JP2001242383A

JP2001242383A - 顕微鏡

Info

Publication number: JP2001242383A
Application number: JP2001014718A
Authority: JP
Inventors: Werner Knebel; ワーナー、クネベル
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2001-01-23
Publication date: 2001-09-07
Also published as: US6836359B2; US20010021063A1; DE10024135B4; US20030030900A1; DE10024135A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】検査される対象物を照射するための光源と、対
象物を通過する透過光および対象物で形成される蛍光を
分離するための分光装置と、透過光に作用する分離装置
とを有する特に共焦点走査型顕微鏡のための顕微鏡設計
に関し、できる限り短い検出光経路が、構造的に簡素な
手段の助けによって実現される。【解決手段】検査される対象物６を照射するための光源
１と、対象物６を通過する透過光１５および対象物６で
形成される蛍光１０，１３を分離するための分光装置
９，１２と、透過光１５に作用する分離装置１７と、を
有する特に共焦点走査型顕微鏡のための顕微鏡は、分離
装置１７が対象物６と分光装置９，１２との間に配置さ
れるように、検出光経路に関してできる限り短くなるよ
うに構成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、検査される対象物
を照射するための光源と、対象物を通過する透過光およ
び対象物で形成される蛍光を分離するための分光装置
と、透過光に作用する分離装置とを有する特に共焦点走
査型顕微鏡のための顕微鏡設計に関する。このような分
離装置は、透過光コントラスト顕微鏡法に必要なコント
ラストを供給する。

【０００２】

【従来の技術】冒頭に述べたようなタイプの顕微鏡設計
は実際に既知であり、最も多様な実施形態が存在する。

【０００３】顕微鏡は一般に、光源および光源からの光
がピンホール絞りの上に焦点を結ぶようにするための集
束光学系を含む。この場合には、ビームスプリッタ、ビ
ーム制御用の走査装置、顕微鏡光学系、検出絞り、検出
光および／または蛍光を検出するための検出器が設けら
れる。

【０００４】蛍光または透過光用の光透過装置におい
て、励起光の透過は、たとえば集光器側、すなわち対象
物の下流に配置された集光器の側で検出することもでき
る。この場合には、検出光ビームは、走査ミラーを介し
て検出器に伝達されない。このような装置は、非デスキ
ャニング装置(non-descanning arrangement)として示さ
れている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】蛍光を検出するため
に、上述したデスキャニング装置のように、３次元解像
度を実現するための集光器側の検出絞り用の透過光装置
が必要とされるであろう。しかし、励起確率が、光子密
度の平方または強度の関数であり、一般に隣接領域より
焦点の方がさらに高いため、２光子励起の場合には、集
光器側の検出絞りを不要にすることができる。

【０００６】したがって、検出対象の蛍光は、集光領域
から圧倒的な割合の高い確率で生じることから、絞り装
置の助けによって、隣接領域からの蛍光光子および集光
領域からの蛍光光子をさらに微分する必要がない。

【０００７】特に、２光子励起のいずれの場合において
も、蛍光光子の発生が少ない背景に対して、検出光経路
に沿って一般に光をあまり失わない非デスキャニング装
置が重要である。

【０００８】しかし、この種の蛍光が観測される場合で
あっても、生体プレパラートにおいてラベル付けしない
ことから、たとえば、細胞の輪郭をあまり十分に検出す
ることはできない。

【０００９】したがって、明確な結果を得ることができ
ると思われる透過光を同時に観測することが可能である
ことが望ましいと思われる。

【００１０】蛍光および透過光を同時に検出するための
顕微鏡設計は、初期の特許出願から出願者には既知であ
る。既知の顕微鏡設計は、集光器の下流に、透過光から
蛍光を空間的に隔離または分離する少なくとも１つのカ
ラービームスプリッタの形状の分光装置を含む。

【００１１】透過光コントラスト顕微鏡法のために、既
知の顕微鏡設計の場合には、分光装置の下流またはカラ
ービームスプリッタの下流にある透過光のフーリエ平面
に、セグメント絞りの形状でコントラストのために必要
とされる分離装置が配置される。

【００１２】したがって、本発明の目的は、できる限り
短い検出光経路が、構造的に簡素な手段の助けによって
実現されるように、冒頭に述べた種類の顕微鏡設計およ
び分離装置の特徴を備えることにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上述した課題を解決する
ため、この発明の顕微鏡では、検査される対象物（６）
を照射するための光源（１）と、該対象物（６）を通過
する透過光（１５）および該対象物（６）で生成される
蛍光（１０，１３）を分離するための分光装置（９，１
２）とを有し、透過光（１５）に作用する分離装置（１
７）が、前記対象物（６）と前記分光装置（９，１２）
との間に配置されるようにしている。

【００１４】

【発明の実施の形態】図１は、概略図における本発明に
よる顕微鏡設計の具体的な実施形態を示している。

【００１５】顕微鏡設計は、共焦点レーザ走査型顕微鏡
である。

【００１６】顕微鏡は、レーザとして設計される光源１
を有する。光源１は、メインビームスプリッタ３を経て
走査装置４に反射される照射光ビーム２を放射する。

【００１７】走査装置４は、顕微鏡光学系または対物レ
ンズ５によって、対象物６を通るように照射光ビーム２
を誘導する。

【００１８】対象物６を通過する透過光も対象物６で形
成される蛍光も、集光器７および偏光ミラー８を経て第
１のカラービームスプリッタ９に供給される。

【００１９】第１のカラービームスプリッタ９は、蛍光
のスペクトルの低い方の波長領域１０を分割し、それを
蛍光検出器１１へ反射する。

【００２０】蛍光のスペクトルの高い方の波長領域１３
は、カラービームスプリッタ１２を経て別の蛍光検出器
１４に反射される。

【００２１】透過光１５は、直進前方に配置される透過
光検出器１６に到達する。

【００２２】したがって、顕微鏡設計は、検査対象であ
る対象物６を照射するための光源１を有する。さらに、
顕微鏡設計は、対象物６を通過する透過光１５および対
象物６において形成された蛍光１０，１３を分離するた
めの２つのカラービームスプリッタ９，１２を備えた分
光装置を有する。

【００２３】最後に、顕微鏡設計は、透過光１５に作用
するカラーセグメント絞り１７の形状に分離装置を備え
る。

【００２４】できる限り短い検出光経路に関して、分離
装置は、対象物６または集光器７と分光装置との間に配
置される。顕微鏡設計は、分離装置によって、透過光コ
ントラスト顕微鏡法に適応している。

【００２５】図１に示された顕微鏡設計は、対物レンズ
側に配置され、通常は透過光コントラスト顕微鏡法では
使用されない検出器１８をさらに有する。

【００２６】両方の蛍光検出器１１，１４は、光源１と
反対方向に面する対象物６の面に配置される。さらに、
透過光検出器１６も光源１と反対方向に面する対象物６
の面に配置される。

【００２７】カラーセグメント絞り１７の形状である分
離装置は、集光器７と分光装置、さらに正確に言えば偏
光ミラーの間のフーリエ平面に配置される。

【００２８】カラーセグメント絞り１７を挿入するため
に、回転機構または摺動機構を使用することができる。

【００２９】図２は、本発明による分離装置の具体的な
実施形態の概略図を示している。

【００３０】分離装置は、コーティング２０を備えた平
坦な基板１９を有する。

【００３１】コーティング２０は絶縁性であることが好
ましく、基板１９の上に蒸着される。透明基板に蒸着さ
れるコーティング２０は、透過光に対して不透明であ
り、蛍光に対して透明である。

【００３２】特に、絶縁コーティング２０は、７９０ｎ
ｍ未満の波長の光に対して透明である。さらに高い波長
の光は、反射される。しかし、光の透過および反射に関
する波長の限界はまた、別の適切な波長であってもよ
い。

【００３３】本発明による顕微鏡設計のさらに好都合な
改良ならびに発展および本発明による分離装置に関し
て、反復を避けるため、説明の一般的な部分および添付
の請求項を参照してもよい。

【００３４】顕微鏡設計の具体的な実施形態において、
透過光および蛍光のための集光器は、光源とは反対方向
に面する対象物の面に配置されてもよい。そうであるな
らば、分離装置は、集光器と分光装置との間に簡素な方
法で配置されてもよく、この場合にはできる限り効率的
な分離に関して、集光器と分光装置との間のフーリエ平
面に分離装置を配置することが好都合である。いずれの
場合においても、分離装置は、透過光に排他的に作用し
てもよく、この場合には蛍光は影響を受けることなく分
離装置を通過することができる。

【００３５】光学素子をビーム経路に挿入するための装
置は、ビーム経路への光学素子の特に信頼性の高い挿入
を確実に行うために、回転装置機構または摺動機構を備
えていてもよい。それによって、きわめて高い信頼性の
みならず、ビーム経路に分離装置をきわめて簡素な挿入
が実現される。

【００３６】特に適応性の高い方法では、異なる分離装
置が装置に配置されてもよい。したがって、必要な検査
方法に応じて、適切な分離装置をビーム経路に挿入する
ことが可能である。

【００３７】最も多様な構成要素は、分離装置として考
慮される。特に、分離装置は、セグメント絞り、セグメ
ント位相絞りまたはセグメント位相フィルタを備えてい
てもよい。

【００３８】構造的に特に簡素な構成において、分離装
置は、色選択コーティングを有する透明基板を備えてい
てもよい。これは、特に簡素な分離装置のみならず、冒
頭に述べたような種類の顕微鏡設計の難点を経験するこ
となく挿入することができる特別に薄い分離装置でも実
現される。この場合には、コーティングは、透過光に対
して不透明であり、蛍光に対して透明であってもよい。

【００３９】コーティングは、絶縁コーティングであれ
ば好都合である。いずれの場合においても、特に適切な
方法で、コーティングは、基板に蒸着されてもよい。そ
れによって、基板の上にコーティングを信頼性の高い方
法で接着することができる。

【００４０】別の改良において、分離装置は、適切に構
成されたカラーフィルタを備えていてもよい。カラーフ
ィルタは、特に、公知のセグメント絞りに応じて適応さ
れてもよい。さまざまな材料が、カラーフィルタ材料と
して考えられる。この場合には、プラスチック、好まし
くはプラスチックフィルムによってカラーフィルタを構
成すれば、特に扱いやすい。しかし、ガラスで構成され
るカラーフィルタも考えられる。

【００４１】さらに別の改良において、分離装置は、カ
ラーＬＣＤマトリックスを備えていてもよい。このよう
なカラーＬＣＤマトリックスは、さらに再設計を行うこ
となく、セグメントまたは絞りの形状の変形およびカラ
ー特性の変形を行うことができる。

【００４２】最も簡素な場合には、分離装置の光学的に
作動する部分は、顕微鏡設計の光軸に対して垂直に配置
されてもよい。従来のセグメント絞りにおいて、光学的
に作動する部分は、本質的に平坦な領域によって形成さ
れる。たとえば、コートされた基板の場合には、コーテ
ィングは分離装置の光学的に作動する部分であろう。

【００４３】光源に戻る反射を防止するために、分離装
置の光学的に作動する部分は、顕微鏡設計の光軸に対す
る垂直部分から逸れるような方法で配置されてもよい。
この場合には、照準の方向は、特に、分離装置の光学作
用に影響を及ぼさない程度のわずかな偏向となる。

【００４４】分離装置または分離装置の光学的に作動す
る部分は、用途に応じて、異なる幾何形状であってもよ
い。

【００４５】特に簡素な方法において、分光装置は、少
なくとも１つのカラービームスプリッタであってもよ
い。この場合には、特に、異なる波長または波長領域に
分割することができるようにするために、複数のカラー
ビームスプリッタを直列に配置してもよい。

【００４６】この別法として、分光装置は、少なくとも
１つの部分的に透明なミラーであってもよい。帯域通過
フィルタまたはブロッキングフィルタは、このミラーま
たはこれらのミラーの下流に配置されてもよい。ミラー
のほか分割構成要素も使用する場合には、適切であれば
下流の帯域通過フィルタまたはブロッキングフィルタを
備え、このような複数のミラーは直列に配置されてもよ
い。また、それによって、蛍光を複数のスペクトル領域
に分割することもできる。

【００４７】カラービームスプリッタまたはミラーの使
用の別法として、たとえば、ドイツ特許公開第１９９
０２６２５Ａ１号に記載されるマルチバンド検出器
の分割を利用することも可能である。また、蛍光を複数
のスペクトル領域に分割するために、このようなマルチ
バンド検出器を使用することができる。

【００４８】透過光および蛍光の信頼性の高い検出に関
して、光源とは反対方向に面する対象物の面において、
蛍光および透過光を同時に検出するために、蛍光を検出
するための少なくとも１つの蛍光検出器および透過光を
検出するための少なくとも１つの透過光検出器を配置す
ることも可能であろう。

【００４９】光源として特に好都合な方法で、レーザを
使用してもよい。しかし、他の適切な光源を使用するこ
とも考えられる。

【００５０】（本発明）による顕微鏡で使用するための
分離装置は、適切に構成され、好ましくは調整されたカ
ラーフィルタを有する。カラーフィルタは、プラスチッ
クで製作されてもよい。

【００５１】このような最近命名された分離装置の特に
有利な点に関して、重複を避けるために前述の説明を参
照されたい。

【００５２】分離装置は、たとえば、Ｄｏｄｔ原理また
はＨｏｆｆｍａｎ原理を用いて作動してもよい。この場
合には、分離装置は、通常のように、中実の不透明なセ
グメント絞りを含まない。コートされた基板として設計
された分離装置の場合には、コーティングは蛍光に対し
て透明であるのに対し、透過光、すなわち２光子または
多光子励起光に対して不透明である。

【００５３】図面の助けによる本発明の好ましい具体的
な実施形態の説明と共に、好ましい改良および教えの発
展もまた一般的に説明される。

【００５４】

【発明の効果】本発明の顕微鏡によると、分離装置は、
分光装置の下流に配置されることはないが、対象物と分
光装置との間に配置される。

【００５５】したがって、本発明による顕微鏡設計は、
構造的に簡素な手段の助けによって、できる限り短い検
出光経路が設けられる顕微鏡設計を実現する。

【００５６】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による顕微鏡設計の具体的な実施形態の
概略図を示す。

【図２】適切に被覆された基板を備えた本発明による分
離装置の具体的な実施形態の概略図を示す。

【符号の説明】

１光源、２照射光ビーム、３メインビームスプリッタ、４走査装置、５対物レンズ、６対象物、７集光器、８偏光ミラー、９カラービームスプリッタ、１０波長領域、１１蛍光検出器、１２カラービームスプリッタ、１３波長領域、１４蛍光検出器、１５透過光ビーム、１６透過光検出器、１７カラーセグメント絞り、１８検出器、１９基板、２０コーティング

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検査される対象物（６）を照射するための
光源（１）と、該対象物（６）を通過する透過光（１
５）および該対象物（６）で生成される蛍光（１０，１
３）を分離するための分光装置（９，１２）とを有し、透過光（１５）に作用する分離装置（１７）が、前記対
象物（６）と前記分光装置（９，１２）との間に配置さ
れることを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】透過光（１５）および蛍光（１０，１３）
用の集光器（７）が、前記対象物（６）の前記光源
（１）と反対方向に面する面に配置されることと、前記
分離装置（１７）が、前記集光器（７）と前記分光装置
（９，１２）との間に配置されることを特徴とする請求
項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】前記分離装置（１７）が、前記集光器
（７）と前記分光装置（９，１２）との間のフーリエ平
面に配置されることを特徴とする請求項２に記載の顕微
鏡。
【請求項４】前記分離装置（１７）が色選択コーティン
グ（２０）を有する透明基板（１９）を備えることと、
該コーティング（２０）が透過光（１５）に対して不透
明であり、蛍光（１０，１３）に対して透明であること
を特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項５】検査される対象物（６）を照射するための
光源（１）と、該対象物（６）を通過する透過光（１
５）および該対象物（６）で生成される蛍光（１０，１
３）を分離するための分光装置（９，１２）とを有し、前記透過光（１５）に作用する分離装置（１７）が、前
記対象物（６）と前記分光装置（９，１２）との間に配
置されることを特徴とする共焦点顕微鏡。