muestra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz utilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 50 mM y luego la elución se realizó con imidazol 150 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos.

EJEMPLO 31 Caracterización antiqénica de PAZ2 La fracción purificada de PAZ2 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (cuadro 36). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-3. El reconocimiento por LAHI contra los otros serotipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Finalmente se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto título y tres de bajo título a DEN-3, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Dot blotting y Western blotting.

CUADRO 36 Reactividad de la proteína PAZ2 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales Acs** Especificidad*** PAZ2 LAHI DEN-1 - LAHI DEN -2 - LAHI DEN-3 +++ LAHI DEN-4 + LAHI EEE _ LAHI YFV - LAHI SLV - AcM 3H5 NT - * Se aplicaron 10 µg de la proteína purificada PAZ2. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++. ** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000. *** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.

EJEMPLO 32 Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PAZ2 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PAZ2 utilizando el Adyuvante de Freund. Una parte de los animales(10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-3 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obtuvo reactividad alguna (cuadro 37 y cuadro 40). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-3 (cuadro 38 y cuadro 40). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización ¡n vitro alcanzándose títulos de 1/1280 contra DEN-3 (cuadro 39). No se obtuvieron títulos neutralizantes contra el resto de los serotipos (cuadro 40).

CUADRO 37 Títulos de anticuerpos contra DEN-3 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PAZ2 CUADRO 38 Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PAZ2 *Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutlnación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.

CUADRO 39 Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PAZ2 * Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

CUADRO 40 Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PAZ2 Mezclas de ELISA (anti- ELISA (anti ELISA (anti- ELISA (anti- sueros* DEN-1 ) DEN-2) DEN-3) DEN- 4) 1 (PAZ2) < 1/100 < 1/100 > 1 : 128 000 < 1/100 2(PAZ2) < 1/100 < 1/100 > 1 : 128 000 < 1/100 Mezclas de IHA**anti-DEN-1 IHA anti-DEN-2 IHA anti-DEN-3 IHA anti-DEN-4 sueros * PAZ2 < 1/ 5 < 1/ 5 >1/ 320 < 1/ 5 Mezclas de Títulos Títulos Títulos Títulos sueros* neutralizantes*** neutralizantes neutralizantes neutralizantes anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 1 (PAZ2) < 1 : 5 < 1: 5 >1 : 1280 < 1: 5 2(PAZ2) < 1 : 5 < 1: 5 >1 : 1280 < 1 : 5 * Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros. ** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales. *** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

EJEMPLO 33 Obtención de pAZ3 La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN- 3 (Secuencia No.39) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.14 y Secuencia No.15 a partir de la cepa viral de DEN-3 (Osatomi K., Sumiyoshi H. Complete nucleotide sequence of dengue type 3 virus genome RNA. Virology. 990. 176(2):643-647). El vector se generó por digestión Bam Hl/Bam Hl del plasmidio pD4, el cual contiene el gen de la MDH con una secuencia de 6 histidinas sin codón de parada (Secuencia No.26). Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W3110 se transformaron con el clon seleccionado llamado pAZ3 (Fig. 9 y Secuencia No.44). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 20 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-3. Esta banda fue reconocida con AcP anti-DEN-3 contenidos en un LAHI. La proteína se'denominó PAZ3 (Secuencia No.45).

EJEMPLO 34 Purificación de la proteína PAZ3 La biomasa obtenida de la cepa transformada con pAZ3 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la proteína se extrajo con Urea 7M y luego se realizó una cambio de tampón por G-25. A partir de la muestra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz utilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 45 mM y luego la elución se realizó con imidazol 230 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios ¡nmunológicos.

EJEMPLO 35 Caracterización antigénica de PAZ3 La fracción purificada de PAZ3 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (cuadro 41 ).

Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el LAHl anti-DEN-3. El reconocimiento por LAHl contra los otros serotipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Finalmente se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto titulo y tres de bajo título a DEN-3, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting y Dot blotting.

CUADRO 41 Reactividad de la proteína PAZ3 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales Acs** Especificidad*** PAZ3 ~ LAHl DEN-1 LAHl DEN-2 LAHl DEN-3 +++ LAHl DEN-4 + LAHl EEE LAHl YFV LAHl SLV AcM 3H5 NT * Se aplicaron 10 µ9 de la proteína purificada PAZ3. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.

EJEMPLO 36 Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PAZ3 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PAZ3 utilizando el adyuvante de Freund. Una parte de los animales (10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-3 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obtuvo reactividad alguna (cuadro 42 y cuadro 45). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-3 (cuadro 43 y cuadro 45). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro alcanzándose títulos de 1 : 1280 contra DEN-3 (cuadro 44). No se obtuvieron títulos neutralizantes contra el resto de los serotipos (cuadro 45).

CUADRO 42 Títulos de anticuerpos contra DEN-3 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PAZ3 CUADRO 43 Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PAZ3 *Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglütinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.

CUADRO 44 Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PAZ3 * Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

CUADRO 45 Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PAZ3 Mezclas de ELISA (anti- ELISA (anti ELISA (anti- ELISA (antí- sueros* DEN-1 ) DEN-2) DEN-3) DEN- 4) 1 (PAZ3) < 1/100 < 1/100 > 1 : 128 000 < 1/100 2(PAZ3) < 1/100 < 1/100 1 : 128 000 < 1/100 Mezclas de IHA**ant¡-DEN-1 IHA anti-DEN-2 IHA antí-DEN-3 IHA anti-DEN-4 sueros * PAZ3 < 1/ 5 < 1/ 5 >1/ 320 < 1/ 5 Mezclas de Títulos Títulos Títulos Títulos sueros* neutralizantes*** neutralizantes neutralizantes neutralizantes anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 1 (PAZ3) < 1 : 5 < 1 : 5 >1 : 1280 < 1 : 5 2(PAZ3) < 1 : 5 < 1 : 5 >1 : 1280 < 1 : 5 * Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros. ** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales. *** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

EJEMPLO 37 Obtención de plD1 La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-4 (Secuencia No.46) se amplificó con los oligonudeótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.17 y Secuencia No.18 a partir de la cepa viral de DEN-4. (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C- J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Analysis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155:77-88). El vector se generó por digestión Xba l/Bam Hl del plasmidio PM108 His, el cual contiene la secuencia nucleotídica que codifica para la región N-terminal de la MDH y para una secuencia de 6 histidinas (Secuencia No.23). Después del proceso de ligamiento, ios posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W31 10 se transformaron con el clon seleccionado llamado plD1 (Fig.10 y Secuencia No.47). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 25 kDa correspondiente al 10 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la región N-terminal de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-1. Esta banda fue reconocida con AcP anti-DEN-4 contenidos en un LAHI. La proteína se denominó PID1 (Secuencia No.48).

EJEMPLO 38 Purificación de la proteína PID1 La biomasa obtenida de la cepa transformada con plD1 y crecida a 37 °C se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo mayoritariamente de forma insoluble asociada al precipitado de ruptura celular. A partir del precipitado, se realizó una extracción con urea 6 M y el sobrenadante, conteniendo la proteína PLL1 , se aplicó en una columna de G-25 para eliminar el agente caotrópico. La fracción obtenida se aplicó en una columna de Quelating sepharose FF (Pharmacia, UK), en presencia de iones Cu++. La elución se realizó con Imidazol 60 mM y el volumen obtenido se aplicó en una columna de G-25 para obtener la proteína en el tampón de formulación (PBS). Esta preparación se utilizó para los estudios inmunológicos.

EJEMPLO 39 Caracterización antiqénica de PID1 La fracción purificada de PID1 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos así como por sueros humanos positivos a Dengue (cuadro 46). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-4..EI reconocimiento por LAHI contra los otros serotipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Por último, se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto título y tres de bajo título a DEN-4, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting y Dot blotting.

CUADRO 46 Reactividad de la proteína PID1 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales Acs** Especificidad*** PID1 LAHI DEN-1 LAHI DEN-2 LAHI DEN-3 + LAHI DEN-4 ++ LAHI EEE LAHI YFV LAHI SLV AcM 3H5 NT Se aplicaron 10 de la proteína purificada PID1. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.

EJEMPLO 40 Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PID1 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 35 ug i.p de la preparación purificada de PID1 utilizando el Adyuvante de Freund. Una parte de estos animales (10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-4 mientras que, frente al resto de los serotipos, no se obtuvo reactividad alguna (cuadro 47 y cuadro 50). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-4 (cuadro 48 y cuadro 50). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro evidenciándose títulos neutralizantes (1 :320) contra DEN-4 mientras que contra el resto de los serotipos no existió neutralización de la infectividad viral (cuadro 49 y cuadro 50). Estos resultados indican la gran serotipo-especificidad de los anticuerpos generados por PID1.

CUADRO 47 Títulos de anticuerpos contra DEN-4 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PID1 CUADRO 48 Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PID1 *Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.

CUADRO 49 Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PID1 * Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

CUADRO 50 Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PID1 Mezclas de IHA**anti-DEN-1 IHA anti-DEN-2 IHA anti-DEN-3 IHA anti-DEN-4 sueros * PID1 < 1/ 5 < 1/ 5 < 1/ 5 >1 :320 Mezclas de Títulos Títulos Títulos Títulos sueros* neutralizantes*** neutralizantes neutralizantes neutralizantes anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 1 (PID1 ) < 1 : 5 < 1 : 5 < 1 : 5 1 : 160 2(PID1) < 1 : 5 < 1: 5 < 1 : 5 1 : 320 * Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros.

EJEMPLO 41 Obtención de plD2 La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN- 4 (Secuencia No.46) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.16 y Secuencia No.18 a partir de la cepa viral de DEN-4 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C-J., Makino Y. Cloning fuil-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Analysis of genes coding for structural proteins. Virology 986. 155:77-88. El vector se generó por digestión Xba l/Eco Rl del plasmidio PM84 His , que contiene la secuencia nucleotídica de la MDH más la codificante para una cola de 6 histidinas (Secuencia No.26) . Esta digestión permite la inserción del fragmento amplificado por PCR dentro de la región codificante para un dominio estructural de la MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes MM294 se transformaron con el clon seleccionado llamado plD2 (Fig. 11 y Secuencia No.49). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 10% de las proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la talla de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-4. Esta banda fue reconocida por un LAHI anti-DEN-4 y se denominó PID2 (Secuencia No.50).

EJEMPLO 42 Purificación de la proteína PID2 La biomasa obtenida de la cepa transformada con plD2 y crecida a 37 °C se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la proteína se extrajo con Urea 6M y luego se realizó una cambio de tampón por G-25. A partir de la muestra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz utilizada fue Quelaílng Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 30 mM y luego la elución se realizó con imidazol 250 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos EJEMPLO 43 Caracterización antigénica de P1D2 La fracción purificada de PID2 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (cuadro 51 ). Los mayores reconocimientos por Dof blotting se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-4. El reconocimiento por LAHI contra los otros serotipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Finalmente se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto título y tres de bajo título a DEN-4, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting y Dot blotting.

CUADRO 51 Reactividad de la proteína PID2 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales Acs** Especificidad*** PID2 LAHI DEN-1 LAHI DEN-2 LAHI DEN-3 + LAHI DEN-4 +++ LAHI EEE LAHI YFV LAHI SLV AcM 3H5 NT * Se aplicaron 10 µg de la proteína purificada PID2. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.

EJEMPLO 44 Caracterización de ta respuesta de anticuerpos generada por P1D2 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PID2 utilizando el adyuvante de Freund. Una parte de los animales(10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-4 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obtuvo reactividad alguna (cuadro 52 y cuadro 55). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-4 (cuadro 53 y cuadro 55). Finalmente, se realizó el ensayo de neutralización ¡n vitro alcanzándose títulos de 1/1280 contra DEN-4 (cuadro 54). No se obtuvieron títulos neutralizantes contra el resto de los serotipos (cuadro 55).

CUADRO 52 Títulos de anticuerpos contra DEN -4 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PID2 CUADRO 53 Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PID2 *Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.

CUADRO 54 Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PID2 * Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

CUADRO 55 Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PID2 Mezclas de ELISA (anti- ELISA (anti ELISA (anti- ELISA (anti- sueros* DEN-1 ) DEN-2) DEN-3) DEN- 4) KPID2) < 1/100 < 1/100 < 1/100 > 1 : 128 000 2(PID2) < 1/100 < 1/100 < 1/100 1 : 64 000 Mezclas de IHA**anti-DEN-1 IHA anti-DEN-2 IHA anti-DEN-3 IHA anti-DEN-4 sueros * PID2 < 1/ 5 < 1/ 5 < 1/ 5 >1/ 320 Mezclas de Títulos Títulos Títulos Títulos sueros* neutralizantes*** neutralizantes neutralizantes neutralizantes anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 ant¡-DEN-4 KPID2) < 1 : 5 < 1 : 5 < 1 : 5 >1 : 1280 2(PID2) < 1 : 5 < 1 : 5 < 1 : 5 >1 : 1280 * Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros. ** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.

EJEMPLO 45 Obtención de plD3 La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN- 4 (Secuencia No.46) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.19 y Secuencia No.20 a partir de la cepa viral de DEN-4 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L., Chancock R.M., Lai C-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Analysis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155:77-88). El vector se generó por digestión Bam Hl/Bam Hl del plasmidio pD4, el cual contiene el gen de la MDH con una secuencia de 6 histidinas sin codón de parada (Secuencia No.29). Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes W3110 se transformaron con el clon seleccionado llamado plD3 (fig. 12 y Secuencia No.51 ). Luego del crecimiento de la colonia en medio líquido Louria Bertani (LB), se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 80 kDa correspondiente al 20 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la MDH y el fragmento de la proteína DENe del DEN-4. Esta banda fue reconocida por AcP anti-DEN-4 contenidos en un LAHI. La proteína se denominó PID3 (Secuencia No.52).

EJEMPLO 46 Purificación de la proteína PID3 La biomasa obtenida de la cepa transformada con plD3 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la proteína recombinante se extrajo con Urea 6M y luego se realizó una cambio de tampón por G-25. A partir de la muestra en Tris 10mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz utilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 40 mM y luego la elución se realizó con imidazol 200 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos EJEMPLO 47 Caracterización antigénica de PID3 La fracción purificada de PID3 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (cuadro 56). Los mayores reconocimientos por Dot blotting se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-4. El reconocimiento por LAHI contra los otros serotipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Finalmente se analizó la reactividad frente a tres sueros humanos de alto título y tres de bajo título a DEN-4, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blotting y Dot blotting.

CUADRO 56 Reactividad de la proteína PID3 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales Acs** Especificidad*** PID3 LAHI DEN-1 - LAHI DEN-2 - LAHI DEN-3 + LAHI DEN-4 +++ LAHI EEE - LAHI YFV - LAHI SLV - AcM 3H5 NT - * Se aplicaron 10 µ9 de la proteína purificada PID3. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++.

EJEMPLO 48 Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PID3 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PAZ3 utilizando el adyuvante de Freund. Una parte de los animales (10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-4 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obtuvo reactividad alguna (cuadro 57 y cuadro 60). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-4 (cuadro 58 y cuadro 60). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro alcanzándose altos títulos contra DEN-4 (1 :1280) (cuadro 59). No se obtuvieron títulos neutralizantes contra el resto de los serotipos (cuadro 60).

CUADRO 57 Títulos de anticuerpos contra DEN-1 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PLH2 CUADRO 58 Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PID3 *Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.

CUADRO 59 Ensayo de neutralización viral con ios sueros de los animales inmunizados con PID3 * Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

CUADRO 60 Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PID3 Mezclas de IHA**anti-DEN:1 IHA anti-DEN-2 IHA anti-DEN-3 IHA anti-DEN-4 sueros * PID3 < 1/ 5 < 1/ 5 < 1/ 5 >1/ 320 Mezclas de Títulos Títulos Títulos Títulos sueros* neutralizantes*** neutralizantes neutralizantes neutralizantes anti-DEN-1 anti-DEN-2 anti-DEN-3 anti-DEN-4 KPID3) < 1 : 5 < 1 : 5 < 1 : 5 >1 : 1280 2(PID3) < 1 : 5 < 1 : 5 < 1 : 5 >1/1280 * Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros. ** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales. *** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

EJEMPLO 49 Obtención de pD4D2 La secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-4 (Secuencia No.46) se amplificó con los oligonucleótidos identificados en el listado de secuencias como Secuencia No.16 y Secuencia No.21 a partir de la cepa viral de DEN-4 (Zhao B., Mackow E.R., Buckler-White A.J., Markoff L, Chancock R.M., Lai C-J., Makino Y. Cloning full-length Dengue type 4 viral DNA sequences: Analysis of genes coding for structural proteins. Virology 1986. 155:77-88).

El vector se generó por digestión Xba /Xba I del plasmídio pLL3, el cual contiene el gen de la MDH con una secuencia de 6 histídinas en la región 3' del gen y la secuencia del fragmento de la E de DEN-2 en el extremo 3'. Esto permite la obtención de dos regiones de la E de los serotipos 4 y 2 fusionados en el mismo gen de la MDH. Después del proceso de ligamiento, los posibles recombinantes se analizaron por restricción y los positivos se secuenciaron para chequear las uniones. Las células competentes MM294 se transformaron con el clon seleccionado llamado pD4D2 (Fig.13 y Secuencia No.53). Luego del crecimiento de la colonia en medio LB, se realizó un SDS-PAGE del lisado celular. Se obtuvo una banda de aproximadamente 1 10 kDa correspondiente al 20 % de proteínas totales en la célula. La talla obtenida se corresponde con la suma de la MDH y los dos fragmentos de la proteína DENe del DEN. Esta banda fue reconocida con AcP anti-DEN-2 y anti DEN-4 contenidos en un LAHI. La proteína se denominó PD4D2 (Secuencia No.54).

EJEMPLO 50 Purificación de la proteína PD4D2 La biomasa obtenida de la cepa transformada con pD4D2 se rompió en prensa francesa. La proteína recombinante se obtuvo de forma soluble e insoluble. A partir de la fracción insoluble, la proteína recombinante se extrajo con Urea 6M y luego se realizó una cambio de tampón por G-25. A partir de la muestra en Tris 0mM, se realizó una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos. La matriz utilizada fue Quelating Sepharose FF previamente acoplada con iones Cu++. Se realizó un lavado con Imidazol 30 mM y luego la elución se realizó con ¡midazol 250 mM. Finalmente, la preparación pura, se aplicó en una columna de G-25 para obtenerla en el tampón de formulación (PBS) y realizar los estudios inmunológicos EJEMPLO 51 Caracterización anti énica de PID3 La fracción purificada de PD4D2 se caracterizó tanto por reconocimiento con diferentes sueros policlonales y monoclonales murinos, así como por sueros humanos positivos a Dengue (cuadro 61 ). Los mayores reconocimientos por Dot blottíng se obtuvieron con el LAHI anti-DEN-2 y anti-DEN-4. El reconocimiento por LAHI contra los otros serotipos fue menor. En el caso de los anticuerpos generados por otros flavivirus como Fiebre Amarilla, y Encefalitis de San Luis no se obtuvo reconocimiento alguno. Por otra parte, se mantuvo el reconocimiento por el anticuerpo monoclonal 3H5 similar al obtenido con PLL2 y PLL3. Finalmente se analizó la reactividad frente a sueros humanos de alto y bajo título contra DEN-2 y DEN-4, obteniéndose una señal considerable en ambos casos por Western blottíng y Dot blottíng.

CUADRO 61 Reactividad de la proteína PD4D2 frente a anticuerpos monoclonales y policlonales Acs** Especificidad*** PD4D2 LAHI DEN-1 LAHI DEN-2 +++ LAHI DEN-3 - LAHI DEN-4 +++ LAHI EEE _ LAHI YFV - LAHI SLV - AcM 3H5 NT - * Se aplicaron 10 g de la proteína purificada PD4D2. La intensidad de la señal obtenida se evaluó desde + hasta +++. ** Los líquidos ascíticos hiperinmunes se utilizaron 1 :100 mientras que el monoclonal 3H5 se utilizó en la dilución 1 :1000. *** EEE: virus de la Encefalitis Equina, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla; SLV: Virus de la Encefalitis de San Luis. NT: Neutralizante serotipo específico.

EJEMPLO 52 Caracterización de la respuesta de anticuerpos generada por PD4D2 Se inmunizaron 25 ratones Balb/c con 20 ug i.p de la preparación purificada de PAZ3 utilizando el adyuvante de Freund. Una parte de los animales (10 ratones) se sangraron tras la cuarta dosis y los anticuerpos anti-DEN se determinaron por ELISA. Se obtuvieron altos títulos contra DEN-2 y DEN-4 mientras que, frente al resto de los serotipos no se obtuvo reactividad alguna (cuadro 62 y cuadro 65). Paralelamente se realizó el ensayo de IHA obteniéndose títulos positivos solamente al DEN-2 y DEN-4 (cuadro 63 y cuadro 65). Finalmente se realizó el ensayo de neutralización in vitro alcanzándose altos títulos contra DEN-2 (>1:1280) y DEN-4 (>1: 1280) (cuadro 64). No se obtuvieron títulos neutralizantes contra el resto de los serotipos (cuadro 65).

CUADRO 62 Títulos de anticuerpos contra DEN-4 y DEN-2 de los sueros obtenidos tras la inmunización con PD4D2 Ratón Títulos por ELISA (PD4D2) Títulos por ELISA PBS C(-) Anti DEN-4 Anti DEN-2 Anti DEN-4 Anti DEN-2 1 >1: 128000 >1: 128000 < 1 100 < 1 100 2 1: 128000 1: 128000 < 1 100 < 1 100 3 >1: 128000 >1: 128000 < 1 100 < 1 100 4 >1: 128000 >1: 128000 < 1 100 < 1 100 5 1:64000 >1: 128000 < 1 100 < 1 100 6 >1: 128000 1: 128000 < 1 100 < 1 100 .7 1: 64000 >1: 128000 < 1 100 < 1 100 8 >1: 128000 >1: 128000 < 1 100 < 1 100 9 >1: 128000 1: 128000 < 1 100 < 1 100 10 1: 128000 >1: 128000 < 1 100 < 1 100 CUADRO 63 Títulos por IHA de los sueros de los animales inmunizados con la proteína PD4D2 *Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinacion de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales.

CUADRO 64 Ensayo de neutralización viral con los sueros de los animales inmunizados con PD4D2 * Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

CUADRO 65 Ensayo de reactividad cruzada, contra todos los serotipos virales por ELISA, IHA y neutralización viral, con los sueros de los animales inmunizados con PD4D2 * Cada mezcla se formó por la unión de tres sueros. ** Los títulos IHA se definieron como la mayor dilución capaz de inhibir la hemaglutinación de eritrocitos de ganso frente a 8 unidades hemaglutinantes virales. *** Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución del suero donde se obtuvo un 50% de reducción del número de placas virales.

EJEMPLO 53 Ensayo de protección Para la evaluación de la protección conferida a los ratones ante el reto con DEN letal homólogo por la inmunización con todas las variantes ensayadas, se utilizaron los ratones que no fueron sangrados de cada grupo (15 ratones). Cada uno de los animales recibió una dosis de 100 LD50 de DEN letal por inoculación intracraneal y se observaron durante 21 días para obtener los porcentajes de letalidad. Se utilizaron como controles positivos grupos de 15 ratones inmunizados con las cuatro preparaciones virales (DEN-1 , DEN-2, DEN-3 y DEN-4). Todos los ratones de estos grupos sobrevivieron mientras que los ratones del grupo control (-), enfermaron en los 7-11 días posteriores al reto obteniéndose un 100% de mortalidad. Finalmente, los grupos inmunizados con las proteínas de fusión ensayadas presentaron entre un 80% y 100% de protección obteniéndose en todos los casos diferencias significativas respecto al grupo control (cuadro 66) CUADRO 66 Porcentajes de sobrevida en ratones inmunizados con las variantes de proteínas ensayadas frente al reto con virus DEN homólogo letal * Se calculó: (# de ratones sobrevivientes)/ (# total de ratones). Los datos de sobrevivientes se toman 21 después del reto. En el caso de los ratones inmunizados pD4D2, 15 se retaron con DEN-4 y 15 con DEN-2.

EJEMPLO 54 Respuesta Linfoproliferativa Los animales de los diferentes grupos inmunizados con las proteínas quiméricas que presentan el fragmento de la E de DEN-2 (PLL1 , PLL2 y PLL3), y un grupo placebo control, fueron sacrificados 15 días después de la última dosis. Posteriormente, se les extrajeron los bazos y se estudió la respuesta linfoproliferativa frente a los cuatro serotipos del virus Dengue. Los resultados de el cuadro 66 reflejan los índices de estimulación obtenidos, evidenciándose una respuesta serotipo específica.

CUADRO 67 Indices de estimulación frente a los cuatro serotipos virales de los linfocitos de los ratones inmunizados con PLL1, PLL2 y PLL3 *índice de estimulación: cociente de los conteos por minuto de las muestras entre los conteos por minuto del control de síntesis espontánea de ADN. ** mitógeno Phytohemaglutinina LISTADO DE SECUENCIAS <110> Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología <120> CADENAS QUIMRRICAS CODIFICANTES PARA PROTEINAS INDUCTORAS DE EFECTOS CONTRA VIRUS. <130> Dengue <140> <141> <160> 54 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211 > 25 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1 )..(25) <223> Secuencia del oligonucleótido Xba-I para la amplificación del fragmento de la DENe-2 <400> 1 cttctagaca ggctgcgcat ggaca <210> 2 <211 > 29 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1 )..(29) <223> Secuencia del oligonucleótido Bam-HI para la amplificación del fragmento de la DENe-2 <400> 2 gtggatcctt accctcccag gcttccaaa 29 <210>3 <211>25 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <223> Secuencia del oligonucleótido Eco-RI para la amplificación del fragmento de la DENe-2 <400> 3 atgaattcac gcctcccaga gatee 25 <210>4 <211>21 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <223> Secuencia del oligonucleótido Bam-HI para la amplificación de! fragmento de la DENe-2 <400> 4 cttggatcca ggctgagaat g 21 <210>5 <211>31 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222>(1)..(31) <223> Secuencia del oligonucleótido Bam-HI para la amplificación del fragmento de la DENe-2 <400> 5 gaggatcctt aaccacccag agacccaaaa t <210> 6 <211> 25 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1 )..(25) <223> Secuencia del oligonucleótido Xba-I para la amplificación del fragmento de la DENe-1 <400> 6 cttctagaca ggctcaaaat ggata í <210> 7 <21 > 28 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1 )..(28) <223> Secuencia del oligonucleótido Bam-Hl para la amplificación del fragmento de la DENe-1 <400> 7 gaggatcctt acccgccaat agaaccga <210> 8 <211> 25 <212> ADN <2 3> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <223> Secuencia del oligonucleótido Eco-RI para la amplificación del fragmento de la DENe-1 <400> 8 acgaattcac ccctcctata gatee 25 <210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1 )..(24) <223> Secuencia del oligonucleótido Bam-HI para la amplificación del fragmento de la DENe-1 <400> 9 acaccttgga tecagactaa aaat 24 <210> 10 <21 1> 26 <212> ADN <2 3> Escherichia coli <220> <221> primer_b¡nd <222> (1 )..(26) <223> Secuencia del oligonucleótido Bam-HI para la amplificación del fragmento de la DENe-1 <400> 10 ccggatccgt gaattaecca ectata 26 <210> 11 <211> 29 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(29) <223> Secuencia del oligonucleótido Xba-I para la amplificación del fragmento de la DENe-3 <400> 11 tttctagata gactcaagat ggacaaatt 29 <210> 12 <211> 28 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> pr¡mer_bind <222> (1 )..(28) <223> Secuencia del oligonucleótido Bam-HI para la amplificación del fragmento de la DENe-3 <400> 12 gaggatcctt aaccacccac tgaaccaa <210> 13 <211> 25 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_ bind <222> (1 )..(25) <223> Secuencia del oligonucleótido Eco-RI para la amplificación del fragmento de la DENe-3 <400> 13 aagaattcac accacccaca gatee <210> 14 <21 1> 23 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1)..(23) <223> Secuencia del oligonucleótido Bam-HI para la amplificación del fragmento de la DENe-3 <400> 14 acttaggatc cagactcaag atg 23 <210> 15 <211> 26 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_b¡nd <222> (1)..(26) <223> Secuencia del oligonucleótido Bam-Hl para la amplificación del fragmento de la DENe-3 <400> 15 gaggatcctt aaccacccac tgaacc <210> 16 <21 1 > 30 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221 > pr¡mer_bind <222> (1)..(30) <223> Secuencia del oligonucleótido Xba-I para la amplificación del fragmento de la DENe-4 <400> 16 cttctagaca aagtgcgtat ggagaaattg 30 <210> 17 <21 1> 28 <212> ADN <2 3> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1 )..(28) <223> Secuencia del oligonucleótido Bam-HI para la amplificación del fragmento de la DENe-4 <400> 17 gaggatcctt aaccaccaac agaaccaa <210> 18 <211> 25 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1 )..(25) <223> Secuencia del oligonucleótido Eco-RI para la amplificación del fragmento de la DENe-4 <400> 18 atgaattcag tccaccaacg ctacc 25 <210> 19 <211> 27 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1 )..(27) <223> Secuencia del oligonucleótido Bam-HI para la amplificación del fragmento de la DENe-4 <400> 19 ggccatctag gatccaaagt gcgtatg 27 <210> 20 <211> 28 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1 )..(28) <223> Secuencia del oligonucleótido Bam-HI para la amplificación del fragmento de la DENe-4 <400> 20 gaggatcctt agccaccaac cgaaccaa <210> 21 <211> 26 <212> ADN <2 3> Escherichia coli <220> <221> primer_bind <222> (1 )..(26) <223> Secuencia del oligonucleótido Xba-I para la amplificación del fragmento de la DENe-4 <400> 21 attctagaag accaccaacg gaacca <210> 22 <211> 429 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1 )..(426) <223> Secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos del 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-2 <400> 22 gacaggctga gaatggacaa actacagctc aaaggaatgt catactctat gtgtacagga 60 aagtttaaaa ttgtgaagga aatagcagaa acacaacatg gaacaatagt tatcagagta 120 caatatgaag gggacggctc tccatgtaag atcccttttg agataatgga tttggaaaaa 180 agacacgtct taggtcgcct gattacagtt aacccgatcg taacagaaaa agatagccca 240 gtcaacatag aagcagaacc tccattcgga gacagctaca tcatcatagg agtagagccg 300 ggacaattga aactcaactg gtttaagaaa ggaagttcca tcggccaaat gtttgagaca 360 acaatgagag gagcgaagag aatggccatt ttaggtgaca cagcctggga ttttggatcc 420 ctgggagga 429 <210> 23 <211> 168 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1 )..(168) <223> Secuencia nucleotídica que codifica para los primeros 45 aminoácidos de la MDH. <400> 23 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagac 168 <210> 24 <2 1> 603 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1 )..(603) <223> Secuencia nucleotídica que codifica para la proteína quimérica en el plasmidio pLL1 <400> 24 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagacag gctgcgcatg 180 gacaaactac agctcaaagg aatgtcatac tctatgtgta caggaaagtt taaaattgtg 240 aaggaaatag cagaaacaca acatggaaca atagttatca gagtacaata tgaaggggac 300 ggctctccat gtaagatccc ttttgagata atggatttgg aaaaaagaca cgtcttaggt 360 cgcctgatta cagttaaccc gatcgtaaca gaaaaagata gcccagtcaa catagaagca 420 gaacctccat tcggagacag ctacatcatc ataggagtag agccgggaca attgaaactc 480 aactggttta agaaaggaag ttccatcggc caaatgtttg agacaacaat gagaggagcg 540 aagagaatgg ccattttagg tgacacagcc tgggattttg gaagcctggg agggtaagga 600 tcc 603 <210> 25 <211 > 195 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221 > CHAIN <222> (1 )..(195) <223> Secuencia aminoacídica correspondiente a la proteína PLL1 <400> 25 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp He Gly Gly His Glu Asn Val Asp lie lie Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr lie Ala Val Asp Asp Thr Leu lie 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly 50 55 60 Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys He Val Lys Glu lie 65 70 75 80 Ala Glu Thr Gln His Gly Thr lie Val lie Arg Val Gln Tyr Glu Gly 85 90 95 Asp Gly Ser Pro Cys Lys lie Pro Phe Glu He Met Asp Leu Glu Lys 100 105 1 10 Arg His Val Leu Gly Arg Leu lie Thr Val Asn Pro lie Val Thr Glu 1 15 120 125 Lys Asp Ser Pro Val Asn lie Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser 130 135 140 Tyr lie lie lie Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe 145 150 155 160 Lys Lys Gly Ser Ser lie Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly 165 170 175 Ala Lys Arg Met Ala lie Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser 180 185 190 Leu Gly Gly 195 <210> 26 <211> 1851 <212> ADN <2 3> Escherichia coli <220> <221 > gene <222> (1 )..(1851 ) <223> Secuencia nucleotídica correspondiente a la MDH incluida en pM84 His. <400> 26 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagaa 180 gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatgaatt cgatggacgt acctgctgaa 240 gttgcaggcg tagtcaaaga agttaaagtt aaagtcggcg acaaaatctc tgaaggtggt 300 ttgattgtcg tcgttgaagc tgaaggcacg gcagccgctc ctaaagccga agcggctgcc 360 gccccggcgc aagaagcccc taaagctgcc gctcctgctc cgcaagccgc gcaattcggc 420 ggttctgccg atgccgagta cgacgtggtc gtattgggtg gcggtcccgg cggttactcc 480 gctgcatttg ccgctgccga tgaaggcttg aaagtcgcca tcgtcgaacg ttacaaaact 540 ttgggcggcg tttgcctgaa cgtcggctgt atcccttcca aagccttgtt gcacaatgcc 600 gccgttatcg acgaagtgcg ccacttggct gccaacggta tcaaataccc cgagccggaa 660 ctcgacatcg atatgcttcg cgcctacaaa gacggcgtag tttcccgcct cacgggcggt 720 ttggcaggta tggcgaaaag ccgtaaagtg gacgttatcc aaggcgacgg gcaattctta 780 gatccgcacc acttggaagt gtcgctgact gccggcgacg cgtacgaaca ggcagcccct 840 accggcgaga aaaaaatcgt tgccttcaaa aactgtatca ttgcagcagg cagccgcgta 900 accaaactgc ctttcattcc tgaagatccg cgcatcatcg attccagcgg cgcattggct 960 ctgaaagaag taccgggcaa actgctgatt atcggcggcg gcattatcgg cctcgagatg 1020 ggtacggttt acagcacgct gggttcgcgt ttggatgtgg ttgaaatgat ggacggcctg 1080 atgcaaggcg cagaccgcga tttggtaaaa gtatggcaaa aacaaaacga ataccgtttt 1140 gacaacatta tggtcaacac caaaaccgtt gcagttgagc cgaaagaaga cggcgtttac 1200 gttacctttg aaggcgcgaa cgcgcctaaa gagccgcaac gctacgatgc cgtattggtt 260 gccgccggcc gcgcgcccaa cggcaaactc atcagcgcgg aaaaagcagg cgttgccgta 1320 accgatcgcg gcttcatcga agtggacaaa caaatgcgta ccaatgtgcc gcacatctac 1380 gccatcggcg acatcgtcgg tcagccgatg ttggcgcaca aagccgttca cgaaggccac 1440 gttgccgccg aaaactgcgc cggccacaaa gcctacttcg acgcacgcgt gattccgggc 1500 gttgcctaca cttcccccga agtggcgtgg gtgggcgaaa ccgaactgtc cgccaaagcc 1560 tccggccgca aaatcaccaa agccaacttc ccgtgggcgg cttccggccg tgcgattgcc 1620 aacggttgcg acaagccgtt taccaagctg atttttgatg ccgaaaccgg ccgcatcatc 1680 ggcggcggca ttgtcggtcc gaacggtggc gatatgatcg gcgaagtctg ccttgccatc 1740 gaaatgggct gcgacgcggc agacatcggc aaaaccatcc acccgcaccc gggcgaatcc 1800 atcggtatgg cggcggaagt ggcattgggt acttgtaccg acaaaaaaaa a 1851 <210> 27 <211> 2253 <212> ADN <2 3> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1 )..(2253) <223> Secuencia nucleotídica codificante para la proteína quimérica en el plasmidio pLL2. <400> 27 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 80 aggctgcgca tggacaaact acagctcaaa ggaatgtcat actctatgtg tacaggaaag 240 tttaaaattg tgaaggaaat agcagaaaca caacatggaa caatagttat cagagtacaa 300 tatgaagggg acggctctcc atgtaagatc ccttttgaga taatggattt ggaaaaaaga 360 cacgtcttag gtcgcctgat tacagttaac ccgatcgtaa cagaaaaaga tagcccagtc 420 aacatagaag cagaacctcc attcggagac agctacatca tcataggagt agagccggga 480 caattgaaac tcaactggtt taagaaagga agttccatcg gccaaatgtt tgagacaaca 540 atgagaggag cgaagagaat ggccatttta ggtgacacag cctgggattt tggatctctg 600 ggaggcgtga attcgatgaa ttcgatggac gtacctgctg aagttgcagg cgtagtcaaa 660 gaagttaaag ttaaagtcgg cgacaaaatc tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720 gctgaaggca cggcagccgc tcctaaagcc gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780 cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc gcgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840 tacgacgtgg tcgtattggg tggcggtccc ggcggttact ccgctgcatt tgccgctgcc 900 gatgaaggct tgaaagtcgc catcgtcgaa cgttacaaaa ctttgggcgg cgtttgcctg 960 aacgtcggct gtatcccttc caaagccttg ttgcacaatg ccgccgttat cgacgaagtg 1020 cgccacttgg ctgccaacgg tatcaaatac cccgagccgg aactcgacat cgatatgctt 1080 cgcgcctaca aagacggcgt agtttcccgc ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 40 agccgtaaag tggacgttat ccaaggcgac gggcaattct tagatccgca ccacttggaa 1200 gtgtcgctga ctgccggcga cgcgtacgaa caggcagccc ctaccggcga gaaaaaaatc 1260 gttgccttca aaaactgtat cattgcagca ggcagccgcg taaccaaact gcctttcatt 1320 cctgaagatc cgcgcatcat cgattccagc ggcgcattgg ctctgaaaga agtaccgggc 1380 aaactgctga ttatcggcgg cggcattatc ggcctcgaga tgggtacggt ttacagcacg 1440 ctgggttcgc gtttggatgt ggttgaaatg atggacggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 1500 gatttggtaa aagtatggca aaaacaaaac gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560 accaaaaccg ttgcagttga gccgaaagaa gacggcgttt acgttacctt tgaaggcgcg 1620 aacgcgccta aagagccgca acgctacgat gccgtattgg ttgccgccgg ccgcgcgccc 1680 aacggcaaac tcatcagcgc ggaaaaagca ggcgttgccg taaccgatcg cggcttcatc 1740 gaagtggaca aacaaatgcg taccaatgtg ccgcacatct acgccatcgg cgacatcgtc 1800 ggtcagccga tgttggcgca caaagccgtt cacgaaggcc acgttgccgc cgaaaactgc 1860 gccggccaca aagcctactt cgacgcacgc gtgattccgg gcgttgccta cacttccccc 1920 gaagtggcgt gggtgggcga aaccgaactg tccgccaaag cctccggccg caaaatcacc 1980 aaagccaact tcccgtgggc ggcttccggc cgtgcgattg ccaacggttg cgacaagccg 2040 tttaccaagc tgatttttga tgccgaaacc ggccgcatca tcggcggcgg cattgtcggt 2100 ccgaacggtg gcgatatgat cggcgaagtc tgccttgcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160 gcagacatcg gcaaaaccat ccacccgcac ccgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa 2220 gtggcattgg gtacttgtac cgacaaaaaa aaa 2253 <210> 28 <211> 748 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1 )..(748) <223> Secuencia aminoacídica correspondiente a PLL2. <400> 28 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp lie Gly Gly His Glu Asn Val Asp lie lie Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr lie Ala Val Asp Asp Thr Leu lie 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly 50 55 60 Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys lie Val Lys Glu lie 65 70 75 80 Ala Glu Thr Gln His Gly Thr lie Val lie Arg Val Gln Tyr Glu Gly 85 90 95 Asp Gly Ser Pro Cys Lys He Pro Phe Glu lie Met Asp Leu Glu Lys 100 105 110 Arg His Val Leu Gly Arg Leu lie Thr Val Asn Pro lie Val Thr Glu 115 120 125 Lys Asp Ser Pro Val Asn lie Glu Ala GIu Pro Pro Phe Gly Asp Ser 130 135 140 Tyr lie lie lie Gly Val GIu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe 145 150 155 160 Lys Lys Gly Ser Ser lie Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly 165 170 175 Ala Lys Arg Met Ala lie Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser 180 185 190 Leu Gly Gly Val Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala GIu Val 195 200 205 Ala Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys lie Ser 210 215 220 GIu Gly Gly Leu lie Val Val Val Glu Ala GIu Gly Thr Ala Ala Ala 225 230 235 240 Pro Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala 245 250 255 Ala Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala 260 265 270 GIu Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala 275 280 285 Ala Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala lie Val Glu Arg 290 295 300 Tyr Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys lie Pro Ser 305 310 315 320 Lys Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val lie Asp Glu Val Arg His Leu 325 330 335 Ala Ala Asn Gly lie Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp lie Asp Met 340 345 350 Leu Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu 355 360 365 Ala Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val lie GIn Gly Asp Gly 370 375 380 GIn Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp 385 390 395 400 Ala Tyr Glu GIn Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys lie Val Ala Phe 405 410 415 Lys Asn Cys lie lie Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe 420 425 430 He Pro Glu Asp Pro Arg lie lie Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu 435 440 445 Lys Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu lie lie Gly Gly Gly lie lie Gly 450 455 460 Leu Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val 465 470 475 480 Val Glu Met Met Asp Gly Leu Met GIn Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val 485 490 495 Lys Val Trp GIn Lys GIn Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn lie Met Val 500 505 510 Asn Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val 515 520 525 Thr Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala 530 535 540 Val Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu lie Ser Ala 545 550 555 560 Glu Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe lie Glu Val Asp 565 570 575 Lys Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His lie Tyr Ala lie Gly Asp He 580 585 590 Val Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val 595 600 605 Ala Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val 610 615 620 lie Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu 625 630 635 640 Thr Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys lie Thr Lys Ala Asn 645 650 655 Phe Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala lie Ala Asn Gly Cys Asp Lys 660 665 670 Pro Phe Thr Lys Leu lie Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg lie lie Gly 675 680 685 Gly Gly lie Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met lie Gly Glu Val Cys 690 695 700 Leu Ala lie Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp lie Gly Lys Thr lie 705 710 715 720 His Pro His Pro Gly Glu Ser lie Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu 725 730 735 Gly Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys 740 745 <210> 29 <21 1 > 1821 <212> ADN <213> Escherichia col i <220> <221> gene <222> (1 )..( 821 ) <223> Secuencia nucleotídica correspondiente a la MDH incluida en pD4. <400> 29 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180 gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240 ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300 gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360 ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420 tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480 aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540 aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600 ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660 ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720 ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780 gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840 cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900 ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960 gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020 ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080 cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1 140 gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200 ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260 gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320 atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380 ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500 aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620 atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680 gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740 ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800 ccgcaaaaga aaaaaggatc c <210> 30 <211> 2259 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1 )..(2259) <223> Secuencia nucleotídica codificante para ia proteína quimérica en el plasmidio pLL3 <400> 30 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180 gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240 ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300 gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360 ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420 tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480 aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540 aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600 ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660 ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720 ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780 gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840 cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900 ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960 gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020 ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080 cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1 140 gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200 ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260 gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320 atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380 ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500 aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620 atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680 gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740 ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800 ccgcaaaaga aaaaaggatc cgacaggctg agaatggaca aactacagct caaaggaatg 1860 tcatactcta tgtgtacagg aaagtttaaa attgtgaagg aaatagcaga aacacaacat 1920 ggaacaatag ttatcagagt acaatatgaa ggggacggct ctccatgtaa gatccctttt 1980 gagataatgg atttggaaaa aagacacgtc ttaggtcgcc tgattacagt taacccgatc 2040 gtaacagaaa aagatagccc agtcaacata gaagcagaac ctccattcgg agacagctac 2100 atcatcatag gagtagagcc gggacaattg aaactcaact ggtttaagaa aggaagttcc 2160 atcggccaaa tgtttgagac aacaatgaga ggagcgaaga gaatggccat tttaggtgac 2220 acagcctggg attttgggtc tctgggtggt taaggatcc 2259 <210> 31 <21 1 > 745 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221 > CHAIN <222> (1 )..(745) <223> Secuencia aminoacídica correspondiente a PLL3 <400> 31 His His His His His His Met Va! Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp lie Gly Gly His Glu Asn Val Asp lie lie Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr lie Ala Val Asp Asp Thr Leu lie 35 40 45 Thr Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val 50 55 60 Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys lie Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Leu lie Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala 85 90 95 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro 100 105 1 10 Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp 115 120 125 Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala 130 135 140 Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala lie Val Glu Arg Tyr Lys Thr 145 150 155 160 Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys lie Pro Ser Lys Ala Leu 165 170 175 Leu Hls Asn Ala Ala Val lie Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn 180 185 190 Gly lie Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp lie Asp Met Leu Arg Ala 195 200 205 Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met 210 215 220 Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val lie Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu 225 230 235 240 Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu 245 250 255 Gln Ala Ala Pro Thr Giy Glu Lys Lys lie Val Ala Phe Lys Asn Cys 260 265 270 lie lie Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe lie Pro Glu 275 280 285 Asp Pro Arg lie lie Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val 290 295 300 Pro Gly Lys Leu Leu lie lie Gly Gly Gly He He Gly Leu Glu Met 305 310 315 320 Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met 325 330 335 Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp 340 345 350 Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn lle Met Val Asn Thr Lys 355 360 365 Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu 370 375 380 Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val 385 390 395 400 Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu lle Ser Ala Glu Lys Ala 405 410 415 Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe lle Glu Val Asp Lys Gln Met 420 425 430 Arg Thr Asn Val Pro His lle Tyr Ala lle Gly Asp lle Val Gly Gln 435 440 445 Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu 450 455 460 Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val lle Pro Gly 465 470 475 480 Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu 485 490 495 Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys lle Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp 500 505 510 Ala Ala Ser Gly Arg Ala lle Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr 515 520 525 Lys Leu lle Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg lle lle Gly Gly Gly lle 530 535 540 Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met lle Gly Glu Val Cys Leu Ala lle 545 550 555 560 Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp lle Gly Lys Thr lle His Pro His 565 570 575 Pro Gly Glu Ser lle Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys 580 585 590 Thr Asp Leu Pro Pro GIn Lys Lys Lys Gly SerArg Leu Arg Met Asp 595 600 605 Lys Leu GIn Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe 610 615 620 Lys lie Val Lys Glu He Ala Glu Thr GIn His Gly Thr lie Val lie 625 630 635 640 Arg Val GIn Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys lie Pro Phe Glu 645 650 655 lie Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu lie Thr Val 660 665 670 Asn Pro He Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn lie Glu Ala Glu 675 680 685 Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr lie lie lie Gly Val Glu Pro Gly GIn 690 695 700 Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser lie Gly GIn Met Phe 705 710 715 720 Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala lie Leu Gly Asp Thr 725 730 735 Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly 740 745 <210> 32 <211> 429 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(429) <223> Secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos del 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-1 <400> 32 agactaaaaa tggataaact gactttaaaa ggggtatcat atgtaatgtg cacagggtca 60 ttcaagttag agaaggaagt ggctgagacc cagcatggaa ctgttctagt gcaggttaaa 20 tacgaaggaa cagatgcacc atgcaagatc cccttctcgt cccaagatga gaaaggagta 180 acccagaatg ggagattgat aacagccaac cccatagtca ttgacaaaga aaaaccagtc 240 aacattgaag cggagccacc ttttggtgag agctatattg tggtaggagc aggtgaaaaa 300 gctttgaaac taagctggtt caagaaggga agcagtatag ggaaaatgtt tgaagcaact 360 gcccgtggag cacgaaggat ggccatcctg ggagacaccg catgggactt cggttctata 420 ggagggtaa 429 <210> 33 <211> 615 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1 )..(615) <223> Secuencia nucleotídica codificante para la proteína quimérica en el plasmidio pLH1 <400> 33 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 20 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180 aggctcaaaa tggataaact gactttaaaa ggggtatcat atgtaatgtg cacagggtca 240 ttcaagttag agaaggaagt ggctgagacc cagcatggaa ctgttctagt gcaggttaaa 300 tacgaaggaa cagatgcacc atgcaagatc cccttctcgt cccaagatga gaaaggagta 360 acccagaatg ggagattgat aacagccaac cccatagtca ttgacaaaga aaaaccagtc 420 aacattgaag cggagccacc ttttggtgag agctatattg tggtaggagc aggtgaaaaa 480 gctttgaaac taagctggtt caagaaggga agcagtatag ggaaaatgtt tgaagcaact 540 gcccgtggag cacgaaggat ggccatcctg ggagacaccg catgggactt cggttctatt 600 ggcgggtaag gatee 615 <210> 34 <21 1> 174 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1 )..(174) <223> Secuencia aminoacídica correspondiente a la proteína PLH1 <400> 34 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp lie Gly Gly His Glu Asn Val Asp lie lie Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr lie Ala Val Asp Asp Thr Leu lie 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln 50 . 55 60 His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Gln Gly Thr Asp Ala Pro 65 70 75 80 Cys Lys lie Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn 85 90 95 Arg Leu lie Thr Ala Asn Pro lie Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val 100 105 110 Asn He Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr lie Val Val Gly 1 15 120 125 Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Gln Cys Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser 130 135 140 lie Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala 145 150 155 160 lie Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser lie Gly Gly 165 170 <210> 35 <21 1 > 2253 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1 )..(2253) <223> Secuencia nucleotídica codificante para la proteína quimérica en el plasmidio pLH2 <400> 35 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 20 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180 aggctcaaaa tggataaact gactttaaaa ggggtatcat atgtaatgtg cacagggtca 240 ttcaagttag agaaggaagt ggctgagacc cagcatggaa ctgttctagt gcaggttaaa 300 tacgaaggaa cagatgcacc atgcaagatc cccttctcgt cccaagatga gaaaggagta 360 acccagaatg ggagattgat aacagccaac cccatagtca ttgacaaaga aaaaccagtc 420 aacattgaag cggagccacc ttttggtgag agctatattg tggtaggagc aggtgaaaaa 480 gctttgaaac taagctggtt caagaaggga agcagtatag ggaaaatgtt tgaagcaact 540 gcccgtggag cacgaaggat ggccatcctg ggagacaccg catgggactt cggatctata 600 ggaggggtga attcgatgaa ttcgatggac gtacctgctg aagttgcagg cgtagtcaaa 660 gaagttaaag ttaaagtcgg cgacaaaatc tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720 gctgaaggca cggcagccgc tcctaaagcc gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780 cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc gcgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840 tacgacgtgg tcgtattggg tggcggtccc ggcggttact ccgctgcatt tgccgctgcc 900 gatgaaggct tgaaagtcgc catcgtcgaa cgttacaaaa ctttgggcgg cgtttgcctg 960 aacgtcggct gtatcccttc caaagccttg ttgcacaatg ccgccgttat cgacgaagtg 1020 cgccacttgg ctgccaacgg tatcaaatac cccgagccgg aactcgacat cgatatgctt 1080 cgcgcctaca aagacggcgt agtttcccgc ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 1140 agccgtaaag tggacgttat ccaaggcgac gggcaattct tagatccgca ccacttggaa 1200 gtgtcgctga ctgccggcga cgcgtacgaa caggcagccc ctaccggcga gaaaaaaatc 1260 gttgccttca aaaactgtat cattgcagca ggcagccgcg taaccaaact gcctttcatt 1320 cctgaagatc cgcgcatcat cgattccagc ggcgcattgg ctctgaaaga agtaccgggc 1380 aaactgctga ttatcggcgg cggcattatc ggcctcgaga tgggtacggt ttacagcacg 1440 ctgggttcgc gtttggatgt ggttgaaatg atggacggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 1500 gatttggtaa aagtatggca aaaacaaaac gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560 accaaaaccg ttgcagttga gccgaaagaa gacggcgttt acgttacctt tgaaggcgcg 1620 aacgcgccta aagagccgca acgctacgat gccgtattgg ttgccgccgg ccgcgcgccc 1680 aacggcaaac tcatcagcgc ggaaaaagca ggcgttgccg taaccgatcg cggcttcatc 1740 gaagtggaca aacaaatgcg taccaatgtg ccgcacatct acgccatcgg cgacatcgtc 800 ggtcagccga tgttggcgca caaagccgtt cacgaaggcc acgttgccgc cgaaaactgc 1860 gccggccaca aagcctactt cgacgcacgc gtgattccgg gcgttgccta cacttccccc 920 gaagtggcgt gggtgggcga aaccgaactg tccgccaaag cctccggccg caaaatcacc 1980 aaagccaact tcccgtgggc ggcttccggc cgtgcgattg ccaacggttg cgacaagccg 2040 tttaccaagc tgatttttga tgccgaaacc ggccgcatca tcggcggcgg cattgtcggt 2100 ccgaacggtg gcgatatgat cggcgaagtc tgccttgcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160 gcagacatcg gcaaaaccat ccacccgcac ccgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa 2220 gtggcattgg gtacttgtac cgacaaaaaa aaa 2253 <210> 36 <211> 727 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1)..(727) <223> Secuencia aminoacídica correspondiente a la proteína PLH2 <400> 36 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp lie Gly Gly His Glu Asn Val Asp lie lie Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Me Ala Val Asp Asp Thr Leu lie 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln 50 55 60 His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Gln Gly Thr Asp Ala Pro 65 70 75 80 Cys Lys lie Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn 85 90 95 Arg Leu lie Thr Ala Asn Pro lie Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val 100 105 1 10 Asn lie Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr lie Val Val Gly 115 120 125 Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Gln Cys Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser 130 135 140 lie Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala 145 150 155 160 lie Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser lie Gly Gly Val Asn 165 170 175 Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val Val Lys 180 185 190 Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys lie Ser Glu Gly Gly Leu lie 195 200 205 Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala Glu Ala 210 215 220 Ala Ala Ala Pro Ala GIn Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro Ala Pro 225 230 235 240 GIn Ala Ala GIn Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp Val Val 245 250 255 Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala Ala Ala 260 265 270 Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala He Val Glu Arg Tyr Lys Thr Leu Gly 275 280 285 Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys He Pro Ser Lys Ala Leu Leu His 290 295 300 Asn Ala Ala Val lie Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn Gly lie 305 310 315 320 Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp lie Asp Met Leu Arg Ala Tyr Lys 325 330 335 Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys 340 345 350 Ser Arg Lys Val Asp Val lie GIn Gly Asp Gly GIn Phe Leu Asp Pro 355 360 365 His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu GIn Ala 370 375 380 Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys lie Val Ala Phe Lys Asn Cys lie lie 385 390 395 400 Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe lie Pro Glu Asp Pro 405 410 415 Arg lie lie Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val Pro Gly 420 425 430 Lys Leu Leu lie lie Gly Gly Gly lie lie Gly Leu Glu Met Gly Thr 435 440 445 Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met Met Asp 450 455 460 Giy Leu Met GIn Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp GIn Lys 465 470 475 480 GIn Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn lie Met Val Asn Thr Lys Thr Val 485 490 495 Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu Gly Ala 500 505 510 Asn Ala Pro Lys Glu Pro GIn Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ala 515 520 525 Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu lie Ser Ala Glu Lys Ala Gly Val 530 535 540 Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe lie Glu Val Asp Lys GIn Met Arg Thr 545 550 555 560 Asn Val Pro His lie Tyr Ala He Gly Asp lie Val Gly GIn Pro Met 565 570 575 Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Asn Cys 580 585 590 Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val He Pro Gly Val Ala 595 600 605 Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu Ser Ala 610 615 620 Lys Ala Ser Gly Arg Lys lie Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp Ala Ala 625 630 635 640 Ser Gly Arg Ala lie Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr Lys Leu 645 650 655 lie Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg lie lie Gly Gly Gly lie Val Gly 660 665 670 Pro Asn Gly Gly Asp Met lie Gly Glu Val Cys Leu Ala lie Glu Met 675 680 685 Gly Cys Asp Ala Ala Asp lie Gly Lys Thr lie His Pro His Pro Gly 690 695 700 Glu Ser lie Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys Thr Asp 705 710 715 720 Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys 725 <210> 37 <211> 2250 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221 > gene <222> (1 )..(2250) <223> Secuencia nucleotídica codificante para la proteína quimérica en el plasmidio pLH3 <400> 37 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180 gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240 ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300 gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360 ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420 tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480 aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540 aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600 ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660 ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720 ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780 gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840 cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900 ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960 gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020 , ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080 cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 140 gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200 ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260 gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320 atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380 ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500 aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620 atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680 gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740 ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800 ccgcaaaaga aaaaaggatc cagactaaaa atggataaac tgactttaaa aggggtatca 1860 tatgtaatgt gcacagggtc attcaagtta gagaaggaag tggctgagac ccagcatgga 1920 actgttctag tgcaggttaa atacgaagga acagatgcac catgcaagat ccccttctcg 1980 tcccaagatg agaaaggagt aacccagaat gggagattga taacagccaa ccccatagtc 2040 attgacaaag aaaaaccagt caacattgaa gcggagccac cttttggtga gagctatatt 2100 gtggtaggag caggtgaaaa agctttgaaa ctaagctggt tcaagaaggg aagcagtata 2160 gggaaaatgt ttgaagcaac tgcccgtgga gcacgaagga tggccatcct gggagacacc 2220 gcatgggact tcggttctat aggtgggtaa 2250 <210> 38 <21 1> 724 <212> PRT <2 3> Escherichia coli <220> <221 > CHAIN <222> (1 )..(724) <223> Secuencia aminoacídica correspondiente a la proteína PLH3 <400> 38 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp He Gly Gly His Glu Asn Val Asp lie lie Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr lie Ala Val Asp Asp Thr Leu lie 35 40 45 Thr Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val 50 55 60 Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys He Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Leu lie 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He Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly 705 710 715 720 Ser lie Gly Gly <210> 39 <211> 426 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1 )..(426) <223> Secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos del 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-3 <400> 39 agactcaaga tggacaaatt gaaactcaag gggatgagct atgcaatgtg cttgaatacc 60 tttgtgttga agaaagaagt ctccgaaacg cagcatggga caatactcat taaggttgag 120 tacaaagggg aagatgcacc ctgcaagatt cctttctcca cggaggatgg acaagggaaa 180 gctcacaatg gcagactgat cacagccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 240 aacattgagg ctgaacctcc ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 300 gccctgaaaa tcaactggta caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccact 360 gccagaggíg caaggcgcaí ggccafctfg ggagacacag cctgggacít tggaícagíg 420 ggtggt 426 <210> 40 <21 1> 615 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221 > gene <222> (1)..(615) <223> Secuencia nucleotídica codificante para la proteína quimérica en el plasmidio pAZ1 <400> 40 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagat 180 agactcaaga tggacaaatt gaaactcaag gggatgagct atgcaatgtg cttgaatacc 240 tttgtgttga agaaagaagt ctccgaaacg cagcatggga caatactcat taaggttgag 300 tacaaagggg aagatgcacc ctgcaagatt cctttctcca cggaggatgg acaagggaaa 360 gctcacaatg gcagactgat cacagccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 420 aacattgagg ctgaacctcc ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 480 gccctgaaaa tcaactggta caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccact 540 gccagaggtg caaggcgcat ggccatcttg ggagacacag cctgggactt tggttcagtg 600 ggtggttaag gatee 615 <210> 41 <21 1> 194 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1 )..(194) <223> Secuencia aminoacídica correspondiente a la proteína PAZ1 <400> 41 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp lie Gly Gly His Glu Asn Val Asp lie lie Ala 20 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gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagat 180 agactcaaga tggacaaatt gaaactcaag gggatgagct atgcaatgtg cttgaatacc 240 tttgtgttga agaaagaagt ctccgaaacg cagcatggga caatactcat taaggttgag 300 tacaaagggg aagatgcacc ctgcaagatt cctttctcca cggaggatgg acaagggaaa 360 gctcacaatg gcagactgat cacagccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 420 aacattgagg ctgaacctcc ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 480 gccctgaaaa tcaactggta caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccact 540 gccagaggtg caaggcgcat ggccatcttg ggagacacag cctgggactt tggatctgtg 600 ggtggtgtga attcgatgaa ttcgatggac gtacctgctg aagttgcagg cgtagtcaaa 660 gaagttaaag ttaaagtcgg cgacaaaatc tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720 gctgaaggca cggcagccgc tcctaaagcc gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780 cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc gcgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840 tacgacgtgg tcgtattggg tggcggtccc ggcggttact ccgctgcatt tgccgctgcc 900 gatgaaggct tgaaagtcgc catcgtcgaa cgttacaaaa ctttgggcgg cgtttgcctg 960 aacgtcggct gtatcccttc caaagccttg ttgcacaatg ccgccgttat cgacgaagtg 1020 cgccacttgg ctgccaacgg tatcaaatac cccgagccgg aactcgacat cgatatgctt 1080 cgcgcctaca aagacggcgt agtttcccgc ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 1 40 agccgtaaag tggacgttat ccaaggcgac gggcaattct tagatccgca ccacttggaa 200 gtgtcgctga ctgccggcga cgcgtacgaa caggcagccc ctaccggcga gaaaaaaatc 1260 gttgccttca aaaactgtat cattgcagca ggcagccgcg taaccaaact gcctttcatt 1320 cctgaagatc cgcgcatcat cgattccagc ggcgcattgg ctctgaaaga agtaccgggc 1380 aaactgctga ttatcggcgg cggcattatc ggcctcgaga tgggtacggt ttacagcacg 1440 ctgggttcgc gtttggatgt ggttgaaatg atggacggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 500 gatttggtaa aagtatggca aaaacaaaac gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560 accaaaaccg ttgcagttga gccgaaagaa gacggcgttt acgttacctt tgaaggcgcg 620 aacgcgccta aagagccgca acgctacgat gccgtattgg ttgccgccgg ccgcgcgccc 1680 aacggcaaac tcatcagcgc ggaaaaagca ggcgttgccg taaccgatcg cggcttcatc 740 gaagtggaca aacaaatgcg taccaatgtg ccgcacatct acgccatcgg cgacatcgtc 800 ggtcagccga tgttggcgca caaagccgtt cacgaaggcc acgttgccgc cgaaaactgc 860 gccggccaca aagcctactt cgacgcacgc gtgattccgg gcgttgccta cacttccccc 1920 gaagtggcgt gggtgggcga aaccgaactg tccgccaaag cctccggccg caaaatcacc 1980 aaagccaact tcccgtgggc ggcttccggc cgtgcgattg ccaacggttg cgacaagccg 2040 tttaccaagc tgatttttga tgccgaaacc ggccgcatca tcggcggcgg cattgtcggt 2100 ccgaacggtg gcgatatgat cggcgaagtc tgccttgcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160 gcagacatcg gcaaaaccat ccacccgcac ccgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa 2220 gtggcattgg gtacttgtac cgacaaaaaa aaa 2253 <210> 43 v <211> 747 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221 > CHAIN <222> (1 )..(747) <223> Secuencia aminoacídica correspondiente a la proteína PAZ2 <400> 43 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp lie Gly Gly His Glu Asn Val Asp lie He Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr lie Ala Val Asp Asp Thr Leu lie 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly 50 55 60 Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val 65 70 75 80 Ser Glu Thr His Gly Thr lie Leu lie Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu 85 90 95 Asp Ala Pro Cys Lys lie Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly GIn Gly Lys 100 105 110 Ala His Asn Gly Arg Leu lie Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys 115 120 125 Glu Glu Pro Val Asn lie Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn 130 135 140 He Val lie Gly lie Gly Asp Lys Ala Leu Lys lie Asn Trp Tyr Arg 145 150 155 160 Lys Gly Ser Ser lie Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala 165 170 175 Arg Arg Met Ala lie Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val 180 185 190 Gly Gly Val Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala 195 200 205 Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys lie Ser Glu 210 215 220 Gly Gly Leu lie Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro 225 230 235 240 Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala GIn Glu Ala Pro Lys Ala Ala 245 250 255 Ala Pro Ala Pro 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tgggtggcgg tcccggcggt 420 tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480 aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540 aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600 ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660 ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720 ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780 gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840 cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900 ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960 gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020 ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080 cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140 gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200 ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260 gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320 atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380 ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440 ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500 aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620 atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680 gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740 ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800 ccgcaaaaga aaaaaggatc cagactcaag atggacaaat tgaaactcaa ggggatgagc 1860 tatgcaatgt gcttgaatac ctttgtgttg aagaaagaag tctccgaaac gcagcatggg 1920 acaatactca ttaaggttga gtacaaaggg gaagatgcac cctgcaagat tcctttctcc 1980 acggaggatg gacaagggaa agctcacaat ggcagactga tcacagccaa tccagtggtg 2040 accaagaagg aggagcctgt caacattgag gctgaacctc cttttgggga aagtaatata 2100 gtaattggaa ttggagacaa agccctgaaa atcaactggt acaggaaggg aagctcgatt 2160 gggaagatgt tcgaggccac tgccagaggt gcaaggcgca tggccatctt gggagacaca 2220 gcctgggact ttggttcagt gggtggttaa ggatcc 2256 <210> 45 <211> 744 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1 )..(744) <223> Secuencia aminoacídica correspondiente a PAZ3 <400> 45 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp lie Gly Gly His Glu Asn Val Asp He lie Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr lie Ala Val Asp Asp Thr Leu lie 35 40 45 Thr Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val 50 55 60 Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys lie Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Leu lie Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala 85 90 95 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala GIn Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro 100 105 110 Ala Pro GIn Ala Ala GIn Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp 115 120 125 Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala 130 135 140 Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala lie Val Glu Arg Tyr Lys Thr 145 150 155 160 Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys lie P.ro Ser Lys Ala Leu 165 170 175 Leu His Asn Ala Ala Val He Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn 180 185 190 Gly lie Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp lie Asp Met Leu Arg Ala 195 200 205 Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met 210 215 220 Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val He GIn Gly Asp Gly GIn Phe Leu 225 230 235 240 Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu 245 250 255 GIn Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys He Val Ala Phe Lys Asn Cys 260 265 270 lie lie Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe lie Pro Glu 275 280 285 Asp Pro Arg lie He Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val 290 295 300 Pro Gly Lys Leu Leu He lie Gly Gly Gly lie lie Gly Leu Glu Met 305 310 315 320 Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met 325 330 335 Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val 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Secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos del 286 al 426 de la proteína de la envoltura del virus DEN-4 <400> 46 aaagtccgta tggagaaatt gagaatcaag ggaatgtcat acacgatgtg ttcaggaaag 60 ttttcaattg acaaagagat ggcagaaaca cagcatggga caacagtggt gaaagtcaag 120 tatgaaggtg ctggagctcc gtgtaaagtc cccatagaga taagagatgt aaacaaggaa 180 aaagtggttg ggcgtatcat ctcatccacc cctttggctg agaataccaa cagtgtaacc 240 aacatagaat tagaaccccc ctttggggac agctacatag tgataggtgt tggaaacagc 300 gcattaacac tccattggtt caggaaaggg agttccattg gcaagatgtt tgagtccaca 360 tacagaggtg caaaacgaat ggccattcta ggtgaaacag cttgggattt tggttccgtt 420 ggtgga 426 <210> 47 <21 1 > 615 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1 )..(615) <223> Secuencia nucleotídica codificante para la proteína quimérica en el plasmidio plD1 <400> 47 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 20 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180 aaagtgcgta tggagaaatt gagaatcaag ggaatgtcat acacgatgtg ttcaggaaag 240 ttttcaattg acaaagagat ggcagaaaca cagcatggga caacagtggt gaaagtcaag 300 tatgaaggtg ctggagctcc gtgtaaagtc cccatagaga taagagatgt aaacaaggaa 360 aaagtggttg ggcgtatcat ctcatccacc cctttggctg agaataccaa cagtgtaacc 420 aacatagaat tagaaccccc ctttggggac agctacatag tgataggtgt tggaaacagc 480 gcattaacac tccattggtt caggaaaggg agttccattg gcaagatgtt tgagtccaca 540 tacagaggtg caaaacgaat ggccattcta ggtgaaacag cttgggattt tggttccgtt 600 ggtggataag gatee 615 <210> 48 <211> 192 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1 )..(192) <223> Secuencia aminoacídica correspondiente a la proteína PID1 <400> 48 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp lle Gly Gly His Glu Asn Val Asp lle lle Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr lle Ala Val Asp Asp Thr Leu lle 35 40 45 Thr Leu Asp Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg lle Lys Gly Met Ser 50 55 60 Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser lle Asp Lys Glu Met Ala Glu 65 70 75 80 Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly 85 90 95 Ala Pro Cys Lys Val Pro lle Glu lle Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys 100 105 110 Val Val Gly Arg lle lle Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn 115 120 125 Ser Val Thr Asn lle Glu Leu Glu Arg Pro Leu Asp Ser Tyr lle Val 130 135 140 lle Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly 145 150 155 160 Ser Ser lle Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg 165 170 175 Met Ala He Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly 180 185 190 <210> 49 <211 > 2241 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1 )..(2241 ) <223> Secuencia nucleotídica codificante para la proteína quimérica en el plasmidio plD2 <400> 49 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 20 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagacaa agtccgtatg 180 gagaaattga gaatcaaggg aatgtcatac acgatgtgtt caggaaagtt ttcaattgac 240. aaagagatgg cagaaacaca gcatgggaca acagtggtga aagtcaagta tgaaggtgct 300 ggagctccgt gtaaagtccc catagagata agagatgtaa acaaggaaaa agtggttggg 360 cgtatcatct catccacccc tttggctgag aataccaaca gtgtaaccaa catagaatta 420 gaacccccct ttggggacag ctacatagtg ataggtgttg gaaacagcgc attaacactc 480 cattggttca ggaaagggag ttccattggc aagatgtttg agtccacata cagaggtgca 540 aaacgaatgg ccattctagg tgaaacagct tgggattttg gtagcgttgg tggactgaat 600 tcgatgaatt cgatggacgt acctgctgaa gttgcaggcg tagtcaaaga agttaaagtt 660 aaagtcggcg acaaaatctc tgaaggtggt ttgattgtcg tcgttgaagc tgaaggcacg 720 gcagccgctc ctaaagccga agcggctgcc gccccggcgc aagaagcccc taaagctgcc 780 gctcctgctc cgcaagccgc gcaattcggc ggttctgccg atgccgagta cgacgtggtc 840 gtattgggtg gcggtcccgg cggttactcc gctgcatttg ccgctgccga tgaaggcttg 900 aaagtcgcca tcgtcgaacg ttacaaaact ttgggcggcg tttgcctgaa cgtcggctgt 960 atcccttcca aagccttgtt gcacaatgcc gccgttatcg acgaagtgcg ccacttggct 1020 gccaacggta tcaaataccc cgagccggaa ctcgacatcg atatgcttcg cgcctacaaa 1080 gacggcgtag tttcccgcct cacgggcggt ttggcaggta tggcgaaaag ccgtaaagtg 1140 gacgttatcc aaggcgacgg gcaattctta gatccgcacc acttggaagt gtcgctgact 1200 gccggcgacg cgtacgaaca ggcagcccct accggcgaga aaaaaatcgt tgccttcaaa 1260 aactgtatca ttgcagcagg cagccgcgta accaaactgc ctttcattcc tgaagatccg 1320 cgcatcatcg attccagcgg cgcattggct ctgaaagaag taccgggcaa actgctgatt 1380 atcggcggcg gcattatcgg cctcgagatg ggtacggttt acagcacgct gggttcgcgt 1440 ttggatgtgg ttgaaatgat ggacggcctg atgcaaggcg cagaccgcga tttggtaaaa 1500 gtatggcaaa aacaaaacga ataccgtttt gacaacatta tggtcaacac caaaaccgtt 1560 gcagttgagc cgaaagaaga cggcgtttac gttacctttg aaggcgcgaa cgcgcctaaa 1620 gagccgcaac gctacgatgc cgtattggtt gccgccggcc gcgcgcccaa cggcaaactc 1680 atcagcgcgg aaaaagcagg cgttgccgta accgatcgcg gcttcatcga agtggacaaa 1740 caaatgcgta ccaatgtgcc gcacatctac gccatcggcg acatcgtcgg tcagccgatg 800 ttggcgcaca aagccgttca cgaaggccac gttgccgccg aaaactgcgc cggccacaaa 1860 gcctacttcg acgcacgcgt gattccgggc gttgcctaca cttcccccga agtggcgtgg 1920 gtgggcgaaa ccgaactgtc cgccaaagcc tccggccgca aaatcaccaa agccaacttc 1980 ccgtgggcgg cttccggccg tgcgattgcc aacggttgcg acaagccgtt taccaagctg 2040 atttttgatg ccgaaaccgg ccgcatcatc ggcggcggca ttgtcggtcc gaacggtggc 2100 gatatgatcg gcgaagtctg ccttgccatc gaaatgggct gcgacgcggc agacatcggc 2160 aaaaccatcc acccgcaccc gggcgaatcc atcggtatgg cggcggaagt ggcattgggt 2220 acttgtaccg acaaaaaaaa a 2241 <210> 50 <21 1> 747 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1 )..(747) <223> Secuencia aminoacídica correspondiente a la proteína PID2 <400> 50 His His His His Hls His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp He Gly Gly His Glu Asn Val Asp lie lie Ala . 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr lie Ala Val Asp Asp Thr Leu lie 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg lie Lys Gly 50 55 60 Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser lie Asp Lys Glu Met 65 70 75 80 Ala Glu Thr Gln His Gly 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agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600 ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660 ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720 ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780 gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840 cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900 ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960 gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020 ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080 cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140 gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200 ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260 gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320 atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 380 ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 440 ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500 aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560 attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620 atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680 gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740 ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800 ccgcaaaaga aaaaaggatc caaagtgcgt atggagaaat tgagaatcaa gggaatgtca 1860 tacacgatgt gttcaggaaa gttttcaatt gacaaagaga tggcagaaac acagcatggg 1920 acaacagtgg tgaaagtcaa gtatgaaggt gctggagctc cgtgtaaagt ccccatagag 1980 ataagagatg taaacaagga aaaagtggtt gggcgtatca tctcatccac ccctttggct 2040 gagaatacca acagtgtaac caacatagaa ttagaacccc cctttgggga cagctacata 2 00 gtgataggtg ttggaaacag cgcattaaca ctccattggt tcaggaaagg gagttccatt 2160 ggcaagatgt ttgagtccac atacagaggt gcaaaacgaa tggccattct aggtgaaaca 2220 gcttgggatt ttggttcggt tggtggctaa ggatcc <210> 52 <211> 744 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1 )..(744) <223> Secuencia aminoacídica correspondiente a PID3 <400> 52 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp lie Gly Gly His Glu Asn Val Asp lie lie Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr lie Ala Val Asp Asp Thr Leu lie 35 40 45 Thr Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val 50 55 60 Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys lie Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Leu lie Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala 85 90 95 Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala GIn Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro 100 105 1 10 Ala Pro GIn Ala Ala GIn Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp 1 15 120 125 Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala 130 135 140 Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala lie Val Glu Arg Tyr Lys Thr 145 150 155 160 Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys lle Pro Ser Lys Ala Leu 165 170 175 Leu His Asn Ala Ala Val lle Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn 180 185 190 Gly lle Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp lle Asp Met Leu Arg Ala 195 200 205 Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met 210 215 220 Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val lle Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu 225 230 235 240 Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu 245 250 255 Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys lle Val Ala Phe Lys Asn Cys 260 265 270 lle lle Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe lle Pro Glu 275 280 285 Asp Pro Arg lle lle Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val 290 295 300 Pro Gly Lys Leu Leu lle lle Gly Gly Gly lle lle Gly Leu Glu Met 305 310 315 320 Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met 325 330 335 Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp 340 345 350 Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn lle Met Val Asn Thr Lys 355 360 365 Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu 370 375 380 Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val 385 390 395 400 Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu lie Ser Ala Glu Lys Ala 405 410 415 Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe lie Glu Val Asp Lys GIn Met 420 425 430 Arg Thr Asn Val Pro His He Tyr Ala lie Gly Asp lie Val Gly GIn 435 440 445 Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu 450 455 460 Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val lie Pro Gly 465 47? 475 480 Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu 485 490 495 Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys lie Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp 500 505 510 Ala Ala Ser Gly Arg Ala lie Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr 515 520 525 Lys Leu He Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg lie lie Gly Gly Gly lie 530 535 540 Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met lie Gly Glu Val Cys Leu Ala lie 545 550 555 560 Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp lie Gly Lys Thr lie His Pro His 565 570 575 Pro Gly Glu Ser lie Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys 580 585 590 Thr Asp Leu Pro Pro GIn Lys Lys Lys Gly Ser Lys Val Arg Met Glu 595 600 605 Lys Leu Arg lie Lys Gly Met SerTyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe 610 615 620 Ser lie Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly ThrThrVal Val 625 630 635. 640 Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro lie Glu 645 650 655 lie Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg lie lie Ser Ser 660 665 670 Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn lie Glu Leu Glu 675 680 685 Arg Pro Leu Asp Ser Tyr lie Val lie Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu 690 695 700 Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser lie Gly Lys Met Phe Glu 705 710 715 720 Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala lie Leu Gly Glu Thr Ala 725 730 735 Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly 740 <210> 53 <21 1 > 2694 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1 )..(2694) <223> Secuencia nucleotídica codificante para la proteina quimérica en el plasmidio PD4D2 <400> 53 atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60 aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120 ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagacaa agtccgtatg 80 gagaaattga gaatcaaggg aatgtcatac acgatgtgtt caggaaagtt ttcaattgac 240 aaagagatgg cagaaacaca gcatgggaca acagtggtga aagtcaagta tgaaggtgct 300 ggagctccgt gtaaagtccc catagagata agagatgtaa acaaggaaaa agtggttggg 360 cgtatcatct catccacccc tttggctgag aataccaaca gtgtaaccaa catagaatta 420 gaacccccct ttggggacag ctacatagtg ataggtgttg gaaacagcgc attaacactc 480 cattggttca ggaaagggag ttccattggc aagatgtttg agtccacata cagaggtgca 540 aaacgaatgg ccattctagg tgaaacagct tgggattttg gttccgttgg tggtcttcta 600 gaaatggacg tacctgctga agttgcaggc gtagtcaaag aagttaaagt taaagtcggc 660 gacaaaatct ctgaaggtgg tttgattgtc gtcgttgaag ctgaaggcac ggcagccgct 720 cctaaagccg aagcggctgc cgccccggcg caagaagccc ctaaagctgc cgctcctgct 780 ccgcaagccg cgcaattcgg cggttctgcc gatgccgagt acgacgtggt cgtattgggt 840 ggcggtcccg gcggttactc cgctgcattt gccgctgccg atgaaggctt gaaagtcgcc 900 atcgtcgaac gttacaaaac tttgggcggc gtttgcctga acgtcggctg tatcccttcc 960 aaagccttgt tgcacaatgc cgccgttatc gacgaagtgc gccacttggc tgccaacggt 1020 atcaaatacc ccgagccgga actcgacatc gatatgcttc gcgcctacaa agacggcgta 1080 gtttcccgcc tcacgggcgg tttggcaggt atggcgaaaa gccgtaaagt ggacgttatc 1140 caaggcgacg ggcaattctt agatccgcac cacttggaag tgtcgctgac tgccggcgac 1200 gcgtacgaac aggcagcccc taccggcgag aaaaaaatcg ttgccttcaa aaactgtatc 1260 attgcagcag gcagccgcgt aaccaaactg cctttcattc ctgaagatcc gcgcatcatc 1320 gattccagcg gcgcattggc tctgaaagaa gtaccgggca aactgctgat tatcggcggc 1380 ggcattatcg gcctcgagat gggtacggtt tacagcacgc tgggttcgcg tttggatgtg 1440 gttgaaatga tggacggcct gatgcaaggc gcagaccgcg atttggtaaa agtatggcaa 1500 aaacaaaacg aataccgttt tgacaacatt atggtcaaca ccaaaaccgt tgcagttgag 1560 ccgaaagaag acggcgttta cgttaccttt gaaggcgcga acgcgcctaa agagccgcaa 1620 cgctacgatg ccgtattggt tgccgccggc cgcgcgccca acggcaaact catcagcgcg 1680 gaaaaagcag gcgttgccgt aaccgatcgc ggcttcatcg aagtggacaa acaaatgcgt 1740 accaatgtgc cgcacatcta cgccatcggc gacatcgtcg gtcagccgat gttggcgcac 1800 aaagccgttc acgaaggcca cgttgccgcc gaaaactgcg ccggccacaa agcctacttc 1860 gacgcacgcg tgattccggg cgttgcctac acttcccccg aagtggcgtg ggtgggcgaa 1920 accgaactgt ccgccaaagc ctccggccgc aaaatcacca aagccaactt cccgtgggcg 1980 gcttccggcc gtgcgattgc caacggttgc gacaagccgt ttaccaagct gatttttgat 2040 gccgaaaccg gccgcatcat cggcggcggc attgtcggtc cgaacggtgg cgatatgatc 2100 ggcgaagtct gccttgccat cgaaatgggc tgcgacgcgg cagacatcgg caaaaccatc 2160 cacccgcacc cgaccttggg cgaatccatc ggtatggcgg cggaagtggc attgggtact 2220 tgtaccgacc tgcctccgca aaagaaaaaa ggatccgaca ggctgagaat ggacaaacta 2280 cagctcaaag gaatgtcata ctctatgtgt acaggaaagt ttaaaattgt gaaggaaata 2340 gcagaaacac aacatggaac aatagttatc agagtacaat atgaagggga cggctctcca 2400 tgtaagatcc cttttgagat aatggatttg gaaaaaagac acgtcttagg tcgcctgatt 2460 acagttaacc cgatcgtaac agaaaaagat agcccagtca acatagaagc agaacctcca 2520 ttcggagaca gctacatcat cataggagta gagccgggac aattgaaact caactggttt 2580 aagaaaggaa gttccatcgg ccaaatgttt gagacaacaa tgagaggagc gaagagaatg 2640 gccattttag gtgacacagc ctgggatttt gggtctctgg gtggttaagg atcc 2694 <210> 54 <21 1 > 891 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> CHAIN <222> (1 )..(891) <223> Secuencia aminoacídica correspondiente a PD4D2 <400> 54 His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu 1 5 10 15 Leu Lys Val Pro Asp lie Gly Gly His Glu Asn Val Asp lie lie Ala 20 25 30 Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr lie Ala Va! Asp Asp Thr Leu lie 35 40 45 Thr Leu Asp Leu Asp Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg lie Lys Gly 50 55 60 Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser lie Asp Lys Glu Met 65 70 75 80 Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly 85 90 95 Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro lie Glu lie Arg Asp Val Asn Lys 100 105 1 10 Glu Lys Val Val Gly Arg lie He Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn 115 120 125 Thr Asn Ser Val Thr Asn lie Glu Leu Glu Arg Pro Leu Asp Ser Tyr 130 135 140 lie Val lie Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg 145 150 155 160 Lys Gly Ser Ser lie Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala 165 170 175 Lys Arg Met Ala lie Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val 180 185 190 Gly Gly Leu Leu Glu Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala 195 200 205 Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys He Ser Glu 210 215 220 Gly Gly Leu lie Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro 225 230 235 240 Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala 245 250 255 Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu 260 265 270 Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala 275 280 285 Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala lie Val Glu Arg Tyr 290 295 300 Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys lie Pro Ser Lys 305 310 315 320 Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val lie Asp Glu Val Arg His Leu Ala 325 330 335 Ala Asn Gly lie Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp lie Asp Met Leu 340 345 350 Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala 355 360 365 Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val lie Gln Gly Asp Gly Gln 370 375 380 Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala 385 390 395 400 Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys lie Val Ala Phe Lys 405 410 415 Asn Cys lie lie Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe lie 420 425 430 Pro Glu Asp Pro Arg He lie Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys 435 440 445 Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu lie lie Gly Gly Gly lie lie Gly Leu 450 455 460 Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val 465 470 475 480 Glu Met Met Asp Gly Leu Met GIn Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys 485 490 495 Val Trp GIn Lys GIn Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn lie Met Val Asn 500 505 510 Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr 515 520 525 Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro GIn Arg Tyr Asp Ala Val 530 535 540 Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu He Ser Ala Glu 545 550 555 560 Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe lie Glu Val Asp Lys 565 570 575 GIn Met Arg Thr Asn Val Pro His He Tyr Ala He Gly Asp lie Val 580 585 590 Gly GIn Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala 595 600 605 Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val lie 610 615 620 Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr 625 630 635 640 Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys lie Thr Lys Ala Asn Phe 645 650 655 Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala lie Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro 660 665 670 Phe Thr Lys Leu lie Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg lie lie Gly Gly 675 680 685 _ Gly lie Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met lie Gly Glu Val Cys Leu 690 695 700 Ala lie Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp lie Gly Lys Thr lie His 705 710 715 720 Pro His Pro Gly Glu Ser lie Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly 725 730 . 735 Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro GIn Lys Lys Lys Gly Ser Arg Leu Arg 740 745 750 Met Asp Lys Leu GIn Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr GIy 755 760 765 Lys Phe Lys lie Val Lys Glu lie Ala Glu Thr GIn His Gly Thr lie 770 775 780 Val lie Arg Val GIn Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys lie Pro 785 790 795 800 Phe Glu lie Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu lie 805 810 815 Thr Val Asn Pro He Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn. lie Glu 820 825 830 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr lie lie lie Gly Val Glu Pro 835 840 845 Gly GIn Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser lie Gly GIn 850 855 860 Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala lie Leu Gly 865 870 875 880 Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly 885 890

Claims

160 NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Cadenas nucleotídicas quiméricas caracterizadas por ser la combinación específica de secuencias correspondientes a fragmentos de la proteina E de los Flavivirus, con secuencias correspondientes al gen codificante para la proteína muíante MDH identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.26, Secuencia No.29 o con el fragmento de estas identificado como Secuencia No.23, las cuales codifican para proteínas quiméricas capaces de inducir en el organismo receptor una respuesta inmune de anticuerpos neutralizantes y protectora, contra los Flavivirus, cuando estas proteínas se encuentran presentes en una preparación farmacéutica. 2 - Las cadenas nucleotídicas quiméricas de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizadas además por ser la combinación específica de una o varias de las secuencias que codifican para los aminoácidos 286 al 426 de la proteína E de los virus del Dengue con la secuencia nucleotídica de la proteina MDH, donde dichas secuencias se encuentren insertadas y/o fusionadas con las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.26, Secuencia No.29, o Secuencia No.23, las cuales codifican para proteínas quiméricas capaces de inducir en el organismo receptor una respuesta inmune humoral, neutralizante y protectora serotipo específica contra cada serotipo del virus Dengue. 161 3. - Las cadenas nucleotídicas quiméricas de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas además por estar formadas por las secuencias que codifican para los aminoácidos del 286 al 426 de la proteína E de cada serotipo 1 , 2, 3 y 4 de los virus Dengue, fusionada al extremo 3' de la región que codifica para los primeros 45 aminoácidos de la proteína MDH identificada como Secuencia No.23. 4. - Las cadenas nucleotídicas quiméricas de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas además por estar formadas por las secuencias que codifican para los aminoácidos del 286 al 426 de la proteína E de cada serotipo 1 , 2, 3 y 4 de los virus Dengue, insertada en la región que codifica para el aminoácido 45 en la secuencia nucleotídica de la MDH identificada como Secuencia No. 26. 5. - Las cadenas nucleotídicas quiméricas de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas además por estar formadas por las secuencias que codifican para los aminoácidos del 286 al 426 de la proteína E de cada serotipos 1 , 2, 3 y 4 de los virus Dengue fusionada al extremo 3' de la secuencia que codifica para la proteína MDH identificada como secuencia No. 29. 6 - Las cadenas nucleotídicas quiméricas de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas además por ser la combinación de las secuencias nucleotídicas que codifican para los aminoácidos del 286 al 426 de la proteína E de dos serotipos diferentes del virus Dengue con la secuencia de la MDH, donde una de las secuencias correspondientes a la proteina E está 162 insertada en la región que codifica para el aminoácido 45 de la MDH y la otra está fusionada en la región 3' de la secuencia de la misma MDH identificada como secuencia No. 29. 7. - Proteínas quiméricas recombinantes caracterizadas por ser el producto de expresión de las cadenas nucleotídicas de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 5 y 6, y ser capaces de inducir en el organismo receptor una respuesta inmune humoral, neutralizante y protectora serotipo específica únicamente contra cada serotipo homólogo del virus Dengue, cuando esta proteínas se encuentra presente en una preparación farmacéutica. 8. - Proteínas quiméricas recombinantes caracterizadas por ser el producto de expresión de las cadenas nucleotídicas de las reivindicaciones 1 y 6, y ser capaces de inducir en el organismo receptor una respuesta inmune humoral, neutralizante y protectora específica contra los dos serotipos homólogos del virus Dengue. 9. - La cadena nucleotídica quimérica, identificada esencialmente por la Secuencia No.24, de conformidad con la reivindicación 1 , 2 y 3 caracterizada además por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.22 y Secuencia No.23, la cual codifica para la proteína quimérica PLL1 . 10. - La proteína quimérica PLL1 , de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 y 7 caracterizada además por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.25, ser el producto de expresión de ¡a Secuencia No. 24 y ser 163 capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-2 cuando PLL1 se encuentra presente en una preparación farmacéutica. 11. - La cadena nucleotídica quimérica de conformidad con la reivindicaciones 1 , 2 y 4 identificada esencialmente como Secuencia No.27, caracterizada además por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.22 y Secuencia No.26, la cual codifica para la proteína quimérica PLL2. 12. - La proteína quimérica PLL2, de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada además por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.28, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 27 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-2 cuando PLL2 se encuentra presente en una preparación farmacéutica. 13. - La cadena nucleotídica quimérica de conformidad con la reivindicación 1 , 2 y 5 identificada esencialmente como Secuencia No.30, caracterizada además por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.22 y Secuencia No.29, la cual codifica para la proteína quimérica PLL3. 14. - La protema quimérica PLL3, de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada además por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como 164 Secuencia No.31 , ser el producto de expresión de la Secuencia No. 30 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-2 cuando PLL3 se encuentra presente en una preparación farmacéutica. 15.- La cadena nucleotídica quimérica de conformidad con la reivindicación 1 , 2 y 3 identificada esencialmente como Secuencia No.33, caracterizada además por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.23 y Secuencia No.32, la cual codifica para la proteína quimérica PLH1 . 16.- La proteína quimérica PLH1 , de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada además por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.34, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 33 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-1 cuando PLH1 se encuentra presente en una preparación farmacéutica. 17. - La cadena nucleotídica quimérica de conformidad con la reivindicación 1 , 2 y 4 identificada esencialmente como Secuencia No.35, caracterizada además por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.26 y Secuencia No.32, la cual codifica para la proteína quimérica PLH2. 18. - La proteína quimérica PLH2, de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada además por tener esencialmente la 165 secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.36, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 35 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-1 cuando PLH2 se encuentra presente en una preparación farmacéutica. 19. - La cadena nucleotídica quimérica de conformidad con la reivindicación 1 , 2 y 5 identificada esencialmente como Secuencia No.37, caracterizada además por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.29 y Secuencia No.32, la cual codifica para la proteína quimérica PLH3. 20. - La proteína quimérica PLH3, de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada además por tener esencialmente la secuencia aminoacídica, identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.38,. ser el producto de expresión de la Secuencia No. 37 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-1 cuando PLH3 se encuentra presente en una preparación farmacéutica. 21. - La cadena nucleotídica quimérica de conformidad con la reivindicación 1 , 2 y 3 identificada esencialmente como Secuencia No.40, caracterizada además por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.23 y Secuencia No.39, la cual codifica para la proteína quimérica PAZ1. 22. - La proteína quimérica PAZ1 , de conformidad con las 166 reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada además por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.41 , ser el producto de expresión de la Secuencia No. 40 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-3 cuando PAZ1 se encuentra presente en una preparación farmacéutica. 23.- La cadena nucleotídica quimérica de conformidad con la reivindicación 1 , 2 y 4 identificada esencialmente como Secuencia No.42, caracterizada además por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.26 y Secuencia No.39, la cual codifica para la proteína quimérica PAZ2. 24 - La proteína quimérica PAZ2, de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada además por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.43, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 42 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-3 cuando PAZ2 se encuentra presente en una preparación farmacéutica. 25.- La cadena nucleotídica quimérica de conformidad con la reivindicación 1 , 2 y 5, identificada esencialmente como Secuencia No.44, caracterizada además por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.29 y Secuencia No.39, la cual codifica para la proteína quimérica PAZ3. 167 26. - La proteína quimérica PAZ3, de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada además por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.45, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 44 y ser capaz de inducir en el organismo receptor, una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-3 cuando PAZ3 se encuentra presente en una preparación farmacéutica. 27. - La cadena nucleotídica quimérica de conformidad con la reivindicación 1 , 2 y 3 identificada esencialmente como Secuencia No.47, caracterizada además por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.23 y Secuencia No.46, la cual codifica para la proteína quimérica PID1. 28. - La proteína quimérica PID1 , de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada además por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.48, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 47 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-4 cuando PID1 se encuentra presente en una preparación farmacéutica. 29.- La cadena nucleotídica quimérica de conformidad con la reivindicación 1 , 2 y 4 identificada esencialmente como Secuencia No.49, caracterizada además por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.26 y Secuencia No.46, la cual 168 codifica para la proteína quimérica PID2. 30. - La proteína quimérica PID2, de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada además por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.50, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 49 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus del Dengue-4 cuando PID2 se encuentra presente en una preparación farmacéutica. 31. - La cadena nucleotídica quimérica de conformidad con la reivindicación 1 , 2 y 5, identificada esencialmente como Secuencia No.5 , caracterizada además por ser la combinación de las secuencias identificadas en el listado de secuencias como Secuencia No.29 y Secuencia No.46, la cual codifica para la proteína quimérica PID3. 32. - La proteína quimérica PID3, de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 y 7, caracterizada además por tener esencialmente la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia No.52, ser el producto de expresión de la Secuencia No. 51 y ser capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta humoral, neutralizante y protectora específica contra el virus Dengue-4 cuando PID3 se encuentra presente en una preparación farmacéutica. 33. - Una preparación farmacéutica capaz de inducir en el organismo receptor una respuesta inmune protectora específica contra los virus del Dengue de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada por contener dos 169 o más de las proteínas quiméricas descritas en las reivindicaciones 1 , 2, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32 y un vehículo farmacológico. 34. - La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 33 caracterizada además por ser un agente preventivo o terapéutico contra los virus del Dengue, para uso oral, intramuscular, subcutáneo, mucosal o intravenoso. 35. - Un método diagnóstico caracterizado por contener una o varias de las proteínas descritas en las reivindicaciones 1 , 2, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 y 32 útil para el diagnostico o el serotipaje de los virus del Dengue.