FI80700C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara mitomycinanaloger. - Google Patents

Description

1 80700

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten mitomysiiniana-logien valmistamiseksi

Keksintö koskee uusien mitomysiinianalogien valmis-5 tusta, jotka sisältävät disulfidiryhmän. Nämä yhdisteet ovat mitomysiini A:n analogeja, joissa 7-alkoksiryhmässä on orgaaninen substituentti, joka tuo yhdisteeseen disulfidiryhmän. Mitomysiini A on antibiootti, jonka käyttökelpoisuus on todettu, ja sen 7-0-substituoidulla mitosaani-10 analogeilla on samankaltainen käyttökelpoisuus.

Nimistö - Chemical Abstractsin systemaattinen, hiljattain tehtyyn korjaukseen [Shirhata et ai., J. Am. Chem. Soc., 105, 7199 (1983)] perustuva nimi on [laS-(lap, 8β, 8ao, 8bp)]-8-(((aminokarbonyyli)ok-15 si) metyyli]-6,8a-dimetoksi-l,la,2,8,8a,8b-heksahydro-5-metyyliatsirino-[2 ' , 3 ' , 3,4]pyrrolo[l,2-a]indoli-4-7-dio-ni, jonka mukaan atsirinopyrroloindolirengasjärjestelmä on numeroitu seuraavasti: 20 7 8 25

Mitomysiinikirjallisuudessa paljon käytetty tri-viaalinimistö nimeää edellä esitetyn rengasjärjestelmän, johon on liittynyt useita mitomysiineille tunnusomaisia substituentteja, mitosaaniksi.

30 10 o CH2OCONH2 1 3 CH3y^NflS>\ o 4 2 80700 Tämän systeemin mukaan mitomysiini A on 7,9a-dimet-oksimitosaani ja mitomysiini C on 7-amino-9a-metoksimito-saani. Mitä tulee tämän keksinnön mukaisten tuotteiden stereokemialliseen konfiguraatioon, niin kun ne identifi-5 oidaan nimen perusosalla "mitosaani" tai rakennekaavalla, tarkoitetaan, että niillä on sama stereokemiailinen konfiguraatio kuin mitomysiini A:11a tai C:llä.

10 q CI^OCONl·^ Mitomysiini A R=R^=OCH^ R I R-, Mitomysiini C R=NH~, — \ R^och CHXx)s^ 3 o N\ 15

Mitomysiini C on antibiootti, jota valmistetaan fermentoimalla ja joka on nykyään myynnissä Food and Drug Administrationin hyväksymänä mahalaukun tai haiman hajape-20 säkkeisen adenokarsinooman hoitoon tutkittuina yhdistelminä muiden hyväksyttyjen kemoterapeuttisten aineiden kanssa ja lievittävään hoitoon, kun muut hoitotavat eivät ole onnistuneet (Mutamycir^', Bristol Laboratories, Syracuse, New York 13221, Physicians' Desk Reference, 37. pai-25 nos, 1983, s. 747 ja 748). Mitomysiini C ja sen valmistus fermentoimalla ovat US-patentin 3 660 578 kohteena, mainittu patentti on myönnetty 2.5. 1972 ja sille on pyydetty etuoikeutta aikaisempien hakemusten, mm. Japanissa 6.4.1957 tehdyn hakemuksen perusteella.

30 J.S. Webb et ai. Lederle Laboratories Division Ame rican Cyanamid Company, J. Am. Chem. Soc., 84, 3185 -3187, (1962) julkaisivat ensiksi mitomysiinien A, B ja C ja profiromysiinin rakenteet. Yksi tässä rakennetutkimuksessa mitomysiini A:n ja mitomysiini C:n suhteen selvit-35 tämiseksi käytetyistä kemiallisista muuttamisreaktioista 3 80700 oli ensinmainitun, 7,9a-dimetoksimitosaanin, muuttaminen reaktiolla ammoniakin kanssa Jälkimmäiseksi, 7-amino-9a-metoksimitosaaniksi. Mitomysiini A:n 7-metoksiryhmän korvautuminen on osoittautunut huomattavan mielenkiintoiseksi 5 reaktioksi valmistettaessa mitomysiini C:n johdannaisia, joilla on kasvainten vastainen teho. Hiljattain on osoittautunut, että asemien 1, la, 8a ja 8b stereokemiallinen konfiguraatio on sellainen kuin edellä Chemical Abst-ractsin nimistöön viitaten esitettiin [Shirata et ai., J. 10 Am. Chem. Soc., 105 , 7199 - 7200 (1983)]. Aikaisemmassa kirjallisuudessa puhutaan enantiomeeristä.

Seuraavissa artikkeleissa ja patenteissa käsitellään muunmuassa mitomysiini A:n muuttamista 7-(substituoi-tu amino)mitomysiini C-johdannaiseksi, jolla on kasvaimia 15 vastustava teho. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli valmistaa johdannaisia, jotka olivat tehokkaampia ja jotka varsinkin olivat vähemmän toksia kuin mitomysiini C; Matsui et ai., J., Antibiotic, XXI, 189-198 (1968); Konishita et ai ., J . Med. Chem. 14,103-109 (1971); 20 Iyengar et ai ., J. Med . Chem., 24, 975-981 (1981);

Iyengar, Sami, Remers ja Bradner, Abstracts of Papers, 183rd Annual Meeting of the American Chemical Society, Las Vegas, Nevada, maaliskuu 1982, Abstract No. MEDI 72; Consulich et al., US-patentti n:o 3 332 944, myönnetty 25 25.7.1967;

Matsui et al., US-patentti n:o 3 420 836, myönnetty 7.1.1969;

Matsui et al., US-patentti n:o 3 450 705, myönnetty 17.6.1969; 30 Matsui et al., US-patentti n:o 3 514 452, myönnetty 26.5.1970;

Nakano et al., US-patentti n:o 4 231 936, myönnetty 4.11.1980;

Remes, US-patentti n;o 4 268 676, myönnetty 19.5.1981.

35 Seuraavissa patenttihakemuksissa käsitellään sei- 4 80700 laisten 7-(substituoitu amino)mitomysiini C-johdannaisten valmistusta, joissa substituentti tuo yhdisteeseen disul-£ idisidoksen:

Kono et ai., EPO-patenttihakemus n:o 116 208 (1984); 5 Vyas et ai., GB-patenttihakemus n:o 2 140 799 (1984).

7-alkoksisubstituoituja mitosaaneja, jotka ovat rakenteeltaan lähellä mitomysiini Aita, kuvataan käyttökelpoisina antibiootteina, joilla on aktiivisuutta eläin-kasvainkokeissa, julkaisussa Urakawa et ai♦, J. Antibio-10 ties, 23, 804 -809 (1980).

Mitomysiini C on päämitomysiini, jota tuotetaan fermentoimalla ja se on kaupallisesti saatava muoto. Tekniikkaa, jolla mitomysiini C nykyään muutetaan mitomysiini A:ksi, haittaavat lukuisat puutteellisuudet. Hydrolysoi-15 taessa mitomysiini C vastaavaksi 7-hydroksi-9a-metoksirni-tosaaniksi ja metyloitaessa tämä aine tarvitaan diatsome-taania, joka on hyvin vaarallinen aine käsiteltäväksi tuo-tantomittakaavassa, ja 7-hydroksivälituote on hyvin epästabiili [Matsui et ai♦, J. Antibiotics, XXI; 189 - 198 20 (1968)]. Yhdessä menetelmässä, jossa nämä vaikeudet pyri tään välttämään, käytetään 7-asyylioksimitosaaneja (Kyowa Hakko Kogyo KK JP-patentti n:o J5 6073-085, Farmdoc No. 56227 D/31). Urakawan et aliin [J. Antibiotics, 23, 804-809 (1980)] kuvaama mitomysiini A:n alkoholyysi rajoittuu 25 vain tiettyjen 7-alkoksirakennetyyppien valmistukseen lähtöaineina käytettyjen alkoholien saatavuuden ja reaktiivisuuden vuoksi.

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten kaavan (II) tai (III) mukaisten mitomy-30 siinianalogien ja niiden myrkyttömien farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, 35

II

5 80700 o n CH2OCNH2

5 R3-Alk, -SS- (CH„) ~-0 v. A

ϊϊ\"3 “3·" <»> ° 10 o O CH2OCNH2 r4-ss- ^,och3 15 CH3’7X|^\^^Xn‘h (III) 20 joissa kaavoissa Alkx on etyleenl tai metyleeni, R3 on asetyylioksi, 1,2-dihydroksietyyli, karboksi, 1-karboksi-aminometyyli tai l-metyyli-imidatsol-2-yyli, ryhmä NH, NHC0CH2CH2CHCOO'Na* tai dimetyyliamino, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

—CH

2 3 CONHCH2 COO- Na* 4 R4 on fenyyli, 4-nitrofenyyli, 4-metoksifenyyli, 4-amino-fenyyli, 2-karboksifenyyli, 4-nitro-3-karboksifenyyli, 4- 5 pyridyyli, 2-(3-nitropyridyyli).

6 Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet ovat eläinten 7 kokeellisten kasvaimien inhibiittoreita. Erityisesti ai 8 neet, jotka tässä on esitetty esimerkkien 17, 20 ja 21- 9 34 yhdisteinä, ovat uusia aineita. Niitä käytetään samaan 10 tapaan kuin mitomysiini C:tä. Käytetyt annostukset sääde- 11 tään sen mukaisesti, mikä on niiden toksisuus verrattuna 6 80700 mitomysiini C:n toksisuuteen. Niissä tapauksissa, joissa uuden yhdisteen toksisuus on vähäisempi, käytetään suurempia annoksia.

Kaavojen II ja III mukaisia mitosaaneja valmiste-5 taan keksinnön mukaisesti siten, että ainakin yksi ekvivalentti triatseenia, jolla on kaava (V) tai (VI)

Ar-N=N-NH- ( CH2 )2 -SS-Alkj -R3 Ar-N=N-NH-(CH2 )2 -SS-R4 (V) (VI) 10 saatetaan reagoimaan yhden ekvivalentin kanssa mitosaania, jolla on kaava (IV)

O

O CH2OCNH2

HO II W

I N-H (IV) 0 W" 20 joissa kaavoissa R3 , R4 ja AlkL ovat edellä määritellyt ja Ar on diatsotoitavissa olevan aromaattisen amiinin orgaaninen tähde, sopivissa reaktio-olosuhteissa inertissä orgaanisessa liuottimessa lämpötilassa noin 0 - 60°C, kun-25 nes riittävä määrä kaavan (II) tai (III) mukaista yhdistettä on muodostunut, tai b) ainakin yksi ekvivalentti kaavan R3 Alk:SH tai kaavan R4 SH mukaista tiolia saatetaan reagoimaan yhden ekvivalentin kanssa mitosaania, jolla on kaava (Ib) 30 /N02 ° /—ζ O CH20iNH2 (' ^^CH^-O OCH, (Ib) ch3 il k

Il \ J^n-h 7 807C0 joissa kaavoissa R3 , R4 ja Alkx ovat edellä määritellyt, mahdollisesti ainakin yhden emäsekviValentin läsnäollessa, inertissä liuottimessa lämpötilassa noin 0 - 60°C, kunnes riittävä määrä kaavan (II) tai (III) mukaista yhdistettä 5 on muodostunut.

Ilmaisu myrkytön, "farmaseuttisesti hyväksyttävä suola" on tarkoitettu käsittämään kaavan II tai III mukaisten yhdisteiden suolat, minkä tahansa myrkyttömän farmaseuttisesti hyväksyttävän hapon tai emäksen kanssa. Täl-10 laiset hapot ovat hyvin tunnettuja ja niihin kuuluvat ve-tykloridi, vetybromidi, rikki-, sulfamiini-, fosfori-, typpi-, maleiini-, fumaari-, meripihka-, oksaali-, bent-soe-, metaanisulfoni-, viini-, sitruuna-, kamferisulfo-ni- ja levuliinihappo yms. Myös tällaiset emäkset ovat 15 hyvin tunnettuja ja niitä ovat esim. ei-toksiset metalli-suolat kuten natrium-, kalium-, kalsium-, ja magnesiumsuo-lat, ammoniumsuolat ja ei-toksisten amiinien, esim. tri-alkyyliamiinien, prokaiinin, dibentsyyliamiinin, pyridii-nin, N-metyylimorfoliinin, N-metyylipiperidiinin yms.

20 amiinien suolat. Suolat valmistetaan alalla tunnetuilla menetelmillä.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä saatetaan kaavan IV mukainen mitosaani reagoimaan kaavan V tai VI mukaisen triatseenin kanssa kuten on esitetty kaaviossa 2.

25 Kaavio 2 0 0 CH.OCNH» HO Π fc 2 2 yVV0CH3

30 CH3aVx^]>-H

Ar-N=N-NH-(CH2)2-SS-Alk1-R3

+ —---> II tai III

35 tai Ar-N=N-NH-(CH2)2-SS-R4

VI

8 80700 jossa R3, R4 ja Alkj ovat edellä määritellyt ja Ar on di-atsotoitavissa olevan aromaattisen amiinin orgaaninen tähde.

Kaavan V tai VI mukaisia aryylitriatseeneja voidaan 5 valmistaa tavanomaisilla menetelmillä lähtien aminodisul-fideista, joilla on kaava XII

R2 SS-(CH2 )2 NH2 XII

10 joita voidaan vaihtoehtoisesti kuvata kaavoilla XIII ja XIV

R3 -Alkj -SS-(CH2 )2NH2 ja R4-SS-(CH2 )2NH2 XIII XIV

15

Kaavan XIli tai XIV mukaiset aminodisulfidit ovat tunnettuja yhdisteitä ja niitä voidaan valmistaa lukuisilla menetelmillä. Niitä voidaan valmistaa esimerkiksi sopivan tiolin, jolla on kaava R3AklxSH tai R4 SH, reaktiolla 20 Bunten suolan kanssa, jolla on kaava

NH2 (CH2 )2 SS03Na XV

tai sulfenyylitiokarbonaatin kanssa, jolla on kaava

25 O

II

NH2 (CH2 ) 2 SSCOCHj XVI

Klayman et ai., [J. Org. Chem., 29, 3737 - 3738 (1964)] ovat valmistaneet Bunte-suolamenetelmällä seuraa-30 vat yhdisteet: 2-aminoetyyli-n-butyylidisulfidi; 2-aminoetyyli-n-heksyylidisulfidi; 2-aminoetyyli-n-oktyylidisulfidi; 2-aminoetyylifenyylidisulfidi; 35 2-aminoetyylibentsyylidisulfidi.

Il 9 80700

Metanolin on todettu olevan edullinen reaktioliuo-tin Bunten suolan ja tiolin väliselle reaktiolle. Tätä liuotinta käytettäessä reaktiolämpötilat 9 - -10eC on todettu edullisiksi. Muita liuottimia käytettäessä olivat 5 korkeammat lämpötilat tarpeen. Tämän menetelmä tärkein haitta on symmetristen disulfidien muodostuminen sivutuotteena, oletettavasti tuloksena halutun sekadisulfidin dis-proportionoitumisesta.

Kaavojen XIII ja XIV mukaisina lähtöaineina käytet-10 täviä sekadisulfideja valmistetaan edullisesti sopivan tiolin ja kaavan XVI mukaisen sulfenyylitiokarbonaatin välisellä reaktiolla. Tämä on menetelmä, joka on kuvattu julkaisussa S.J. Brois et ai., J. Am. Chem. Soc., 92 7629 - 7631 (1970). Tyypillisesti tämä valmistusmenetelmä kä-15 sittää tiolin lisäämisen kaavan XVI mukaisen aminoalkyyli-sulfenyylitiokarbonaatin metanolilluokseen, minkä jälkeen reaktion annetaan tapahtua lämpötila-alueella 0 - 25°C. Reaktioajat vaihtelevat käytännöllisesti katsoen hetkellisestä reaktiosta useihin tunteihin riippuen kulloinkin 20 käytetystä tiolista. Reaktion etenemistä voidaan seurata mittaamalla reagoimattoman tiolin läsnäolo reaktioastias-sa. Jos reaktio on hidas, sen kiihdyttämiseksi voidaan lisätä katalyyttinen määrä trietyyliamiinia.

Kaavan V tai VI mukaisia l-(substituoitu disulfi-25 di)-3-aryyliriatseeneja valmistetaan kaavan XII mukaisten aminodisulfidien reaktiolla aryylidiatsoniumsuolojen kanssa tavanomaisilla menetelmillä. 1,3-disubstituoidun triat-seenin aryyliosan lähteenä voidaan käyttää mitä tahansa aryyliamiinia, jossa on 6 - 12 hiiliatomia ja joka muodos-30 taa helposti diatsoniumsuolan. Esimerkkejä tällä tavalla valmistetuista ja tämän keksinnön mukaisesti käytettävistä disulfiditriatseeneista ovat l-[-(2-asetamidoetyyliditio)-etyyli]-3-(4-metyylifenyyli)triatseeni ja l-[2-(3-nitro-2-pyridyyliditio)etyyli]-3-(4-metyylifenyyli)triatsiini. 35 Seuraavat yhdisteet ovat myös esimerkkejä kaavan V

10 80700 tai VI mukaisista tässä keksinnössä lähtöaineina käytettävistä sopivista triatseeneista: 1- [ 2- (3-nitro-2-pyridyyliditio)etyyli] -3-(4-kloorifenyy-li)triatseeni, 5 l-[2-(3-nitro-2-pyridyyliditio)propyyli]-3-(4-metyylifen-yyli)triatseeni, 1- [ 2-(2-pyridyylitio )etyyli] -3-( 4-metyylifenyyli )triatsee-ni, l-[2-( fenyyliditio)etyyli] -3-(4-metyylifenyyli )triatseeni, 10 1- [2- (butyyliditio )etyyli] -3-(4-metyylifenyyli )triatseeni, 1-[2-(4-metoksifenyyliditio)etyyli]-3-(4-metyylifenyyli)-triatseeni, 1-[2-(4-nitrofenyyliditio)etyyli]-3-(4-metyylifenyyli)-triatseeni, 15 l-{2-[2-bentsoyyliaminoetyyli)ditio]etyyli}-3-(4-metyyli fenyyli )triatseeni, 1-[2-(4-kloori-2-naftyyliditio)etyyli]-3-(4-metyylifenyy-li)triatseeni, l-{2- [ ( 2-fenoksietyyli )ditio]etyyli}-3-(4-metyylifenyyli)-20 triatseeni.

Tämän keksinnön yhtenä edullisena sovellutusmuotona on vaihtoehtoinen menetelmä disulfidimitosaanien valmistamiseksi, joilla on kaava Ia 25 0 2 I? CH_0CNH_ R “ss_CH2CH2°>v^/JJsvs^_^Jl ^ 2 M ΗΓ \ s°CH, V* 3 30 γ \^y jossa R2 on orgaaninen ryhmä, nimittäin R2SH mukaisen orgaanisen tiolin rakenneosa, jota voidaan vaihtoehtoisesti 35 kuvata ryhmänä R3Alkx tai R4 , joisa R3 , R4 ja Alkx ovat

II

11 80700 edellä määritellyt.

Valmistettaessa kaavan Ia mukaisia disulfidimito-saaneja on suositeltavaa käyttää kaavan XVII mukaista 9a-metoksi-7-[2-(3-nitro-2-pyridyylitio)etoksi]mitosaania 5 tiolin vaihtomenetelmässä orgaanisen, kaavan R2 SH mukaisen tiolin kanssa kuten on kuvattu kaaviossa 3. Kaavan Ia mukaisten disulfidien muodostuminen perustuu sivutuotteen, nimittäin 3-nitro-2-merkaptopyridiinin pysyvyyteen, tämä on pelkästään kaavan XVIII mukaisena tionina.

10 Kaavio 3 _po2 j) r. Λ o ch2ocnh2 '-N Nfj + r2sh -> 15

XVII

20 R2 A ftoLj R -^ävVA ^o*°2 I ιΓχί!3 * l 25

XVIII

Ia Tässä kuvataan kaksi yleistä synteettistä menetelmää sekä lipofUlisten että hydrofiilisten kaavan Ia mu- 30 kaisten mitosaanien valmistamiseksi. Yleistä menetelmää A käytetään joko lipofiilisten tai keskinkertaisesti liukenevien kaavan Ia mukaisten disulfidien valmistamiseen, kun taas yleistä menetelmää B käytetään valmistettaessa vesiliukoisia kaavan Ia mukaisia disulfideja, jotka eris- 35 tetään edullisesti natriumsuoloina tai kahtaisionimuotoi- 12 80700 na. Edullisesti käytetään vähintään yksi ekvivalentti kaavan R2SH mukaista merkaptaania kaavan XVII mukaisen mito-saanin yhtä ekvivalenttia kohti ja reaktio voidaan toteuttaa siten, että läsnä on noin yksi emäsekvivalentti kaavan 5 R2 SH mukaisen merkaptaanin yhtä ekvivalenttia kohti.

Edullisia emäksiä ovat tertiaariset amiinit, esim. trietyyliemiini, N-metyylimorfOliini, N-metyylipiperidii-ni, pyridiini, 2,6-lutidiini ja epäorgaaniset emäkset, esim. natriumbikarbonaatti, kaliumkarbonaatti, kaliumbi-10 karbonaatti yms. Sopivia inerttejä liuottimia kaavojen XVIII ja R2SH mukaisten lähtöaineiden reaktiolle ovat alemmat alkanolit, alempien alkaanihappoj en alemmat alkyy-liesterit, alemmat alifaattiset ketonit, sykliset alifaat-tiset eetterit, alemmat polyhalogenoidut alifaattiset hii-15 livedyt ja vesi. Orgaaniset liuottimet sisältävät jopa 8 hiiliatomia mutta edullisia ovat ne, joiden kiehumispiste on alle 100°C. Yksittäisiä edullisia liuottimia ovat mety-leenikloridi, metanoli, asetoni, vesi ja niiden seokset. Reaktio voidaan toteuttaa reaktioseoksen refluksointiläm-20 pötilassa tai korkeintaan noin 60°C:ssa. On suositeltavaa, että reaktio saatetaan tapahtumaan huoneen lämpötilassa tai tätä alemmassa lämpötilassa, esimerkiksi alueella 0 - 25eC.

Edellä esitetyt reaktio-olosuhteet ja ennakkoehdot 25 ovat sovellettavissa valmistettaessa muita kaavan Ia mukaisia mitosaaneja kaaviossa 3 esitetyn yleisen menettelyn mukaisesti.

Mitä tulee kaavan R3 Alkx SH tai R4 SH mukaisia tio-leja edustaviin yhdisteisiin, jotka voidaan muuttaa reak-30 tiolla Bunten suolan XV tai sulfenyylitiokarbonaatin XVI kanssa kaavan XIII tai XIV mukaisiksi välituotteiksi, jotka puolestaan muutetaan tämän keksinnön mukaisiksi tuotteiksi kuten edellä on kuvattu, keksinnön mukaisia menetelmiä rajoittavat ainoastaan sellaisten tiolien käyttö, 35 jotka sisältävät pääteryhminä primaarisia alkyyliamiineja, 13 80700 jotka voisivat johtaa tuoteseosten muodostumiseen, sekä sellaisten heteroaromaattisten tiolien käyttö, jotka eivät reagoi kaavan Ia mukaisten yhdisteiden kanssa.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden käyttökelpoisuus 5 antineoplastisissa terapeuttisissa menetelmissä käy ilmi tuloksista, jotka on saatu in vivo -seulontakokeissa, joissa yhdisteitä on annettu erilaisina annostuksina hiirille, joille on ensin aikaansaatu P-388-leukemia tai B16-melanooma.

10 Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden uskotaan omaavan antibakteerinen teho gram-positiivisia ja gram-negatiivisia mikro-organismeja vastaan samalla tavalla kuin luonnon mitomysiineillä ja ne ovat siten mahdollisesti käyttökelpoisia terapeuttisina aineina käsiteltäessä 15 ihmisten ja eläinten bakteeri-infektioita.

Taulukossa I on esitetty tulokset laboratoriokokeista, jotka tehtiin CDFj-hiirillä, joihin oli siirretty intraperitoneaalisesti kasvainistute, jonka muodosti P-388-muriinileukemian 106 askiittisolua, ja joita kä-20 siteltiin erilaisilla annoksilla joko tutkittavaa kaavan II tai III mukaista yhdistettä tai mitomysiini C:tä. Yhdisteet annettiin intraperitoneaaliruiskeina. Kullekin annostukselle käytettiin kuuden hiiren ryhmää ja niitä käsiteltiin yhdisteen yhdellä annoksella kasvainistutusta 25 seuraavana päivänä. Kuhunkin koesarjaan sisällytettiin kymmenen vertailuhiirtä, jota käsiteltiin suolaliuoksella. Mitomysiini C:llä käsitellyt ryhmät sisällytettiin kokeisiin positiivisina verrokkeina. 30 vuorokauden ajan pidettiin pöytäkirjaa, jonka avulla määritettiin jokaiselle 30 hiiriryhmälle keskimääräinen elossaoloaika ja merkittiin muistiin elossa olevien hiirien lukumäärä 30 vuorokauden pituisen jakson lopussa. Hiiret punnittiin ennen käsittelyä ja uudelleen kuudentena vuorokautena. Painonmuutos merkittiin lääkkeen toksisuudeksi. Käytettiin hiiriä, jot-35 ka painoivat 20 g kukin ja enintään noin 2 gramman paino- 14 80700 ; vähenemistä ei katsottu liialliseksi. Tulokset määritettiin arvoina % T/C, joka on käsitellyn ryhmän keskimääräisen elossaoloajan suhde suolaliuoksella käsitellyn vertailuryhmän keskimääriseen elossaoloaikaan kerrottuna 5 100:11a. Suolaliuoksella käsitellyt vertailueläimet yleen sä kuolivat yhdeksän vuorokauden kuluessa. "Maksimiteho" seuraavassa taulukossa on ilmoitettu arvona % T/C ja annos, jolla tämä teho on saavutettu, on ilmoitettu. Sulkeissa olevat arvot ovat arvot, jotka on saatu samassa ko-10 keessa positiivisena vertailuna käytetyllä mitomysiini C:llä. Siten voidaan likimääräisesti määrittää nyt kyseessä olevien aineiden suhteellinen aktiivisuus mitomysiini C:hen verrattuna. Minimitehoksi arvona % T/C ilmaistuna katsottiin 125. Seuraavassa taulukossa ilmoitettu tehokas 15 minimiannos on annos, jolla saadaan % T/C-arvoksi noin 125. Kussakin tapauksessa sarakkeessa "keskimääräinen painonmuutos" annetut kaksi arvoa ovat vastaavasti keskimääräinen painonmuutos hiirtä kohti tehokkaalla maksimiannoksella ja tehokkaalla minimiannoksella.

20 ii is 80700 ·*τ *ή in cn ro ' * * ·* O o o o o o • +5 I + l + + H 3 •H E: #%* *·* ·*. ·«.

'd p «—» Γ** Γ"· •H § '

y C O O rH (N O

W -Ή 4-1 I I I

<U (fl , ^ 1 1 1 1 X Ch mmm m o o o γν *· ·* — - ·.

O o o o o o

£ rH V V

ai cn u o •3 s «r <N cn cn cn cn ¢-4 » ·> r » r .H 1-1 yj CO ro ro ro ro 0 0 "T ^

jQ C VO VO ·3· CN "T

__I CC r r - H n «h*

**· rl >-l VO ro O

c ω •H ti

M -H

Λ c ·§ O (0 to λ; -h

3(1) äUVOVO vO VO VO

^ M (N - 2 \00 O O O

3 3 2 F\ £h ro ro ro ro ro E-· ι-H 0=U ^ f \ f— l— (N ro vo 1 O ' / \ vovo (M ro m •H (N \i. y rH I—I CN r\| 1-4 •H 2

i _M

- I °>r

i § sT

υ O I

\ z s

2 U

1 T co

CN (N CN

2 2 2

u u O

3 U (N CN CN

a CU 2 2 2

1,1, U U U

C| Hl | I I

:rcJ

‘: -P

cn

•H

0) M

m ω <*> m

•HE CN ΓΟ N· LO VO

S rH r—( r—t rH r—C

-C M

>H <U

16 80 700

CM

W CH CO C"* LT) 1-H

0 * ·*

* ** O t—» rH rH CM

:¾ § , + + + + *!3 ^ ··. ·«. *.

S C cs vo σ\ o ^ rj O ► - ,. „ _ ω S ^ ° ° 1-1 o S3 ., + ,+ * a > i· O 10 in <-· o o CN> m

Q) m _T

+ o o o o o

H cn V V

ε S

H £

C 5 •M

a iH CN CM CM CO 00

Ci ^ ► r *.

g ^ ro m co 'T rr

^ tj* tj* CO

-£ ^ r *. *, *. #.

^ O O VO CM

H ε 5 -5 -¾ ^ _

Cj JS —» — —.mm 3^0 vo n. cn m m pj ^ o r~ n» m m ε· m r-( r-t Λ Λ öp m i—( t^* vo co oo —i vo o r>-

- ‘ ; m CN CN CN i—I

- - CN

O

z “ *~ oL Ί L i

U-U = / \ ΊΓ TT

cn s U / \ cn cq cn z O cn cn

CN O CN VJ VJ CN CN

s u s \a=X x x

U co U u u U

(N 3 CN CN CN CN

® U 33 X X X

U U U U CJ

i i i i i :rfl - +i cn

•H

0) M -P p in qj H £

T3 *H

£ 01 ^ >5 <u r» oo σν o vo

>—( r—l ·—< CN (N

II

17 80 700 03

(N

M

° Τ' • -P + M 3 :trt 3 ·**

=<0 E rH

EC

•HO ro

Ai G I

tn -h (1) trt

O

>

Γ H

£ *

<U »V +J

•H o 3 ε S v ^ -H C 10 □ 5 o m •5 S ^ ω s ai o

W iH

Ai' i—I

O

G a

G

-r m -h 2 , Λ -h c

Ai tn 00 ^

s 1 = s _ E

O o 5 cn e o e 2 ^ „ oo o

m ω ro (rt 4J

M φ -Π rH -H

O -H , K

§ -Hmm

Hm E O tn φ -h oo tn 'G ·* CT tn i qj 2 5., £? Ai m- ai fo S CJ rn ru o a H M E co o tH Λ ν'

'— OJ ^ UI

<*> T rH ΓΟI -H

o\ H cm| (rt rH (rt Ai <rt -a;

Ai - (rt Ai tn G O <U G Art O -H

<u -h m 4-1 4-1 0 4-1

tN G -H G

s ·Η Λ > 2 Ai -H o

Oai 4->

rH G 4-1 rH C O

* Ai M

(rt Ai CO O G ^4-1 w .5 £ ' £

O tn H U

r; ex g <H

u e e o ^ O Ή 4->

F. -G G ai G

v-> O :G tn < Ai :g m tn E S -h tr> -h g ai

Ai Ai Ai Ai

·φ \ tn G rH

tn eri ai G G

“ E « D m

a) Ai 4-1 G

tn tu ....

3 -H m rH (N ro

Art tn ®

><a) M

18 80700

Taulukossa II on tulokset kasvaimenvastaista tehoa selvittävistä kokeista, joissa käytettiin hiirissä kasvatettua B16-melanomaa. Käytettiin BDFl-hiiriä ja niihin istutettiin ihonalaisesti kasvainsiirros. Käytettiin 60-5 vuorokautista pöytäkirjaa. Kullekin tutkitulle annostukselle käytettiin kymmenen hiiren ryhmiä ja määritettiin kullekin ryhmälle keskimääräinen elossaoloaika. Vertailu-eläimillä, joihin siirrettiin kasvain samoin kuin tutkittaviin eläimiin ja jotka käsiteltiin lääkeainetta sisäl-10 tämättömällä ruiskeen kantajalla, saatiin keskimääräiseksi elossaoloajaksi 24 vuorokautta. Elossaolojen suhdetta vertai lueläinten elossaoloaikaan (% T/C) käytettiin tehokkuuden mittana ja kullekin tutkittavalle yhdisteelle määritettiin tehokas maksimiannos ja tehokas minimiannos. Te-15 hokkaaksi minimiannokseksi määriteltiin annos, jolla saatiin % T/C-arvoksi 125. Kullakin annostuksella koe-eläimiä käsiteltiin tutkittavalla yhdisteellä päivinä 1, 5 ja 9 intravenöösisti.

20

Taulukko II

Yhdiste Maksimiteho ^ Tehokas minimi- Keskimääräinen esim. n:o % T/C Annos annos_ painonmuutos 28 167 (112)1 2 3 1,6 (3)3 0,4 -0,9; +1,4 25 >214 (145) 2,4 (3) 1,6 -2,4; -1,9 20 110 (112) 3,2 (3) 3,2 +0,5; +0,5 26 152 (145) 1,6 (3) 1,6 -0,6; -0,6 35 Eläimillä suoritetuissa kasvainkokeissa saatujen mg/kg kehon painoa 30 2. keskimäärin gramma/vuorokausi kullekin maksimi- 2 ja minimiannokselle 3 sulkeissa olevat arvot ovat rinnakkaiskokeessa mitomysiini C:lle saadut arvot.

19 80700 tulosten perusteella keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää nisäkkäissä esiintyvien kasvainten ehkäisemiseen. Tähän tarkoitukseen niitä annetaan systeemisesti oleellisesti ei-toksisena, kasvaimenvastaisesti tehokkaana annok-5 sena nisäkkäälle, jolla on kasvain.

Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet on tarkoitettu annettavaksi ensisijaisesti ruiskeena, suuressa määrin samalla tavalla ja joihinkin samoista tarkoituksista kuin mitomysiini C:tä. Jonkin verran suurempia tai pienempiä 10 annoksia voidaan käyttää riippuen kyseessä olevan kasvaimen herkkyydestä. Niitä on helppo jakaa kuivina farmaseuttisina koostumuksina, jotka sisältävät laimentimia, puskureita, stabilointiaineita, liukenemista edistäviä aineita ja aineosia, jotka ovat avuksi farmaseuttisesti miel-15 lyttävän tuotteen aikaansaamiseksi. Nämä koostumukset saatetaan sitten käyttömuotoon injektoitavan nestemäisen väliaineen kanssa juuri ennen käyttöä. Sopiviin injektoitaviin nesteisiin kuuluvat vesi, isotoninen suolaliuos yms.

20 Seuraavissa menetelmissä ja esimerkeissä kaikki lämpötilat on annettu celsiusasteina ja sulamispisteet ovat korjaamattomia. Ydinmagneettiset resonanssipektrit (1H NMR) määritettiin laitteella Varian XL100, Joel FX-900 tai Bruker WM 360-spektrometrillä joko pyridiini-d5:ssä 25 tai D20:ssa kuten on ilmoitettu. Kun liuottimena käytetään pyridiini-d5:ttä, käytetään sisäisenä vertailuna pyridii-nin resonanssia kohdassa 6- 8,57, kun taas TSPrtä käytetään sisäisenä vertailuna silloin, kun D20:ta käytetään liuottimena. Kemialliset siirtymät on annettu δ -yksikköi-30 nä ja kytkentävakiot Hertseinä. Jakautumistyypit on merkitty seuraavasti: s singletti, d dupletti, t tripletti, g kvartetti, m multipletti, bs leveä singletti, dd kak-soisdupletti dt kaksoistripletti. Infrapunaspektrit määritettiin joko Bekman Model 4240-spektrometrillä tai Nicolet 35 5DX-IR -spektrometrillä ja ne ilmoitetaan yksikköinä 20 80 700 cm'1. Ultraviolettispektrit (UV) määritettiin joko Cary Model 290 -spektrometrillä tai Hewlitt Packard 8450A -spektrometrillä, joka oli varustettu multidioditaulukko! 1-maisimella. Ohutkerroskromatografia (TLC) suoritettiin 5 0,25 mm:n Analtech silica gel GF-levyillä. Flash-kromato- grafia suoritettiin joko Woelm-neutraalilla alumiinioksidilla (DCC grade) ja Woelm-silikageelillä (32 - 63 pm) ja kulloinkin ilmoitetuilla liuottimilla. Kaikki haihdutukset suoritettiin alipaineessa ja alle 40°C:n lämpötilassa.

10 l-alkyyli-3-aryylitriatseenit ovat ryhmä reagensse- ja, joiden tiedetään olevan käyttökelpoisia reaktiossa, jolla karboksyylihapoista muodostetaan vastaavia alempia alkyyliestereitä. l-metyyli-3-(4-metyylifenyyli)triatseeni voidaan valmistaa seuraavasti: 15 Menetelmä 1 E. H. White et ai., Org. Syn., 48, 102 - 195 (1968).

l-metyyli-3-p-tolyylitrlatseeni. p-toluidiinia (50,2 g, 0,47 mol) lisätään kahden litran pulloon, joka on varustettu 200 ml:n tiputussuppilolla ja tehokkaalla se-20 koittimella ja pullo upotetaan jää-suolahauteeseen n.

-10°C:ssa. Tiputussuppiloon pannaan liuos, jonka muodostaa 46,8 g (0,55 mol) kaliumnitriittiä 150 ml:ssa vettä ja p-toluidiiniin lisätään samalla sekoittaen seos, jonka muodostavat 250 g murskattua jäätä ja 140 ml väkevää suola-25 happoa. Kaliumnitriittiliuosta lisätään hitaasti ja samalla sekoittaen 1-2 tunnin kuluessa, kunnes saadaan positiivinen tärkkelyskaliumjodidikoe (huomautus 1) ja seosta sekoitetaan vielä tunti kaiken toluidiinin reagoimisen varmistamiseksi.

30 p-tolueenidiatsoniumkloridiliuoksen pH säädetään sitten arvoon 6,8 - 7,2 0°:ssa kylmällä, väkevällä natriumkarbonaatin vesiliuoksella, jolloin liuoksen väri muuttuu alueelle punainen - oranssi ja pieni määrä punaista ainetta saostuu. Kylmä, neutraali liuos siirretään ti-35 putussuppiloon ja lisätään hitaasti ja samalla voimakkaas- 2i 80700 ti sekoittaen seokseen, jonka muodostavat 150 g natrium-karbonattia, 300 ml 30 - 35-prosenttista metyyliamiinin vesiliuosta (huomautus 2) ja 100 g murskattua jäätä 3 l:n pullossa. Reaktioseos pidetään n. -10eC:ssa lisäyksen ai-5 kana, johon kuluu noin 45 minuuttia (huomautus 3). Liuosta uutetaan kolmella 1 litran eetterierällä. Eetteriuutteet kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla ja haihdutetaan kiertohaihduttimessa huoneenlämmössä, jolloin saadaan 65 g raakaa l-metyyli-3-p-tolyylitriatseenia (huomatus 4). 10 Tämä pannaan vedellä jäähdytettyyn sublimointilaitteeseen ja triatseeni sublimoidaan 50°C:ssa (1 mm); saadaan 43,3 g (0,29 mol, 62 %) keltaista, kiteistä sublimaattia, sulamispiste 77-80°C (huomautus 5). Sublimoitunut aine voidaan uudelleenkiteyttää heksaanista, jolloin saadaan 15 triatseeni valkoisina neulasina, sp. 80,5 - 81,5. Yksinkertaisemmin se liuotetaan minimimäärään eetteriä ja liuos laimennetaan 2-kertaisena tilavuudella heksaania ja jäähdytetään 0°C:seen, jolloin saadaan tasaisia levyjä, jotka ovat heikosti kellertäviä; sp. 79 - 81°. Puhtaan triatsee-20 nin saanto on 33 - 37 g (47 - 53 %) (huomautus 6).

1. Yksittäiset kokeet tärkkelys-kaliumjodidipape-rilla tulisi tehdä 1-2 minuutin kuluessa sen jälkeen kun kaliumnitriilin lisääminen on lopetettu.

2. Tämän sijasta voidaan käyttää 40-prosenttista 25 metyyliamiinin vesiliuosta.

3. Reaktio on mennyt loppuun, kun tippa liuosta ei enää anna punaista väriä liuoksen kanssa, jonka muodostaa β-naftoli natriumkarbonaatin vesiliuoksessa.

4. Pääepäpuhtaus on 1,5-di-p-tolyyli-3-metyyli-l,4-30 penta-atsadieeni (sp. 148°C). Tämä voidaan poistaa jakoki- teytyksellä, mutta on helpompaa sublimoida triatseeni reaktioseoksesta.

5. Sublimoitunut aine sisältää jälkiä 1,3-di-p-to-lyylitriatseenista, mikä ilmenee ohutkerroskromatografias- 35 ta. Uudelleenkiteytys antaa puhtaan l-metyyli-3-p-tolyyli- 22 80700 triatseenin.

6. Tämä menettely toimii hyvin vain vesiliukoisten amiinien ollessa kyseessä. Seuraavassa esitetty menetelmä 2 sopii paremmin triatseenin valmistamiseen veteen liuke-5 nemattomista amiineista.

Menetelmä 2 E.H.White el ai., Tetrahedron Letters No. 21, s. 761 (1961).

l-n-butyyli-3-p-kloorlfenyylltrlatseeni. p-kloori-bentseenidiatsoniumheksafluorifosfaatin (uudelleenkitey-10 tetty asetoni-metanolista) (2,87 g, 10,1 mol) liuos dime-tyyliformamidissa (joka ei sisältänyt dimetyyliamiinia) lisättiin hitaasti ja samalla sekoittaen n-butyyliamiinin (0,73 g, 10,0 mol), jauhetun natriumkarbonaatin (15 g) ja dimetyyliformamidin (30 ml) seokseen, jota sekoitettiin ja 15 pidettiin -5eC:n lämpötilassa. Diatsoniumsuolaliuosta voidaan käyttää huoneenlämmössä, mutta tavallisesti saadaan puhtaampi tuote, jos diatsoniumsuolaliuos valmistetaan ja lisätään n. -50°C:ssa pidetystä erotussuppilosta. Liuos lämmitettiin 0°C:seen ja sekoitettiin kunnes saatiin nega-20 tiivinen tulos kokeessa 2-naftolin kanssa (tavallisesti tarvitaan vain muutama minuutti). Lisättiin eetteriä, seos suodatettiin ja suodos pestiin huolellisesti vedellä ja kuivattiin, (triatseeni voidaan tässä kohdin eristää ja uudelleenkiteyttää pentaanista aikalisissä lämpötiloissa). 25 Menetelmä 3 7-hydroksl-9a-metoksimitosaani. Mitomysiini C (2,2 g 6,6 mmol) liuotettiin 140 ml:aan 0,1 N metanolipi-toista NaOHrta (50 %) ja reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämmössä 30 tuntia. Liuoksen pH säädettiin sitten ar-30 voon n. 4,0 IN HCl:n avulla ja uutettiin etyyliasetaatilla, yhdistetyt etyylisetaattiuutteet kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin alipaineessa noin 30 - 35°C:ssa, jolloin saatiin kiinteä jäännös, joka liuotettiin eetteriin ja käsiteltiin purppuranpunainen heksaaniylimäärällä, jolloin 35 muodostui sakka. Sakka otettiin talteen ja kuivattiin il- 23 80 700 massa, jolloin saatiin otsikossa mainittu yhdiste hienona purppuranpunaisena jauheena (1,4 g 63%).

XH NMR (pyridiini-d5 , δ ): 2,05 (s, 3H), 2,14 (bs, 1H), 2,74 (bs, 1H), 3,13 (d, 1H), 3,24 (s, 3H), 3,56 (d, 5 1H), 4,00 (dd, 1H), 4,37 (d,lH), 5,05 (t, 1H), 5,40 (dd, 1H), 5,90 (bs, 2H).

Menetelmä 4

Mitomysiini A. 100 mg (0,30 mmol) 7-hydroksi-9a-me-toksimitosaania ja 100 mg (0,67 mmol) 3-metyyli-l-p-tolyy-10 litriatseenia liuotettiin 2 ml:aan metyleenikloridia ja 10 mitään dietyylieetteriä. Sen jälkeen kun liuosta oli varovasti refluksoitu 8 tuntia, sitä sekoitettiin huoneen lämmössä 18 tuntia. TCL (metyleenikloridi/metanoli, 90:10) osoitti syvän purppuranpunaisen täplän kohdassa Rf = 0,36 15 ja jälkiä epäpuhtauksista kohdassa Rf = 0,41. Reaktioseos haihdutettiin kuiviin ja kromatografoitiin Woelmin neutraalilla alumiinioksidilla käyttäen käyttäen eluointi-liuottimina metyleenikloridia ja metyleenikloridi/metano-lia (30:1). Fraktiot, jotka sisälsivät komponenttia, jonka 20 Rf - 0,36, yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin. Seostamalla kuiva jäännös metyleenikloridista ja heksaanista saatiin otsikossa mainittu yhdiste hienona amorfisena purppuranpunaisena jauheena (25 mg, 24%), sp. 161°C. Analyysi yhdisteelle Cx 6 H19N3 06 : 25 laskettu C 54,96; H 5,44; N 12,02 todettu C 53,96; H 5,37; N 11,99.

IR(KBr), v max, cm'1: 3400, 3300, 2950, 1700, 1630, 1575, 1200, 1060.

*Η NMR (pyridiini-d5 , ): 1,82 (s, 3H), 2,74 (dd, 1H), 30 3,12 (d, 1H), 3,24 (s, 3H), 3,54 (dd, 1H), 3,96 (dd, 1H), 4,02 (s, 3H), 4,22 (d, 1H), 4,84 (bs, 2H), 5,02 (t, 1H), 5,38 (dd, 1H).

Menetelmän 4 saanto nousee 63 %:iin, kun käytetään metyleenikloridia reaktioliuottimena ja huoneenlämpötilaa 35 24 tunnin ajan.

24 80700

Menetelmä 5 250 ml:n yksikaulaiseen pyöreäpohjäiseen pulloon pantiin kiinteää Na2C03, amiinin 35-prosenttista vesi-liuosta (määrä sama kuin menetelmässä 1) ja jäätä ja sus-5 pensiota sekoitettiin -5°C:ssa (jää-suolahaude). Tähän suspensioon lisättiin tipoittain kylmä p-klooribentseeni-diatsoniumheksafluorifosfaasin (Aldrich Chemical Co.) suspensio jäässä, vedessä ja Na2C03:ssa (liuoksen pH noin 7). Kun lisäys oli tehty kokonaan, reaktioseosta uutettiin 10 dietyylieetterillä. Yhdistetyt dietyylieetteriuutteet pestiin vedellä, kuivattiin (Na2S04) ja väkevöitiin. Kellertävä kiinteä jäännös puhdistettiin pylväskromatografiällä Woelm-alumiinioksidilla käyttäen eluointiliuottimena hek-saani/metyleenikloridia (1:1) (*Η NMR määritettiin).

15 Esimerkit 1-10

Seuraavassa taulukossa III esitetyt triatseenit 1-7 valmistettiin edellä kuvatun yleisen menetelmän 1 mukaisesti, jossa on esimerkkinä valmistettu esimerkin 1 triatseeni. Triatseenit puhdistettiin pylväskromatogra-20 fiällä Woelm-alumiinioksidilla.

Taulukon III triatseenit 8-10 valmistettiin edellä esitetyn yleisen menetelmän 5 mukaisesti.

25 80700 rn

G

O

(fj) O @ V 3* n fs \ ^ υ w

•H 5B — 2 T W UI

C U m (N CM fM ΓΜ Q) «n x s X X = 0) — u υ u u u U) n <n - rs rs rs rs -p B X B X B S = »o υ υ y <-> υ o o *U 5 X—2 2 2 2 2 2 fi I I I I 1 l t ^ 222 2 2 2 2 n it u il n n il 2 2 2 2 2 2 2 «r v ^ «o*

X XX X X X X

Φ vo vO vo ^ ^ vO

υ cj υ o υ u o n m r> n rn r> m

G G 5 G 5 5 G

I I I I I I I

£ ααααααα 2 il »g 2 Ή

i O

0 I .

t o -< X U) u -U + m ™ A n) f z x r t * .

:: B*' 0 Q C >1 ; Λ! <u 3 δ n 3 ui υ

-H -P

3 «1 ίΟ Ή H £ *, Φ s - l·

1 I

* g cm JN X

*2 2 — CJ tn fM Z-, -T* w

2« »N M fM

fN m r- o x I -Γ £· ^ ^ Hs ; ♦ -Γ I V V o 5

<N U 2 1 I X

rs X fN / v 2 1 s fl (Cf\ Π 8

f »" »" S kJ U-J

§ u o — o u I ϋ ΝΠ » m W I- ui ω ·η ο w ε Λί c 26 80700 H S' 5 1 Γ~Λ j3 s" 2 ‘Π - s υ 6 y ^ i ζ ζ ζ

I I I

ζ ζ ζ

It I! It ζ ζ ζ ^

XXX

νο υ υ ο —t ^ ^ U U ο

I I I

CL CU 0« ro

rH

8 en

-rH I

o ^ Γυ <ν _ β •Η Ζ * *

U

* * <Ν - ΖΜ -Γ» 5 *, 5 ΓΝ _Γ* 1 i a κ 3 i e w Ο 3 Μ -Ρ »Ö η Μ Μ Ο H 3 Ή 9 Μ 2 s-i . D (V) οο α\ ο

;-; 3 S

Εη Μ ; : w 27 80700

Esimerkki 11 1-/2-(3-nitro-pyridyyliditio)etyyli/-3-(4-metyyli-fenyyli)-triatseeni 4-metyylifenyylidiatsoniumkloridiliuos valmistetaan 5 kuten menetelmässä 1 on kuvattu.p-toluidiinista ja säädetään pH-arvoon 6,8 - 7,2 0°C:ssa kuten mainitussa menetelmässä on kuvattu.

Tällä tavalla valmistettiin liuos, joka sisälsi 21,15 mmol diatsoniumsuolaa 45 ml:ssa liuosta ja se pantiin tipu-10 tussuppiloon, joka oli yhdistetty 250 ml:n pyöreäpoh- jaiseen kolmikaulapulloon, joka sisälsi 5,34 g (20,0 mmol) 2-(3-nitro-2-pyridyyliditio)etyyliamiinia, 7 g natrium-karbonaattia ja 150 ml dioksaania joka oli lisätty pulloon tässä vaiheessa. Pulloon lisättiin kyllästetttyä 15 natriumkarbonaatin vesiliuosta 6 ml ja jäätä 10 g.

Pullo jäähdytettiin jäähauteella ja sen sisältöä sekoitettiin mekaanisesti. Sitten lisättiin diatsonium-suolaliuos tipoittain tunnin kuluessa tiputussuppilosta. Kun koko lisäys oli tehty, reaktioseoksen annettiin läm-20 metä huoneen lämpötilaan ja sitä uutettiin sitten kolmella 400 ml:n eetterierällä. Kun uutteet kuivattiin ja haihdutettiin, saatiin haluttu tuote, joka puhdistettiin kromatografisesti käyttäen alumiinioksidilla täytettyä kolonnia, halkaisija 25,4 mm ja pituus 254 mm, 25 ja pylvään kehittämiseen ja eluoitiin heksaani/metyleeni-kloridia (4:1), heksaani/metyleenikloridia (3:2), heksaani/metyleenikloridia (1:4) ja lopuksi metyleeni-kloridia, joka sisälsi 1 % metanolia. Sopivat fraktiot (todettiin TLC:llä) yhdistettiin ja haihdutettiin, jol-30 loin saatiin 2,5 g otsikossa mainittua yhdistettä.

Esimerkit 12 - 19

Yleinen menetelmä 7-alkoksi-9a-metoksimitosaanien (12-19) valmistamiseksi

Liuos, jonka muodostui triatseeni (2,4 ekvivalenttia) 35 Cl^C^/metanolissa (4:1), lisättiin 7-hydroksi-9a-metoksi- 28 80700 mitosaanin (valmistettu menetelmässä 3) liuokseen CJ^Clj/metanolissa (4:1). Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämmössä ja reaktion kulkua seurattiin ohutker-roskromatografiällä (TLC) (10 % MeOH Cl^C^iSsä).

5 7-alkoksi-9a-metoksimitosaanituote ilmenee tumman purppurana täplänä TLC:ssät Reaktioseos kromatogra-foidaan Woelm-alumiinioksidilla, kun reaktion katsotaan TLC:n perusteella olevan täydellinen, ja 7-alkoksi-9a-metoksimitosaani saadaan amorfisena kiinteänä aineena.

10 Valmistetut tuotteet on identifioitu esimerkkeinä 12 - 19 taulukossa IV.

29 8 0 7 0 0

V O

r» go o o

Z Z

. ^ m

•H ^ <N

W ^ -.

£ VO VO

rH " » l

(0 SS

§ - ·* <D o ^ .g m ® co j5 m in ,ä u' £ £ *•1 e G i 1 s

M

~ * S w · k H «M. M «, M, Λ in ui tn ,Q * % ,0 * * ro ,'Τ" '.'-Ό’Ο '~-Ό-3 •n _ '-Ό n n o ο ΜνβΌΌ c /2. , LT) tr r O tr CO r O tr (0 _jN _m / \ ^ co m o tr co m o tr Ϊλ 2 O / \ I. rH t tr lh ~t * tr m ΠΛΟ H S-5S·. S-5S·-* § U**\ , Ή ^ «, ** .-* m « ^ γμ . \ / Ό w w ^ ·§ >=( 'iB i S i £ i z i i

O -M / \ Ω* <N TT COr-VDO

SU O z=/ Vo CX α » ^ ^ o γν in o_ 3 T \ / *ή m tn m *n •Η ίΰ \ —-/ oi * p CT» / \ S - ~ ~ - Ρη·Η § - X-HXrnjSttSs

(/] T] S

v; ^ ^ * Y=s rS Ό-Ω^Γ3 oaooco^oo^^ *|U CO O fN <Ν Ό (N (N (N rs r- O CN Γ"> ^ Γ- ^ΗΓΜΓΠ^Γ ΓΛ υ ΓΜ S ΓΜ £ =" ? ^ Rni ^

0 G

1 i

Il II

a x

•rH

I ^ /HV-I · W gj Q -O J3 w £ e 2 ^ rt nt 30 80700 rv η «, ·-* ν· r-· νο mm

V V ν » VO SO

*· ** (N <N <- *4 iM -h CO 00

H M

z‘ * 2 2 i z

— · ON VO O VO

fu vn σ f\j n· so vpvo •H o ,_| - - - t/1 ’’"O min mm >i m e ^ 3 = =' B = = =' = G G) - ·- ·*

•r-j ·* ·· J2 ON «O· VO

(rt o sn , ' on on m © rv vo G) - - . so-so C ^ fti Jj es es on * e* .

.3 n m ^ mm m vo m vo

Jj m m 4-> O

α ω ö * . ....

5 o u 3 Ε υ υ owuOT

d £ m .. „ ”· "·>·* H tu H Cm

E-> Cm ·— O

7 ° S ° g σι o o m o o m m

’ VO fN «—4 O -H -H CD OS r># rg VO

= <NI^<N m r* rv IN e N en VO O

^ rn«-g*«4 m ·—« «η γί -h ·—« rg “ o o o m o o m o o o o un © o o *“* co Tr fN m m m cv so cv m rv vo o · *r on vo o 'f ffs vc o ^ en vo o mf^rs* m γν ·-* r-· m γμ *-h ,-h m rv ^ % -.S'* —H «k » » ^ ^ ^ Ξ^Ξ mi-* m ^ ~ m « — D w w * * vi « * . % £< ,?w2? -Q jJ Ό £ w Ό * m w r

-U W-WW ^ ” Ό 4J · J3 ^ T3 4J

Γ3 — N* ^ IN O VO VD VO *— ’X" —H w^-ww.

•m -s. ^ S Z r»rN^ r*. cn rr rg tn ττ rg co v ' m 01 _!* ° ° ·“ * - <n * on o rri I * <** - - n* m n· rv m - r m . - S l fNN*m ^ m so n nm H -H , ^ % , * -Γ ^ ^ ^ ^ ^ % ^ ^ ^r^^rrv . 'Nrv-rnrsjrj G *H p * Ό * * W -tJ T3 Π (ft in » « *c ·>£«.%

Ti H q. E'-'ES Ä w *0 ^ £ £ W £ - w χ- xj 2 pN - Ό ' ' ' O " w w q) _ w

f0 (1| ί-M o—ccao « M IN (N vD VO O T KOVOIN

E~i ~— *c· *. \c vo o> ·· on -M-Mcosa^ o^rMfv.

-">·.- «<*». >o ' - - - r-v -r>.» ινπ^τ —< n ~ <N r-> n ·» rvinv S .*..-1 » JO * . .

X rn -Hri ri -M n In h h S "" 3 £J "* •x · ~ · *..

» in » « Ό . in - — ....¾ .to..-j •ϋ S. 2 Ξ Ξ w J3 Ό e VlrtJTSOO ΜΛΌ'Ό’Ο Ό ιύ n ia v co ao O (N fN -er vo co m c5«o<Nve? m s m in n· voomov ONocmcN'»· co m (N ^ -MPMr-i«rm —i m n v — n n «r m „ n" n V in i o o 9 i S f Sr K 8

Ä JN _IN _fN <N

ϋ ΰ ΰ 5

IN CN <N I

S S G 8 I II in N II II —

•H OS K « M

' t

•H l-l O

tn ω e „ I

ω e c ^ « u * n* m so r*»

^ — - -H

3i 80700

OB <N

VO Φ Γ· • - ον Γ- O O + m

ON OV

Z Z z' 2

Jrt ^ m o vo co äo m >*t ί? m in in in 03 £ . . . . £ d == == ·§ c .. .. .. .. ^ Γ0 m m in 9 r-j Ο) σι *r *-* -*r _p •5 ir -v r-1 rrt m in mm 4 r-t +-* M * * * ' ’!j in U u υ u < .. .. .. .. > £ £ f il • t—i 03 —. o o o o o *n o 4j -h 00 O O VO vo ΓΜ VO fl) I m r* <N m o' vo o g m ^ π cn ή ^ — a ... .... 3 ooom oooo [5 Ä v ιΛ M g vo © fN ä H (Ti VO O f (M f> fN JÖ

— m <n *-« i-h m m ^ P

^ D

3 :rd 3 03 *> 55 w .¾ ^-- * * * ; o ^ In r. * r> -η — >,

M u>«. - ,H

n . ό i ' & £ v σιΐο y — μ ό -0----0 o — vj —S — «Ν — O — -T O — 00Ό r^S Γ-* ΓΜ o co 00 VO vo inis.

3 - fN - ΤΓ Ο.-ΓΊ 1 5 ? rH LO (N . rr — . r> ^ *. ^ ^ gV1 .-.- ! § T c ^ .h =-: = ,: - = = - < 5h 35 h 33 33 h h 23 i*

n rt ·— I—4 ΓΜ -H

- ' C C

S2 W . Ό * * Ό Ό . * *H *H

a jaoiO*j e-o — £ tn-H-H

h — — — — — — o — 3 U+Mfl tj. OOIOTT (NINtNOD i) -r) +j ^

jfi o m σι o i-' m - m -P 4-> (U E

P4 ' - - - · » 4T j) OB B

— cm m m m <n n m Ό·ΗΟ+-* « ,: ~ ~ 2 3 * -g Z 3 3 ~ 5 2 3 H 3 ^ il c ΓΛ m -n m (n <n r> ·-« 3 Ό :0 -Γ ..,. ..-o«ui ^ ^ 'π n -o e e w w o jj λ . j . c CO 00 CM io (NOU-lOtN {fl ’d !? oo O m m σι <n σι σι in UJ « 01 - - - r- - - _ - - G · Ο ΙΛ

n·) m h* h r1» π v h *H *H *H

-P fO I >

/ \ StiiSS

= O O M _ (0 CD

u \ ✓ Q rp I—I -M

m 8 = Φ 3 Ο tn I *" 9 ^1¾¾

ώ U m II (3 <H H

* s CJ I 6 ^ ^ I II ^ ^ _ ^ * rtj Λ υ td •fl

I S

m Φ 8 δ w ε δ 2 2 32 80700

Esimerkki 20 9a-metoksi-7-Z2- (3-nitro-2-pyridyylitio) etoksi.7 mitosaani (20) 7-hydroksi-9a-metoksimitosaania mitattiin 580 mg 5 (1,37 mmol) pyöreäpohjäiseen pulloon ja liuotettiin se 60 mlraan metyleenikloridia. Esimerkin 11 triatseenia lisättiin pullossa olevaan liuokseen 2,5 g (5,7 mmol) ja seosta sekoitettiin 5°C:ssa 14 tuntia ja sitten huoneenlämmössä 8 tuntia. Reaktion kulkua seurattiin 10 piioksidi-TLC:llä käyttäen metyleenikloridi/metanolia (9:1). Reaktioseosta pidettiin huoneenlämmössä vielä 26 tuntia ja jatkokäsiteltiin sitten pylväskromatogra-fialla kolonnissa, jonka halkaisija oli 8,5 mm ja pituus 305 mm ja joka oli täytetty alumiinioksidilla.

15 Käytetyt liuotinjaksot pylvään kehittämiseksi ja eluoimiseksi olivat 200 ml:n erät liuottimia: metyleeni-kloridi; 0,5 % metanolia metyleenikloridissa; 1,0 % me-tanolia metyleenikloridissa; 1,5 % metanolia metyleenikloridissa; 2 % metanolia metyleenikloridissa ja 4 % 20 metanolia metyleenikloridissa. Sopivat fraktiot yhdis-tettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin otsikossa mainittu yhdiste, 470 mg.

Analyysi Yhdisteelle C22H23N5°8S2:lie (korjattuna ottaen huomioon 0,5 mooli-% CH2Cl2): 25 laskettu C 45.65; H 4,09; N 11,82 todettu C 45,74; H 4,14; N 11,61.

IR (KBr), Vmax, cm 3440-3200, 3060, 2930,1720, 1570, 1510, 1395, 1335, 1210, 1055.

30 1H NMR (pyridiini>d5, δ): 11 81 (s, 3H) , 2,00 (bs , 1H) , 2t61(bs, 1H), 2,98(bs, 1H), 3,08(s, 3H), 3f 20 (m, 2H) , 3,39(d, 1H) , 3r83(dd, 1H) , 4,07(d, 1H), 4,59-4,89(m, 3H), 35 5,21 (dd, 1H) , 7,16 (dd, 1H) , 8,31(dd, 1H) , 8r 71(dd, 1H).

Il 33 80700

Soveltamalla esimerkkien 11 ja 20 menetelmiä muihin (3-nitro-2-pyridyyliditio)alkyyliamiineihin, joiden alkyyliryhmässä on 2 - 6 hiiliatomia/ voidaan valmistaa seuraavan kaavan mukaisia mitosaanijohdannaisia.

5 o O CH-OCNH, Π '"M"SS- (CH-) -O, J Λ 2 2 n '0CH2 10 CH3'y ' n = 2-6 R = H tai alkyyli 15

Esimerkit 21 - 34 Jäljempänä esitetyssä taulukossa V mainitut 7-alkoksi-ditio 9-a metoksimitosaanit 21 - 34 valmistettiin seuraa-: : : vassa esitetyn yleisen menetelmän A tai B mukaisesti kuten taulukossa V on ilmoitettu. Mitosaaniyhdisteille 20 21 - 34 on fysikaaliset vakiot esitetty taulukossa VI, joka myös seuraa.

Menetelmä A

Esimerkin 20 mitosaanin (-^0,1 mmol) liuokseen asetonissa (3-5 ml), josta happi on poistettu, lisä- 25 tään sekoittaen ja argonkaasussa trietyyliamiinia ( ^1,1 ekvivalenttia) ja sen jälkeen tipoittain tai annoksittain merkaptaania^ (1 ekvivalentti) asetonissa (h) (1-2 ml). Useimpien reaktioiden' ollessa kyseessä reaktion kulkua seurataan silikageeliohutkerroskromato- '! 30 grafialla (10 % CH3OH CH2Cl2:ssa). Se, että reaktio on mennyt loppuun, ilmenee siten että lähtöainetta vastaava täplä katoaa ja tuotetäplä tulee näkyviin.

Tässä vaiheessa reaktioseos väkevöidään alipaineessa ( ~ 30°C:ssa) ja jäännös kromatografoidaan neutraa- lilla Wielm-alumiinioksidikolonnilla (8,3 mm x 254 mm), 35 34 80700 joka on täytetty käyttäen lietettä seoksessa, jonka muodostaa 2 - 5 % CHgOH CH2Cl2:ssa. Tämä menettely erottaa halutun mitosaanituotteen sivutuotteena olevasta pyridyylitioniyhdisteestä, joka jää kolonniin.

5 Tällä tavoin seoksella 2 - 5 % CH^OH CH2Cl2:ssa eluoitu tuote puhdistetaan edelleen huolellisesti flash-silikageelikromatografiällä käyttäen eluointi-liuottimena seosta, jonka muodostaa 5 - 7 % CH^oH CH2CL2:ssa. Pääjuova, joka vastaa tuotetta, eriste-10 tään ja amorfinen 7-alkoksiditio-9a-metoksimito-saani karakterisoidaan.

a) Tapauksissa, joissa lähtöainemerkaptaani on epäpuhdasta, tarvitaan yli 1 ekvivalentti tiolia.

15 b) Tapauksessa, joissa esimerkin 20 lähtöainemito-

saabilla ja tuotteella on hyvin lähekkäiset R^-arvot RLC:llä, käytetään suurpainenestekromatografiaa (HPLC) reaktion seuraamiseen ^uBondapak-C^g-kolonni). Menetelmä B

20 Esimerkin 20 mitosaanin ( ^ 0,1 mmol) liuokseen ' seoksessa, jonka muodostaa 2 - 5 % asetonila^metanolissa / i_ \ (10 ml), lisätään kyllästettyä NaHCO^rn vesiliuosta ' ( 6 tippaa), minkä jälkeen lisätään merkaptaania * (c) (1 ekvivalentti) metanolissa (1 ml). Reaktion kulkua 25 seurataan TLC:llä (silikageeli, 10 % CH^OH CH2Cl2:ssa). Kun reaktio on mennyt loppuun, reaktioseos laimennetaan vedellä (15 ml) ja väkevöidään noin 10 ml:ksi alipaineessa noin 30°C:ssa. Muodostunut liuos kromatografoi-daan käänteisfaasi;C-18-kolonnissa käyttäen eluentin 30 asteittaista gradienttia (100 %:sta ^ H20 80 %:iin CHgOHrta H20:ssa). Tuote, joka eluoituu runsaimpana punaisena juovana, otetaan talteen ja väkevöidään, jolloin saadaan 7-alkoksiditio-9a-metoksimitosaani amorfisena kiinteänä aineena. Mikäli lisäpuhdistusta 35 tarvitaan, toistetaan edellä esitetty kromatografiavaihe.

li 35 80700 a) Metyleenikloridiakin voidaan käyttää, mutta asetoni on edullinen.

b) Mikäli merkaptaani on L-kysteiini, tätä emästä ei käytetä.

5 c) Vettä käytetään, jos lähtöainetioli on vesiliukoinen, d) Eluointi vedellä erottaa sivutuotteena muodostuneen keltaisen pyridyylitionin tuotteesta, joka jää kolonniin.

36 80700

Taulukko V

7-alkoksiditio -9a-metoksimitosaaneja

If o CH2OCNH2 . . RSS^—\ vOCH, A tai 3

RSH + 20 --> JU

B CH3 n LFu

Esimerkki Tioli

No. (RSH) Menetelmä Tuote

O

II

21 etyyli-2-merkapto- A R=-CH2CH2OCCH3 asetaatti

22 3-merkapto-l,2- ^ R=-CH2CH(OH)CH2OH

propaanidioli 1 2 3 4 5 6 3-merkaptopropioni- B R=-CH2CH2COO Na+ : happo 2 kysteiini B R=-CH2CH(NH3+)COO_ 3 tiofenoli A R = ^ 4 p-nitrobentseenitioli A R = ^-N02 5 p-metoksibentseeni A R = ^^-OCH^ 6 p-aminobentseenitioli A R = ^^~NH2 37 80 700

Taulukko V (jatkuu)

Esimerkki Trioli

No. (RSH) Menetelmä Tuote COO~Na+ 29 2-merkaptobentsoe- B r = // \\ happo \ —/ 30 2-nitro-4-merkapto- B R = -U y—N02 bentsoehappo COO_Na 31 4-merkaptopyridiini A R = \\

/N

32 2-merkaptometyyl i-l- A R = | metyyli-imidatsoli ch3 NH_ I 2 _ NHCOCH2CH2CHCOO Na

33 glutationi B R=-CHnCH

2I _ + CONHCH2COO Na 1 dimetyyliamiini- B R=-CH2CH2N(CH3)2 etaanidioli 38 80700 ^ ^ ή o o m m — I n Tr m vo U E m 10 n o O U {NI r-l M r-t ^4 ^ ^ »

w » o o o O

X r-t fN (N O

OS (0 m r- m cn

M £ n iH i-H rH

? ^ ^ ^ s i - o o o o o p" rr vo (n m m f'· m cn o

m »M rH t—1 rH

N-*

k*4 C

o e m «s1 X « ΓΜ

H S

£ O vo

> r< «N rH

D w m is - s ns s ~ —· γη ·· ij n tn » <n p» ^- O| 4J X r (N (V| rl h '-r cn r« rH ^ σν ».

•Ä - g S: /r 00 ^ ^ - Μ

QJ pj —< -r-l σν+J ~ T

e ~ m X. -h - ~ - m = —. »

irt H -S / \ T rH —4 ^ H n «—4. rH

S o=S y /—\ ΐ - =° n Ä * = = - Q Ö O / \ 5. -Tr — .-Xns-tlMCN-

Mi) ^T. ''/,] \ n £ JCtNCNnO »«.rH

m r—. y/\ / Cu m ^ ·- * ’ cn £ ·» n .5 rt 2Γ ^Qi ••^votnxTrH'— ns _V (/) W \ / 4J en E «. — 00 4 vo ό 3 Λ! \ / n*· "— m ~ r~~ ·- E m — d Q )-(, In <o ry •rCNionorH - in

;Η01 / - \ Cl W ® M -r-v^rTfN

3 S 0=( Vn (C -ja-um—.-O--

E-l V ^\ / α J, M— — -LO

ιό \ _/ X * st vo __ HS m n «· o' V-—< S ^tnovcsMon;-^

Q / \ Π S Sr rrHkr-r^N

•h Q33 mmm « m -» r 2 +j \U S » » «. in h » io co rj > tn .Q - - - / -^nn'— SNSSo

m \ VOXXOVrHnSrvIfH

M λ-, Γ'-σΊΓ-σν-.η·...

0 w - - - ► Ό - j-ins

Ch (H HhVOfN-rfsrrt < r~

rtJ

> (0 m to s « o 0=0 o

CN

X

o

(N

X

0

H JL

X 05 Q) E ·

•H O

(Λ Z rl

W fN

il 39 80700 ^ « w η % •-h o o o o in m ο ο

.— I ίΝ 03 (— !—t r~~- <—I

Ui E r* in on o ρ« m m h

CQ 0 rH ι—I rH rH l"H rH r-4 rH

33 ^ ^ h ^ ^ ^ ^ —' in m o in o o m o X 30 ΟΊ r-l r-l 04 cn o *—i

Oi <3 OI ID ^ (N 03 30 ^ 04 M E 04 rH M r-l (N rH iH ι-l ? » » k * · k k k k —· o in m m o o o o o in *3" in in o ra mininovo τ 30 ·*τ m o io 'T m o

mi—I r-I ι—I *—I 03 ι—I ι—I ι—I rH

M f MM ts 0 2 m *3“ m E * 04 04 U >j m m E m o in o > r< i—I 04 —I i—( D w oj m 04 in rrt — * k * N k —.

_M — *«** _ _ mm mm m* yMv mm ^ ^ Mm m km «m in - N * rH 4-> —. 04 'Tl—i 04 rQl W * 55 CO * *55 * * * * * I Z TJ >«r Λ M K i-ι .u * m ^ — £ •H —’»O·—' .Q >—1« ι *— ~ ' c O _.— 04 O' — —' ID 00 55 * 30 i-I rj· •H 3O55C0rHC3C0O4.jQ r* m 55 © * © - - r| — rH OI H r- 04 03 ’ — * 1—1 ·— P r- P Ό 04 * · s n ·. · σι nm » v - o D-H * = 03 rH * hj· rr 04 * — T3 * hT k M Ui — —· * * —. * k r i —. o —' — co —»

•UI >h — Zo—ON——.30.— E O 00 N - N

Π3 Qi £ —i o 55 — E N E * E m r m 55 rr 55

Tl — Q, k rH[SNXHÄN * m * O *30 CL· tn m * m « «g< *55 * tn * m - —* -

., t! -3 * E -r-l - em£ .Q —. * rH E O

ΪΓ O * —' —. — m 1—I 04 * *— *— K H* rH 04 rH

> ><o co n m * * —ι τ 73 m o m n * * * ^ Ui — O S H - ι/l » ID T3 30 * S O e m - S'0 »m * n »E -—O' · »- £ 'T c — *.

·* l m ► m S m· i—ι m· m * tvi h· t ^ ® «r -± PS *30 »oi * * *04__. * τ r* * in * Z, Σ —.*-**SO-h-E —.03 * e * e

'JZ ESSPl*-!'— Eu"»«-H E - E rH *T rH

|5 moimi—l * © rH * * m 04 oi * * * c_, E * * * * Ό o *—.tn * * *T3-*T3 i—* m d in ι/i Ό ·- E n .fi tn—»40όντ3 — .*— ^,*^3-*^ — N —' '— E—' t m r~* nr hji *0*3003 t— S r* m m o 0-00 * CD ,_.in *-30 0* TT rH 03 r 04

k ► ► — r- 111 r- i — i * — r. r- r 04 K

rHmmi-Hmo4*Ti-(30 i-h r*· m m rH in > + S 03 M 2

Ό E I

« O Q

04 O

E O

EE aT

o—u u 04 04

E E

u u

•rl ' I

Λί II II

Ξ « «

Ui <14 e

•H

tn o ω Z 04 m 04 04 «O 80700

--' » * * « » » I

·~* mino m m o m — ·» <-h en o i-tr^om i-i E r- -τ o p- m o o

CQU rH ι—I ι-Η i—IrHr—ti—I

^ — — — · ^ — — — '—' - omoo oomm X cNr^'Tio <n o o o d ns omoo οι 10 m <—< HE 0s| i—I I—t i—I (N f—I »—ii—( ? ---- ---- — omoo oooo o o m o tj· m m r-i

N· «3 T CM <f ^ (N

(H rH rH rH ΓΗ i-H rH rH

ο Ξ 0 'TO hj·

X CN CN (M

U X o m o fQ *. v ·> £ vo »-h vo rr

> r< rH CO o IN

X 'r' (no cn m «- ^ CN -- CN rH--

O — VO X - ·. O rH N

»-Ν'-O i-H _. X - ~

ns (J\ *T X - - X ι-H ^ Γ- CN

.—· cm - r- n· cn r-I - m - —. - - j3»t3._ —. r- X| o n ao — Ό — X N -

1 - X - X i-H '— VD rH O <N

‘2 —. O O CN «300-0».

. X - - - ^ O ·» £ ». Γ- ,H mm'TE cn-'T-'i-h- rr-— - 1—1 - -- « o - r- ο as •X ,H E - S to — - .— m - cn ξ ^ ·χ '-'OrH'T χ — N · O - 3>c m »- - r- ι-ηΧΚ-τ-ό

X η, Ω< ι-Η·«3·Ό·«τ· - O o - N· X

-- Ό - — m - — - ·— +J ΟΧ'-'— n jQ tn rH X X Ο O " 1 I-H o N X —' —' I-H i-H i-H i-H —

μ. >*° m - rH X CO O00----N

^ Sh o ό - m - cn o o £ χ r- X

^ ns - Ό 'S· - o r·.·.—'T3-.cn 0 CM ' - o o rH O O — — - M K - VO — i-H - -. - - »3* ΓΗ N Γ- 52 —ON - 00 — — X - CM X -

3 Z X -XX ·. X X i-H Ν' - CM X

O O O rH rr 00--m-CN

rH —H ^ *» ΓΗ ^ ^ ·». *» fQ «e*» *, ^ (0^ UI — - 4J X U) E Ό N — - T3 ' rH — — ~ * ac -33 33 —r CN O i-H o - m 00 CN N1 I-H I-H o cxi - -οχ en co - - - m r tn X r~ X - - CN E X -- I ' --- N* — rH (N O rH ^ ' P-

M

<0 S

> <N U ^ 1 cd 23 23

ro Z—U l»C\ J

x cn

x T

°

! -H II II

S

1H

0) e ! -rl “O n· m

W2 (N CN

4i 80700

A S K ^ (k k ^ S

*-t o o m m m o o o m o —> l n* cn n· σ\ m ro r- o ν' o S-t S σι 10 *y cn o m in tj n h

X 0 CN i—t i—· f—I f—I CN i-H r-4 i-H i-H

X * » * * * k » » > * · —' k o in m m m o m o in o o

X <30 Ν’ O CO O O CN N· C7\ f" CN

CC 0} (N Ά in n H ro lO N· <N -4 O

►H S rO 1—1 kH 1-0 f—| PO 1—I r—I r—I i—I i—1 ? » k * * » k » s k V k —· o in o o o o in o o o tn in <-i r-^ o r-ι m i—i σι ro ι-o m ^ i> in ^ m n* i— Ν’ ro cn o Γ0 rH r—I i-H i-H rO 1—1 r—I rH i—I i—1 M g 0 5 ro in in X «· t-i ro U X cn m CQ % *k £ CM f-f > »< (N m D ^ ro ro % « « » · -—* *>*»*. CN «m»

S Z3 CN £ S O S ~ S N

CQ F·* CO *» i-H **> r-H CO rH * S

*k ro %. co ** ·* *. r».

m tn w * in ό % m ui ·* Ή * n - ό l .q x ► to ja ~ . ^ x x χ 1 — n· t—1 rr k-' n — äo x m i-< o * •r4 o * * O X <J\ O ΓΟ O » ·- ~

5 in ' Ό »k N 00 lo k k k 4J rH (N

;q - ro to n - - - ro in n· i-· R TO CN k - ~ ^ a rs ·* —' * ro « Ό R -H "k k— <31 rl kk. k. — H —k σι tN - r\ Γ_ — —. X r^ - — j- —. x m n * - o

Jj r"1 Ξ X CN k (N N CN X CN *- χ n· n· in C. CL »h ·> ro fH x k. rH-roo--*- -_- CU k 4-1 k. - O XJ k JJ kr· X r*k m Ξ—’ — X ε —' —. ,—i x ,—i M o o n <-ι ,h tn k— m n »h ru - ^k

k;, TT O X k r-ι in O o X k ~ T3 M

—’ σι—i^Ok·- o^otNgOX

o dj k ro k· ' X r» · k ro *k k ' ' pk 1—1 k oi (M r-l k —. rv) k (l) 5! |k V CC k -—k i—t o k -—k n k — 1—4 k m cn co O -l-ι . —. X k r 4—1 N —l— X k 32 k — k Z x i—i χ n· —· X oo χ ·-· χ ,-n n* m χ 3 ro k t—i k id o ** ro » ,-ι k » k c-ι nj x k en k .—„ co — co k m ~ χ .— .—. k Εη'-' tn j3 Τ3 n k ,-ι k ιηΛΌ'ΌΝΝ'Π w ^ — X N· 1-1 X k^ w k^ k-, X X kk ro m m o k k f\j ro o r-~ n· in iq n·

fs (n Γ0 k M CN k l". O ro 00 r k CO

— kk I-H X k- ’Q k k k k pg o k- r—i m ro *—i cn n* —k kHfOrorOk-ik-iin ' $

S m G

« o o 2 0 o 1 ti h °S cc 2 14 · |£ en m r» U CN cn 42 80700 ~r'~ ^ ^ % ·> «. v ·>> · V ° ί1 ° ° o o o m m Τ' ' CNt^r-trH ΠΟΛΗΝ on in »r cn on m m cn 0

® ^ CN rH rH ,-H (N fH rH fH rH

X ^ ^ « I ^ ^ % ^ ' ° 2 o 0 ^ o m tn in 0 . n P"* fO Lfi O VO Ο Ό LO Ο Γ^·

Sp fnvo^rno m id n· m 0 m e m f—( «-h r—( cn rH rH η ,h ' » ^ » ·.·***.,.

^ ooinmm oomoo in <n on en o oi in in 'r h

^ -rr m h m m n rH

nrHr-llHrH ΓΟ Ή fH Ή ,H

*7* C

+U C

O C

(N vO

®. * 10 "3* (N

CJ g <n in in S 00 rr 0

^ r< rH fH CN

•h ' ’ m in π «m» V <h 23 22

"L ^ rH rH rH

-K' ' vo~= in * . ό ^ -u ~ ΌΙ ' — m in m _q . . .— — — · · ..

1 ^ C N r~ rN v — 2: n in H co n _

N — ~ O N· ΤΓ t3 CN—'ZO*.OZ*O

‘2 —mm * — m«.oo»-=~Tr·" -3 « ; * v « s n , -ιη^ττ·^·Γ^^-Η •H •‘KIN ΗΓ'—. (N £ IN - Γ~ *0 VC' fH --IN V r-N r.'— fH CO —.*03 u'Z· -m^N^fQvOS —^in-N-NCO* _ £ SrHSi — £ Ό ‘ IN SO>S=:nr~».~ H Hf ~H fH ·* fH O " r— r· fH r~ fH O r* N* fH —f hh0* ~ m .. · m h h en *.«n »*·,»..»» 5 0 * E ‘ Ό H s 0 = fl .

4J f> ~ m - »· ' 2: ·—.— — rHfNfHfH--__ η £ *° m on r~ - n1 in in n m n co ^ » v m n •rnro^ -O r-mcN^^ja*· c^KmrMEiNroiNs: —- *" CN r- ·. —. —«.<—'Ό · CN » r- — · Ό ·- [*« (H— (N - m^NNT-^ rH ·- rn *T m T 03 »

> — VC - ' — — cor~ vio-*in»n-fH

Σ -—' — —. — in id ro _____ «, — ·. 2 cn r— «.

KH“h »rin S — — — -H Ν» fH ·-— ~

y, , M cn * m - (NO - r-~ niNm***cHCNfH

-- ^ —· *W*OrHfH— * ~ - ~ T3- 'Xj 3 I inj3MOff.N— in +j in ό no—.uitj f—I " * * 33 X X N H-f ’ 1 ' S Η» fj _Q s_r 3 "<TOrHTj<fHrHO~ NoovDo-^rcoS— to [hnooqo «. *. r(N rnoNOco^—(ττιηττ E-l , '-•-r'a-pHl H r-«--^(Nr-^^^

HiNnm — — Hoo tHCNmmfHinrHr-.oo !>

(fl CN

I + 0 •rj 11 11 ^ « on u d in z ω

CD ON

CN CN

II

43 8 0 7 0 0 A ^ ^ h s ^ ^ · h o o o ominut

—. I (N CN HP CN Γ~ ΓΟ ID

J-I £ m ro r~- m ro o CQ O I—I rH (-H f—1 rH r—I f—t ^ k ^ ^ · V ^ v — > oooo o o m o X ro oo o cn ro o <—·

X <0 ot m Tr o otio'S’CN

M £ CN rH rH rH CN rH rH rH

O ^ ^ ^ ^ N ^ % Ib —1 o o o m oooo τη cn m i—i rommo V \β t N ^ lO ^ ro ro <-ti—( rH ro (—t»—it—<

•M C

o δ *.

ro r-( rH rsl

X «· CN N· <-vI

U X ro fN ut (0 «b b b E m o m ro

> r< rH «N rH (N

O —* <n m (N ro rj * 00 ^ 3 S oo h e y CU r\I O b b b ^ ,—I *. b

4J —» »· CN —b 'p WX » — 'O

cc m jjmN-^m χ ,—. ^ τ3 x ό

Tt Ό | '“'»Sr—bCNlO ' bb . -— , . b— — ro X σι X * b o E n r^· - o σι I-H b CN Hp [h id - x o in ro h » - o » - - . - o ut b χ b > "d N fl h E X —« cn o - - r~ ^ ’ ** * rH N X b b rH b O " r-b O -H — oo ro ro - X rH .—. ro h ^ σι -« X · X X —. X ro ·- m x3 ut » x ..»Ν b. n (n .—.

X T4 E Ή ·- Hp b X r UJ rHÄ — X Ό- X «·Ν

3 S,0' * n * — oo J3 -n—io-mEX

Ή Q.CU to h X ^ h ^ to x - «b -—- r — m 3 -=4 £ r* rt r> n a ΤΓ Λήτ3γηΧοιο·- l0 "ro ^ X r N rH *—I —' b ^“b' rrt CN r-H b rp

Eh 51° oo ·—! 03 x m « · miocTi-.·.·.^- C —· m -oh - tJ 00 c\-ro<NEro^m (¾ · E ' *b — ^ - - X *- - -- .— v

CN — CN <N N Ut -b 1—I CN ro HJ" CN N .H

X "b O 00 1—I X N - b b b LT) - X b 2 —b o » «· m »- x —..υ.-^χ - xmx

2 £ · (O X r r> (O Cn—rXrHrTrH - CN

00 CN ^ r—i o b» b, *b f-π ro b b b rp b

X b b .—. b ,—I —.00 ΧΟ-Ό.— X - X

—1 V) —b N X ·* N ro».tnONT3mX

— N X — X X X — ΓΟ — X — r — m X 00 id 1—1 r- rH id * 00 ro -r m ή 00 r~- ro b o - · b _ o 00 *b <n b *p b b CN * 4-1 O X *b X b b CN - X ·

rH ID rH HP —> rH *— 1-HrHrOrOrHlCtCNCO

5 + CO (fl 5 rC* 2

« O I

2 O

<f 0 « Il

X X

•H

S.

I δ o a "

1 I

44 80700 — * * » * > Τ' o o in m o m in o o Λ J cn αο ro o cn ro ο r-ι ro ijS r~» m ro ι—I σ-ι vo -»r <n o ® o i-Hr-lr-lrH CN ·—4 f—f r—4 r—4 S S S ^ ^ ^ ^ * oooo o o m o in X so co in ι-c en in in o vo DSjfl oi 10 ^ ΓΊ cn vo rp ro o

M £ CN I—I ι-l I—( ΓΟ <H rH i-H <-H

^ s s s ^ M ^ % ^ w o o o o m o m o o in eo in os o vo oo·—ico^ro ’T vo 'T n o ro r^ in ro -h

CO ·—I r-H rH l—) CO ·—< ·—I ·—< <—I

hN H

O 5

ro CO VO

2 s CS) so

CJ x CO CO

’* flj ^ *» g co o vo

?> r< H IN CN CN

O'-" cn m · ro in * ** —^ «.

X N N Ο Ό <o <n EX x ο os to —' - ΙΛ s CN m CN<—4 - ·- m -u — Ό » ·. ro o in "—CO ^ £ Ο «Τ^ΟΧΝΙΓΟΙΟ ! ro o vo ·—I t-o I ·—* X 0 ·" ·* n* ^ * 0 vo » s in s p- »— · •h s ro .—. s ·<τ sr os ό » ·· * ·· -C CN s χ ry * *. s ·- Ό ro ro —» Λ 2 s Λ ro «. <<3« sr t~.cN—r-(-.tgx

3½) — N » —» - * > «00 « ~ 2 (N

5 -H *X XX tn N ^ X X —.CNXNr-1·.

cd M E ·—4 cn — x x —4 m n ·. ·—t x ·> g ro £0 Ch s ·- ro o CN «. * X co » in ro —· 7^ Ä 10 ^ <ί . * ό ό (N »O t h vo ^ -p Λ * i h ίο Ό Ό ·· o s τρ O- —· X CO Γ-4 ' — — CO X i-l τ-Ο X ».

O > «O Λ H » s H 1/1 VO - ro VO '“CNN* · •5 2 w m * - sr H o r^ro*^TT*^^

"3 · Ό E · .· ·. ·· ·. tn co *. Ό —>N

r-t CN —— · I Ν’ ^J· in CN CN — ^'T'— ne 2 χ -00j*-’“-· •‘•»co^-cNxr^ S -—.os £ Z — —* — —.XcsiNXOin

^ 2 X*~^4—ΙΝΧΧ X CN ·* X r—I - -O

_, CO CN O s X f-H CN ro s CO r—4 «P N* t—4 r—4 — ' ' 'Γ Ό in » s ^ w — · Ό * E CT nO-vu - *ir

- N ro - CN — — — — = —, — X X

•t X » <r h es m ,—4 in m s o *>«-< rs τί — 00 * 00 01 osin - vor-s ......

** s E S- E · s **g**.g 4J X

.—( vo ro ro ,-h o* vo ,—1 rs] — n· ro — — , ) + m

E

8 + cn cj rd

EE S

2—CJ I

CN o

> E O

cd CJ CJ

(0 CN CN

^ /-> ,η EE

E 2-Γ) O E

On / U CJ 2

XV^ E E O

T 2— U—CJ

CN CN

E χ

CJ U

1 I

-H II II

3 “ “

P

0) ω o cn m 2 ro ro 11 45 80700

H

— I

u e CQ ö

X I

*

X

« ia M 6 >

0 I

ΓΟ S - 1

U X

—' (¾ > -c5 3 — m ai ΌI —

1 T * VO

"2 S - O

\\ n in S 'J —i £ 'O-i * = § 2 — *- « ^ rs —

_Z = rn ε N 'N

i rs -.1-=6 = (rt rv Qj ' O O CO — ro Φ

.|5, 3d. I» CO <f ·. Γ" rH

_. ja »- *· o m o —t

i_i o ' '—’ <n ro —t «. —i -H

o> «O PO » <» ». "3· «· 0>

>_i — σ>ΛΛΓ0»Γ0 C

q (rt *- rti# = * — ^ (rt I —I Γ0 ro ·<τ N 'T (rt v = « » « » 95 « ai

p 2 —.6 ui = ui = O

i—( 2 = —^ . *- —. -P

3 O h CO » (N ' -r~* (rt = - a o rt o fl £ £h —( 01 ·· *- Ό ^ Ό — CN ro — = — η° r-~ - >. 'T —( vo n^ r~ __ co » cn

*·==·. Ό — nJ

—i ό m ro — m ό

CN

S

QJ

•H

>; λ: ν α; 5 .§

S -Γ1 S

*5 c 2 3 CN .μ = 4-· u <u CN 4-» = >1 U :crt

I X

II

X

r4 (rt * -p a; P · o

φ 0 (N

S 2 «r Q

•h ro 01 — W <0

Claims (3)

46 80700

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten kaavan (II) tai (III) mukaisten mitomysiinianalogien ja nii-5 den myrkyttömien farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, O q ch2ocnh2

10 R -Alk,-SS- (CH„) _-0 Jl Jf CH3 ui) 15 2 o CH2OCNH2 r4-ss-<ch,),-ov IL J rrv^

20 CH3 (111) joissa kaavoissa Alkx on etyleeni tai metyleeni, R3 on asetyylioksi, 1,2-dihydroksietyyli, karboksi, 1-karboksi-25 aminometyyli tai l-metyyli-imidatsol-2-yyli, ryhmä NH2 NHCOCH2 CH2 (LhCOO-Na+ tai dimetyyliamino, -CH CONHCH2 COO* Na* 30 R4 on fenyyli, 4-nitrofenyyli, 4-metoksifenyyli, 4-amino-fenyyli, 2-karboksifenyyli, 4-nitro-3-karboksifenyyli, 4-pyridyyli, 2-(3-nitropyridyyli), tunnettu siitä, että a) ainakin yksi ekvivalentti 35 triatseenia, jolla on kaava (V) tai (VI) II 47 80700 Ar-N=N-NH-(CH2 )2 -SS-Alk1 -R3 Ar-N=N-NH-(CH2 )2 -SS-R4 (V) (VI saatetaan reagoimaan yhden ekvivalentin kanssa mitosaania, 5 Jolla on kaava (IV) O o ch2ocnh2 jdch3 3 o \ J^”H (IV) joissa kaavoissa R3 , R4 ja Alkx ovat edellä määritellyt ja 15 Ar on diatsotoitavissa olevan aromaattisen amiinin orgaaninen tähde, sopivissa reaktio-olosuhteissa inertissä orgaanisessa liuottimessa lämpötilassa noin 0 - 60eC, kunnes riittävä määrä kaavan (II) tai (III) mukaista yhdistettä on muodostunut, tai 20 b) ainakin yksi ekvivalentti kaavan R3AlkjSH tai kaavan R4 SH mukaista tiolia saatetaan reagoimaan yhden ekvivalentin kanssa mitosaania, jolla on kaava (Ib) /N02 2 25 /T\ N CH2°=NH2 V 7s5' (CH2>2-V^S-^ OCH, CHj *lb* 30 '--- joissa kaavoissa R3 , R4 ja Alk2 ovat edellä määritellyt, mahdollisesti ainakin yhden emäsekviValentin läsnäollessa, inertissä liuottimessa lämpötilassa noin 0 - 60°C, kunnes 35 riittävä määrä kaavan (II) tai (III) mukaista yhdistettä 48 8 0 7 0 0 on muodostunut.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jolla on kaava 5 VH2 O ho2cchch2ch2cohh O CH.OCJJH, CHCH «SSCH-CH-O I 2

10 H02CCH2NHC0 ^ I N (N

3 T^V>-H 15 tai sen myrkytön farmaseuttisesti suola.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jolla on kaava 20 j! chXh V X)-SS-CH,CH,-Ox Λ 25 '—N j I fevil) II 49 80700