JP2002525651A - 共焦点蛍光顕微鏡のビーム路における光学装置 - Google Patents
共焦点蛍光顕微鏡のビーム路における光学装置Info
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- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
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- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
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Abstract
(57)【要約】
【課題】共焦点蛍光顕微鏡のビーム路中に配置された光学装置を、簡単な構造で蛍光効率を向上させる。
【解決手段】少なくとも１つのレーザ光源（１，２）と、照明/検知ビーム路（３，４，５）に配置され、対象物（７）で反射された励起光（８）を対象物（７）により放射された蛍光光（９）から分離するための分離装置（６）と、分離装置（６）と対象物（７）との間に配置された対物レンズ（１０）と、検知ビーム路（５）中に分離装置（６）に後置された検知器（１１）とを有する光学装置において、分離装置（６）はミラー（１３）を有し、該ミラー（１３）は照明/検知ビーム路（３，４，５）に次のように配置され構成されている、すなわち当該ミラーが、対象物（７）を暗視野照明するために、レーザ光源（１，２）から到来し、拡散されない励起ビームを対物レンズ（１０）へ反射し、対象物（７）から到来した蛍光光（９）を全開口数で、−検知ビーム路（５）で作用するミラー（１３）の横断面積分だけ減少されて−検知器（１１）の方向へ通過させる。
Description
【０００１】
本発明は、共焦点蛍光顕微鏡のビーム路中に配置された光学装置であって、少
なくとも１つのレーザ光源と、照明/検知ビーム路に配置され、対象物で反射さ
れた励起光を対象物により放射された蛍光光から分離するための装置と、前記分
離装置と対象物との間に配置された対物レンズと、検知ビーム路中に前記分離装
置に後置された検知器とを有する光学装置に関する。
なくとも１つのレーザ光源と、照明/検知ビーム路に配置され、対象物で反射さ
れた励起光を対象物により放射された蛍光光から分離するための装置と、前記分
離装置と対象物との間に配置された対物レンズと、検知ビーム路中に前記分離装
置に後置された検知器とを有する光学装置に関する。
【０００２】
実際にはすでに長い間、対象物で反射された励起光を対象物から照射された蛍
光光から分離するために二色性ビームスプリッタを使用することが公知である。
多色を同時に使用する場合には相応に多数の二色性ビームスプリッタを使用する
。反射された励起光を含まない蛍光光は、ビームスプリッタにより分離した後、
別個の検知器により検知される。実際に使用されるビームスプリッタは一般的に
高価である。さらにこのビームスプリッタは、測定ダイナミックスの大きい量的
比較測定を高精度で行う場合には適さない。とりわけこのビームスプリッタは温
度にも依存する。さらに二色性ビームスプリッタは検知器に対して約１０％の透
過損失を有する。
光光から分離するために二色性ビームスプリッタを使用することが公知である。
多色を同時に使用する場合には相応に多数の二色性ビームスプリッタを使用する
。反射された励起光を含まない蛍光光は、ビームスプリッタにより分離した後、
別個の検知器により検知される。実際に使用されるビームスプリッタは一般的に
高価である。さらにこのビームスプリッタは、測定ダイナミックスの大きい量的
比較測定を高精度で行う場合には適さない。とりわけこのビームスプリッタは温
度にも依存する。さらに二色性ビームスプリッタは検知器に対して約１０％の透
過損失を有する。
【０００３】 例えば波長に依存しないビームスプリッタを使用することになれば、コストは
間違いなく低下することとなる。しかしここでの欠点は、励起光の散乱光をその
検知の前に、例えば阻止フィルタを使用して、除去ろ波しなければならないこと
である。このこともまた構造的観点から大がかりであり、再度コストのかかる原
因ともなる。さらにこのことにより蛍光の効率が低下する。しかも多色の同時使
用は不可能である。
間違いなく低下することとなる。しかしここでの欠点は、励起光の散乱光をその
検知の前に、例えば阻止フィルタを使用して、除去ろ波しなければならないこと
である。このこともまた構造的観点から大がかりであり、再度コストのかかる原
因ともなる。さらにこのことにより蛍光の効率が低下する。しかも多色の同時使
用は不可能である。
【０００４】 単純なビームスプリッタを使用すれば、励起光の散乱光反射がレーザ光源に戻
り、そこで行われている誘導放射を妨げる。このことはまた不所望のレーザ光強
度変動として現れる。
り、そこで行われている誘導放射を妨げる。このことはまた不所望のレーザ光強
度変動として現れる。
【０００５】 高解像度の使用に対しては照明ないしスキャンのために全開口数を使用する。
そのため照明フォーカスがラテラル方向に非常に小さくなり、従って比較的に長
い記録時間が必要となる。解像度がそれほど重要でない使用に対しては、この手
法は記録時間が延長されるので不利である。
そのため照明フォーカスがラテラル方向に非常に小さくなり、従って比較的に長
い記録時間が必要となる。解像度がそれほど重要でない使用に対しては、この手
法は記録時間が延長されるので不利である。
【０００６】 共焦点蛍光顕微鏡については単に例として、Engelhardt und Knebel,“Physik
in unserer Zeit”,24.Jahrg.,1993,Nr.2,“Konfokale Laserscanning-Mikrosk
opie”およびD.K.Hamilton und T.Wilson in Appl.Phys.B 27,1982,211-213,“T
hree-Dimensional Surface Measurement Using the Confocal Scanning Microsc
ope”を挙げておく。
in unserer Zeit”,24.Jahrg.,1993,Nr.2,“Konfokale Laserscanning-Mikrosk
opie”およびD.K.Hamilton und T.Wilson in Appl.Phys.B 27,1982,211-213,“T
hree-Dimensional Surface Measurement Using the Confocal Scanning Microsc
ope”を挙げておく。
【０００７】
本発明の課題は、共焦点蛍光顕微鏡のビーム路における光学装置を、従来の二
色性ビームスプリッタを有する上位概念記載の構成体に対して、構造が簡単であ
り蛍光効率が向上されるように構成および改善することである。
色性ビームスプリッタを有する上位概念記載の構成体に対して、構造が簡単であ
り蛍光効率が向上されるように構成および改善することである。
【０００８】
共焦点蛍光顕微鏡のビーム路における本発明の光学装置は、前記の課題を請求
項１の特徴によって解決する。これによれば冒頭に述べた光学装置において、分
離装置はミラーを有し、該ミラーは照明/検知ビーム路に次のように配置され構
成されている、すなわち当該ミラーが、対象物を暗視野照明するために、レーザ
光源から到来し、拡散されない励起ビームを対物レンズへ反射し、対象物から到
来した蛍光光を全開口数で、−検知ビーム路で作用するミラーの横断面積分だけ
減少されて−検知器の方向へ通過させるように配置および構成されていることを
特徴とする。
項１の特徴によって解決する。これによれば冒頭に述べた光学装置において、分
離装置はミラーを有し、該ミラーは照明/検知ビーム路に次のように配置され構
成されている、すなわち当該ミラーが、対象物を暗視野照明するために、レーザ
光源から到来し、拡散されない励起ビームを対物レンズへ反射し、対象物から到
来した蛍光光を全開口数で、−検知ビーム路で作用するミラーの横断面積分だけ
減少されて−検知器の方向へ通過させるように配置および構成されていることを
特徴とする。
【０００９】 本発明では、分離装置はミラーを有し、該ミラーは照明/検知ビーム路に次の
ように配置され構成されている、すなわち当該ミラーが、対象物を暗視野照明す
るために、レーザ光源から到来し、拡散されない励起ビームを対物レンズへ反射
し、対象物から（放射されて）到来した蛍光光を全開口数で、−（但し、検知ビ
ーム路で作用するミラーの横断面積分だけ減少されて）−検知器の方向へ通過さ
せるように配置および構成されている。
ように配置され構成されている、すなわち当該ミラーが、対象物を暗視野照明す
るために、レーザ光源から到来し、拡散されない励起ビームを対物レンズへ反射
し、対象物から（放射されて）到来した蛍光光を全開口数で、−（但し、検知ビ
ーム路で作用するミラーの横断面積分だけ減少されて）−検知器の方向へ通過さ
せるように配置および構成されている。
【００１０】 本発明ではさらに、対象物で反射された励起光を対象物から放射された蛍光光
から分離するための分離装置は、従来の二色性ビームスプリッタではなく照明ビ
ーム路／検知ビーム路に配置されたミラーとすることができる。このミラーは十
分に小型であり、対象物を暗視野照明するために、レーザ光源から到来する拡散
されていない励起ビームを対象物に向けて反射すると共に、対象物から到来する
蛍光光は全開口数で検知器の方向に通過させる。ここで蛍光光は検知ビーム路に
おいて作用するミラーの（有効）断面積だけ低減される。対象物により反射され
た励起光の主反射は有利にはミラーで検知ビーム路から除去されるよう反射され
る。
から分離するための分離装置は、従来の二色性ビームスプリッタではなく照明ビ
ーム路／検知ビーム路に配置されたミラーとすることができる。このミラーは十
分に小型であり、対象物を暗視野照明するために、レーザ光源から到来する拡散
されていない励起ビームを対象物に向けて反射すると共に、対象物から到来する
蛍光光は全開口数で検知器の方向に通過させる。ここで蛍光光は検知ビーム路に
おいて作用するミラーの（有効）断面積だけ低減される。対象物により反射され
た励起光の主反射は有利にはミラーで検知ビーム路から除去されるよう反射され
る。
【００１１】 ミラーないし反射性面を十分に小さく構成することにより、拡散されていない
励起光だけが対象物に反射される。この種の“小さな”開口数（その他は通常の
開口の例えば１０％）による照明によって“暗視野照明”が達成される。この照
明は光軸に沿って延長された焦点領域を有し、この焦点領域は良く定義された横
方向の焦点直径を備える。本発明では、対象物位置で光軸に沿った十分な照明公
差が達成される。このことは共焦点蛍光顕微鏡での特別な適用に特に有利に作用
する。さらに高いシーン内ダイナミックスを備えた照明が保証される。このよう
なシーン内ダイナミックス（intraszenische Dynamik）が高いことの利点は、例
えば直接隣接する２つの対象物を異なる絶対蛍光強度により、例えば対象物Ａを
１００％により対象物Ｂを０．０５％により同じ共焦点面で、明るい対象物をオ
ーバ照明（ueberleuchten）することなしに相互に分離して測定できることであ
る。
励起光だけが対象物に反射される。この種の“小さな”開口数（その他は通常の
開口の例えば１０％）による照明によって“暗視野照明”が達成される。この照
明は光軸に沿って延長された焦点領域を有し、この焦点領域は良く定義された横
方向の焦点直径を備える。本発明では、対象物位置で光軸に沿った十分な照明公
差が達成される。このことは共焦点蛍光顕微鏡での特別な適用に特に有利に作用
する。さらに高いシーン内ダイナミックスを備えた照明が保証される。このよう
なシーン内ダイナミックス（intraszenische Dynamik）が高いことの利点は、例
えば直接隣接する２つの対象物を異なる絶対蛍光強度により、例えば対象物Ａを
１００％により対象物Ｂを０．０５％により同じ共焦点面で、明るい対象物をオ
ーバ照明（ueberleuchten）することなしに相互に分離して測定できることであ
る。
【００１２】 特に有利にはミラーは、検知すべき蛍光光に対して検知ビーム路における損失
が約１％であるように構成ないし小型に構成される。このことにより効率的な検
知が特に高いダイナミックレンジで可能である。
が約１％であるように構成ないし小型に構成される。このことにより効率的な検
知が特に高いダイナミックレンジで可能である。
【００１３】 ここで使用されるミラーは特に簡単な実施例の枠内で、独立の構成部材として
構成することができる。この場合ミラーはまたホルダにより支持される。このよ
うな実施例の枠内で、従来のビームスプリッタは完全に省略される。なぜならこ
こではビーム路に相応の箇所で単に小型のミラーが配置されているだけだからで
ある。さらに別の実施例の枠内で、ミラーは、（その他の点では従来の）ビーム
スプリッタの、有利には一体的な、反射性領域として構成することができる。こ
こでミラーないし反射性領域は少なくともビームスプリッタのほぼ中央に配置な
いし構成する。この小型の一体的ミラーはほぼ円形または楕円形ないしは卵形に
構成することができる。最終的にここでは、ビームスプリッタの中央にあり、独
立したミラーと同じように拡散されていない励起ビームを対象物に反射する反射
性領域が取り扱われる。ここでも照明は、ダイナミックスを有利にするため極端
に小さな開口数により行われる。
構成することができる。この場合ミラーはまたホルダにより支持される。このよ
うな実施例の枠内で、従来のビームスプリッタは完全に省略される。なぜならこ
こではビーム路に相応の箇所で単に小型のミラーが配置されているだけだからで
ある。さらに別の実施例の枠内で、ミラーは、（その他の点では従来の）ビーム
スプリッタの、有利には一体的な、反射性領域として構成することができる。こ
こでミラーないし反射性領域は少なくともビームスプリッタのほぼ中央に配置な
いし構成する。この小型の一体的ミラーはほぼ円形または楕円形ないしは卵形に
構成することができる。最終的にここでは、ビームスプリッタの中央にあり、独
立したミラーと同じように拡散されていない励起ビームを対象物に反射する反射
性領域が取り扱われる。ここでも照明は、ダイナミックスを有利にするため極端
に小さな開口数により行われる。
【００１４】 ビームスプリッタの非反射性領域は、検知器の方向に約１０％の反射と９０％
の透過を有することができる。ここで具体的には、ビームスプリッタの検知器側
に反射防止（ＡＲ）被覆を設けることができる。このようなビームスプリッタは
蛍光光を、通常の（無限）のビーム路に従って全開口数で−反射性領域に当たる
蛍光光の分だけ低減されて−検知器の方向に通過させる。反射性領域により発生
する、検知すべき蛍光光に対する損失は、すなわちミラーの大きさに依存して、
極端に小さい。ここでは僅か１％の損失が実現され、このことは前に述べた高い
ダイナミックスにつながる。
の透過を有することができる。ここで具体的には、ビームスプリッタの検知器側
に反射防止（ＡＲ）被覆を設けることができる。このようなビームスプリッタは
蛍光光を、通常の（無限）のビーム路に従って全開口数で−反射性領域に当たる
蛍光光の分だけ低減されて−検知器の方向に通過させる。反射性領域により発生
する、検知すべき蛍光光に対する損失は、すなわちミラーの大きさに依存して、
極端に小さい。ここでは僅か１％の損失が実現され、このことは前に述べた高い
ダイナミックスにつながる。
【００１５】 さらにビームスプリッタの非反射性領域は、ビームスプリッタの非反射性領域
の光学的特性が少なくともほぼ温度に依存しないように構成ないし被覆されてい
る。測定の再現性がこのことにより有利になる。
の光学的特性が少なくともほぼ温度に依存しないように構成ないし被覆されてい
る。測定の再現性がこのことにより有利になる。
【００１６】 対象物から蛍光光だけが検知ビーム路に到達するのではなく、励起光の再帰反
射（逆方向への反射）も到達する。このような再帰反射は不所望のものである。
対象物での励起光がレーザ光源に再帰反射するのを抑圧するために、対象物を傾
けて配置することができる。このことは、対象物自体が光軸に対して直交してい
ないことを意味し、そのため再帰反射された励起光に対しては別個のビーム路が
生じる。このビーム路は照明ビーム路に対して少なくとも僅かに−空間的に−ず
らされている。この別個のビーム路には簡単に従来の光バリア（ストップ手段
Lichtfalle）を配置し、これにより再帰反射された励起光を効果的に絞り除去す
ることができる。
射（逆方向への反射）も到達する。このような再帰反射は不所望のものである。
対象物での励起光がレーザ光源に再帰反射するのを抑圧するために、対象物を傾
けて配置することができる。このことは、対象物自体が光軸に対して直交してい
ないことを意味し、そのため再帰反射された励起光に対しては別個のビーム路が
生じる。このビーム路は照明ビーム路に対して少なくとも僅かに−空間的に−ず
らされている。この別個のビーム路には簡単に従来の光バリア（ストップ手段
Lichtfalle）を配置し、これにより再帰反射された励起光を効果的に絞り除去す
ることができる。
【００１７】 対象物のシフトが所望される場合、ないし別の対象物を見つけ出すためには、
対象物がその平面で、照明される対象物領域が常に対物レンズに対して同じ間隔
を有しながら可動であるように構成すると特に有利である。このことにより、対
象物で反射される光および／または散乱される光が、前記の実施例にしたがって
レーザ光源に戻らないのではなく、別個のビーム路を介して光バリアに到達する
。
対象物がその平面で、照明される対象物領域が常に対物レンズに対して同じ間隔
を有しながら可動であるように構成すると特に有利である。このことにより、対
象物で反射される光および／または散乱される光が、前記の実施例にしたがって
レーザ光源に戻らないのではなく、別個のビーム路を介して光バリアに到達する
。
【００１８】 光バリアによる措置に代り、ミラーは、独立した構成部材としての実施例の枠
内で、対象物により散乱および／または反射された励起光を吸収するための吸収
領域を有することができる。別個の光バリアによる措置はここではもはや不要で
ある。このことにより装置が空間的に小型化される。ミラーは、円形または楕円
形ないし卵形の実施例の枠内で反射性の領域と吸収性の領域を有する。
内で、対象物により散乱および／または反射された励起光を吸収するための吸収
領域を有することができる。別個の光バリアによる措置はここではもはや不要で
ある。このことにより装置が空間的に小型化される。ミラーは、円形または楕円
形ないし卵形の実施例の枠内で反射性の領域と吸収性の領域を有する。
【００１９】 同じようにビームスプリッタは、反射性領域の近傍に、対象物により散乱およ
び／または反射された励起光を吸収するための吸収領域を有することもできる。
このような実施例の枠内でも、別個の光バリアによる措置は省略することができ
、この構成によって装置を最小の空間スペースにより製作できるという利点が得
られる。
び／または反射された励起光を吸収するための吸収領域を有することもできる。
このような実施例の枠内でも、別個の光バリアによる措置は省略することができ
、この構成によって装置を最小の空間スペースにより製作できるという利点が得
られる。
【００２０】 最後に、ビーム拡散と使用されるレーザ光源の波長との関係を適切にすること
によって、少なくとも近似的に同じ軸方向の焦点位置が可能であると特に有利で
ある。このことにより一方では対象物位置での光軸に沿った所要の照明公差が得
られ、他方では高いシーン内ダイナミクスを備えた照明が保証される。これにつ
いては繰り返しを避けるために前の実施例を参照されたい。
によって、少なくとも近似的に同じ軸方向の焦点位置が可能であると特に有利で
ある。このことにより一方では対象物位置での光軸に沿った所要の照明公差が得
られ、他方では高いシーン内ダイナミクスを備えた照明が保証される。これにつ
いては繰り返しを避けるために前の実施例を参照されたい。
【００２１】 本発明の思想を有利に構成および改善する種々の手段がある。これについて一
方では請求項１の従属請求項を、他方では以下の図面に基づいた本発明の実施例
の説明を参照されたい。図面に基づいた本発明の有利な実施例の説明と関連して
、一般的に有利な実施形態および改善形態を説明する。
方では請求項１の従属請求項を、他方では以下の図面に基づいた本発明の実施例
の説明を参照されたい。図面に基づいた本発明の有利な実施例の説明と関連して
、一般的に有利な実施形態および改善形態を説明する。
【００２２】
図１は、共焦点蛍光顕微鏡のビーム路における光学装置の実施例が概略図であ
る。この光学装置は、ここで選択された実施例では２つのレーザ光源１，２、照
明ビーム路/検知ビーム路３，４，５に配置され、対象物７により反射された励
起光７を対象物７から放射された蛍光光９から分離するための分離装置６、分離
装置６と対象物７との間に配置された対物レンズ１０、および検知ビーム５中で
分離装置６に後置された検知器１１を有する。
る。この光学装置は、ここで選択された実施例では２つのレーザ光源１，２、照
明ビーム路/検知ビーム路３，４，５に配置され、対象物７により反射された励
起光７を対象物７から放射された蛍光光９から分離するための分離装置６、分離
装置６と対象物７との間に配置された対物レンズ１０、および検知ビーム５中で
分離装置６に後置された検知器１１を有する。
【００２３】 図１から、励起光８がビーム統合器（入射結合器）１２を介して装置６に達し
、これから対物レンズ１０へ反射され、そこから対象物７に達することがわかる
。蛍光光９も対物レンズ１０を通過して装置６に達し、本発明によりミラー１３
として構成された反射性領域を除いてこの装置６を通過し、円筒レンズ１４，阻
止フィルタホイール（ディスク）１５および検知ホール絞り１５を介して検知器
１１に達する。
、これから対物レンズ１０へ反射され、そこから対象物７に達することがわかる
。蛍光光９も対物レンズ１０を通過して装置６に達し、本発明によりミラー１３
として構成された反射性領域を除いてこの装置６を通過し、円筒レンズ１４，阻
止フィルタホイール（ディスク）１５および検知ホール絞り１５を介して検知器
１１に達する。
【００２４】 本発明では分離装置６はミラー１３を有しており、このミラー１３は照明ビー
ム路/検知ビーム路３，４，５に次のように配置および構成されている。すなわ
ちこのミラーが、対象物７を暗視野照明するために、レーザ光源１，２から到来
し、拡散されない励起ビームないし励起光８を対物レンズ１０へ反射し、対象物
７から到来した蛍光光９を全開口数で、（但し、検知ビーム路４，５で作用する
ミラー１３の横断面積分だけ減少されて）検知器１１の方向へ通過させるように
配置および構成されている。
ム路/検知ビーム路３，４，５に次のように配置および構成されている。すなわ
ちこのミラーが、対象物７を暗視野照明するために、レーザ光源１，２から到来
し、拡散されない励起ビームないし励起光８を対物レンズ１０へ反射し、対象物
７から到来した蛍光光９を全開口数で、（但し、検知ビーム路４，５で作用する
ミラー１３の横断面積分だけ減少されて）検知器１１の方向へ通過させるように
配置および構成されている。
【００２５】 図１と図２に示された実施例では、分離装置６はビームスプリッタとして構成
されており、その中央にはミラー１３が組み込まれている。
されており、その中央にはミラー１３が組み込まれている。
【００２６】 図３は、分離装置６の択一的構成を示しており、ここでは分離装置６は簡単で
単純に、ただ１つのミラー１３として構成されている。ここでこのミラー１３は
自立的な構成部材である。ミラー１３は、図３に示したように全体反射面を有す
ることができる。
単純に、ただ１つのミラー１３として構成されている。ここでこのミラー１３は
自立的な構成部材である。ミラー１３は、図３に示したように全体反射面を有す
ることができる。
【００２７】 図４に示した実施例でもミラー１３は同じように別個の構成部材として構成さ
れている。ここではミラー１３の面は、反射性のミラー面１７と吸収性面１８と
に分割されている。この手段により、反射されて戻る励起光１９に対して別個の
光バリアを設ける措置が不要になる。
れている。ここではミラー１３の面は、反射性のミラー面１７と吸収性面１８と
に分割されている。この手段により、反射されて戻る励起光１９に対して別個の
光バリアを設ける措置が不要になる。
【００２８】 分離装置６として、例えば図１と図２の図示のようなビームスプリッタ、また
は図３と図４の実施例を適用すれば、再帰反射、ないし再帰反射された励起光１
９が次のようにして「無害化」される。すなわち試料ないし対象物７を斜めに調
整し、光軸２３に対して直交しないように配置するのである。このことにより、
再帰反射された励起光１９が励起光８の照明ビーム路２０ないしビーム路に対し
て僅かにずらされ、再帰反射される励起光１９は固有のビーム路２１に沿って再
帰反射されるようになる。そして適切な箇所に光バリア２２を配置する。この光
バリアは、ビーム路２１の配向に基づき、照明ビーム路２０ないし励起光の反対
側にある。
は図３と図４の実施例を適用すれば、再帰反射、ないし再帰反射された励起光１
９が次のようにして「無害化」される。すなわち試料ないし対象物７を斜めに調
整し、光軸２３に対して直交しないように配置するのである。このことにより、
再帰反射された励起光１９が励起光８の照明ビーム路２０ないしビーム路に対し
て僅かにずらされ、再帰反射される励起光１９は固有のビーム路２１に沿って再
帰反射されるようになる。そして適切な箇所に光バリア２２を配置する。この光
バリアは、ビーム路２１の配向に基づき、照明ビーム路２０ないし励起光の反対
側にある。
【００２９】 本発明の別の有利な構成については、繰り返しを避けるために明細書の一般的
部分に記載した実施形態を参照されたい。
部分に記載した実施形態を参照されたい。
【図１】 図１は、共焦点蛍光顕微鏡のビーム路における本発明の光学装置の基本構成の
概略図である。
概略図である。
【図２】 図２は、中央ミラーを有するビームスプリッタの概略図である。
【図３】 図３は、ビームスプリッタの代わりに別個の構成部材として使用されるミラー
の概略図である。
の概略図である。
【図４】 図４は、一体的に反射領域と吸収領域を有するミラーの概略図である。
１ レーザ光源 ２ レーザ光源 ３ 照明ビーム路 ４ 照明/検知ビーム路 ５ 検知ビーム路 ６ 対象物で反射された励起光を対象物により放射された蛍光光から分離する
ための装置 ７ 対象物 ８ 励起光 ９ 蛍光光 １０ 対物レンズ １１ 検知器 １２ ビーム統合器 １３ ミラー １４ 円筒レンズ １５ 阻止フィルタホイール １６ 検知ホール絞り １７ ミラー面 １８ 吸収性面 １９ 再帰反射された励起光 ２０ 照明ビーム路 ２１ 再帰反射された励起光のビーム路 ２２ 光バリア ２３ 光軸
ための装置 ７ 対象物 ８ 励起光 ９ 蛍光光 １０ 対物レンズ １１ 検知器 １２ ビーム統合器 １３ ミラー １４ 円筒レンズ １５ 阻止フィルタホイール １６ 検知ホール絞り １７ ミラー面 １８ 吸収性面 １９ 再帰反射された励起光 ２０ 照明ビーム路 ２１ 再帰反射された励起光のビーム路 ２２ 光バリア ２３ 光軸
【手続補正書】
【提出日】平成１２年６月１２日（２０００．６．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】 対象物から蛍光光だけが検知ビーム路に到達するのではなく、励起光の再帰反
射（逆方向への反射）も到達する。このような再帰反射は不所望のものである。
対象物での励起光がレーザ光源に再帰反射するのを抑圧するために、対象物を傾
けて配置することができる。このことは、対象物自体が光軸に対して直交してい
ないことを意味し、そのため再帰反射された励起光に対しては別個のビーム路が
生じる。このビーム路は照明ビーム路に対して少なくとも僅かに−空間的に−ず
らされている。この別個のビーム路には簡単に従来の光ストップ手段 （Lichtf
alle）を配置し、これにより再帰反射された励起光を効果的に絞り除去すること
ができる。
射（逆方向への反射）も到達する。このような再帰反射は不所望のものである。
対象物での励起光がレーザ光源に再帰反射するのを抑圧するために、対象物を傾
けて配置することができる。このことは、対象物自体が光軸に対して直交してい
ないことを意味し、そのため再帰反射された励起光に対しては別個のビーム路が
生じる。このビーム路は照明ビーム路に対して少なくとも僅かに−空間的に−ず
らされている。この別個のビーム路には簡単に従来の光ストップ手段 （Lichtf
alle）を配置し、これにより再帰反射された励起光を効果的に絞り除去すること
ができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】 対象物のシフトが所望される場合、ないし別の対象物を見つけ出すためには、
対象物がその平面で、照明される対象物領域が常に対物レンズに対して同じ間隔
を有しながら可動であるように構成すると特に有利である。このことにより、対
象物で反射される光および／または散乱される光が、前記の実施例にしたがって
レーザ光源に戻らないのではなく、別個のビーム路を介して光ストップ手段に到
達する。
対象物がその平面で、照明される対象物領域が常に対物レンズに対して同じ間隔
を有しながら可動であるように構成すると特に有利である。このことにより、対
象物で反射される光および／または散乱される光が、前記の実施例にしたがって
レーザ光源に戻らないのではなく、別個のビーム路を介して光ストップ手段に到
達する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】 光ストップ手段による措置に代り、ミラーは、独立した構成部材としての実施
例の枠内で、対象物により散乱および／または反射された励起光を吸収するため
の吸収領域を有することができる。別個の光ストップ手段による措置はここでは
もはや不要である。このことにより装置が空間的に小型化される。ミラーは、円
形または楕円形ないし卵形の実施例の枠内で反射性の領域と吸収性の領域を有す
る。
例の枠内で、対象物により散乱および／または反射された励起光を吸収するため
の吸収領域を有することができる。別個の光ストップ手段による措置はここでは
もはや不要である。このことにより装置が空間的に小型化される。ミラーは、円
形または楕円形ないし卵形の実施例の枠内で反射性の領域と吸収性の領域を有す
る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】 同じようにビームスプリッタは、反射性領域の近傍に、対象物により散乱およ
び／または反射された励起光を吸収するための吸収領域を有することもできる。
このような実施例の枠内でも、別個の光ストップ手段による措置は省略すること
ができ、この構成によって装置を最小の空間スペースにより製作できるという利
点が得られる。
び／または反射された励起光を吸収するための吸収領域を有することもできる。
このような実施例の枠内でも、別個の光ストップ手段による措置は省略すること
ができ、この構成によって装置を最小の空間スペースにより製作できるという利
点が得られる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】 図４に示した実施例でもミラー１３は同じように別個の構成部材として構成さ
れている。ここではミラー１３の面は、反射性のミラー面１７と吸収性面１８と
に分割されている。この手段により、反射されて戻る励起光１９に対して別個の
光ストップ手段を設ける措置が不要になる。
れている。ここではミラー１３の面は、反射性のミラー面１７と吸収性面１８と
に分割されている。この手段により、反射されて戻る励起光１９に対して別個の
光ストップ手段を設ける措置が不要になる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】 分離装置６として、例えば図１と図２の図示のようなビームスプリッタ、また
は図３と図４の実施例を適用すれば、再帰反射、ないし再帰反射された励起光１
９が次のようにして「無害化」される。すなわち試料ないし対象物７を斜めに調
整し、光軸２３に対して直交しないように配置するのである。このことにより、
再帰反射された励起光１９が励起光８の照明ビーム路２０ないしビーム路に対し
て僅かにずらされ、再帰反射される励起光１９は固有のビーム路２１に沿って再
帰反射されるようになる。そして適切な箇所に光ストップ手段２２を配置する。
この光ストップ手段は、ビーム路２１の配向に基づき、照明ビーム路２０ないし
励起光の反対側にある。
は図３と図４の実施例を適用すれば、再帰反射、ないし再帰反射された励起光１
９が次のようにして「無害化」される。すなわち試料ないし対象物７を斜めに調
整し、光軸２３に対して直交しないように配置するのである。このことにより、
再帰反射された励起光１９が励起光８の照明ビーム路２０ないしビーム路に対し
て僅かにずらされ、再帰反射される励起光１９は固有のビーム路２１に沿って再
帰反射されるようになる。そして適切な箇所に光ストップ手段２２を配置する。
この光ストップ手段は、ビーム路２１の配向に基づき、照明ビーム路２０ないし
励起光の反対側にある。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、共焦点蛍光顕微鏡のビーム路における本発明の光学装置の基本構成の
概略図である。
概略図である。
【図２】 図２は、中央ミラーを有するビームスプリッタの概略図である。
【図３】 図３は、ビームスプリッタの代わりに別個の構成部材として使用されるミラー
の概略図である。
の概略図である。
【図４】 図４は、一体的に反射領域と吸収領域を有するミラーの概略図である。
【符号の説明】 １ レーザ光源 ２ レーザ光源 ３ 照明ビーム路 ４ 照明/検知ビーム路 ５ 検知ビーム路 ６ 対象物で反射された励起光を対象物により放射された蛍光光から分離する
ための装置 ７ 対象物 ８ 励起光 ９ 蛍光光 １０ 対物レンズ １１ 検知器 １２ ビーム統合器 １３ ミラー １４ 円筒レンズ １５ 阻止フィルタホイール １６ 検知ホール絞り １７ ミラー面 １８ 吸収性面 １９ 再帰反射された励起光 ２０ 照明ビーム路 ２１ 再帰反射された励起光のビーム路 ２２ 光ストップ手段 ２３ 光軸
ための装置 ７ 対象物 ８ 励起光 ９ 蛍光光 １０ 対物レンズ １１ 検知器 １２ ビーム統合器 １３ ミラー １４ 円筒レンズ １５ 阻止フィルタホイール １６ 検知ホール絞り １７ ミラー面 １８ 吸収性面 １９ 再帰反射された励起光 ２０ 照明ビーム路 ２１ 再帰反射された励起光のビーム路 ２２ 光ストップ手段 ２３ 光軸
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハイ、ヴィリアム、ツェー． ドイツ連邦共和国 Ｄ−69493 ヒルシュ ベルク アム ミュールグラーベン ８ Ｆターム(参考） 2H052 AA08 AA09 AB30 AC06 AC34 AD31
Claims (16)
- 【請求項１】 共焦点蛍光顕微鏡のビーム路中に配置された光学装置であっ
て、少なくとも１つのレーザ光源（１，２）と、照明/検知ビーム路（３，４，
５）に配置され、対象物（７）で反射された励起光（８）を対象物（７）により
放射された蛍光光（９）から分離するための装置（６）と、前記分離装置（６）
と対象物（７）との間に配置された対物レンズ（１０）と、検知ビーム路（５）
中に前記分離装置（６）に後置された検知器（１１）とを有する光学装置におい
て、 前記分離装置（６）はミラー（１３）を有し、 該ミラー（１３）は照明/検知ビーム路（３，４，５）に次のように配置され
構成されていること、すなわち 当該ミラーが、対象物（７）を暗視野照明するための、レーザ光源（１，２）
から到来し、拡散されない励起ビームを対物レンズ（１０）へ反射し、対象物（
７）から到来した蛍光光（９）を全開口数で、−検知ビーム路（５）で作用する
ミラー（１３）の横断面積分だけ減少されて−検知器（１１）の方向へ通過させ
るように配置および構成されていること、 を特徴とする光学装置。 - 【請求項２】 該ミラー（１３）は、検知すべき蛍光光（９）に対して検知
ビーム路（５）で約１％の損失を引き起こすように構成されている、請求項１記
載の装置。 - 【請求項３】 該ミラー（１３）は独立の構成部材として構成されている、
請求項１または２記載の装置。 - 【請求項４】 該ミラー（１３）はホルダにより支持されている、請求項３
記載の装置。 - 【請求項５】 該ミラー（１３）は、ビームスプリッタの有利には一体的な
反射性領域として構成されている、請求項１または２記載の装置。 - 【請求項６】 該ミラー（１３）は、ビームスプリッタの少なくともほぼ中
央に配置ないし構成されている、請求項５記載の装置。 - 【請求項７】 該ミラー（１３）はほぼ円形に構成されている、請求項５ま
たは６記載の装置。 - 【請求項８】 該ミラー（１３）はほぼ楕円形に構成されている、請求項５
または６記載の装置。 - 【請求項９】 ビームスプリッタ（６）の非反射性領域は検知器（１１）の
方向に、約１０％の反射と９０％の透過を有する、請求項５から８までのいずれ
か１項記載の装置。 - 【請求項１０】 ビームスプリッタの非反射性領域の光学的特性は少なくと
も十分に温度に依存しない、請求項５から９までのいずれか１項記載の装置。 - 【請求項１１】 対象物（７）でレーザ光源（１，２）に戻る励起光（８）
の再帰反射を抑圧するために、対象物（７）は斜めに、すなわち光軸（２３）に
直交しないように配置されている、請求項１から１０までのいずれか１項記載の
装置。 - 【請求項１２】 再帰反射された励起光（１９）に対して、照明ビーム路（
２０）に対して僅かにずらされた当該励起光のビーム路（２１）に光バリア（２
２）が設けられている、請求項１１記載の装置。 - 【請求項１３】 対象物（７）はその平面内において、対象物の照明領域が
常に対物レンズ（１０）に対して同じ間隔を有するように可動であるよう配され
る、請求項１から１２までのいずれか１項記載の装置。 - 【請求項１４】 該ミラー（１３）は、対象物（７）により散乱された励起
光（８）を吸収するための吸収領域（１８）を有する、請求項１から１３までの
いずれか１項記載の装置。 - 【請求項１５】 該ビームスプリッタは、反射性領域の他に、対象物（７）
により散乱された励起光（８）を吸収するための吸収領域（１８）を有している
、請求項５から１３までのいずれか１項記載の装置。 - 【請求項１６】 ビーム拡散と、使用されるレーザ光源（１，２）の波長と
の関係を適切に選択することにより、少なくとも近似的に同じ焦点位置が実現可
能である、請求項１から１５までのいずれか１項記載の装置。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19842153A DE19842153C2 (de) | 1998-09-15 | 1998-09-15 | Fluoreszenzmikroskop |
| DE19842153.2 | 1998-09-15 | ||
| PCT/DE1999/002910 WO2000016149A1 (de) | 1998-09-15 | 1999-09-13 | Optische anordnung im strahlengang eines konfokalen fluoreszenzmikroskops |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002525651A true JP2002525651A (ja) | 2002-08-13 |
| JP2002525651A5 JP2002525651A5 (ja) | 2005-12-22 |
| JP4197395B2 JP4197395B2 (ja) | 2008-12-17 |
Family
ID=7880995
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000570627A Expired - Lifetime JP4197395B2 (ja) | 1998-09-15 | 1999-09-13 | 共焦点蛍光顕微鏡のビーム路における光学装置 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6785302B1 (ja) |
| EP (1) | EP1031055B1 (ja) |
| JP (1) | JP4197395B2 (ja) |
| DE (2) | DE19842153C2 (ja) |
| WO (1) | WO2000016149A1 (ja) |
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| WO2014077158A1 (ja) * | 2012-11-15 | 2014-05-22 | シャープ株式会社 | 蛍光検出装置 |
| WO2015005073A1 (ja) * | 2013-07-11 | 2015-01-15 | 株式会社島津製作所 | ラマン分光分析装置 |
| JP2021519438A (ja) * | 2018-03-23 | 2021-08-10 | イェンラブ ゲーエムベーハー | 被験体を非侵襲的に検査するためのマルチモード撮像システムおよび方法 |
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| EP1157268B1 (en) * | 1999-02-26 | 2007-11-21 | Perkinelmer Life Sciences, Inc. | Imaging system for an optical scanner |
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