JP2007510176A - ノン・デスキャンド検出光路および／または観察光路を備えるレーザ走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

ノン・デスキャンド検出光路および／または観察光路を備えるレーザ走査型顕微鏡において、照明光路と検出光路を分離するためのビーム・スプリッタが設けられ、検出方向において、検出された光の通常の伝達を行うための少なくとも１つの光学系が設けられ、ビーム・スプリッタと光学系との間に、結像を行う光束の直径を減じるための付加光学系が設けられている、レーザ走査型顕微鏡。

Description

レーザ走査型顕微鏡法では、蛍光光線を観察するため、ノン・デスキャンド検出法（ＮＤＤ）がしばしば用いられる。

ノン・デスキャンド検出方法が特に重要となるのは、散乱の著しいサンプルを観察したい場合、または大きい透過深さを得たい場合、そしてＬＳＭ−Ｓｃａｎヘッドで検出を行おうとしても、利用できるミラーが近くに隣接しており、しかも光コンダクタンスが限られている場合である。この場合、変調される励起の検出は、ノン・デスキャンドにより、外部の瞳の近くで行われる。

多くの場合、ＵＶ／ＶＩＳ領域における励起は、パルス化された赤外線を用いる２光子プロセスによって生じる［米国特許第５０３４６１３号明細書］。この場合、放出された蛍光光線全体は、その焦点の共焦点ボリュームにおける励起に割り当てられ、サンプル内で場合によって複数回の散乱の後、正反射光または透過光のチャンネルで検出することができる。そのためには検出チャンネルにおける高い光コンダクタンスを必要とする。

したがって、光学的構造の基本的要件は、有効視野を散乱光線のバーチャルな光源として最大化するため、蛍光光線を有効に、かつサンプル近くで検出することである。しかし、このスペースへのアクセス性は、しばしば顕微鏡の台架自体とのインタフェースによって、ならびに使用される補助手段、たとえばピペットや電極によって制限される。重要な周辺条件は検出器自体であって、この検出器は、スペクトルのみならず、場所や角度にも依存する感受性を持つ。

それだけでなく、利用されるその他の顕微鏡光学系が通常の光路のために設計されていること、そして、その光学系で利用できる直径の自由度が制限されていることを、出発点としなければならない。にもかかわらず後続の光学系における、たとえば正反射光チャンネルにおけるチューブ・レンズまたは照明光学系における、周縁による散乱光カットオフを防止するため、正反射光路では励起と放出を対物レンズ近くで分離することが望まれる。通常、そのため標準的方法として、「プッシュ・アンド・クリック」スプリッタを、正反射チャンネル入射のリフレクタのレベルで用いて、できるだけ大きな柔軟性を維持する。後続する通常の設計による光学系の制限は、従来ほとんど甘受されている。特に有利なのは、検出モジュールを接続するための定められたインタフェース、たとえばＴＶポートを用いることである。しかし、このようなインタフェースの位置と大きさは、散乱光透過にとって重大な周辺条件を決定する。

特許請求の対象となる装置の目的は、励起と検出の分離直後で、光路を通常の光路と比較して次のように改良することである。すなわち、後続の光学系を考慮しながら、できるだけ大きい（カットオフのない）視野を検出器に結像できるようにすることである。

これは請求項１に記載の構成によって解決される。好ましい発展形態を従属請求項に記載した。
１つの有利な実施形態は、光学的な補助システム、好ましくは集光レンズを、正反射チャンネル入射のリフレクタ架台に設けることである。この集光レンズの寸法は、メインビームの屈曲角を最大にすることと、検出器上に生じる光束直径を大き過ぎないものにすることとの間の妥協によって決定される。特に、この最適化は、ＮＤＤモジュールをＴＶポートで用いることができるように行われる。

図１は、光路によってこの装置の動作を説明する。
図１に示すのはレーザ走査型顕微鏡の光路の一部であって（たとえば、独国特許出願公開第１９７０２７５３号明細書を参照）、対物レンズ（ここでは対物レンズ瞳３だけを示す）方向において、スキャナ瞳ＳＰから照明光ビームを伝達するスキャナ対物レンズＳＯ、照明チューブ・レンズ５、およびビーム・スプリッタ１（励起光と検出光を分離するメイン・スプリッタ）を示す。

ノン・デスキャンド検出光路は、検出方向に、１およびミラー２、ならびに検出チューブ・レンズ４を経由して延びる。この場合、観察光路を絞るため、もう１つのビーム・スプリッタＳＴ３を設けることができる。リフレクタ（１）に入射直後に集光レンズ（６）を取り付けることにより、リフレクタ（２）に通常用いられる直径が減じられ、それとともに散乱光の透過を大きくすることができる。特に、照明チューブ・レンズ（４）の前で通常用いられる直径が、検出チューブ・レンズ（５）の前の直径よりも、明らかに大きいことが認められる。これらのチューブ・レンズは、それぞれ対物レンズまでの距離が等しい位置にあり、それによる利得を直接示している。この実施例では、アパチャを周縁領域で約１５％大きくすることができ、このことは明るさの利得約３０％に相当する。

集光レンズのリフレクタへの直接取り付けは、たとえば差し込みによるなど、リフレクタ・ハウジングに直接行うのが有利であり、この場合、フィルタのための既存の差し込み箇所を利用することができる。このレンズは、交換可能、ないしは差し込みおよび引き抜き可能とするのも有利である。

集光レンズは、検出方向に見てリフレクタ２の前で、リフレクタ・ハウジングに取り付けることもできる。
第２のレンズを設け、これをミラー２に、またはミラー・ハウジング内に組み込むこともでき、これは独立したレンズ、またはビーム・スプリッタのレンズと組み合わされたものとする。偏向要素の偏向ミラーを、凸面鏡または凹面鏡として形成することもできる。

レーザ走査型顕微鏡の光路の一部を示す模式図。

Claims (8)

1. ノン・デスキャンド検出光路および／または観察光路を備えるレーザ走査型顕微鏡において、照明光路と検出光路を分離するためのビーム・スプリッタが設けられ、検出方向において、検出された光の伝達を行うための少なくとも１つの光学系が設けられ、前記ビーム・スプリッタと前記光学系との間に、結像を行う光束の直径を減じるための付加光学系が設けられている、レーザ走査型顕微鏡。
2. 前記付加光学系が集光レンズである、請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
3. 前記付加光学系が回折光学要素（ＤＯＥ）として形成されている、請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
4. 前記付加光学系がビーム・スプリッタ・ハウジングの検出方向に直接取り付けられている、請求項１、２または３に記載のレーザ走査型顕微鏡。
5. 前記付加光学系がビーム・スプリッタ・ハウジング内に組み込まれている、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のレーザ走査型顕微鏡。
6. 前記付加光学系が交換可能または差し込み可能である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のレーザ走査型顕微鏡。
7. 第２のレンズを別の偏向要素に対して、または、その要素内に組み込みこんで設け、該レンズが独立しているか、または前記ビーム・スプリッタの追加の要素と組み合わされたものである、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のレーザ走査型顕微鏡。
8. 前記偏向要素内の偏向ミラーが凸面鏡または凹面鏡として設けられている、請求項１乃至７の１項に記載のレーザ走査型顕微鏡。

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