HU207448B - Tissue-preparation for transplantation - Google Patents

Description

A leírás terjedelme: 8 oldal (ezen belül 1 lap ábra)

HU 207 448 Β

A találmány tárgya olyan új szövet-készítmény, amely transzplantációhoz alkalmazva tartós, fertőzéssel szemben ellenálló, nem okoz immunreakciót, nem trombogén és - amennyiben érpótlásra alkalmazzuk nyitott és nem eredményez aneurizma kialakulást; ezeknél a tulajdonságainál fogva számos szintetikus transzplantációs anyagnál előnyösebben alkalmazható.

Közelebbről, a találmány olyan új szövet-készítményre és az abból készíthető szövet formált alakra vonatkozik, amely egy melegvérű gerinces állat bélszegmensének submucosa és basilaris mucosa részeit tartalmazza.

A transzplantációs szövet-készítmények alkalmazása manapság jelentős klinikai és gazdasági jelentőségre tett szert. Becslések szerint 1986-ban 130 millió dollárt költöttek csak értranszplantátumokra, nem számítva a koronáriás artéria bypass transzplantátumokat. Ennek ellenére az értranszplantációs eljárások sikeressége a legtöbb sebészeti eljáráshoz képest kicsi. Kis átmérőjű értranszplantátumok esetében például az 5 éven keresztüli 50%-os átjárhatóság kiválónak minősül. Ez a mérsékelt sikeresség nagyrészt a jelenleg klinikailag transzplantációhoz alkalmazott készítmények egy vagy több fizikai vagy működési jellemzőjének hiányosságaiból adódik.

A szövet transzplantátumnak alkalmas anyagok megtalálása rendkívül nehéz, mert ezeknek számos összeegyeztethetetlennek tűnő tulajdonsággal kell rendelkezniük. így például az értranszplantációhoz alkalmazható készítményeknek nemcsak mechanikai stabilitással kell rendelkezniük folyamatos feszültség igénybevétel mellett, hanem a kapillarizálódáshoz megfelelő porozitással, a befogadó szövethez való illeszkedési képességgel és nagy negatív zéta-potenciállal (hogy ne legyenek trombogének) is bírniuk kell. Ezen túlmenően nem okozhatnak allergiát, nem lehetnek rákkeltő hatásúak és előnyösen előállításuknak olcsónak kell lennie.

Igen kevés, sőt talán egyetlenegy transzplantációs szövetkészítmény sem rendelkezik valamennyi kívánt jellemzővel. A szakirodalomban számos kutatási és fejlesztési eljárást leírtak az érrendszeri transzplantátumok vonatkozásában, ami azt jelzi, hogy jelentős kísérletek folynak abból a célból, hogy a jelenleg ismert transzplantációs anyagok hátrányos tulajdonságait kiküszöböljék.

Érrendszeri transzplantátum céljára szintetikus és testben keletkezett anyagokat egyaránt alkalmaznak. Az alkalmazott szintetikus anyagok közül például az expandált poli-tetrafluor-etilén (PTFE) szokásosan alkalmazott érrendszeri transzplantációs anyag, különösen kisméretű erek bypass sebészetben. Azonban az expandált PIHE transzplantátumok hajlamosak érbelhártya hiperplasia kifejlődésre és késői beültetett szövet trombózis kialakulásra (például a comb- térdhajlati bypass esetében a 6 éves nyitottság mértéke kb. 50%). Leírták, hogy a PTFE beültetések ennél még nagyobb sikertelenséget mutatnak abban az esetben, ha vénás erekben alkalmazzák őket.

Egy másik szintetikus anyagot, a Dacron®-t gyakran alkalmazzák nagy átmérőjű érrendszeri transzplantációs eljárásokban (például infrarenalis aorta átültetések). A kötött Dacron® azonban viszonylag nagy porozitású és ennélfogva előzetesen tömöríteni kell a beültetés előtt, hogy a túlzott haemorrhagia elkerülhető legyen. Ez a tömörítési eljárás gyakran nem praktikus és nem is sikeres. A szőtt Dacron® ugyan kevésbé porózus, a normál aortában tapasztalható illeszkedésnek azonban csak 20%-ára képes. Végül a Dacron® beültetések kis átmérőjű artériákban vagy vénákban nem jól alkalmazhatók, mert ezekben a véráram sebessége viszonylag kicsi.

A szintetikus szövettranszplantátumok egyik jelentős hátránya, hogy ezek a szintetikus anyagok fertőzéssel szemben kis rezisztenciát mutatnak. A szintetikus beültetett szövet fertőzése a beültetés után 66%-os elhalálozási aránnyal jár együtt. A szintetikus anyagok hajlamosak befogadni a mikroorganizmusokat a hézagjaikba, és amikor megfertőződtek, az antibaktérium terápiával szemben rendkívül ellenállóak. A fertőzött szintetikus transzplantátumok kioperálása gyakorlatilag elkerülhetetlen.

Az utóbbi években a kutatók leírtak szintetikus bőrés éredény ekvivalens anyagokat, amelyek élő emberi sejteket alkalmaznak (a 4604346, a 4546500, a 4539716, a 4485097 és a 4485096 számú USA-beli szabadalmi leírások).

Az autogén anyagok közül ilyen célra a saphena vénát, az emberi köldökvénát, az invertált vékonybelet és az alkari artériát alkalmazták, azonban valamennyi jelentős hátrányokkal rendelkezett. A saphena véna bizonyos eljárásokban nem megfelelő méretű lehet vagy betegség következtében roncsolódás miatt nem áll rendelkezésre. Ezen túlmenően a saphena véna elfogadhatatlan visszértágulást tartalmazhat, és artériaként beépítve gyorsított aterogenezis léphet fel. Mind az átültetett köldökvénában, mind az invertált vékonybélben korai trombózis és késő aneurizma alakulhat ki, végül az alkari verőér alkalmazása limitált, mivel igen nehéz beszerezni, valamint a beültetés után roncsolódhat.

A 3 562820 számú USA-beli szabadalmi leírásban olyan biológiai alapú szövetprotézist ismertetnek, amely különböző élő szervek pótlására, károsodásaik kijavítására vagy megerősítésükre szolgál. Az ismertetett szövetprotézis legalább két rétegű, és természetes szövetből (általában submucosa-ból) álló, valamint kollagén szálakból készített „kötő” rétegek váltakozásából épül fel; előállítása során a szövetrétegeket kollagén szálakkal egymásra ragasztják.

Kutyabél submucosa-jából nyert transzplantátumot is megkíséreltek érpótlásra alkalmazni [Am. J. Surg., 122, 517, (1971)]. A transzplantátum, amelyet úgy állítottak elő, hogy a bél submucosa rétegéből eltávolították a mucosa-t és a muscularis-t, kutyák mellkasi aortájába ültetve aneurizma fellépése miatt, a hasi véna cava-ba ültetve trombózisképződés miatt alkalmatlan volt érpótlásra, és csupán a mellkasi véna cava-ba ültetve bizonyult használhatónak.

Később is folytattak kísérleteket a hasi véna cava és aorta vékonybélből nyert submucosa-val való helyettesítésére [Acta Med. Okayama, 22,153-165, (1986)]. A

HU 207 448 Β kísérletekben kutya vékonybélből nyert submucosa-t (beleértve a hozzá csatlakozó izomréteget is), illetve ugyanilyen eredetű, a mucosa réteget nem tartalmazó szegmenst alkalmaztak érpótlóként; ezeket a kivágott béldarabok kifordításával és a mucosa réteg lekaparásával készítették.

Szívburoki - elsősorban marhából származó - szövetből készített és speciális varratokkal összevarrt hengeres érpótlót ismertetnek a 4502159 számú USA-beli szabadalmi leírásban. A szívburoki szövétet a zsír, a rostok és a roncsolt sejtdarabok eltávolítása után teljes egészében felhasználták.

Kutya csípőbél transzplantátumokkal is próbálkoztak már fertőzött kutya aortába való beültetésre [Eur. Surg. Rés., 18, 391, (1986)]. A transzplantátumokat kivágott csípőbél darabokból a mucosa eltávolításával készítették.

Mivel eddig egyik alkalmazott ismert megoldás sem biztosított megfelelő tulajdonságokkal rendelkező, transzplantációhoz alkalmazható szövet-készítményt, találmányunk célkitűzése ilyen készítmény létrehozása volt.

Találmányunk tárgya tehát olyan szövet-készítmény transzplantációhoz, amely a jelenleg klinikailag alkalmazott számos szövet-készítmény hátrányos tulajdonságaitól mentes; a találmány szerinti szövet-készítmény több célra alkalmazható, autotranszplantátumként, allo-transzplantátumként és hetero-transzplantátumként.

A találmány szerinti szövet-készítményt az jellemzi, hogy egy melegvérű gerinces állat bélszegmensének tunica submucosa, a csatlakozó muscularis mucosa rétegét és a tunica mucosa kompakt rétegét tartalmazza.

A találmány szerinti szövet-készítményt kívánt esetben - például értranszplantátumként való felhasználáshoz- szövet formált alakká is alakíthatjuk.

A találmány szerinti szövet-készítményt előnyösen melegvérű gerincesek vékonybeléből készítjük.

Az 1. ábrán bemutatjuk a vékonybél adott szekciójának keresztmetszeti képét.

A találmány szerinti szövet-készítmény elsődlegesen a gerinces melegvérűek vékonybelének egy szegmens tunica submucosa rétegét tartalmazza. A tunica submucosa-t rétegként elválasztjuk a tunica muscularistól és legalább a tunica mucosa luminális részétől a vékonybél adott szakaszában. A találmány szerinti szövet-készítményről bebizonyosodott, hogy kiváló működési jellemzőkkel rendelkezik, mint érrendszeri autogén transzplantátum és érrendszeri allo-transzplantátum, ennélfogva előre látható, hogy ez a találmány szerinti szövet-készítmény széleskörűen alkalmazható mint heterotranszplantátum mind érrendszeri, mind más szövettranszplantációs célokra. Felismertük, hogy a találmány szerinti szövet-készítmény többféle fizikai és biológiai jellemzővel rendelkezik, amely alkalmassá teszi, hogy különösen jól alkalmazható legyen szövettranszplantációs felhasználásokban.

A találmány szerinti előnyös szövet-készítmény a submucosa-t és a basilaris mucosa-t tartalmazza, amelyet a vékonybél egy adott szegmenséről választunk le, előnyösen a jejunum szegmensről; ez a vékonybél azon részlete, amely a nyombél és a csípőbél között helyezkedik el. A vékonybél eredetileg (mielőtt a találmány szerinti rétegelválasztást elvégeznénk, hogy a találmány szerint a szövet-készítményt kinyerjük) számos elkülönült szövetrétegből áll. Az 1. ábrán bemutatjuk a vékonybél keresztmetszeti képét, amelyen megjelöltük az egyes elkülönülő szövetrétegeket, amelyeket A-G jelekkel jelöltünk (kívülről befelé haladva) és ezek együttesen alkotják a vékonybél falát. A legkülső réteg a mezenteriális szövet. A mezenteriális szöveteket külön rétegként csak illusztratív célból jelöltük. Normális esetben ezek a szövetek nem jelentkeznek külön rétegként, hanem inkább mint folytonos szövet szegmensek. A B és C rétegek a tunica serosa és a tunica muscularis, a D réteg a tunica submucosa, amely egy sűrű, rendszertelen, kollagén kötőszövet, ami gyakran számos hízósejtet is tartalmaz. Az ezekből a hízósejtekből származó heparin valószínűleg legalább részben oka annak, hogy az ilyen átültetett szövetekben nem alakul ki korai trombózis.

Az E, F és G rétegek együttesen képezik az úgynevezett tunica mucosa réteget. Az E réteg simaizom sejtekből áll, és ezt mint muscularis mucosa réteget ismerik. Az F réteg, amely a stratum compactum réteg, a sejtmentes kollagén és elasztin szálakból áll. A G réteg a hám nyálkahártyát és ennek hártyáját (epithelialis mucosa és lamina propria) tartalmazza, amelyek együttesen bolyhos alakban elrendezettek a nyálkahártya membránból ujjszerű kinyúlások sorozatának formájában.

A találmány szerinti szövet-készítményt a bélszövet szegmenséből a következőképpen készíthetjük. A hisztológiai vizsgálat szerint a hám nyálkahártyát és ennek hártyáját eltávolítjuk, valamint eltávolítjuk a tunica muscularis és a tunica serosa réteget is. A találmány szerinti előnyös szövet-készítmény ennélfogva a D tunica submucosa réteget, valamint a tunica mucosa réteg alaprétegét (basilaris rétegét), azaz az E muscularis mucosa réteget és az F stratum compactum réteget tartalmazza. Ezeket a rétegeket együttesen a továbbiakban vékonybél submucosa névvel jelöljük („SIS”).

A SIS autogén szövet-készítményt például úgy állíthatjuk elő, hogy először a proximális autogén jejunum egy szegmensét kimetsszük egy középvonali hasbemetszés ejtése után. A kimetszett jejunum szegmenst sebészeti törlőbe burkoljuk, amelyet előzetesen fiziológiás sóoldatban áztatunk. A bél anastomosis befejezése után a kimetszett bél szegmenst az alábbi eljárással feldolgozzuk és transzplantációs szövet-készítménnyé alakítjuk. Hasonlóan allo-transzplantációs szövetkészítményt állítunk elő ugyanolyan fajta donor egyedekből, amelyek szerv/szövet donorok úgy, hogy a bél szövetet eltávolítjuk. Hetero transzplantációs szövetkészítményt állíthatunk elő például macska, sertés vagy marha bélszövetéből, amit elaltatott vágóhídi állatokból nyerünk. A különféle fajták bélszövetei között a mai napig csak igen minimális morfológiai különbségeket mutattak ki; az emberi transzplantációs szövet hisztológiai jellemzői csaknem azonosnak mutatkoztak

HU 207 448 Β a kutya ilyen jellemzőivel. Az egyetlen felismerhető morfológiai különbség az, hogy az emberi szövetben a kompakt réteg (stratum compactum) kevésbé sűrű.

A találmány szerinti transzplantációs szövet-készítményt úgy állítjuk elő, hogy a bélszövetet csiszoljuk, és ennek révén eltávolítjuk a külső rétegeket, beleértve a tunica serosa és a tunica muscularis (B és C réteg az

1. ábrán) rétegeket, és a belső rétegeket, beleértve a tunica mucosa (E-G rétegek az 1. ábrán) legalább üreg felőli (luminalis) részét (G réteg). Gyenge koptatás hatására a tunica mucosa a kompakt réteg (F réteg) és a G réteg lamina propria-ja között válik el. Részletesebben, a bélfodor szövet eltávolítása után, amit például Aswon-Brown-csipesz és Metzenbaum-olló alkalmazásával végzünk, a tunica serosa és a tunica muscularis rétegeket (a külső szövetrétegek) a bélszegmensről koptatással távolítjuk el úgy, hogy egy szikenyél és nedvesített géz segítségével hosszanti törléseket végzünk. A bélszegmens kifordítása után a tunica mucosa üreg felé eső részét az alsó szövettől ugyanilyen dörzsölési mozgással távolítjuk el. Óvatosan kell eljárni, hogy a submucosa réteget ne lyukasszuk ki. Ugyancsak el kell távolítani valamennyi szövetdarabkát, ami az eltávolított rétegekből a szövet-készítmény felületén maradt. Más eljárás szerint a bélszegmenst először kifordíthatjuk, és az üreg felőli rétegeket dörzsölhetjük le, majd eredeti állapotába fordíthatjuk és ekkor a tunica serosa és a tunica muscularis eltávolítását végezhetjük el. A kapott transzplantációs készítmény fehéres, áttetsző cső, amely körülbelül 0,1 mm vastag, és jellemzően a tunica submucosa réteget tartalmazza a csatlakozó muscularis mucosa réteggel és a tunica mucosa kompakt rétegével együtt. Az érrendszeri transzplantátumhoz való alkalmazáshoz a kapott szövet-készítményt eredeti állapotába fordítjuk vissza úgy, hogy a kompakt réteg legyen a beültetett szövet üregi felülete.

Az elkészített transzplantációs szövet-készítményt jellemzően izotóniás sóoldattal átöblítjük és kb. 20 perc időtartamra 10%-os neomicin-szulfát oldatba merítjük, így felhasználásra kész állapotba kerül. A transzplantációs szövet-készítményt általában rutin sebészeti eljárásokban alkalmazzuk, amelyeket szokásosan transzplantációkban használnak. Nem érrendszeri alkalmazás céljából transzplantációs szövet-készítményt, amely csőszerű, hosszanti irányban elvághatjuk, és sík szövetté kiteríthetjük. A fent leírt teljes szövetréíeg eltávolítási eljárást végrehajthatjuk a kiterített bélszövet lapokon is úgy, hogy a bélszegmenst hosszanti irányban elvágjuk és a kiterítésével egy előzetes transzplantációs szövetlemezt készítünk. Az így előállított transzplantációs szövet-készítmény lapokat például mint bőrátültetési anyagokat alkalmazhatjuk vagy más károsodott testszövetek korrigálására használhatjuk, amelyek lehetővé teszik hasonló fizikai és funkcionális jellemzőik miatt a találmány szerinti transzplantációs szövet-készítmény sebészeti alkalmazását.

Érrendszeri transzplantációs anyagként történő felhasználás céljából a találmány szerinti szövet-készítmény körülbelül azonos átmérőjű kell legyen, mint a befogadó ér átmérője. Ezt úgy lehet elérni, hogy a szövet-készítményt meghatározott, a befogadó érrel azonos átmérőjű hengeres formává alakítjuk és összevarrjuk vagy más módon rögzítjük hosszanti irányban. Eljárhatunk úgy, hogy egy steril üvegrudat, amelynek külső átmérője megegyezik a befogadó ér átmérőjével, bevezetünk a szövet-készítmény üregébe. Ezután a felesleges szövetet összehúzzuk és a kívánt üreg átmérőt úgy állítjuk be, hogy a beültetett szövet hosszanti irányában varratot készítünk (például két folytonos varratvonalat vagy egy megszakított varratvonalat előállítva) vagy más, szakirodalomban Ismert szövet rögzítő technológiát alkalmazunk.

A találmány célkitűzésének megfelelően, az SIS formált alak igen jó, transzplantációs szövet-készítmények számára megfelelő fizikai jellemzőkkel rendelkezik, például alacsony porozitási indexszel, jó rugalmassággal és nagy repesztési ellenállással. A transzplantációs szövetkészítmény porozitásúnak ugyanis megfelelően kicsinek kell lennie ahhoz, hogy megakadályozza a belső vérzéseket, de elég nagynak kell lennie ahhoz, hogy lehetővé tegye, hogy az újonnan kialakult vasa vasorum (az erek erei) átjusson a transzplantált szövet-készítményen és az új érfalat, valamint a belső felületet táplálhassa. Egy transzplantátum porozitásút általában 16000 Pa nyomás mellett emsénként és percenként áthaladt víz milliliteréinek mennyiségével határozzák meg. Az SIS szövet-készítmény porozitási indexe 10, amely sokkal alacsonyabb, mint a jelenlegi, a szakirodalomból ismert transzplantátumoké (például a szövött Dacron porozitási indexe 50). Az alacsony porozitási index ellenére az SIS anyag megfelelően porózus ahhoz, hogy lehetővé tegye a kapilláris rendszer újra kialakulását az SIS transzplantált anyagon belül. Érrendszeri transzplantá tűmként való alkalmazás esetében az SIS formált alak az operáció utáni négy nappal lehetővé teszi, hogy vérrel töltött kapillárisok alakuljanak ki a transzplantátum falában, amelyek a belső felületig terjednek.

A rugalmassági illeszkedés vonatkozásában a transzplantátumok esetében a szakirodalomból ismert, hogy közvetlen viszony áll fenn a rugalmasság és az átjárhatóság között. Ideális esetben a transzplantátum legalább olyan mértékben rugalmas kell legyen, mint az a szövet, amelyet vele helyettesítünk. Az SIS beültetett anyag hosszanti rugalmasságát egyszerű húzási tesztvizsgálattal állapíthatjuk meg. Egy kezdeti mérési hosszat jelölünk be tintajelekkel egymástól 5,0 cm távolságra. A megnyúlást és az alkalmazott erőt mérjük úgy, hogy a mintákat 0,0053 m/s feszítési sebességgel terheljük és az alábbi eredményeket kaptuk:

Az SIS beültetett anyag rugalmassága: 0,045 m/N/m hosszúság

A normál kutya aorta rugalmassága: 0,017 m/N/m hosszúság így kimutattuk, hogy az SIS transzplantátumok nagyobb rugalmasságúak, mint egy normál aorta. Ez jelentős javulást jelent a korábbi szakirodalmi leírásokhoz képest az érrendszeri transzplantátumok területén.

Valamennyi jelenleg rendelkezésre álló szintetikus

HU 207 448 Β transzplantációs anyag 3-10-szer kevésbé rugalmas, mint a természetes artéria és arányosan nagyobb veszély áll fenn trombózis kialakulására ezzel kapcsolatban, mint amilyen a természetes artériában felléphet. A korábbi szakirodalmi megoldásokban ennek a rugalmassági hiánynak a kiküszöbölésére általában nagyobb átmérőjű transzplantátumot alkalmaztak, mint a csatlakozó természetes artéria. Ez a technika azonban további problémákhoz vezetett. A nagyobb átmérőjű transzplantátum szegmensben a vér áramlási sebessége kisebb. Ennélfogva a transzplantátum falán kisebb nyírófeszültség lép fel. Ilyen körülmények között a vérlemezke és fibrinlerakódás és az ezt követő trombózis kialakulásának valószínűsége nagyobb. Ezzel szemben, mivel az SIS szövet-készítmény ilyen jó rugalmasságot mutat, azonos átmérőjű SIS transzplantátumot lehet alkalmazni a fenti problémák fellépése nélkül.

A találmány szerinti SIS transzplantációs anyag nyomás ellenállási pontja messze a fiziológiásán jelentkező nyomásértékek fölé esik. A nyomás ellenállást úgy vizsgáltuk, hogy a csőszerű SIS transzplantáció szegmenst két 25 mm átmérőjű hengerhez csatlakoztattuk és a szegmenst nitrogéngáz nyomásnak vetettük alá folyamatos áramlási sebesség alkalmazásával. Két áramlási sebességet alkalmaztunk. Az alacsonyabb áramlási sebesség alkalmazásakor a nyomás kezdetben növekedett, majd alacsonyabb értékre esett és olyan állandó értékre állt be, amelyet a transzplantációs szövet-készítmény falán keresztüli gázkiáramlás és a gázbeáramlás egyensúlya szabott meg. Nagyobb áramlási sebesség esetében a nyomás azonnal megemelkedett és kipukkanást okozott 600 000 Pa értéknél, ami azt jelenti, hogy a transzplantációs szövet-készítmény könnyen kiállja a folytonos pulzáló nyomást, amely normális fiziológiás értranszplantátumként való alkalmazásakor felléphet.

A találmány szerinti eljárást az alábbi nem-korlátozó példákon részletesen bemutatjuk.

7. példa

Vékonybél submucosa, mint nagy átmérőjű artériás transzplantációs anyag alkalmazása Kísérletsorozatot végeztünk, hogy megvizsgáljuk három különböző vékonybél preparátum, mint érrendszeri transzplantációs anyag alkalmazását, vese alatti aorta pótlására kutyákban. Az első két kísérlet szolgált kontrollként. Az első kísérletben teljes vastagságú, nem invertált jejunum szegmenst alkalmaztunk. Az anyagot vagy érintetlen bélfodor neurovascularis csatlakozással együtt vagy szabad, izolált szegmensként alkalmaztuk transzplantációs anyag céljára. A bél mucosa szolgált vér-transzplantátum határfelületként. Az ebben a kísérletben alkalmazott 4 kutya egyaránt elpusztult az operáció utáni első 18 óra során trombózis következtében, amely a transzplantátum szegmensben jött létre, illetve haemorrhagia következtében, amely a varrat vonalak mentén alakult ki.

A második kísérletben izolált és invertált jejunum szegmenst alkalmaztunk transzplantátumként, amelyben a vér és a transzplantátum határfelületét a tunica serosa képezte. A kísérletben 2 kutyát alkalmaztunk. A beültetett transzplantátumban az első kutyában 4 órával az operáció után trombózis alakult ki, a másik kutya pedig akut haemorrhagia következtében, amely a proximális anasztomózisnál alakult ki, 4 napon belül az operáció után elpusztult.

A harmadik kísérletben a bélfal egy részét alkalmaztuk transzplantátumként. Minden egyes kutyából egy autogén felső jejunum szabad szegmenst operáltunk ki, majd a nucosa nagy részét eltávolítottuk egy tompa szikenyéllel a belső felületet kaparva. Ugyanilyen eljárással ezután a serosa és a tunica muscularis réteget is eltávolítottuk. Ezen preparálás után maradt 100 μ vastag szekció a submucosa és az alap (basilaris) mucosa (ami a muscularis mucosa és a stratum compactum rétegeket tartalmazza) rétegekből állt. Ezt a szövet-készítményt használtuk ezután a vese alatti aorta pótlására 15 kutyában és a vizsgálatok meglepően sikeresnek bizonyultak. A harmadik kísérlet eredményeit az alábbiakban foglalhatjuk össze.

A 15 kutya közül 13 megtartotta a beültetett transzplantátumokat az elpusztulás időpontjáig. 11 kutyát megöltünk különböző időpontokban (4 nap és 1 év között) a sebészeti beavatkozás után. Az állatokban nem mutatkozott transzplantátum fertőzöttség, aneurizma képződés vagy trombózis. A hibás transzplantátum, amit 2 kutyában figyeltünk meg, technikai hiba következtében jött létre, a fém szalagkapcsolók rossz elhelyezése, illetve a rossz kötési technika alkalmazása miatt. 2 állat a jelen leírás elkészítésekor is életben van és hosszú időtartamú átjárhatósági vizsgálatot végzünk rajtuk.

A beültetett erek nyitottságának vizsgálatát pozitív kontrasztanyagos radiográfia segítségével vizsgáltuk a sebészeti beavatkozást követő 4-7 napon belül, majd ezt követően minden 6-8 hét után. Ezen túlmenően a beültetett ér átjárhatóságát klinikailag is ellenőriztük az erős combi pulzus jelenlétének és a hátsó végtag ödéma hiányának megfigyelésével.

11, átjárható transzplantátumot tartalmazó kutyát különböző időtartammal az operáció után megöltünk (4„ 7., 10. és 14. nap, és 9., 11., 13., 17., 26., 44., valamint 52. hét). Az elpusztulás időpontja előtt az állatokról angiogramot készítettünk, hogy a transzplantátum átjárhatóságát megerősítsük, és összehasonlító radiogramot kapjunk a transzplantátum tágulás, szűkülés, illetve aneurizma képződés vonatkozásában. Mind a 11 állat teljes érátjárhatóságot mutatott és semmiféle káros elváltozást nem tapasztaltunk az érátmérőben.

A beültetett transzplantátum szegmensek általános patológiai értékelése csillogó belső üregi felületet mutatott, amelyen rendszertelen helyzetű piros és fehér területek találhatók, és nincs jele kiterjedő trombus képződésnek. A beültetett szövet körül tömör kötőszövet alakult ki, amely folytonosan csatlakozott a transzplantátum falához. Valamennyi, a sebészeti beavatkozás után 6 hónapon belül megvizsgált egyed esetében azt tapasztaltuk, hogy a transzplantátum felületén nem tapasztalható belhám sejtek növekedése. Abeülte5

HU 207 448 Β tett szövetek felülete sík, viszonylag sűrű és rendezett kollagén réteggel fedett.

A 26., 44. és 52. hét utáni szövettani vizsgálatok az állatokban besüllyedt belhám-szerű sejtet mutattak, amelyek részben vékony (kb. 500 μ) réteg sűrű, rendezett fibrinnel bevontak. A teljes szövetet behálózták a vérrel töltött kapillárisok és a külső határt az eredeti transzplantátumban nem lehetett megkülöntöztetni a körülvevő kötőszövettől. A belső üreg elektronmikroszkópos vizsgálata a felületen azt mutatta, hogy az besüllyedt sejtekkel borított, amelyek megkülönböztethetetlenek a belhám sejtektől és kiterjedt „álnyúlványokkal” (pszeudopódium) rendelkeznek. A transzplantátumon áthaladó elektron-szegmensek mikroszkópos vizsgálata ugyancsak azt mutatta, hogy valószínűleg belhám sejtréteg borítja az üreg belsejében a felületet. Ezen túlmenően a VIII. faktorhoz kapcsolódó antigén jelenléte, ami immunfluoreszcenciás festéssel kimutatható, szintén azt mutatja, hogy a beültetett szövet belső üregi felületét belhám sejt eredetű sejtek borítják. A transzplantátumot ugyancsak megvizsgáltuk belhám sejt jelenléte szempontjából az endotéliumból származó relaxációs faktor jelenlétének vizsgálatával. A transzplantátumok felületére acetil-kolint juttattunk és a kifolyó anyagot gyűjtöttük. A kifolyó anyagról kimutattuk patkány aorta-preparátumon végzett simaizom relaxációs vizsgálattal, hogy endotéliumból származó relaxációs faktort tartalmaz.

elpusztított kutyában megvizsgáltuk a vérnyomást az SIS transzplantátum belsejében, ettől távol és ennek közvetlen közelében. A nyomásértékek mind a három helyen minden egyes kutyában azonosnak mutatkoztak, ami azt mutatja, hogy az SIS transzplantációs szövet-készítmény következtében nem lépnek fel káros hemodinamikai hatások.

Valamennyi kutya esetében az alábbi laboratóriumi jellemzőket mértük az operáció előtt, 1 nappal az operáció után, majd különböző időpontokban az operációt követő hónapokban: hematokrit, protrombin idő, aktivált parciális tromboplasztin idő, vérlemezke szám, teljes vérkép, és részleges szérumkémiai vizsgálat. Az eredmények azt mutatták, hogy valamennyi állat normális állapotú az ilyen laboratóriumi vizsgálatok szerint bármely időpontban. Az alkalmazott állatoknak alacsony dózisú heparin kezelést adagoltunk (600 egység iv.) a sebészeti eljárás során, de a műtét utáni időszakban nem kezeltünk antikoagulánsokkal. A koagulációs tesztvizsgálatok és a vérlemezkeszámlálás analízisében a változás hiánya különösen biztatónak tűnik abban az esetben, ha figyelembe vesszük, hogy a kutya viszonylag hiperaktív koagulációs rendszerrel rendelkezik az emberrel összehasonlítva.

Ez a harmadik, a találmány szerinti szövet-készítménnyel végzett vizsgálat tehát világosan mutatja az új transzplantátum előnyeit az első és második kísérletben alkalmazott kontrolihoz képest.

A 2-5. példákban a találmány szerinti vékonybél submucosa (SIS) készítményt alkalmaztuk.

2. példa

Vékonybél submucosa alkalmazása kis átmérőjű artéria beültetési anyagként

Ebben a kísérletben 18 kutyába összesen 36 SIS szövet-készítmény beültetést végeztünk a combi artériába és a nyaki artériába. A 36 beültetett szövet közül 33 érbeültetés átjárható maradt. Az állatokban az

I. példában leírt laboratóriumi vizsgálatok elvégzése után nem tapasztaltunk abnormális jelenségeket. Az 1. példához viszonyítva szokásos kétdimenziós ultrahangos leképzést is végeztünk, hogy az ér átjárhatóságát is teljes keresztmetszetben vizsgáljuk.

A sebészeti beavatkozást követő 4. napon elpusztított kutyák beültetett szövetének patológiai vizsgálata azt mutatta, hogy az ér belső felülete trombózismentes és kissé szűkült a csatlakozások (proximális anasztomózisok) közelében. A hisztológíai vizsgálat azt mutatta, hogy a transzplantátum falában igen hamar vérrel töltött kapillárisok jelennek meg, ami a fertőzés elleni természetes testbeni védelem jelenlétét mutatja. A kísérleti állatok közül 5 életben van további vizsgálatok céljára. A vizsgálatot leghosszabb ideig túlélő kutya a bejelentés időpontjában a sebészeti beavatkzás után 7 hónapot ért meg,

3. példa

Vékonybél submucosa, a találmány szerinti SIS szövet-készítmény alkalmazása véna transzplantációként

Ebben a kísérletben az SIS transzplantátumot a hátulsó véna cava-ba építettük (amely analóg az ember „alsó” véna cavajával) 2 kutyában, valamint az elülső véna cava-ba helyeztük (amely analóg az emberben a „felső” véna cava-val) 5 kutyában. Bár a hátulsó véna cava-ba épített transzplantátumok csak

II, illetve 14 napig maradtak átjárhatók, a patológiás vizsgálat kimutatta, hogy ez amiatt következett be, hogy az alsó illesztési (anasztomozis) hely szűkületes volt (8 mm átmérőjű volt a kapcsolódó 16 mm-es természetes véna cava-val és a proximális transzplantátummal szemben). Ezen túlmenően mindkét értranszplantátum belső felületét nem-trombózisos „pszeudo-belhám” borította, amely sűrűn elhelyezkedő fibrinből és nem kifejlett kollagén-szerű kötőszövetből állt.

Az elülső véna cava-ba beültetett transzplantációk átjárhatók maradtak a kutyák elpusztítási időpontjáig, amely 3 kutya esetében a 7., 14., illetve 21. nap volt a sebészeti beavatkozás után. Két kutya átjárható transzplantátumokkal a bejelentés időpontjáig életben van, amely 7 héttel a sebészeti beavatkozás utáni időpont. A proximális varrat vonala a 3 kutya beültetett érdarabján korai trombózis jeleit mutatta, ahol a lebeny a transzplantátumban invertált, és turbulens véráramlást okozott, de a transzplantátum többi része nem volt trombózisos. Ezen túlmenően az általános patológiai és hisztológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a transzplantált ér fényes, sima, vörös felületű, ami megfelel a korábbi kísérletekben tanulmányozott transzplantátumok felületének.

HU 207 448 Β

4. példa

Vékonybél submucosa alkalmazása artériás allotranszplantátumként

Kutya aortában SIS szövet-készítményt alkalmaztunk nagy átmérőjű allo-transzplantátumként. Az allotranszplantátumot a fentiek szerint készítettük az aorta beültetésekhez használt autotranszplantátumhoz hasonlóan. A bejelentés időpontjában a kísérleti állatok 8 héttel a sebészeti beavatkozás után nem mutattak semmiféle transzplantációs szövet trombózist, fertőzést vagy aneurizmát (angiogramok alapján).

5. példa

Vékonybél submucosa alkalmazása artériás heterotranszplantátumként

Kutyában SIS szövet-készítményt alkalmazunk hetero-transzplantátumként. Macskából származó SIS szövet-készítményt készítettünk a korábban leírt eljárás szerint és ezeket kutyába ültettük. A bejelentés időpontjában a vizsgált állat a sebészeti beavatkozás után 2 héttel semmiféle káros jelenséget nem mutatott.

Claims (5)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Szövet-készítmény transzplantációhoz, azzaljellemezve, hogy egy melegvérű gerinces bélszegmensének tunica submucosa rétegét és a csatlakozó tunica mucosa alaprétegét, a muscularis mucosa réteget, valamint a tunica mucosa kompakt rétegét, a stratum compactum réteget tartalmazza.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti transzplantációs szövetkészítmény, azzaljellemezve, hogy a vékonybélből kivágott szegmens rétegeit tartalmazza.
3. 3. A 2. igénypont szerinti transzplantációs szövetkészítmény, azzaljellemezve, hogy a vékonybél jejunum részéből kivágott szegmens rétegeit tartalmazza.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti hengeres transzplantációs szövet-készítmény, azzaljellemezve, hogy a bélszegmens rétegeit hosszanti irányban összevarrva szövet formált alakban tartalmazza.
5. 5. A 4. igénypont szerinti hengeres transzplantációs szövet-készítmény, azzaljellemezve, hogy a stratum compactum réteg képezi a hengeres szövet formált alak belső felszínét.