JP2001506864A

JP2001506864A - ピロホスフェートの放出の検出に基づくｄｎａ配列決定方法

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Publication number: JP2001506864A
Application number: JP52854698A
Authority: JP
Inventors: ナイレン、パイ
Original assignee: パイロシーケンシング・アーベー
Priority date: 1996-12-23
Filing date: 1997-12-22
Publication date: 2001-05-29
Anticipated expiration: 2017-12-22
Also published as: GB9626815D0; JP3533223B2; WO1998028440A1; EP0946752A1; DE69713386D1; DE69713386T2; EP0946752B1; US6258568B1; AU5331198A

Abstract

(57)【要約】本発明は、試料ＤＮＡ中の標的位置の塩基を同定する方法であって、試料ＤＮＡ中の標的位置にすぐ隣接してハイブリダイズする伸長プライマーを用意し、試料ＤＮＡおよび伸長プライマーを、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、それによりデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが標的位置の塩基と相補的である場合にのみ取り込まれてピロホスフェート（ＰＰｉ）を放出するようにし、ＰＰｉ放出を酵素により検出し、異なるデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを試料−プライマー混合物の別個のアリコートに、または同じ試料−プライマー混合物に連続的に添加し、ポリメラーゼ反応に供し、どのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが取り込まれたかを示す方法であって、取り込まれなかったヌクレオチドが分解されるように、ヌクレオチド分解酵素をポリメラーゼ反応工程中に包含させる特徴とする方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ピロホスフェートの放出の検出に基づくＤＮＡ配列決定方法本発明は、ピロホスフェート（ＰＰｉ）の放出による塩基の取り込みの検出および同時の酵素的ヌクレオチド分解に基づくＤＮＡの配列決定法に関する。ＤＮＡ配列決定（シーケンシング）は、分子遺伝学的分析において必須の道具である。ＤＮＡヌクレオチド配列を決定する能力は、ヒトおよび他の高等生物の大きなゲノムの配列を決定するための努力が開始されたので、ますます重要になってきている。ＤＮＡ配列決定のための２つの最も一般的に用いられる方法は、サンガー(Sanger)の酵素的鎖停止法、およびマキサムおよびギルバート(Maxam a nd Gilbert)の化学的切断技術である。両方法とも、より大きなＤＮＡフラグメントから生成されたＤＮＡフラグメントを、そのサイズにしたがって解像するために、ゲル電気泳動に依存している。電気泳動の工程は、その後の分離されたＤＮＡフラグメントの検出とともに、手間のかかる手順であるので、これらの工程を自動化するために多大な努力がなされてきた。しかし、自動化された電気泳動ユニットが商業的に利用可能であるという事実にもかかわらず、電気泳動は、高性能のスループットを有する比較的費用に対する効果のよいユニットが必要とされる大規模ゲノムプロジェクトまたは臨床的配列決定には充分に適していない。したがって、電気泳動によらない配列決定法の必要性は大きく、電気泳動の欠点を克服するためのいくつかの代替的な戦略、例えばスキャニング・トンネル電子顕微鏡術（Driscoll et al.,1990,Nature,346,294-296）、ハイブリダイゼーションによる配列決定法（Bains et al.,1988,J.Theo.Biol.135,308-307）および単一分子検出法（Jeff et al.,1989,Biomol.Struct.Dynamics,7,301-306）が記載されてきた。単一のＤＮＡ塩基の変化の迅速な検出を可能にする技術もまた、遺伝的解析のための重要な道具である。多くの場合、単一塩基または少数塩基の検出は、遺伝的解析において非常な助けとなる。これは、いくつかの遺伝的疾患およびある種のガンは微少な突然変異に関連しているためである。固相原理に基づくミニ配列決定プロトコールが記載されていた（Hultman et al.,1988,Nucl.Acid Res.,17, 4937-4946;Syvanen et al.,1990,Genomics,8,684-692）。放射性標識ヌクレオチドの取り込みを測定し、ヒトアポリポタンパクＥ遺伝子の３対立遺伝子多型の解析に用いた。しかし、放射性法は、ルーチンの臨床的適用には充分に適さず、それゆえ、迅速なＤＮＡ配列決定解析のための簡便な非放射性法も興味が持たれてきた。ポリメラーゼ反応中に放出される無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）を検出するコンセプトに基づく配列決定の方法は、記載されていた（ＷＯ９３／２３５６４およびＷＯ８９／０９２８３）。ポリメラーゼ反応中に伸長する核酸鎖に各ヌクレオチドが付加されるにしたがって、ピロホスフェート分子が放出される。これらの条件下で放出されるピロホスフェートは、酵素的に、例えばルシフェラーゼールシフェリン反応において光を生成することにより、検出することができることが見出された。このような方法は、電気泳動の必要性および有害な放射性標識の使用を回避しながら、塩基が標的位置で同定され、ＤＮＡが簡便に迅速に配列決定されることを可能にする。しかし、上述のＰＰｉベースの配列決定方法は、欠点がないものではない。テンプレート（鋳型）を、各ヌクレオチドの添加の間に充分に洗浄し、すべての取り込まれなかったデオキシヌクレオチドを除去しなければならない。これは、固体支持体に結合していないテンプレートを配列決定することを困難にする。そのうえ、各デオキシヌクレオチドとともに新たな酵素を添加しなければならない。したがって、上述のようなＰＰｉベースの方法は、操作の容易さと速さにおける改良を表す一方、迅速な検出および配列情報の提供を可能にし、簡便かつ迅速に行え、自動化の容易な、改良された配列決定法の需要がなお存在する。本発明者らは、これらの問題が検討された、中間の洗浄工程なしで配列決定反応が行われることを可能にし、例えば単一のマイクロタイタープレート中で、簡便かつ迅速に手順を行うことを可能にする、新規な改変されたＰＰｉベースの配列決定法を提案する。有利にも、ＤＮＡを固定化する必要はない。好都合なことに、そして以下においてより詳細に説明するように、本発明の新規な方法は、各ヌクレオチドが取り込まれるにつれて、シグナルが生成され、検出され、配列決定反応がリアルタイムで連続的にモニタリングされるよう適合させてもよい。したがって、１つの側面においては、本発明は、試料ＤＮＡ配列中の標的位置の塩基を同定する方法であって、標的位置にすぐ隣接して試料ＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーを用意し、試料ＤＮＡおよび伸長プライマーを、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、それによりデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを、それが標的位置の塩基と相補的である場合にのみ取り込まれてピロホスフェート（ＰＰｉ）を放出するようにし、ＰＰｉの放出を酵素的に検出し、異なるデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを、試料−プライマー混合物の別個のアリコートに、または同じ試料−プライマー混合物に連続的に、添加して、ポリメラーゼ反応に供し、どのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが取り込まれたかを示す方法であって、取り込まれなかったヌクレオチドが分解されるようにヌクレオチド分解酵素をポリメラーゼ反応工程中に包含させることを特徴とする方法を提供する。本明細書で用いる場合、「ヌクレオチド分解酵素」という用語は、ヌクレオチド類（少なくともヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰｓ）を含み、場合によってはジおよびモノホスフェートをも含む）を非特異的に分解することができるすべての酵素、および、ヌクレオシドトリホスファターゼまたは他のＮＴＰ分解活性が存在することを条件に、このような酵素のあらゆる混合物または組み合わせを含む。ホスファターゼ活性を有するヌクレオチド分解酵素は、本発明ににおいて好都合に用いることができるが、ホスフェート基以外の位置で（例えば塩基または糖残基で）ヌクレオチドを切断する酵素のような、任意のヌクレオチドまたはヌクレオシド分解活性を有する酵素を用いてもよい。したがって、ヌクレオシドトリホスフェート分解酵素は、本発明に関して必須である。ヌクレオシドジおよび／またはモノホスフェート分解酵素は、付加的であり、ヌクレオシドトリホスフェート分解酵素との組み合わせで用いてもよい。好適なこのような酵素としては、最も顕著にはアピラーゼが挙げられる。アピラーゼは、ヌクレオシドジホスファターゼおよびトリホスファターゼの両方であり、ＮＴＰ→ＮＭＰ＋２ＰｉおよびＮＴＰ→ＮＤＰ＋Ｐｉ（ここで、ＮＴＰは、ヌクレオシドトリホスフェートであり、ＮＤＰは、ヌクレオシドジホスフェートであり、ＮＭＰは、ヌクレオシドモノホスフェートであり、Ｐｉは、ホスフェートである）の反応を触媒する。アピラーゼは、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Compamy）から入手してもよい。他の好適なヌクレオチドトリホスフェート分解酵素としては、ブタ膵臓ヌクレオシドトリホスフェートジホスホヒドロラーゼ(Le Bel et a l.,1980,J.Biol.Chem.,255，1227-1233)が挙げられる。さらなる酵素は文献に記載されている。異なる組み合わせのヌクレオシドトリ、ジまたはモノホスフェートを用いることができる。このような酵素は、文献に記載されており、異なる酵素はデオキシヌクレオチドの分解に関して異なる特徴（例えば異なるＫｍ、異なるヌクレオチドに関して異なる効率等）を有する可能性がある。したがって、任意の所定の系においてヌクレオチド分解工程の効率を増大させるために、ヌクレオチド分解酵素の異なる組み合わせを用いてもよい。例えば、いくつかの場合においては、さらなるヌクレオシドトリホスフェートを添加した場合に、残存しているあらゆるヌクレオシドジホスフェートをヌクレオシドトリホスフェートに転換しうるキナーゼによる汚染に付随する問題がある可能性がある。このような場合においては、ヌクレオシドジホスフェートを分解するためにヌクレオシドジホスファターゼを含有させることが有利であり得る。有利には、ヌクレオシドトリ、ジおよびモノホスファターゼの組み合わされた作用により、すべてのヌクレオチドをヌクレオシドに分解してもよい。一般的に言って、ヌクレオチド分解酵素は、ポリメラーゼに対して相対的に、ヌクレオチドが最初に効率的にポリメラーゼによって取り込まれ、次に、取り込まれなかったヌクレオチドが分解されるように、速度論的特徴を有するように選択される。したがって、例えば、望ましい場合には、ヌクレオチド分解酵素のＫｍは、ポリメラーゼによって取り込まれなかったヌクレオチドが分解されるように、ポリメラーゼのＫｍより高くてもよい。これは、配列決定手順を、連続的なヌクレオチドの添加の間にテンプレートを洗浄する工程なしで進めることを可能にする。さらなる利点の１つは、洗浄工程が回避されるので、各々の新たなヌクレオチドの添加とともに新たな酵素、例えばポリメラーゼを添加する必要がなく、したがって手順の経済性が改善されることである。したがって、ヌクレオチド分解酵素は、単にポリメラーゼ反応混合物に包含され、連続的な各ヌクレオチド添加の間に、取り込まれなかったヌクレオチドの実質的にほとんどが分解されるために充分な時間が与えられる。用いるべきヌクレオチド分解酵素の量、およびヌクレオチド添加の間の時間の長さは、選択した反応体、反応条件等によって、それぞれの特定の系について容易に決定することができる。しかし、例えば、酵素アピラーゼは０．２５Ｕ／ｍｌ〜２Ｕ／ｍｌの量で好都合に用いることができることが見出されている。上述したように、ヌクレオチド分解酵素は、ポリメラーゼ反応工程中に含有させることができる。これは、ポリメラーゼ反応（すなわち鎖伸長またはヌクレオチド取り込み）が起こる前、それと同時、またはその後に、例えばポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドを試料／プライマーに添加する前、それと同時、またはその後に、酵素をポリメラーゼ反応混合物に単に添加することにより達成してもよい。１つの態様においては、ヌクレオチド分解酵素は、ポリメラーゼ反応のための反応混合物の溶液に単に含有させてもよく、ポリメラーゼ反応は、ポリメラーゼまたはヌクレオチドの添加により開始させてもよい。あるいは、ヌクレオチド分解酵素は、固体支持体、例えば粒子固体支持体（例えば磁性ビーズ）またはフィルター、またはディップスティック等の上に固定化してもよく、それを好都合な時間にポリメラーゼ反応混合物に添加してもよい。例えば、このような固定化された酵素は、ヌクレオチド取り込み（鎖伸長）が起こった後に添加してもよく、次に、取り込まれたヌクレオチドが加水分解される場合には、次のヌクレオチドを添加する前に、固定化された酵素を反応混合物から除去してもよい（例えば磁性粒子の場合には磁性によって、それを、例えば取り出し、または捕獲する）。次いで、この手順を、より多くの塩基を配列決定するために、繰り返してもよい。このようなアレンジは、短い期間により多くのヌクレオチド分解酵素が添加されることを可能にするので、より効率的なヌクレオチド分解が達成され得るという利点を有する。このアレンジはまた、ＤＮＡ重合およびヌクレオチド分解という２つの競合する反応の間のバランスの最適化を容易にし得る。別の態様においては、ヌクレオチド分解酵素の固定化を、溶液中の酵素の使用と組み合わせてもよい。例えば、より少ない量をポリメラーゼ反応混合物中に含有させてもよく、必要な場合、上述のような固定化酵素を添加することによりヌクレオチド分解活性を高めてもよい。本明細書で用いる場合、「ジデオキシヌクレオチド」という用語は、３’−ヒドロキシル基が欠如し、または改変されており、したがって、ポリメラーゼの存在下でプライマーに付加されることはできるが、その後の重合反応に入ることはできない、すべての２’−デオキシヌクレオチドを包含する。ＰＰｉは、多くの異なる方法によって測定することができ、多数の酵素的方法が文献に記載されている（Reeves et al.,(1969),Anal.Biochem.,28,282-287;Gu illory et al.,(1971),Anal.Biochem.,39,170-180;Johnson et al.,(1968),Anal .Biochem.,15,273;Cook et al.,(1978),Anal.Biochem.91,557-565;およびDrake et al.,(1979),Anal.Biochem.94,117-120）。ピロホスフェートの放出を同定するために、ルシフェラーゼおよびルシフェリンを組み合わせで用いることが好ましい。これは、生成される光の量は、放出されたピロホスフェートの量に実質的に比例し、放出されたピロホスフェートの量は、取り込まれた塩基の量に正比例するためである。光の量は、ルミノメーターのような好適な光感受性装置により容易に概算することができる。ＰＰｉの放出を検出するためのルシフェリン−ルシフェラーゼ反応は、当業界で周知である。特に、酵素ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼに基づいてＰＰｉ放出を連続的にモニタリングする方法は、NyrenおよびLundin（Anal.Bi ochem.,151,504-509，1985）により開発されており、ＥＬＩＤＡ（Enzymatic Lu minometric Inorganic Pyrophosphate Detection Assay；酵素的ルミノメトリック無機ピロホスフェート検出アッセイ）と呼ばれる。ＰＰｉを検出するためのＥＬＩＤＡ法の使用は、本発明によれば、好ましい。しかし、この方法は、例えばより熱安定性の高いルシフェラーゼ（Kaliyama et al.,1994,Biosci.Biotech.Bi ochem.,58,1170-1171）および／またはＡＴＰスルフリラーゼ（Onda et al.,199 6,Bioscience,Biotechnology and Biochemistry,60:10,1740-42）の使用により、改変してもよい。この方法は、以下の反応に基づいている：したがって、ＰＰｉ検出反応に関与する好ましい検出酵素は、ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼである。本発明の方法は、例えばＷＯ９３／２３５６４およびＷＯ８９／０９２８３に記載されたように、２つの工程で行ってもよく、最初にポリメラーゼ反応工程、すなわちヌクレオチドが取り込まれるプライマー伸長工程を行い、続いてＰＰｉの放出をモニタリングまたは検出し、ヌクレオチド取り込みが起こったかどうかを検出する第二の検出工程を行ってもよい。したがって、ポリメラーゼ反応が起こった後に、ポリメラーゼ反応混合物からの試料を、採取して、例えば試料のアリコートをＥＬＩＤＡ酵素および反応体を含有する反応混合物中に添加することにより、ＥＬＩＤＡによって解析してもよい。しかし、上述したように、本発明の方法は、配列決定（すなわち塩基の取り込み）反応をリアルタイムで連続的にモニタリングすることを可能にし得る。これは、「検出酵素」を鎖伸長反応混合物中に含有させることによって、鎖伸長および検出（またはシグナル生成）反応を実質的に同時に行うことによって、簡便に達成される。これは、上述の文献で考察されたＰＰｉベースの配列決定手順において報告されたアプローチ（ここでは、鎖伸長反応を第一の反応工程として分離して最初に行い、続いて別個の「検出」反応を行い、ここで伸長反応の生成物を、続いてルシフェリン−ルシフェラーゼベースのシグナル生成（「検出」）反応に供する）からの逸脱を表す。この「リアルタイム」手順は、本発明の好ましい態様を表す。本発明の方法のこの好ましい態様を実施するためには、ＰＰｉ検出酵素をポリメラーゼ反応工程、すなわち鎖伸長反応工程に含有させる。したがって、検出酵素は、ポリメラーゼ反応の前、それと同時またはその後に、ポリメラーゼ工程のための反応混合物に添加される。したがって、ＥＬＩＤＡ検出反応の場合には、ポリメラーゼ反応のための反応混合物は、少なくとも、ヌクレオチド（デオキシまたはジデオキシ）、ポリメラーゼ、ルシフェリン、ＡＰＳ、ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼをヌクレオチド分解酵素とともに含有することができる。ポリメラーゼ反応は、ポリメラーゼ、より好ましくはヌクレオチドの添加により開始させてもよく、あるいは、好ましくは、検出酵素は、反応が開始される時に既に存在するか、反応を開始させる試薬とともに添加してもよい。したがって、本発明のこの後者の態様は、ポリメラーゼ反応中にＰＰｉ放出が検出されることを可能にし、リアルタイムのシグナルを与える。配列決定反応は、リアルタイムで連続的にモニタリングしてもよい。したがって、ＰＰｉ放出の迅速な検出のための手順が本発明により可能になる。ＥＬＩＤＡ反応は、２秒未満で起こると概算されている（Nyren and Lundin、前出）。律速工程は、ＡＴＰスルフリラーゼによるＰＰｉのＡＴＰへの変換であり、一方、ルシフェラーゼ反応は素早く、０．２秒未満で起こると概算されている。ポリメラーゼについての取り込み率もまた、種々の方法で概算されており、例えばKlenow（クレノウ）ポリメラーゼの場合には、１つの塩基の完全な取り込みが０．５秒未満で起こりうることが見出されている。したがって、ＥＬＩＤＡによる１つの塩基の取り込みおよび検出のための概算の総時間は、およそ３秒である。したがって、非常に早い反応時間が可能であり、リアルタイムの検出が可能になることがわかるであろう。反応時間は、より熱安定性の高いルシフェラーゼを用いることにより、さらに短縮しうる。存在する半分のヌクレオチドを分解するために秒のオーダーの時間でヌクレオチド分解酵素を用いることにより、数秒〜数分の時間枠内で効率的な分解を達成することができる。したがって、本発明の方法は、４種までまたはそれ以上の酵素の反応混合物、すなわち多酵素混合物が関与する単一の反応工程において行ってもよい。複数の相互に関連した酵素反応間の有益で協調的な効果を本発明にしたがって起こすことができ、有益な結果が得られることは驚くべきことである。したがって、カップリングした配列決定／検出系は、以下の反応に基づいていることができる：アピラーゼのようなヌクレオチド分解酵素は、ルシフェラーゼ反応において使用されないＡＴＰも分解するであろうことは注目される。したがって、すべてのヌクレオチドトリホスフェートが分解される。実際、本発明にしたがったＰＰｉ放出をルシフェラーゼベースの反応、例えばＥＬＩＤＡによって検出する場合、このＡＴＰ分解活性は、特にルシフェリン／ルシフェラーゼ反応による光生成を「消灯」することにおいて、重要な利点であり得る。これも、ルシフェラーゼ酵素の低い「燃焼率」とともに、有利であり得る。ＰＰｉベースの配列決定方法に関して従来観察された潜在的な問題の１つは、配列決定（鎖伸長）反応において用いられるｄＡＴＰが、ルシフェラーゼ酵素の基質として作用することにより、その後のルシフェラーゼベースの検出反応において干渉することである。これは、デオキシまたはジデオキシアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）の代わりに、ポリメラーゼの基質としては作用することができるが上記ＰＰｉ検出酵素の基質としては作用することができないｄＡＴＰまたはｄｄＡＴＰアナログを用いることにより低減または回避することができる。「作用することができない」という用語は、ＰＰｉ検出反応において実質的に有意な干渉がない、または無視できる程度の干渉しかないように、検出酵素のための貧弱な基質であるアナログ、または実質的に基質として作用することができないアナログをも含む。したがって、本発明のさらに好ましい特徴は、酵素的ＰＰｉ検出反応においては干渉しないが、それにもかかわらずポリメラーゼによって伸長するＤＮＡ鎖に正常に取り込まれることができ、かつヌクレオチド分解酵素によって分解されることもできるｄＡＴＰまたはｄｄＡＴＰアナログの使用である。「正常に取り込まれる」とは、ヌクレオチドは正常な正しい塩基対を形成して取り込まれることを意味する。ルシフェラーゼがＰＰｉ検出酵素である本発明の好ましい態様においては、本発明にしたがって用いるための好ましいアナログは、デオキシまたはジデオキシＡＴＰの〔１−チオ〕トリホスフェート（またはα−チオトリホスフェート）アナログ、好ましくはデオキシアデノシン〔１−チオ〕トリホスフェート、またはこれも公知のデオキシアデノシンα−チオトリホスフェート（αＡＴＰαＳ）である。ｄＡＴＰαＳは、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰのα−チオアナログとともに、New England Nuclear Labsから購入することができる。実験により、ｄＡＴＰをｄＡＴＰαＳで置換することは、ｄＡＴＰαＳとルシフェラーゼとの間での相互作用の欠如のため、低いバックグラウンドシグナルでのポリメラーゼによる効率的な取り込みを可能にすることが示された。ｄＡＴＰの代わりにヌクレオチドアナログを用いることにより、それがルシフェラーゼの基質として作用することができるｄＡＴＰの能力により引き起こされるバックグラウンドを排除し、シグナル対ノイズ比は増大する。特に、ｄＡＴＰによる干渉に起因するルシフェリン−ルシフェラーゼ系による光の生成によるバックグラウンドシグナルが実質的に減少する一方で、ポリメラーゼを用いての効率的な取り込みが達成され得る。他のヌクレオチドのｄＮＴＰαＳアナログも、すべてのｄＮＴＰの代わりに用いてもよい。試料ＤＮＡ（すなわちＤＮＡテンプレート）は、好都合には一本鎖であることができ、固体支持体上に固定されていてもよく、溶液中にあってもよい。本発明にしたがったヌクレオチド分解酵素の使用は、洗浄工程はもはや必要ではないので、洗浄を容易にするためにテンプレートＤＮＡを固定化する必要がないことを意味する。熱安定性酵素を用いることにより、二本鎖ＤＮＡテンプレートもまた用い得る。試料ＤＮＡは、例えばＰＣＲまたは他の増幅フラグメント、Ｍ１３またはプラスミドのようなベクター中のインサートを含む任意の望ましいＤＮＡ供給源により提供することができる。本発明の方法をサイクルとして繰り返し、それによって試料ＤＮＡを配列決定するために、また、一本鎖試料ＤＮＡをその相補鎖から分離するのを助けるために、試料ＤＮＡを、場合により固定化するか、または固体支持体への付着のための手段とともに提供することが望ましい。さらに、利用可能な試料ＤＮＡの量は少量である可能性があり、したがって、本発明の方法を実行する前に試料ＤＮＡを増幅することが望ましいことがある。試料ＤＮＡは増幅してもよく、例えば、ＰＣＲもしくはSelf Sustained Seq uence Replication（３ＳＲ）によりインビトロで、またはベクターを用いてインビボで、任意の方法を用いることができ、望ましい場合には、インビトロおよびインビボの増幅を、組み合わせて用いてもよい。いずれの増幅方法を用いる場合であっても、手順は、増幅されたＤＮＡを固定化し、または固体支持体への付着手段とともに提供するよう改変することができる。例えば、ＰＣＲプライマーを固定化してもよく、または固体支持体への付着手段とともに提供してもよい。また、ベクターは、増幅された試料ＤＮＡおよび付着手段が一緒に切り出されるように、試料ＤＮＡの挿入部位の隣に固体支持体への付着手段を含んでいてもよい。増幅されたＤＮＡの固定化は、１または２以上のプライマーを支持体に付着させる場として、ＰＣＲ増幅反応それ自身の一部として起こってもよく、あるいは１または２以上のＰＣＲプライマーがその後の固定化を可能にする官能基、例えばビオチンまたはチオール基を有していてもよい。プライマーの５’末端による固定化は、ＤＮＡの鎖が固体支持体に付着すべきプライマーから発し、その３’ 末端が支持体から離れてその後の伸長プライマーとのハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼによる鎖伸長に利用可能であることを可能にする。固体支持体は、好都合にはマイクロタイターウェルの形態をとってもよく、これは、有利には８×１２の従来のフォーマット、またはプライマーＤＮＡを結合するように活性化されるポリスチレン製であってもよい計量棒（ディップスティック）の形態であってもよい（K．Almer，Doctoral Theses，Royal Institute o f Technology，Stockholm，Sweden，1988）。しかし、当業界で記載されている非常に多数のいずれのものをも含め、任意の固体支持体を好都合に用いることができ、例えば分離／固定化反応または固相アッセイ用のものがある。したがって、支持体は、例えば、アガロース、セルロース、アルギネート、テフロン（商標）またはポリスチレン製の、粒子、繊維またはキャピラリ（毛細管）を含んでいてよい。磁性粒子、例えばDynal AS（Oslo,Norway）によって生産される超常磁性ビーズもまた、支持体として用いてもよい。固体支持体は、プライマーの付着のために、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒドまたはアミノ基のような官能基、あるいは他の部分（アビジンまたはストレプトアビジン等）を担持していてもよい。これらは、一般に、支持体を処理してこのような官能基の１つを担持するポリマーの表面コーティングを提供することにより提供され得る。例えば、ポリグリコールとともにポリウレタンを用いてヒドロキシル基が提供され、またはセルロース誘導体によりヒドロキシル官能基、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーまたはコポリマーによりカルボキシル基、またはアミノアルキル化ポリマーによりアミノ基が提供される。米国特許第４６５４２６７号には、多くのこのような表面コーティングの導入が記載されている。反応副生成物の蓄積が起こり得る。これは、一定数（例えば１５〜２５回）の反応サイクルの後、試料を洗浄することにより容易に回避することができる。洗浄は、試料を固体表面に固定化することにより容易にすることができる。アッセイ技術は、非常に簡便で迅速であり、したがって多数の試料を迅速に解析する可能性がある場合にはロボット装置を用いることによって自動化することが容易となる。好ましい検出および定量は発光計測反応に基づいているので、これは、分光光度分析的に容易に行うことができる。ルミノメーターの使用は、当業界で周知であり、文献に記載されている。したがって、本発明のピロホスフェート検出法は、大規模な、電気泳動によらない、固相配列決定手順のための自動化アプローチの可能性を拓くものであり、これは、時間とともに重合反応の進行を連続的に計測することを可能にする。また、本発明の方法は、複数の試料を並行して取り扱うことができるという利点も有する。標的ＤＮＡは、試料中のＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであってもよく、したがって、本発明の方法は、特徴的なＲＮＡに基づく診断に適用可能である。このような予備的合成は、逆転写酵素を用いる予備的処理により、好都合には用いる場合その後のＰＣＲ工程の緩衝液および塩基類と同じ系において、実行することができる。ＰＣＲ手順は、鎖の分離を行うために加熱を必要とするので、逆転写酵素は最初のＰＣＲサイクルで不活性化されることになる。ｍＲＮＡが試料核酸である場合、すべてのｍＲＮＡをその末端のポリＡ配列を介して取り出すために、最初の試料、例えば血清試料を、固定化ポリｄＴオリゴヌクレオチドでの処理に供することが有利である可能性がある。あるいは、特異的オリゴヌクレオチド配列を用いて、そのＲＮＡを、特異的ＲＮＡ配列を介して取り出してもよい。オリゴヌクレオチドは、次に、ＷＯ８９／０９８２に記載されているようにｃＤＮＡ合成のプライマーとして役立つことができる。有利には、伸長プライマーは、標的位置のすぐ５’側の配列との適切なハイブリダイゼーションを提供するのに充分に長いものであり、なおかつ不要な化学合成を避けるために妥当に短いものである。Ｃ−Ｇペアリング（対合）においてより多い水素結合が利用できるので、伸長プライマーのサイズおよびハイブリダイゼーションの安定性がある程度Ａ−Ｔ対Ｃ−Ｇの塩基ペアリングの比に依存することは、当業者には明らかであろう。また、当業者は、伸長プライマーと増幅される配列の他の部分との間の相同性の度合いも考慮して、それにしたがってストリンジェンシー（厳密性）を選択するであろう。このようなルーチンの実験のための指針は、例えばSambrook，J.,Fritsch E.F．およびManiatis,T(1989)の「Mo lecular Cloning:A Laboratory Manual」のような文献に見出すことができる。配列決定プライマーがテンプレートの３’末端から少なくとも１塩基内側にハイブリダイズすることを確実にすることが、平滑末端ＤＮＡポリメラーゼ活性を排除するために有利であり得る。別個のアリコート（すなわち各塩基について１つの、４つのアリコート）を用いる場合、伸長プライマーは、各アリコートに別個に添加してもよいが、好ましくは試料を４つのアリコートに分ける前に添加する。伸長プライマーは、ＰＣＲプライマーと同一であってもよいが、系にさらなる特異性の要素を導入するために、好ましくは異なるものであることは注意すべきである。あるいは、リン酸化された５’末端を有する、ループを含み、それ自身および一本鎖テンプレートの３’末端にアニーリングするプライマーを用いることができる。テンプレートの３’末端がＴ（テンプレート）で示される配列領域を有する場合、プライマーは、５’末端から始まる以下の配列を有する：Ｐ−Ｌ−Ｐ’ −Ｔ’、ここで、Ｐはプライマー特異的であり（５〜３０ヌクレオチド）、Ｌはループであり（好ましくは４〜１０ヌクレオチド）、Ｐ’はＰに相補的であり（好ましくは５〜３０ヌクレオチド）、Ｔ’は３’末端のテンプレート配列（Ｔ）（少なくとも４ヌクレオチド）に相補的である。このプライマーは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼまたは同様の酵素を用いて一本鎖テンプレートに連結させることができる。これは、テンプレートとプライマーとの間に共有結合リンクを提供し、したがってハイブリダイズしたプライマーがプロトコールの最中に洗い落とされる可能性を回避する。伸長プライマーおよびデオキシヌクレオチドの存在下でのポリメラーゼ反応は、ジデオキシヌクレオチドを取り込むであろうポリメラーゼ、例えばＴ７ポリメラーゼ、クレノウまたはシークエナーゼ（Sequenase）Ver.2.0（ＵＳＢＵ.Ｓ. Ａ.）を用いて実行する。任意の好適なポリメラーゼを好都合に用いることができ、多くが当業界で公知であり、文献に報告されている。しかし、多くのポリメラーゼはプルーフリーディングまたはエラーチェック能を有すること、および鎖伸長に利用可能である３’末端はしばしば１または２以上のヌクレオチドにより消化されることが公知である。本発明の方法においてこのような消化が起こる場合、バックグラウンドのノイズのレベルが上昇する。この問題を避けるために、プルーフリーディングのないポリメラーゼ、例えばエキソヌクレアーゼ欠損（ｅｘｏ^-）クレノウポリメラーゼを用いてもよい。そうでない場合、ポリメラーゼによる３ ’消化を抑制するフッ化物イオンまたはヌクレオチドモノホスフェートを各アリコートに添加することが望ましい。正確な反応条件、反応体の濃度等は、選択にしたがって各系について容易に決定することができる。しかし、すべての遊離３ ’末端が伸長されることを確実にするために、プライマー／テンプレートに対して過剰のポリメラーゼを用いることが有利であり得る。本発明の方法において、充分に伸長されていないテンプレートが蓄積する場合に起こりうるバックグラウンドシグナルの急速な増大のため、各伸長工程において高い効率を有するＤＮＡポリメラーゼが必要である。各工程における高い正確性も望ましく、これは、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて達成することができる。しかし、これは、プライマーの分解が起こりうるという上述の不利益を有する。クレノウポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は低いが、本発明者らは、プライマーの３’末端がヌクレオチドの不存在下でのより長いインキュベーションで分解されることを見出した。重合工程におけるインデュースト・フィット結合メカニズムは、１０⁵〜１０⁶の正確性に向かっての正味の貢献を有する正しいｄＮＴＰの結合について非常に効率的に選択する。エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼ、例えば（ｅｘｏ^-）クレノウまたはシークエナーゼ２．０は、ヌクレオチドの取り込みを触媒するが、これは、相補的なｄＮＴＰが存在するときのみ観察され、プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性が存在しなくても、これらの酵素の高い正確性が確認された。シークエナーゼ２．０と比較して（ｅｘｏ^-）クレノウＤＮＡポリメラーゼを用いる主な利点は、その、ヌクレオチドに対するより低いＫｍであり、これが低いヌクレオチド濃度であってさえ、高率のヌクレオチド取り込みを可能にする。すべてのｄＮＴＰをヌクレオチドアナログまたは非天然ヌクレオチド（例えばｄＮＴＰαＳ）で置換することも可能であり、このようなアナログは、エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとともに用いるためには好ましいことがある。ある種の場合、例えばより長い試料テンプレートを用いるような場合には、正しくない（ミスマッチ）ヌクレオチドについてよりも正しい（マッチ）ヌクレオチドの取り込みについてより低いＫｍを有するポリメラーゼを用いることが有利であり得る。これは、本方法の正確性および効率を改善し得る。このような好適なポリメラーゼ酵素としては、ショウジョウバエ（Drosophila）のα−ポリメラーゼが挙げられる。多くの診断用の適用、例えば遺伝的疾患のキャリアについての遺伝的試験において、試料は、ヘテロ接合体の物質を含むことになる。これは、標的位置に、そのＤＮＡの半分がある１つのヌクレオチドを有し、他の半分が別のヌクレオチドを有することになるということである。したがって、本発明の１つの態様において４つのアリコートを用いる場台、２つは陰性のシグナルを示すであろうし、２つは陽性のシグナルの半分を示すであろう。したがって、各試料中に検出されるシグナルの量を定量的に測定することが望ましいことがわかるであろう。また、同じ塩基の２またはそれ以上がプライマーの３’末端に隣接する場合、より大きなシグナルが生成されることも理解されるであろう。ホモ接合体の試料の場合には、試料を４つのアリコートにするとき、３つの陰性および１つの陽性シグナルがあることは明らかであろう。さらに本方法の正確性を増強するために、両方向の配列決定、すなわち二本鎖テンプレートの両鎖の配列決定を行ってもよい。これは、例えばヘテロ接合体の材料を配列決定する場合に有利であり得る。好都合には、これは、二本鎖試料テンプレートを一方の鎖によって、例えば粒子上またはマイクロタイターウェル中に、固定化し、第二の鎖を溶出し、そして両鎖を別個に本発明の方法による配列決定に供することにより達成してもよい。本発明の方法を実施する場合、試薬（例えばＮＴＰ溶液）の、ＰＰｉによる可能性のあるあらゆる汚染は望ましくなく、試薬溶液中に、好ましくは少量で、ピロホスファターゼを含有させることにより、容易に回避することができる。実際、あらゆる種類の汚染は回避することが望ましく、例えばキナーゼによる汚染を回避するために、高純度の、または注意深く精製された試薬を用いることが好ましい。反応効率は、試薬（ＮＴＰおよび／またはポリメラーゼ）溶液中にＭｇ²⁺イオンを含有させることにより改良してもよい。プライマーのすぐ３’側の標的塩基がその３’側と同じ塩基を有する場合、および重合がデオキシヌクレオチド（ジデオキシヌクレオチドでなく）を用いて行われる場合、伸長反応により、同時に２つの塩基が付加され、実際、試料中の連続する同一の塩基のあらゆる配列は、プライマー中への対応する塩基の同時取り込みをもたらすことは理解されるであろう。しかし、そのような反復を検出するのに何の困難もないように、解放されるピロホスフェートの量は、取り込まれた塩基の数に明らかに比例するであろう。プライマーは、上述の手順で単一の塩基（または同一の塩基の配列）ごとに伸長されるので、伸長されたプライマーは、正確に同じようにして、繰り返した手順において配列中の次の塩基の決定に役立つことができ、したがって試料全体の配列決定が可能になる。上述したように、本発明の方法においては、異なるデオキシまたはジデオキシヌクレオチドを試料−プライマー混合物の別個のアリコートに添加してもよく、あるいは同じ試料−プライマー混合物に連続的に添加してもよい。これは、ある一定の反応において個別のおよび複数の両方の標的ＤＮＡ試料（そのＤＮＡ試料は同じであっても異なるものであってもよい）を用いる状況をカバーする。したがって、例えば以下においてより詳細に記載するように、本発明のある種の態様においては、１つの容器中で１つの反応（伸長される１つの試料ＤＮＡ、すなわち１つの標的ＤＮＡ配列の意味において）があってもよく、その一方で、他の態様においては、同じ反応チャンバー中に異なるプライマー−試料の組み合わせが存在してもよいが、例えば領域選択的固定化により、分離状態に保たれる。本発明は、固定化ＤＮＡの配列決定の、２つの基本的な方法を提供する。Ａ．本発明は、試料ＤＮＡの配列決定の第一の方法を提供する。この方法においては、試料ＤＮＡを増幅に供し；増幅されたＤＮＡを場合により固定化して、次に鎖分離に供し、一方の鎖、例えば場合により固定化された鎖または固定化されていない鎖を除去し（すなわちいずれの鎖を配列決定してもよい）、配列決定すべきＤＮＡの部分にすぐに隣接する試料ＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーを用意し；次に、一本鎖ＤＮＡの４つのアリコートの各々を、デオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、各アリコートには異なるデオキシヌクレオチドを用いることによって、標的位置の塩基に相補的なデオキシヌクレオチドのみが取り込まれるようにし；塩基取り込みにより放出されたピロホスフェートを同定する。取り込まれたヌクレオチドの同定の後、ヌクレオチド分解酵素を添加する。異なるアリコートからのヌクレオチド分解酵素の分離の際、例えばそれが磁性ビーズ上に固定化されている場合には、その４つのアリコートをヌクレオチド添加の新たなサイクルにおいて用いることができる。次に、この手順を連続的に繰り返すことができる。Ｂ．本発明は、試料ＤＮＡを配列決定する第二の方法も提供する。この方法においては、試料ＤＮＡを増幅に供し；増幅されたＤＮＡを場合により固定化し、次に鎖分離に供し、一方の鎖、例えば場合により固定化されている鎖または固定化されていない鎖を除去し、配列決定すべきＤＮＡの部分にすぐ隣接する試料ＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーを提供し；次に、一本鎖ＤＮＡを第一のデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、ピロホスフェートの放出の度合いを決定し、取り込まれなかったヌクレオチドをヌクレオチド分解酵素によって分解し、反応を、第二、第三、第四のデオキシヌクレオチドの連続的な添加によって、ピロホスフェートの陽性の放出が特定のデオキシヌクレオチドのプライマー中への取り込みを示すまで繰り返し、そこで、手順を、１度に１塩基プライマーを伸長するよう、また、各段階で伸長されたプライマーのすぐ３’ 側の塩基を決定するよう、繰り返す。解析のための代替的なフォーマットの１つは、アレイフォーマットを用いることであり、このフォーマットにおいては、試料を、例えば微小に製作されたチップの表面に分布させ、それにより規則正しい試料のセットを２次元フォーマットに固定化してもよい。多くの試料をこれにより並行して解析することができる。本発明の方法を用いれば、酵素および１つのヌクレオチドを含有する溶液を表面から流出させて、次に各試料について生成されたシグナルを検出することにより、このようにして多くの固定化テンプレートを解析することができる。次に、この手順を繰り返すことができる。あるいは、テンプレートに相補的ないくつかの異なるオリゴヌクレオチドを表面に分布させ、続いてテンプレートのハイブリダイゼーションを行ってもよい。デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの取り込みは、プライマーとして種々のオリゴヌクレオチドを用いて生成されたシグナルにより各オリゴヌクレオチドについてモニタリングしてもよい。表面の異なる区域からのシグナルを一緒にすることにより、配列ベースの解析を、種々のジデオキシヌクレオチドを用いるポリメラーゼ反応の４つのサイクルにより行ってもよい。本出願人らにより係属中の出願ＷＯ９０／１１３６９に記載されているような（ネステッド・プライマーを用いる）２段階ＰＣＲを用いて、シグナル対ノイズ比を強化し、それにより本発明の方法の感度を増大させてもよい。このような予備的な増幅により、標的ＤＮＡの濃度は、試料中に存在しうる他のＤＮＡに関して大きく増大し、標的ＤＮＡの異なる配列に対して特異的な少なくとも１つのプライマーを用いる第二段階の増幅により、「バックグラウンドノイズ」に対して標的ＤＮＡによるシグナルが有意に増強される。一段階または二段階ＰＣＲのどちらを行うかに拘らず、ＰＣＲの効率は重要ではない。これは、本発明は、アリコートとは異なる区別される差異に依存するためである。しかし、上述したように、増幅されたＤＮＡの存在または不存在のチェックとして、例えばＷＯ９０／１１３６９に記載されているようなＤＩＡＮＡ法（Detection of Immobilized Amplified Nucleic Acids）による最初の定性的ＰＣＲを行うことが好ましい。任意の好適なポリメラーゼを用いてよいが、ＰＣＲの各サイクルにおいて、さらにポリメラーゼ（例えばクレノウフラグメント）を添加することなしに反復的な温度サイクルを行うことを可能にするために、Ｔａｑポリメラーゼのような好熱性酵素を用いることが好ましい。上記で論じたＰＣＲは、最初に標的ＤＮＡを増幅する好ましい方法であるが、当業者はＰＣＲの代わりに、またはそれと組み合わせて、他の方法を用いてもよいことを理解するであろう。温度サイクルまたは熱安定性ポリメラーゼの使用を必要としない増幅技術の最近の開発の１つは、Self Sustained Sequence Rephca tion（３ＳＲ）である。３ＳＲは、レトロウイルスの複製をモデルとしており、増幅に用いることができる（Gingeras，T.R．et al.，PNAS（USA）87:1874-1878 およびGingeras,T.R.et al.,PCR Methods and Applications Vol.1,pp.25-33）。上で示したように、この方法は、ジデオキシヌクレオチド残基がＤＮＡ鎖の末端に取り込まれる場合、ピロホスフェートの放出を同定することに適用することができる。ＷＯ９３／２３５６２は、ＤＮＡ配列の単一の標的位置での塩基の同定方法（ミニ・シーケンシング）に関する。この方法においては、試料ＤＮＡを増幅に供し；増幅されたＤＮＡを固定化し、次に鎖分離に供し、固定化されていない鎖を除去し、標的位置にすぐ隣接する固定化ＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーを用意し;固定化された一本鎖ＤＮＡの４つのアリコートの各々を、次に、ジデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、各アリコートには異なるジデオキシヌクレオチドを用いて、それにより標的位置の塩基に相補的なジデオキシヌクレオチドのみが取り込まれるようにし；次に、４つのアリコートを４つすべてのデオキシヌクレオチドの存在下で伸長反応に供し、それにより各アリコートにおいてジデオキシヌクレオチドと反応していないＤＮＡを伸長させて二本鎖ＤＮＡを形成させ、一方、ジデオキシでブロックされたＤＮＡフラグメントを一本鎖のまま残るようにし；続いて二本鎖および／または一本鎖ＤＮＡを同定してどのジデオキシヌクレオチドが取り込まれたか、それゆえどの塩基が標的位置に存在したかを示す。明らかに、鎖停止ジデオキシヌクレオチド反応におけるピロホスフェートの放出は、どの塩基が取り込まれたかを示すが、その後のデオキシヌクレオチドプライマー伸長反応（いわゆるチェース反応）において放出された比較的大量のピロホスフェートは、はるかに強いシグナルを与えるので、より高感度である。通常、ジデオキシヌクレオチドなしの対照（コントロール）および４つすべてのジデオキシヌクレオチドの混合物を含有する「ゼロ」対照を設けることが望ましい。ＷＯ９３／２３５６２は、「ジデオキシヌクレオチド」という用語を、さらなる鎖伸長を防止することにより同じように作用する３’保護２’−デオキシヌクレオチドを含むものとして定義している。しかし、３’保護基が、例えば加水分解によって除去可能であれば、鎖伸長（単一塩基ごと）の後に３’位のブロック除去を続け、伸長された鎖をさらなる伸長反応の準備ができた状態にしてもよい。このようにして、鎖伸長は、上で論じたような同一塩基の配列についての複雑さなしに、一度に１つの位置を進むことができる。したがって、上述の方法ＡおよびＢは、改変することができ、それにより各段階で付加された塩基が３’保護２ ’−デオキシヌクレオチドであり、この塩基が付加された（および発光が検出された）後に、３’保護基を除去してさらに３’保護２’−デオキシヌクレオチドが付加されるのを可能にする。好適な保護基としては、アルカノール基のようなアシル基、例えばアセチル、または実際当業界で公知の任意のヒドロキシル保護基、例えば「Protective Groups in Organic Chemistry」JFW McOnie,Plenum Pr ess,1973に記載されているものが挙げられる。本発明は、上記の態様において、単一塩基変化の検出のための簡便で迅速な方法を提供する。１つのフォーマットにおいては、これは２つの技術、すなわち固相技術(磁性ビーズに結合させたＤＮＡ)および酵素的発光計測検出アッセイ（ＥＬＩＤＡ）を成功裏に一緒にする。この方法は、選択的に増幅されたＤＮＡフラグメントを同定および定量するために用いることができる。それはまた、単一塩基置換の検出および増幅された多型遺伝子フラグメントについてのヘテロ接合性インデックスの推定のためにも用いることができる。これは、この方法が、後天的および遺伝性疾患の両方に関与する希な点突然変異についてスクリーニングするため、ＤＮＡ多型を同定するため、また、ウイルスまたは細菌の薬剤耐性および薬剤感受性株を区別するためにさえ、遠心分離、ろ過、抽出または電気泳動する必要なしに用いることができることを意味する。この方法は、その簡便性のため、多くの医療的（広い範囲の遺伝性疾患におけるルーチンの解析）および商業的適用に好適である。以下に表す陽性の実験結果は、本発明の方法が段階的単一デオキシヌクレオチドの取り込みを伴う、オンライン自動化非電気泳動ＤＮＡ配列決定法に適用可能であることを示す。一本鎖ＤＮＡを得るための増幅およびプライマーとのアニーリングの後、テンプレート／プライマーフラグメントを、ｄＮＴＰインキュベーションの反復的サイクルにおいて用いる。試料は、ＥＬＩＤＡにおいて連続的にモニタリングする。ＤＮＡの合成には、取り込まれたヌクレオチドの量と等しい量の無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）の放出が付随するので、ＥＬＩＤＡにおけるシグナルは、相補的な塩基が取り込まれたときにのみ観測される。ＰＰｉを定量的に決定するこの方法の能力のため、２つまたはいくつかの同時の取り込みから単一塩基の取り込みを区別することが可能である。ＤＮＡテンプレートは、好ましくはＰＣＲによって得られるため、そのようなアッセイについて必要とされるＤＮＡの量を増加させることは、比較的容易である。上述のように、本発明者らの結果は、電気泳動によらない大規模なＤＮＡ配列決定の新規なアプローチの可能性を拓くものであり、この配列決定法は、時間とともに重合反応の進行を連続的に測定することを可能にする。このようなアプローチの成功のためには、「フェーズが合っていない（not“in phase”）」テンプレートが蓄積する場合に急速に増大するバックグラウンドシグナルのため、ＤＮＡポリメラーゼの高い効率の必要性がある。この新規なアプローチは、標準的配列決定法と比較して、いくつかの利点を有する。第一に、この方法は、複数の試料を並行して取り扱うのに適している。第二に、比較的費用に対する効果のよい装置を企図することができる。さらに、この方法は、電気泳動の使用を避け、それにより試料の装填およびゲルの作製を回避する。本発明の方法のさらなる利点は、標準的なサンガー法配列決定プロトコールにおいてゲル電気泳動工程中に圧縮を起こす配列を解析するために用いることができることである。本発明の方法は、他の配列決定法における適用をも見出し得る。例えば、プローブまたはアダプターの連結およびその後の切断に基づく多数の反復配列決定法（有利には、二本鎖標的ＤＮＡの配列決定を可能にするもの）が記載されてきた（例えば米国特許第５，５９９，６７５号およびJones，BioTechniques,22:938- 946,1997を参照されたい）。このような方法は、一般に、クラスIIＳヌクレアーゼ認識部位を含有する二本鎖プローブ（またはアダプター）を、二本鎖標的（試料）ＤＮＡへ連結すること、およびプローブ／アダプター−標的複合体を連結部位からの１または２以上のヌクレオチドの標的ＤＮＡ内の部位で切断することを包含し、短くなった標的ＤＮＡが残される。次に、連結および切断サイクルを繰り返す。標的ＤＮＡの末端の１または２以上のヌクレオチドを同定することにより配列情報が得られる。末端ヌクレオチドの同定は、本発明の方法を用いる鎖伸長により達成してもよい。さらに二本鎖ＤＮＡの配列決定を可能にするために、例えばニックの導入による、鎖置換に基づく配列決定プロトコール（例えばFu et al.，Nucleic Acids R esearch,1977,25(3):677-679に記載されている）において本発明の方法を用いてもよい。このような方法においては、試料ＤＮＡを、例えば非リン酸化もしくはモノリン酸化またはジデオキシヌクレオチドを含有させることにより、ニックを導入するために役立つ二本鎖プローブまたはアダプター配列を連結することにより改変してもよい。鎖置換ポリメラーゼを用いることにより、ニックのところでプローブ／アダプターの３’末端を伸長させることにより配列決定反応が起こることが可能になり、本発明の方法にしたがってヌクレオチドの取り込みが検出される。有利には、本発明の方法は、ＷＯ９３／２３５６３において教示されている方法と組み合わせてもよい。その方法は、ＰＣＲを用いて、目的のＤＮＡ鎖の３’ 末端に永久的に付着した３’プライマーを提供するループ構造を導入する。例えば、このような改変された方法においては、伸長プライマーを、標的位置を含む二本鎖ＤＮＡの１つの鎖の標的配列上に３'末端ループ構造の一部として導入し、前記標的配列は、その３’末端に領域Ａを有し、場合によっては領域Ａから３ ’側に伸びるＤＮＡ領域Ｂを有し、それにより、標的配列に相補的な配列の３’ 末端にハイブリダイズする第一のプライマー（この第一のプライマーは固定化されているか、または固体支持体への付着手段を備えている）と、標的配列のＡおよび／またはＢの少なくとも一部にハイブリダイズする３’末端配列を有する一方で実質的にＡと同一の配列をその５’末端に有する第二のプライマーとを用いて前記二本鎖ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に供し、前記増幅により標的配列の３’末端に以下の順序：領域Ａ、ループを形成することができる領域および配列Ａに相補的な配列Ａ’を有する二本鎖の標的ＤＮＡを生成し、その後、増幅された二本鎖ＤＮＡを固定化形態で鎖分離に供し、それにより固定化されていない標的鎖を放出させて、領域Ａ’が領域Ａにハイブリダイズできるようにするかハイブリダイズを起こさせ、それにより前記ループを形成する。領域Ａ’の３’末端は、標的位置のすぐ隣にハイブリダイズする。ジデオキシおよび／または伸長反応は、ハイブリダイズした部分をプライマーとして用いる。本発明の方法は、公知の単一塩基変化のリアルタイムの検出のために用いてもよい。このコンセプトは、ミスマッチの３’末端に対するマッチした３’末端の、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長効率における差異の測定に依存する。ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応の速度は、従来記載されているＥＬＩＤＡにより測定される。重合反応において形成されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換され、このＡＴＰ産生は、ホタルルシフェラーゼにより連続的にモニタリングされる。単一塩基検出アッセイにおいては、一本鎖ＤＮＡフラグメントをテンプレートして用いる。３’末端で１塩基異なる２つの検出プライマーを設計する；一方は突然変異していないＤＮＡ配列に完全に相補的であり、他方は突然変異したＤＮＡ配列に完全に相補的である。プライマーを、目的の塩基に対して３’末端でハイブリダイズさせ、プライマー伸長速度を、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドとのインキュベーションの後、ＥＬＩＤＡを用いて測定する。検出プライマーがテンプレートに正確に一致する場合、高い伸長速度が観察される。これに対し、検出プライマーの３’末端がテンプレートに正確に一致しない（ミスマッチ）場合、プライマー伸長速度ははるかに低くなる。こうして、ミスマッチの３’末端に対するマッチした末端のＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長速度の差異を、単一塩基差異のために用いることができる。したがって、突然変異ＤＮＡ配列の存在を、突然変異していない配列から区別することができる。相対ミスマッチ伸長効率は、３’ミスマッチ末端の後の次の正しい天然デオキシヌクレオチドをα−チオトリホスフェートで置換することにより、かなり低減され得る。ヌクレオチド分解酵素の存在下でこのアッセイを行うことにより、Ａ：Ｔ、Ｔ：ＧおよびＣ：Ｔのような伸長されやすいタイプのミスマッチとマッチとの間を区別することがより容易になる。本発明はまた、本発明の方法における用途のためのキットをも含む。キットは、通常、少なくとも以下の構成成分を含む：（ａ）標的位置がプライマーの３’末端に直接隣接するように試料ＤＮＡにハイブリダイズする試験特異的プライマー；（ｂ）ポリメラーゼ；（ｃ）ピロホスフェート放出を同定するための検出酵素手段；（ｄ）ヌクレオチド分解酵素；（ｅ）デオキシヌクレオチド、または場合によってはデオキシヌクレオチドアナログ、場合によっては、ｄＡＴＰの代わりに、ポリメラーゼの基質として作用することができるが前記ＰＰｉ検出酵素の基質として作用することはできないｄＡＴＰアナログを含む；および（ｆ）場合により、ジデオキシヌクレオチド、または場合によってはジデオキシヌクレオチドアナログ、場合によっては、ｄｄＡＴＰは、ポリメラーゼの基質として作用することができるが前記ＰＰｉ検出酵素の基質として作用することはできないｄｄＡＴＰアナログで置換されているもの。キットが、最初のＰＣＲ増幅について使用するためのものである場合、通常は、以下の構成成分もまた含む： (i) 少なくとも１つのプライマーがプライマーの固定化を可能にする手段を有する１対のＰＣＲプライマー； (ii) 好ましくは熱安定性である、ポリメラーゼ（例えばＴａｑＩポリメラーゼ）； (iii) ＰＣＲ反応のための緩衝液；および (iv) デオキシヌクレオチド。本発明を、非制限的な例を用いて、図面を参照しながら説明する。図面において、図１は、本発明の新規なＤＮＡ配列決定法の模式図である。４つの異なるヌクレオチドを、プライマーにハイブリダイズしたテンプレートに段階的に添加する。ＤＮＡポリメラーゼ触媒反応において放出されたＰＰｉを、ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼにより触媒される反応によって検出する。シグナルの高さは、取り込まれた塩基の数に比例する。添加されたヌクレオチドは、ヌクレオチド分解酵素により連続的に分解される。最初に添加されたヌクレオチドの分解の後、次のヌクレオチドを添加する。これらの工程をサイクルで繰り返し、テンプレートの配列を推定する。図２は、３５塩基長のオリゴヌクレオチドテンプレート上でのＤＮＡ配列決定を示す。約２ｐｍｏｌのテンプレート／プライマー(Ｅ３ＰＮ／ＮＵＳＰＴ)を、４ｐｍｏｌの（ｅｘｏ^-）クレノウおよび０．２Ｕのアピラーゼとともにインキュベートした。反応は、０．４ｎｍｏｌの示したデオキシヌクレオチドの各々の添加により開始させ、放出されたＰＰｉをＥＬＩＤＡによってリアルタイムで検出した。テンプレートのＤＮＡ配列を図に示す。実験条件は例１に記載したとおりである。図３は、３５塩基長のオリゴヌクレオチドテンプレート上でのＤＮＡ配列決定を示す。約５ｐｍｏｌのテンプレート／プライマー(Ｅ３ＰＮ／ＮＵＳＰＴ)を、８ｐｍｏｌの（ｅｘｏ^-）クレノウおよび０．２Ｕのアピラーゼとともにインキュベートした。反応は、０．４ｎｍｏｌの示したデオキシヌクレオチドの各々の添加により開始させ、放出されたＰＰｉをＥＬＩＤＡによって検出した。テンプレートのＤＮＡ配列を図に示す。実験条件は例１に記載したとおりであった。図４は、３５塩基長のオリゴヌクレオチドテンプレート上でのＤＮＡ配列決定を示す。約５ｐｍｏｌのテンプレート／プライマー(ＰＥＢＥ２５／ＲＩＴ２７) を、８ｐｍｏｌの（ｅｘｏ^-）クレノウおよび０．２Ｕのアピラーゼとともにインキュベートした。反応は、０．４ｎｍｏｌの示したデオキシヌクレオチドの各々の添加により開始させ、放出されたＰＰｉをＥＬＩＤＡによって検出した。テンプレートのＤＮＡ配列を図に示す。実験条件は例１に記載したとおりであった。図５は、１６０塩基長の一本鎖ＰＣＲ生成物上で行ったリアルタイムＤＮＡ配列決定を示す。約５ｐｍｏｌのテンプレート／プライマー（ＮＵＳＰＴ）を、８ｐｍｏｌの（ｅｘｏ^-）クレノウおよび０．２Ｕのアピラーゼとともにインキュベートした。反応は、０．４ｎｍｏｌの示したデオキシヌクレオチドの各々の添加により開始させ、放出されたＰＰｉをＥＬＩＤＡによって検出した。プライマーの後のＤＮＡ配列を図に示す。実験条件は例１に記載したとおりであった。図６は、例２に記載したとおりの配列決定プライマーにハイブリダイズした１３０塩基長の一本鎖ＰＣＲ生成物上で行った本発明の配列決定法を示す。約２ｐｍｏｌのテンプレート／プライマーを、アッセイにおいて用いた。反応は、０．６ｎｍｏｌの示したデオキシヌクレオチドの各々の添加により開始させ、放出されたＰＰｉを、記載した方法によって検出した。プライマーの後のＤＮＡ配列を図に示す。例１材料および方法オリゴヌクレオチドの合成および精製オリゴヌクレオチドＰＥＢＥ２５（３５ｍｅｒ：５'−ＧＣＡＡＣＧＴＣＧＣＣＡＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧ−３'）、ＲＩＴ２７（２３ｍｅｒ：５'−ＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧ−３'）、Ｅ３ＰＮ（３５ｍｅｒ：５'−ＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＡＧＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ−３'）、ＮＵＳＰＴ（１７ｍｅｒ：５'−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３'）、ＲＩＴ２０３（５１ｍｅｒ：５'−ＡＧＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＡＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧ−３'）、ＲＩＴ２０４（５１ｍｅｒ：５'−ＡＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴＡＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＧＡＡＣＣＣＡ−３'）、ＲＯＭＯ２０５Ｓ（５'−ＣＧＡＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＧＣＧ−３'）、ＲＯＭＯ２０５Ｂ（２５ｍｅｒ：５'−ビオチン−ＣＧＡＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＧＣＧ−３'）、ＲＩＴ２８、ＲＩＴ２９、およびＵＳＰ（Hultman,et al.(1990)Nudeic Acids Res.18,5107-5112）を、自動化ＤＮＡ合成装置(Gene Assembler Plus,Pharmaci a Biotech,Uppsala,Sweden)を用いてホスホルアミダイト化学により合成した。精製は、迅速タンパク液体クロマトグラフィｐｅｐＲＰＣ５／５カラム（Pharma cia Biotech）によって行った。インビトロ増幅およびテンプレート調製ＰＣＲ反応を、Hultmanら（前出）にしたがって、プラスミドｐＲＴ２８のマルチリンカー上で７．５pmolの一般的プライマーＲＩＴ２８およびＲＩＴ２９（ビオチニル化されている）を用いて行った。ビオチニル化されたＰＣＲ生成物を、ストレプトアビジンでコーティングされた超常磁性ビーズDynabeads(登録商標 )Ｍ280−ストレプトアビジンまたはＭ450−ストレプトアビジン（Dynal A.S.,Os lo,Norway）上に固定化した。０．１０ＭＮａＯＨ中で５分間の固定化されたＰＣＲ生成物のインキュベーションの後、上清を除去することにより、一本鎖ＤＮＡを得た。固定化された一本鎖ＤＮＡの洗浄および配列決定プライマーとのハイブリダイゼーションは、以前に記載されたように行った(Nyren,et al .(1993)Anal.Biochem.208,171-175)。ヘアピンベクターｐＲＩＴ２８ＨＰの構築およびＰＣＲ増幅テンプレートの調製オリゴヌクレオチドＲＩＴ２０３およびＲＩＴ２０４を、ＨｉｎｄII（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）で予め制限したプラスミドｐＲＩＴ２８にハイブリダイズさせ、連結した（得られたプラスミドを、ｐＲＩＴ２８ＨＰと名づけた）。プラスミドｐＲＩＴ２８ＨＰのマルチリンカー上で、７．５pmolのプライマー対、ＲＩＴ２９／ＲＯＭＯ２０５ＳまたはＲＩＴ２７／ＲＯＭＯ２０５Ｂ、２００μＭのｄＮＴＰ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）、２ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１％Tween ２０、および１単位のAmphTaq ＤＮＡポリメラーゼを用いて、最終容量５０μＬでＰＣＲ反応を行った。温度プロフィールは、９５℃ で１５秒間の変性工程および７２℃で９０秒間のハイブリダイゼーション／伸長工程を含んでいた。これらの工程を、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム、９６００（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）を用いて３５回繰り返した。ＲＩＴ２９／ＲＯＭＯ２０５Ｓ増幅反応から得られた固定化された（上述のとおり）一本鎖ＤＮＡまたはＲＩＴ２７／ＲＯＭＯ２０５Ｂ増幅反応からの非ビオチニル化一本鎖ＤＮＡフラグメントを、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭＭｇＣｌ₂中で６５℃で５分間ハイブリダイズさせ、自己プライミング・ループ構造を作製した。ＤＮＡ配列決定オリゴヌクレオチドＥ３ＰＮ、ＰＥＢＥ２５、および上述のＰＣＲ生成物を、ＤＮＡ配列決定のためのテンプレートとして用いた。オリゴヌクレオチドＥ３ＰＮ、ＰＥＢＥ２５、および一本鎖ＲＩＴ２８／ＲＩＴ２９増幅ＰＣＲ生成物を、それぞれプライマーＮＵＳＰＴ、ＲＩＴ２７およびＮＵＳＰＴにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたＤＮＡフラグメント、または自己プライミング・ループ構造を、改変Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ(Sequenase2.0;U.S.Biochemical,Cl eveland,OH,USA)またはエキソヌクレアーゼ欠損（ｅｘｏ^-）クレノウＤＮＡポリメラーゼ（Amersham,UK）のいずれかとともにインキュベートした。配列決定手順は、異なるデオキシヌクレオシドトリホスフェート(Pharmacia Biotech)の連続的な付加の際のプライマー鎖の段階的伸長、およびアピラーゼによるヌクレオチドの同時分解により行った。ヌクレオチドの取り込みによるＰＰｉ放出を、ＥＬＩＤＡによって検出した。生成されたＡＴＰおよび取り込まれなかったデオキシヌクレオチドを、アピラーゼによりリアルタイムで分解した。発光は、ポテンシオメトリックレコーダーに接続したＬＫＢ１２５０ルミノメーターを用いて測定した。ルミノメーターは、内部光標準について１０ｍＶの応答を与えるように較正した。発光アウトプットは、既知の量のＡＴＰまたはＰＰｉの添加により較正した。標準的アッセイ容量は、０．２ｍｌであり、以下の成分を含有していた：０．１Ｍトリス−アセテート（ｐＨ７．７５）、２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭマグネシウムアセテート、０．１％ウシ血清アルブミン、１ｍＭジチオスレイトール、２μＭアデノシン５’−ホスホスルフェート（ＡＰＳ）、０．４ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリドン（３６０，０００）、１００μg／ml Ｄ −１０ＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ：スルフェートアデニリルトランスフエラーゼ；ＥＣ２．７．７．４）(Sigma Chemical Co.)、１００〜４００ｍＵアピラーゼ(ヌクレオシド５’トリホスファターゼおよびヌクレオシド５’ジホスファターゼ；ＥＣ３.６.１.５)(Sigma Chemical Co.)、精製ルシフェラーゼ(Sigma Chemical Co.,)、０．１μＭＡＴＰについて２００ｍＶの応答を与える量。１〜５pmol のＤＮＡフラグメントおよび３〜１５pmolのＤＮＡポリメラーゼを上記の溶液に添加した。配列決定反応は、０．２〜１．０nmolのデオキシヌクレオチドの１つ（Pharmacia Biotech）を添加することによって開始させた。反応は、室温で行った。従来のＤＮＡ配列決定新規なＤＮＡ配列決定により得られた配列データを、放射能標識ターミネーターを用いた半自動化固相配列決定法（Hultman,et al.(1991)BioTechniques10,84 -93）により確認した。ループ構造ＰＣＲ生成物から生成されたサンガーフラグメントは、ゲルにかける前にＢｇｌII制限エンドヌクレアーゼにより制限した。結果配列決定法の原理新規な配列決定法の原理を図１において説明する。目的の特異的ＤＮＡフラグメント（一本鎖ＤＮＡテンプレートにハイブリダイズした配列決定プライマー、または自己プライミング−本鎖生成物）を、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびヌクレオチド分解酵素とともにインキュベートし、反復サイクルのヌクレオチドインキュベーションを行う。ＤＮＡの合成は、取り込まれたヌクレオチドのそれに等しいモラリティのＰＰｉの放出を伴う。それにより、酵素的無機ピロリン酸検出アッセイ（ＥＬＩＤＡ）により、相補的な塩基が取り込まれた場合にのみ、リアルタイムのシグナルが得られる。ＥＬＩＤＡにおいては、生成されたＰＰｉを、ＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰに変換し、次に、ＡＴＰの量をルシフェラーゼアッセイによって決定する（図１）。添加されたヌクレオチドはヌクレオチド分解酵素によって連続的に分解されるので、特定の時間間隔の後、新たなヌクレオチドを添加することができる。ＥＬＩＤＡの結果から、プライマーの後の配列を推定する。本発明のＤＮＡ配列決定法を、「パイロシーケンシング」(pyrosequencing）と名づける。方法の最適化新規なＤＮＡ配列決定法のいくつかの異なるパラメーターを、合成ＤＮＡテンプレートを用いてモデル系において最適化した。本方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる添加されたデオキシヌクレオチドの利用、カップリングした酵素系による放出されたＰＰｉの検出およびヌクレオチドの連続的分解に基づいているため、アッセイにおいて用いられる異なる成分の濃度は、注意深くバランスをとるべきである。添加された正しいデオキシヌクレオチドの数の関数としてのシグナルー程度を図２に示す。反応は、３つの最初の正しい塩基（ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ）の添加により開始させた。軌跡は、塩基の取り込みの間のＰＰｉ（ＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰに変換される）の放出、およびそれに続くＡＴＰの分解を示す。３つの残基の取り込みを記した。短いタイムラグの後（アピラーゼ反応は約２分間進行させた）、ｄＡＴＰαＳを添加した。１つの残基の取り込みに相当するシグナルが観察された。その後、次の２つの正しいデオキシヌクレオチド（ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）を添加した。今回は、２つの残基の取り込みが観察された。図２に示す結果は、このＤＮＡ配列決定のアプローチが機能することを示す；添加されたデオキシヌクレオチドは、各添加の間にアピラーゼにより分解され、観察されたシグナルは取り込まれたヌクレオチドの量に比例し、相補的でない塩基が添加された場合にはＰＰｉの放出が観察されなかった（示していない）。上述の実験においては、３２ｍＵＡＴＰスルフリラーゼ、２００ｍＵアピラーゼ、２Ｕ（ｅｘｏ^-）クレノウ、２ｐｍｏｌテンプレート／プライマー、および０．４ｐｍｏｌデオキシヌクレオチドを用いた。２４〜４８ｍＵＡＴＰスルフリラーゼ、１００〜４００ｍＵアピラーゼ、１〜５Ｕ（ｅｘｏ^-）クレノウ、１〜５ｐｍｏｌテンプレート／プライマー、および０．２〜１．０ｎｍｏｌデオキシヌクレオチド、の範囲で異なる化合物を変化させた場合に、同様の結果が得られた（示していない）。プライマー／テンプレートに対して過剰のポリメラーゼを用いることが、すべての遊離３’末端が伸長されることを確実にするために重要であり得る。また、配列決定プライマーがテンプレートの３’末端から少なくとも１塩基内側にハイブリダイズすることも、平滑末端ＤＮＡポリメラーゼ活性（Clark,1991,Gene,104,75-80）を排除するために重要であり得る。ＤＮＡ配列決定この新規なアプローチの能力を調べるために、次の一連の実験において、２つの異なる合成テンプレートならびにＰＣＲ生成物を配列決定した。図３および４は、２つの異なる合成テンプレート上で行ったＤＮＡ配列決定の結果を示す。両テンプレートとも、末端まで配列決定し、両方の場合において真の配列を決定することができた。ポリメラーゼがテンプレートの末端に達するとき、シグナルはかなり低減し、最後の塩基について重合が遅くなることを示す。より長いテンプレートを配列決定した場合、シグナルは、同じ程度では低減しなかった（図５）。非相補的塩基を添加した場合に観察された少量のシグナルは、ヌクレオチド溶液中のＰＰｉ汚染によるものである。このバックグラウンドシグナル(偽シグナル) の後での増大は、おそらく、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ活性によるものである（SigmaからのATPスルフリラーゼ調製物中の汚染物）。ヌクレオシドジホスフェートキナーゼは、新規なデオキシヌクレオチドトリホスフェートを添加すると、分解されていないデオキシヌクレオシドジホスフェートをデオキシヌクレオシドトリホスフェートに変換する。こうして、形成されたデオキシヌクレオシドトリホスフェートは、伸長するプライマー中に取り込まれることができる。この影響は、合成テンプレートＥ３ＰＮを配列決定した場合に特に明らかであった。最初の正しいヌクレオチド（ｄＣＴＰ）を添加したとき、分解されなかったｄＴＤＰのいくらかがｄＴＴＰに変換される。ｄＣＭＰが取り込まれた後、形成されたｄＴＴＰのいくらかが取り込まれ得る。この「フェーズがあっていない（ out-of-phase）」得られたＤＮＡは、ｄＧＴＰが添加されるとさらに伸長され得る。これは、フェーズがあっていないＤＮＡが、２つのＡが取り込まれるべき位置に達したときに明らかに示される。ここでは、偽シグナルの方が強い。２つのＴおよびＣの後も、より強いシグナルを与えるが、一方、次の単一のＡはより低いシグナルを与える。図５において、自己プライミングした１６０塩基長の一本鎖ＰＣＲ生成物の２０塩基の配列決定を示す。得られた配列は、半自動的固相サンガー配列決定法により確認された（データは示していない）。配列決定がフェーズが合わない主要な理由は、ジャガイモアピラーゼ（Liebecq，C.Lallemand A ,and Deguldre-Guinaume,M.J.(1963)Bull.Soc.Chim.Biol.45,573-594）によるデオキシヌクレオシドジホスフェート（少なくともｄＮＤＰのいくつか）の遅い分解と、Sigmaから入手したＡＴＰスルフリラーゼ調製物中のデオキシヌクレオチドジホスフェートキナーゼ汚染との組み合わせである。ＡＴＰスルフリラーゼの純粋調製物を用いることにより、またはより効率的なｄＮＤＰ分解酵素（Doremu s,H.D.and Blevins,D.G.(1988)Plant Physiol.87(1),41-45）を用いることにより、この問題を克服することが可能である。ＡＴＰスルフリラーゼの純粋調製物を用いる場合であっても、ヌクレオチド分解酵素（ＮＴＰａｓｅ、ＮＤＰａｓｅおよびＮＭＰａｓｅ）の組み合わせを用いることが、分解プロセスの速度を増大させ、かつ熱流動性平衡濃度のｄＮＴＰを低減させるために有利であり得る。さらに、ブタ膵臓ヌクレオシドトリホスフェートジホスホヒドロラーゼ(Le Bel，D.，Piriet，G.G.Phaneuf，S.,St-Jean，P.,Laliberte,J.F .and Beudoin，A.R.(1980)J.Biol.Chem.255,1227-1233;Lahberte,J.F.St-Jean,P .and Beudoin,R.(1982)J.Biol.Chem.257,3869-3871)のようなｄＮＴＰについて低いＫｍを有する酵素を用いることは、利点であり得る。例２ＰＣＲ生成物の「パイロシーケンシングビオチニル化されたＰＣＲ生成物を、ストレプトアビジンでコーティングされた超常磁性ビーズであるDynabeads(登録商標)Ｍ２８０−ストレプトアビジン（D ynal）上に固定化した。一本鎖ＤＮＡの溶出および配列決定プライマー（ＪＡ８０：５’−ＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＴＡＧＧ−３’）へのハイブリダイゼーションは、以前記載されたように行った(T.Hultman,M.Murby, ダイズしたテンプレート／プライマーを、シークエナーゼ２．０ＤＮＡポリメラーゼ（Amersham）とともにインキュベートした。配列決定手順は、異なるデオキシヌクレオシドトリホスフェート（Pharmacia Biotech）の連続的な添加の際のプライマー鎖の段階的な伸長、およびアピラーゼによるヌクレオチドの同時分解により行った。アピラーゼは、等級VI、高ＡＴＰａｓｅ／ＡＤＰａｓｅ比（ヌクレオシド５’−トリホスファターゼおよびヌクレオシド５’−ジホスファターゼ；ＥＣ３．６１．５）のものであった（Sigma Chemical Co.）。配列決定反応は、室温で行い、０．６ｎｍｏｌのデオキシヌクレオチドの１つ（Pharmacia Biotech）の添加により開始させた。ヌクレオチドの取り込みにより放出されたＰＰｉは、以前記載されたように検出した(例１を参照されたい)。ＪＡ８０は、ホスホルアミダイド化学により合成した（Interactiva）。パイロシーケンシング法により得られた配列決定データは、Hultmanらにしたがった半自動化固相サンガー配列決定法により確認された(T．Hultman，M．Murby，S.で行った。結果を図６に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】 1. 試料ＤＮＡ中の標的位置の塩基を同定する方法であって、標的位置にすぐ隣接して試料ＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーを用意し、試料ＤＮＡおよび伸長プライマーを、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、それによりデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを、それが標的位置の塩基と相補的である場合にのみ取り込まれてピロホスフェート（ＰＰｉ）を放出するようにし、ＰＰｉの放出を酵素的に検出し、異なるデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを、試料−プライマー混合物の別個のアリコートに、または同じ試料−プライマー混合物に連続的に添加して、ポリメラーゼ反応に供し、どのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが取り込まれたかを示す方法であって、取り込まれなかったヌクレオチドが分解されるようにヌクレオチド分解酵素をポリメラーゼ反応工程中に包含させることを特徴とする方法。 2. ヌクレオチド分解酵素が、アピラーゼである、請求項１記載の方法。 3. ヌクレオシドトリホスファターゼ、ヌクレオシドジホスファターゼおよびヌクレオシドモノホスファターゼ活性を有するヌクレオチド分解酵素の混合物を用いる、請求項１または２記載の方法。 4. ヌクレオチド分解酵素が、固体支持体に固定化されている、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 5. 前記固定化ヌクレオチド分解酵素を、ポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みが起こった後に添加し、次に、続くヌクレオチド取り込み反応工程の前に除去する、請求項４記載の方法。 6. ＰＰｉ放出を、酵素発光計測無機ピロホスフェート検出アッセイ（ＥＬＩＤＡ）を用いて検出する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。 7. ＰＰｉ検出酵素を、ポリメラーゼ反応工程に包含させ、ポリメラーゼ反応工程およびＰＰｉ放出検出工程を実質的に同時に行う、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。 8. ポリメラーゼ反応工程において、ポリメラーゼの基質として作用することができるがＰＰｉ検出酵素の基質としては作用することができないｄＡＴＰまたはｄｄＡＴＰアナログを用いる、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。 9. ｄＡＴＰアナログが、デオキシアデノシンα−チオトリホスフェート（ｄＡＴＰαＳ）である、請求項８記載の方法。 10.ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰのα−チオアナログの使用をさらに包含する、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。 11.試料ＤＮＡを、固定化する、または固体支持体への付着手段とともに提供する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。 12.試料ＤＮＡを、最初に増幅する、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。 13.伸長プライマーが、ループを含み、それ自身および試料ＤＮＡの３’末端にアニーリングする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。 14.正確性の高いエキソヌクレアーゼ欠損（ｅｘｏ^-）ポリメラーゼを用いる、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。 15.ＤＮＡ配列中の単一の標的位置の塩基の同定のための請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法であって、試料ＤＮＡを増幅に供し；増幅されたＤＮＡを固定化し、次に鎖分離に供し、固定化されていない鎖を除去し、固定化ＤＮＡに標的位置にすぐ隣接してハイブリダイズする伸長プライマーを用意し；固定化一本鎖ＤＮＡの４つのアリコートの各々を、次にジデオキシヌクレオチドの存在下でポロメラーゼ反応に供し、各アリコートに異なるジデオキシヌクレオチドを用い、それにより標的位置の塩基に相補的なジデオキシヌクレオチドのみが取り込まれるようにし；次に４つのアリコートを４つ全てのデオキシヌクレオチドの存在下で伸長に供し、それにより各アリコートにおいてジデオキシヌクレオチドと未反応のＤＮＡを伸長させて二本鎖ＤＮＡを形成させる一方で、ジデオキシでブロックされたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡのままに残し；その後、二本鎖ＤＮＡおよび／または一本鎖ＤＮＡを同定して、どのジデオキシヌクレオチドが取り込まれたか、したがってどの塩基が標的位置に存在したかを示す、方法。 16.請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法において用いるためのキットであって、 (a) 標的位置がプライマーのすぐ３’側に隣接するように試料ＤＮＡにハイブリダイズする試験特異的プライマー； (b) ポリメラーゼ； (c) ピロホスフェート放出を同定するための検出酵素手段； (d) ヌクレオチド分解酵素； (e) デオキシヌクレオチド、または場合によりデオキシヌクレオチドアナログ、場合によっては、ｄＡＴＰの代わりに、ポリメラーゼの基質として作用することができるが前記ＰＰｉ検出酵素の基質として作用することができないｄＡＴＰアナログを包含する；および (f) 場合により、ジデオキシヌクレオチド、または場合によりジデオキシヌクレオチドアナログ、場合によってはｄｄＡＴＰがポリメラーゼの基質として作用することができるが前記ＰＰｉ検出酵素の基質として作用することができないｄｄＡＴＰアナログで置換されていてもよいを含むキット。 17.請求項１６記載のキットであって、最初のＰＣＲ増幅について用いるためにさらに（ｉ）少なくとも１つのプライマーがプライマーの固定化を可能にする手段を有する１対のＰＣＲプライマー；（ii）ＰＣＲ用ポリメラーゼ；および（iii）デオキシヌクレオチドを含むキット。 18.複数の試料ＤＮＡ配列についての使用のために、前記ＤＮＡ配列を固体表面にアッセイフォーマットで配置する、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法またはキット。