HU190999B - Process for preparing l-treonint producing strains - Google Patents

Description

(54) ELJÁRÁS L-TREONINT TERMELŐ TÖRZSEK ELŐÁLLÍTÁSÁRA (57) KIVONAT

A találmány tárgya eljárás L-treonint termelő törzs előállítására, melynek során az Escherichia colt VNIIgenetika MG 442 donortörzs DNSkromoszómájának Hindiit endor-ukleáz enzimmel nyert, a treonin-operon génjeit tartalmazó töredékét DNS-vektormolekulaként pBR 332 piazmiddal egyesítjük, és a kapott hibridplazmiddal közvetlenül vagy Hindlli és Bam Hl specifikus endonukleáz enzimekkel végzett hasítás a képződött töredékeket polinukleotidligáz enzimmel történő újraegyesítése után L-treonin szintézisét blokkoló, az L-izoleucin szín tézisét, pedig részlegesen blokkoló mutációkkal rendelkező Escherichia coli VL334 befogadó törzs sejtjeit transzformáljuk, és a kapott törzset elkülönítjük.

190 999

A találmány tárgya eljárás L-treonint termelő törzsek előállítására.

A mikroorganizmusok segítségével előállított aminosavak takarmány- és tápanyagadalékként alkalmazhatók a mezőgazdaságban és az élelmiszeriparban , kiterjedten felhasználhatók különféle, gyógyászati célú tápanyagkeverékek komponenseiként, továbbá reagensként a gyógyszeriparban és a vegyiparban.

A továbbiakban a leírásban az alábbi szakkifejezéseket használjuk:

A DNS szakkifejezésen a dezoxiribonukleinsavat értjük.

A plazmidok olyan genetikai elemek, amelyek a baktériumsejtekben a kromoszómától függetlenül léteznek.

Replikáción a genetikai anyag reprodukcióját értjük.

A transzformáció szakkifejezés azt jelenti, hogy egyes baktériumok genetikai anyaga a kivált DNS segítségével átkerül egy más baktériumsejtbe.

A transzfekció azt jelenti, hogy a fágok genetikai anyaga a kivált DNS segítségével átkerül a baktériumsejtbe.

Vektormolckula szakkifejezésen a plazmidok és fágok DNS-molekuláit értjük, amely DNS-molekulák átviszik a genetikailag idegen anyagot a sejtbe, és biztosítják azok autonóm replikációját a sejten belül.

Rekombinációs molekulán (hibridmolekulán) olyan DNS-molekulákat értünk, amelyek in vitro képződnek különböző DNS-molekulák egyetlen molekulává való egyesülésével. A különböző DNSmolekulák közül az egyik rendszerint vektormolekula.

Kiónon valamely sejt genetikailag homogén utódait értjük.

A gének klónozásán (molekuláris klónozás) olyan baktériumklónok előállításátértjük, amelyek a hibridplazmidon az illető géneket tartalmazzák.

Az amplifikáció a sejtben jelenlevő gének számának növekedése.

A konjugáció a genetikai anyag átvitele a baktériumsejtek egymással való érintkezésekor.

A transzdukció a genetikai anyagnak baktériumfágok segítségével történő átvitelét jelenti.

Az auxotróf törzseken olyan mutációs organizmusokat értünk, amelyek nem képesek bizonyos aminosavak vagy más növekedési faktorok szintetizálására, és csak abban az esetben növekednek, ha ezek a faktorok a táptalajban jelen vannak.

A prototróf törzseken olyan vad organizmusokat értünk, amelyek minimális glukóz-só táptalajon is képesek a növekedésre.

Az operon a gének szabályozó csoportja, amely gének rendszerint valamely termék, például egy aminosav szintézisét szabályozzák.

A katabolizmus bonyolult összetételű vegyületek egyszerű szerkezetű vegyületekké történő átalakulási folyamatát jelenti.

A represszió a gének és az operonok működésének kikapcsolása, ami az enzimszintézis leállásához vezet.

A represszor a szabályozó fehérje, amely a repressziós kofaktorok - ezek rendszerint a bioszintézis végtermékei vagy ez utóbbiak származékai részvételével kikapcsolják a gének működését.

A specifikus endonukleáz (restriktáz) az az enzim, amely a DNS kettős-spirál molekuláját meghatározott bázisszekvenciájú helyeken részekre hasítja.

A polinukleotidligáz olyan enzim, amely biztosítja az endonukleázok hatására képződött részek újra-összekapcsolódását.

A replikon az a genetikai anyag, amely képes a replikációra.

A fenotípus a genetikai jellemzők megnyilvánulása a mindenkor fennálló körülmények között.

Ismertek olyan eljárások, amelyekkel aminosavakat, például L-lizint, L-treonint, L-izoleucint stb. termelő törzseket lehet előállítani különböző mutagén faktorok (ultraibolya fény, ionizáló sugárzás, kémiai mutagének) alkalmazásával. A kapott mutációs mikroorganizmus-törzseknél genetikailag meghatározott zavarok tapasztalhatók az anyagcsere szabályozásánál, és e zavarok következtében bizonyos aminosavakat adnak át a táptalajnak, azaz bizonyos aminosavakat termelnek.

A kívánt típusú mutációs mikroorganizmustörzseket önmagukban ismert módszerekkel nyerhetjük: a mutációs törzsek meghatározott tápanyagszükséglete szerint (auxotrófia) vagy a mutációs törzseknek a kiindulási törzs növekedését gátló egyik vagy másik aminosav-szerkezeti analóggal szembeni rezisztenciája alapján [1 258 380, 1 186 988 és 1 316 888 sz. nagy-britanniai szabadalmi leírás, 51-6237 sz. japán szabadalmi leírás].

Olyan eljárás is ismert az aminosavakat termelő mutációs törzsek előállítására, amely az antimetabolitokkal (antibiotikum vagy aminosav-analóg) és a koinhibitorokkal (meghatározott aminosav) szemben egyidejűleg fennálló rezisztencián alapul [3 756 916 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás].

Valamennyi fentebb említett esetben olyan módon kapunk aminosavak termelésére képes mutációs törzseket, hogy egyszerre vagy szakaszokban kiváltjuk az aminosavat nem termelő kiindulási törzs genetikai szerkezetének mutációját.

Mindeddig nem vált ismertté olyan törzs, amelynél az aminosavtermelés növekedését a bioszintéziséhez szükséges gének adagolásának növelésével vagy genetikailag idegen anyag bevitelével érnénk el. Nem ismertettek olyan törzset, amelynél az amínosavtermelés megnövelését rekombinációs DNSmolekulákat alkalmazó módszerekkel biztosítanák.

Jelenleg a genetikai kutatások gyakorlatában olyan módszereket alkalmaznak, amelyek DNShibridmolekulák in vitro előállítására szorítkoznak. Ezek a DNS-hibridmolekulák autonóm replikációra és amplifikációra képesek, és felhasználják őket transzformáció és transzfekció kiváltására a baktériumtörzsben. Vektormolekulaként a plazmid DNS-ét vagy közepes baktériumfágok DNS-ét alkalmazzák. Ezekkel az ismert módszerekkel részletesen az alábbi publikációk foglalkoznak;

1. Cohen S. N., Chang A. C. Y., Boyer H. W. és Helling R. B., Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., 70, 3270 (1973);

190 999 _

2. Green P. J,, Betlach' M. C., Boyer H. W., Goodman Η. N., Methods in Molecular Biology, 7, 87 (1974);

3. Tanaka T., Weisblum B., J. Bacteriol., 121, 354 (1975);

4. Clarké L., Carbon J., Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., 72, 4361 (1975);

5. Bolivár F., Rodrigues R. L., Green Pl. J., Betlach M. C., Heyneker H. L., Boyer H. W., Gene/2, 95 (1977):

6. Kozlov J. I., Kalinina N. A., Gening L. V., Rebentish B. A., Strongin A. J., Bogush V. G., DebanovV. G., Molec. Gén. Genetics, 150, 211 (1?77).

Á genetikai kutatási módszerek gyakorlati alkalmazása a Pseudomonas törzsek előállítására kifejlesztett eljárás lett. Ezek a törzsek a kőolajban jelenlevő szénhidrogéneket bontják el [3 923 603 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Ez utóbbi ismert eljárásnál a hibridmolekulákat in vivő állították elő sejtközi rekombinációval. Ennek ellenére mindeddig nem váltak ismertté olyan módszerek, amelyekkel aminosavakat termelő törzsek lennének előállíthatok genetikai módszerekkel.

A találmány célja a genetikai módszerek alkalmazása a kívánt aminosav bioszintéziséhez szükséges gének dózisának megnövelésére, annak érdekében, hogy az aminosavak termelésére nagyobb mértékben képes törzseket kapjunk.

A kitűzött célt a találmány szerint úgy érjük el, hogy az aminosavakat termelő törzsek előállításához a kiválasztott aminosav szintézisét szabályozó géneket tartalmazó és a szóban forgó aminosav szintézisének negatív regulációját zavaró mutációjú donor organizmus DNS-kromoszómájának egy töredékét DNS-vektormolekulával DNS-hibridmolekulává egyesítjük. Az eljáráshoz olyan DNSvektormolekulát alkalmazunk, amely képes a DNS-hibridmolekula amplifikációjára. Az így kapott DNS-hibridmolekulával a befogadó törzs sejtjeit transzformáljuk. A befogadó törzs eredeti mutációja olyan, hogy blokkolja a szóban forgó aminosav szintézisét ennél a törzsnél és részben blokkolja az aminosav metabolizmusának szomszédos szakaszát. A transzformáció után ilyen módon olyan törzshöz jutunk, amely megnövelt mértékben képes a kiválasztott aminosav termelésére.

A genetikai ballasztanyag eltávolítására - annak érdekében, hogy megnöveljük a hibridplazmid stabilitását és másolatainak számát a sejtben - a kapott DNS-hibridmolekulát célszerűen a befogadó törzs sejtjeinek transzformációja előtt olyan endonukleázokkal kezeljük, amelyek elhasítják a DNShibridmolekulát a molekula előzetesen meghatározott pontjain, majd a szükséges DNS-töredékeket polinukleotidlígáz enzimmel történő kezeléssel újra egyesítjük.

A találmány szerint úgy állítunk elő gminosavakat, például L-treonint termelő törzset, hogy az Escherichia coli VNIIgenetika MG 442 donortörzs DNS-kromoszómájának Hind III endonukleáz enzim segítségével nyert részletét - amely treoninoperon géneket tartalmaz, és amelynél az enzim mutációja folytán a thrA gén termékei ellenállnak a treoninnal való gátlással szemben - DNS-vektormolekulával egyesítjük. DNS-vektormolekulaként pBR 322 plazmidot alkalmazunk. Ilyen módon hibridplazmidot kapunk, amelynek a molekulasúlya 11,2 megadalton, s a pBR 322 plazmid, valamint a donortörzs DNS-kromoszómájából előállított töredék két másolatából áll. A hibridplazmid ellenállóvá teszi a sejteket penicillinnel és tetraciklinnel szemben, s a logaritmusos növekedési szakaszban a sejtekben körülbelül 10 másolata lehet jelen. A kapott hibridplazmidot transzformáljuk a befogadó törzs sejtjeibe. Befogadó törzsként Escherichia coli VL334-t alkalmazunk, amely olyan mutációjú, hogy blokkolja az L-treonin és az Lizoieucin szintézisét, ahol az izoleucin szintézisének blokkolása részleges, és a sejtben megnövelt treonintartalommal ellensúlyozható. E mutációk szelektív módon előnyt adnak a hibridplazmidot tartalmazó sejteknek azokkal a sejtekkel szemben, amelyekben a tenyésztés során a plazmid elveszett. Ilyen módon L-treonint termelő Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pyN6) törzset kapunk. Ez a törzs B-1649 számon lett letétbe helyezve a Szovjetunió Genetikai és Ipari Mikroorganizmuskiválasztó Tudományos Kutatóintézetéhez tartozó Központi Ipari Mikroorganizmus Múzeumban. A VNIIgenetika kifejezés a Szovjetunió Genetikai és Ipari Mikroorganizmuskiválasztó Tudományos Kutatóintézetének rövidítése.

Az L-treonint termelő törzs előállítására szolgáló találmány szerinti eljárás egy másik változata szerint az Escherichia coli VNIIgenetika MG 442 donorörzs DNS-kromoszómájának Hindlll endonukleáz enzim segítségével nyert részletét - amely treoninoperon géneket tartalmaz, és amelynél az enzim mutációja folytán a thrA gén termékei ellenállnak a treoninnal való gátlással szemben DNS-vektormolekulával egyesítjük. DNS-vektormol.'kulaként pBR 322 plazmidot alkalmazunk. Ilye i módon hibridplazmidot kapunk, amelynek a molekulasúlya 11,2 megadalton, s a pBR 322 plazmid valamint a donortörzs DNS-kromoszómájából előállítót töredék két másolatából áll. A kapott hibridplazmidot Hind III és fiam Hl endonukleázokkal kezeljük, és a képződő töredékeket polinuleotidiigáz enzimmel történő kezelés útján újraegyesítjük. Ekkor a képződött hibridplazmid 5,7 megadalton molekulasúlyú, a pBR 322 plazmid molekulájából és a DNg-krorr|oszóma említett töredékéből áll, ellenállóvá teszi a sejteket penicillinnel szemben, s a logaritmusos növekedési szakaszban a sejtekben körülbelül 20 másolata lehet jelen. Az így kapott hibridplazmiddal módosítjuk a befogadó Escherichia coli VL334 törzs sejtjeit. E törzs olyai mutációjú, hogy blokkolja az L-treonin és az L-izoleucin szintézisét, ahol az izoleucin szintézisének blokkolása részleges, és a sejt megnövelt treoninbirtalmával ellensúlyozható. E mutációk szelektív módon előnyt adnak a hibridplazmidot tartalmazó sejteknek. Ilyen módon L-treonint termelő Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN7) törzset kapunk. Ez a törzs B 1684 számon lett letétbe helyezve a Szovjetunió Genetikai és Ipari Mikroorganizmuskiválasztó Tudományos Kutatóintézetéhez tartozó Központi Ipari Mikroorganizmus Múzeumban.

190 999

A találmány szerinti eljárás során az alábbiakban ismertetett módon járunk et/;'

Egy meghatározott aminosavat termelő törzs előállításához olyan mikroorganizmus donortörzset választunk ki, amelynek a DNS-kromoszómatöredéke a szóban forgó aminosav szintézisét szabályozó géneket tartalmaz. A donortörzset olyan mutációk jellemzik a klónozni kívánt génekben vagy az ezekkel a génekkel szomszédos szabályozó tartományban, amelyek zavarják az aminosavszintézis negatív szabályozását. Az ilyen jellegű mutációk fokozzák az aminosavszintézist, és önmagában ismert módon biztosíthatók. Olyan DNS-vektormolekulát, például egy plazmidot választunk ki, amely biztosítja a beépült, genetikailag idegen anyag replikációját, és meghatároz egy vagy több megkülönböztető jellemzőt, például az antibiotikumokkal szembeni ellenállóképességet. A hibridmolekulák képzéséhez, azaz a donortörzs DNSkromoszöma-töredékének és a DNS-vektormolekulának az egyesítéséhez DNS-kromoszóma töredékeket hozunk létre specifikus endonukleáz segítségével vagy valamilyen más módon, majd a kapott elegyet polínukleotidligázzal kezeljük. Ez az enzim véletlenszerű módon újraegyesíti a töredékeket. A kapott elegyet felhasználjuk a baktériumok genetikai transzformációjához. A hibridplazmidoknál elvan DNS-kromoszóma töredékeket választunk ki, amelyek az illető aminosav szintézisét szabályozó géneket hordozzák. A transzformáció során befogadó törzsként olyan baktériumtörzset alkalmazunk. amelynél az adott aminosav szintézisét szabályozó gének közül legalább egy sérült, és a törzs a szóban forgó aminosavat tekintve auxotróf. A transzformáció után olyan prototróf transzformánsokat választunk ki, amelyek egyidejűleg a veklorplazmid által meghatározott szelektív jellemzőket hordozzák. Ezek a transzformánsok több fenotipust is képezhetnek. Az egyes fenotípusba tartozó transzformánsokból önmagában ismert módon elválasztjuk a hibridplazmidokat. Ezek a hibridplazmidok a donortörzs DNS-kromoszómájának különböző méretű töredékeit hordozhatják, és a vektormolekula különböző számú másolatait tartalmazhatják.

Megvizsgáljuk, hogy az elválasztott hibridplazmidokban megtalálhatók-e a donortörzs kromoszómájának olyan töredékei, amelyek az illető aminosav szintézisét szabályozó géneket tartalmaznak. Ehhez a hibridplazmidokkal olyan auxotróf törzseket transzformálunk, amelyek a klónozni kívánt géneknek megfelelő mutációkkal rendelkeznek. A transzformánsok prototrófiájának ismételt kialakulása ebben az esetben az illető gén hibridplazmidjának jelenlétére mutat. A kívánt aminosavat termelő törzsek létrehozására irányuló további munka során olyan hibridplazmidokat alkalmazunk, amelyek valamennyi kiválasztott, az aminosav szintézisét szabályozó gént tartalmazzák. Abban az esetben, ha az elkülönített plazmidok nem tartalmazzák az összes szükséges gént, megismételjük a fentebb ismertetett műveleteket, megváltoztatjuk azonban a DNS-töredékek előállításmódját, például egy másik specifikus endonukleáz alkalmazásával.

A genetikai ballasztanyag eltávolítása, a hibridplazmid stabilitásának növelése és a sejtben jelenlevő hibridplazmid-másolatok számának növelése érdekében a kapott hibrídplazmidot a befogadó törzs transzformációja előtt célszerűen specifikus endonukleázokkal kezeljük, amelyek felhasítják a molekulát az előre meghatározott pontokon, majd a szükséges töredékeket polinukleotidligáz enzimmel való kezeléssel újraegyesítjük.

A kapott hibrídplazmidot, amely valamennyi, az aminosav szintézisét a szóban forgó mikroorganizmusnál szabályozó, kiválasztott gént tartalmaz, felhasználjuk a befogadó törzs sejtjeinek genetikai transzformációjához. A transzformáció után ez a törzs magasabb szinten képes a szóban forgó aminosav termelésére. A befogadó törzs mutációja olyan, hogy az blokkolja a szóban forgó aminosav szintézisét ennél a törzsnél. Ezáltal lehetőség nyílik arra, hogy könnyen kiválaszthassuk azokat a transzformált törzseket, amelyek az aminosav szintézisét szabályozó géneket tartalmazó hibridplazmidot hordozzák. Ezen túlmenően a befogadó törzsnek olyan mutációval kell rendelkeznie, amely részlegesen blokkolja a kérdéses aminosav metabolizmusának szomszédos szakaszát. Az aminosav metabolizmusánál a szomszédos szakasz, például a következő szakasz részleges blokkolása azzal a következménnyel jár, hogy nagy koncentrációban van szükség erre az aminosavra annak a metabolitnak a szintéziséhez, amelynek elővegyülete a szóban forgó aminosav. Ennek következtében előtérbe kerülnek az olyan hibridplazmidokat tartalmazó befogadó sejtek, amelyek képesek az illető aminosav jelentős mennyiségének a szintetizálására, mivel ezek az aminosav és a metabolit - e metabolit elővegyülete az illető aminosav - távollétében is képesek a táptalajon növekedni. Ugyanakkor háttérbe szorulnak a plazmidokat nem tartalmazó sejtek.

Célszerűen a befogadó törzs olyan mutációval is rendelkezik, amely zavarja a megfelelő gének represszióját. Előnyös az olyan mutációk jelenléte is, amelyek blokkolják az illető aminosav katabolizmusát és átalakulásait.

A találmány szerinti eljárással előállított törzseket különböző aminosavak, például a treonin termelésére alkalmazzuk. Ehhez a törzseket asszimilálható szénforrásokat, ásványi anyagokban jelenlévő nitrogént és ásványi sókat tartalmazó táptalajon fermentáljuk, ahol a táptalaj célszerűen annak a sejtpopulációnak a fejlődését biztosítja, amely a hibrídplazmidot hordozza.

Kísérleteket végeztünk az Escherichia coli K12 törzs sejtjeiben a treonin-operon génjeinek klónozására, és a kísérleti eredmények a találmány szerinti eljárás helyességét igazolják.

Kísérleteinket a következőképpen végeztük;

. Donortörzsként az Escherichia coli W3350 törzset alkalmaztuk, amely vad típushoz tartozó treonih-operont hordoz. A DNS-vektormolekula a pBR 322 plazmid volt. A DNS-töredékek előállításához EcoRI restrikciós endonukleáz enzimet használunk, és így pEKI hibrídplazmidot kaptunk. A plazmidot ezután Hindlll endonukleáz enzimmel és polinukleotidligáz enzimmel kezeltük, és ily

190 999 módon pYNI plazmidot kaptunk. Ez a plazmid abban tér el a pEKI plazmidtól, hogy nem tartalmaz kromoszóma-töredéket Hindiit endonukleáz enzimmel történő két hasítási hely között.

A pEKI és a pYNI plazmidok a treonin-operon három génje közül mindössze kettőt tartalmaznak, a thr A és a thr B gént, amint ezt az 1. és 2. ábra szemlélteti.

Az 1. ábrán a pEKI plazmid restrikciós rajza látható. A vastagon kihúzott körív a pBR 322 vektorplazmid-szakasz, a vékony vonallal húzott körív pedig a DNS-kromoszóma klónozott töredékét jelenti. A szaggatott vonal annak a plazmidszakasznak felel meg, amely a pYNI plazmid keletkezésekor el lett távolitva. A nyilak azokat a helyeket mutatják, ahol a plazmidot a különféle endonukleáz enzimek felhasították, a számok pedig a felhasítási pontok közötti szakaszok nagyságát adják meg megadalton egységekben. A nyilakkal ellátott fekete négyszögek a tetraciklinnel (T_c) és penicillinnel (Ap) szemben ellenállást képviselő gének, a replikációs gének (P„) és a treonin-operon promotor- és szerkezeti részeit jelképezik.

A 2. ábra a pYNI plazmid restrikciós rajzát szemlélteti. A jelölések megegyeznek az 1. ábrán alkalmazottakkal.

Azt tapasztaltuk, hogy a B. coli C600 törzs hibridplazmidjaival végzett transzformáció nem növelte jelentős mértékben a sejtek treonin-szintézisét.

Amikor ugyanezt a donortörzset és vektorként a pBR 322 plazmidot alkalmaztuk, a Hind III típusú specifikus endonukleázzal együtt, a pYNII hibridplazmidot kaptuk, amely a treonin-operin mindhárom génjét tartalmazza.

A 3. ábrán a pYNII plazmid restrikciós rajzát mutatjuk be. A jelölések azonosak az 1. ábrán használtakkal.

A befogadó törzsként alkalmazott Escherichia coli VL334 kapott hibridplazmidjával végzett transzformáció megnövelte a treonintermelést. A fermentálás folyamán az aminosav 4 g/1 koncentrációra dúsul fel a táptalajban. Vizsgálataink tehát azt bizonyítják, hogy a treonintermelés növeléséhez szükség van a treonin-operon mindhárom génjének az amplifikálására. Emellett lehetővé vált az endonukleáz enzimek segítségével az Escherichia coli olyan kromoszóma-töredékének a kiválasztása, amely a treonin-operon valamennyi génjét tartalmazza.

A homoszerindehidrogenáz I (a thrA gén terméke) specifikus aktivitásának az Escherichia coli VL334 törzs sejtjeinek extraktumából (ρΥΝΠ) végzett meghatározása azt mutatta, hogy az több mini 60-szorosa az olyan sejtextraktumokban fennálló enzimaktivitásnak, ahol a sejtek a thrA génnek csak egy másolatát tartalmazzák. Egyidejűleg a treonintermelés mértéke alapján a vad típusú treonin-operont tartalmazó hibridplazmidot hordozó Escherichia coli VL334 (pYNII) törzs csak alig múlja felül a plazmidmentes Escherichia coli VNIIgenetika MG442 törzset, amelynek a thrA génjében olyan mutáció található, hogy az gátolja e gén termékeit képező enzimek treoninnal történő alloszterikus gátlását. Feltételeztük, hogy az Escherichia coli VL334 (pYNII) törzs sejtjei treonin-szintézisének nem túlságosan magas szintje arra vezethet 5 vissza, hogy a felhalmozódó treonin csökkenti a treonin szintézisét szabályozó eúzimek aktivitását. Ezért célszerűnek látszik donortörzsként a treonin-operon klónozásához az Escherichia coli VNIIgenetika MG442 törzs alkalmazása, amelynél zavart a treoninszintézis negatív szabályozása.

Ha donortörzsként az Escherichia coli VNIIgenetika MG442 törzset, vektorként pedig a pBR 322 plazmidot használjuk, és a DNS-töredékeket a Hind III endonukleáz enzimmel hozzuk létre, akkor a pYNIO hibridplazmidot kapjuk, amelynek a restrikciós térképe nem tér el a pYNII 3. ábrán bemutatott térképtől. Miután a befogadó Escherichia coli VL334 törzset a pYNIO plazmiddal transzformáltuk, az Escherichia coli VL334 (pYNIO) törzset kaptuk, amely 12-13 g/1 treonint szintetizál.

Ennek megfelelően, az aminosavat termelő törzs hibridplazmid segítségével történő előállításához olyan mutációra van szükség a klónozandó DNStöredéknél, amely zavarja az aminosavszintézis negatív szabályozását.

A különböző molekulasúlyú hibridplazmidokkal végzett kísérletek során - az ismert adatokkal összhangban - azt tapasztaltuk, hogy a hibridplazmidok másolatainak száma, a baktériumkromoszómái a vonatkoztatva, 10—22 között ingadozik, és a molekulasúlytól függ. Minél kisebb a plazmid molekulasúlya, annál több másolata van jelen a sejtben Másrészt viszont a plazmidban található gének által szabályozott enzimaktivitás egyenes arányban növekszik a plazmid másolatainak számával. Ebben az összefüggésben célszerűnek látszik az illető aminosav szintézisét szabályozó géneket hordozó hibridplazmid nagyságának csökkentése. és a genetikai ballasztanyag eltávolítása.

Amikor a hibridplazmidot hordozó sejtek extraktumaiból meghatároztuk a homoszerindehidrogenaz I aktivitását, azt az eredményt kaptuk, hogy a nagy treonin- és izoleucinkoncentrációk (1 π g/ml) harmadára-negyedére csökkentik az enzim aktivitását. Ezt az amplifikált treonin-operon repressziója megnyilvánulásának tekintjük. Ezért ahhoz, hogy a legnagyobb mértékben jusson kifejezésre az amplifikált treonin-operon, célszerűen derepressziós viszonyokat hozunk létre.

A befogadó törzsben a derepressziós feltételek a reptesszor fehérje szintézisét szabályozó gén károsításával vagy a repressziós kofaktor szintézisének megzavarásával hozhatók létre. így például a treonin-operon derepresszióját olyan mutációnak a befogadó törzsbe való bevitelével érhetjük el, amely megzavarja az izoleucin szintézisét. Az izoleucinnak ugyanis szerepe van a treonin-operon represzsziójában. Kiderült, hogy a VL334 befogadó törzsben az izoleucin szintézisét részben blokkoló ilvA mutáció jelenlétében a treoninszintézis a hibridplazmid szabályozásának hatására 4-S-szörösre növikszik.

Amint arra már rámutattunk, a VL334 törzs amelynél a thrC mutáció blokkolja a treonin szintézisé:, az ilvA mutáció pedig a treonin metabolizmusán; k szomszédos szakaszát, az izoleucinná való

190 999 átalakulását részlegesen blokkolja - képes arra, hogy izoleucin távollétében nagy treonin-koncentrációjú táptalajon növekedjen. Nyilvánvaló, hogy az izoleucin nélküli táptalajon való növekedésre azok a hibridplazmidot tartalmazó sejtek is képesek, amelyek jelentős mennyiségű treonint tudnak szintetizálni. Valóban, miután a VL334 törzset a treonin-operon mindhárom génjét hordozó hibridplazmidokkal transzformáltuk, a sejtek képesek lesznek arra, hogy további növekedési faktorokat nem tartalmazó, glukózból és ásványt anyagokból álló táptalajon is növekedjenek.

A teljes treonin-operont hordozó hibridplazmidokat tartalmazó sejtek - abban az esetben, ha a körülmények nem szelektívek - könnyen elveszítik a hibridpfázmidot, és kihasad a befogadó kiindulási törzs, amely a treonint és az izoleucint tekintve auxotróf. Ha a növekedés ásványi anyagú, pótlólagos növekedési faktorokat nem tartalmazó táptalajon történik, a hibridplazmidot hordozó sejtek szelektív módon előnyben részesülnek azokhoz a sejtekhez képest, amelyek a plazmidot elveszítették. Ilyen körülmények között jelentős mennyiségű treonint szintetizálnak, amely a táptalajon kiválik. A táptalajon feldúsuló treonin elősegítheti azoknak a sejteknek a növekedését, amelyek a hibridplazmidot elveszítették.

Csak 10-15 g/1 közötti treonin-koncentrációnál közelíti meg a VL334 törzs plazmidmentes sejtjeinek növekedési sebessége az olyan, hibridplazmidot hordozó sejtekét, amelyek az Escherichia coli VNlIgenetika MG442 donortörzstől származó teljes treonin-operont tartalmaznak. így az ámutáció, amely részlegesen blokkolja az illető aminosav metabolizmusának szomszédos szakaszát, biztosítja az aminosavszintézist fermentációs körülmények között szabályozó géneket hordozó hibridplazmidokat tartalmazó sejtek fejlődését.

Az aminosavakat termelő törzsek előállítására irányuló találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy genetikai módszerekkel, a kívánt aminosav bioszintéziséhez szükséges gének dózisának megnövelésével olyan törzsekhez jussunk, amelyek pótlólagos növekedési faktorokat nem igényelnek, és megnövelt mértékben képesek a kívánt aminosav termelésére.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példák segítségével részletesen ismertetjük.

I. példa

Donortörzsként az Escherichia coli VNIIgenetika MG442 törzset alkalmazzuk. A tÖTzs ellenálló a treoninnal analóg beta-hidroxi-norvalinnal szemben, és olyan mutációt tartalmaz a thrA génben, amely zavarja a homoszerindehidrogenáz I enzim - ez kulcsenzim a treonin bioszintézisénél - aktivitásának treonin hatására fellépő alloszterikus gátlását.

DNS-vektormolekulaként a pBR322 plazmidot alkalmazzuk. Ez a plazmid a CoIEI replikonon alapul, és olyan géneket tartalmaz, amelyek ellenállóvá teszik ampicillinnel, penicillinnel (Ap^r) és tetraciklinnel (Te^r) szemben.

A donortörzsként alkalmazott Escherichia coli VNlIgenetika MG442 törzs DNS-ktomoszómájának töredékét és a pBR322 plazmidot önmagában ismert módon választjuk el. Hibridplazmidok létrehozása céljából a donortörzs DNS-kromoszómájának töredékét és a pBR322 plazmidot 1,5 órán át kezeljük 37 °C-on Hindin endonukleázzal, 10 percig melegítjük 65”C-on, és 18 óra alatt 6°C-on újraegyesítjük az enzimet a T4 fágok polinukleotidligázával. Az így nyert eleggyel transzformáljuk a C600 thrleu~ törzs sejtjeit. A transzformánsokat 500 mikrogramm/ml penicillint és 50 mikrogramm/ml leucint tartalmazó táptalajon választjuk ki. Kétféle fenotípusba tartozó baktériumokat kapunk (Ap^rTc^sThr⁺Leu~ és ApTcThr^Leu'). A kromoszómán kívüli DNS elválasztásához és analíziséhez önkényesen az egyes fenotípusokba tartozó transzformált termékek egy-egy kiónját választjuk ki. Az ApTcThr+Leu^- fenotípusba tartozó transzformánsokból a pYNIO hibridplazmidot különítjük el, amely a pBR322 plazmid töredékét tartalmazza, továbbá a donor 5,8 megadalton molekulasúlyú kromoszómatöredékét különítjük el. A hibridplazmiddal transzformáljuk a treoninoperon különböző génjeiben mutációkat hordozó Estherichia coli törzseket, abból a célból, hogy megvizsgáljuk a treonin-operon mindhárom génjének a jelenlétét és működését. A treonin-operon alábbi génjeiben fennálló mutációkat tartalmazó Escherichia coli törzseket transzformáljuk a hibridplazmiddal: Gtl4 (thrA,'), Gifl02 (thrA₂), Gt25 (thrB ), VL334 (thrC~). Mindegyik esetben a treoninnak megfelelően prototróf transzformált baktériumtörzseket kapunk, és ez arra mutat, hogy a plazmidban a treonin-operon mindhárom génje (thrA, thrB és thrC) jelen van.

A kromoszóma-DNS töredékének beépülése a Hind III endonukleáz enzimmel felhasított pBR322 plazmidba azzal a következménnyel jár, hogy inaktiválódnak a tetraciklinnel szembeni ellenállóképességet meghatározó plazmidgének, mivel az endonukleáz hatására bekövetkező elhasadási szakasz e gének promotorában helyezkedik el, amint az a 4. ábrán látható.

A másik fenotípusba (Ap'TcThr⁺ Leu“) tartozó baktériumokból 11,4 megadalton molekulasúlyú plazmidot különítünk el. Ennek a pYN6 jelzésű plazmidnak a restrikciós analízise azt az eredményt szolgáltatta, hogy a plazmid a DNS-kromoszóma Hind III töredékéből (5,8 megadalton molekulasúlyú) és a pBR322 plazmid két másolatából - ezek „fej-láb” típus szerint kapcsolódnak össze - áll, amint az a 4. ábrán látható. A 4. ábra a pYN7 plazmid restrikciós rajzát szemlélteti. A szaggatott vonallal kihúzott körív azokat a plazmidtöredékeket jelképezi, amelyekből a pYN7 plazmid felépül. A többi jelölés azonos az 1. ábrán alkalmazottal.

A pBR322 plazmidnak a Hind III endonukleázza) történő felhasítása a promotor széttörését eredményezi azoknál a géneknél, amelyek a tetraciklinnel szembeni ellenálló képességet határozzák meg. A képződött töredékeknek a két lehetséges orientáció valamelyike szerinti összekapcsolása pontosan helyreállítja a promotor szerkezetét, és biztosítja

190 999 azoknak a géneknek a működését, amelyek a tetraciklinnel szembeni ellenállóképességet határozzák meg. Ennek következtében a pYN6 plazmidot tartalmazó sejtek ellenállnak ennek az antibiotikumnak. A treonin-operon különböző génjeiben mutációkat tartalmazó Escherichia coli törzseknek a pYN6 plazmiddal történő transzformációja azt mutatja, hogy ebben a plazmidban a treoninoperon mindhárom génje jelen van és működik..

Treonint termelő törzs előállításához a kapott pYN6 hibridplazmidot használjuk, amellyel a thrC 1010 és ilvA 442 mutációkat hordozó befogadó Escherichia coli VL334 törzset transzformáljuk. A thr C1010 mutáció zavarja a treoninszintézist, és ezáltal lehetővé válik hibridplazmidot tartalmazó transzformánsok kinyerése.

Az ilvA 442 mutáció részlegesen blokkolja a treonin metabolizmusának szomszédos szakaszát - ez az első reakció a treoninnak izoleucinná történő átalakulása során - és így zavarja a treonin átalakulását s az izoleucin szintézisét (az izoleucin részt vesz a treonin-operon repressziójában).

Az izoleucin szintézisének blokkolása nem teljes azonban, és ellensúlyozható a sejt nagyobb treonintartalmával.

A pYN6 plazmidot tartalmazó transzformánst olyan táptalajon különítjük el, amely 500 mikrogramm/ml penicillint és 20 mikrogramm/ml tetraciklint tartalmaz, treonin és izoleucin azonban nincs jelen. A kapott törzs neve Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN6). A törzs ellenáll penicillin és tetraciklin behatásával szemben, és aminosavakat nem tartalmazó táptalajon is képes a növekedésre. A törzsnek az a képessége, hogy izoleucin nélkül is növekedni tud, összefüggésben van azzal, hogy igen nagy a treonintartalom az Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYNó) törzs sejtjeiben. Ez a képesség a mutáns treonin-operon amplifikációjának a következménye. így szelektív módon előnyben részesülnek a hibridplazmidot hordozó sejtek azokhoz a sejtekhez képest, amelyek a hibridplazmidot elveszítették. A kapott Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN6) törzs sejtjei kromoszómánként a pYN6 plazmidnak körülbelül 10 másolatát tartalmazzák. A 3. példában adjuk meg azokat az eredményeket, amelyeket a törzs aminosav-termelőképességének vizsgálata során kaptunk.

2. példa

Az 1. példában leírtak szerint nyert pYN6 pYNIO plazmidot Hind III és Bam Hl specifikus endonukleáz enzimekkel kezeljük. Az enzimeket 65 ’C-on 10 percig történő melegítéssel inaktiváljuk, majd az elegyet T4 fág polinukleotidligázzal •kezeljük. A kapott készítménnyel transzformáljuk a C600 baktériumtörzset, és ApTc’Thr⁴ fenotipusú kiónt választunk ki. Az önkényesen kiválasztott klónból 5,7 megadalton molekulasúlyú, pYN7 jelzésű plazmidot különítünk el. Amint az a restrikciós analízis mutatja, amikor ezt a plazmidot Hind III és Bam Hl endonukleázokkal elhasitjuk, két töredéket kapunk, amelyek közül az egyik a pBR322 plazmid (molekulasúlya 2,7 megadalton) jelentős részének felel meg, míg a másik a VNIIgenetika MG442 törzs DNS-kromoszómájának egy töredéke (molekulasúlya 3,0 megadalton). A restrikciós analízis eredménye az 5. ábrán látható. A pYN6 plazmid vázlatos rajzán ezeket a töredékeket a szaggatottan kihúzott körívek jelképezik (lásd a 4. ábrát).

A treonin-operon különböző génjeiben mutációkkil rendelkező törzsek pYN7 plazmiddal történő ‘ranszformációja azt mutatja, hogy ebben a plazmidban a treonin-operon mindhárom génje működik.

T eonint termelő törzs előállításához a pYN7 plazmidot alkalmazzuk az Escherichia coli VL334 törzs transzformációjára. Ez a törzs mutációkat hordoz a thrC és ilvA génekben. A transzformációval nyert terméket, amely átvette a pYN7 plazmidot, olyan közegen különítjük el, amely treonint és izolcucint nem, azonban 500 mikrogramm/ml penicillint tartalmaz. Az így nyert törzs elnevezése Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN7). Ez a törzs ellenálló penicillinnel szemben, és aminosavakat nem tartalmazó táptalajban is képes növekedésre. A nyert VNIIgenetika VL334 (pYN7) törzs sejtjei kromoszómánként körülbelül 320 másolatot tartalmaznak a pYN7 plazmidból. A 3. példában adjuk meg azokat az eredményeket, amelyeket a törzs aminosav-termelőképességének vizsgálata során kaptunk. ,

3. példa

Az 1. és 2. példában leírt eljárással kapott Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN6), Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN7) és Escherichia coli VNIIgenetika MG442 törzsekkel, az aminosav-termelőképesség összehasonlítása céljából beoltunk - 0,5 mg/ml benzil-penicillin-káliumsót tartalmazó ferde Adams-féle agar-agar táptalajról (1,0 g/1 NH„C1, 1,5 g/1 KH₂PO₄, 3,5 g/1 Na₂HPO₄, 0,2 MgSO₄.7H₂O + 20 g/1 agar) oltókacs segítségével - 250 ml-es Erlenmeyer lombikokban elhelyezett 30 ml folyékony, 1 % glükózt tartalmazó Adams-féle táptalajt. Beoltás után a lombikokat forgó rázógépbe helyezzük (200 fordulat percenként), és 18 órán át végezzük az inkubálást 37 ’Con. \z így nyert oltóanyag 1-1 ml mennyiségével beoltjuk az előzetesen sterilizált fermentációs táptalajokat, (1-3. számú), amelyekből mindig 15 ml-t töltünk 250 ml térfogatú Erlenmeyer lombikokba.

A fermentációs táptalajok összetétele az alábbi:

1. számú táptalaj: 30 g/1 glukóz, 10 g/1 ammóniumszulfát, 2 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát, 1 g/1 magnézium-szulfát, 20 g/1 kálcium-karbonát.

2. számú táptalaj: 50 g/1 glukóz, 15 g/1 ammóniumszulfát, 2 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát, 1 g/1 magnézium-szulfát, 20 g/1 kálcium-karbonát.

3. számú táptalaj: 80 g/1 glukóz, 20 g/1 ammónium-szulfát, 2 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát, 1 g/1 magnézium-szulfát, 30 g/1 kalcium-karbonát.

A fermentációs táptalajokat autoklávban sterilizáljuk, 0,5 at túlnyomáson, 15 percig. A kalciumkart onátot különállóan sterilizáljuk, és a sterilizá7

190 999 lást követően adjuk a táptalajhoz. A kalciumkarbonát hozzáadása után a táptalaj pH-értéke 6,8-7,2.

Az 1-3. számú táptalajokat tartalmazó lombikokat a fentebb felsorolt törzsek tenyészetével történő beoltás után forgó rázógépbe helyezzük (200 fordulat percenként), és 48 órán át inkubálunk 37 °C-on. A sejtek 95 %-a a fermentálás után is megőrzik azt a képességüket, hogy treonin és izoleucin nélkül is növekedjenek. Az ampicillinnel szembeni ellenállóképességük plazmidok jelenlétét mutatja.

A törzsek által termelt treonin mennyiségét az 1. táblázatban adjuk meg.

Az L-treonin fermentorban történő előállítására a 2. példában ismertetett módon nyert Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN7) törzsből készített oltóanyag 25 ml mennyiségét laboratóriumi fermentorba mérjük be. A fermentorba előzetesen beviszünk 250 ml 1. számú táptalajt. A fermentációs feltételek a következők: a hőmérséklet 37 °C, a készülékbe vezetett levegő mennyisége 1,1 (a rotamérő szerint), a keverő fordulatszáma 900/perc. A fermentálás kezdete után 28 órával megkezdjük az 1. számú táptalaj 10-szeres koncentrátumának beadagolását (térfogat: 250 ml). A koncentrátum azonban kalcium-karbonátot nem tartalmaz. Az adagolás 1,5 ml/óra sebességgel, perisztaltikus sziattyú segítségével történik. 51 órával a fermentálás kezdete után 20 g/1 mennyiségű treonin halmozódik fel a táptalajban. A sejtek a fermentálás után a pYN7 plazmidot tartalmazzák. A vizsgálati eredmények az 1. táblázatban láthatók.

Szabadalmi igénypontok

Claims (2)

1. Eljárás L-treonint termelő törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli VNIlge⁵ netika MG 442 donortörzs DNS-kromoszómájának Hind 111 endonukleáz enzimmel nyert, a treonin-operon génjeit tartalmazó töredékét DNSvektormolekulaként pBR332 plazmiddal egyesítjük, ezáltal olyan hibridplazmidot kapunk, amely ¹⁰ a pBR 322 plazmidnak és a donortörzs DNSkromoszóma megfelelő töredékének két másolatából áll, ezzel a hibridplazmiddal az L-treonin szintézisét blokkoló, az L-izoleucin szintézisét pedig részlegesen blokkoló mutációkkal rendelkező Es¹⁵ cherichia coli VL334 befogadó törzs sejtjeit transzformáljuk, és a kapott, L-treonint termelő Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN6) törzset amely B-1649 számon lett letétbe helyezve a Szovjetunió Genetikai és Ipari Mikroorganizmus kivá^2G lasztó Tudományos Kutatóintézetéhez tartozó Központi Ipari Mikroorganizmus Múzeumban elkülönítjük.

2. Eljárás L-treonint termelő törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli VNIIge26 netika MG442 donortörzs DNS-kromoszómájának Hind III endonukleáz enzimmel nyert, a treonin-operon génjeit tartalmazó töredékekét DNS vektormolekulaként pBR322 plazmiddal egyesítjük, a kapott, 11,2 megadalton molekulasúlyú, a

3f pBR322 plazmid két másolatából és a donortörzs DNS-kromoszómalöredékéből álló hibridplazmidot Hind III és Bam Hl specifikus endonukleáz

I. láb ázat

Törzs A törzs sejtjeiben lévő plazmid típusa Fermentációs táptalaj sorszáma Termelt treonin- mennyiség g/1 Escherichia coli VN1I- 1 3,0 genetika MG442 nin ;s plazmid 2 3,3 Escherichia coli VNII- 1 7,0 genetika VL334 (pYN6) plazmid pYN6 2 11,2 3 14,4 Escherichia coli VNII- 1 20,0* genetika VL334 (pYN7) plazmid pYN7 2 13,3 3 16,5

* Táptalaj-adagolással ellátott fermentorban.

Az L-treonint önmagában ismert módon különítjük el a táptalajtól.

Amint a táblázat adataiból kitűnik, az aminosavat azok a törzsek termelik a legnagyobb mennyiségben, amelyek hibridplazmidot tartalmaznak.

enzimekkel kezeljük, a képződött töredékeket polinukleotidligáz enzimmel kezelve újra egyesítjük, és a kapott, 5,7 megadalton molekulasúlyú, a pBR322 plazmid egy molekulájából és a donortörzs DNS⁵'’ kromoszómatöredékéből álló hibridplazmiddal transzformáljuk az L-treonin szintézisét blokkoló, az L-izoleucin szintézisét pedig részlegesen blokkoló mutációkkal rendelkező Escherichia coli VL334 befogadó törzs sejtjeit, és a kapott, L-treonint termeló Escherichia coli VNIIgenetika VL334 (pYN7) törzset, - amely Bl 684 számon lett letétbe helyez-