HU228735B1 - Novel alkaline protease from bacillus sp. (dsm 14392) and washing and cleaning products comprising said novel alkaline protease - Google Patents

Novel alkaline protease from bacillus sp. (dsm 14392) and washing and cleaning products comprising said novel alkaline protease Download PDF

Info

Publication number
HU228735B1
HU228735B1 HU0500286A HUP0500286A HU228735B1 HU 228735 B1 HU228735 B1 HU 228735B1 HU 0500286 A HU0500286 A HU 0500286A HU P0500286 A HUP0500286 A HU P0500286A HU 228735 B1 HU228735 B1 HU 228735B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protein
acid
proteins
nucleic acid
protein according
Prior art date
Application number
HU0500286A
Other languages
English (en)
Inventor
Angrit Weber
Angela Hellebrandt
Susanne Schmitz
Karl-Heinz Maurer
Beatrix Kottwitz
Original Assignee
Henkel Ag & Co Kgaa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel Ag & Co Kgaa filed Critical Henkel Ag & Co Kgaa
Publication of HUP0500286A2 publication Critical patent/HUP0500286A2/hu
Publication of HUP0500286A3 publication Critical patent/HUP0500286A3/hu
Publication of HU228735B1 publication Critical patent/HU228735B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase

Description

Öj alkaükus proteáz őddüus (DSM 14392) törzsből és az ezeket tartalmazó mosó és tisztítószerek
A találmány a Bneífius .sp. (DSM 14392) törzsből nyerhető új, szubtílizin típusú alkalikus preteázra vonatkomk, valamint ezen fehérje változataira és származékaira. Á mosó- és a tisztítószerekben történő alkalmazásaikon túl ezek a szubtilizm típusú új alfcalikus proteázok, fehérje változataik és származékaik, további technikai alkalmazási lehetőségekben is megtalálják helyűket.
A szubtilizm típusú proteázok (szubtílázok, azufetilopepüdázok, EC 3,4,21,62} katalitikus hatású aminosavaik alapján a széria. proteázok közé tartoznak. Természetes körülmények között mikroorga.nánnuaok, különösen Bneáfes fajok termelik és szekrefalják. Nem specifikus sndopepíidázfcént hatnak, azaz tetszés szerinti savamidkotést hidrolizálnak, melyek főleg a peptidekben vagy a fehérjékben fordulnak elő. pH-optímum értékük legtöbbször a lúgos tartományban található. A szakirodalomban ezek áttekintésé megtörtént (Siezem Subtílases: SuhtHiam-like Proíeases 75-95 Subtilisin enzymesp kiadó: R. Bolt és C. Betzefi New York., (1996)], A szubtilizm. számos technikai alkalmazási lehetőséggel rendelkezik, így kozmetikumokban, és különösen a mosó- és tisztítószerek aktív alkotójaként szerepelhet.
Az enzimek a mosó- és tisztítószerek aktív alkotórészét adják. A proteázok képesek a tízzkandő termékek, mint például a textíliák, vagy szilárd, felületek fehérje tartalmú szennyezéseinek •S * lebontására. Kedvező esetben az enzimek ée a szer szokásos alkotói szinergista kölcsönhatásba lépnek. Erről a szakirodalomban beszámoltak (60008178 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi, bejelentés], A mosó- és tisztítószer proteázok között a szubtílízfe kedvező enzimatíkus tulajdonságai miatt, mint például stabilitás vagy pH optimum, kiemelkedő helyet foglal el, A továbbiakban ezek közül a. legfontosabbakat, és technikai továbbfejlesztésük legfontosabb stratégiáit mutatjuk be,
A moaeszer-proteázok fejlesztése alapvetően mikrobíálisan kialakuló enzimekből indul ki. Ezeket ismert mutagen hatást okozó eljárásokkal, példán! pontmutáciőval, deléciőval, inszerciőval vagy fúzióval, más fehérjékkel vagy fehérje részekkel, vagy más módon módosítjuk a mosó- és tisztítószerekbe adagolás optimalizálásához.
Ezt tehetjük a szakirodalomban leírtak alapján {WO 93/07276 számú szabadalmi bejelentés], ebben a szabadalmi bejelentésben. közzétették (Firmen Chemgen Corp., Gaithersburg, M.D, VSA, és Vista Chemical Company, Austin, TX, USA), hogy a. OnriÖus 164-A1 fejből nyerhető proteáz Í64-A1 mosó- és tisztítószerekben felhasználható. Az alkalikus proteázok további példái, éo forrásaik a kővetkezők: BóriSns sp-ből származó PD138, NCIMB 40338 (Fa), Novo^mes (WO 93/18140 számú szabadalmi bejelentés], melyet SadOus fajból fermentációval nyertek, a. BP3376 törzsből származó proteináz K-16 (Fa. Kao Corp., Tokyo, Japan) {5,344,770 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés), és a pzzfohmfe szervezetekből nyert jdfewbaeferium feafeabnum) proteáz (Fa, Procter fe Gamble, Cincínatti, OH, USA: WO 96/25489 számú szabadalmi bejelen> X ·.* •ί «· >
η :.n * * S* ♦ * «·* <· * tésj. A további míkrobiális eredetű pmteázok, melyek a mosó- és tisztítószerekbe megfelelnek, a szabadalmi irodalomban megtalálhatók, például Bseudamon<xs~ból [WO 00/05352 számú szabadalmi bejelentés], Áfefo.rrÁtfeum~böl (EP 601.005 számú szabadalmi bejelentés]., Socd&ís öfealqphífee DSM 6845 vagy DSM 5466 törzsekből [DE 4411223 számú szabadalmi bejelentés] és más további mikroorganizmusból )WÖ 95/07350 számú szabadalmi bejelentés, EP 1.029920 számú szabadalmi bejelentés, EP 57371.2 számú szabadalmi bejelentés, WO 01/00764 számú szabadalmi bejelentés, 6197740 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, Wö 01/16285 számú szabadalmi bejelentés].
A szúbtümn BPN\ mely a BadKus ampfobq-ue/ddenmbdl nyerhető, előnyösebben S. subhfe törzsekből, Vasantha és munkatársai, valamint Wells és mtsai munkái nyomán ismert [Vasantha és mtsai: d. Bacteríot, 159, 811-819(1984} Wells és mtsai: Nueleic Adds Research, 11, 7911-7925(1983}}. A szubtilízin BFN* elsősorban a szubtilízin számozás referencia enzimeként ismert. A szakirodalomban leírták [CA 2049097 Al számú szabadalmi bejelentés] ezen molekulák többszörösen mutált formált is, különösen figyelembe véve ezek stabilitását mosó- és tisztítószerekben. Az enzimek loop-régtoiban pontmutáciőkkal olyan változatokat kapunk, melyek a szubsztráthoz kisebb mértékben kapcsolódnak, miközben a hidrolízis sebessége nagyobb, ahogy ezt a szakirodalomban leírták [WO 95/07991 és WO 95/30010 számú szabadalmi bejelentések], Ilyen BPN' változatokat tartalmazd mosószereket a szakirodalomban közzétettek [Wö 95/29979 számú szabadalmi bejelentés].
•ίA szubtilizin Carlsherg proteáz! a szakirodalomban bemutatták (Smith és mtsai: J. Biot Chem., 243, 2184-2191(1968]; és Jacobs és mtsai: Nucl. Acids Rés., 13. kötet, 8913-8926(1983)]. Esek természetes körülmények. között a Buedlus ácAení/bunisbán épülnek fel, és például Maxatase^ márkanéven forgalmazzák (Genencor International Inc., Rochester, New York, USA), valamint Alcalase^ márkanéven (Novozymes A/S, Bagsvaetd, Dánemark] kapható. A. pontmutációval nyerhető, szubsztráthoz csökkent mértékben kötődő, de egyidejűleg nagyobb hidrolízis sebességű változatok a szakirodalomból ismertek (WO 96/28566 számú szabadalmi bejelentés]. Itt azokra a változatokra gondolunk, mely molekulák locp-régiójában egy vagy több kicserélés fordul elő.
A FB92 proteáz természetes körülmények között az alkaloid Bundám non. 92 törzsben képződik, és a Fa cég Maxacal® néven forgalmazza (Gist-Brooades, Detft, Niederlande], Ennek eredeti szekvenciáját a. szakirodalomban leírták (EP 283Ö75 számú szabadalmi bejelentés]. Az enzim pontmutáeióval nyerhető változatait, melyek mosó- és tisztítószerekben alkalmazhatók, a szakirodalomban közzétették (WO 94/02618 és EP 328229 számú szabadalmi bejelentések].
A szubtilizin 147 és 309 kereskedelmi neve Esperase^, illetőleg Savinase*’, ezeket a Novozyme cég forgalmazza. Eredetileg törzsekből származnak, melyeket a szakirodalomban közzétettek (GB 1243784 számú szabadalmi bejelentés]. Ezen enzimek pontmutációval továbbfejlesztett változatait, melyek mosó- és tisztítószerekben alkalmazhatók, a szakirodalomban közzétették (Wö 94/02618, WO 89/06279, WO 95/30011 és Wö 99/27082 számú szabadalmi bejelentések]. A WO 39/06279 számú szabadalmi bejelentés szerzői a következő célokat tűzték maguk elé: nagyobb stabilitás biztosítása oxidációval szemben, megnövelt proteolíxm sebesség és javított mosási teljesítmény. Kiderült, hogy bizonyos helyzetekben végzett kicserélés a szubtilizin 147 vagy 309 molekulák fizikai vagy kémiai stabilitását képes megváltoztatni. A WO 95/300II számú szabadalmi, bejelentés a sxufoíffizm 309 változatait mutatja be, melyeket a molekulák loop-területén pontmutációkkal alakítottak ki, igy a szubsztrát-ábszorpeiő csökken, miközben a hidrolízis sebessége nő. A WO 99/27082 számú szabadalmi bejelentés példája a szubtilizin 309 változatok fejlesztését mutatja be, mellyel a mosási teljesítmény javult, miközben az aktív loop-ot inszerciöval legalább egy aminosawal megnövelték.
A &«8us fentuc-böl nyert atkalikus proteázok a BnciOus fajok nagymértékben a&alikus proteázaL A. vadtípusű enzim egy alkaloid Bodfte törzsből származik, és stabilitása az oxidáció és a detergensek hatásaival szemben figyelemre méltó mértékben nagy. Ezt a törzset a szakirodalomban leírták [WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentés; EF 493398 számú szabadalmi bejelentés, és 5352604 számú Amerikai. Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés] és DEM 5433 számon letétbe helyezték. A fenti bejelentések alapján az enzim a Bacd/us kcheuí/brodz gazdában heterológ módon kifejeződhet. Háromdimenziós felépítését a szakirodalomban szintén leírták [Goddette és mtsaí: d. Mól. Biok, 228, 580595(1992): “The crystal structure of the Baeillus lentus alkaline protease, Subtihsm BL} at 1.4 A resolution”]. Ezen enzim pontmutáciokkal kapott változatai mosó és tisztítószerekben alkalmazhatók [WO 92/21.760 számú szabadalmi bejelentés; 5340735, 5500364 és 5985639 számú
-<· *
Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi bejelentések, és WO 95/23221 számú szabadalmi bejelentés; valamint a 5691295, 5801039 és 5S5562S számú. Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi bejelentések). A WO 95/23221 számú szabadalmi bejelentésben alapul vett stratégia a. raktározás érdekében a szuszbriát-kötőhely közelében lévé rész megváltoztatását célozta meg, ezt világítja meg a 6197589 számú Amerikai Egyesült Államok- beli szabadalmi bejelentés is, E proteáz további változatait még nem tették nyilvánossá. [DE 10121463 és DE 10153792 számú szabadalmi bejelentések).
A szubtílizin DY-t eredetileg Nedkov és munkatársai írták le [Nedkor és mtsaí; Biok Chem Hoppe-Seyler, 366, 421 -430(1985}). Például a WO 96/23557 számú szabadalmi bejelentés szerint a mosó- és tisztítószerekben történd optimalizáláshoz a megcélzott pontmutáciok az aktív loop-han szerepelhetnek, ide tartoznak a csökkentett. adhszorpdöjú és növelt hidrolízis sebességű változatok.
A Dmrmnaehnomgees vuk/ons-ban természetes körülmények között képződő tennitázt a szakirodalomban leírták [Melóim és mtsai: FEBS Lett, 195-200(1983). A csökkentett abszorpoiójú és megnövelt hidrolízis sebességű változatokat a loop-réglóban végzett szubsztitúciókkal nyerték [WO 96/28558 A2 számú szabadalmi bejelentés). A fentieken kívül olyan termitáz molekulák is vannak, melyekben a szekvenciák a többi szúbtilirinektöl jelentősen eltérnek.
A proteináz K is egy szubülizin, mely például a BacO&m fentes alkalikus proteázhoz képest kisebb homoiőgiát mutat. A proteináz K~t eredetileg a IWrirachmm album Umher mikroorganizmusban írták le [Jany és Mayer: Bioi. Chem. Hoppe-Seyler,
366. 485-492(1985)). A WO 96/28556 számú szabadalmi bejelentésben a proteínáz K-ban pöntautáciékksJ számos aminosavcserét végeztek, mely változatok a szubsztráthoz kevésbé abszorbeálódnak, és a hidrolízis sebességük nagyobb.
Végül a WO 88/07581 számú szabadalmi bejelentésben egymáshoz nagyon hasonló TW3 és TW7 proícázokaí tettek közzé, melyeket a mosó- és tisztítószerekben alkalmaztak,
A megfelelő proteázok további technikai alkalmazását, különösen mosó- és tisztítószerekben, a szakíród alom bán közzétették (EP 199404, EP 25X446, WO 91/06637 és WO 95/10591 számú szabadalmi bejelentések). Az EP 199404 számú szabadalmi bejelentés proteázai különbőzé BPPP változatok, melyek EP 130756 számú szabadalmi bejelentésen alapulnak, A WO 91/06637 számú szabadalmi bejelentés szerint a. “proteáz C-k a BP6P pontmutarlói a. 123. és/vagy 274, helyzetekben. Elsősorban a .Bacillus lentws-ból nyerhetők változatok, melyeket a WO 95/1059 X számú szabadalmi bejelentésben írtak le, valamint a 76, helyzet mutációi. és ezen kívül más helyzetek is érintettek.
A további ismert proteázok kereskedelmi nevei a kővetkezők: Dutaxymy Relase^', Everlase^, Naftzym, Natalase^, K'annase^ és Ovozymes^ (melyek a Novozymes cégtől szerezhetők be), Maxapem®, Purafeet^, Buraiért OxP^' és Froperase^ (melyek a Genencor-töl vásárolhatók), Protosol^ (Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien) és Wux? (Firma Wnxi Snyder Bxoproducts Ltd., Chína),
A szubtílízin mosási teljesítményének e^ík javítási stratégiája abban áll, hogy statisztikusan, vagy az egyes aminosavak ismert funkdöi alapján, az iámért molekulákban pontmutációkat alakítunk ki, és a kapott változatok mosási teljesítményre gyakoUR rolt hozzájárulását ellenőrizzük, A stratégia megvalósulhat például a. fentiekben említett szabadalmi bejelentésekben közzétett módon [EP 130756 számú szabadalmi bejelentés]. Például a WO 99/49056, WO 99/49057 és WO 01/07575 számú szabadalmi bejelentések szerint az enzimek bizonyos aminosavkicserélésekkel vagy elvételekkel kisebb allergenitású formák kialakításához vezethetnek.
A szubtilizin mosási teljesítményének javítására, .melyet az aktív loopfea történő további aminosav beépítéssel kísérelték meg elérni, a fentieken kívül [WO 99/37082 számú szabadalmi beje· lentés] számos bejelentést és stratégiát tettek közzé, ezek például a következő bejelentésekben találhatók meg: WO 00/37599, WO 00/37621-tői WO 00/37627-ig és WO 00/71633-től WO 00/71691-ig. Ezen alapelv alapján lehet az összes szubtiüzínt alkalmazni, melyek egyik alcsoportja az l~Sl. [igazi sznbtilizin), mig a. másik az 1-S2 (nagymértékben ulkalikus szubtilizin}.
A teljesítmény növelésének egy másik stratégiája abban áll, hogy a molekula felületi töltése és/vagy izoelektromos pontja, és így kölcsönhatása, a. szubsztráttal megváltoztatható. Az ilyen változatokat a szakirodalomban .leírták [5665537 számú Amerikai Egyesült Államok-beli. szabadalmi bejelentés; EP 405901 számú szabadalmi bejelentés, WO 91/00334 számú szabadalmi bejelentés, és WO 91/00345 számú szabadalmi bejelentés]. A pH-értéktől kevésbé függő molekula változatokat a WO 92/11348 számú szabadalmi bejelentésben, tették közzé. A WO 00/24924 számú szabadalmi, bejelentés ezen elv alapján a változatok azonosítási eljárásához vezetett, melyek alkalmazása a mosó- és tisztítószerekben megfelelő lehetne; bár az Összes közzétett változat legalább egy a 103, helyzetben végzett kicserélésre vonatkozik, előnyben részesítve a többszörös változatokat, amikor is a szóban forgó bejelentés a releváns kicseréléseket nem adja meg. A WO 96/34935 számú szabadalmi bejelentés szerint a teljesítmény javítását a mosó- és tisztítószerekben a molekula hidroföb jellege ís megnövelheti, ami az enssm stabilitására befolyással lehet.
A WÖ 99/20727 számú szabadalmi bejelentésből a szufetílizin változatokat ismerhetjük meg, melyek a WO 00/24924 számú szabadalmi bejelentés eljárásával előállíthatok: ezek mindegyike legalább egy kicserélést tartalmaz a. 103. helyzetben, kombinálva. sok más tehetséges kicseréléssel. Az ilyen mutánsokat a WO 99/20723 és a WO 99/20726 számú szabadalmi bejelentésekben közzétették mosó- és tisztítószerben történő alkalmazásokhoz, amit amilázzal, előnyösen fehérítővel egészítettek ki.
Egy másik eljárás a proteázok teljesítményének változtatására a fúziósfehérjék kialakításán alapul. így például a WO 98/13433 és a WO 00/01831 számú szabadalmi bejelentések proteázokból és inhibitorból fúziós fehérjék létrehozását teszik közzé, mint például a Stmpíomt/ces-szubtilizin-inhíbitor fúziós fehérjét. Egy további lehetőség a WO 97/28243 vagy a WO 99/57250 számú szabadalmi bejelentések szerint a cellulózokból nyerhető cellulóz kötődőmén (CBDj kapcsolása az aktív enzimhez, így növelve az aktív enzim koncentrációját a szubsztrátkőtőhely közeiében. A WO 99/43918 számú szabadalmi bejelentés szerint pephd-kapcsolók segítségével kapcsolt polimerekkel az allergenitás, előnyösen az immunogenítás csökkenthető.
A statisztikusan kialakított aminosavcserékkel és kiválasztással teljesítményükben javított változatokat nyerhetünk például fág bemutatási rendszeren alapuló eljárással [WO ί * ί*»1»
99/20769 azámtí szabadalmi bejelentés], ezek alkalmazását mosó- és tisztítószerekben a azaldrodalmnban leírták (WO 97/09446 számú szabadalmi bejelentés].
Az enzimfejlesztés egy modem iránya, melynek elemei ismertek, az új enzimek statisztikus előállítását egymással rokon fehérjék kombinálásával éri el, melyek a mai napig nem ismert tulajdonságokat mutatnak. Az ilyen eljárások tekinthetők irányított evolúciónak. Ide tartoznak például a következő eljárások: a St.EP módszer (Zhao és mtsai: Nat. Biotechnol., 16, 258-261 (1998}], a. randám primtng rekombináció (Shao és mtsai: Nucleíc Acids Rés., 26, 681-683(1998)], a DN8-shuílling (Stemmer: Natúré, 370, 389-391(1994)), vagy rekurzív szekvencia rekombináció (R8R) (WO 98/27230, WO 97/20078, WO 95/22625 számú szabadalmi bejelentések], vagy a RACHITT (Coco és mtsai: Nat. Biotechnol., 19, 354-3x59(2001)]. Ezek áttekintése a szakirodalomban megtalálható (Powell és mtsai: Gerichtete Evolution und Biokataiyse”, Angew. Chem., 113, 4068-4080(2001)).
Bgy további, különösen kiteljesített stratégia abban ált hogy a. kérdéses proteázok stabilitását és ezzel hatékonyságukat is megnövelik. Polimer csatolásával stabilizált proteázok kozmetikumokban alkalmazhatók, ahogy azt a. szakirodalomban leírták (5230891 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés]; ez lehetővé teszi a termék jobb elviselhetőségét a bőrön. Különösen a. mosó- és tisztítószereknél közismertek a pontmutádökkal végzett stabilizálások. így a 6087315 és 6110884 számú Amerikai Egyesült ÁUamok-heü szabadalmi bejelentések szerinti proteázok úgy stabilizálhatok, hogy bizonyos Hrozinokat más aminosavakra cserélünk. A WO 89/09819 és a WG 89/09830 számú szabadalmi bejelentésekben termostabilis BPN’ változatokat írtak le. A pontmutációkkal végzett stabilizálásra további leírt lehetőségek például a kővetkezők:
- Bizonyos aminosavak kicserélése prolinra [WO 92/19729 számú szabadalmi bejelentés, EP 583339 számú szabadalmi bejelentés és 5858757 számú Amerikai Egyesült ÁUamok-beli szabadalmi bejelentés, valamint EP 518200 számú szabadalmi bejelentés);
- A molekula felületére polárosabb vagy töltötte bb csoportok felvitele [EP 525610 számú szabadalmi bejelentés, EP 995801 számú szabadalmi bejelentés és 5453372 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés);
- A fémionok kötésének megerősítése, különösen a kalciumkotőhely mutagenezisével [WO 88/08028 és WO 88/08033 sssámú szabadalmi bejelentések);
- Az autolízis blokkolása módosítással vagy mutagenezissel (WO 98/20116 számú szabadalmi bejelentés; 5543302 számú Amerikai Egyesült AHamok-bek szabadalmi bejelentés).
- .Az BP 398539 számú szabadalmi bejelentésben, több stabilizálő stratégia kombinációját tették közzé.
·· Az 5340735, 5500364, 5985639 és 6136553 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentések szerint a stabilizáláshoz releváns helyzetek a háromdimenziós felépítés analízisével kiderithetők.
Például az EP 755999 és WO 98/30669 számú szabadalmi bejelentésekből tudjuk, hogy a proteázok, különösen a mosó- és tisztítószerekben használt javított, teljesítményű proteázok, előnyösen a mosó- és tisztítószerekben a tisztítási teljesítmény növelésére «-amilázzal és további mosószer enzimekkel együtt alkalmazhatok. Például az EP 791046 számú szabadalmi bejelentésben lipázos kombinációkat tették közzé. A WO 95/10592 számú szabadalmi bejelentés példáiban, a már a WO 95/10591 számú szabadalmi bejelentésben mosószerekhez alkalmazott változatokhoz adott fehérítő szerek alkalmazhatóságát teszik kézzé. A 6,121,226 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésben proteázok és talajt-kiszedó hatóanyagok egyidejű alkalmazását tették közzé mosószerekhez.
Például a WO 97/07770 számú szabadalmi bejelentésből ismert, hogy ezek kézül néhányat korábban mosószer proteázként használtak» de akár kozmetikai célokra is alkalmazhatók. A proteázok egyik további alkalmazási lehetőségét a szakirodalomban leírták [EP 380362 számú szabadalmi bejelentés). Ezek szintetikusan előállított formákra vonatkoznak, és ezért a fenti bejelentések szerint azok a szubtilizinek felelhetnek meg, melyeket pontmutácíőkkal stabilizáltak.
Az itt példákon keresztül bemutatott, különböző technikai felhasználási területek olyan proteázokat igényelnek, melyek különböző tulajdonságaik, például reakciókörülményeik» stabilitásuk vagy szubsztrát specíhtásuk révén, hozzájárulnak alkalmazhatóságukhoz. Viszont a proteázok technikai alkalmazhatósága, például a mosó- és tisztítószerek receptjeinek tekintetében további tényezőktől függnek, mint például magas hőmérséklettel szemben mutatott stabilitásuk, az oxidáló szerekkel szemben mutatott ellenállőképességük, tenzídes denaturálhatóságuk, kicsapó hatásuk, vagy elvárt szinergizmusuk más alkotórészekkel így nagyobb igény mutatkozik olyan technikailag alkalmazható proteázokra, melyek főbb alkalmazási területen, tulajdonsáΦ X Φ Φ * X Φ φ «ΦΦ
ΦΦ Φ Λ Φ gaik széles spektruma alapján, igen kifinomult, teljesítmény különbségeket eredményeznek.
Ehhez alapul szolgál azon proteázok továbbfejlesztése, melyeknél speciális felhasználási területeket célozhatunk meg.
A találmány előtt áll az a. feladat is, hogy még további, eddig nem ismert, proteázokat találjon. A vadtípusü enzim előnyösen azzal emelhető ki, hogy a szerben az adott célnak megfelelő formát leginkább megközelíti. Különösen azokra a felfedezésekre van szükség, melyek a mosó- és előnyösen a tisztítószerekben jobb teljesítményt biztosítanak.
A további részfeladatok olyan nukleinsavak biztosításával állnak kapcsolatban, melyek az ilyen proteázokat kódolják, valamint vektorokkal, gazdasejtekkel és ezek előállítási eljárásainak biztosításával az ilyen proteázok kialakításához. Továbbá a megfelelő anyagok biztosítására ís kiterjed, különösen mosó- és tisztítószerek alkalmazási lehetőségeinek bővítésére szolgáló proteázokra. Végül a talált proteázok technikai alkalmazási lehetőségeit meg kell határoznunk,
A találmány előtt álló feladatot a szubtilizín típusú proteázokkal úgy oldottuk meg, hogy az a 2. szekvencia számon megadott aminosav szekvenciával legalább 98,1 %-ban azonos.
Különösen jó megoldást jelentenek azok a proteázok, melyek a Bacdíüs sp, (DSM 14392) űj alkalíkus proteázzal fokozott mértékben megegyeznek.
A részfeladatok és a találmány egyes tárgyköreinek további megoldása azok a nukleinsavak, melyek szekvenciáját az 1. számon adtunk meg, melyek a találmány szerinti proteázokat kódolják, valamint vektorokat; gazdasejteket és előállítási eljárásokat biztosítunk, melyek az ilyen nroteázok nyeréséhez
AU szükségesek. Továbbá az ilyen proteázok részére megfelelő szereket, különösen mosó- és tisztítószerekhez, megfelelő mosóés tisztítószer eljárásokat, valamint megfelelő alkalmazási lehetőségeket alakítunk ki. Végül meghatároztuk a talált proteázok technikai alkalmazási lehetőségeit.
A találmány szellemében fehérje alatt természetes aminosavakból allé, főleg lineáris építőelemekből felépülő, hatását elsődlegesen háromdimenziós struktúrája révén kifejtő polimert értünk, A találmányban a 19 fehérjét felépítő, természetben előfordtúő L-aminosav nemzetközileg szokásos egy- és hárombetűs kódjait használjuk. Az ilyen elnevezések kombinációja egy számmal arra a fehérjére utal, melyben a szóban forgó aminosav a megjelölt helyzetben fordul elő. A pontmutációknál analóg jelölést alkalmazunk, A helyzeteket, ha azt másképpen nem adtuk meg, a szóban forgó fehérje érett formájára vonatkoznak, annak szignálpeptid nélküli formájára (lásd lejjebb).
A találmány szellemében enzim, alatt olyan fehérjét értünk, mely meghatározott biokémiai funkciót mutat. Froteolítikus enzimek vagy proteohükus funkcióval rendelkező enzimek alatt azokat értjük, melyek a fehérjék savantid-kötéseit hidrolizálják, különösen azokat, melyek a fehérjék, belsejében találhatok, és ezért ezeket endopeptidázoknak ís nevezhetjük, A sznbnlizin proteázok endopeptidázok, melyeket a természetben előforduló Örmn-poziiiv baktériumok állítják elő, és szekretálják, vagy ezekből, például molekuláris biológiai eljárásokkal előállíthatjuk; és részegységekből állnak, melyek strukturálisan vagy funkcionálisan elkülöníthetők, miközben a természetes szubtilizín profeázokkal homologizálhatők. Ezeket a szakirodalomban leírták (Síezen.: sSubtilases: Suhtilisin-like >·4 4
4« 4 4 φ <ί 4 *4
X 444 4 4
4» 4 4 Λ *4
X * 4 4·*«
Proteases, 75-95. Subtilisin enzymes, kiadó: R, Bott und C. Betzel, New York, (1996)],
Számos fehérje úgynevezett elöpeptidként, tehát egy szignál-pepiiddel együtt keletkezik. Ez a. fehérjék N-termmálisán foglal helyet, melynek funkciója legtöbbször a termelő sejtből a képződő fehérje periplazmába vagy a tenyészközegbe juttatása, és/vagy a fehérje szabályos .hajtogatodásának garantálása. Végül a szignál-pepiid természetes körülmények között szignálpeptidáz hatására a fehérjéről lehasad, feszi ezt a képződő űj N-fonnlnálfe megsértése nélkül,
A technikai alkalmazáshoz az enzimatlkus aktivitás az érett pepiidhez kötött, így a megcsonkított előfehérje termelését előnyben részesítjük.
Az előfehérjék a fehérjék inaktív alakjai. Ezek előhírnökét a szignálszekvencíával pre-pro-fe.hég ének nevezzük.
A találmány szellemében nukleinsavak alatt természetesen a nuldeotídokhől felépülő információt hordozó molekulákat értjük, melyek a fehérje vagy enzim lineáris aminosavsorrendjét kódolják. Előfordulhatnak egyszálú formában, és ehhez az egyszálú formához komplementerként kötődő másik szállal kettősszálú formában. A természetesen tartósan megmaradandó, információt hordozó DNS-t a molekuláris biológiai munkákhoz előnyben részesítjük. Ezzel szemben a találmány megvalósítása során természetes környezetben, mint például egy kísérleti sejtben, RNS alakul ki, ezért az RNS molekula szintén a. találmány megvalósítási fórmájába tartozik. Ezekből például fordított átírással ismét CDNS vezethető le.
A találmány szellemében a fehérjének megfelelő információ egységet génnek nevezzük, A DHS-nól mindkét komplementer <·< φφ·£ φ « * * * * * φ * * ** *** φ ΧΦΦΧ X Φ * χνχφχ· Α *« ** szál mindhárom lehetséges olvasási keretére figyelemmel vagyunk. Továbbá arra is tekintettel vagyunk, hogy az aminosavakat különböző kodon-hármasok is kódolhatják, így egy meghatározott amínosav sorrend több különböző, és viszonylag csak kis azonosságot mutató, nukleotid szekvenciából vezethető le (a genetikai köd degenerált). Ezen kívül ismeretes, hogy a különböző mikroorganizmusok eltérő kodonokat használnak. Ez alapján az oltalmi kört mind az amínosav szekvenciákra, mind a nukleotid szekvenciákra ki kell terjeszteni, és a megadott nukleotid szekvenciákat mindig csak egy meghatározott amínosav szekvencia példa sorrendjének kell tekinteni.
A szakirodalomban jártas szakemberek számára ismert, hogy a teljes gén előállításához például a kémiai szintézis vagy a polimeráz láncreakció eljárások (PCR) molekuláris biológiai és/vagy proteinkémiai. standard módszerekkel együtt végezhetők az ismert DNS és/vagy az amínosav szekvenciáknak megfelelő nukleinsav szekvenciák alkalmazásával. Az ilyen eljárásokat a szakirodalomban közzétették fbezikon dér Biochemie”, Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1, kötet, 267-271 és 2. kötet 227-229(1999)1» Ez különösen akkor lehetséges, amikor a letétbe helyezett törzsért a tőrzs^üjteménybe visszanyúlhatunk. Például PCR-primerekkel az ismert szekvencia és/vagy izolált mRNS molekula .alapján az ilyen törzsekben előforduló gén problémamentesen szintetizálható, klónozható és kívánt esetben tovább alakítható, például mutagén kezelésnek vethető alá.
A nukleotid szekvencia megváltoztatását, amelyet például az itt ismertetett molekuláris biológiai módszerekkel elvégezhetünk, mutációnak nevezzük, A változtatások típusa szerint megkülönböztetünk deléciős, inszerciós vagy helyettesítéses mutá** ♦ *'Χ Φ*
S » « * * * *
φ. * » ** *** * ·♦**# *· * * ·>»Φ* » ** ** ciót; azt a folyamatot amikor a különböző géneket vagy a gének részeit fuzíonáltatjuk (shufíling) génmutációnak nevezzük. Az így kialakított szervezeteket mutánsoknak nevezzük. A mutált nukleinsavből levezethető fehérjét változatnak nevezzük. így például a delécíős. in szerelés vagy szubsztituciós mutációk delécíős, inszerelés vagy szubsztituciós mutáns fúziósgén változatokhoz és delécíős, inszerciós és szubsztituciós fehérje, illetve fúziós fehérje változatokhoz vezetnek.
A találmány szellemében vektor alatt olyan nukleinsav elemeket, tartalmazó konstrukciót értünk, mely kritériumai alapján a kérdéses gént tartalmazza. Ez a fajban vagy a sejtvonalban több generáción vagy sejtosztódáson keresztül képes a befogadó genomjától függetlenül stabilis genetikai elemként fennmaradni. A bakteriális fajoknál a vektorok kiváltképpen plazmidok, azaz cirkuláris genetikai, elemek, A géntechnikában egyrészt megkülönböztetünk olyan vektorokat, melyek tárolásra és bizonyos tekintetben a genetikai feladatok ellátására szolgálnak, ezek az úgynevezett klónozó vektorok, másrészt, melyek a gazdasejtben a kérdéses gén funkcióit megvalósítják, azaz a szóban forgó fehérjék kifejezését lehetővé teszik. Ezeket a vektorokat expresszíós vektoroknak nevezzük.
Mind a bakteriális sejteket, mint az eukariőta sejteket, melyek a megnevezett vektorokat tartalmazzák, mindezek ellenére általánosan megkülönböztetés nélkül sejteknek, nevezzük. Az ilyen sejtek, melyek vektort, különösen expresszíós vektort tartalmaznak, és ezzel egy transzgén kifejezését megindíthatják, gazdasejtnek nevezzük, mivel lehetőséget biztosítanak a szóban forgó genetikai rendszer fenntartásához.
<ί
S
•χ
A homologizálás nem más, mint a nukleinsav szekvencia vagy az aminosav szekvencia egybevetése ismert génnel vagy fehérjével. Ez például adott elrendezés alapján történhet. A homolőgía mértékét százalékos azonosságként a szakirodalomban leírt módon határozhatjuk meg (Lipman és Fearsom Science, 227, 1435 144Ifi985)j. Ez az adat tükrözheti a teljes fehérjét, de annak egy részét is. A homológia fogalom egy további jelentése az a hasonlóság, mely a konzervatív változatokra is vonatkozik, tehát ahol az aminosavak hasonló kémiai aktivitásűak, mivel a fehérjében legtöbbjük azonos kémiai aktivitást fejt ki. Nukleinsavak esetében csak százalékos azonosságról beszélünk.
A homoiogizálással, azaz ismert enzimmel történő összehasonlítással, például megadott elrendezésben., a kérdéses enzim aminosav vagy a nukieotíd szekvenciáinak enzimatikus aktivitása kikövetkeztethető. A különböző fehérjék homológia területei összehasonlítható funkciók esetében felismerhetők, amennyiben azonos vagy hagyományos kicseréléseket végeztek primer aminosav szekvenciájukban. Ez felöleli az egyes aminosavakat, kisebb területeket, úgynevezett boxokat, melyek néhány aminosav hosszúságúak, valamint kiterjed az elsődleges aminosav szekvencia nagyobb területekre is. A homológ területek funkciói alatt a szóban forgó fehérje legkisebb részfunkcióii is értjük, mint például egyes hídrogénhid kötések kialakulását a szubsztrátokkal vagy átmeneti komplexekkel. A fehérjék más területei, melyek az adott enzimatikus reakcióban nem vesznek részt, minőségileg vagy mennyiségileg módosíthatók. Ezek például az enzimstábilitásra, aktivitásra, reakciófeltételekre vagy a szubsztrátspeciíitásra kihatással vannak.
V í,{.
s** $
A proteolítíkus enzimek vagy proteázok szakkifejezés alatt így a katalitikusán aktív központokban levő néhány amlnosav mindazon funkcióit értjük, melyek a teljes fehérje megmarad többi részének vagy egyes részeinek, vagy a megmaradt fehérje több részének, tulajdonképpen az aktív területét adják. A találmány szellemében proteolítíkus aktivitásnak tekintjük magukat az ilyen módosított funkciókat vagy részaktivitásokat is, amennyiben proteolítíkus funkciót támogatnak. Az ilyen segédfunkciók vagy részaktivitások például egyes szubsztrátok, közti vagy végtermékek kötésére, valamint a hidrolitíkus aktivitást befolyásoló szabályozok aktiválására vagy gátlására vagy közbelépésére szolgálnak. így például bizonyos strukturális elemek kiépítése az aktív centrumtól távol is elvégezhető. A második feltétel, hogy a találmány szerinti proteolítíkus fehérjének megfeleljen, valójában az, hogy a tulajdonképpen aktív csoport kémiai viselkedése magában vagy a módosított rész hatásával együtt a peptídkötés hidrolízisét adja. Ez alapján az ís lehetséges, hogy egyéb proteázok aktivitásai egy vagy több rész bevonásával, például a találmány szerinti fehérje, minőségileg vagy mennyiségileg módosítva legyen. A proteolítíkus aktivitásnál egyéb tényezők befolyását ugyancsak figyelembe vesszük. A proteolítikusan aktív enzimek közé tartoznak azok is, melyek aktivitását adott időpontban bizonyos anyagokkal gátolhatjuk. Döntő ezek alapvető képessége az adott proteolízis reakcióban.
Fragmensnek nevezzük az összes fehérjét vagy pepiidet, mely kisebb mint a természetes fehérje, vagy azokat, melyek a teljesen átíródott génnek felelnek meg, éa például szintetikusan •is megkaphatok. Amlnosav szekvenciájuk alapján a. megfelelő teljes láncú fehérjévé rendezhetők, Például azonos struktúrát vehetnek fel, vagy prntenlitikus vagy más részaktivkást mutathatnak. A kiindulási fehérjék fragmensei és hiányváltozatai lényegében egyet jelentenek, mivel akár fragmensek, akár a delécíós mutánsok, amelyeknél csak kis darabok hiányosnak, csak egyes részfunkciókat jeleníthetnek meg.
A találmány szellemében kimérák vagy hibád fehérjék alatt azokat a fehérjéket értjük, melyek olyan természetes elemekből épülnek fel, melyek ugyanabból a szervezetből vagy különböző szervezetekből származnak. Az ilyen folyamatot shuffiing-nak vagy fúziós mutagenezisnek nevezik. Az ilyen fúziók jelentősége, hogy például a találmány szerinti fehérjerészek fúziójának segítségével enzimatikus funkció jöhet létre vagy módosulhat.
Inszerciös mutációval nyerhető fehérjék alatt azokat a változatokat értjük, melyek ismert eljárásokkal, az egyez nukleinsavak, előnyösebben fehérj e fragmensek egybekapcsolásával a kiindulási szekvenciában alakíthatók ki. Ezek lényegében azonosak a .kialakított kánéra, fehérjékkel. Megkülönböztetésként csupán a fehérje részek méretéhen tőrnek el a teljes fehérjétől, Az ilyen inszerciősan mutált fehérjékben az idegen fehérje kevesebb mint a kiméra fehérjékben,.
Az inverzíős mutsgenezis, azaz a részleges szekvencia megfordítás, a deléció egyik eltérő formája, ínazerdónák ís tekinthető. Ez csak az eredeti aminosav sorrenddel rendelkező, de 'különböző molekularészek új csoportosulására érvényes. Ezek az eredeti fehérjék, deléciős változatainak, kiszerelés változatainak, valamint shuffiing változatainak tekinthetők.
A találmány széliemében származékok alatt olyan fehérjéket értünk, melyek aminosav lánca kémiailag módosított. Az ilyen származék képzés például biológiailag, fehérje szintézissel
W>i «.« »-«·· kapcsoltan a gazdaszervezetben elvégezhető. Ehhez molekuláris biológiai eljárásokat alkalmazhatunk, mint például ko-trarxszformácíó génnel, mely a. szóban forgó mutációt hordozza. A származékok képzése kémiailag is elvégezhetők, akár az oldallánc aminosav kémiai átalakításával, akár a fehérjén más kovalens kötéssel. Az ilyen kötéseknél például más fehérjéket használunk, melyek például a találmány szerinti fehérjéhez bifunkeiös kémiai vegyül etekkel kapcsolh atók. Az ilyen módosításokkal például a szubsztrátspecifitás vagy a kötés erőssége a szubsztráton befolyásolható, vagy az itt említett enzim atikus aktivitás átmenetileg blokkolható, amennyiben a kapcsolt anyag inhibitor. Ennek például a tárolási idő alatt lehet értelme. Hasonlóan, a makromolekuáris hordozó kovalens kötésének módosítását szárai azékképzé snek tekin tj ük.
A találmány szellemében minden enzimet, fehérjét, fragmenst és származékot, amennyiben azt másképpen nem jelezzük, a fehérje fogalomba egyesítjük.
Az enzim teljesítménye alatt az adott technikai területen kifejtett hatékonyságát értjük. Ez az enzimaktivitáson alapul, de az adott folyamat egyéb releváns tényezőitől is függ. Ide tartozik például a stabilitás, a szübsztrátkötés, kölcsönhatása a szubsztrátot hordozó anyaggal, vagy kölcsönhatása más alkotórészekkel, és elsősorban a szinergista hatások.
A találmány szellemében mosószer teljesítmény vagy tisztítószer teljesítmény alatt azokat a hatásokat értjük, melyek a. szóban forgó) szennyezett anyagon, mint például textíliákon, vagy adott esetben szilárd felületeken, fejtenek ld, Az ilyen, anyagok egyik komponense például az enzim, melyet a mosó- és tisztítószerekhez hatása miatt alkalmazásra érdemesnek tartunk.
< Φ X ί,ϊ»
Ennek megfelelően az enzim enzimatikns sajátságai alapján nem minden további nélkül alkalmazhatok egyes szerekben a mosási teljesítmény elősegítésére, Itt például olyan további tényezők játszanak szerepet, mint a stabilitás, szubsztrátkötés, a tisztítandó dologgal vagy a szer egyéb alkotórészeivel kialakuló kapcsolódás, különösen a szennyezés eltávolításában, megmutatkozó színergizmus.
A találmány alapja a természetes úton keletkező szubtilízin típusú alkalíkus proteáz, amelyet a példákat követve Boed&m sp. DSM 14392 törzsből tenyészkörütoények kozott izoláltunk.
Ezt a törzset a mikroorganizmusok letétbe helyezésének Budapesti Egyezménye alapján (1977) a német törzs^üjteménybe letétbe helyeztük (Deutsehen Sammlung von Mikroorganismen und Eeltkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 33124 Braunschweig (http://www.dsmz.de)]. Ott a ID 01-193 elnevezést és a DSM 14392 számot kapta. Ezen biológiai anyag főbb jellemzőit meghatározták (DSM2, 2ÖÖ1), melyeket az 1. táblázatban foglaltunk össze.
A találmány azon stratégián alapul, hogy természetes körülmények között élő, proteázt előállító mikroorganizmusokat tanulmányoz, és ezzel olyan, a természetben kialakuló enzimet keres, mely a megadott követelményeknek a lehető legnagyobb mértékben megfelel.
Az ilyen enzimet, ahogy azt a találmány példáiban, leírtuk, a Boddus sp, (DSM 14392) alkalíkus proteázként találtuk meg,
Ahogy azt a német tőrzsgyűjtemény vizsgálatai állították (Deutsehen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) ez a törzs proteolítikus aktivitást szekretál (az I. táblázat 1. példájában). Ezt a találmány megvalósítási formái szerint megvizsgáltuk, és a kővetkezőkben ismertetjük. SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel kiderült, hogy ez egy 26 kD-oe fehérje, és izoelektrofökuszálással megállapítottuk, hogy izoelektromos pontja 11. Az AAPF szubsztrátra nézve specifikus aktivitása 9 egység/mg.
A találmány szerinti űj alkalikus proteáz nukleotid szekvenciáját, mely a Bíxddus sp. D8M 14392-ből származik, az L számon adtuk meg. Ez 112S bázispárból ált Ez ebből levezetett aminosav szekvenciát szintén megadtuk (a szekvencia száma: 2). Ez 374 aminosavat jelent, melyet stopkodon követ. Az első 1Ö5 aminosav az érett fehérjén vaiöszinűleg nem található meg, így előrelátható, hogy az érett fehérje hossza 269 aminosav.
Ahogy azt a 2, példában leírtuk, a kapott szekvenciát az általános adatbankokban lévő proteáz szekvenciákkal összehasonlítottuk (Svdss-Prot (Geneva Bioínformatics (GeneBío) $.A>, Genf, Schweíz; http: / / www.genefeio.com/ eprot bírni} és GenBank (National Center fór Bietechnology Information NCB1, National Instítutes of Health, Sethesda, MD, USA}).
DNS szinten a teljes gén legközelebbi hasonlóságot három génnel mutatott: (1.) alkalikus elasztáz Buedfes Ya-B-vel (ID ELYAJ8ACSP) ez 98 %-os azonosságot jelent, (2.} Böeáíue mknlopMIus-ből izolált szubtilizin P92-vel (ID ELYA^BACAO), ez 69 %-os azonosságot, (3.} szubtilizin Sendai-val, melyet a Sueöfeú Sendubhöl (ID Q45522} mutattak ki, 66 %-os az azonosság).
Aminosav szinten a legközelebbi hasonlóságot a pre-proteinnel a kővetkezők mutatták: (1.) Beeí&e Ya~B (ID ELYAJBACSP) alkalikus elasztázzal, 98 %-os azonosság, (2.} BudSvs aíMpphtlus-ból izolált ezubtibzfe P92-vel (ID
Χ <· « V
ELYAJ3ACAO), ez 80 %-os azonosságot, (3.) Bodi'te Sendhi' {ID Q45522) zzubtilizin Sendai-val 69 %-os mértékben.
Aminosav szinten az érett fehérjével a. legközelebbi hasonlóságot a kővetkezők mutatták: (1.) BndHus Ya~B (ID ELYÁ..BACSF) alkalikus elasztázzal, 99 %-os azonosság, ez azt jelenti, hogy csak. három aminosavban tértek el a kódoló területen (24 mindkét szubülizm; a szubíüizm F92 a Bact&us alkafepmiws-ból (ID BLÁYA J5ACLE) és a szubtüízin 309 (Savinase^) a Budöus fenhunhb! (ID SVBSJBACLE), 83 %-os azonosságot mutat, (3.) a B. íentus alkalikus proteáz a Bacülus lentus-ből (DSM 5483) (ID SUBB....BACXE), melynél az azonosság 82 %,
A további hasonló enzimeket a 2. táblázatban (2. példa) foglaltuk össze, és az 1, ábra szerinti elrendezésben az érett fehérje aminosav szekvenciájával hasonlítottuk össze, amelyet a találmány szerinti aBodííus sp, (DSM 14392) törzsből nyertünk.
A megadott többi szubtilizáneknél felismert Összhang és rokonság alapján az alkalikus proteázokat szubtilizínnek tekintjük,
A találmány egyik tárgyköre ezért azokkal az aminosav szekvenciával rendelkező szubtílízin típusú proteázokkal foglakozik, melyek a 2. szekvenciaszámon megadott aminosav szekvenciával legalább 98 J %-ban azonosak.
Ide előnyösen azok tartoznak, melyek aminosav szekvenciája a 2. számon megadott aminosav szekvenciával legalább a kővetkező mértékben azonosak: 98,2-100 %-ig tizedszázalékonként.
Ezért elvárható, hogy ezek tulajdonságai a Buctöus pp. (DSM 14392) alkalikus proteázzal nagymértékben azonosak.
X < « '
Ahogy azt már említettük, az ^-terminális szekvenciák összehasonlítása alapián az 1-105. aminosavak valószínűles a vezető-szekvenciát adják, míg az érett fehérje a 2. szekvencia. 106-374. helyzetéig terjed. A 375. helyzetben stopkodon található, mely nem kódol aminosavat. Mivel az egyes kódoló területek vegei is az aminosav szekvencia fontos területei lehetnek, ezért ezek a helyzetek a találmány szerinti érett fehérje részei.
A találmány egyik .megvalósítási, formája ezért mindazokra a szubtilizin típusú alkalikus proteázokra vonatkozik, melyek, aminosav szekvenciája, a 2. számon megadott szekvencia 106375-lg terjedő helyzeteiben legalább 98,9 %-ban megegyezik.
Ennek megfelelően különösen előnyösek azok a proteázok, melyek a 2. szekvencia 106-375. aminosavaival a következő százalékokban megegyeznek: 99-100 %-ig tizedszázalékonként.
Például a BaciOus sp. (DSM 14392) m fovo felszabadult proteolítikus fehérjéinek N~terminális szekvenálásával lehetővé válik olyan forma előállítása, mely nem a 2. szekvencia 105. és 106. helyzeteinél tartalmaz hasítóhelyet, hanem más helyeken, melyek a ténylegesen érett fehérje adatainak megfelel.
A találmány egyik tárgyköre szubtilizin típusú alkalikus proteáz. melynek nukleotid szekvenciája legalább 98,1 %-ban azonos az 1. számú szekvenciával., különösen a 2. szekvencia 106-375. helyzeteinek, részterületén.
így különösen előnyösek, melyek az 1. számú nukleotid szekvenciával legalább a kővetkező százalékokban megegyeznek: 98,2-100 '%-ig tizedszázalékonként, különösen a 2. szekvencia 106-375, helyzeteinek részterületén.
Ezért elvárható, hogy azok a fehérjék, melyeket á fenti nukleinsavak kódolják, tulajdonságaikban a BaciHus sp. (DSM
14392) alkaiikus proteázával, különösen érett formájával, megegyeznek. A következő megvalósítási formákra az is jellemző, hogy ezek a ténylegesen érett fehérjékre vonatkoznak, abban az esetben is, ha a fehérje hasítási helye a fentiekben megadottól eltér.
A találmány tárgyköreinek legtöbb előnyben részesített megvalósítási formájában valamennyi szubtilizán típusú alkahkus proteóz, melyek aminosav szekvenciáját egészében a 2. számon adtuk meg, előnyösen a 106-375 helyzetekben azonos, és/vagy ezek aminosav szekvenciája összességben a 1. nukleotid szekvenciából levezethető, előnyösen a 106-375 aminosavakat kódoló helyzetekben azonos.
így az újonnan talált és a találmánnyal biztosított Bodllus sp. (DSM 14392) alkaiikus proteázzal foglakozunk.
Ez a technika jelenlegi állása szerint nem ismert. Ahogy azt a példákban megadtuk ez izolálható, előállítható és alkalmazható. Ahogy azt a példákban is dokumentáltuk, ez abban mutatkozik meg, hogy alkalmazása megfelelő szerben az erre a célra kialakított enzimek teljesítményét megközelíti, előnyösen ezen részben még túl is tesz.
A fejlesztéshez, különösen a mosószerekben alkalmazható proteázoknál, természetes, mlkrobiálíaan létrehozott enzimként szolgálnak ismert mutagén eljárásokhoz, mint például pontmutádó, fragmemképzes, deléció, inszemö vagy más fehérjékkel vagy fehérje részekkel való fúzió, vagy egyéb az alkalmazáshoz optimalizált kívánt módosítások. Az ilyen optimalizálás a technikai alkalmazási területeken releváns lehet, például a hőmérséklet a pH ingadozások, a redox állapot és/vagy egyéb behatások befolyásolásában. Szükség lehet például az oxidációval, a denaturáló szerekkel vagy a proteolitíkus lebontással, vagy a s * «’ ϊ <Φ savakkal, erősen lúgos feltételekkel szembeni ellenállőképesség befolyásolására, a kalciumionok vagy más faktorokkal mutatott érzékenység megváltoztatására, az immunogenitás vagy más allergén hatások csökkentésére.
.Ehhez például megváltoztathatók a felületi töltést vagy a katalízist, vagy a szuhsztrátkötéshen résztvevő loopokat megcélzó pontmutáciok [WO 00/36069 számú szabadalmi bejelentési. Az utóbbiakról a szakirodalomban részletesen olvashatunk (WO 95/3001.1, WO 99/27032, WO 00/37599, WO 00/37621-től WO 00/37627-ig és WO 00/71683-tól WO 00/71691-igJ. Továbbá, különösen a genetikai módosítások eljárásai a következő szabadalmi bejelentésekben megtalálhatók [WO 92/2.1760 és WO 95/23221 számú szabadalmi bejelentések]. Ebhez kiindulást jelent az 1. ábrán feltüntetett elrendezés. Ez lehetővé teszi ismert enzimekből az érdeklődésre számot tartő a BoeWas sp-re (DSM 14392) vonatkozó helyzetek levezetését, és ismert eljárásokkal történő változtatásukat.
A mutagenezis eljárások azokon a nukleotid szekvenciákon alapulnak, melyet az L számon adtunk meg, ami előnyösen a találmány egyes tárgyköreiben bemutatott hasonló nukleotid szekvenciára vonatkozik . A megfelelő molekuláris biológiai eljárások a szakirodalomból ismertek (Fritsch és mtsai: Mölécular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, (1939)).
A különösen előnyben részesített megvalósítási formákban a pontmutáciok. a szóban forgó proteázok teljesítményének növeléséhez vezetnek, különösen a megfelelő szerben a mosó vagy tisztító teljesítmény tekintetében, A találmány példáiban megmutattuk, hogy a Badí/us sp, (DSM 14392) törzsből izolált * * találmány szerinti fehérje jobb teljesítményű, mint a Savinase^ enzim, vagy mint a Bodkws fentus átkalikus proteáza.
Ahogy az '.L ábra elrendezéséből levezethető, a Bodlte sp. (DSM 143921 proteáz a BadOus Fa-B alkalikus elasztáztől három helyzetben eltér (melyről még nem íriák le, hogy mosószerben vagy tisztítószerben alkalmazták volnál: az 1, helyzetben (a találmány szerinti 1. szekvencia számozása alapján) M található, a 6S. helyzetben Q helyett H, és 182, helyzetben T helyett S. így különösen előnyben részesítjük a. fentiekben megadott oltalmi területbe eső azon proteázokat, melyek egy’ vagy több ilyen aminosav helyzetben a Budkns sp (DSM 14392) proteázának megfelel.
A találmány további megvalósítási formáiban az összes fentiekben leírt, találmány szerinti szubthizin típusú alkalikus proteáz, melyet fragmentálással vagy deiéciós mutagenezissel vezettünk le, legalább a kiindulási molekula 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 343, 350 és
360 aminosavával megegyezik, az aminosav szekvencia elején közepén vagy végén, vagy amelyek kiindulási molekulával 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 343 és 360 amínosavban megegyeznek, az 1, szekvencia I,, 65. és/vagy 182. helyzetének megfelelő aminosav számozásnál
Az 1. ábra elrendezéséből következik, hogy a BadÖw sp (DSM 14392) torzóból nyert érett proteáz aminosav szekvenciája a 2-22.» 68-187, és 137-189. helyzeteiben a SudOw FoB alkalikus elesztázának szekvenciájával azonos. A találmány szerinti fragmentálással vagy deiéciós mutagenezissel levezetett fehérje vagy fragmens tehát nagyobb, ismert proteázokkal nem azonos területekkel rendelkezik, vagy olyan, mely az L, 65., előnyösen a 182 helyzetekben (az 1. szekvencia számozásának megfelelően) Μ, H és/vagy S aminosavakban eltér. Ezért az utóbbinak, ahogy azt a Budfíus nlkolophilus (BLYAJBACA0) szubtilizinnal összevetettük, legalább 40 aminosav hosszúnak kell lennie. Mível a legközelebb állá proteáz a 188. helyzetben az elrendezés számozása alapján S-t tartalmaz, ezért összességében 36 helyzetében a Baeillus sp. (DSM 14392) proteázával azonos,
A megnevezett fragmensek és deléciós változatok közül azok előnyösek, melyek a 2. szekvencia 106-375. amínosavaiban az érett fehérjével megegyeznek.
Ezért a 2. szekvencia fehérjéjéből vagy fragmenséből. fragmentálással vagy deléciós mutagenezissel levezetett változatok közül azok különösen előnyösek melyek szekvencia azonossága százalékban a kővetkezők: 98,9 %, 99 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %,99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, 99,9 % és 100 %.
A találmány szerinti fragmensek alatt értjük az összes olyan fehérjét vagy pepiidet, melyek: kisebbek, mint a homológ fehérje, melyek szekvenciája a 1. vagy a 2. számon megadott, szekvenciának megfelel, de amelyek: megfelelő részszekvneciája egyhe-vág. Ezek: a fragmensek lehetnek például azok a dómén vagy töredék részek, melyek a doménnal nem egyeznek meg, Az ilyen fragmensek kedvező költséggel előállíthatok, melyek: adott esetben a kiindulási molekula bizonyos hátrányos tulajdonságaival a továbbiakban nem rendelkeznek, melyek esetleg aktivitásukat csökkentik, vagy szabályozó mechanizmusukat, kedvező aktivitás-profiljukat kibontják. Áz ilyen fehérje fragmensek nem csak bioszintetikusán, hanem ί * például kémiailag is előállíthatok, A kémia szintézis például akkor előnyös, ha a szintézis elvégzése kémiai módosítással kapcsolt,
A fragmenseket alapvető hasonlóságuk miatt a deléciós mutációval kapott fehérjékhez is hozzárendelhetjük. Á deléciós mutagenezis különösen jól alkalmazható a gátló területek eltávolítására. Eredményképpen a deléciók együtt járnak mind specializálódással, mind a fehérje felhasználási területének kiszélesedésével,
A természetes úton képződő fragmensek, előnyösen a deléciós mutációval kialakított fehérjék, megvizsgálhatok, a pre-profehérjékből kapott fehérje N-terminális aminosavainak és a szignál -peptídjének .1 eh ásításával, Az ilyen hasítási mechanizmust arra lehet például felhasználni, hogy segítségével bizonyos szekvencia tartományt, melyet a szignál-peptidázok felismernek, felismerjünk, ezzel a rekornbináns fehérjékben specifikus hasítási helyet nyújtsunk. Ezzel a találmány szerinti fehérje in akro aktiválását vagy desaktíválásá.f lehetővé tehetjük,
A találmány további megvalósítási formáinak mindegyike a fentiekben leírt találmány szerinti szubtilizin típusú alkaiikus proteázokra vagy azok fragmenseikre vonatkozik, melyeket helyettesítéses mutagenezissel és/vagy legalább egy további fehérjével vagy fehérje fragmessel történő fúzióval állítunk elő.
A találmány szerinti kiméra fehérje legszélesebb értelemben proteolitíkus aktivitással rendelkezik. Ez kialakítható a találmány szerinti fehérjéből származtatható molekularésszel vagy annak módosításával. A kiméra fehérje a fehérje teljes hosszát és a fentiekben igénybe vett területeket is magában foglalhatja. Az ilyen fúzió értelme például az, hogy a találmány szerint fuzionált fehérje részek segítségévei egy adott funkciót vagy részfunkciót a fehérjébe bejuttathatunk vagy módosíthatunk. A találmány szempontjából lényegtelen, hogy a kiméra fehérje egyetlen poiipeptid lánc vagy több alegységből áll. Az utóbbi alternatíva kivitelezése például transzláció utáni módosítással, vagy az első tisztítási lépésben az egységet alkotó kiméra poiipeptíd lánc több részre darabolásának elvégzésével lehetséges.
így például a szakirodalomban leírták [WO 99/57254 számú szabadalmi bejelentés], hogy a találmány szerinti fehérje vagy fehérje rész peptid-kapcsolőval vagy közvetlenül fúziós fehérjeként más fehérjékből származó kotődoméne'kkel, mint például cellulózkötő doménnel kialakítható, és ezzel a szubsztrát hidrolízise hatásosabban elvégezhető. Az ilyen kötődőmén proteáz törzsből is származhat a találmány szerinti fehérjék fehérje szubsztráton történő kötésének megerősítésére. Ez a helyi proteáz koncentrációt megnöveli, mely egyes alkalmazásban, például a nyersanyagok kezelésénél, előnyös lehet. Hasonlóképpen a találmány szerinti fehérjék más enzimekkel együtt, mint például amilázokkal vagy cellulázokkal kapcsolhatók, kettős funkció kialakítása érdekében,
Inszercíós mutációval nyerhető találmány szerinti íe-hérjék alatt azokat értjük, melyek: lényegében azonosak a találmány szerint kialakított kiméra. fehérjékkel. Ide tartoznak a szufosztitüciös változatok is, valamint azok is, melyeknél a molekula egyes területei más fehérjékből származnak.
Az inszercíós és helyettesítéses mutagenezís értelme a hibridképzésben mutatkozik meg, mivel igy a találmány szerinti fehérje egyes tulajdonságai és funkciói más fehérje
4
26, 681-
370, 389-
ÍRSR) [WQ
szabadalmi
tulajdonságaival és funkcióival kombinálódnak. Ide tartoznak például a különböző proteázokból nyert, részszekvenciák shuffling-jával vagy űj kombinációival nyerhető változatok ís. Ezzel olyan fehérjék nyerhetők, melyeket még ez idáig nem írtak le. Az ilyen technikák igen alapvető aktivitás módosításokat tesznek lehetővé..
Előnyösen az ilyen mutációs megoldások statisztikus jellegű helyspecífikusan irányított evolúciós eljárásokat jelentenek, mint például a StEP módszer [Zhao és mtsai: Nat. Biotechnoi., 16, 258-261 (1998)], a random priming rekombináció [Shao és mtsai: Nucleic Acids Rés., 26, 681 683(1998)], a DNS-shuffling [Stemmer: Natúré, 370, 389' 891(1994)]: vagy· .rekurzív szekvencia rekombináció
98/27230, WO 97/20078, WO 95/22625 számú szabadalmi bejelentések], vagy a RACH1TT [Coco és mtsai: Nat. Biotechnoi., 19, 354-359(2001)]. Célirányosan az ilyen eljárások a mutagenezíst követő kifejezés után szelekcióval és szűréssel társulnak, a kívánt tulajdonságú változások felismeréséhez. Mivel, ezek DNS szintű technikák, ezért a biológiai termeléshez kiindulási pontként a megfelelő géneket kell biztosítanunk.
Az inverziós mutagenezis, azaz egy részleges szekvencia megfordítása, a deléció egyik eltérő formája, mind deléciönak, mind ínszerciónák is tekinthető. Az ilyen változatok ugyancsak célirányosan vagy véletlen módon hozhatók létre.
A mai napig előnyösek mindazok a. fehérjék, fehérje fragmensek vagy fúziós fehérjék, melyek azzal jellemezhetők, hogy a fehérjék hidrolízisére képesek.
Ezeket a hivatalos enzim nómenklatúra szerint peptidázoknak nevezzük (Enzyme Nomenclature, (1992) IUBMB 3.4). Az ide tartozó előnyös enzimek a következők: endopeptidázok, különösen a 3,4,21. csoportba tartozó szerin-proteinázok, a 3.4.22 ciszteín-proteinázok, a 3,4.23 aszpartát-proteinázok és 3.4,24 metallo-proteinázok. Különösen előnyben részesítjük a szerin-proteinázokat (3.4,21), ide tartoznak a szubtilázok és különösen a szubtilizín [Síezen: Subtílases: Subtilisin-like Proteases, 75-95, Subtibsin enzymes, kiadó: Bőit: és Betzel, New York, (1996)], Másrészt előnyös az IS-2 csoportba tartozó szubtilizín, az erősen alkalikus szubtilizín.
Itt az aktív molekula az inaktívval szemben előnyösebb, mivel például az alábbiakban megadott alkalmazási területeken különösen a kifejtett proteolízis fontos.
Szélesebb értelemben a fentiekben megvalósított fragmensek is proteolítikus aktivitással rendelkeznek, mintegy a szubsztráttal komplexet képeznek, vagy a hidrolízishez szükséges strukturális elemeket biztosítják. Előnyösek azok, melyeknél a hidrolízishez más fehérjéket is figyelembe keli venni, anélkül, hogy más további fehérje komponensek jelenlétét biztosítani kellene. Ez· ennti az aktivitást, melyet a proteáz kifejthet; ami esetleg pufferanyagok, ko-faktorok stb, szükséges egyidejű jelenlétében érinte11 en marad.
A fehérjék hidrolíziséhez a. különböző molekula, részek összjátéka a deléciós mutánsokban természetes körülmények között korábban fellép mint a fragmensekken és ez különösen a fúziós fehérjék esetében van így. mindenek előtt azoknál, melyek shuffling-gal megváltoztatott fehérjéből származnak. Amennyiben ezzel szélesebb értelemben a proteolítikus funkciót megőrizzük, módosítjuk, felbontjuk vagy előbb el ís ériük, akkor deléciós változatokról van szó, ahogy a találmány szerinti fehérje fúziós
Μ'
változatainál. A találmány tárgykörében ezek előnyben részesített képviselői lehetővé teszik a fehérje·”szubsztrát hidrolízisét további fehérje komponensek jelenléte nélkül.
Az egyik előnyben részesített megvalósítási formába azok a kialakított fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy változatok tartoznak, melyek azzal jellemezhetők, hogy pótlólag származékká alakították.
Származék alatt azokat a fehérjéket értjük, melyek a kialakított fehérjék pótlólagos módosításával vezethetők le. Az ilyen módosítások például a következőkre hathatnak: stabilitás, szubsztrát speciílcitás vagy szubsztráton való kötődés erőssége, vagy endmatikus aktivitás. Ezek arra is szolgálhatnak, hogy a fehérjék aüergenitását és/vagy ímmunogenítását csökkentsék és ezzel például a bőr-összeférhetóségét növeljék.
Az ilyen származékképzés például történhet biológiai úton, a fehérje binszintézfse során a termelő gazdaszervezetben. Ennél a kis molekulatőmegü vegyületek, mint például a lipidek vagy olígoszacharidok kapcsolása kiemelt jelentőségű.
A származékképzést azonban kémiai módszerekkel ís elvégezhetjük, például az oldallánc átalakításával, vagy kovalens kötések kialakításával, mint például a fehérjéhez makromolekulák kapcsolásával. A kémiai módosításokat a szakirodalomban leírták [DE 4013142 számú szabadalmi bejelentés). Például az enzim karboxil csoportjaihoz aminokat kapcsoltak, ezzel •megváltoztatták a fehérje izoelektromos pontját [WO 95/26398 számú szabadalmi bejelentés}. A találmány szerinti fehérjékhez bifunkeiös makromolekulát kapcsolhatunk, mint például fehérét. Például a szakirodalomban leírták [WO 99/57154-től WO 99/57159úg, WO 00/13865 és WO 00/57155 számú
Ο 4 ** szabadalmi bejelentések), hogy lehetőség van a találmány szerinti fehérje kapcsolón keresztül specifikus kötődoménnel látható et Az ilyen származék mosó- és tisztítószerekbe különösen jól megfelel. Analóg módon [WO 00/01831 számú szabadalmi bejelentési kapcsolón keresztül, .különösen aminosav kapcsolón át, a. találmány szerinti fehérjéhez proteáz inhibitor kapcsolható. Egyéb makroxnolekuláris vegyületek, mint például polietilénglikol kapcsolásával, a molekula tulajdonságai, mint például stabilitása, vagy bőr elviselhetősége, javíthatók. Az ilyen módosításokat kozmetikai alkalmazásokhoz a szakirodalom han leírták [5230891 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés).
A találmány szerinti fehérje származékok alatt széles értelemben ezen enzimek előállítását is értjük. A fehérjék kinyerése, feldolgozása, va^ elkészítése különböző más anyagokkal társulhat, például, melyek a termelő mikroorganizmusok tenyészetéből származn.ak. Például, a. tárolási stabilitás növelésére fehérje adagolható bizonyos más anyagokkal együtt. A találmány tárgykörébe tartozik ezért a találmány szerinti összes fehérje előállítása is. Ez független a kérdéses készítmény kifejtett enzimatíkus aktivitásától, vagy annak hiányától. Szükség lehet arra, hogy tárolás során az aktivitás kis mértékű, vagy ne legyen, és a proteolítikus aktivitás csak az alkalmazás időpontjában fejlődjön ki. Ez például a megfelelő kiegészítő anyaggal szabályozható. A szakirodalomban kiváltképp a proteáz készítmény proteáz inhibitoros formája ismert [WO 00/01826 számú szabadalmi bejelentés).
sí Ο •4 4
Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában az összes fentiekben kivitelezett fehérje, fehérje fragmens vágyfúziós fehérje, azzal jellemezhető, hogy pótlólag stabilizált
Ezzel a tárolás és/vagy az alkalmazás során, például a mosási folyamatban, a stabilitását úgy növeljük, hogy az aktivitás tovább fennmaradjon és ezzel erősödjön. A találmány szerinti proteázok stabilitása például polimer kapcsolásával növelhető. Az ilyen eljárásokat a szakirodalomban leírták (5230891 számú Amerikai Egyesült Államok-heli szabadalmi bejelentés). Ez azt igényli, hogy a fehérje, a megfelelő szerbe történő beadagolása előtt, kémiai kapcsolási lépésben az ilyen polimerrel kapcsolódjon.
Előnyösek azok a változtatások, melyek a stabilitást a molekula pontmutációival teszik lehetővé, mivel ez a fehérje kinyeréshez csatoltan további feldolgozási lépést nem igényét Az ehhez megfelelő pontmutációk a szakirodalomban ismertek. így a 6087315 és a 6110884 számú Amerikai Egyesült Államok-heli szabadalmi bejelentések szerint a proteázok úgy stabilizálhatok, hogy bizonyos tirozlncsoportokat más ammosavra kicserélünk.
A további lehetőségek például a következők:
- Bizonyos amínosavak kicserélése prolinra (EP 583339 számú szabadalmi bejelentés);
- A molekula felületére polárosabb vagy tőltöttebb csoportok felvitele (EP 995801 számú szabadalmi bejelentés);
- A fémionok kötésének megerősítése, .különösen a kalciumkötöheiy mntagenezísével (WO 88/08023 és WO 88/08033 számú szabadalmi bejelentések];
Az első leírás szerint egy vagy több kalcium-kötésben résztvevő aminosavat negatívan töltött amino savra kell kicserélni; a
X-i •ί
WO 88/08033 számú szabadalmi bejelentés szerint a kalciumkötő stabilizálásához legalább egy, az argimnt/glicmt kővető •pontmutációt kell kialakítani.
- Az 5453372 számú Amerikai. Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés szerint a fehérje bizonyos mutációkkal a felületen ható denaturáló szerekkel szemben, mini például tenzidekkel szemben, megvédhető.
A további összehasonlítható lehetőségeket a szakirodalomban megadták [5340735, 5600364, 5985639 és 5136553 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentések].
A magas hőmérsékletiéi és a tenzidek hatásával szembeni stabilizálás egy másik lehetősége megtalálható a szakirodalomban [WO 92/21760 számú szabadalmi bejelentés], valamint stabilizálásra alkalmazzák az aminosavldcseréléseket is az N-terminális közelében |DE 10121453 és DE 10153792 számú szabadalmi bejelentések] a nem kovalens kölcsönhatások ellen a globuláris struktúra védelme érdekében.
Előnyösek azok a megvalósítási formák, melyeknél a molekula több módon stabilizált. Például a szakirodalomból megtudható [WO 89/09819 számú szabadalmi bejelentés], hogy több stabilizáló mutáció együttesen additív hatást fejt ki.
Az előnyben részesített megvalósítási formákba tartoznak mindazok a fehérjék, fehérje feagmeneek, fúziós fehérjék vagy származékok, melyek azzal jellemezhetők, hogy legalább egy antigén determinánsa megegyezik a találmány szerinti fentiekben megadott fehérjével, fehérje fragmenssel, fúziós fehérjével vagy származékkal.
Mivel, az enzímadkns aktivitást a fehérjék másodlagos felépítése és háromdimenziós feketedése határozza meg, ezért elsőd* * > * Φ X* . * ♦*'♦♦♦ V **«* « *.·.
leges struktúrájának egymástól nyilvánvalóan eltérő doménjeí térbelikig messzemenő egybehangolt struktúrát építenek ki, és ezzel azonos enzimatikus viselkedést tesznek lehetővé, A másodlagos felépítés ilyen együtteseit rendszerint az antiszérumok egybehangolt antigén determinánsai vagy tiszta vagy monoklonáiís ellenanyagok ismerik fel. így immunkémiai keresztreakcióval az egymáshoz hasonló fehérjéket vagy származékaikat képesek vagyunk kimutatni, és egymáshoz hozzárendelni. Ezért a találmány oltalmai kőre az olyan fehérjékre is vonatkozik, melyek elsődleges felépítésének homológiai értékei nem megfelelőek, ellenben immunológiai tulajdonságaik a fentiekben meghatározott találmány szerinti fehérjékhez, fehérje íragmensekhez, fúziós fehérjékhez vagy származékokhoz hozzárendelhetők.
Az egyik előnyben részesített megvalósítási, formában az összes fentiekben kivitelezett fehérje, fehérje fragmens vagy fúziós fehérje vagy származék, azzal jellemezhető, hogy természetes forrás hói származik; előnyösen mikroorganizmusokból nyerhetők.
Ezek lehetnek például egysejtű élesztők, vagy baktériumok, mivel ezek többnyire sokkal egyszerűbben nyerhetők és kezelhetők mint a soksejtű szervezetek vagy a soksejtűekbői levezetett sejttenyészetek; jóllehet ezek a specifikus megvalósítási formákban értelmet nyernek, és ezért a. találmány oltalmi köréből elvileg nem zárhatók ki.
Bár lehetséges, hogy a természetben előforduló termelők a. találmány szerinti enzimet képesek előállítani, mégis a továbbiakban. meghatározott körülmények között csak kisebb tömegben. fejezik ki, és/vagy a táptalajba bocsátják. De nem zárható ki, hogy a megfelelő környezeti körülmények vagy a további
V O 5. .
-<· > Φ Xí * ί > ς **>'* .< ' ♦* faktorok kísérletileg kiderítetek, ami a találmány szerinti fehérjék ipari termelésének befolyásolására ösztönözhet. Az ilyen szabályozó mechanizmus a biotechnológiai termelést célozhatja meg. Még ha. ez nem is lehetséges, akkor is a hozzátartozó gén. izolálására szolgálhat.
Ehhez különösen előnyben részesítjük a Gram-pozitív baktériumokat.
Mivel ezek külső membránnal nem rendelkeznek, és a székrotált fehérjét közvetlenül a környező táptalajba adják le.
Különösen előnyösek a Gram-pozitiv bélbaktériumok, a hacíllusok.
A Snddus proteázok kedvező tulajdonságaik miatt eleve különböző technikai alkalmazási lehetőségeket nyernek Ide tartozik a magas hőmérséklettel szembeni bizonyos stabilitás, valamint az oxidáló és denaturáló szerekkel szemben kialakuló bizonyos stabilitás. Ezzel társul a mikrobiálís proteázok biotechnológiai termelésében megmutatkozó nagy tapasztalat, mely például a kedvező Időnozövektorokra, a gazdasejt és a fertsnentácíös körülmények kiválasztására vagy a .kockázatok mérlegelésére vonatkozik, mind például az allergiát kiváltó hatásra. Termelő szervezetként ehhez bacBusokat alakítottak ki, melyek különösen magas termelékenységet mutatnak az ilyen technikai folyamatokban. A tapasztalat, melyet a proteázok előállításában és alkalmazásában megszereztünk, a találmány szerinti további fejlesztések javára van. Ide tartozik például ezek kompatibilitása más kémiai vegyületekkel, mint például a mosdós tisztítószerek alkotórészeivel.
A bacillus fajok közül előnyben részesítjük a Mbs sp~t, különösen a BndOus sp. (DSM 14392j törzset.
φ φ. φ φ » φ φ * φ φ φ ί, «««» ίί
Ezekből a. találmány szerinti megvalósítási formák eredeti enzimei megkaphatok. Ezek szekvenciáit megadtuk és enzimatikus tulajdonságaikat a példákban .leírtuk. Ezekből vagy ezen törzsek felhasználásával a változatok molekuláris biológiai standard módszerekkel, mint például PCR és közismert pontmutáciős élj árasokkal kialakíthatók.
A feladat egy további megoldása, és ezzel a találmány tárgykörének egyik sajátja, a nukleinsavakat érinti, melyek a találmány fejlesztését, szolgálják.
A nukleinsavak majdnem mindegyik jelenleg folyó molekuláris biológiai kutatás és fejlesztés, valamint fehérje termelés, kiindulási pontja. Ide tartozik kiváltképp a gének szekvenálása és a hozzájuk tartozó aminosav szekvenciák levezetése, ahogy a mutagenezis (lásd fenn) és a fehérjék kifejezése is.
Á meghatározott tulajdonságú fehérjék fejlesztéséhez a mutagenezist fehérje tervezésnek” is hívjuk. A tulajdonságok optimalizálásához további példákat csatoltunk. Az ilyen mutagenezis célirányos vagy véletlenszerű eljárásokkal valósítható meg, például a klónozott gén felismerésével és/vagy kiválasztásával (szűrés és szelekció) nukleinsav szondákkal történő hibridizáláson keresztül, vagy a géntermékek, fehérjék aktivitásának megállapításával. A találmány szerinti proteázok fejlesztése a szakirodalomban leírtaknak megfelelően végezhető [Bryan: Protein engineering” Biochim. Bíophys. Acta., ,1543.. 203-222(2000)].
így a találmány egyik tárgyköre azokra a szuhtihzin típusú alkalíkus proteázokra vonatkozik, melyek nukieotid szekvenciája az 1. számon megadott szekvenciával legalább 98,1 %-ban ***s .'** ***. « * . * * X »·♦ ·*« A azonos, különösen a nukleinsav szekvencia 316-1125. amtnosavainák területén.
Ide előnyösen azok tartoznak, melyek aminosav szekvenciája a 2, számon megadott aminosav szekvenciával legalább a kővetkező mértékben azonosak: 98,2-100 %-ig tizedszázalékonként, különösen a 316-1125. helyzeteknek megfelelő nukleotidok területén. Az érett fehérjék helyzetei és a stopkodon helyzete a fentieknek megtelek
Ezért elvárható, hogy ezeknek a nukleinsavak által kódolt fehérjéknek a tulajdonságai a Bncfeus sp. (DSM .14392) alkalikus proteáz tulajdonságaival nagymértékben azonosak.
Ezen tárgykör további képviselői mindazon nuklemsavak, melyek a fentiekben leírt találmány szerinti fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot kódolják.
A nukleinsavak, melyek a fentieknek megfelelően kidolgozott, előnyös formákat kódolják, különösen jól alkalmazhatók, még mutagenezissel nyert nukleinsavaknál ís.
Különösen azok a nukleinsavak tartoznak a találmány oltalmi körébe, melyek fehérje fragmenst kódolnák. Az ilyen öligonukleotidokat mindhárom olvasási keretben, valamint szensz és antiszensz irányban figyelembe vesszük. Ezek különösen polimeráz láncreakciónál (PCR) az alkalmazott nukleinsavak szintéziséhez kiindulási termékként alkalmazhatok, például a természetes szervezetből származó, rokon gén sokszorozásáfeoz. Ezek. a PCR alapú ehuffing eljárások a kimérák létrehozását is szolgálhatják. Oligonukleotidokon. alapulnak más shuföing eljárások is, mint például a rekomhinálő lígálási reakció (RLR) (WÖ 00/09679 számú szabadalmi bejelentési, ami a véletlen vagy célra irányított fehérje fragmensek kiválasztásának felel meg. Anti* fc * «**, «**» *»*s ** J»;. x xc *«$ * *** fc *fcfc* »A* í szensz oílgonukleotidok például a kifejezés szabályozásához is alkalmazhatok.
A fenti állításnak megfelelően a fentiekben leírt találmány szerinti nukleinsavak a. következő esetekben előnyösek;
- Ha azzal jellemezhetők, hogy természetes forrásból nyerhetők, különösen mikroorganizmusokból.
- Ha azzal jellemezhetők, hagy a szóban forgó mikroorganizmus Gram-pozitív baktérium.
- Ha azzal jellemezhetők, hogy a szóban forgó Gram-pozitív baktérium bélbaktérium; és · Ha azzal jellemezhetők, hogy a szóban forgó bacillus faj Bacihaa sp,, előnyösebben Sadfem sp. (DSM 14392) törzs.
A találmány egyik tárgya vektorok kialakítása, melyek az előzőekben említett nukleinsav területeket tartalmazzák, és különösen olyan nukleinsav területeket fognak át, melyek a megnevezett fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot kódolják
A találmánynak megfelelő nukleinsav felhasználásához, és ezzel különösen a találmány szerinti fehérje termelés előkészítéséhez a nukieinsavat megfelelő módon vektorokba ligáljuk. Ezeket a szakirodalomban korábban kimerítően leírták, és nagy számban és változatban mind klónozáshoz, mind kifejezéshez a kereskedelemben beszerezhetők, Ide tartoznak például a bakteriális plazmidok, a vírusokból vagy bakteriofágokból levezetett vektorok, vagy a túlnyomó részben szintetikus vektorok. Továbbá a sejttípusok szakirodalma szerint megkülönböztetünk különböző területekre kialakított vektorokat, például a Gratanegatív, Gram-pozitív baktériumok, gombák vagy magasabb rendű eukaríóta vektorokat, Ezek például a molekuláris biológiai $· \' * «·* * < λ és biokémiai kutatásokhoz, valamint a szóban forgó gének vagy a hozzájuk tartozó fehérjék kifejezéséhez megfelelő kiindulási pontot, jelentenek.
A találmány egyik megvalósítási formájában a találmány szerinti vektorok klónozó vektorok.
Á klónozó vektorok a tárolás mellett, a biológiai sokszorozási, vagy a kérdéses gének szelekcióját biztosítják, a szóban forgó gének molekuláris biológiai jellemzését elősegítve. Egyidejűleg a szóban forgó nuklemsavak transzponálható és tárolható formáit adják és kiinduló pontot jelentenek azokhoz a molekuláris biológiai technikákhoz, melyek nem köthetők sejtekhez, mint például a PCR vagy az in vöm mutagenezis eljárások.
Hasonlóan előnyős a találmány szerinti expressziős vektorok alkalmazása.
Az ilyen expressziős vektorok alapja a megfelelő nukleinsavak biológiai termelő rendszerben történő realizálása, és ezzel a. hozzátartozó fehérje termelése. Az előnyben részesített megvalósítási formákban ezek olyan expresszíós vektorok, melyek a kifejezőéhez szükséges valamennyi genetikai, elemet magukon hordozzak, például a természetes, eredeti helyen lévő promotert, vagy olyan promotert, mely más szervezetből származik. Ezek az elemek például az úgynevezett, expresszíós kazettába rendezhetők. Alternatívaként, az egyes vagy mindegyik szabályozó elemet, mindig az adott gazdasejtnek. megfelelően lehet kialakítani. Különösen előnyösek azok az expresszíós vektorok, melyek, a további tulajdonságokkal rendelkeznek, mint például optimális kőpiaszám, a kiválasztott, expresszíós rendszerhez, különösen az, amely a gazdasejtnek lerobban megfelel (lásd lejjebb).
Előnyösen a magas kifejezési arányhoz a továbbiakban az szükséges, hogy a szóban forgó inszertált gén ne tartalmazzon nagyobb 5- vagy 3'- nem kódoló területeket. Ilyen inszerteket például úgy kaphatunk, ba. a kiindulási törzs kromoszómális DNS-ét statisztikusan kezeljük restrikciós enzmmel, majd a kapott fragmenseket szekvenálás után megfelelően félhasított expressziős vektorba integráljuk.
A találmány szerint kialakított expressziós vektor egyik példáját 2. ábrán mutattuk be, ami a 2. példa szerinti. pAWA22. A további vektorok a szakirodalomban jártas szakemberek szamára rendelkezésre állnak, és nagy számban a kereskedelemben vásárolhatók.
A találmány tárgykörének megfelelő sejtek, melyeket az előzőekben megneveztünk, a találmány szerinti nukleinsav területeket tartalmazzák, különösen azokat, melyek a találmány szerinti fehérjéket, fehérje fragmenseket, fúziós fehérjéket, vagy származékokat kódolják, előnyösen a fentiekben megnevezett találmány szerinti vektorokon,
Mivel ezek a sejtek a találmány szerinti fehérjék szintéziséhez szükséges genetikai információt tartalmazzák, ezért, például a szóban forgó gének sokszorozása lehetővé válik, de biztosítja. a mutagenezisét vagy transzkripcióját és transzlációját is, valamint a szóban forgó fehérje biotechnológiai előállítását. Ez a genetikai információ vagy extrakromoszőmálísan vagy egyedi genetikai elemként, azaz bakteriális plazmidon helyezkedhet el, illetőleg a kromoszómába integráltan fordulhat élő. A megfelelő rendszer kiválasztása a következő tényezőktől függ, mint például a gének tárolásának módjától és időtartamától, előnyösen a szervezettől, vagy a mutagenezis vagy szelekció módjától. A technika > * φφ jelenlegi állása szerint például a bakteriofágokat és ezek specifikus gazdasejtjeit - mutagenezistől függően - és a szelekciós eljárásaikat mosószer-enzim fejlesztéséhez, a szakirodalomban leírták (WO 97/09446 számú szabadalmi bejelentés].
Előnyben részesítjük azokat a gazdasejteket, melyek az előzőekben leirt találmány szerinti fehérjét, fehérje fragmenseket, fúziós fehérjéket vagy származékokat képesek kifejezni, vagy ezek kifejezését képesek szabályozni, különösen az előzőekben leirt, találmány szerinti nukleinsav területeknél, miután ezeket a megnevezett expresszíős vektorba beépítettük..
Mivel ezek a fehérjéket képző sejtek a biotechnológiai termelést lehetővé teszik, ezért a fentiekben leírt vektorok egyikének a szóban forgó gént megfelelő módon tartalmaznia kell, és ezek transzkripciójára, transzlációjára, valamint pótlólagos módosítására alkalmassá kell tenni.
Gazdasejtként a fehérje kifejezéséhez alapjában véve az összes szervezet megfelel, így prokaríóta, evkaríőta vagy Cyanophyfe. or^rónus. Előnyben részesítjük azokat a gazdasejteket, melyek genetikailag jól kezelhetők, például expresszlós vektorral végzett transzformálásuk után stabilan fennmaradnak, Ilyenek például az egysejtes gombák vagy bakténumok. Me tartoznak előnyösen azok a gazdasejtek., melyek jő mikrobiológiai és biotechnológiai kezelhetőséget mutatnak, Ez például vonatkozhat könnyű tenyészthetőségükre, jó szaporodó képességükre, táptalajjal szembeni igénytelenségükre és az idegen fehérje jó termelésére és kibocsátására. Előnyösen olyan laboratóriumi törzset választunk, melynek kifejezése jól szabályozható. Az ilyen törzsek a. kereskedelemben vásárolhatók, vagy tór^gyüjteményekböl beszerezhetők, Elméletileg az összes találmány szerinti fehéxje számos gazdaszervezetből kinyerhető. A technika jelenlegi állása szerinti széles választékból az optimális expressziős rendszert kell kiválasztanunk, 'Különösen előnyösek azok a gazdasejtek, melyek maguk proteáz negatívok, és így a. proteázokat nem bontják le. Ilyen a 2. példában alkalmazott Borídus subáké DB 104 törzs.
Az előnyben részesített megvalósítási formákban az ilyen gazdasejt aktivitása a megfelelő genetikai elem segítségével szabályozható, például kémia anyagok adagolásával, a tenyésztési körülmények megváltoztatásával, vagy a mindenkori sejtsűrűségtol függően. Ez a szabályozható kifejezés a kérdéses fehérje igen gazdaságos termelését lehetővé teszi. Megfelelő esetben a gén, az expressziős vektor és a gazdasejt összhangban van egymással, így például a kifejezéshez szükséges genetikai elemek (riboszöma kötőhely, promotorek, terminátor szekvenciák) rendelkezésre állnak, illetve a kodonhas^iálat kielégítő. Például az utóbbi úgy optimalizálható, hogy a gén minden kodonját, melyek a szóban forgó gazdában csak nehezen transzlálődnak, olyanra, cseréljük ki, mely a gazdában a leghatékonyabb.
Így előnyben részesítjük azokat a gazdasejteket, melyek azzal jellemezhetők, hogy baktériumok, különösen olyanok, melyek az elkészített fehérjét a környezetbe kibocsátják.
A baktériumok generációs ideje rövid, és a tenyésztési körülményekkel szembeni igényük kicsi. így olcsó eljárások alakíthatók ki. Ehhez olyan baktériumokkal rendelkezünk, melyek fermentációs tapasztalata gazdag. A speciális termeléshez többféle Gram-negatív vagy Gram-pozitív szervezet megfelel, melyeknél a tápanvagforrásokat, termelési paramétereket, termelési időigényt kísérletileg kiderítették.
'* . *** $ fr
A Gram-negativ baktériumok, mint például E. coli, számos fehérjét a peri.plazmatiku.s térbe juttatnak. Ez speciális alkalmazásoknál előnyös lehet. A Gram-pozitív baktériumok, mint például. a baeiílusok, ezzel szemben a fehérjéket a környező táptalajba juttatják, melyből másik előnyben részesített megvalősítási formák alapján a találmány szerinti fehérjék tisztíthatok.
A WO 01/81597 számú szabadalmi bejelentésben olyan eljárást tettek közzé, mellyel elérték, hogy a kifejezett fehérjék a Gram-negativ baktériumokból is kijussanak. Az ilyen rendszerek a találmány szerinti fehérjék előállítására alkalmasak. így gazdasejtként előnyben részesítjük a kővetkező fajokat Etíchouoáfo coli vagy Afebsfeátí, különösen a kővetkező törzseket: .fo coá JM 109, fo coli DH 100B, .fo coli DH 123 vagy Efebsicáu plantfoofo (Rí). Ezek megfeleld xnikrobiológiai módosításokat igényelnek, és/vagy megfelelő» a találmány werinti vektorokba beépíthetők, a. keletkező fehérje kibocsátása érdekében.
Gazdasejtként előnyösek azok a baktériumok, melyek azzal jellemezhetők, hogy Gram-pozitív típusúak, elsődlegesen a Badáus nemzetségbe tartoznak, főleg a kővetkező fajok: BoaKus fentus, BaeBus feáeni/hrntfo, Bucö&s ampfoá^m/bcfons, BaaOus suátíás vagy Bucáám ateíppáffos.
A találmány egyik megvalósítási formája a Badíte pp~t használja, különösen a Budtíuc sp. (DSM 14392) törzset, a találmány szerinti fehérjék (homológ kifejezéséhez. Mégis előnyben részesítjük a heteroióg kifejezést. Ehhez előnyösek a bélbaktériumok, mivel termelést szempontból a Gram-pozitív baktériumok közül a legjobban jellemzett baktériumok. Ide tartoznak elsődlegesen a kővetkező fajok: Bad&w
Φ*
A ** ** ΦΦ * φ s φ φ *· * φ
Sscálus smí/toíque/adens, ŐadOus subáid vagy más fajok és a törzsek, valamint a BadÖus aicalopMua törzsei. Ezekkel a fajokkal például proteázok előállítását kezdték meg [WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentés]. Ebben a szabadalmi bejelentésben számos lehetséges expressaős vektort tettek közzé. Ezek és az alkalmazott fajok azonos kodonhasználattal rendelkeznek, és hasonló szubtílizineket alakítanak ki, így a fehérjeszintézis lépései megfelelően szabályozhatok.
A további előny, hogy ezekkel az eljárásokkal a találmány szerinti fehétjék a gazdasejtben endogén úton keletkező szubtilizinekkel együtt nyerhetők. Az ilyen együttes kifejeződést a szakirodalomban leírták [WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentés]. Adott esetben nincs szükség arra, hogy a gazdasejtet a természetesen előforduló proteáz génnel adott ideig vagy azzal egy időben ínaktiválni kelljen (lásd fenn).
A további előnyben részesített gazdasejtek azok, melyek úgy jellemezhetők, hogy eukarióták, különösen azok, melyek a készülő fehérjét transzláció után képesek módosítani.
A megfelelő eukarióták a gombák, mint például az Achnnmpcotdk vagy élesztők, mint például a Sucehnrnmx/eex vagy a Kíupveromyces. A termőül gombák expressziós rendszerét a szakirodalomban leírták (WO 96/02653 számú szabadalmi bejelentés], Az ilyen rendszerek főleg a hőmérséklettűrő változatok kifejezésére felelnek meg, Az ilyen rendszerek módosításaihoz, különösen a fehérjeszintézissel kapcsolatban, például a kis molekuiatömegű vegyületek, mint például membrán horgonyáé részek, vagy oligoszaeharidok kapcsolása tartozik. Az ilyen öligoszacharíd módosítások például az. .allergiás hatás csökkentésében előnyösek lehetnek. Az ilyen sejtek természetes úton kialakítolt enzimeivel együtt történő kifejezése is előnyős lehet, mint például cellulózokkal.
A találmány egyik tárgyköre a találmány szerinti fehérjék, előállítási, eljárásaira vonatkozik.
így igényt formálunk a fentiekben leírt találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék vagy származékok előállításához alkalmazható minden egyes eljárásra, miután a fentiekben leirt, találmány szerinti nukleinsavakat a fentiekben, leírt találmány szerinti vektorokba beépítettük és/vagy a. fentiekben leírt találmány szerinti sejtekbe bejuttattuk.
Ide tartoznak, például a kémiai szintézis eljárások., melyek különösen a rövid fragmensek esetében gazdaságosak.
Ezzel szemben, mégis előnyben részesítjük, a technika jelenlegi állása alapján, kialakított, a fenti követelményeknek megfelelő molekuláris biológiai, mikrobiológiai, előnyösen biotechnológia. előállítási eljárásokat. Ennélfogva a példák alapján a fentiekben megnevezett. DNS és aminosav szekvenciák esetében, mint például, amelyek a megadott szekvencia protokollokból levezethetők, előnyösen az 1. és a 2. szekvenciákból, előnyösnek tartjuk a megfelelő oligonukleotidok és oligonukleotidoktőí teljes génig terjedő szekvenciák, valamint fehérjék ismert molekuláris biotechnológiai módszerekkel történő szintézisét.
Kiindulva ismert szuhtilizin termelő mikroorganizmusokból például a találmány példáira támaszkodva, további természetes szuhtilizin termelők azonosíthatók és izolálhatok, melyek szubtilízin-gén- és/vagy aminosav szekvenciáját levezethetjük, és az itt megadott: előírásoknak megfelelően, továbbfejleszthetjük. Az ilyen baktériumfajok a megfelelő előállítási eljárásokkal tenyészt··, hetek és alkalmazhatók. Analóg modellt, mely vektorok és új *·* * -S «Λ·* «Λ * ·$· *
* expresszíós vektor fejlesztésére vonatkozik, a szakirodalomban leírtak (WÖ 91/02792 számú szabadalmi bejelentés), A találmány megvalósítási formái, a hozzátartozó nukleinsav szekvenciák alapján, sejtmentes expressziős rendszerben ís megvalósíthatók, melynél a fehérje bioszintézise in vám elfogadható. A fentiekben már csatolt elemek mindegyike egymással kombinálható, a találmány szerinti fehérje előállítása érdekében. Á találmány szerint elképzelhető, mindegyik fehérje több kombinációs lehetősége miatt, az előállítási lépések során, kísérletekkel az optimális eljárást mindegyik konkrét esetben ki kell dolgozni.
A találmány egyik sajátos tárgyköre olyan szerekre vonatkozik, melyek azzal jellemezhetők, hogy a fentiekben leírt, találmány szerinti fehérjét, fehétfe fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot tartalmazzák.
Beért az összes szer, különösen keverékek, receptúrák, oldatok, stb., ezek alkalmazhatósága a fentiekben leírt, találmány szerinti fehérjék fejlesztéséhez a találmány oltalmi körébe tartoznak. Az alkalmazási területnek megfelelően ezek lehetnek szilárd keverékek, például porok fagyasztva. szárított vagy kapszulázott fehérjékkel, vagy gélképző, vagy folyékony formák. Előnyben részesítjük azokat a. receptúrákat, melyek, például puffcranyagokat, stabiüzátorokat, reakciőpartnereket, és/vagy proteáz kofaktorokat tartalmaznak, és/va^ más a proteázokkal szinerglzmusba lépő alkotórészeket. Különösen azokra a szerekre gondolunk, melyek az alábbi csatolt alkalmazási területeken alkalmazhatók. A technika jelenlegi állását tükröző további felhasználási területeket a azakirodalomban leírták [Uhüg:. Handbuch Industríal Bnyzmes and íheír Applications*, 'Wdey~ Verlag, New York, (1998)).
!> Φ
Ezek a tárgykörök a. mosó- és tisztítószerek előnyben részesített megvalósítási formáinak számítanak, melyek azzal jellemezhetők, hogy az előzőekben leírt találmány szerinti fehérjéket, fehérje fragmenseket, fúziós fehérjéket, vagy származékokat tartalmazzak.
Ahogy azt a találmány kivitek példáiban bemutattuk, meglepetésünkre az állapítható meg, hogy különösen előnyős a Baedfea sp. (DSM 14392) törzsből származó alkalikus proteáz, azaz mely a vadtípnsű enzimtől abban különbözik, hogy a megfelelő mosó- és tisztítószer alkalmazásánál az ilyen célra kialakított enzimet mosó-, előnyösen tisztítószer teljesítményében megközelíti, vagy részben felül is múlja.
A találmány tárgykörében az összes elképzelhető tisztítószer fajtára, gondolunk, mind koncentráltakra, mind higítatíanul alkalmazott szerekre: ipari méretekben, mosógépbe vagy kézi- illetve tiaztítömosáshoz adagolva. Ide tartoznak például a textíliákhoz, szőnyegekhez, vagy természetes rostokhoz adott találmány szerinti mosószerek, Ide tartoznak például a. mosogatógépek mosogatószerei, vagy a manuális mosogatószerek, vagy a kemény felületek, mint például fém, üveg, porcelán, kerámia, csempe, vas, lakkozott felületok, műanyagok, fa vagy bőr, mosószerei, amennyiben a. találmány szerinti tisztítószerben alkalmazzák.. Mindegyik tisztítószer típus a találmány megvalósítási formáját jelenti, amennyiben a találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúzióé fehérjék vagy származékok gazdagítják.
A találmány megvalósítási formái, felölelik az összes napjainkban ismert technikát és/vagy az összes a találmány szerint nyújtott formát. Ide tartoznak például a szilárd, por, folyékony ** Λ*·
φ.χ. χ — * vagy pasztaszerű szerek, adott esetben akár többfázisban présel vagy nem préselt szerek, valamint ide tartoznak az extradátumok, szemcsék, tabletták, valamint pouch-ok, akár nagy csomagokban, akár kisebb adagokban csomagolták.
Az egyik. előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti szer 1 grammjára nézve a találmány szerinti fehérjéből, fehérje fragmensfoől, fúziós fehérjéből vagy származékból 2 pg-lóO mg~ot tartalmaz, előnyösen ez 5 g.g-140 mgot, 20 pg-120 mg-ot, legelőnyösebben SÖ pg~80 mg-ot.
Az ilyen szer proteáz aktivitását a szakirodalomban leírtaknak megfelelően meghatározhatjuk (Tenside, 7, 125-132 (1970)). Ezt ennek megfelelően PE-feen (proteáz egységben) adjuk meg.
A találmány szerinti fehérje, íragmens, fúziós fehérje vagy származék mellett a találmány szerinti mosó·' és tisztítószerben további alkotórészek fordulnak elő, mint például enzimstabilizálók, tenridek, mint például nem ionos, anionos és/vagy amfoter tenzídek, és/vagy fehérítő anyagok, és/vagy kötőanyagok, és adott esetben további szokásos alkotórészek találhatók, melyeket a következőkben ismertetünk.
A nem-ionos tenzídek előnyösen az alkoxilezett, előnyösen etoxílezett, különösen a 8-18 szénatomos primer alkoholok és átlagban. 1 -12 möl ethén-oxid (EO) per mól alkohol felhasználásával, készülnek, melyekben az alkoholcsoport lineáris vagy előnyösen a 2, helyzetben metilesen elágazó lehet, illetve a lineáris és a metilesen elágazó csoportnak .keverékét tartalmazhatja, igy szokásosan az oxoalkoholcsoportokban találhatók. Mégis különösen előnyösek az alkoholetoxllátck, melyek természetes eredetű 12-18 szénatomos lineáris alkoholokat tartalmaznak, mint például kókusz-, pálma-, fággyűzrir vagy oleilalkohol, és un átlagban 2-8 mól alkoholból állnak. Az előnyben részesített etoxilezeit alkoholok közé tartoznak például a 12-1.4 szénatomos alkoholok 3 EO-val vagy 4 EO-val, a 9*11 szénatomos alkoholok 7 EO-val, a 13-15 szénatomos alkoholok 3 EO-val, 5 EO-val, 7 EO-val vagy S EO-val, a 12-18 szénatomos alkoholok 3 EO-val, 5 EO-val vagy 7 EO-val és ezek keverékei, mint például a 12-14 szénatomos alkoholok 3 EO-val és a 12-1.8 szénatomos alkoholok 5 EO-val alkotott keverékei. A megadott etoxilezési. fokok statisztikai középértékeket jelentenek, melyek a speciális termékeknél egy egész vagy egy tőrtszám lehet. Előnyősén az alkoholetomlát egy bizonyos homológmegoszlást mutat (szűk tartományú elomlótok, NRE). Ezeken a nem-ionos tenzideken kívül a zsíralkoholok több mint 12 EO-val is alkalmazhatók. Ezekre példák a faggyűzsíralkoholok 14 EO-val, 25 EO-val, 30 EO-val vagy 40 EO-val.
A nem ionos tenzidek egy további előnyben részesített osztálya., melyek vagy csak a magukban lévő nem. ionos tenzidek vagy más nem ionos tenzidekkel kombinációban adagolhatok, a következők; alkozüezett, előnyösen etozílezett vagy etozilezett ős propoxüezett zsírsavaMészterek, előnyösen az ahdHáncban 1-4 szénatommal, ilyenek elsősorban a zsirsavmetílészterek.
A nem ionos tenzidek egy további osztálya, melyek előnyösen adagolhatok, az ahdlpoiiglíkozidok (AFG). Az alkalmazható alkilpoliglikozidok általános képlete; RO(G)», ahol. R jelentése primer egyenesláncú vagy metilesen elágazó, különösen a 2. helyzetben metilesen elágazó 8-22 szénatomos, előnyösen 12-1,8 szénatomos alifás csoport, és G jelentése S-6 szénatomos glűkozidegység, előnyösen glükóz. Az oügomerizáeiő foka, mely a monoglükozídok és oligoglükozidok megoszlását adja, 1-4,0 között elfogadható, előnyösen 1,0 és 2.0 között és legelőnyösebben 1,1 -1,4 között van. Az előnyben részesített alkilpoliglíkozidiok lineárisak, tehát olyan alkilpolíglikozid, melyben a poliglikozilmaradék egy glükózán és az alkilesoport az n-alkilcsoporton van.
Az aminoxid típusú nem-ionos tenzidek, például az N-kőlmszalkil-N,N-dimetil“aminoxid és az H-faggyúalkil-N,N-dihidro3detil-aminoxid, valamint a zsírsavalkanolamidok is megfelelnek. Az ilyen nem-ionos tenzidek mennyisége előnyösen nem több mint az etoxilezett zsíralkoholokké, adott esetben nem több mint ezek. fele.
A további megfelelő tenzidek a (Π) általános képietü polihidroxizsírsavamidok:
E1
R-CO-N-[Z1 <II>
ahol az RCO jelentéses 6-22 szénatomos alifás aeiiesoport, Rx jelentése hidrogén, 1-4 szénatomos alkil- vagy hidroxilalkücsoport és [Z] jelentése egyenes vagy elágazó 3-10 szénatomos polihídroxialkilcsoport és 3 - 10 hidroxilcsoportból ált A polibídroxizsírsavamidok. esetében ismert anyagokról van sző, amelyek általában egyes redukáló cukrok ammóniával, alkxlaminnal vagy alkanolaminnal reduktív aminálásával, és ezt követően zsírsavalldlészterrel vagy zsírsavkloríddal végzett acilezéssél megkaphatok.
A polihidroxizsírsavamidok. csoportjához a kővetkező általános képietü vegyületek tartóznak:
; 3
R -O-R * -4 <. * « « * Φ *
R-CO-N-(Z) (ΙΠ) ahol R jelentése egyenes vagy elágazó 7-12 szénatomos alkilvagy alkenilcsoport, RJ jelentése egyenes vagy elágazó vagy ciklikus 2-8 szénatomos alkilcsoport vagy arilcsoport és R2 jelentése egyenes vagy elágazó 1-8 szénatomos egyenes vagy elágazó vagy ciklikus alkilcsoport vagy arilcsoport vagy oxialldlcsoport, ahol Ci..4~alkil· vagy fenilcsoport előnyös, és (Z| jelentése lineáris políhídroxialkilcsoport, melynek alkíllánca legalább két hidroxilcsoporttal szubsztituált, vagy ezen csoportok alkoxilezett, előnyösen eíoxílezett vagy propoxilezett származékai.
Előnyösen [Z] egyes redukáló cukrok, mint például glükóz, fruktóz, maltóz, láktóz, galaktőz, mannőz vagy xilőz reduktív aminálásával kapható meg. .Az N-alkoxi- vagy N-ariloxiszübszíituált vegyületek úgy állíthatók elő, hogy a zsírsavmetilészierekkel alkoxid katalizátorok jelenlétében a kívánt polihidroxizsírsavamiddá átalakítjuk.
Anionos fenéidként például a szulfonát és a szulfát típusúak használhatók. A szulfonát tenzidek közöl előnyben részesítjük példán! a C9.13-alkiibenzolszulfonátoka.t, az oleinszulfonátokat, azaz az alkén- és a hidroxialkánszulfonátokat, mint például a diszulfonátokat, amelyeket például 12-18 szénatomos monoolefínekből, melyek a láncvégeken vagy annak belsejében kettöskötést tartalmaznak, gázformájú kéntrioxiddal történő szulfonálással, majd ezután a sznlfenált termék lúgos vagy savas hidrolízisével kapunk. Azok az alkánszulfonátok is megfelelnek, melyeket például 1.2-18 szénatomos alkánokből szulfoHőrozással vagy szulfoxidálással és végül hidrolízissel, illetve neutralízálással nyerhetünk. Hasonlóképpen az a-szulfozsírsav
X* (észterszulfonát) észterek,· például a kókusz- pábnamag- vagy íaggyúzsírs&vak α-szulfonált metilészterei, is megfelelnek.
Egy további alkalmas anionos tenzid a szulfátéit zsírsav-glicerinészter. Á zsírsavglícerinészterek alatt, a mono··, dl- és triésztereket, valamint ezek keverékeit értjük, amit monoglicerinből 1 -3 möl zsírsav segítségével észterezéssel állítunk elő vagy a trigliceridek 0,3-2 mól glicerinnel történő átészteresítésével kapunk. Ráadásul az előnyben részesített szulfátéit, 6-22 szénatomos telített zsírsavakból, mint például a kapronsav, a kaprilsav, a kaprinsav, a mirisziínsav, a laurinsav, a palmitinsav, a sztearinsav vagy a behénsav (dokozánsav) indulnak ki,.
Alk(én|ilszulfátként 12-18 szénatomos zsíralkoholok kénsav-félészterek alkáli, és különösen nátriumsői, például kókuszzsíralkohol, faggyűzsíralkohol, lau.nl- , mirisztii-, cetli- vagy sztearilalkohol vagy 10-20 szénatomos lánchosszúságú oxoalkoholok és ezek szekunder alkohollal alkotott félésztereí előnyösek. Továbbá a megnevezett lánchosszúságú alk(én)ilszulfátok, melyek szintetikus, petrolkémiai alapokon előállított, egyenesláneú alkilesoportot. tartalmaznak, a zsirkémiai nyersanyagok vegyületeivel analóg lebontási gátlást mutatnak. Mosástechnikai szempontból a 12-16 szénatomos alkilszulfátok és a 12 1.5 szénatomos alkilszulfátok, valamint a 14-15 szénatomos alkilszulfátok érdekesek, és előnyben részesítettek. A 2,3-álkilszulfát is a megfelelő anionos tenzidek kézé tartozik.
Azok a kénsavmonoészterek is előnyösek, melyeket 1-6 mól etüén-oxiddal etoxiiezett egyenes vagy elágazó láncú 7-21 szénatomos alkoholokból, mint például a 2-metile.sen elágazó 9-11. szénatomos alkoholokból, átlagban 3,5 mól etílén-oxiddal, vagy a φφ φφφ •X Φ Φ Φ *
18 szénatomos esetében 1-5 mől EO-val készülnek. A kis mennyiségben már megmutatkozó magas habzási képességük: miatt a tisztítószerekben csak kis mennyiségben, 5 tőmeg%-ig, például 1-5 tömeg%-ban alkalmazzák.
A további alkalmas anionos lensddek azok az alküszulfoborostyánkősav-sók, melyeket szulfoszukckiátnak vagy szuMoborostyánkősavésztemek is neveznek, és amelyek a szulfoborosiyánkósav alkoholokkal, előnyösen zsíralkoholokkal alkotott monoésztereiből és/vagy díésztereiböl és adott esetben etomlezett zsíralkoholökből állítanak elő. Az előnyben részesített szulfoszukcinát 8-18 szénatomszámos zsíralkoholokat vagy ezek keverékét tartalmazzák, A különösen előnyben részesített megváló sítási formában a szulfoszukcinát egy zsíralkoholcsoportot tartalmaz, amelyet etoxüezett zskalkoholokból vezethetünk le, amelyek maguk a nem-ionos tenzídek közé számítanak (leírásukat lásd lejjebb). Ráadásul, ezzel szemben, a szulfoszukcinát, melynek zsíralkoholcsoportja etozüezett zsíralkoholból korlátozott homolőgmegosztással vezethető le, különösen előnyös. Épp ügy az is lehetséges, hogy előnyösen 8-18 szénatomos alk(én)ílláncos alk(én)ílborostyánkő savat vagy annak sóját alkalmazzuk.
Anionos tenzidekként különösen a szappanok jönnek szoba. A megfelelők közé a telített zsirsavszappanok, mint például a laurilsav, mirisztilaav, palmintínsav, sztearinsav, hidrogénezett erukasav és a behénsav söí, valamint különösen a természetes zsírsavakból, mint például a kókusz-, pálmamagvagy faggyűsavakből levezetett szappankeverékek tartoznak.
Az anionos tenridek, beleértve a szappanokat is, nátrium-, kálium- vagy ammőníumsó formákban, valamint oldható szerves ·*♦* •λ X
bázisokként, mint például a mono-, dí-· vagy trietanol-amin, fordulhatnak elő. Előnyösen az anionos tenzidek nátrium- vagy kálíumsó formákban, különösen nátriumsó formákban fordulnak elő,
A találmány szerinti mosó- és tisztítószerekben a. tenzidek a kész szerre viszonyítva előnyösen 5-50 tömeg%-ban, előnyösebben 8-50 tömeg%-ban, és legelőnyösebben 8-30 tőmeg%-ban fordulnak elő.
A találmány a kővetkező fehérítöszereket tart&Imaxha.tja, Fehérítő anyagként, a vízben HaOa-t szolgáltató vegyületek közül a következők különös jelentőséggel bírnak: nátrium-perkarbonát, nátóum-perborát-tetrahídrát és a nátóum-perborát-monohidrát, A további alkalmazható fehérítő szerek a következők: peroxopirofoszfát, citrátperhídrát, valamint a HgOs-t szolgáltató persav-sok vagy persavak, mint például a perszulfát, illetve a perkén sav. Alkalmazható a karbamíd-preroxobidrát-perkarfeamid, ami a kővetkező képlettel írható le: HaN-CO-NaHaMhöa. A szilárd felületek tisztításához. elsősorban, például a gépi mosogatáshoz, a fehérítő szert a szerves fehérítő szerek csoportjából választják, ezek a textíliák esetében is alkalmazhatók. A tipikus szerves fehérítő anyagok közé a diacilperoxídok, mint például a dibenzoilperoxíd, tartoznak. További tipikus szerves fehérítő szerek a peroxisavak, ahol például különösen az alküperoxisavak és az arilperoxisavak nevezhetők meg. Az előnyben részesített képviselők a peroxibenzoesavak és ennek gyűrűben helyettesített származékai, mint például alkilperoxibenzpesavák, .de a következők is ide tartoznak: peroxí-a-naftoesav és a magnézium-monóperftalát, az alifás vagy szubsztituált alifás peroxisavak, niint például a peroxdanrínsav, peroxisztearinsav, ε-ftálimidoperoxikapronsav (ftálimidoperoxí «X- ***** ί φ * ’*» η
Μ* hexánsav, PAP), o-karboxíbenzamidoperoxikapronsav, N-nonenílamidoperadípínsav és N-nonemlamídoperszukcinát, és az alifás és arilalífás peroxidxkarbonsavak, mint például 1,12-diperoxikarbonsav, 1,9-diperoxiazelainsav, diperoxiszebacinsav, diperoxibrasszílsav, a diperoxiftálsavak, 2-decíldiperoxibután- 1,4-disav, Ν, N - tereftaloil-di(6-aminoperkapronsav).
A fehérítőszer mennyisége a mosó és tisztítószerben 1-40 tömeg% és előnyösen 10-20 tömeg%, ahol előnyösen perborátmonohidrátot vagy perkarbonátot alkalmazunk.
A 60 °C -on vagy a felett végzett mosásoknál a. jobb fehérítés elérése érdekében kizárólagos alkotórészként fehérítést biztosító aktívátorokat alkalmazhatunk. A fehérítést aktiválóként olyan vegyöletet alkalmazhatunk, amelyek, előnyösen 1-10 szénatomos, előnyösebben 2-4 szénatomos alifás peroxokarbon savakat aa perhidrolízisnek megfelelő körülmények között, és/vagy adott esetben a szubsztítuált perbenzoesavak adnak hozzá. A megfelelő anyagok azok, amelyek a megadott szénatomszámú O- és/vagy N-adlcsoportokat és/vagy adott esetben szubsztítuált benzolcsoportot hordoznak. Előnyben részesítjük a többszörösen acilezett alkiléndiaminokat, különösen a tetraacetil-etiléndiamint (TÁED), az acilezett tríazinszámiazékokat, különösen az 1,5-di.acetil-2,4~dioxo-hexahidro- 1,3,5-triazint (DADHT), az acilezett glükoluríleket, különösen a. tetraacetüglükcluriit (TAGÚ), az N-aeilimideket, különösen az N-nonanoüszukdhImidet (NÖS1), az acilezett fenolszuííbnátokat, különösen az n-nonaíxoil- vagy izononanoil-oxibenzol^ulfonátot (n- illetve izo-NOBS), az acilezett hidroxíkarfeorisavakat, mint például a trietü-O-acetílcitrát (TEOC), a karbonsavanhidrideket, különösen a ftálsavanhidridet, izatosavanbidridet és/vagy borostyánkősavX X * * ί
«χ *<· .* nr
Κ #·«ϊ *·♦' anhidridet, karbonsavamidok, mint például K-metíldiacetamid, glíkolid, acilezett. többértékű alkoholok, különösen tríacetin, etilénglikoldiacetát, izopropenöaeetát, 2,5-diaeetmtí-2,5dihidroiürán és az egyik német zzábadalombóí (DB 196 16 693 és DE 196 16 767 számú. szabadalmi bejelentések) ismert enolészterek, mint például aeetílezett szerbitől és mannitol, előnyösen az EP Ö 525239 szabadalmi bejelentésben közzétett keverékek (SORMAN), acilezett admrazármazékok, különösen pentaacetílglűkóz (PAG), pentaacetílfruktöz, tetraacetíMőz és oktaacetlilaktoz, valamint aeetílezett, adott esetben N-alkilezett glukamin, illetve glukonolakton, triazol, illetve tríazolszármazékok és/vagy farokképző kaprolaktámok és/vagy kaprolaktám származékok, előnyösen H-acilezett laktámok, például N-benzoilkaprolaktám és N-acetitaprolaktám, melyek a szakirodalomból ismertek [WO 94/27970, WO 94/23102, WO 94/23103, WO 95/00626, WO 95/14759 és WO 95/17493 számú, szabadalmi bejelentések], A német DE 196 16 769 számú, szabadalmi bejelentésből ismertek a hidrofilen szubsztítuáli acüacetálok, és a német DE 196 16 770 számú szabadalmi bejelentésben, valamint a WO 95/14075 számú szabadalmi bejelentésben leirt aeíllaktámok, melyeket szintén előnyben részesítünk.. A német DE 4443 177 számú szabadalmi bejelentésből a hagyományosabb fehérítők kombinációi szintén alkalmazhatók. Hasonlóan a mtrilszármazékok, mint a cianopirídin, nitrikjuat-ok, mint például az N-alkil-ammőniumacetonitrilek, és/vao1 ríanamidszármazékok alkalmazhatók. Az előnyben részesített fehérítő aktívátorok a kővetkezők;. nátrium-4-(oktanoüorí)~benMszulfonát, nnonaneil- vagy izononanoilo^ben^louBonát (n- öl izo-DOBS], undecenü-oxibenzolszulfonát (IJDÖBS). nátriumdodekanoOoxi«ψ Α*
Λ s* * ΐ* φ* * benzolszulfonát (DOBS). dekanoil-oxibenzoesav (DÓBA, OBC .10) és/vagy dodekanoiloxibenzolszulfonát (OBS 12), valamint Nmetilmorfolinum-acetonxtril (MMA). Az ilyen fehérítő aktivátorok szokásos módon a teljes összetételre nézve 0,01-20 tömeg%-ban, előnyösen 0,1-15 töme^4>~ben, niég előnyösebben 1-10 tomeg%~ bari fordulhatnak elő,
A hagyományos fehérítő-akh válókhoz vagy azok helyett úgynevezett fehérítő-katalizátorok adhatók a formatestekbe. Ezek közé a fehérítést erősítő átmeneti fémsók illetőleg átmeneti fémkomplexek tartoznak, mint például Μη-, Fe-> Co-, Ru- vagy Mosókomplexek vagy -karbonilkomplexek, Fehérítő--katalizátorként felhasználhatók a következők is: Μη-, Fe-, Co-, Ru-, Mo-, Ti-, Vés Cu--'komplexek N-t tartalmazó tripodális-ligandok, valamint Co-, Fe-, Cu- és Ru-amminkomplexek, amely vegyületeket a szakirodalomban közzétették (DE 197 09 284 Al számú szabadalmi bejelentés). A szakirodalom szerint acetonitril származékok (WO 99/63038 számú szabadalmi bejelentés) és fehérítő aktiváló átmenetifém-komplex vegyületek az amilázzal kombinációban fehérítő hatást fejtenek ki (WÖ 99/63041 számú szabadalmi bejelentés) «
Rendszerint a találmány szerinti szer egy vagy több kötőanyagot tartalmaz, különösen zeolitot, szilikátot, karbonátot, szerves kötőanyagot, és ha alkalmazásuk ökológiai problémákkal nem jár, akkor a foszfátokat is tartalmazhat. Végül, az utóbbiak, tisztítószerekbe a gépi mosogatáshoz előnyösen, állomány-anyagok adhatók.
Az alkalmas kristályok a réteges nátriumszxlikátok, melyek általános képlete a. következő: NaMS^O^t Ή2Ο, ahol M jelentése nátrium vagy hidrogénatom, x értéke 1,9 - 4 és y értéke 0 - 20 és *fc *· *
X fcfc tt fcfc fcfc fc * fcfc z $ fcfcfc* fcfcfcfc fc s
előnyösen x értéke 2, 3 vagy 4, Az ilyen kristályos rétegszilikátokat például az EP 164514 szabadalmi bejelentésben leírták, Az előnyben részesített kristályos rétegszilikátok formájában M jelentése nátrium és x értéket 2 vagy 3, Mind a mind az ö-nátriumdiszílikátot, Na2Si2Os yH2O, előnyben részesítjük. A kereskedelemben például ilyen termék az SKS® (Fa. Clariant). Az SKS~ 6® túlnyomó részben ö~nátrium~diszilikát, melynek képlete: N'euSiaösWHsO, míg az SKS-7® túlnyomó részben E-nátriumdiszilikát. Savval reagáltatva. (például citrom sav vagy szénsav) a δ-nátrium-diszilikátból kanemit keletkezik (NaHShö^yHgO, amelynek kereskedelmi neve SK8-9® illetve SKS 10® (Fa. Clariant). Előnyös lehet ezen rétegszüikátok kémiailag módosított változatainak alkalmazása is. így például a rétegsziUkát lügossága megfelelően befolyásolható, A foszfáttal, illetve karbonáttal dotált rétegsrilikát kristályfelépítése a Ö-nátriumdiszilikáthoz viszonyítva más, gyorsabban oldódik és a 3nátrium.··•diszüikáthoz képest kalcium··kötő képessége nagyobb, így a x NaaO * y SiOa * z Psös összegképletö vegyületeket, melyekben az x. és y tartalom arányában 0,35-0,6-ig, a x és z tartalom 1/75-1200 arányban és a y és z tartalom 4-2800 arányban változhat, a szakirodalomban közzétették (DE 19601 063 számú szabadalmi bejelentés]. A rétegszilikátok oldókonysága növelhető, különösen fínomrészecskés rétegszüikátok alkalmazásával. A kristályos rétegsrilikátok összetevői más alkotórészekkel együtt alkalmazhatók Ide tartoznak, különösen a eellulózszármazékok, melyek előnyösen szétesést biztosító hatást mutatnak és különösen mosószer tablettákban alkalmazhatók, valamint a polikarbóxilezett vegyületek, mely közül például a cít•ΑΦ φΦ·νφ α «Φ Φ* *·** φ Φ Φ Α Φ *τν rt romsavakat, illetve polimer poükarboxilátokat, például az akrilsavak kopoHmereket nevezzük meg.
Az amorf nátriumszüikátok is alkalmazhatók, melyek Na^ö : SiO2 arányszáma 1:2 és 1:3,3, előnyösen í;2 és 1:2,8, és különösen előnyösen 1:2 - l:2,ö között van, melyeknek oldódási késleltetésük van és másodlagos mosási tulajdonságokat mutatnak. Az oldódási késleltetés a hagyományos amorf nátrium.szüikátokkal szemben különbőzéképpen, például felületi kezeléssel, kompaundálással, kompaktálással/tömörítéssel vagy túlszárítással idézhető elő, A találmány tárgykörében “amorf alatt röntgenamorfot is értünk. Ez azt jelenti, hogy a szilikat a rontgendifirakciős kísérletekben éles rontgenviaszaveródést nem ad, ami a kristályos anyagokra egyébként tipikus, hanem éppenséggel a szőrt röntgensugár egy vagy több maximumot mutat, melyek szélessége a diffrakciós szög többszöröse. Mégis egészen jó képtulajdonságokhoz vezet, ha a szibkátrészeoske az elektron-diffrakciós kísérlet éknél elmosódott, de még éles diffrakciós maximumot ad. Ezt úgy magyarázhatjuk, hogy a mikrokristályos termék, nagysága 10-t.ől néhány száz nm-ig terjed, és ezek az SO nm-es, és különösen a 20 nm-es maximumig előnyősnek számítanak. Az ilyen úgynevezett rőntgenamorf sziklátokat, amelyek a ha^ományos vleüveggel szemben lassabb oldódásnak, előnyben részesítjük. Különösen előnyben részesí^ük a tömőrített/kompaktált amorf szilikátokat, a kompaundált .amorf szüikátokat és a túlszűrheti rőntgenamorf szálkátokat
Az alkalmazott feomkrístáiyos, szintetikus és kötött vizet tartalmazó zeoht előnyösen a «elit A és/vagy F. Zeolit F-ként a Eeohth MAF^ (a Crosüeld cég gyártmánya) különösen előnyős.
·$·
Megfelelő még a zeolit X is, vagy mint például az A, X és/vagy P keverékek. A kereskedelemben kapható és a találmányban előnyösen alkalmazható példák a kővetkezők: a zeolit X-ből és a zeolit Á-ből a. Co-kristályosított termék (körülbelül 80 tömegéé zeolit X), ez a GONDBA Augusta S.p.A. cég terméke, amelyet VEGOBOND AX® márkanéven forgalmaznak és a kővetkező általános képlettel jellemezhető:
nNa2O · (l-n)K^O> A12O3 (2 - 2,5)SiO2 (3,5 - 5,5) · H2O
A megfelelő zeolit közepes részecskemérete kisebb, mint 10 pm (térfogati megoszlás; mérési módszer: Coulter Counter) és előnyösen 18-22 tőmeg-X, adott esetben 20 - 22 tomeg% kötött vizet tartalmaz.
Magától értetődő az is, hogy az általánosan ismert foszfátok mint kötőanyagok alkalmazása addig lehetséges, míg azok környezetvédelmi problémákat nem okoznak. A sok, kereskedelemben kapható foszfát kézül a kővetkezők játszanak jelentős szerepet a mosó- és tisztítószerek ipari előállításánál: alkalifémfoszfátok, különösen a pentanátrium- illetve a pentakáliumtrifoszfát (nátrium, illetve kálíum-polifoszfát).
Az alkálifémfoszfátok a foszforsavak különböző alkálifém(különösen a nátrium- és kálium··) sóinak összefoglaló elnevezése, amelyeknél a metafoszforsavak (HPO3)» és az ortofoszforsavak H3PO4 mellett nagyobb molekulatőmegű képviselőket különböztethetünk meg. A foszfátok több előnnyel rendelkeznek. Alkáli, hordozóként működnek, a mészkőlerakődást a különböző géprészekbe, illetve a. mészkő inkrusztádót a szövetekbe gátolják és ezen kívül a tisztításban hatékonyak.
A nátríum-díhidrogénfoszfát, NaKgPCn, dihidrátként (sűrűsége 1,91 g/cm3, olvadási pontja 60 °G) és monohidrátként . Λ XX tf.*'·'*· ** 3 * <· * * *
ΑίΜ * ···* (sűrűség 2,04 g/cm3) fordul elő. Mindkettő fehér só, vízben könnyen oldódó por, melyek kristályvizüket hevítéssel elveszítik, és 200 öC-on gyenge savban difeszfátot adnak (dinátmnnhidrogén-difoszfát, HasH^P^O?), magasabb hőmérsékleten nátrium-trimetafeszfáttá (NaaPaOs) «s Maddrell-féle sókká (lásd lejjebb) átalakulnak. A NaHaPCb savas reakcióban akkor alakul ki. mikor a foszforsavat nátronlűggal pH 4,5 értékre állítják és a levet porlasztják. A kálium-dihidrogénfoszfát (primer vagy egy bázisú kálium foszfát, káhumbifoszfát, EDP), a KH2P04, fehér só melynek sűrűsége 2,33 g/cm3, és olvadáspontja 253 »C (a káhum-pokfoszfát szétesése és képződése (KKhlxj és vízben könnyen oldódik.
A dinátríum-bidrogénfoszfát (szekunder nátrium-foszfát), MasHPCh, színtelen vízben könnyen oldódó kristályos ső. Vízmentes formában létezik, és vízben 2 mólnál (sűrűség 2,066 g/cm3, vízvesztés 95 «C-onj, 7 mólnál (sűrűség 1,68 g/cm3, olvadáspont 48 »C, 5 H2O vesztéssel) és 12 mólnál (sűrűség 1,52 g/cm3, olvadáspont 35 eC, 5 Hi>O vesztés után), 100 «C-on vízmentessé válik és magasabb hőmérsékleten difosriattá alakul (Na4PzÖ?|. A dinátrium-hidrogénfoszfát foszforsav sződaoldatos semlegesítésével, fenolítaleín Indikátor jelenlétében, előállítható. A dikálium-hidrogénfoszfát (másodlagos vagy kétbázisú kálium-foszfát), K2HPO4, arafoter tulajdonságú fehér ső, mely vízben könnyen oldódik.
A trinátrium-fozzfát, tercier nátrium-fosri'át, NaaPÖ*, színtelen kristály, dibidrátkánt sűrűsége 1,62 g/cm3 és olvadáspontja 73-76 (szétesik), dekahidrátként (ez megfelel 19-20 % Ibös-nek) olvadáspontja 10Ö öC és vfement.es formában (ez megfelel 39-40 % PsOs-nek) sűrűsége 2,536 g/cm3. A trínátrium-foszfát vízben nlkalikua reakcióban könnyen oldódik.
és pontosan 1 mól dinátrium-foszfát oldatból bepárolva előállítható. A trikálium-foszfát (tercier vagy hárombázisú kálium-foszfát), K3PO4, fehér, elfolyosodó szemcsés por, melynek sűrűsége 2,S6 g/cm3, olvadáspontja 1340 »c, és vízben alkalikus reakcióval könnyen oldódik. Példá^il a Thomas salak szénnel és kálium-szulfáttal történő melegítésével jön létre. Magas ára miatt a tisztítószer iparban a könnyebben oldódó, mégis nagyhatású kálium-foszfátot részesítik előnyben a nátriumvegyületekkel szemben.
A tetranátrium-difoszfát (nátrium-pírofoszfát), Na«PsO?, vízmentes formában (sűrűsége 2,534 g/cm3, olvadáspontja 988 öC, de 880 «C-ot tűntetnek fel) és dekahidrátként fordul elő (sűrűsége 1,815-1,836 g/em3, olvadáspontja vízvesztés után 94 °C). Mindkét anyag színtelen, vízben alkalikus reakcióban a kristályok oldódnak. A N&HHO? a. dinátrium-foszfát 20Ö °C feletti hőmérsékletre hevítésével nyerhető, vagy foszforsavat szódával sztöehíometrikus arányban egyesítünk, és az oldatot porlasztással víztelenítjük. A dekahidrát komplexben lévő nehézfémsót tartalmaz és a víz keménységét csökkenti. A kálium-difoszfát (kálium-pirofoszfát), K«PsO?, trihidrát formában létezik, színtelen higroszkőpos porként, melyen sűrűsége 2,33 g/cm3, vízben oldódik, Így pH értéke .1 %-os oldatban 25 8C-on 10,4,
A N&HgPO*, illetőleg a R'hHPCH kondenzációjával keletkező magas molekulatömegü nátrium- és kálium -foszfát, melynek ciklikus képviselője a nátrium- illetőleg a kálíum-metafoszfát, és a láncképzó típusok, melyek esetében nátrium- illetve a kálium-polifoszfát különböztethető meg. Különösen az utóbbinál számos megnevezés ismeretes: olvadó vagy glükofoszfát, Graham-féle só,
Kurrol és Maddrel-féle só. Itt az· összes· magasabb nátrium és kálium-foszfátot együttesen kondenzált foszfátnak nevezzük.
A technikailag fontos pentanátrium-trifoszfát, NasFáQw (náírium-tripolifoszláti. vízmentes vagy 6 vizet tartalmazó, kristályosodó, nem higroszkőpos, fehér vízben oldható só, melynek általános képlete a kővetkező: NaO-[P(O)(ONa)-O]n-N:a, ahol n~3. Száz gramm vízben szobahőmérsékleten körülbelül 17 g, 60 °Con körülbelül 20 g, 1ÖÖ °C-on körülbelül 32 g kristályvizmentes só oldódik; az oldat 100 °C kétórás melegítés után 8 %-ban. hidrolízissel keletkező ortofoszfátot és 15 % dífoszfátot tartalmaz. A pentanátrium-trifoszfát előállításánál a foszforsavat a szódaoldattal vagy nátronlúggal sztőchiometrikus arányban reakcióba hozzuk, és az oldatot porlasztással vízmentesítjük. A Graham-féle sóhoz és a. nátrium-difoszfathoz hasonlóan a pentanátrium-trifoszfát több oldhatatlan fémvegyületet tartalmaz (kálisókat stb.). A pentanátrium-trifoszfát KsFsÖjo (káliumtripolifoszfát) például 50 tömeg%-os oldatban kerül forgalomba (> 23 % p2:Os, 25 % K2Ö). A kálium-polifoszfátot a mosó- és tisztítószer iparban széles körben felhasználják. Továbbá nátríum-kálium-tripolifoszfátként is léteznek, melyeket éppen a találmány tárgykörében alkalmazunk. Ezek például akkor keletkeznek, ha a nátríum-trímetafoszfátot KOH-val hidrolizáljuk: (NaPösIs + 2 KOH -> NasKsPaOio + H2O.
Ezek a találmány szerint mint nátrium-tripolifoszíát, kálium-tripolífosztát vagy ezek keverékeként pontosan, adagolhatok; a nátríum-tdpöl.i.foszfát és a nátrium-kálium-tripolifoszfát keverékek, a kálium-tripolifoszfát és a nátrium-kálium-tripolifoszfát keverékek, vagy a nátrium-tripolifoszfát és a kálium-tripolifoszfát * * φ * * * <* * φφ..
*’»<·♦ φ és náttríum-kálium-tripolifoszfát keverékek szintén alkalmazhatók.
Szerves kötőanyagként a találmány szerinti mosó- és tisztítószerekbe különösen a poltkarboxilátok vagy a polikarbonsavak, polimer polikarboxilátok, poliaszparaginsavak, poliacetálok, adott esetben oxidált dextrinek, továbbá szer kötőanyagok (lásd lejjebb), mint például fosztottátok adagolhatok.
A használható szerves vázanyagok példái a nátriumsó formában. alkalmazható polikarbonsavak, mint például a citromsav, az adipinsav, a borostyánkősav, a glutársav, a borkősav, a cukorsavak, az aminokarbonsavak., a nitrilotriecetsav (NTA), hacsak az ilyen alkalmazások Ökológiai szempontból nem kifogásolhatók, valamint az ezekből készült keverékek. Előnyben részesítjük a polikarbonsavak sóit, mint például a citromsavat, az adipinsavat, a borostyánkősavat, a glutársavat, a borkősavat, a cukorsavakat és az ezekből készül keverékeket.
Savak is adagolhatok. Kötőanyag hatásuk mellett tipikusan savasito komponensként szerepelhetnek, ezzel nemcsak a mosdós tisztítószereknél az alacsonyabb és közepes pH tartományok beállítását biztosítják, hanem a szokásos komponensek pH-értékét is. Ehhez különösen a rendszerre és a környezetre ártalmatlan savak alkalmasak, mint például citromsav, ecetsav, bőrsav, almasav, tejsav, glikolsav, borostyánkősav, glutársav, adipinsav, glukonsav és ezek előnyös keverékei. De az ásványi savak is, mint például kénsav, vagy a lúgok, különösen ammőnium- vagy alkálihidroxíd, pH szabályozóként szolgálhatnak. Az ilyen szabályozók a találmány szerinti szerekben előnyösen nem több mint 20 tömeg%-ban? különösen 1,2-17 tőmeg%-ban fordulhatnak elő.
Kötőanyagként további polimer polikarfeoxilátok is megfelelnek, melyek például a poliakrilsavak vagy a polimetakrüsavak alkálifémsői, például melyek viszonylagos molekulatömege 50070000 g/mol
A polimer pohkarbosálátnál megadott moltomegek a találmány szellemében a mindenkori savforma tömegkőzép értékére vonatkoznak, melyet alapvetően gélpermeábOitásí kromatog·· rafiával (G.FC) határozunk meg UV detektálás mellett. A meghatározás belső poliakrilsav standarddal történik, mely strukturálisan a vizsgált polimerekkel rokonságban van, és közel megegyező molekulaiömegű, Ezek lehetővé teszik, hogy a polísztirolszulfonsav standardként szolgáljon. Rendszerint a polisztirolszulfonsavakkal szemben mért moltomegek magasabbak mint a leírásokban megadottak.
A megfeleld polimer elsődlegesen poliakrilát, melynek molekulatömege előnyösen 2000-20000 g/mol. Kitűnő oldékonysága miatt a csoportból a rövidlánoű poliakrilátok előnyösek, melyek mól tömege 2000-10000 g/mol, és különösen előnyösen 3000-5000 g/mol.
Megfelelnek továbbá azok a kopolimer pobkarboxilátok is, mélyek különösen az akrilsavak metakrilsavakkal és az akrilsavak vagy metakrilsavak maleinsawal alkotott vegyületek Különösen előnyös az akrilsav kopolimere maleinsavval, melyben az akrilsav 50-90 tömegé és a. maleinsav 50-10 tőmeg%. Viszonylagos molekulatömege a szabad savra nézve általában 2ÖÖO-70ÖOÖ g/mol, előnyösen 20000-50000 g/mol, és különösen előnyösen 30000-40000 g/mol> A (ko)polimer poökarboxílátek vagy porban, vagy vízben kialakított oldatban adagolhatok. A szerben a (ko)po”$ s:\ limer polikorboxilátok mennyisége 0,5-20 tömeg%, különösen l10 tömeg% lehet.
A vízoldékonyoág javításához a polimerek alklszulíonzavakát, mint például alliloxibenzoteulfonsavakat és metallilszulfonsavakat monomerként tartalmazhatnak.
Különösen előnyben részesített, ha a biológiailag lebomlo polimerek két eltérő monomer egységet tartalamaznak, például melyek az akríls&vak monomer sói, és a maleinsav, valamint a vinilalkehol, illetve a vinilolkehol származékai vagy az akrüsavak monomer sói, és a 2-aüdlallilszulfonsavat, valamint cixkorszármazékot tartalmaznák.
A. további előnyben részesített kopolimerek monomerként előnyösen akroleint és aknlsavat/akrilsavsékat, illetve akroleint és vinilacetátot tartalmaznak.
Hasonlóan a további előnyben részesített kötőanyagok közé tartoznak a polimer aminodikarbonsavak, ezek sói vagy az ezekből levezethető vegyületek. Különösen, előnyösek a poliaszparaginsavak, illetve ezek sói és származékai<
A további megfelelő kötőanyagok közé tartoznak a políacetálok, melyek a dialdehidek polikarbonsavakkal adott reakciójában keletkeznek, melyek 5-7 szénatomosak, és legalább 3 hídroxilcsoporttal rendelkeznek. Az előnyben részesített poliacetálok díaldehideket, mint például glioxát, glutáraldehid, tereftálaldehíd, valamint ezek keverékeit és polikarbonsavakat, mint például glükonsav és/vagy giukoheptonsav, tartalmaznak.
A további megfelelő szerves kötőanyagok a dextrinek, például a szénhidrátok oligomerjei, illetve polimerjei, melyek a keményítő részleges hidrolízisével álMthatők elő. Rendszerint a hidrolízist például savval vagy enzixnmol katalizálhatjuk. Előnyösen ** <
* >
Χ'«·« <
* ·> *·>
'♦.<S >
a hidrobris termék közepes moltömegű, 400-500000 g/mol. Ráadásul a poliszacharid dextrőz ekvivalense (DE) előnyős, mível DB értéke a Ö,5-4Ö, különösen a .2-30 tartományban, található, ahol a DE az a szükséges tömeg, mely a poliszacharidok redukáló hatásához szükséges, összevetve a dextrőzzal, melynél a DE *« 100, Használható mind maltodextrin, melynek DE tartománya 320 közé esik, mind szántott glükózszirup, melynek DE tartománya 20-37 közé esik, mind az úgynevezett sárgadextrin és fehérdextrin, magasabb moltömegnél 2000-30000 g/mol között.
Az ilyen dextrinek oxidált származékait olyan oxidációs anyagokkal alakíthatjuk ki, melyek a karbonsavas reakciónál az oxidáláshoz a .sz&eharidgyürú legalább egy atkoholcsoportfát biztosítják. Különösen előnyős szerves kötőanyagok a találmány szerinti szerekhez az oxidált keményítők, illetve ezek származékai, melyeket a szakirodalomban közzétettek (EP 472042, Wö 97/25309 és EP 755944 számú szabadalmi bejelentések).
Az amdíszukcinátok és a diszukcinátok más származékai is, előnyösen az etöéndiamindisznkeinát, megfelelő kötőanyagok. Ehhez előnyösen az etdéndismin-N^^diszukeinát (EDDS) nátrium- vagy magnéziumod formában fordul elé. Továbbá ebből a. szempontból előnyős a glieerindíszukcmát és a gllcerintriszukcinát is. Az adagolás megfelelő mennyisége a zeolittartalmúaknál és/vagy a szikkáttartalműaknál 3-15 tömegáú
A további alkalmazható szerves kötőanyagok közé tartoznak például az aeöezeit hídrorikarbensavak, illetve ezek sői, melyek adott esetben laktan formában fordulhatnak elő, és amelyek legalább 4 szénatomot és legalább egy hidrofofosoporéot valamint maximálisan két savesuportat tartalmaznak.
A kötőanyagok további 'képviselői a foszfonátok. alcsoportjába tartoznak. Ezek közül különösen előnyösek a hidroxialkáu-, illette az aminoalkánfoszfonátok. A hídroxialkíxnfoszfonátok közül az l-hidroxietán-l,l-difoszfonát (H.EDF) különös jelentőséggel bíró kötőanyag. Ezt előnyösen nátriumsó formában adagoljuk, ahol a dinátriumső semleges és a tetranátrxumsó lúgos (pH 9). Aminoalkánfoszfonátként előnyösek a következők: eüléndiamintetrametílénfoszfonát (EDTMP), dietiléntriaminpentametilénfoszfonát (DTPMP), valamint ezek magasabb rendű homológjai. Ezeket előnyösen semlegesen reagáló nátriumső formában adagoljuk, például az EDTMP hexanátriumsójaként, illetve a DTPMP hepta- és okta-nátriumsőjaként, A foszfonátok osztályából ezért kötőanyagként előnyösen HED'P-t alkalmazunk. Az aminoalkánfoszfonátok ehhez kiemelkedő nehézfém kötési képességgel rendelkeznek. Ennek megfelelően, különösen ha. a szer fehérítőt is tartalmaz, előnyösek lehetnek az aminoalkánfoszfonátok, különösen a DTPMP alkalmazása, vagy a megnevezett foszfonátok keverékeinek adagolása.
A fenti összes vegyület alkáliföldfémekkel komplexben, kialakíthatók és kötőanyagként így alkalmazhatók.
Adott esetben a találmány szerinti szerekben a kötőanyagok 90 tömeg%-ig lehetnek jelen. Előnyösen 75 tömeg%-ot tartalmaznak. A találmány szerinti mosószer kötőanyag tartalma. 5-50 tőmeg%. A találmány szerinti kemény felületek tisztítására szol-gálő ttsztítőszerekben, különösen a gépi mosogatógépeknél alkalmazottaknál, 5-88 t.ömeg% kötőanyag szerepelhet, amikor is az ilyen szerekben előnyösen vízben oldhatatlan kötőanyagot nem alkalmazunk. Egy előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti szer * * * S 4 χ M* különösen az edények gépi tisztításához 20-40 tömeg% vízben oldódó szerves kötőanyagot, így S tömeg% alkalícitrátot, 5-15 tömeg% alkalíkarbonátot és 20-40 tömeg% alkaüdiszilikátot tartalmaz.
Az oldószer, mely a folyékony-gélképző mosó- és tisztítószer összetételekben szerepelhet, például a következőkből származhat; tőbbértékű alkoholok csoportja, alkanolaminok vagy glikoléter, amennyiben a megadott koncentráció tartományban vízzel elegyíthető. Előnyösen az oldószert a következők közül választjuk ki: etanol, n- vagy i-propanol, butanolok, etilénglikolmetiléter, etüéngkkoletiléter, etílénghkolpropiléter, etiléngükolmonon-butíléter, dietílénglikol-metiléter, dietüénglikoletiléfer, propiíéngHkolmeril-, -etil- vagy -propü-éter, dipropilénghkoimonometil, vagy - etiléter, di-izopropilénglikolmonometíl·-, vagy -etiléter, metoxi-, etoxi- vagy butoxitrigtikGl, l-butometoxi-2-propanol, 3metü-3-metoxifeutanol, propilén-glikoi-t-butüéter valamint ezek elegy ei.
A találmány szerinti folyékony-gélképző mosó- és tisztítószerekben az oldószer mennyisége 0,1-20 tömeg%, előnyösen 15 tömeg%~nál kevesebb, és előnyösebben lö tömeg%~nál. kevesebb.
A találmány szerinti összetételek viszkozitásának beállítására tőményítőszert, illetve tőményitő rendszert adagolunk. Ezek a nagy molekulatömegő. anyagok, melyek duzzaaztőszerként ismertek, a folyadékot beszíyják és megduzzadnak, és igy végül sűrűn folyó valódi vagy kolloid oldatot alakítanak ki.
A megfelelő tőményítőszer szervetlen vagy szerves polimer vegyület. A. szervetlen, töményítőszerek közé számítanák például a polikieselsavak, agyagásványok, mint például zeolit,
444 »» ί kieselsavak és a bentonit. A szerves tőményítőszerek a természetes polimerekből vezethetők, le, melyek változtatható természetes polimerek és teljesen szintetikus polimerek lehetnek. Az ilyen természetes eredetű polimerek példái a következők: agar-agar, carrageen, tragantmézga. gumiarábikum, algínát, pektin, poliszok, guar-liszt, szentjánoskenyérfa magjának lisztje, keményítő, dextrin, zselatin és kazein. A változtatható természetes anyagok, melyek toményítöszerként alkalmazhatók, mindegyike a keményítők és a cellulózok módosított változatai. Például a következők ismertek: karboximetíicellulóz és más cellulózéterek, hidroxietü-· és -propilcellulóz, valamint a maglisztéter. A teljesen szintetikus tőményítőszerek példái a következők: polimerek, mint például poliakril- és poÜrnetakrii-vegyűletek, vinilpolimerek, polikarbonsavak, poliéterek, poliiminek, poliamidok és poliuretánok.
A kész összetételre vonatkoztatva a. tőményítőszerek mennyisége 5 tömegéé, előnyösen 0,05-2 tömeg%, és legelőnyösebben 0,1-1,5 tőmeg%.
A. találmány szerinti mosó- és tisztítószerek adott esetben további szokásos alkotórészeket tartalmazhatnak: kibocsátószereket, elektrolitokat és további segédanyagokat, mint például optikai derítőszereket, fakulásgátlo anyagokat, ezustkorrőzio gátlókat, színváltozást gátló anyagokat, habgátlókat, (törzsanyagokat, színanyagokat és/vagy illatanyagokat, valamint mikrobiáiis hatóanyagokat, és/vagy ÜV abszorbeáló anyagokat.
A találmány szerinti, textíliákat mosó szereket optikai derítőkkel , a díaminosztiibéndiszúlfonsav származékokkal, illetve ezek alkálifém sóival, egészítheyúk ki. Megfelel például a 4,4*bíszj2-ammo-4~morfolino·· l,3,5-triarinil-0-amino)sztiibén2,2’-diisis *>
* ·:·$· ·*·ί ? <· szulfonsav sója, vagy ezzel egyenértékű vegyület, ahol a mórfolínocsoport. helyett dietanolaminocsoport, metiiammocsoport, anüinocsoport vagy 2-etoxietílaminocsoport található. Á további derítők típusai lehetnek a szubsztituált difenilsztírílek, például a 4,4,-bisz(2-szulfosztiríl)-difenilekí a 4,4’-bisz(4-kÍőr-3-szulfoszti· ril)-difenilek, vagy a 4-(4~kÍőrsztíril)-4-(2-szulfosztíríl)-difenilek alkáli sói. Az előzőekben megnevezett optikai derítők elegye! is alkaltnazhalők.
A szűrkülésgátlő anyagok, feladata a textilrostokröl lemosott szennyeződés szabadon üsző fázisba juttatása és ott tartása. Ide vízben oldódó kolloidok, legtöbbször természetes eredetű anyagok feleinek meg, mint például keményítő, enyv, zselatin, keményítő, cellulóz éterkarbonsavainak vagy éterszutfonsavainak sói vagy a cellulóz vagy keményítő kénsavészterei. A vízben oldható savas csoportú. poliamldok alkalmazhatok erre a célra. Továbbá a fentiekben me^xevezett keményítőszármazékok, mint például az aldehidkeményitók, is felhasználhatók. Az előnyben részesített celtulőzéterek a következők: karboxlmetilcellulőz (Nasó), metíleellulóz, hidroxialkUcellulőz és kevert éterek, mint például metilhidroxietilcellulóz, metűhidromprcpüceliulőz, metilkarborimetlleellulöz és ezek keverékei, például a szerre vonatkoztatva 0,1-5 tőmeg%-ban.
Az ezüstkorrőziő védelem érdekében a találmány szerinti tisztítószerekben edény ezüstkorrőziő gátlókat alkalmazunk. Ezek a szakirodalomban jártas szakemberek számára ismertek, ilyen például a benzotriazol, a vas(lll)-kloríd. vagy a CoSCM A szakirodalomból ismert (EF 0 736 084 B1 számú szabadalmi bejelentés) az is, hogy az enzimek mangán-, titán.-, cirkónium-, hafnium-, vanádium-, kobalt-, vagy cériumsóival és/vagy kompX» *
hú >
«#» s leseivel együtt jól használhatók ezústkorróziő elleni védelemre, ahol a megnevezett fémek IL IH, IV, V vagy VI oxidációs fokúak. E yegyületekre példák a MnSCX VsOs, V2O4, VO2, TiOSCU, KstTiFs, KrsZrFee, CofNOsh, CofNChh, valamint ezek keverékei.
A “földet kiűző” hatóanyagok vagy a földet kitaszító anyagok főleg polimerek, melyek mosószerben való használatukkor a fehérnemű rostoknak szennytaszitó tulajdonságot kölcsönöznek, és/vagy a szokásos mosószer alkotórészek szennyleoldő képességét támogatják. Hasonló hatás érhető el tisztítószerekben alkalmazva. a szilárd felületeken is.
Különösen hatékonyak és már régóta ismertek a főidet kitaszító hatóanyagok, melyek a dikarbonsavak-, alkilénglikol- és polialkiléngli'kol-egységek kopoiiészterei. Ide például a polietiléntereftalát és a políetüéngllkol kopolimerei vagy kevert polimerei tartoznak [DT lő 1? 141, és DT 22 00 911 számú szabadalmi bejelentések]. A szakirodalomban [DT 22 53 063 számú szabadalmi bejelentés] savas szerek ismertek, melyek többek között dibázisos karbonsavak és alkilén- vagy cildoalkilénpoligiikolt tartalmaznak. Ismeretesek etiléntereftálát és políetilénoxídtereftalát polimerek, melyeket mosószerekben alkalmaznak [.DE 23 57 292, DE 33 24 258 és EP 0 253 567 számú szabadalmi bejelentések]. Az EP 066 944 számú szabadalmi bejelentés olyan szerre vonatkozik, mely etilénglikol, polietilénglikol, aromás dikarbonsavak és szulfonált aromás dikarbonsavak megbatározott arányú kopoliésztereít tartalmazza, A szakirodalomban [EP ö 185 427 számú szabadalmi bejelentés] ismertek végükön metilvagy etilesoportokat tartalmazó poliészterek etilén- és/vagy propilén-tereftalát- és polietílénoxid-tereftalát-egységekkel, és olyan mosószerek, melyek az ilyen földet kitaszító polimert •ν ·χ
ΦΦΦ
X
* «
I $» •>χί· tartalmazzák. Az EP Ο 241 984 számú szabadalmi bejelentés poliészterre vonatkozik, mely az oxietilén-csoportok és a tereftálsav egységek mellett szubsztituált etilénegységeket, valamint glicerinegységeket tartalmaz. A szakirodalomból (EP 0 241 985 számú szabadalmi bejelentés] ismert olyan poliészter mely az oxíetilén-csoportok és tereftálsav egységeken kívül l,2~propiléxv, 1,2~butüén~ és/vagy 3~metom~l,2-propiléncsGpartökat, valamint glicerinegységeket tartalmaz és láncai C1-C4 alkücsoporto'kkal záródnak. A szakirodalomból [EP 0 272033 számú szabadalmi bejelentés] ismeretesek 1-4 szénatomszámos alkil- vagy acilcsoporttal zárt poliészterek, melyek polipropiléntereftalát- és polioxietiléntereftalát egységeket tartalmaznak. Az EP 0 274 907 számú szabadalmi bejelentés szulfoetil végcsoporttal zárt tereftalát tartalmú főldkibocsátő poliésztert ismertet. Az EP 0 357 280 számú szabadalmi bejelentés szerint a fóldkibocsátő poliészterek előállíthatok telítetlen végcsoportos szulfonálással terefthalát··, aiküénglikol- és potí-C^-glikol egységek segítségével. A WO 95/32232 számú szabadalmi bejelentés aromás szennyleoldó képességű poliészterekre vonatkozik. A szakirodalomból [WO 97/31085 számú szabadalmi bejelentés) ismert, hogy a pamuthoz nincs olyan több funkciós csoportot tartalmazó polimer, mely főldkitasrttő hatású, lenne. Az első egység például kationos lehet a pamut felületi adszorpciójához, elektrosztatikus kölcsönhatásban, és a második egység híclrofőb területet alakít ki, mely a hatóanyag megmaradását biztosítja a pamut-víz határfelületen.
A találmány szerinti, textíliákhoz használható szerekhez színfakulást gátló anyagok adagolhatok, elösorban a kővetkezők:
polivinilpirrolidon, polivmilimídazol, polimer N-oxidok, mint például poiy-(vmüpiridin~N-oxid) és a vinü-pirrolidon vinilimidazollal alkotott kopolimere.
A gépi tisztítóeljárásokhoz előnyös lehet a habgátlók alkalmazása. Habzásgátlóként alkalmasak például a természetes vagy szintetikus eredetű szappanok, melyek nagy része 13-24 szénatomszámos zsírsavak. A megfelelő nem tenzidszerü habzásgátlők például a szerves poliszi'loxánok és ezek mikrofinom, adott esetben szilánozott kieselsavaíval adott, keverékei, valamint paraffin, viasz, mikrokristályos viasz és ezek keverékei, szilánozott. .tóeselsavakkaí vagy biszteariletüéndiamiddaL A különböző habzásgátlők keverékei is előnyösen alkalmazhatók, mint például a. szilikonokból, paraffinokból vagy viaszokból állók. Előnyösen a habzásgátlők, különösen a szilikon és/vagy paraffin tartalmú habzásgátlők, szemcsések, vízben oldódnak, illetőleg a hordozóanyaghoz kötötten diszponálhatok. Különösen a paraffinokból és biszteriletiléndíamidekböi álló keverékek előnyösek.
A találmány szerinti kemény felületek tisztítására alkalmas ti sztílőszerek dörzshatásü alkotórészeket tartalmazhatnak, különösen a következő csoportokból: kvarcliszt, faliszt, müanyagliszt, kréta és mikroűveggömbök, valamint ezek keverékei. A dörzsanyagok a találmány szerinti tisztítószerekben előnyösen nem több mint 20 tömeg%-ban, előnyösebben 5-15 tömeg%-ban fordulnak elő,
A szín- és illatanyagokat a mosó- és tisztítószerekbe a termék esztétikai hatásának javítására adagolunk, és· a felhasználó számára a termék tipikus és ősszetévesztheteden látványának, valamint érzeteiének biztosítására. Parfümolajként, illetőleg illatΦ > φ. Φ» <5 Φ Φ Φ X «
Φ X Φ· V *· « * <
φ X* X* * X X Φ φ Χφφφ * ♦ * ·* »«> X * ΦΦ ** * anyagként szaganyag vegyületek, mint például észter, éter, aldehid, keton és szénhidrogén típusú szintetikus termékek, alkalmazhatók. Az észter típusú illatanyag vegyuletek például a következők: henzilaeetát, a fenoxi-etiiizobutirát, p-terc-butil-ciklohexilacetát, linalílacetát, dimetii-benzd-karbanilacetát, fenil-etilacetát, linalil-benzoát, benzilformíát, etil-metil-fenilgücinát, alül-ciklohexilpropionát, sztiraliilpropionát és benzilszalicilát. Az éterekhez számítanak például a. benzü-etiléier és az Ambroxan, az aldehidekhez számítanak például a 8-18 C-atomos lineáris alkanálok, eitrál, cítronellál, citronelül-oxi-acetaldehid, ciklámenaldehíd, Li.li.al és Bourgeonal, a ketonok közé tartoznak például a Jonone, a- izom éti Ilonon és metil-cedrilketon, az alkoholok közé például az anetol, citroneHol, eugenol, geraníol, línalool, fenil-etilalkohol és a terpíneol, a szénhidrogének közé főleg a. törpének mint például a limonén és Pirién. tartoznak. Mégis előnyben részesítjük, a. különböző Íllatanyagok keverékeinek használatát, melyek közösen vonzó, egyéni illatot biztosítanak. Az ilyen parfümolajokat természetes illatanyag keverékekből is megkaphatjuk, mint például növényi forrásokból, így fenyő-, cítrus-, jázmin-, Patchouly-, rózsa- vagy Ylang-Ylang-olajbok Hasonlóképpen alkalmasak a muskotályzsája-olaj, kamillaolaj, szekfűolaj, .mézfüolaj, mentaolaj, fahéjlevél-olaj, hársvirág-olaj, horőkaolaj, vetive-olaj, oiibanum-olaj, galbanum-olaj és labdanum-olaj, valamint naraes-olaj, neroliol, narancshéj olaj és szantálfa-olaj. Általában a találmány szerinti fehérítő és színanyagok a teljes kiszerelés főbb mint 0,01 tömeg%-át, míg az íllatanyagok legfeljebb 2 tőm.eg%-át alkothatják.
Az íllatanyag közvetlenül beépíthető a találmány szerinti szerbe, de az is előnyös lehet, ha az illatanyagot a hordozóra φ * φ * φφφ * φ φ* «««« φ φ hordjuk fel, mellyel a parfümök felületi tapadását a fehérneműn megerősítjük és ezzel a textíliából hosszabb illat-felszabadulást érünk eh Az ilyen hordozóanyagok közé például a ciklodextrin választható, ahol a oiklodextrin-parfüm komplex pótlólagosan még további segédanyagokkal rétegezhető. Egy további illatanyag hordozó a későbbiekben leírt zeolit X, melynek alkalmazása a tenzid.es keverékekkel és az illatanyagokkal. egyaránt lehetséges.
Az előnyben részesített színanyagok, azok kiválasztása a szakirodalomban jártas szakemberek számára minden nehézség nélkül megtehető, melyek közül előnyős azok kiválasztása, melyek tárolási stabilitása és érzékenysége a szokásos alkotórészekhez képest magas, és a texilrostokat érő fénnyel, valamint behatásokkal szemben ellenállóak, miközben nem színező hatásúak.
A mosó- és tisztítószerek a mikroorganizmusok ellen antirnikrobíális hatóanyagokat tartalmazhatnak. Itt a hatásmechanizmus és spektruma alapján megkülönböztetünk bakteriosztatikus és baktericid anyagokat, fungtsztatíkumokat és fungíeídekét és így tovább, E csoport fontos anyagai például a következők: benzalkoniumkiorid, alkilarilszulfonát, halogénezett fenol és fenolmerkuriacetát. Az antímikrobiális hatás és az antimikrobiális hatóanyagok jelentése a találmánybon a szakirodalomban jártas szakemberek számára nyilvánvaló [Wallhauher: Praxis dér Sterilisation, Desínfektion -Xonservierung: Keimidentifizierung Beíríehohygfene (5, 'kiadás) Stuttgart; New York ; Thíeme, (1995)), melyben leírt összes antlmikrobiális hatású vegyületet alkalmazása a találmányban elképzelhető. A megfelelő antimikrobiális hatóanyagot előnyősén a kővetkező csoportokból választjuk ki: alkoholok, aminek, aldehidek, antlmikrobiális savak,
X Φ Φ Φ Φ Α φ Φ *
ΦΦΦ Φ φφ κ Φ XX illetőleg ezek sói, karbonsavészterek, savamidok, fenolok, fenolszármazékok, difenilek, difenilalkánok, karbamidszármazékok, oxigén- és nitrogén-acetálo'k, valamint forrniátok, benzamidin, ízotiazolin, ftálimidazármazékok, piridinszármazékok, antimikrobiálís felületaktív vegyüíetek, guanidin, antimikrobális amfoter vegyüíetek, kínolinok, l,2~dibróm-2,4~dicíanohután, jőd-2-propil butil-karbamát, jód, jodoforok, peroxo-vegyületek, halogénvegyületek, valamint az előzőek keveréket
Az anttoikrobíáhs hatóanyagokat a kővetkezők: közül választhatjuk ki: etanol, n-propanol, i-propanol, 1,3-butándiol, fenoxíetanol, 1,2-propilénglikol, glicerin, undecilénsav, benzoesav, szalicíisav, dihidroecetsav, o-fenilfenol, N-metilmorfolinacetonítril (Μ.ΜΆ), 2 -benzil-á-klőrfenol, 2,2’-metilén-bisz-(6-bröm4-klórfenoi), 4,4’~diklór~2'‘~hidroxidifeniléter (Dichlosan), 2,4,4’tríklőr-2'-hidroxidifeniléter (Trichlosan), klórhexidin, N-(4klórfenil)-N-(3,4-díklórfenil)-karbamid, 1,10-dekán-diildi-1 piridniil~4-ilidén)-bisz-(l~oktánaniin..)“dihidrokloríd, Ν,Ν’~Μ8ζ-(4klórfenil)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradekándiimid.amid, glakop.rotaml.nok, antimikrobiális felületaktív kvaterner vegyüíetek, guanidinek, beleértve a bt· és poliguanidineket, mint például l,6-bisz-(2-etílbexil-biguanido-hexán)-dihidroklorid, 1,6di-(Ν i ,Ni'-fenildÍguanido-Ns,N5 j-bexán-tetrahidroklorid, 1,6-di~ {Ni,Ki’“fenil-'Ni,Ni'“m.etíldiguanidONs,Ns:bhexán“dihidrokíoríd, l ,6-di-(N ι,Ν i ’-o-klőrfenildiguanido-Ns,Ns! )-hexán-dihodroklorid, l,6-di-(Ni,Nf-2,6~díkÍórfetűldiguanido-Ns,Ns‘)hexán-dihidroklorid, .l,ödi-fNi,Nr~béia~{p™metöxifenü)digumúdo~R%bV14iexán-dihíd~ roklorid, l,6-di-(Ni,Ni'-alfa-metil-bét.a-fenildiguanido-Ns,Ns‘)hexán-dihídroklorid, 1,6-dí-fNi ,N i’-p-nitrofenildiguanidoNspNs’lhexán-dihídroklorid, omega:omega-dí-(Ni,Nf-fenildiguanidO Ν s, Ν s!) -di-n -propíléter-dihidroklorid, omegaromegá -Di(NnNi'-p-klőrfenildiguanido-Ns^sl-di-n-propiléter-tetrahidroklorid5 í,6-di“(NnNf-2,4-diklőrfenildíguanido~N5,N5’)hexán-tetrahidroklorid. 1 jó-di-fNnNr-p-metilfeníldiguanido-NsjNs’lhexán-dihidroklorid, .1,ö~di~(N i ,N i*-2,4,5-tóklőrfenildiguanido-Ns,Ns,)hexántetrahidroklorid, l,6-di-(Ni,Nf-alfa-(p~klörfenil)etildíguanidO Ns,Ns![hexán-dihídroklorid, ómega:omega-di-(Ni,Nif--p-klorfenildi·· guanído-NsjNsjm-xilén-dihidrokloxid, l,12~di-(NnNf-p-klórfenildígu&nído-Ns.Ns) dodekán-dihidroklorid, .Í,10~di-(Ni,Nf-fenildiguan.ído-Ns,Nsl-dekán~tetrahidroklorid, l?12~-d.i-(Ni?Nr~fenildiguanido- Ns,Ns !)-dodekán-t.etrahidroklorid, 1,6-di-(Ni ,Ni'-oklór fend diguanido- Ν », N s') -hexán-dihídroklorid, 1,6--dl - (Ν ι, N t ’ - o klór fenildiguanido-Ns, Ns’)-hexán-tetrahidroklorid, etilén-bisz-(.ltolil-biguanid), etílén~bisz-(p~tolil-biguanid), etilén-bisz~(3,5-dime~ tüfenühiguanid), etilén- bisz-(p-terc-amilfenilbiguanid), etilénbísz~(nonilfemlbiguanid), etilén-bisz-(fenilbiguanid), etilén-bisz~ (N~butilfenilbíguanid), etilén-bisz(2,5-dieto5dfenilbiguanid), etilénbisz(2,4-dimetilfenübíguanid), etilén -bisz(o-difenilbiguanid), étilén~bisz(kevert amil naftUbiguanid), N~butil--etilén-bissz~ (fenilbigaanid), trixnetilén-bisz(o-tolilbiguanid), N-butil-trimetilbisz~(fenilbiguanid) és ezek mefelelő sói, mint például acélát, glnkonát, hidroklorid, hidrobromid, extrát, biszulfifc, fluorid, polimaleát, N-kokozalkilszarkozinát, foszfit, hipofoszfít, perűuorooktanoát, ssdlikát, szórhat, szalícilát, maleát, tartrát, fumarát, etiléndiamin tetraacetát, íminodiaeetát, einnamát, tiocianát, arglnát, piromellitát, tetrakarboxíbudrát, benzoát, glutarát, monofiuorfoszfái, perflorpropionát, valamint kívánt keverékei. A további megfelelő anyagok a következők, lehetnek; halogénezett xilol- és krezolszármazékok, mint. például pfc* g fc fc * fcfc fcfcfc* klőrmetakrezol vagy p-klór-metaxilol, valamint természetes növényi eredetű antimikrobiális hatóanyagok (például fűszerekből vagy lágy száriakból), állati, valamint mikrobíális eredetűek. Előnyősén az antimikrobiálisan ható felületaktív kvaterner vegyületek természetes növényi eredetű aniitnikrobiális és/vagy természetes állati eredetű antimikrobiális anyagok, ahol különösen előnyben részesítjük azokat a növényi eredetű antimikrobiális hatóanyagokat, melyek a kővetkező csoportba tartoznak: koffein, teobromin és teofillín, valamint éterezett olajok, mint. például eugenol, tünol és geraníol, és/vagy legalább egy természetes állati eredetű antimikrobiális hatóanyagot tartalmaznak, mely a következő csoportba tartozik: tejből nyert fehérje, lízozim és lakfcoperoxidáz, és/vagy legalább egy antimikrobiálisan ható felületaktív kvaterner vegyületet tartalmaznak, mint például ammóniusi-, szulfőmum-, foszfőnium-, jodónium- vagy arzóniimicsoportal. rendelkeznek, peroxovegyületek és klórvegyületek. A mikrobíális eredetű, úgynevezett bakteriocin vegyületek szintén alkalmazhatók.
Antimikrobiális hatóanyagként megfelelő kvaterner ammóníumvegyulete-k általános képlete a kővetkező (ΚΧ)(Η5){Κ3)(Κ4)Ν*Χ··, ahol HMM jelentése azonos vagy eltérő 1-22 szénatomszámos aikilcsoport, 7-28 szénatomszámos aralkílcsoport vagy heterocikükus csoport, ahol két vagy aromás kötés, mint például pirídin esetében akár három csoport a heterociklus nitrogénjével kapcsolódik, a. píridinium- vagy- imidazolvegyűleknél, és X jelentése halogenidiönok, szulfáüork>k> hidroxiioru.sk vagy hasonló anionok. Az optimális antimikrobiális hatást előnyösen 8-18, különösen 12-16 szénatom közül legalább egy csoporttal biztosítjuk.
* >
*·¥ X .* *·*
A QAV tercier aminná alakítható alkilezöszerrel, mint például metilklorid, benzilklorid, dimetilszalfát, dodeoilbromid, de etílénoxiddal is előállítható. A tercier aminek alkilezése hosszabb alkílcsoporttal és két metilcaoporttal különösen könnyen elvégezhető, a tercier aminek kvatemerizálása pedig hosszabb csoportokkal és metilcsoporttal, metilkiöriddal, enyhe reakciókörülmények között is elvégezhető. Aminek, melyek három bosszú alkilcsoporttal vagy hidroxi-szübsztituált alkil csoporttal rendelkeznek, kevésbé reaktívak, és előnyösen dimetilszulfáttal kvaternerizálhatők.
A megfelelő QAV-ok például a kővetkezők: benzalkőniumklorid (N-aM.-N,N-dimetil~benril-ammőniumklorid, CAS No, 8001 -54-5), Benzalkon B (m,p-diklőrbenril-dimetil-C 12-alkilammóniumklorid, CAS No. 88390-73-6), Benzoxoniumklorid (benzil~dodecil-bisz~<2~hidroxietil)-ammönium-kiorid); Cetrímoninmbromid (N-hexadecil-N,N-trimetil»ammóniumhromid, CAS No. 57-09-0), Benzeteniumklorid (N,N-dimetil-N-(2-(2-(p-(l, 1,3.3tetrametilbutil)-fenoxi]eto^á]etíl)-henzílammőmtmiklorid, CAS No, 121-54--0), dialkildimetilammőnium-klorid, mint például di-ndeeil-dimetil-ammőníumklorid (CAS No, 7173-51-5-5), didecil-dimeúlammóníumbromid (CAS No. 2390-68-3), dioktd-dimetilammónium'klorid, 1-cetilpiridiniumklorid (CAS No, .123-03-5) és Thíazoliniodid (CAS No, 15764-48-1) valamint ezek keverékei. Különösen előnyben részesítjük azok a. QAV-okat, melyeknél a benzaikóniumklorid 8-18 szénatomszámos alkilesoportokkal rendelkeznek, így különösen előnyös a 12-14 szénatomszámos alkilbenzil-dimetil-ammőniumklorid.
A henzálkóníumhalogenideket és/vagy a szubsztituált benzalkőniumhalogenideket a kereskedelemben beszerezhetjük, *· χ * * * φ·* φ φ φ * φ φ * * φ > φ «·φ ·*♦* * φ * X ΦΦ X X # φ χ χ Φ φ, χ Φφ φχ φ ilyenek például a. kővetkezők: Barquat® ex Lonza, Marqnat® ex Mason, Variquató ex Witco/ Sherex és Hyamíne^ ex Lonza, valamint Bardac® ex Lonza. További kereskedelemben kapható antimikrobiális hatóanyagok az N-(3-klórallil)-hexaminiumkloríd, mint például a Dowicíde® és a DowidF ex Dow, a benzetőníumklorid, mint például a Hvamme® 1622 ex Rohm Haas, a metilbenzetóniumklorid, mint például a Hyamme® 1ÖX ex Rohm Haas, a cetilpíridiniumklorid, mint például a Cepacolchlorid ex Merrell Labs.
Az antimikrobiális hatóanyagokat 0,0001-1 tömeg%~ban, előnyösen 0,001-0,8 tomeg%-ban, előnyösebben 0,005-0,3 tómeg%-ban., és legelőnyösebben.0,01-0,2 tömeg%-ban adagoljuk.
A szer UV abszorbeálókat tartalmazhat, melyek a kezelt textíliákat bevonják, és a rostok és az egyéb alkotórészek fénnyel szembeni tartósságát, vagy fénnyel szembeni tűrését javítják. Az UV-t abszorbeáló szerves anyagok (fényvédő szűrők) alatt azokat értjük, melyek az ultraibolya sugárzást abszorbeálják és a felvett energiát hosszabb hullámhosszon kibocsátják, például meleget, hőt sugároznak.
Az ilyen kívánt tulajdonságokkal rendelkező vegyüietek például a benzofenonok sugárzással dezaktiváló hatású vegyületei és származékai, melyek 2- és/vagy 4-helyen szubsztituáltak. Továbbá a szubszdtuált benzotriazolok ís alkalmazhatók., melyek 3-as helyzetben fenilszubsztituált akrilátok, (fahéjsavszármazékok. adott esetben a. 2-es helyzetben cianocsoportokkal), valamint a. szakellátók, szerves Ni-komplexek, valamint természetes anyagok, mint például um'beliiferon. és testsaját urokánsavák. Különös jelentőséggel bírnak a bifenil··, és mindenek előtt a. sztilbénszármazékok, melyeket a szakirodalomban leírtak {EP
Φ* ΧΦΦ*
Ϊ* * φ
0728749 számú szabadalmi bejelentés] és a kereskedelemben Tmosorb® FD vagy Tmosorb® FR ex Ciha márkanéven megvásárolhatók. ÜV-B-abszorbeálő anyagként a következőket nevezzük meg: 3-benriüdénkámfor, illetve 3-feenzilidénnörkámför és ezek származékai., például 3-{4~metílhenzüidén)kám.for [EP 0693471. B1 számú szabadalmi bejelentés], 4-aminobenzoesavszármazékok, előnyösen 4(dimetíla.mino)benzoesav-2-etílhexilészter, 4-(dimetxlamino)benzoesav-2 -oktilészter és 4·· (dimetiiamino) benzoesav-amilészter, a fahéj sav észterei, előnyösen a 4metoxifaliéjsav-2-etilhexiiészter, 4-metoxifabéjsavpropilészter, 4metoxifahéjsavamílészter, 2-cxa5io-3,3-fenílfahéjsav~2-etilhexil~ észter (Octoerylene), a szalicilsavak észterei, előnyösen a szalicilsav-2-etílltexüészter, szalicilsav-4-izopropílbenzílészter, szalicilsavhomomentilészter, a benzofenonok származékai előnyösen a 2 ·•hidroxi-4~metoxibenzofenon, 2~hidroxi4-metioxi~4 -metilbenzofenon, 2,2 ’-dihidroxi^-metozibenzofenon, a benzmalonsavak észterei, előnyösen a 4-metoxibenzmal.onsav-di-2~etilhe3dl.észter, triazinszármazékok, mint például a 2,4?6'4.riauílÍ2io-{p2-karbo-2?etíl-r-bexiloxi)-l,3,5-triazin és oktil-triazon, ahogy azt a szakirodalomban leírták [EP 0818450 számú szabadalmi bejelentés] vagy diokhl-butamído-triazon (Uvasorb® HEB), propán- 1,3-dion, mint például az l.--(4-'terc~butílfenil)-3(4ímetoxífeml)p2'opán' l53-dlon, ketotriciklo(5.2.1.Ö)dekán-származékok, mint például a szakirodalomban leirt vegyületek (EP 0694521 B1 számit szabadalmi bejelentés]. Továbbá megfelelnek: 2-fen.ilbenzimid~ azol-5-szulfonsav és ezek alkáli-, alkáliföldfém-, ammőnium-, alküammónium-, alkanolammőnium- és glukammóníumsói, a benzofenonok szulfonsav származékai, előnyösen a 2-hidroxi-4metoxibenzofenon-5-szulfonsav és sói, a 3-benzilidénkámíorok ·¥ (. <. <i- * szulfonsavszármazékaí, mint például 4-(2-oxo~3-bornilidénme“ til)benzol-szulfonsav és 2-metil-5-(2-oxo-3-bornílÍdén)s».dfon.sav és ezek sói.
A tipikus W-Á szűrők közé tartoznak a benzoilraetán származékok, mint például l-(4-terc-butilfenil)“3-(4-metoxífenil)propán-1,3-dion, 4- tere-butil-4*-metmtídibenzoílmetán (Parsol 1789), 1 ~fenil-3-(4 ~izopropüfenil)-propán- 1,3-dion, valamint Enamin-vegyületek, mint például azok, melyeket a szakirodalomban leírtak (DE 19712033 Al számú szabadalmi bejelentés) (BASF). Az UV-A és az ÜV'B szűrők természetesen keverten is adagolhatok. A megnevezett oldédé anyagokon kívül erre a célra a fényvédő pigmenteket említjük, melyek finoman diszergált, előnyösen nanométeres tartományba eloszlatott megfelelő fémoxidok, különösen cink-oxid és titáa-oxid, és amelyek lehetnek vas, cirkónium, szilícium, mangán, alumínium és cérium oxidok és ezek keverékei. Sóként szilikátok (talkum), bárium-szulfát vagy cmk-sztearát alkalmazható. Az oxidok és a sók pigment formában már a bőrápoló és bőrvédő emulziókban és szépítőszerekben alkalmazhatók. A részecskék közepes átmérője kevesebb mint XÖÜ nm, előnyösen 5-50 nm és még előnyösebben 15-30 nm között található. Lehetnek gömb formában, de azok a részecskék is adagolhatok, melyek ellipszoid alakúak, vagy egyéb gőbszerú formában vannak. A pigmentek felületkezeltek is lehetnek, azaz hidrofil vagy hidroföb formává alakítottam A tipikus példák a burkolt titándioxid, mint például a Titándioxid T 805 (Degussa) vagy az Eusolex^ T2Ö0Ö (Merck; hidroföb burokként előnyösen szilikon, és előnyösebben trialkomokhlszilánok vagy Sünethicone, jöhet szóba. Előnyösen mikrokristályos cink-oxidot alkalmazunk. A
Μ, ¥ » > x ** további UV-védőanyagokról a szakirodalomban áttekintést kaphatunk (Finkel: SÖFW-Joumak 122, 543(1996)].
Az ÖV-abszorfeeálók rendszerint 0,01-5 tömeg%-ban, előnyösen 0,03-1 tőmeg%~ban. adagolhatok.
A mosó- és tisztítószerek szokásos alkotórészei közé tartoznak az általánosan használt mosó- és tisztító hatású enzimek.
Egyidejűleg a találmány megvalósítási formáiban a mosöés tisztítószer a találmány szerinti fehérjén, fehérje fragmensen» fúziós fehérjén vagy származékon .kívül további ismert enzimeket is tartalmazhat. Ide tartoznak például a további proteázok, amilázok, celhdázok, hemiceilulázük, mint például a fö-glukanáz, OMdoreduktázok, mint például a lakkozok, kulin ózok, és/vagy tipázok, de az észterázok, és további enzimek is szóba kerülhetnek, melyek a technika. jelenlegi állása alapján ismertek.
Áz enzimek, mint például proteázok, amilázok vagy cellulázok évtizedek óta a mosó- és tisztítószerekben alkalmazott komponensek. Mindenkori alkalmazásukat mosási teljesítményük, illetve a szóban forgó anyagok tisztítását biztosító hatékonyságuk szabja meg, igy fehérbe tartalmú szennyeződések lebontásához proteázokat, keményítő tartalmú szennyeződések eltávolításához amilázokat és zsírtartalmú szennyeződésekhez pedig lipázokat alkalmazunk. A mosószerekben a. eelhtiázokat különösen akkor alkalmazzuk, ha azok másodlagos hatása a mosószerekben előnyös, valamint jelenlétük a textíliák rostjaira kedvező. A mindenkori hidrolízis termékeket a megmaradt mosó- és tisztítószer alkotók megtámadják, feloldják, emulgeálják vagy szuszpendálják, vagy nagyobb oldékonyságuk miatt a mosőfürdövel kimossák, tehát az enzimek, a többi alkotórésszel szíuorgizmnaba. lépnek.
>·* « κ
A <· *
ΆΆ «·*«· $· A »<i· **
A másodlagos mosási teljesítmény cellultoal ősszehasonlítható mértékű hozzál árulása miatt, a protetok a természetes rostokra, különösen a gyapjúra és a selyemre képesek, hatásukat kifejteni. Az ilyen szövetek felszínén kifejtett hatásukkal az anyagon fényesítő hatást fejtenek ki, és ezzel a nemezeié hatás ellen hatnak.
A további enzimek a szóban forgó tisztítószer teljesítményét tovább emelik specifikus emdmatikus képességeikkel· Ide tartoznak például a hemicellulázok, mint például a S-glukanázok [WO 99/06515 és WO 99/06516 számú szabadalmi bejelentés) az oxidoreduktázok mint például a Laccasen [WO 00/39306 számú szabadalmi bejelentés] vagy a pektmoldő enzimek [WO 00/421.46 számú szabadalmi bejelentés], amelyek speciális anyagként adagolhatok.
A találmány szerinti szerekben történő felhasználáshoz első vonalban a mikroorganizmusokból kivont enzimek jönnek szóba, melyek, például a baktériumokból vagy gombákból nyerhetők. Ezek az alkotók ismert módon fermentációval a megfelelő mikroorganizmusból kinyerhetők, ahogy azt például a szakirodalomban közzétettek. [DE 1940488 és DB 2121397 számú, szabadalmi bejelentés, 3623957 számú Amerikai Egyesült Államok-heK szabadalmi bejelentés és 4264733 számú. Amerikai Egyesült Államok-belx szabadalmi bejelentés, EP 006638, valamint WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentés].
A találmány szerinti fehérjét, különösen tárolás során, stahilizálókkal, például denaturálással, széteséssel vagy inaktiválással szemben, valamilyen fizikai behatással, oxidációval vagy proteolitíkus hasítással megvédjük
A stabilizátorok egyik csoportjába a reverzibilis proteáz inhibitorok tartoznak, mint például a benzamidin-hidrokloríd és a leupeptiri, melyeket erre a célra alakítottak ki. Gyakran a kővetkezőket használják: borax, bérsavak, boronsavak, ezek sói és észterei., mindenek előtt aromás csoportokkal alkotott származékaik, mint például orto-szubsztituált [WÖ 95/12655 számú szabadalmi bejelentési, meta-szubsztttuált JWO 92/1.9707 számú szabadalmi bejelentés], para-szubsztituált [5972873 számú Amerikai Egyesült. Államok-beii szabadalmi bejelentés] ferdlboronsavak, előnyösek ezek sói vagy észterei is, A WO 98/13460 számú szabadalmi bejelentésben és az EP 583534 számú szabadalmi bejelentésben peptidaldehidet tettek kézzé, azaz C~terminálisán redukált oligopeptidet, és ezek 2 - 50 monomeres változatait a mosó- és tisztítószer proteázok reverzibilis gátlásához. A reverzibilis proteáz inhibitorok közé tartoznak az ovomukoid néven, ismert anyagok [WO 93/00418 számú szabadalmi bejelentés]. Például a WO 00/01826 számú szabadalmi bejelentésben specifikus, reverzibilis peptidinhibitorokat tettek közzé, melyek a proteázokat tartalmazó szerekben a sznhtílizin proteázt gátoljá, és ez megfelel a WÖ 00/Öl831 számú szabadalmi bejelentésben közzétett proteázből és inlsibitorböl álló iüzió s fehérj ének.
A további közismert enzímstabilizátorok a következők: aminoalkoholok, mint például mono-, di-, trieianul· és propanolarnín és ezek keverékei, alifás karbonsavak tizenkét szénatomig, mint például, ahogy az a EP 378261 és WÖ 97/05227 számú szabadalmi bejelentésekből ismert, borostyánkŐsav, más dikarbonsavak és a megnevezett savak sói, A DE 19650S37 számú szabadalmi bejelentés erre a célra végcsoportjában zárt «·*.
ΐ « X * *·χ * _* <s a w.
roh-savanudalkoxílátokat tett közzé. Az alkotóelemként alkalmazott bizonyos szerves savakat a szakirodalomban közzétették [WO 97/18287 számú szabadalmi bejelentés), melyet az adagolt enzim stabilizálására, alkalmaztak.
Az alacsonyabb rendű alifás alkoholok, valamint mindenek előtt a. poMolok, mint például a glicerin; etilénglikol, ptopüénglikol vagy szerbit, gyakran alkalmazott enzim-stabőszátorok. Éppen igy kalciumsókat is használhatunk, mint például a kalciumacetát, vagy az EF 928865 számú szabadalmi bejelentésben leirt kalcium-formiát, és magnérinmaökap különbőzé polimereket (EF 378262 számú szabadalmi bejelentés).
A szakirodalomban közzétették a. poliamid-oligomereket (WO 99143780 számú szalmdalnri bejelentés) vagy polimer vegyületek. mint például lignint (WO 97/00932 számú szabadalmi bejelentés), vfeoldékony vinil-kopohmereket (EF 828762 számú szabadalmi bejelentés) vagy a kővetkezőket [EP 702712 számú szabadalmi bejelentés): cellulóz-éter, akrü-polimer és poliamid, melyek enzim készítmények az- enzimek előállításához a fizikai hatások vagy a pH-érték ingadozásai ellen stabilizátorként szolgálnak. A poliamin-N-omd tartalmú polimer (EF 587550 és EF 581761 számú szabadalmi hejdentóaek) egyszerre enrimstahiüzálókéní es színátvivő képesség gátlójaként használható. A további polimer stabüizátorokat a szakirodalomban közzétették [WO 97/05227 számú szabadalmi bejelentés) más alkotórészek mellett, kiegészítve lineáris, Cs-Cjs poknxilfcaiköénekkek Az alkilpoliglükoridnfc, ahogy azt a WO 97/43377 és WO 98/45396 számú szabadalmi bejelentésekben közzétették, a. találmány szerinti szerek enzimatikus komponenseit stabilizálják, és emel teljesítményüket fokozzák. A hálózatos N-tartalmú vegyületek (WO
X * X * # **·* * * * «*
93/ 17764 számú szabadalmi bejelentés] kettős funkciót töltenek be, igy földet-kiúző szemek és enzimstabilizálom ak tekintik. A hidrofób nem ionos polimerek más stabilizátorokkal együtt a WO 97/32958 számú szabadalmi bejelentés szerint a cellulózokat stabilizálják, így ilyen és hasonló szerek a találmány szerinti szer enziméhez is szerepelhetnek.
A redukáloszerek és az antiomdánsok, ahogy azt a szakirodalomban többek között leírták (EP 780466 szánni szabadalmi bejelentés], az enzimeket az oxidatív szétesés ellen stabilizálják. A kéntartalmú redukáloszerek a szakirodalomból ismertek [EP 0080748 és EP 0080223 számú szabadalmi bejelentések). További példák a nátrium-sznlfit (EP 533239 számú szabadalmi bejelentés) és a redukáló cukrok (EP 656058 számú-.szabadalmi bejelentés).
A stabilízátorok sokféle kombinációja alkalmazható, például poliolokhol, bórsavból és/vagy boraxból álló kombinációk [WO 96/31589 számú szabadalmi bejelentés], bórsavból vagy bóráiból, redukáló sókból és borostyánkősavből vagy más díkarbon savakból álló kombinációk (EP 126505 számú szabadalmi bejelentés) vagy bórsavból más borátokból poliolokkal vagy poliamin vegyületekkel és redukáló sókkal adott kombinációk [EP 030223 számú szabadalmi bejelentés). A pepiid-aldehid stabihzátorok hatása a W'ö 98/13462 számú szabadalmi bejelentés szerint bórsavval kombinációban és/vagy bórsavszármazékokkal és poliolokkal kombinációban fokozható és kalciumionok hozzáadásával ez tovább fokozható [WO 93/13459 számú szabadalmi bejelentés).
A stabilizált enzimaktivitásű szerek a találmány előnyben részesített, megvalósítási formájába tartósnak. Különösen előnyős
X V <· *
>
•íí *
W *#
X « $ < 7» ΐ» s
olyan enzimekkel, melyek több, fentiekben ismertetett módon stabilizáltak.
Mivel a találmány szerinti szer minden elképzelhető formában ajánlható, ezért a találmány szerinti enzimet, előnyösen fehérjét, a mindenkori szerbe adáshoz célirányosan, a találmány megvalósítási formájának megfelelően kiszerelt formában állítjuk elő. Ide tartoznak a folyékony, szilád, szemcsézet vagy kapszula formák.
A kapszulázott forma, az enzim és a többi alkotórészek, mint például fehérítő szerek, védelmére vagy szabályozott kibocsátására szolgálhat. A kapszula mérete alapján megkülönböztetünk rníilí-, mikro- és nanokapszulákat, ahol az enzimek részére különösen a mikrokapszulák felelnek meg. Ilyen kapszulákat a szakirodalomban leírták [WO 97/24177 és DE 19918267 számú szabadalmi bejelentés). Egy további kapszulázási eljárásban a mosó- és tisztítószerekhez megfelelő enzimeket az enzimoldattal keményítőt vagy a keményítő származékot tartalmazó oldatból keményítőbe, előnyösen keményítő származékba, kapszulájuk. A szakirodalomban ilyen kapszulázási eljárást leírtak [WO 01/38471 számú szabadalmi bejelentés).
A fehérjék szilárd szeméi például szárított, szemcsézett, kapszulázott, vagy kapszulázott és végöl szárított formába helyezhetők, Lehetnek elkülönítetten, azaz fázisonként, vagy más alkotórészekkel együtt azonos fázisban, kompaktálással vagy anélkül végzett hozzáadással. A míkrokapszulázoit enzimeket a szilárd formában úgy kell kialakítani, hogy a víz a jelenlegi technikákkal a vizes oldatokból eltávolítható legyen, például poriasz***ι «·.<* 4 * * χ,; Η* tással, centrifugálással vagy oldőszermentesítéssel. Az ilymódon kapott részecskék átlag mérete 50 és 200 ura között található.
A találmány szerinti szerekben az enzim és a találmány szerinti fehérje ís, folyékony, gélképző vagy pasztán kiszerelésben is előfordulhat, ami a technika mai állása, szerinti eljárással nyert fehérjéből indul ki, és az elkészítés koncentrált vizes vagy nem vizes oldatban, például, folyékony formában, folyadékként, szuszpenzióként vagy emulzióként történik, de lehet gél formában is, vagy kapszulázott szárított porként ís adagolni. Az ilyen találmány szerinti mosó- és tisztítószereket folyadékként a szokásos oldószerekkel együtt rendszerint az alkotórészek egyszerű összekeverésével állítják elő, ahol az anyagba, vagy oldatként az automatikus keverobe adható.
A primer mosási teljesítmény mellett a mosószerekben lévő proteázok további funkciókat is betölthetnek, az egyéb enzimatikus alkotórészeket proteolítikus hasítással aktiválhatják vagy megfelelő hatástartam után inaktiválhatják, ahogy azt a szakirodalomban leírták (WO 94/294:26 vagy EP 747471 számú szabadalmi bejelentések). Összehangolható szabályozó funkciók a találmány szerinti enzim esetében is lehetségesek. A találmány egyik megvalósítási formájában, a fentieken kívül olyan szerek találhatók a proteázra érzékeny anyagbői készített kapszulában, melyek például a találmány szerinti fehérjéket a megadott Időpontban hidrolizálják, és így tartalmuk kiszabadul. Hasonló összehangolható hatás más többfázisú szereknél ís elérhető.
A találmány egy további, megvalósítási formájában olyan szereket, állít elő a textil nyersanyagok kezeléséhez vagy a textilápoláshoz, melyek azzal jellemezhetők, hogy magukban vagy együtt más aktív alkotórészekkel a fentiekben leírt proteolítikus §
φφ
fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék egyikét tartalmazzák, különösen természetes rostoknál vagy textíliáknál és különösen gyapjú és selyem esetében.
A természetes rostok, mint például a gyapjú vagy selyem, jellegzetes mikroszkópos felépítéssel rendelkeznek. Az eljárások például a gyapjú szakirodaimában, leírtaknak megfelelően végezhetők [Breier: Mellíand Texülberichte, 1,4. 263(2000)], de ez hosszan tartó kedvezőtlen hatásokhoz, így Összeesomózódáshoz, vezet. Az ilyen hatások elkerülésére a természetes nyersanyagokat a találmány szerinti szerrel kezeljük, mely például hozzájárul, hogy a fehérje felépítésében az uralkodó pikkelyes felszíni struktúrák elsimuljanak, és ezzel összecsomózódásuk ellenében hatnak.
Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában a proteázt tartalmazó szert úgy dolgoztuk ki, hogy a szokásos kezelési anyagok alkalmazhatók, például amit a mosó folyamatban alkalmazunk, vagy az után, függetlenül attól, hogy a mosáskor már alkalmaztuk. A kívánt hatás a textíliák felületi struktúrájának elsimítására irányul, és/vagy a szóvetek károsodásának megelőzésére és/vagy csökkentésére.
A találmány egyik megvalósítási formájában a textíliák vagy a szilárd felületek gépi tisztításához eljárást biztosítunk, melyben a találmány szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje, vagy származék mennyisége legalább az egyik eljárási lépésben alkalmanként 40 pg- 96 g, és előnyösen 50 pg- 72 g, 100 pg- 48 g, és különösen előnyösen 200 pg- 24 mg.
Ide tartoznak mind a kézi, mind a gépi eljárások, amikor is a gépi eljárások pontosabb szabályozhatósága. alapján például az
X adagolt mennyiség és a hatásidő tekintetében előnyben részesítettek.
A textíliák gépi tisztításának eljárásait általánosságban azzal jellemezhetjük, hogy több eljárási lépésben különböző tisztításban aktiv anyagot alkalmazunk a tisztítandó dolgon, és a hatás-idő után .lemossuk, vagy hogy a tisztítandó dolgot egyéb módon a tisztítószerrel vagy ennek oldatával kezeljük. Ez igaz a gépi tisztítások eljárásaira is, mindenek előtt egyéb anyagokra, így azokra a textíliákra, melyeket kemény felszíneken összefognak. Áz összes ilyen szóba jöhető eljárás legalább egyik eljárási lépésében a találmány szerinti fehérjével gazdagítható, és ezek a találmány megvalósítási formáit jelentik.
Mivel a találmány szerinti enzim fehérjeolőő képességgel már rendelkezik, és ezt a közegben fejti ki, másképpen tisztítő'· ereje nincs, mint például a fenék-pufferben, ezért a textíliák gépi tisztításánál az ilyen eljárás egyik részlépése az lehet, hogy a kívánt esetekben a stabilizáló vegyületek mellett sók vagy pufferanyagok alkalmazhatók, a találmány szerinti enzim egyedüli tisztításban aktív komponenseként. Bz a találmány különösen előnyben részesített megvalósítási formáját jelenti.
Egy további előnyben részesített megvalósítási formában az ilyen eljárások a találmány szerinti enzim a fentiekben megadott .receptúráinák keretében, előnyösen a találmány szerinti mosó-, előnyösen tisztítószert biztosítják.
A találmány egyik előnyben részesített megvalósítási formájában a textil nyersanyagok kezeléséhez vagy textilápoláshoz eljárást biztoeítunk, mely azzal jellemezhető, hogy a találmány szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék legalább az egyik eljárási lépésben, aktív, különösen azokon a ·+ * > > ' ς.
textil nyersanyagokon, rostokon vagy lexikákon, melyek természetes alkotójú textil nyersanyagok, különösen, a gyapjún, és a selymen.
Ez például olyan eljárással érhető et melynél a textíliákat a feldolgozásához előkészítjük, mintegy az anti-csontosodás ellen, vagy például olyan eljárással, mely a bevitt textíliák tisztítását a kezelő komponensben gazdagítja. A proteázok fentiekben leírt hatása, ellen a kijelölt szövetet az előnyben részesített megvalósítási forma szerint kezeljük, így a. textil nyersanyagot vagy a természetes alkotójú textil nyersanyagot, különösen a gyapjút és selyemet.
A találmány egyik sajátos tárgykörében a találmány szerinti fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét, vagy származékot textíliák vagy kemény felületek tisztításához állítjuk elő.
Előnyösen ezek az alkalmazások a fentiekben megadott koncentrációtartományban érvényesek.
így a találmány szerinti fehérjék különösen a fentiekben leírt tulajdonságok alapján a fentiekben leírt eljárásokban a textíliák és a szilárd felszínek fehérje tartalmú szennyeződéseinek eltávolítására szolgálnak. Az előnyben részesített megvalósítási formákban a találmány a gépi eljárásokon kívül például a háztartási mosásokkal vagy a textíliák foltjainak kézi eltávolításával vagy szennyezett felületek tisztításával foglalkozik.
Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában ez az alkalmazás az érintett találmány szerinti enzim, a fentiekben, csatolt recqptúrák keretében, a találmány szerinti szerhez, előnyösen mosó···, előnyösebben tisztítószerekhez történő biztosítását jelenti.
** β φφ φφ.
φ * Φ Φ Φ ν * _φ 5 Φ ΦΦ Χφ« ή
X Φ Φ Φ φ φ χ ν ·»»« « <,' <., ί
Egy további megvalósítási forma a találmány szerinti fehéijék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék, vagy származékok alkalmazásával foglalkozik, ami a mosó- és tisztítószerek alkotórészeinek aktiválására vagy deaktiválására szolgál.
Amint az ismeretes, a mosó- és tisztítószerek fehérje alkotói proteázokkal inaktiválhatok. Ezeket egyébként inkább a nem kimégis a találmány tárgy vánt hatások megcélzására körébe tartoznak. Az .is lehetséges, hogy először egy másik komponenst proteolízissel aktíváinak, amikor a tulajdonképpeni hibrid-fehérje enzimből és ennek megfelelő inhibitorból áll, ahogy azt a szakirodalomban leírták [Wö ÖÖ/01831 számú szabadalmi bejelentés]. Egy további példa az ilyen szabályzásra, vonatkozik, az aktív komponens enzím&ktivitásának védelmére, ami szabályozáshoz kapszulába zártan fordul elő, amikor is .hatását a proteolízís megkezdésével fejti ki. A találmány szerinti fehérjék így inaktiválási, aktiválási és felszabadulási reakciókban alkalmazhatók, különösen többfázisú szerekben.
A továbbiakban, a mosó- éa tisztító problematika technikai eljárásain, alkalmazásain és a .hozzátartó szerein kívül, az összes többi eltérést a találmány tárgykörének megfelelően összegezzük, amennyiben azokat a találmány szerinti fehérjék határozzák meg. Ezt az összeállítást nem tekintjük végleges felsorolásnak, hanem csak a legfontosabbakat állítottuk össze, melyeket jelenleg a találmány szerinti proteázok adagolásából felismertünk. Á továbbiakhoz kiindulási alapot, és további alkalmazási lehetőséget nyújt a szakirodalom (Uhlíg; Hanbuch Xndustrial Enyzmes and théir Applications, Wiley-Verlag, New York, (1998)]. Meg kell állapítani, hogy a további technikai területek a * fc e fc fc *fcfc • fcfc találmány szerinti proteázok alkalmazásainál. tovább fejleszthetők, igy ezek a találmány oltalmi körébe tartoznak,
A találmány tárgyköreinek egyik megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék vagy származékok alkalmazásaira vonatkozik, melyeket a kis molekulatőmegú vegyületek vagy fehérjék biokémiai analízisében vagy szintézisében felhasználhatunk.
A találmány és a. szakirodalom szerint [Römpp, ''Lexikon. Chemie” (Version 2,0, Stuttgart/ New York: GeorgThieme Verlag, (1999)) enzimatikus analízis alatt minden olyan biokémiai analitikai műveletet értünk, mely specifikus enzimet vagy szubsztrátot kezel, egyrészről a szubsztrát azonosítására, vagy koncentrációjának megállapítására, másrészről az enzim azonosítására vagy koncentrációjának kiderítésére. Az alkalmazási területek az összes biokémiai alkalmazásokra kiterjednek, különösen a molekuláris biológiaiakra, és fehéije-kémiaiakra. Ez az alkalmazás előnyösen az analitikai eljárások keretében történik. Ezen tárgykör egyik előnyben részesített megvalósítási formája a szekvencia analízis keretében végzett végcsoport meghatározás.
A tárgykör egy további megvalósítási formája a találmány szerinti, fentiekben leírt fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék vagy származékok alkalmazására vonatkozik, a természetes anyagok tisztításához vagy a biológiailag értékes anyagok előállításához.
Előnyösen ez a megfelelő szerrel vagy eljárás keretében történik. így a természetes anyagok vagy biológiailag értékes anyagok tisztítási folyamatában jelentős lehet a fehérjeszennyezésektől való megszabadításnál. így például a kis molekulatőmegú vegyűletek, az összes sejtalkotó, vagy a raktározó anyagok kezelésére használható. Ez mind laboratóriumi méretekben, mind ipari méretekben, például értékes anyagok biotechnológiai előállításában végrehajtható.
A találmány szerinti proteolítikus enzimek felhasználása a fehérjék vagy kis molekulatőmegű vegyuletek szintézisénél a természetes katalitikus reakció átalakító képessége alapján valósul meg, például amikor fehérje íragmenseket kell összekapcsolnunk, vagy amikor a nem túlsúlyban lévő, fehérjéből álló vegyűlet aminosavait össze keli kapcsolni. Az ilyen alkalmazási lehetőségeket a szakirodalomban javasolták (EP 380362 számít szabadalmi bejelentés).
A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjékkel, fehérje fragmensekkel, fúziós fehérjékkel vagy származékokkal a természetes nyersanyagok kezelését biztosítja, amikor ezeket felületi kezelésnek kell alávetni, elsősorban a bőrkikészítésnél.
Előnyösen ez a találmány szerinti szerrel vagy eljárás keretében történik. Erre például akkor van szükség, amikor a természetes nyersanyagot fehérjeszennyeződésétől kell megszabadítani. Elsősorban ide tartoznak a mikrobiológiai szennyeződéseket nem tartalmazó nyersanyagok, melyeken itt mezőgazdasági eredetúeket értünk, de ide értjük a biotechnolőgiailag, fermentációval előállított anyagokat, mint például az antibiotikumokat.
Az egyik előnyben részesített megvalósítási forma a felületi kezelések alkalmazására, és különösen a gazdasági jelentőségű, bőr nyersanyagok kezelésére vonatkozik. így a cserzési eljárások folyamatában, különösen a .lúgos puhításnál (Römpp, ”Lexikon Chemie, Version 2.0, Stuttgart/ New York: Georg Thíeme Verlag, η;
(1999)] a vízben oldódó fehérjék proteolítikus enzimek segítségével a bőr-anyagból kioldhatók. Ehhez a találmány szerinti proteázok alkalmazhatok, különösen lúgos körülmények között és denaturáló szerek jelenlétében.
A. tárgykör további megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék vagy származékok alkalmazására vonatkozik, amennyiben azokat a textíliák előállításához a nyersanyagok kinyerésénél vagy kezelésénél, vagy a közti termékek kialakításánál használják fel, különösen a védőrétegek eltávolítására.
Előnyösen ez a találmány szerinti szerrel vagy eljárás keretében történik. A nyersanyagok nyerésének vagy kezelésének, vagy a textíliák előállításánál közti termék létrehozásának egyik példája a gyapot feldolgozása, ahol a lesimításnak nevezett folyamatban a tok alkotórészeitől meg kell szabadulni, egy másik a gyapot kezelése.; de hasonló érvényes a nyersselyem feldolgozására is. Az enzímatíkus eljárások összevethetők a kémiai eljárásokkal, különösen a környezeti összeegyeztethetőségük tekintetében.
Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti fehérje felhasználható a textíliák védőrétegénél, különösen a közti vagy az értékes termék eltávolításánál, vagy a felületeik lesímításában, mielőtt egy következő feldolgozási lépésben ezeket tovább alakítják.
A. találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék, vagy származékok felhasználását a textil nyersanyagok kezelésénél, ápolásánál érvényesíti, különösen a gyapjú vagy selyem vagy más, főleg selymet tartalmazó kevert textíliák felszíni kezelésénél·
Előnyösen ez a találmány szerinti szerrel vagy eljárás keretében történik, A fentieknek megfelelően a szóban forgó textil nyersanyagok szennyeződéseiktől proteázokkal megszabadíthatok; ezen kívül a fehérjéből álló anyag legalább egy részén a. proteoiitikus enzim felület lesímitő és ápoló tulajdonsága jót. tesz. Ennek alapján a szóban forgó anyagok ápolását is felöleljük. Különösen a gyapjú vagy selyem, vagy a gyapjút vagy selymet tartalmazó anyagok felületi kezelésére formálunk igényt. Ez érvényes mind az ilyen textíliák előállítására, mind alkalmazásuk során ápolásukra, például a textíliák tisztításakor (lásd fenn).
A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék, vagy származékok felhasználását a fotófilmek kezelésénél érvényesíti, különösen a zselatint tartalmazó vagy hasonló védőrétegek eltávolításánál
Előnyősén ez a találmány szerinti szerrel vagy eljárás keretében történik. Az ilyen védőrétegek, különösen az ezüstsókat. tartalmazó zselatin emulziók, a -filmeken találhatók, mint például a röntgenfilm egyik rétege, melyet a hordozóanyag megvilágítása után el kell távolítani. Az itt uralkodó lúgos vagy gyengén denaturáló reakciókörülmények miatt a találmány szerinti proteázok különösen jól aBalmazhatók.
A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék, vagy származékok felhasználását élelmiszerek vagy takarmányok előállításánál érvényesíti.
X* χχφφ
Előnyösen ez a találmány szerinti szerrel vagy eljárás keretében történik. így a proteázok az élelmiszerek előállításában, azok megváltoztatásában alkalmazhatók. Brre példák a sajtok érési folyamatában vagy más tejtermékek kialakításában végzett alkalmazások. Az ilyen, folyamatok a találmány szerinti fehérjével gazdagíthatok, vagy ezekkel teljes egészében végrehajthatok. A nem táplálkozási célú. szénhidrátot tartalmazó élelmi-szerek vagy élelmiszer nyersanyagoknál, mint például a liszt vagy a dextrín, a szóban forgó proteázok a kísérő fehérjék eltávolítására is felhasználhatók. A találmány szerinti proteázok az ilyen felhasználásokhoz is megfelelnek, különösen. abban az esetben., amikor ezek lúgos vagy gyengén denaturáló körülmények között történnek.
Ez érvényes a takarmányok előállítására is. Itt a teljes fe~ hérjementesítés mellett az ís érdeklődésre tarthat számot, hogy a fehérjét tartalmazó kiindulási anyagot vagy anyagkeveréket a proteázokkal csak kis ideig kezelik, azért, hogy a háziállatok számára könnyebben emészthetővé tegyék. Az ilyen kezelés például a táptalajok előállítására is felhasználható, amit a mikroorganizmusok fermentációjánál felhasználhatunk.
A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjék felhasználását kozmetikai célra érvényesíti.
Az igény a találmány szerinti fehérjéket, fehérje fragmenseket, fúziós fehérjéket, vagy származékokat tartalmazó kozmetikai szerekre, eljárásokra is kiterjed, melyek a találmány szerinti, fehérjéket, fehérje fragmenseket, fúziós fehérjéket, vagy származékokat alkalmazzák kozmetikai célokra, különösen az ehhez megfelelő eljárásban vagy szerekben.
X*** Κ A
Mivel a proteázok az emberi bőr sejtmegújulási folyamatban is szerepet játszanak (dezkvamácio), ezért ezek meghatározó szerepét a szakirodalomban leírták jügeirud és mtsai: Acta Derm. Vénéről·, 71., 471-474(1991]]. Ennek megfelelően a proteázok a bőrápolószerekben, bioaktív anyagként felhasználhatók, a száraz bőr leépülésekor a dezmoszóma struktúrák gyarapításával védelmi célra [WO 95/07688 vagy WO 99/18219 számú szabadalmi bejelentés], A szubtílizin proteázok alkalmazását a szakirodalomban kozmetikai célra leírták [WO 97/07770 számú szabadalmi bejelentés], A találmány szerinti proteázok is, különösen a mutagenezissei kialakított, változatok, vagy amelyek aktivitása megfelelő növekedésre ható anyagokkal szabályozható, bőr- vagy hajtisztíto vagy ápoló szerekbe adagolhatok, Különösen előnyösek azok az enzim készítmények, melyek, ahogy azt a fentiekben leírtuk, például makromolekulán® hordozóhoz kapcsolva stabilizállak [5230891 számú Amerikai Egyesült Allamok-belí szabadalmi bejelentés] és/vagy a nagyon, allergén régiókban pontmutációval megváltoztatott származékok, mellyel az emberek számára nagyobb bőrtúrést biztosít.
Ennek megfelelően a proteolítikus enzimek alkalmazása, kozmetikai célra is a találmány oltalmi körébe tartozik, különösen a megfelelő szerekben, mint például sampon, szappan, vagy vizek, vagy ápolószerek, melyek például krém formában ajánlhatók, Ezek a bőrrétegeket eltávolító gyógyszerekben. is alkalmazhatók, íg>f ezek szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.
Példák
Az összes molekuláris biológiai munkalépés standard módszerek követésével történik, amelyek a szakirodalomban megtalálhatók (Pritsch és mtsai Moiecular Cloning; a Laboraiory Manual”, Cold Spring Harbour Laboraiory Press, New York, (1989)), vagy ahogy azt az ide vágó művekben közölték. Az enzimeket és a készleteket a gyártó cég utasításainak megfelelően használtuk.
L Példa
Hl
A talajprőba (0,1 g) 1 mi-ét steril 0,9 %-os NaCl oldatba szuszpendáltuk és tejport tartalmazó agar lemezekre szélesztettük (1,5 % agar, 0,5 % NaCl, 0,1 % KzHPÖ*, 0,1 % élesztökivonat, 2 % pepton (ICN, Eschwede, Art.~Nr. 104808), 1 % tejpor (fölözött te); Difco, Heidelberg, Art.-Nr. 232100), pH ™ 10). Miután a lemezeket 72 óráig 30 «C-οη inkubáltuk a telepek a tejes agaron tisztulási zónát mutattak. A lemezekről egyedül áHó kolóniákat izoláltunk éa Horikoshi táptalajban (0,1 % KsBFO«, 0,5 % élesztőkivonat, 1 % pepton, 0,02 % MgSCU, 0,3 % Na^COs, pH ~ 9) Erlenmeyer lombikban 37 «C-οη tenyésztettük, miközben 200 rpm-mel rázattuk.
Az egyik ilyen kiönt letétbe helyeztük, száma; 1.3.2001 (Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Eellkulturen GmbH, Maseheroder Weg lb, 38124 Braunschweig (DSMZ)). Ott a ID 01-193 megnevezést kapta, mig hozzáférést száma; DSM. 14392. Ezen biológiai anyag jellemvonásainak mérvadó adatait meghatározták és az 1. táblázatban összegezését megadtuk. Ennek, megfelelően, ez alkalikus badllus.
φ φ φ· *
Μ»
1. Táblázat
A BadHus sp. mikrobiológiai jellemzői (DSM 14392)(megegyezik DSMZ-vnl (2001)1
Tulajdonságok j Eredmény
Sejtforma Pálcikák
szélessége (pm) Ü?8~ 1,0
hossza (pm) 2,0 · 3,0
Spórák pozitív, ovális
Sporangmm duzzadás negatív
Növekedés CASÖ, pH - 7 pozitív
Növekedés DSM táptalaj 31, pH - 9,7 pozitív
Alkalíkus vizsgálat
NaCl 2 % pozitív
5 % pozitív
7% pozitív
10 % pozitív
12 % pozitív
14 % pozitív
16 % pozitív
Hidrolízise
Tween 40-ből negatív
Twen OO-ből negatív
Tween SÖ~béí negatív
A celluláris zsírsavak mintázata a fedkaa nemzetségre jellemző
η „. Α *** * ’ ηζ ί
A részleges 16 8-rDNS szekvenálás a. Bscalus sp~vet (DSM 8717) 98,3 %~os hasonlóságot mutatott (Microfoiology, 141, 1745-1761 (1995))
2. Példa
Áz érett proteázok klónozása és szekvenalása
Á BaciOns sp. (DSM 14392) kromoszómáiig DNS-t standard eljárással kinyertük, Sau3A restrikciós enzimmel kezeltük, és a. kapott fragmenseket a pAWÁ22 vektorba klónoztuk. Ez egy pBCl 6-ből levezetett expressziós vektor, mely Bacdíus fajokban álkaim azható [Rernhard és mtsai: J. Bacteriot, 133(2), 897-903 (1978)). Ezt a vektort Radílus suMés DB 104 proteáz negatív gazda törzsbe transzformáltuk [Kawamura és Dói: J. Bacteriot, 160(1), 442-444(1984)).
A transzformánsokat ezok után DM3 táptalajban regeneráltuk (8 g/l agar, 0,5 M borostyánkősav, 3,5 g/l K3HPO4, 1,5 g/l ΚΗ'.ζΡΟα, 20 mM MgCk, 5 g/l kazamínosavak, 5 g/l élesztőkivonat, 6 g/l glükóz. 0,1 g/l BSA) és TBY-Skímmilk lemezekre (10 g/l pepton, 10 g/.l tejpor (lásd fenn), 5 g/l élesztő, 5 g/I NaCl, 15 g/l agar) leoltottuk. A proteolítikusan aktív kolóniákat lizisük mértéke alapján, azonosítottuk. A kapott, proteolítikusan aktív kolóniákat kiválasztottuk (p/Ál), melyekből a plazmídot izoláltuk és az inszertet: standard eljárással szekvenáltuk.
A körülbelül 3,1 kb nagyságú inszert egy körülbelül 1 kb nagyságú nyitott olvasási keretet tartalmazott. Ennek szekvenciáját megadtuk (a szekvencia száma: 1). Ez 1125 bp-t foglal magában. Az ebből levezetett 374 aminosav szekvenciáját stop-kodon követi. Ezt ís megadtuk (a szekvencia száma: 2), Ebből 105 χ* ί
X ,.ΛΛ ' γ ·>* ♦ » !·ϊ· <·· aminosav valószínűleg nem az érett fehérjét tartalmazza, igy az érett fehérje előreláthatóan 269 amínosavat ad.
Ennek szekvenciáját 2001. augusztusában a mindenki által hozzáférhető Swiss-Frot adatbankban (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.Á., Genf, Bohweiz;
http: //www,genebio.,com/ sprothtml) és a GenBank-ban (National Center fór Biotechnology Information NCBI, National institutes of Health, Bethesda, MD, USA) kapott proteáz szekvenciákkal összehasonlítottuk, így a legközelebb álló hasonló enzimeket a következő, 2, táblázatban feltüntettük.
2. Táblázat
A. homolégla bemutatása a BnofSus sp« (DSM 14392) alkalikus proteázhoz legközelebb álló fehérjéknél
Jelmagyarázat:
ID: A Genbank adatbázis és a Swiss-Prot bejegyzési számai; Ident DNS: Azonosság DNS szinten %-ban;
Ident. Prepro.: Azonosság aminosav szinten, a preprofehérjére vonatkoztatva, %-ban;
Ident mát Fkot.; Azonosság aminosav szinten, az érett fehérjére vonatkoztatva, %~ban, n Az adatbázisban nem adták meg.
Enzim Szervezet. ID Ident. Ident, Ident
DNS Prepto mát.
Alkalikus BndHns ¥hS BhYA^BACSF 98 a tit 01 98 99
elasztáz
Szubiilizin BLYA..BACAG 69 80 83
7,,, ** * #« xr4 * * y * . , .
F92 oZfca/opfefes
SzubtiHzüi 309 (Savinase^ BadZtos lantos SUBSJBACLE rk 59 83
BudZíws tentos aikalikus proteáz BadZIus lantos DSM 5483 SUBBJ3ACLE n.: 59 82
Szubtiüzm Sendai SadZtos Sondd Q45522 66 69 79
Szubtilidu AprQ BodZtos sp. Q45523 56 48 60
Szubtüizín Carlsberg BodZtos líchem/brmís SUBT.BACU 44 w V 48 58
Szubtilidn Növő BFNf BodZtos am^lofígua/ada ns SUBXBACAM n, 46 56
Szubtüízin DV SodZtos subtílis DV SUBT BAC8D Xk 41 56
Sxubtómn AprN fíocötos sufcdíis oor natto BUBNJ3ACMÁ 54 55
Szubtilizín BodZtos amplosacehodd cus 3ÜBTBACSA 64 55
Szubtüízin SadIZus pumIZis SUBX>ACFÜ n. 40 55
Szubtilizm J Gaobadllus otóaro· ífermppAZZus SÜBTBACST 54 45 55
Szühtílízin.
E
Badiíws suMís SUBT BACSU
4o
E proteázok aminosav szekvenciáit az 1. ábrán egymással egybevetve megadtuk.
3. Példa
Az alkalikus proteázok tisztítása ésJellemzése
Egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikba, melybe 100 ml Horikosbí táptalajt helyeztünk (lásd fenn) a 2. példa szerint transzformált BadPus törzset oltottunk, éa 72 óráig 37 °C-on tenyésztettük, amíg a stacioner növekedési fázist nem értük el.
A tenyészet felülüszójáböl a következő tisztítási lépésekkel egyedi proteolítikus enzbnet nyertünk: A felülúszó dialízisét 20 mM HEPBS/NaOH-pufferrel szemben végeztük, (pH ::5: 7,6); a negatív anioncserélö kromatográfia Q-Sepharose^ oszlopon történt (PharmaciarAmersham Biotecb, Schweden); a kationcserélö kromatográfiai S- Sepharose^ oszlopon (Pharmacia-Amer&ham), az elúciót HEPBS/N&ÜH gradienssel végeztük, 0-1 M Naül, pH ™ 7,6. A proteázt 0,2 M NaCbnái eluáltuk, melyet kationcserélő kromatográfiás oszlopra vittünk, nevezetesen; Resource S^-re (Pharmacia-Amersbam) és HEPES/NaOH~val (pH 7,6) eluenssel koncentráltuk.
Ily módon az SDS gélelektroforézis és a Coomassie festés szerint fehérjét nyertünk.
4, Példa
Az SDS poliakrilamid gélélektroforéris és izoelektromos Jsta;
száléo «X X * * φ ·* * s· $ » * * * ·** *»♦ * * . **#Φ Φ Φ * >*>·*» « 4<^
A denaturáló SDS poliakrilamid gélelektroforézist FHAST® rendszerben végeztük (Pbarmacia-Amersham Biotech, Schweden), a 2, példa alapján, a 3. példában kapott alkalikus proteázon, amit Bacd/us sp. (DSM 14392) törzsből nyertünk, 26 kD molekulatömeg adódott.
Áz ízoelektromos fókuszálás szerint (PHÁST® rendszer, Pharmada-Amersham Biotech) a Booöfes sp. (DSM 14392) törzsből nyert alkabkus proteáz ízoelektromos pontja 11.
5. Példa
Enzimatikus tulajdonságok
Specifikus aktivitás:
A 2. és a 3. példa alapján előállított alkalikus proteáz specifikus aktivitását, melyet BuctOus sp. (DSM 14392) törzsből nyertünk, a. Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid szubsztráttal (AAPF; Bacbem Bíochenúca GmbH, Heidelberg) határoztuk meg. Az ötperces ínkubálás alatt (pH ~ 8,6 és 25 °C~on) az aktivitás 9 egység/mg, Ez percenként megfelel 1 egység/pmol hasított, szubsztrátnak.
6. Példa
Kisebb aktivitások hozzájárulása a mosástteljesítményhez
Ebben a példában standard módon szennyezett textíliákat alkalmaztunk, melyek a szövetségi szabályoknak megfeleltek (Eidgenössischen Material-Prüfungs- und -Versuchsanstalt, St. Dalién, Schweiz (EMPA))., vagy a mosási kutatóintézet szabályait vettük figyelembe (Wáscheréiforsehungsanstalt, Krefeld), Ezeknél a vizsgálatoknál a lexikák szennye zéséhez a kővetkezőket alkalmazzák: A (vér/tej/korom pamuton), B (vér/tej/tufs pamuton), € (vér/tej/tus pamuton), és D (vér pamutön).
*
X
Ezzel a vizsgálati anyaggal különböző mosószer recepteket mosási teljesítményük szempontjáből megvizsgáltunk. Ehhez a mosőfúrdő tartalma mindig 1:12 arányú és a mosást 30 percig 40 «C-on végeztük. A dózisok közötti különbség az egyes mosásokban 5,88 g~onként. változott. A viz keménysége 16 német fok.
A kontroll mosószer a. mosészerrerept alapjául szolgált, melynek összetétele a következő (minden adat tömegszázalékban): 4 % lineáris alfólbenzolszulfonát (nátríumső), 4 % 12-18 szénatomszámos zsírsavalkoholszvdfát (nátriumsó), 5,5 % 12-18 szénatomszámos zsíralkohöl 7 BO-val, 1 % nátrium szappan, 11 % nátrium-karbonát, 2,5 % amorf nátrium-diszíiíkát, 20 % nátrium-perborál tetrahidrát, 5,5 % TAED, 25 % Zsofith A, 4,5 % polikarboxílát, 0,5 % foszfonát, 2,5 % hahgátíő szemcse, 5 % nátrium-szulfát, maradék: viz, optikai derítő, ső. A különböző kísérletsorozatokhoz a kővetkező protoázokat adagoltuk, melyek mosásonként mindig 2250 FE proteolítikus aktivitást adtak végkoncentráciöban: Bnetilus fentws alkalikus proteáz F49 (WO 95/23221 számú szabadalmi bejelentés); előállító: Bíozym, Kundl, Ósterreích), Savinase^ (Novozym.es A/S, Bagsvaerd, Dánemark), előnyösen a találmány szerinti proteáz, melyek Bacti/as sp, (DSM 14392) törzsből nyertünk.
Mosások után a mosott textíliák fehérség! fokát báriumszufáttal hasonlítottuk össze, amit löö %-ra nomináltunk. A méréseket, spektrofotométerrel 460 mn-en végzetük (Dataeoior SF5ÖÖ-2) (UV-Sperrülter 3), 30 mm-es hlende, fényesités nélkül, fényforrás D65, 10% d/8% A kapott eredményeket a remissrió százalékában adtuk meg, azaz százalékos értékekben, ahogy az a következő táblázatban látható. Az adatok mindig 4 mérés átlagát.
tükrözik, Ez a vizsgált enzimnél az alkalmazott szerek mosási teljesítményében megnyilvánuló hozzájárulásának közvetlen visszakövetkeztetést teszi lehetővé.
3> Táblázat
Alap mosószer a kővetkezőkkel: A B c D
kiindulási érték 15,8 14,3 11,3 19,9
kontroll (proteáz nélkül) 21,7 22,2 14,7 67,9
a találmány szerinti proteáz, melyet 29,9 40,1 32,0 73,0
Budifen sp, DSM 14392 törzsből
izoláltunk
Budlfes fente alkalikus proteáz F49 29,3 30,2 25,2 70,8
Savinase^ 30,0 32,1 29,1 68,3
szórás 1,0 1,1 1,2 0,8
Felismerhető, hogy a, találmány szerinti Baedte sp. (DSM 14392) törzsből nyert proteáz minden vizsgált szennyezőnél mosási teljesítményében megközelítette, és részben még tűi ís szárnyalta a kővetkező proteázokat: Sadllus fente alkalikus proteáz F49 és SavinasA
7,„Példa
AJdgefehaktivitetezg^^
A kemény, síma felületű edényeket standardizált módon szennyeztük kevert-kexnényítővel (B) és tejjel (F), és ezt a kereskedelemben vásárolható háztartási mosogató géppel öblítettük Az B próbán a normál programot 45 «Gon végeztük el (Miele^ G 676 mosogatógép), és az F-et SS Oon normál programmal vizsgáltuk gépi mosogatógéppel (SGS 4002 Bosch% öblítő programonként mindig 20 g őblítőszert alkalmaztunk, A víz keménysége 16 német fok.
Öblítőszerként a kővetkező alapreceptek szolgáltak: (az összes érték tömegszázalékot jelent): 55 % nátrium-tripolifos^át (vízmentesnek tekinthető), 4 % amorf nátrium-disziiikát (vízmentesnek tekinthető), 22 % nátrium-karbonát, 9 % nátrium.perborát, 2 % TAED, 2 % nem ionos tenzid, maradék: víz, színező, parfüm. Ezzel az alap recepttel különböző aktivitású különböző proteázokat vizsgáltunk, ezek a kővetkezők: Bacfikm íeníus alkalikus proteáz F49, Properase^, előnyösen a találmány szerinti BodHus sp. (DSM 14392) törzsből izolált proteáz, öblítőprogramokként mindegyiket 10000 FE-ben alkalmaztuk. Ez a tisztítási folyamatban a tisztítószer 1 grammjára nézve megfelel minden esetben körülbelül 0,1 mg proteáz fehérjének.
Öblítés után a szennyezés eltávolításának mértékét B-nél gravimetriásán határoztuk meg. Ehhez a szennyezett és az öblített edény tömegének különbségét, valamint az edény kiindulási tömegét meghatároztuk. Ezek arányát százalékban fejeztük, ki, A F szennyezésnél az öblítés után. vizuális skálán, ö-től (változatlan, igen erős szennyeződés) lö-ig (szennyezés nem figyelhető meg) állapítottuk meg a hatást. A kapott eredményeket a kővetkező, 4. táblázatban foglaltuk össze. Az adatok 8 mérés átlagát adják. Ez a vizsgált enzimnél az alkalmazott szerek, mosási teljesítményében megnyilvánuló hozzájárulásának közvetlen visszakövetkeztetést teszi lehetővé.
4. Táblázat
Alap mosószer a következőkkel E F ' * X
8,1
8,2 a találmánv a találmány szerinti proteáz, melyet Bncáfes 58,1 sp. DSM 14392 törzsből izoláltunk Baedfes lentua alkalikus proteáz F49 60,6
Properase® 56,5
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy szerinti Bncfifes sp, (DSM 14392) törzsből nyert proteáz minden vizsgált szennyezőnél gépi mosogatóban mosási teljesítményében részben még tűi is szárnyalta a kontroll proteázokat, vagy legalább azzal egyenértékűnek mutatkozott, és ez a hatás már kisebb aktivitásnál is fellép.
8. Példa
A nagyobb aktivitású enzim. befolyása a tisztítani teljesítményre
A 7. példában leírtaknak megfelelően a következő szennyezett edényeket használtuk: tojásfehérje <G), tojás /tej (H) és tej (1), melyeket az előzőekben leírtaknak megfelelően öblítettük. A G és H próbákat 55 »C~on normál-programmal gépi mosogatóban vizsgáltuk (Bosch^, típus: SGS4002) és az 1 próbát 45 °C~on (Miele^ G 676 mosogatógép). Az egyetlen különbség az, hogy mindegyik proteázból 20000 F'E-t adtunk, Ez megfelel minden esetben körülbelül 0,2 mg proteáz tisztítószer .koncentrációnak.
A G és H sorozatok eredményeit az előző példában leírtaknak megfelelően gravimetriásán határoztuk meg. Az I szennyezés értékeit vizuális skálán értékeltük, O-től (változatlan, igen erős szennyeződés) 10-ig (szennyezés nem figyelhető meg), A kapott, eredményeket a kővetkező, 5, táblázatban foglaltuk össze. Az adatok 8 mérés átlagát adják.
5. Táblázat
Alap mosószer a kővetkezőkkel 0· H I
találmány szerinti proteáz, melyet .Budifos 19,7 21,0 6,6
sp. DSM 14392 törzsből izoláltunk
.Budifos tentus alkalíkus proteáz F49 52,4 81,0 6,1
Properase^ 17,3 16,9 6,1
Magasabb proteáz aktivitásoknál is magasabb, de legalább ís összevethető hatást kaptunk a találmány szerinti BndZfos sp. (DSM 14392) törzsből izolált proteázzal, mosogatógép! tisztításnál, mint a Bíufofos feníus alkalíkus proteáz F49-oel és a Properase^ szerrel.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat
Az i. ábrán a találmány szerinti Budifos sp (DSM 14392) törzsből izolált proteáz aminosav a^ekvendáját a legközelebbi és legfontosabb, a 2. táblázatban összefoglalt ismert szubiOizineldtel együtt mutatjuk be, műidig a érett azaz feldolgozott formában.
A kővetkező számok ezeket a proteázokat adják meg (a zárójelben az adatbanki azonosítót ís megadtuk, vő. a 2. példa 2. táblázatával).
szám neve forrás adatbanki azonosító
1 Találmány szerinti Budlfou sp. (DSM 14392)
2 Alkalíkus eíasztáz Bacdfoa DOB (elyOácsf)
3 Szubtilizín F92 .Budifos ulkufoplnfos (BIAAJMCAO)
4 SavínaseS .Budifos foufos (SÖBS...BACLE)
φ* *
5 Szubtíbzin BL Bael&m fentws (SÜBSLBACLE)
6 Szuhtilizin Sendai AprS B. sp. (Q45522)
>>y Szubtilizín AprQ S. ep. (Q45523)
8 Szuhtilizin Carlsberg 5, kebenifunnri (BÜBTJ3ACL1)
9 Szubtilizín Novo BPN B. amt/in^íe^xriens (subtJÁcam)
10 Szuhtilizin DY Sodlkte eubkős BE (SÖBTJSÁCSD)
11 ÁprN B. suMis var. nafcto (SÜBNJBÁCNA)
12 Szubtilizín B. ampEttetecbunAeus (SUBNJBACSÁ) |
13 Szubtilizín B. pwrnius (SUBTL.BACFU) |
14 Szubtilizín J öeobuciktte stearothermophüus (SOOTJBÁCST)
15 Szuhtilizin E B. suMis (SÜBTJBÁCSU)
2. ábra: A pBCl6-ből levezetett pAWA22 expressziős vektor, melynek promotere a B. íichem/brmis-bél (FromPLi) származik, és 5‘ irányban egy Bell restrikcióé hasítási helyet tartalmaz, (vő. 2. példával) (Bernhard és mtsai: J. Bacteriol., 133(21 897-903 (1978)).
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat, és számítógéppel olvasható formában is megadjuk.
SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE < 119» Henkel Kommanditgeaellschaft auf Aktién ♦ * * fcfc «s < * * fc fc fc fc
V fcfcfc fcfc fcfcfc fc *fcfcfc fcfc fc s fc * fcfcfc fc Xfc. ,fc>· «120 Új alkaiikus proteáz BudOus xp-böl (DSM 14392), valamint használata mosó- és tisztítószerekben «130» B5389PCT «140» «Í41>
«150» DE 10163884.1 «151» 2001-12-22 «160» 2 «170» Patentln Ver, 2.1 «210» 1 «21.1» 1125 «212» DNS «213» BadWs sp. (DSM 14392) «220» «221» CDS «222» (1)..(1125) «220» «221» mat^peptid «222» (316),.(1125) «400» 1 fcfc* fc
S5S 777 SAS st ytt ycc 77* aga aaa Cts Sitt c es tCA ySs ess ct 5 0
Gs 5 ii.i.y Lys XXe VsX AXa GXy T5.s: AXa Lse X Xa Me Gsr Vs X AGA Ohe
-L : -105 -55 -50
se 5 tea 5 re A 5c <Λ ess sec CA.y CAA cos SAS ess aaa 5AS cts 05
?: Ger Gsr X 18 AXa Mc AXs AXa M.S Gls M« Lys G C \i Lys Tyr Lee
-55 -55 -75
s·: 5 77« ttt AAA q«« GAA ess s5t «Μ tet ess 555 et 5 ysc ess At 5 XM
11 s L.y Lys <M.e Ma Mu Vas iMst Gec Mg i-GG Vác Asp Sla Us
-55 -50 -55
ysí. 70« ess ysc 5 At 5c5 Ai: 5 tét :a 5 caa M CAA yet C5t PÁS sitt XOS
Mc My Asp «5« Lyr Ssr XXe Gse 5 c c Gca Les GXe Asp A, 55Xs Ue
- 55 -55 -55
**«♦
gat: ctc Ctt est gaa tet: gat ttt att cet gtt tta tet gtt gaa ctt 240
Asp Lee Lac His Glc Öcs Asp Phe lle Pre Val i.eu Ser Vas Gla Lee
-40 -35 30
gat cca gaa g a t gtc gat get tta gag ott gat cca goa ato gcc tat 288
Asp Pro Glc Asp Val Asp Alá Leu Glc Lee Asp Ote Asa lle Alá Tyr
2 5 -20 -15 -10
a 5t g ag gaa gat get gag gta a -g a ca atg caa act gtt eea tgg 99V 338
I. Le Glc Gsu Aac Alá Glc Val Tht Thr Met: Gla Thr Vas Pre Trp Gly
-5 -1 1 5
a t t asc agt gta caa get C'.Oví att ccc caa agc aga gga tte aca 997 384
11« Asc Arg Val. Glc Alá O.t c 11« Alá Glc Ser Arg Gly Phe Thr Gly
10 15 20
a c t 99« gtt cgt gtt got gl.c tt a gac aca 999 atc tea aat cac get 432
Tht Gly Val Atg Val Alá Val Lee Asp Thr Gly lle Ser Asc hsa Asa
.·:·. ·.· 30 35
gat tta a ga att cgt 99- ggt gcg agt ttt gta COcS gga gag ccg íU -Ú O 4 09
Asp Lat Arg Ha Arg Gly Gly Alá Ser Phe Vas Pro Giy Glu Pro Asn
4 0 45 50 55
st t agt ga t gga aac 992 cat ggt aoo caa gtt get ggt aca at: t gca 528
11« Ser Asp Gly Asc Gly Pia Gly Thr His Vas Asa Giy Thr lse Al.a
80 55 7 0
gag tta aaa aat tea atc ggt g t a ott gcc gta gca. eet aac gtt ga t 57 5
Alá Lee Asc Asc Gar- 11« Gly Val Lee Gly Val. Ara Őre Asn Val Acp
75 80 85
tta tat ggg gtt asa gtg cta gga gca agt ggv tet 999 t ca etc agt 824
lea Tyt Gly vas Lys Val biíU Gly Alá Get Gly Ser Gly Ser He Ser
00 95 100
ggt att gca caa ggt :1 a caa tgg get goa est aat ego a t g oa t at: t 57 2
Giy Ϊ1 a Alá Glc G l y Lee Gtc Trp Alá Alá Asrs Áss Giy Aat his lse
105 110 11.5
gat aac atg agt tta gca agt agt get 99* tót get aca atg gaa caa 720
Alá As ti Gat Gat Lac Gly Ser Sex' Al a Gly Ser Alá Thr Get Gitt Gl.c
120 125 130 135
gC't gtt <?·. G caa gca aca gca agt 9 9 ’·· ctt ctt gta gtc gca get tet ”58
Alá Val Asa Glc Asa '•'tá- Al a Sex? Gly Vas Leu Val Val. A. la. Alá Ser
140 14 5 150
ggt <í. ::t tea ggt gca ggá aat gtt gga tte cca gea ego tat C 3 a a t 815
Gly As ti Ser Gly Alá Gly Asc Val Gl y Phe Pre Alá Atg Tyr Asa Act:
155 150 155
gcg atg get gtt ggt gca aca get caa ASC aac aac ego get agc t: 11 884
asa Gat Al a Val G.-.y Alá. Thr Aap Glc Asa Acc Asc Atg Al a Ser Phe
no 17 5 180
·> X
120 *♦» Φ * ·♦ 0»
let cag tSc qgs gta ggt. ett gac stt gtc ggy cca ggt gta ggt gta 012
Ser Gic Tyr G 0 y a.r a G.ly Öcs Acp Ars Vsi Alá Örs Giy Vei Giy Vsi
100 Ah; 100
csa SCt a cg gtt CC; OOt aat tsc ges. agc ttc aat IGA sca tel: 000
Olt Sar Thr Vsi Ott <5 Giy Asn Giy Tyr Ais Sás:' Oha Aec Giy Thr Ser
200 200 21.0 210
sy get ács cag CSC gtt get <h4 gtt get gtg tts 0:;2 asg caa asg 1000
Mst >. 2 ... A\.\ ís Thx- Orc Aie U. 2;« Giy Ver A.H Ais •Gát Vsi G,is Lys
220 220 200
aai CC 3 r:ct tgg tea aat gt;: cs y att est gt ίΐ·Λν CSC ett a est a cg 1000
Asc Arc 30; r Trc Gar Asn Vsi GÍC iiá Arg Áss Óra hsa Lys Áss Thr
235 240 2 00
CCS sca ase t ta <syt ser aag set ess ttc gga sgt ggt ett. g t1 ssc üOa
Ale The Asc Leu Giy Asn Thr Thr Giá Ohs Giy Tar Giy Lae Vsi Áss
2 00 200 200
sca ssa O’tg gca SCS egr f: sa Ü20
Ví v?,í. V A. A: Ai® Tor Arg
2 ? 0
<210>2
<211» 374
<212» PRT
<213» Badöus pp. (DSM 14392]
<400»2
Vet Giy Gys i .1 á Var Al.a Gr y Thr Alá isse r.rs Ha Ser Val Ais Aha
i 0 10 15
Ser Gar ser Air Alá Gi c. Alá Aia Gic Gia Alá Lys Gic Lys Tyr Lse
20 20 20
illa Giy Tas Lys Gic Gin Gic Val hat Ser Gin Ohá Val. Asg Gic iiá
20 40 40
Asp Giy Asp Gic Tyr Ser iiá 2c r Ser Gic Aia Gic Asp Val Gic He
00 OS 00
Aap Lac Lac Üis Gic Oha Asp Oha 2 is Óta Val Les Sár Ver Gic Lee
•0 0 70 75 00
Asg Őre öle Asp Vei Asp Alá isse Gic t-ac Asp Őre Als iiá Als Tyr
00 00 05
11% Gic Giy. Asp Aia Gir Val The Thr Mer Gia Thr Vsi Őre Trp GI y
100 100 110
21.a Lse Arg vsi G1 f'í Ara Őre 2 la Ais Gic Ser Arg se > > C 'CS Ohp Ac t>a y
115 120 125
Thr Gly Val Arg Val Ála Val ben Asp Tar Gly lle Ser Asn Has Alá
130 135 140
Asp ben Ara He Arg Gly Gly Alá Ser Oh a Val Pro Gly Gin Pro Asxx
..Α· 150 155 150
Ile Ser Lep G l y Asx·; Gly His Gly Thr his Val Alá G1 y Thr lle Aj. a.
1 05 170 175
Ála Len Len Ásr Sár lle Gly Val Len Gly Val Ála Vre Asn Val ÁSD
ISO 135 ISO
Λ.-'ϊ- '2 :'·,': Gly Ve 1 Lys Val Lan! Gly Ála Sex: Gly Ser Gly Ser lle Sex:
105 200 205
G1 y 1 le .Álé Gin Gly Lan G χ n Trp Alá Ála ÁSn Arxi Gly Mer Pia He
210 215 220
Ál a Len Vet S e χ Lee. Gly Sár Ser Ál 3 Gly Sex: Alii Thr Líeb Gin Gin
.·:' Z Ű 230 235 240
Alá Val Asn G.Lxí Ála Thr Ála Sex- Gly Val Len Vei Val Ála Alá Sex:
045 030 255
Gly Ás n Sex· Gly Alá bi y A sxx VaS. G: x. y The Pro Ála A rxj Tyx: A.L a Asn
050 265 270
Λ1 a Met Ál a Val Gly Ála Thr Asp Gin Ara Ám A,«π. Árg áj. a S οχ- Phe
275 050 285
Se:r G1 n Tyr Oly Alá Gly L.en Asp Tla Vei. Alá Pro Gly Val Gly Val
ISO 2 05 300
Gin Ser ?ÁX' Va 1 Őre Gly Asn Gly Tyr Alá Ser One A.sx> V Thr Ser
305 510 315 320
híÁ Alá Thr Őre 5 Is Val Alá Gly Va ·. Ara Ála Len Val Lya Gin Lys
005 300 335
Á.sn Orn Ser Trp Sex· Asn Val Gin X la Arg Asn;. His Lex: Lya Asn Thr
05 0 345 350
Alá ! Οχ- Asn Taxi ty Asn Thx Thr Glx; Lha Gly Sex- Gly Len Val A ex:
555 350 305
Ai a Ο La aj. e Ál a Thr Ars
070
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (40)

1. Szuhtilizin aminosavszekvenciája a azonos.
típusú. alkaiikus proteóz, melynek
2. számon megadott aminosav szekvenciával
2. Szubtilizín aminosavszekvenciája a 2 alkaiikus proteáz, .számon megadott aminosav s melynek
ÍGó-374-ig terjedő szakaszával azonos.
3. Szubtilizín típusú alkaiikus proteáz, mely olyan nukleotidszekveneíából származik, mely az 1. számon megadott nukleotid szekvenciával azonos.
4. Szuhtilizm típusú alkaiikus proteáz, mely olyan nukleotidszekvenciáből vezethető le, mely a 2. számon megadott szekvencia 106-374. helyzeteiben megadottakkal azonos.
5. Szuhtilizm típusú alkaiikus proteáz, mely az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti proteázból fragmentálásssl vagy deléciős mutagenézissel vezethető le, és legalább 260, már a kiindulási molekulával összefüggő, a kiindulási arninosavszekvenciában jelenlévő aminosavat tartalmaz.
pótlólag bármelyike szerinti fehérje, melyhez ΰ vegyüietet kapcsoltunk az oldallánc átalakításával, öiíunkciós kémiai vegyület és/vagy makromolekulák kovalens kapcsolásával, és/vagy társult kísérő anyaggal származékot képeztünk belőle.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, melyet pótlólag stabilizáltunk, különösen polimer kapcsolásával és/vagy pontmu rációval.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, mely természetes forrásból, különösen mikroorganizmusból nyerhető.
9. A 8. igénypont szerinti fehérje, mely esetében a. mikroorganizmus Gram -pozitív baktérium.
10. A 9. igénypont szerinti fehérje, mely esetében a Gram-pozitív baktérium egy Bacillus.
11. A 10. igénypont szerinti fehérje, mely esetében a Bacillus faj a. következő lehet: Bacillus sp, különösen a BaeiSns sp, (DSM 14392) .
12. Sznbtiliztn típusú alkalikus proteázt kódoló nukleinsav, melynek szekvenciája az 1. számon megadott nukleotid szekvenciával azonos.
13. Szubfilizin típusú alkalikus proteázt kódoló nukleinsav, melynek szekvenciája az 1. számon megadott nukleotid szekvenciával az 1. szekvencia 316-1125 helyzeteinek megfelelő területen azonos.
14. Nukleinsav, mely az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét kódolja..
15. A 12 - 14. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav, mely természetes forrásból származik, különösen .mikroorganizmusból nyerhető.
lő. A 15. igénypont szerinti nukleinsav. mely esetében a mikroorganizmus Gram-pozitív baktérium.
17. A 16. igénypont szerinti nukleinsav. mely esetében a Grampozitív baktérium Bacillus.
18. A 17. igénypont szerinti nukleinsav, mely esetében, a. Bacillus faj a kővetkező lehet: BoeOZus sp, különösen a Bndfius sp. (DSM 14392).
19. Vektor, mely a 12-18. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav területet tartalmazza, különösen az, mely az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét kódolja..
20. A. 19. igénypont szerinti klónozó vektor,
21. A 19. igénypont szerinti expressziős vektor.
22. Sejt, mely a 12-18. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav területet tartalmazza, különösen az, mely az 1-11, igény421.
bármelyike szerinti fehérjét kódolja, előnyösen a igénypontok bármelyike szerinti vektoron.
'
23. Gazdasejt, mely az 1-1 i. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét kifejezi, vagy ezek kifejezését szabályozza, különösen a 12-18. igénypontok bármelyike szerint megnevezett nukleinsav terület bevitele után, különösen, a 21. igénypont szerinti expresszlós vektor bejuttatását követően.
24. A 23. igénypont szerinti .gazdasejt, mely baktérium, nősen, mely képes a felépített fehérjét a környezetbe kiválasztani.
25. A 24. igénypont szerinti baktérium., mely Gramkúlönösen BaciUus, elsődlegesen a kővetkező fajok, közül választható: Bacá/as lantos, Sucdtos Bocífíws amí/Wájue/aciens,
Bocátos subtöís vagy Baaí/us afcalöptotos.
26, A 22. vagy 23. igénypont szerinti sejt, mely eukarióta, különösen az, mely képes a fehérje transzlációt kővető módosítására,
27, Az 1-11, igénypontok bármelyike szerint megnevezett, fehérje előállítási eljárása, melynek során a 12-18. igénypontok bármelyike szerinti nuklein savat, és/vagy a 19-21. igénypontok bármelyike szerinti vektort és/vagy a 22-26. igénypontok bármelyike- szerinti sejtet
8. Szer, mely az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti
29. Mosó- és tisztító-szer, mely az 1-11, igénypontok bármelyike
30. A. 29. igénypont szerinti szer, mely grammonként a fehérjét 2 pg - 160 mg, előnyösen 5 pg - 140 mg, különösen előnyösen 20 pg 120 mg, előnyösebben S0 pg - 80 mg mennyiségben tartalmazza.
31. A 29. vagy a 30. igénypont szerinti szer, mely további .enzimet, főleg más proteázt, amilázt, cellulázt, hemicellulázt. oxireduktázt és/ vagy lípázt. tartalmaz.
32. Szer textil nyersanyagok kezeléséhez, vagy textíliák ápolásához, mely magában vagy más aktív alkotórészekkel együtt az 1-11. igénypontok bármelyike -szerinti fehérjét tartalmazza, különösen termé szetes alapú, rostokhoz, vagy a textíliákhoz, úgymint gyapjúhoz vagy
33. Eljárás textíliák vagy szilárd felületek gépi tisztításához, azzal re, hogy legalább az egyik eljárási lépésben az 1-11.
igénypontok bármelyike szerinti fehérjét alkalmanként 40 pg - 32 mg, előnyösen 50 pg - 24 mg, különösen 100 pg - 16 g, előnyösen 200 pg 8 mg mennyiségben tartalmazza.
34. Eljárás textil nyersanyagok kezeléséhez vagy textíliák >z„ azzal jellemezve, hogy legalább az egyik eljárási az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti fehérje aktív, különösen természetes alapú rostokhoz, vagy a textíliákhoz, úgymint gyapjúhoz vagy selyemhez.
35. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti proteolítikusan aktív fehérje alkalmazása textíliák vagy szilárd felületek tisztításához, különösen alkalmanként 40 pg - 32 mg, előnyösen 50 pg - 24 mg, előnyösebben 1ÖÖ pg - 16 mg, különösen előnyösen 200 pg - 8 mg
36. Az 1-11.. igénypontok, bármelyike szerinti fehérje alkalmazása a mosó- és tisztítószerek alkotórészeinek aktiválásához vagy
37. Az 1-11. Igénypontok bármelyike szerinti fehérje alkalmazása eíai analízisben vasrv kis molekulatómeaü vesvületek vaev fehériék
38. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti fehérje alkalmazása természetes anyagok vagy biológiailag értékes anyagok előállításához, oz vagy
39. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti fehérje alkalmazása a természetes nyersanyagok kezeléséhez, különösen felszíni kezeléséhez, elsődlegesen a. bórfeldolgozásí eljárásokban.
40. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti fehérje alkalmazása a nyersanyagok vagy a textíliák előállításában a közti termékek nyerésében vagy kezelésében, a szövetek védőrétegeinek eltávolítása érdekében.
41, Az 1-11.. igénypontok bármelyike szerinti fehérje alkalmazása a textil nyersanyagok kezeléséhez vagy' a textíliák ápolásához, különösen a gyapjú vagy a selyem vagy a selymet tartalmazó kevert
42, Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti fehérje alkalmazása fotófilmek kezeléséhez, különösen a zselatint tartalmazó- vagy hasonló védőrétegek eltávolítására.
43. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti fehérje -alkalmazása élelmiszerek vagy takarmányok előállításához.
HU0500286A 2001-12-22 2002-12-12 Novel alkaline protease from bacillus sp. (dsm 14392) and washing and cleaning products comprising said novel alkaline protease HU228735B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10163884A DE10163884A1 (de) 2001-12-22 2001-12-22 Neue Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14392) und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease
PCT/EP2002/014132 WO2003055974A2 (de) 2001-12-22 2002-12-12 Neue alkalische protease aus bacillus sp. (dsm 14392) und wasch- und reinigungsmittel enthaltend diese neue alkalische protease

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0500286A2 HUP0500286A2 (hu) 2005-06-28
HUP0500286A3 HUP0500286A3 (en) 2010-03-29
HU228735B1 true HU228735B1 (en) 2013-05-28

Family

ID=7710814

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0500286A HU228735B1 (en) 2001-12-22 2002-12-12 Novel alkaline protease from bacillus sp. (dsm 14392) and washing and cleaning products comprising said novel alkaline protease

Country Status (12)

Country Link
US (1) US7569226B2 (hu)
EP (1) EP1456368B1 (hu)
JP (1) JP4495967B2 (hu)
CN (1) CN1608129B (hu)
AT (1) ATE543903T1 (hu)
AU (1) AU2002361402A1 (hu)
DE (1) DE10163884A1 (hu)
DK (1) DK1456368T3 (hu)
ES (1) ES2381539T3 (hu)
HK (1) HK1071766A1 (hu)
HU (1) HU228735B1 (hu)
WO (1) WO2003055974A2 (hu)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10162727A1 (de) * 2001-12-20 2003-07-10 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14391) und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease
US7448556B2 (en) 2002-08-16 2008-11-11 Henkel Kgaa Dispenser bottle for at least two active fluids
DE10257387A1 (de) 2002-12-06 2004-06-24 Henkel Kgaa Mehrkomponenten-Flüssigwaschmittel
DE10260930A1 (de) * 2002-12-20 2004-07-15 Henkel Kgaa Neue Cholinoxidasen
DE10260903A1 (de) * 2002-12-20 2004-07-08 Henkel Kgaa Neue Perhydrolasen
DE10304066B4 (de) * 2003-01-31 2007-01-18 Henkel Kgaa Verfahren zur Veredelung konzentrierter Enzymlösungen
DE10309557A1 (de) * 2003-03-04 2004-09-23 Henkel Kgaa Ein Translokationsenzym als Selektionsmarker
DE10360841A1 (de) * 2003-12-20 2005-07-14 Henkel Kgaa Helle, stabile, staub- und geruchsarme Enzymgranulate
DE10360805A1 (de) 2003-12-23 2005-07-28 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neue Alkalische Protease
EP1725246A4 (en) * 2004-01-30 2009-07-15 E L Management Corp COMPOSITIONS WITH INTERNAL ACTIVATED ANTIOXIDANE
DE102004007860A1 (de) * 2004-02-17 2005-09-15 Henkel Kgaa Spenderflasche für Flüssigwaschmittel, die aus mindestens zwei Teilzusammensetzungen bestehen
DE102004019751A1 (de) * 2004-04-23 2005-11-17 Henkel Kgaa Neue Alkalische Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Alkalischen Proteasen
DE102004048591A1 (de) * 2004-04-27 2005-11-24 Henkel Kgaa Reinigungsmittel mit Klarspültensid und einer speziellen α-Amylase
DE102004048590A1 (de) * 2004-04-27 2005-11-24 Henkel Kgaa Reinigungsmittel mit Klarspül-Sulfopolymer und einer speziellen α-Amylase
DE102004021384A1 (de) * 2004-04-30 2005-11-24 Henkel Kgaa Verfahren zur Herstellung von Granulaten mit verbesserter Lagerstabilität und Abriebfestigkeit
DE102004029475A1 (de) * 2004-06-18 2006-01-26 Henkel Kgaa Neues enzymatisches Bleichsystem
JP5051680B2 (ja) * 2004-08-09 2012-10-17 ナノミストテクノロジーズ株式会社 石油の分離方法と分離装置
DE102004047777B4 (de) 2004-10-01 2018-05-09 Basf Se Alpha-Amylase-Varianten mit erhöhter Lösungsmittelstabilität, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung
DE102004047776B4 (de) 2004-10-01 2018-05-09 Basf Se Gegen Di- und/oder Multimerisierung stabilisierte Alpha-Amylase-Varianten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung
DE102005053529A1 (de) 2005-11-08 2007-06-21 Henkel Kgaa System zur enzymatischen Generierung von Wasserstoffperoxid
DE102006038448A1 (de) 2005-12-28 2008-02-21 Henkel Kgaa Enzym-haltiges Reinigungsmittel
DE102006018780A1 (de) * 2006-04-20 2007-10-25 Henkel Kgaa Granulat eines sensitiven Wasch- oder Reinigungsmittelinhaltsstoffs
DE102006022224A1 (de) * 2006-05-11 2007-11-15 Henkel Kgaa Subtilisin aus Bacillus pumilus und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend dieses neue Subtilisin
DE102006055669A1 (de) 2006-11-23 2008-07-17 Henkel Kgaa Enzymzubereitung mit trägergebundenen Antioxidationsmitteln
DE102007003143A1 (de) 2007-01-16 2008-07-17 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease
DE102007008655A1 (de) 2007-02-20 2008-08-21 Henkel Ag & Co. Kgaa Siderophor-Metall-Komplexe als Bleichkatalysatoren
DE102007010785A1 (de) * 2007-03-02 2008-09-04 Henkel Ag & Co. Kgaa Verwendung von Superoxid-Dismutasen in Wasch- und Reinigungsmitteln
DE102007017657A1 (de) 2007-04-12 2008-10-16 Henkel Ag & Co. Kgaa Tris/heterocyclyl)-Metallkomplexe als Bleichkatalysatoren
DE102007017656A1 (de) 2007-04-12 2008-10-16 Henkel Ag & Co. Kgaa Biheteroaryl-Metallkomplexe als Bleichkatalysatoren
DE102007017654A1 (de) 2007-04-12 2008-10-16 Henkel Ag & Co. Kgaa Bis(hydroxychinolin)-Metallkomplexe als Bleichkatalysatoren
DE102007032111B4 (de) 2007-07-09 2017-07-20 Henkel Ag & Co. Kgaa Neue Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese Proteasen
DE102007033104A1 (de) 2007-07-13 2009-01-15 Henkel Ag & Co. Kgaa Mittel enthaltend Proteasen aus Stenotrophomonas maltophilia
DE102007036756A1 (de) 2007-08-03 2009-02-05 Henkel Ag & Co. Kgaa Neue Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Proteasen
DE102007038031A1 (de) 2007-08-10 2009-06-04 Henkel Ag & Co. Kgaa Mittel enthaltend Proteasen
DE102007040326A1 (de) 2007-08-24 2009-02-26 Henkel Ag & Co. Kgaa Wäschevorbehandlungsmittel und -verfahren
DE102007049830A1 (de) 2007-10-16 2009-04-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Neue Proteinvarianten durch zirkulare Permutation
DE102007051092A1 (de) 2007-10-24 2009-04-30 Henkel Ag & Co. Kgaa Subtilisin aus Becillus pumilus und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend dieses neue Subtilisin
DE102008017103A1 (de) 2008-04-02 2009-10-08 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend Proteasen aus Xanthomonas
DE102008027375A1 (de) 2008-06-09 2009-12-10 Henkel Ag & Co. Kgaa Bacitracin-Metall-Komplexe als Bleichkatalysatoren
US8969283B2 (en) * 2009-02-05 2015-03-03 American Sterilizer Company Low odor, hard surface sporicides and chemical decontaminants
DE102009033248A1 (de) 2009-07-14 2010-05-06 Henkel Ag & Co. Kgaa Waschmittel für die Niedrigtemperaturwäsche von hochfunktionellen Materialien
CN102277245B (zh) * 2011-07-14 2012-11-28 北京赛富威环境工程技术有限公司 生物可降解型玻璃清洗液制品
WO2014200656A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces umbrinus
WO2014200658A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis
WO2014200657A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Danisco Us Inc. Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis
US20160130571A1 (en) 2013-06-17 2016-05-12 Danisco Us Inc. Alpha-Amylase from Bacillaceae Family Member
EP3060659B1 (en) 2013-10-03 2019-05-29 Danisco US Inc. Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof
EP3052622B1 (en) 2013-10-03 2018-09-19 Danisco US Inc. Alpha-amylases from a subset of exiguobacterium, and methods of use, thereof
CN105960456A (zh) 2013-11-20 2016-09-21 丹尼斯科美国公司 对蛋白酶裂解敏感性降低的变体α-淀粉酶及其使用方法
DK3080262T3 (da) 2013-12-13 2019-05-06 Danisco Us Inc Serinproteaser af bacillus-arter
JP6487637B2 (ja) * 2014-06-06 2019-03-20 森永乳業株式会社 食肉改質用処理液、及び該食肉改質用処理液を用いた加工肉又は食肉加工品の製造方法、並びに加工肉又は食肉加工品
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
DE102014224825A1 (de) * 2014-12-04 2016-06-09 Henkel Ag & Co. Kgaa Proteasevarianten mit verbesserter Waschleistung
CN105176951B (zh) * 2015-09-04 2018-07-17 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种新型碱性蛋白酶突变体
DE102015223270A1 (de) * 2015-11-25 2017-06-01 Henkel Ag & Co. Kgaa Proteasevarianten mit verbesserter Enzymstabilität in Wasch- und Reinigungsmitteln
WO2017173190A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
WO2017173324A2 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylases, compositions & methods
JP2019524960A (ja) 2016-08-08 2019-09-05 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 液体洗濯製剤
CN110023475A (zh) 2016-12-01 2019-07-16 巴斯夫欧洲公司 酶在组合物中的稳定化
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
CA3083390A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Basf Se Storage-stable enzyme preparations, their production and use
CN112368375A (zh) 2018-04-26 2021-02-12 巴斯夫欧洲公司 脂肪酶
WO2019211143A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Basf Se Amylase enzymes
WO2019238761A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Basf Se Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes
WO2020030623A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Basf Se Packaging unit comprising a detergent composition containing an enzyme and at least one chelating agent
US20220112479A1 (en) 2018-10-05 2022-04-14 Basf Se Compounds stabilizing amylases in liquids
EP3677676A1 (en) 2019-01-03 2020-07-08 Basf Se Compounds stabilizing amylases in liquids
CN112840021A (zh) 2018-10-05 2021-05-25 巴斯夫欧洲公司 在液体中稳定水解酶的化合物
EP3861116A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Basf Se Compounds stabilizing hydrolases in liquids
WO2020104231A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Basf Se Powders and granules containing a chelating agent and an enzyme
WO2020169564A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Basf Se Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and trace element feed
EP3927837A1 (en) 2019-02-20 2021-12-29 Basf Se Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and magnesium feed
CN113748192B (zh) 2019-04-12 2023-08-29 埃科莱布美国股份有限公司 抗微生物多用途清洁剂及其制备和使用方法
WO2020229480A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Basf Se Compounds stabilizing hydrolases in liquids
US20220275355A1 (en) 2019-06-13 2022-09-01 Basf Se Method of Recovering a Protein from Fermentation Broth Using a Divalent Cation
JP2022538360A (ja) 2019-07-01 2022-09-01 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 酵素を安定化するためのペプチドアセタール
WO2021001297A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 Basf Se Method for preparing a fermentation medium
CN114096677A (zh) 2019-07-05 2022-02-25 巴斯夫欧洲公司 使用补料分批预培养的微生物细胞工业发酵方法
BR112022006082A2 (pt) 2019-10-18 2022-06-21 Basf Se Preparação enzimática, formulação de detergente, e, uso de pelo menos um diol
WO2021105336A1 (en) 2019-11-29 2021-06-03 Basf Se Compositions comprising polymer and enzyme
WO2021115912A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 Basf Se Formulations comprising a hydrophobically modified polyethyleneimine and one or more enzymes
JP2023513377A (ja) 2020-02-14 2023-03-30 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア マンナナーゼバリアント
WO2021254824A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 Basf Se Compositions and their use
JP2023537833A (ja) 2020-07-09 2023-09-06 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 組成物及びその用途
WO2022008732A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Basf Se Enhancing the activity of antimicrobial preservatives
BR112023005106A2 (pt) 2020-09-22 2023-04-18 Basf Se Composição líquida, formulação de detergente líquida, e, usos de pelo menos um diol (exceto 1,2-proanodiol) e das formulações de detergente
WO2022083949A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Basf Se Compositions and their use
EP4015629A1 (en) 2020-12-18 2022-06-22 Basf Se Polymer mixtures for increasing stability and performance of hydrolase-containing detergents
WO2023061827A1 (en) 2021-10-13 2023-04-20 Basf Se Compositions comprising polymers, polymers, and their use
WO2023066741A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Basf Se Phosphate-free composition and methods for their manufacture and use
WO2023088776A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Basf Se Compositions comprising polymers, polymers, and their use
WO2023088761A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Basf Se Compositions comprising polymers, polymers, and their use
WO2023088777A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Basf Se Compositions comprising polymers, polymers, and their use
WO2023114794A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 The Procter & Gamble Company Fabric and home care composition comprising a protease
US20230265358A1 (en) 2021-12-16 2023-08-24 The Procter & Gamble Company Home care composition comprising an amylase
WO2023114795A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing composition comprising a protease
WO2023114793A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 The Procter & Gamble Company Home care composition
WO2023110599A2 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Basf Se Compositions and their applications
WO2023148086A1 (en) 2022-02-04 2023-08-10 Basf Se Compositions comprising polymers, polymers, and their use
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
WO2024012894A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Basf Se Alkanolamine formates for enzyme stabilization in liquid formulations

Family Cites Families (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1154730A (en) 1965-10-08 1969-06-11 Ici Ltd Improvements in the Laundering of Synthetic Polymeric Textile Materials
GB1234445A (hu) 1967-10-03 1971-06-03
GB1263765A (en) 1969-11-18 1972-02-16 Godo Shusei Kabushika Kaisha A method for the production of protease by cultivating bacteria
US3623957A (en) 1970-01-21 1971-11-30 Baxter Laboratories Inc Preparation of microbial alkaline protease by fermentation with bacillus subtilis, variety licheniformis
CA989557A (en) 1971-10-28 1976-05-25 The Procter And Gamble Company Compositions and process for imparting renewable soil release finish to polyester-containing fabrics
US4116885A (en) 1977-09-23 1978-09-26 The Procter & Gamble Company Anionic surfactant-containing detergent compositions having soil-release properties
BE877435A (fr) 1978-07-04 1980-01-03 Novo Industri As Produit de protease a allergenicite reduite
US4264738A (en) 1979-08-01 1981-04-28 Stepanov Valentin M Process for purification of proteolytic enzymes
DE3067184D1 (en) 1979-11-09 1984-04-26 Procter & Gamble Homogeneous enzyme-containing liquid detergent compositions containing saturated fatty acids
CA1190695A (en) 1981-05-14 1985-07-16 George J. Stockburger Anionic textile treating compositions
EP0080748B1 (en) 1981-11-13 1985-07-10 Unilever N.V. Enzymatic liquid cleaning composition
US4462922A (en) 1981-11-19 1984-07-31 Lever Brothers Company Enzymatic liquid detergent composition
DE3324258A1 (de) 1982-07-09 1984-01-12 Colgate-Palmolive Co., 10022 New York, N.Y. Nichtionogene waschmittelzusammensetzung mit verbesserter schmutzauswaschbarkeit
GB8311314D0 (en) 1983-04-26 1983-06-02 Unilever Plc Aqueous enzyme-containing compositions
IE81141B1 (en) 1983-06-24 2000-04-05 Genencor Int Procaryotic carbonyl hydrolases
DE3413571A1 (de) 1984-04-11 1985-10-24 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verwendung von kristallinen schichtfoermigen natriumsilikaten zur wasserenthaertung und verfahren zur wasserenthaertung
ATE73150T1 (de) 1984-12-21 1992-03-15 Procter & Gamble Blockpolyester und aehnliche verbindungen, verwendbar als verschmutzungsentferner in waschmittelzusammensetzungen.
DE3685768T2 (de) 1985-04-15 1993-01-21 Procter & Gamble Fluessige reinigungsmittel mit einer anionischen oberflaechenaktiven verbindung, einem verstaerker und einem proteolytischen enzym.
US4990452A (en) 1986-02-12 1991-02-05 Genex Corporation Combining mutations for stabilization of subtilisin
US4711730A (en) 1986-04-15 1987-12-08 The Procter & Gamble Company Capped 1,2-propylene terephthalate-polyoxyethylene terephthalate polyesters useful as soil release agents
US4713194A (en) 1986-04-15 1987-12-15 The Procter & Gamble Company Block polyester and like compounds having branched hydrophilic capping groups useful as soil release agents in detergent compositions
IE65767B1 (en) 1986-04-30 1995-11-15 Genencor Int Non-human carbonyl hydrolase mutants DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors
GB8617255D0 (en) 1986-07-15 1986-08-20 Procter & Gamble Ltd Laundry compositions
GB8629936D0 (en) 1986-12-15 1987-01-28 Procter & Gamble Laundry compositions
US4721580A (en) 1987-01-07 1988-01-26 The Procter & Gamble Company Anionic end-capped oligomeric esters as soil release agents in detergent compositions
ES2135386T3 (es) 1987-02-27 1999-11-01 Genencor Int Transformacion de cepas de bacillus alcalofilas.
EP0916732B1 (en) 1987-04-06 2007-08-22 Novozymes A/S The engineering of electronic interactions at metal ion binding sites for the stabilization of proteins
US4914031A (en) 1987-04-10 1990-04-03 Amgen, Inc. Subtilisin analogs
PT89702B (pt) 1988-02-11 1994-04-29 Gist Brocades Nv Processo para a preparacao de novos enzimas proteoliticos e de detergentes que os contem
US5116741A (en) 1988-04-12 1992-05-26 Genex Corporation Biosynthetic uses of thermostable proteases
US5543302A (en) 1988-05-27 1996-08-06 Solvay Enzymes, Inc. Proteases of altered stability to autolytic degradation
ATE134669T1 (de) 1988-08-26 1996-03-15 Procter & Gamble Schmutzabweisende mittel mit von allylgruppen abgeleiteten sulphonierten endgruppen
GB8900525D0 (en) 1989-01-10 1989-03-08 Procter & Gamble Liquid detergent composition containing enzyme and enzyme stabilization system
GB8900496D0 (en) 1989-01-10 1989-03-08 Procter & Gamble Liquid detergent composition containing enzyme and enzyme stabilization system
DK316989D0 (da) 1989-06-26 1989-06-26 Novo Nordisk As Enzymer
EP0405901B1 (en) 1989-06-26 2004-09-01 Unilever Plc Enzymatic detergent compositions
US5665587A (en) 1989-06-26 1997-09-09 Novo Nordisk A/S Modified subtilisins and detergent compositions containing same
WO1991002792A1 (en) 1989-08-25 1991-03-07 Henkel Research Corporation Alkaline proteolytic enzyme and method of production
DE4013142C2 (de) 1990-04-25 1998-08-27 Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg Verfahren zur gezielten Veränderung der Eigenschaften von Enzymen durch chemische Modifizierung und chemisch modifizierte Enzyme
IT1249883B (it) 1990-08-13 1995-03-30 Ferruzzi Ricerca & Tec Agenti sequestranti del calcio a base di carboidrati ossidati e loro impiego come builder per detergenti
CA2049097A1 (en) 1990-08-15 1992-02-16 Thomas Weber Anionic-rich, high ph liquid detergent compositions containing subtilisin mutants
US5230891A (en) * 1990-08-20 1993-07-27 Kanebo Limited Modified protease, method of producing the same and cosmetic products containing the modified protease
MY107664A (en) 1991-01-17 1996-05-30 Kao Corp Novel alkaline proteinase and process for producing the same
DE69212390T2 (de) 1991-05-01 1997-01-09 Unilever Nv Stabilisierte Enzyme enthaltende Waschmittelzusammensetzungen
EP0583339B1 (en) 1991-05-01 1998-07-08 Novo Nordisk A/S Stabilized enzymes and detergent compositions
US5122258A (en) 1991-05-16 1992-06-16 Exxon Research And Engineering Company Increasing VI of lube oil by hydrotreating using bulk Ni/Mn/Mo or Ni/Cr/Mo sulfide catalysts prepared from ligated metal complexes
US5340735A (en) 1991-05-29 1994-08-23 Cognis, Inc. Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability
TW198159B (hu) * 1991-05-31 1993-01-11 Philips Gloeicampenfabrieken Nv
EP0525610A3 (en) 1991-07-27 1993-03-24 Solvay Enzymes Gmbh & Co. Kg Process for increasing the stability of enzymes and stabilized enzymes
DE69126778T2 (de) 1991-07-31 1998-01-02 Ausimont Spa Verfahren zur Erhöhung der Bleichwirksamkeit eines inorganischen Persalzes
WO1993004156A1 (en) 1991-08-19 1993-03-04 Novo Nordisk A/S Detergent enzymes
GB9119936D0 (en) 1991-09-17 1991-10-30 Unilever Plc Aqueous liquid cleaning compositions
US5275945A (en) * 1991-10-08 1994-01-04 Vista Chemical Company Alkaline proteases stable in heavy-duty detergent liquids
EP0587550B1 (en) 1992-07-15 1998-12-09 The Procter & Gamble Company Surfactant containing dye transfer inhibiting compositions
EP0581751B1 (en) 1992-07-15 1998-12-09 The Procter & Gamble Company Enzymatic detergent compositions inhibiting dye transfer
ATE161045T1 (de) 1992-08-14 1997-12-15 Genencor Int Gmbh Neue enzymgranulate
DE69217934T2 (de) 1992-08-14 1997-09-04 Procter & Gamble Peptidaldehydhaltige flüssige Waschmittel
DK39093D0 (da) 1993-04-01 1993-04-01 Novo Nordisk As Enzym
DK52393D0 (hu) * 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
ZA943640B (en) 1993-06-07 1995-01-26 Buckman Labor Inc Synergistically stabilized liquid enzymatic compositions
US5830837A (en) * 1994-11-22 1998-11-03 Novo Nordisk A/S Amylase variants
DE4344215A1 (de) 1993-12-23 1995-06-29 Cognis Bio Umwelt Silberkorrosionsschutzmittelhaltige Enzymzubereitung
ES2364774T3 (es) 1994-02-24 2011-09-14 HENKEL AG &amp; CO. KGAA Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen.
ATE390487T1 (de) 1994-02-24 2008-04-15 Henkel Kgaa Verbesserte enzyme und diese enthaltene detergentien
US5691295A (en) 1995-01-17 1997-11-25 Cognis Gesellschaft Fuer Biotechnologie Mbh Detergent compositions
WO1995026398A1 (en) 1994-03-28 1995-10-05 Novo Nordisk A/S A modified cellulase and an enzyme preparation comprising a modified cellulase
US6110884A (en) 1994-03-29 2000-08-29 Novo Nordisk A/S Protease variants
DE4411223A1 (de) 1994-03-31 1995-10-05 Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg Verwendung alkalischer Proteasen in gewerblichen Textilwaschverfahren
US6599730B1 (en) 1994-05-02 2003-07-29 Procter & Gamble Company Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
DE4426215A1 (de) 1994-07-23 1996-01-25 Merck Patent Gmbh Ketotricyclo [5.2.1.0] decan-Derivate
DE4426216A1 (de) 1994-07-23 1996-01-25 Merck Patent Gmbh Benzyliden-Norcampher-Derivate
EP0791046B1 (en) 1994-11-18 2000-04-05 THE PROCTER &amp; GAMBLE COMPANY Detergent compositions containing lipase and protease
GB9503474D0 (en) 1995-02-22 1995-04-12 Ciba Geigy Ag Compounds and their use
EP0731058B1 (de) 1995-03-06 2000-07-26 Clariant GmbH Kristallines Natriumschichtsilikat
US5587356A (en) 1995-04-03 1996-12-24 The Procter & Gamble Company Thickened, highly aqueous, cost effective liquid detergent compositions
DE19519339A1 (de) 1995-05-26 1996-11-28 Basf Ag Wasserlösliche Copolymerisate, die Vernetzer einpolymerisiert enthalten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US5700686A (en) 1995-06-06 1997-12-23 Iogen Corporation Protease-treated and purified cellulase compositions and methods for reducing backstaining during enzymatic stonewashing
CA2222329C (en) 1995-06-13 2007-10-23 Novo Nordisk A/S 4-substituted-phenyl-boronic acids as enzyme stabilizers
US6008178A (en) 1995-07-08 1999-12-28 Procter & Gamble Company Detergent composition comprising cationic ester surfactant and protease enzyme
GB9514090D0 (en) 1995-07-11 1995-09-13 Cerestar Holding Bv Non-catalysed oxidation of maltodextrin with an oxygen containing oxidant
EP0756000A1 (en) 1995-07-24 1997-01-29 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising specific amylase and linear alkyl benzene sulfonate surfactant
DE19530816A1 (de) 1995-08-23 1997-02-27 Cognis Bio Umwelt Verwendung von mutierter Subtilisin-Protease in kosmetischen Produkten
WO1997009446A1 (en) 1995-09-07 1997-03-13 Novo Nordisk A/S Phage display for detergent enzyme activity
US5858952A (en) 1995-12-22 1999-01-12 Kao Corporation Enzyme-containing granulated product method of preparation and compositions containing the granulated product
DE19600018A1 (de) 1996-01-03 1997-07-10 Henkel Kgaa Waschmittel mit bestimmten oxidierten Oligosacchariden
FR2745014B1 (fr) 1996-02-20 1998-04-03 Rhone Poulenc Chimie Procede de traitement antisalissure des articles a base de coton tisse
US5703032A (en) 1996-03-06 1997-12-30 Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. Heavy duty liquid detergent composition comprising cellulase stabilization system
US6444473B1 (en) 1996-03-29 2002-09-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Atmospheric ozone concentration detector
DE19616693A1 (de) 1996-04-26 1997-11-06 Henkel Kgaa Enolester als Bleichaktivatoren für Wasch- und Reinigungsmittel
US6121226A (en) 1996-05-03 2000-09-19 The Procter & Gamble Company Compositions comprising cotton soil release polymers and protease enzymes
EP0912683A1 (en) 1996-05-15 1999-05-06 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising specific lipolytic enzyme and alkyl poly glucoside surfactant
ES2188883T3 (es) 1996-07-08 2003-07-01 Ciba Sc Holding Ag Derivados de triazina como filtro uv en productos antisolares.
WO1998013459A1 (en) 1996-09-24 1998-04-02 The Procter & Gamble Company Liquid detergents containing proteolytic enzyme, peptide aldehyde and calcium ions
EP0929636B1 (en) 1996-09-24 2002-12-04 The Procter & Gamble Company Liquid detergents containing proteolytic enzyme, peptide aldehyde and a source of boric acid
DE19643133A1 (de) 1996-10-18 1998-04-23 Basf Ag Verwendung von wasserlöslichen oder in Wasser dispergierbaren vernetzten stickstoffhaltigen Verbindungen in Wasch- und Reinigungsmitteln
ES2246501T3 (es) 1996-11-29 2006-02-16 Basf Aktiengesellschaft Preparados cosmeticos y farmaceuticos que contienen filtros uv-a fotoestables.
US6060441A (en) 1997-04-10 2000-05-09 Henkel Corporation Cleaning compositions having enhanced enzyme activity
DE19732750A1 (de) 1997-07-30 1999-02-04 Henkel Kgaa Glucanasehaltiges Reinigungsmittel für harte Oberflächen
DE19732749A1 (de) 1997-07-30 1999-02-04 Henkel Kgaa Glucanasehaltiges Waschmittel
AU732369B2 (en) 1997-10-07 2001-04-26 Kao Corporation Alkaline protease
JP4246384B2 (ja) 1997-11-21 2009-04-02 ノボザイムス アクティーゼルスカブ プロテアーゼ変異体及び組成物
AU7275598A (en) 1998-05-01 1999-11-23 Procter & Gamble Company, The Fabric care compositions comprising cellulose binding domains
JP2002513823A (ja) 1998-05-01 2002-05-14 エクソンモービル・ケミカル・パテンツ・インク オレフィン重合用の三座配位子含有金属触媒錯体
JP2000004896A (ja) * 1998-06-18 2000-01-11 Taiyo Kagaku Co Ltd 蛋白質の分解方法
BR9911891A (pt) 1998-07-07 2001-03-27 Procter & Gamble Proteases fundidas com variantes de inibidor de subtilisina de streptomyces
US6991922B2 (en) 1998-08-12 2006-01-31 Proteus S.A. Process for in vitro creation of recombinant polynucleotide sequences by oriented ligation
FR2782323B1 (fr) 1998-08-12 2002-01-11 Proteus Procede de production in vitro de sequences polynucleotidiques recombinees, banques de sequences et sequences ainsi obtenues
CN1327478A (zh) 1998-09-30 2001-12-19 宝洁公司 洗衣洗涤剂和/或织物护理组合物
DE19857543A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Henkel Kgaa Verwendung von Protease in flüssigen bis gelförmigen Wasch- und Reinigungsmitteln
KR100660818B1 (ko) 1998-12-18 2006-12-26 노보자임스 에이/에스 활성부위 루프 영역에 추가적 아미노산 잔기를 가지는서브그룹 ｉ-ｓ１과 ｉ-ｓ２의 서브틸라제 효소
DE69940744D1 (de) 1998-12-18 2009-05-28 Novozymes As Subtilase enzyme der i-s2 untergruppe, mit einem zusätzlichen aminosäurenrest in einer aktiven schleifenregion
JP4768128B2 (ja) 1998-12-18 2011-09-07 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 活性部位ループ領域中に追加のアミノ酸残基を有するサブチラーゼ酵素サブグループｉ−ｓ１及びｉ−ｓ２
DE60022111T2 (de) 1999-03-17 2006-06-22 Kao Corporation Waschmittelzusammensetzung
DE19918267A1 (de) 1999-04-22 2000-10-26 Henkel Kgaa Handgeschirrspülmittel mit Mikrokapseln
WO2000071691A1 (en) 1999-05-20 2000-11-30 Novozymes A/S Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 125 and 126
AU4392300A (en) 1999-05-20 2000-12-12 Novozymes A/S Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additionalamino acid residue between positions 130 and 131
JP4334698B2 (ja) * 1999-08-31 2009-09-30 太陽化学株式会社 蛋白酵素分解物
DE19956382A1 (de) 1999-11-24 2001-05-31 Henkel Kgaa Verfahren zur Herstellung von mikroverkapselten Enzymen
DE10019881A1 (de) 2000-04-20 2001-11-15 Gerhard Miksch Verfahren zur Überexpression und extrazellulären Produktion bakterieller Phytasen in Escherichia coli
DE10121463A1 (de) 2001-05-02 2003-02-27 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten
DE10153792A1 (de) 2001-10-31 2003-05-22 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten

Also Published As

Publication number Publication date
EP1456368A2 (de) 2004-09-15
JP2005527193A (ja) 2005-09-15
DE10163884A1 (de) 2003-07-10
ATE543903T1 (de) 2012-02-15
WO2003055974A3 (de) 2004-03-11
HK1071766A1 (en) 2005-07-29
JP4495967B2 (ja) 2010-07-07
EP1456368B1 (de) 2012-02-01
HUP0500286A3 (en) 2010-03-29
WO2003055974A2 (de) 2003-07-10
CN1608129A (zh) 2005-04-20
CN1608129B (zh) 2010-06-16
US20050043198A1 (en) 2005-02-24
HUP0500286A2 (hu) 2005-06-28
ES2381539T3 (es) 2012-05-29
AU2002361402A8 (en) 2003-07-15
DK1456368T3 (da) 2012-05-21
US7569226B2 (en) 2009-08-04
AU2002361402A1 (en) 2003-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228735B1 (en) Novel alkaline protease from bacillus sp. (dsm 14392) and washing and cleaning products comprising said novel alkaline protease
JP4484519B2 (ja) Ｂａｃｉｌｌｕｓｇｉｂｓｏｎｉｉ（ＤＳＭ１４３９３）由来の新規なアルカリ性プロテアーゼならびに該新規なアルカリ性プロテアーゼを含有する洗浄剤および浄化剤
HU225362B1 (en) Novel alkaline protease variants and detergents and cleansers containing these novel alkaline protease variants
JP4444566B2 (ja) 新規なアルカリ性プロテアーゼ変異体ならびに該新規なアルカリ性プロテアーゼ変異体を含有する洗浄剤および清浄剤
JP4505337B2 (ja) 改善されたペルヒドロラーゼ活性を有するスブチリシン変異体
JP2005534280A (ja) Ｂａｃｉｌｌｕｓｇｉｂｓｏｎｉｉ（ＤＳＭ１４３９１）由来の新規なアルカリ性プロテアーゼならびに該新規なアルカリ性プロテアーゼを含有する洗浄剤および浄化剤
JP2005512567A6 (ja) Ｂａｃｉｌｌｕｓｇｉｂｓｏｎｉｉ（ＤＳＭ１４３９３）由来の新規なアルカリ性プロテアーゼならびに該新規なアルカリ性プロテアーゼを含有する洗浄剤および浄化剤
JP2005525794A (ja) Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ（ＤＳＭ１４３９０）由来の新規なアルカリ性プロテアーゼならびに該新規なアルカリ性プロテアーゼを含有する洗浄および浄化製品
EP1737952B1 (de) Neue alkalische proteasen und wasch- und reinigungsmittel, enthaltend diese neuen alkalischen proteasen
JP4652059B2 (ja) 新規なコリンオキシダーゼ
US20090275493A1 (en) Novel Alkaline Protease from Bacillus Gibsonii and Washing and Cleaning Agents containing said Novel Alkaline Protease
JP2007515179A (ja) 新規アルカリプロテアーゼおよび、該新規アルカリプロテアーゼを含有する洗浄および清浄製品
JP2009536630A (ja) バチルス・プミラス由来のサブチリシンおよび該新規なサブチリシンを含む洗浄および清浄剤
DE10064983A1 (de) Neue Alkalische Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233)
DE102006022216A1 (de) Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease

Legal Events

Date Code Title Description
HC9A Change of name, address

Owner name: HENKEL AG & CO. KGAA, DE

Free format text: FORMER OWNER(S): HENKEL KOMMANDITGESELLSCHAFT AUF AKTIEN, DE

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees