FI105076B - Menetelmä inaktivointikäsittelyn virusinaktivointikapasiteetin määrittämiseksi - Google Patents

Description

105076

Menetelmä inaktivointikäsittelyn virusinaktivointikapasiteetin määrittämiseksi 5 Keksintö liittyy virusinaktivoituihin verituotteisiin. Etenkin keksintö koskee patenttivaatimuksen johdannon mukaista menetelmää inaktivointikäsittelyn virusinaktivointikapasiteetin määrittämiseksi.

10 Verituotteilla tarkoitetaan ihmisen tai eläimen verestä tai vastaavasti plasmasta tuotettuja tuotteita, jotka on tarkoitettu terapeuttiseen, profylaktiseen tai diagnostiseen käyttöön. Tällaiset tuotteet sisältävät entsyymejä, proentsyymejä, mukaanlukien hyytymätekijöitä, entsyymikofaktoreita, entsyymi-15 inhibiittoreita, immunoglobuliineja, albumiinia, plasmino- geeniä, fibrinogeeniä, fibronektiiniä tai plasmaa.

Verituotteiden käytössä on infektiovaara luovuttajan plasmassa mahdollisesti esiintyvien infektioosisten aineiden, kuten he-20 patiitti- ja AIDS-virusten johdosta. Jopa silloin, kun annetaan yksinomaan plasmaa, joka on testattu näiden infektioosisten aineiden vapauden suhteen, testimenetelmien rajoitetun herkkyyden johdosta ei voida sulkea pois potilaan infektiovaa-raa. Valmistettaessa verituotteita on tästä syystä pakko inak-25 tivoida mahdollisesti esiintyvät infektioosiset aineet erilaisilla toimenpiteillä.

On olemassa laajalti kirjallisuutta, joka käsittelee verituotteissa esiintyvien taudinaiheuttajien inaktivointia.

30

Erilaisissa menetelmissä - kuumennetaan verituotteet vesiliuoksessa, mahdollisesti lisäämällä virusidisiä aineita, - kuumennetaan verituotteet vesiliuoksessa stabilisaatto- i 35 reiden läsnäollessa, - käsitellään verituotteet orgaanisilla liuottimilla ja/tai ' detergenteillä, - kuumennetaan verituotteet kuivassa tai märässä tilassa, - käsitellään verituotteet orgaanisilla liuottimil- 2 105076 la/detergenteillä ja kuumennetaan verituotteet kuivassa tilassa.

Kaikkien näiden inaktivointimenetelmien pyrkimyksenä on pois-5 taa valmisteiden potentiaalinen infektiivisyys, mutta säilyttää pitkälti niiden biologinen aktiivisuus. Tämä päämäärä on kuitenkin tähän mennessä saavutettu ainoastaan albumiinival-misteissa, nimittäin kuumentamalla albumiinin vesiliuokset 60 °C:n lämpötilassa 10 tunnin ajan, koska albumiini on olennai-10 sesti stabiilimpi kuumuuden vaikutuksen suhteen kuin kaikki muut verituotteet.

Yksityiskohtaisesti mainittakoon tekniikan tasolta esimerkiksi seuraavat kirjallisuuskohdat: 15 DE-hakemusjulkaisu 29 16 711 esittää menetelmän hyytymätekijöitä sisältävien valmisteiden käsittelemiseksi vesiliuoksessa käyttämällä 30 - 100 °C:n lämpötilaa, jolloin hyytymätekijöiden liuokseen lisätään aminohappoa ja mono-, oligosakkaridia tai 20 sokerialkoholia.

EP-hakemusjulkaisu 0 053 338 esittää menetelmän hepatiittivirusten inaktivoimiseksi tekijää IX ja X sisältävissä valmisteissa, jolloin verivalmisteen vesiliuosta lämmitetään kal-25 siumionien ja mahdollisesti aminohapon ja/tai sakkaridin tai sokerialkoholin läsnäollessa korkeintaan 100 °C:n lämpötiloissa .

EP-hakemusjulkaisu 0 035 204 esittää menetelmän vesipitoisten 30 proteiiniliuosten inaktivoimiseksi, jotka voivat sisältää te- : kijää VIII, fibronektiiniä, globuliinia, fibrinogeeniä ja mui ta proteiineja, jolloin koostumukseen sekoitetaan polyolia ja seos kuumennetaan 60 - 75 °C:n lämpötilaan.

35 EP-hakemusjulkaisussa 0 052 827 esitetään menetelmä hepatiittivirusten inaktivoimiseksi tekijöitä II ja VII sisältävässä . vesiliuoksessa kelaatinmuodostajan ja mahdollisesti aminohapon ja/tai sakkaridin tai sokerialkoholin läsnäollessa.

3 105076 US-patenttijulkaisussa 4 379 085 esitetään menetelmä plasma-proteiinien, kuten Ci-inhibiittorin tai tekijän IX lämpöinak-tivoimiseksi vesiliuoksessa kalium- tai ammoniumsitraatin läsnäollessa.

5 EP-hakemusjulkaisussa 0 077 870 esitetään inaktivointimenetel-mä, jossa tekijää VIII sisältävää vesiliuosta kuumennetaan 50 - 80 °C:seen lämpötilaan aminohappojen, monosakkaridien, oligosakkaridien, sokerialkoholien ja hiilivety- tai hydroksihii-10 livetykarboksyylihappojen kanssa, jotka sisältävät 3-10 hiiliatomia .

PCT-hakemuksessa WO 83/04371 esitetään menetelmä hepatiitti-virusten inaktivoimiseksi, jolloin virusta sisältävä valmis-15 te käsitellään 4 - 40 °C:n lämpötilassa halogeenihiilivedyl-lä, etenkin kloroformilla.

EP-patenttijulkaisussa 0 015 055 esitetään menetelmä verituotteen käsittelemiseksi, jolloin tuote alistetaan vedettömässä 20 tilassa mikroaaltosäteilytykseen esiintyvien mikro-organismien inaktivoimiseksi.

Rosenberg et ai. esittävät eräässä kirjoituksessa (XII. International Congress on Blood Transfusion, Abstracts, "MIR" 25 Publishers, Moscow 1969, pp. 473 - 475) menetelmän albumiini-pitoisten valmisteiden ja fibrinogeenin inaktivoimiseksi kuivassa tilassa kuumentamalla 10 tunnin ajan 60 °C:ssa.

EP-hakemusjulkaisu 0 094 611 esittää menetelmän tekijää VIII 30 sisältävän koostumuksen käsittelemiseksi kuivassa, esim. lyo-:^ filisoidussa tilassa käyttämällä vähintään 60 °C:n lämpötilaa esiintyvien hepatiittivirusten inaktivoimiseksi.

PCT-hakemusjulkaisussa WO 82/03871 esitetään menetelmä veren-35 hyytymisentsyymejä sisältävien valmisteiden käsittelemiseksi, jolloin nämä kuumennetaan esiintyvien infektioosisten virusten • inaktivoimiseksi kuivassa tilassa,* kuivaksi tilaksi nimitetään sellaista, jossa on alle 5 paino-% (0,05) vettä.

105076 4

On osoittautunut, että menetelmä, jossa kuivakuumennetaan ly-ofilisoitua tekijä VIII-konsentraattia 10 tunnin ajan 60 °C:ssa, saa tosin aikaan määrätyn virusinaktivoinnin, mutta 5 että kuitenkin antamalla kuivakuumennettuja tuotteita siirretään hepatiitti- ja myös AIDS-viruksia [Eur. J. Epidemiol. 3, 103 - 118 (1987)]. Kuivakuumennuksen hyötysuhteen lisäämiseksi PCT-hakemuksessa WO 88/08710 ehdotetaan kuumakäsittelyjen sarjaa .

10

Samoin EP-hakemusjulkaisussa 0 378 208 proteiinipitoiset koostumukset käsitellään trialkyylifosfaatilla yhdistettynä kuiva-kuumennuskäsittelyyn.

15 ΞΡ-patenttijulkaisun 0 159 311 mukaisessa menetelmässä verituotteet käsitellään kiinteässä, märässä tilassa. Veden, me-tanolin tai etanolin pitoisuus säädetään arvoon, joka on yli 0,05 (5 paino-%) ja alle 0,70 (70 paino-%), ja kuumennetaan suljetussa astiassa 50 - 121 °C:n lämpötilassa.

20 EP-patenttijulkaisussa 0 050 061 esitetään menetelmä, jossa biologiset ja farmaseuttiset tuotteet käsitellään 0,25 - 10 paino-%:11a ei-denaturoivaa amfifiiliä (detergentti). EP-patentti julkaisussa 0 131 740 osoitetaan kuitenkin, että kä-25 sittely detergentillä yksinään on melko tehoton virusinaktivoinnin suhteen. Tehokasta käsittelyä varten tässä kirjallisuudessa esitetään detergentin ja di- tai trialkyylifosfaa-tin seosta. Tällöin detergentin konsentraatio oli 1 % ja liuottimen konsentraatio 0,1 %.

30

Yhdistetty käsittely, jossa käytetään orgaanista liuotinta/-detergenttiä ja lämpöä, jolloin verituote kuumennetaan kuivassa tilassa, on esitetty samoin kirjallisuudessa [American Journal of Hematology 35, 142 (1990)] .

Virusinaktivointimenetelmiä nimitään nykyään tehokkaiksi, kun menetelmän suorittamisen jälkeen verituotteessa, johon on lisätty testiviruksen suuri annos (esim. maksimaalisesti mahdol- 35 5 105076 lisen titterin mukaisesti, joka on n. 10s, hyytymätekijävalmis-teessa), ei voida osoittaa enää viruksia näytteessä ja virus-titteri on siten vähentynyt alle osoitusrajan.

5 Inaktivoinnin mittana on niin kutsuttu muuntokerroin, joka lasketaan testiviruksen ainutkertaisen lisäyksen jälkeen alkuja loppuvirustitterin osamäärän dekadisesta logaritmista. Euroopan yhteisön komission ohjeista EC III/8115/89-EN tunnetaan edelleen niin kutsuttu kokonaismuuntokerroin. Se lasketaan 10 yksittäisten peräkkäisten inaktivointitoimenpiteiden muunto-kertoimien summasta.

Nykyaikaisessa lääketieteessä on tarpeen käyttää useita verituotteita pitkään - useissa tapauksissa myös kestokäsittelynä 15 - suuria määriä, nimenomaan myös profylaksiaan. Tämä johtaa pakostakin infektioosisten hiukkasten kertymiseen ja siten olennaisesti, lisääntyneeseen infektiovaaraan, jopa käytettäessä jo virusinaktivoituja valmisteita.

20 Muuntokertoimia on verrattava koko plasmaseoksen virussaastu- misen niin kutsuttuun "worst case situation"iin. Aikakauslehdestä Allgemeine Medizin 65, 429 - 433 (1989) on tunnettua, että huolimatta testatun ja HIV-negatiiviseksi todetun plasman käsittelystä plasmajohdannaisissa on mahdollista HIV-pitoi-, 25 suus, joka on 10B ID/ml (infektioosisia yksikköjä millilitraa kohden). Olettaen, että potilaalle annetaan hänen elinikänsä aikana kaikkiaan n. 100 1 tekijä VIII-valmistetta, plasmajoh-dannaisten virusinaktivointimenetelmän on mahdollistettava virustitterin 1010-kertainen alentaminen potilaan 30 AIDS-virus-infektion välttämiseksi.

Keksinnön tehtävänä on saada aikaan virusturvallinen verituote, lukuunottamatta albumiinia, josta voidaan odottaa, että infektioosisten aineiden siirtyminen jopa annettaessa -suuria 35 määriä verituotetta on suljettu pois ja jolla siitä huolimatta on vielä suuri biologinen aktiivisuus.

Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti infektioosisten 6 105076 aineiden suhteen inaktivoidulla verituotteella, lukuunottamatta albumiinia, joka verituote vastaa arvoltaan vähintään koko-naisvirusmuuntokerrointa 40, jonka biologinen aktiivisuus on vähintään 50 % suhteessa aktiivisuuteen ennen infektioosisten 5 aineiden inaktivoinnin suorittamista ja joka saadaan inakti-vointikäsittelyllä, jolloin verituote käsitellään vesiliuoksessa, joka sisältää vähintään 2 %, etenkin vähintään 5 % detergenttiä, ja kuumennetaan tämän jälkeen kiinteässä tilassa, tai 10 - verituote kuumennetaan kiinteässä tilassa ja käsitellään tämän jälkeen vesiliuoksella, joka sisältää vähintään 2 %, etenkin vähintään 5 % detergenttiä.

Etenkin keksinnön mukaan saadaan aikaan infektioosisten ainei-15 den suhteen inaktivoidun verituotteen, jolloin verituote käsitellään vesiliuoksessa, joka sisältää yli 10 % detergenttiä, ja kuumennetaan kiinteässä tilassa.

Eräs toinen sovellutusmuoto käsittää infektioosisten aineiden 20 suhteen inaktivoidun verituotteen, lukuunottamatta albumiinia, joka verituote vastaa vähintään kokonaisvirusmuuntokerrointa 40, jonka biologinen aktiivisuus on vähintään 50 % suhteessa aktiivisuuteen ennen infektioosisten aineiden inaktivoinnin suorittamista ja joka saadaan inaktivointikäsittelyllä, joka 25 käsittää kaksi tai useampia erilaisia inaktivointimenetelmiä, jolloin vähintään yksi menetelmä koostuu verituotteen lämpökäsittelystä kiinteässä ja kosteassa tilassa, jonka vesipitoisuus on 0,05 - 0,70. Tässä sovellutusmuodossa edullisesti ainakin yksi menetelmä käsittää käsittelyn vesipitoisella deter-30 genttiliuoksella.

Biologinen aktiivisuus määritetään entsymaattisena aktiivisuutena (esim. verenhyytymisentsyymien ja kofaktoreiden aktiivisuus) , aviditeettina (immunoglobuliinien aviditeetti) tai an-35 tigeeniaktiivisuutena - mahdollisesti käyttämällä aktiivi suus- tai vastaavasti antigeenimarkkereita.

Keksinnön mukainen verituote voidaan valmistaa tavanomaisista 105076 verituotteista siten, että inaktivointimenetelmä suoritetaan aikajakson kuluessa, joka riittää vähintään kokonaisvirusmuun-tokertoimen 40 aikaansaamiseksi. Tämä aikajakso voidaan selvittää kokeellisesti verituotenäytteessä siten, että käsitel-5 täessä määrättyjä määriä lisätään toistuvasti testivirusta, jolloin jokainen toisto suoritetaan vasta silloin, kun virus-titteri on laskenut määrättyyn arvoon, edullisesti osoitusra-jan alapuolelle. Kokonaisvirusmuuntokerroin muodostuu yksittäisten muuntokertoimien summasta.

10

Kun siis käsittelyn aikana virusten inaktivoimiseksi testivirusta lisätään valituin ajallisin välein toistuvasti biologiseen tuotteeseen, alku- ja loppuvirustitterin määrittämisen jälkeen virustitterisuhteen dekadinen logaritmi kerrotaan vä-15 lien määrällä ja muuntotekijät lasketaan yhteen kokonaisvirus-muuntokertoimeksi. Tämä lasku edellyttää, että virustitterin lasku viimeisen testiviruslisäyksen jälkeen ei ole suurempi kuin edelliset titterin laskut, mikä on myös osoittautunut.

20 Testiviruksena voidaan käyttää esim. AIDS-virusta tai Sind-bis-virusta (hepatiittivirusten malliviruksena).

Keksintö perustuu siihen havaintoon, että tunnetun tekniikan mukainen käsittely tavaramerkillä Tween® markkinoitavalla ai-25 neella tai detergentillä, mikä suoritetaan alle 10 %:n detergenttikonsentraatioissa, ei johda mihinkään tyydyttävään tulokseen, jos verituotetta ei ole alistettu mihinkään muuhun menetelmään virusten inaktivoimiseksi. Tämä voi johtua virusten proteiinien suojavaikutuksesta inaktivoivia aineita, kuten 30 esim. detergenttejä vastaan. Tämä suojavaikutus voidaan kui-: tenkin kumota korottamalla Tween® - tai vastaavasti detergent- tikonsentraatiota haittamatta olennaisesti proteiinien biologista aktiivisuutta. Tällainen toimintatapa mahdollistaa sen, että voidaan luopua muiden aineiden, kuten esim, liuottimien 35 lisäämisestä, joiden toksinen vaikutus on tunnettu.

On osoittautunut edulliseksi suorittaa käsittely Tween® -nimisellä aineella tai vastaavasti detergentillä yli 10 ja 8 105076 alle 25 massa-%:n konsentraatiossa 1-30 minuutin kuluessa, etenkin pH-arvossa 5,5-8, 0-56 °C:n lämpötilassa, edullisesti 15 - 37 °C:ssa ja mahdollisesti 7-20 mS:n sähkönjohtokyvyssä .

5

Eräs edullinen menetelmä keksinnön mukaisten inaktivoitujen verituotteiden valmistamiseksi on sellainen, että ennen vesipitoisella detergenttiliuoksella suoritettavaa käsittelyä tai sen jälkeen verituote käsitellään kuumalla höyryllä, jolloin 10 verituote säädetään kiinteässä tilassa veden, metanolin tai etanolin pitoisuuteen, joka on yli 0,05 (5 massa) ja alle 0,70 (70 massa-%), etenkin alle 0,40 (40 massa- %), ja käsitellään suljetussa astiassa 50 - 121 °C:n lämpötilassa .

15

Keksintö koskee myös menetelmää inaktivointikäsittelyn virus-inaktivointikapasiteetin määrittämiseksi, joka käsittely käsittää vähintään yhden inaktivointimenetelmän, siten, että testiviruksen avulla määritetään muuntokerroin, joka menetelmä 20 on tunnettu siitä, että testivirusta lisätään toistuvasti vähintään yhden inaktivointimenetelmän aikana ja tämän vähintään yhden inaktivointimenetelmän yksittäiset muuntokertoimet lasketaan mahdollisesti yhteen muiden inaktivointimenetelmien muuntokertoimien kanssa kokonaisvirusmuuntokertoimeksi.

25 Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen tunnus-merkkiosassa.

30 Keksintöä selitetään lähemmin seuraavien esimerkkien avulla.

»

Esimerkki .1

Ihmisen plasmasta valmistettiin hyytymätekijää VIII sisältävä 35 kryopresipitaattiliuos menetelmän mukaisesti, joka on esitetty AT-patenttijulkaisussa 391 808. Liuokseen lisättiin ainetta *. Tween® 80 niin, että tämän konsentraatioksi tuli 8 %. Liuok seen lisättiin tämän jälkeen 7 ml HIV-l-virussuspensiota 2 9 105076 minuutin välein. Inkuboitiin kaikkiaan 14 minuutin ajan 25 °C:ssa, sitten virus sentrifugoitiin ja titteri määritettiin. Ilman Tween® -lisäystä olevan erän kontrolliarvo oli 105'1. Virustitteri oli Tween® -käsittelyn jälkeen alle osoitusarvon 5 ΙΟ0,5, ja voitiin arvioida numerolla 0 käänteistranskriptaasin negatiivisen testin perusteella. Tämä tuottaa virusmuuntoker-toimeksi 7 x 5,1 = 35,7.

Tween®:stä vapautettuun liuokseen lisättiin jälleen HIV-1-10 virussuspensiota, lyofilisoitiin ja kuumennettiin EP-hakemus-julkaisun menetelmän mukaisesti 8 %:n vesipitoisuuteen 10 tunnin kuluessa 60 °C:ssa. Virustitteri aleni arvosta 106·2 arvoon 0.

15 Molemmat inaktivointivaiheet tuottivat siten kokonaisvirus- muuntokertoimeksi 41,9. Siten on osoitettu, että tekijä VIII--valmiste, joka alistetaan yllä esitetyissä olosuhteissa deter-gentti- ja lämpökäsittelyyn, vastaa kokonaisvirusmuuntoker-rointa 41,9, ja sitä voidaan pitää virusturvallisena.

20

Tekijän VIII jäämäaktiivisuuden määritys suoritettiin trombo-plastiinin muodostumistestillä (2-vaiheinen testi). Tekijä VIII-jäämäaktiivisuus laskettiin muodostamalla osamäärä kuumennetun näytteen tekijä VIII-aktiivisuudesta ja lähtöaineen 25 tekijä VIII-aktiivisuudesta ennen Tween® -käsittelyä ja se oli 80 %.

Esimerkki 2 30 Hyytymätekijöitä II, IX ja X sisältävä valmiste (partiaalinen - . (osittainen) protrombiinikompleksi, PPK) valmistettiin jul kaisussa Vox. Sang. 33, 37 - 50 (1977) esitetyn menetelmän mukaisesti ihmisen plasmasta adsorboimalla tuotenimellä DEAE--Sephadex® markkinoitavaan aineeseen, pesemällä ioninvaihdin ja 35 eluoimalla kompleksi.

’ PPK:hon lisättiin 22 %:sessa Tween® 80-pitoisessa liuoksessa - HIV-l-virusta ja inkuboitiin 25 °C:ssa. Virussuspensiota lisät- 10 105076 tiin 15 kertaa 20 sekunnin välein. Ilman Tweenia valmistetun kontrollin virustitteri oli 105,7. Loppuvirustitteri oli Tween-käsittelyn jälkeen osoitusrajan (10°·5) alapuolella. Tästä saadaan kokonaisvirusmuuntokertoimeksi vähintään 15 x 5,2 = 78.

5 PPK-valmiste, joka alistetaan yllä esitettyyn Tween® -käsittelyyn, vastaa siten kokonaisvirusmuuntokerrointa 78 ja sitä pidetään virusturvallisena.

Hyytymätekijöiden aktiivisuus määritettiin tekijän IX esimer-10 kissä lisäämällä testattava näyte tekijä IX-puutosplasmaan ja määrittämällä aktivoitu partiaalinen tromboplastiiniaika (1-vaiheinen testi) ja käsittely Tween®-nimisellä aineella vaikutti siihen tuskin ollenkaan. Käsitellyn näytteen aktiivisuuden suhde käsittelemättömän PPK:n tekijän IX aktiivisuu-15 teen oli lähes 100 %.

Esimerkki 3

Esimerkissä 2 esitettyä PPK-valmistetta inkuboitiin 12 %:sen 20 dimetyylioktyyliamiini-N-oksidin kanssa mallivirusten (Sind- bis- tai vastaavasti vesikulaarinen stomatitis-virus = VSV) läsnäollessa 25 °C:ssa. Virussuspensiota lisättiin 10 kertaa 5 minuutin välein. Detergenttikäsittelyn jälkeen virustitteri oli kulloinkin osoitusrajan 101·5 alapuolella. Ilman detergent-25 tiä saadut kontrolliarvot olivat 106·4 ja vastaavasti 106,1.

Tästä saadaan kokonaisvirusmuuntokertoimeksi vähintään 10 x 4,9 = 49 ja vastaavasti 10 x 4,6 = 46.

Detergenttikäsittely vaikutti tuskin ollenkaan biologiseen 30 aktiivisuuteen ja tämä oli lähes 100 %.

Esimerkki 4

Plasma fraktioitiin Cohnin mukaisesti ja fibrinpgeeniä sisäl-35 tävään COHN I-fraktioon lisättiin malliviruksia (Sindbis tai vastaavasti VSV). Lyofilisoinnin jälkeen konsentraattia, jonka vesipitoisuus oli 8 %, kuumennettiin EP-hakemusjulkaisun 0 159 311 mukaisesti 10 tunnin ajan 60 °C:ssa ja sitten u 105076 3 tunnin ajan 80 °C:ssa. Virustitteri aleni arvosta 105·5 ja vastaavasti 10€ lyofilisoinnilla arvoon 104·9 ja vastaavasti ΙΟ5·5 ja edelleen käsiteltäessä 60 °C:ssa osoitusarvon 100·5 alapuolelle.

5 80 °C:ssa suoritetun toisen käsittelyvaiheen inaktivointika-pasiteetti määritettiin rinnakkaiserässä: Lyofilisoinnin ansiosta virustitteri aleni jälleen arvosta 105,5 ja vastaavasti ΙΟ6·0 arvoon 104<9 ja vastaavasti 105·5 ja edelleen käsiteltäessä 10 80 °C:ssa osoitusarvon alapuolelle.

Muuntokerroin lasketaan kaksikertaisesta alenemisesta 5 ja vastaavasti 5,5 log-asteella miinus 0,6 ja vastaavasti 0,5 logastetta, koska fibrinogeenivalmiste alistettiin kaksivai-15 heisen käsittelymenetelmän aikana ainoastaan yhteen ainoaan lyfilisointiin. Muuntotekijät olivat siis 9,4 ja vastaavasti 10,5.

Jauhe liuotettiin tämän jälkeen 5 V:seen oktyyliglukosidipi-20 toiseen väliaineeseen ja siihen lisättiin 5 minuutin välein 9 kertaa Sindbisiä tai vastaavasti VSV:tä. Inkubaation jälkeen (kaikkiaan 45 minuuttia 25 °C:ssa) määritettiin virustitteri. Käsittely detergentillä vähensi virustitteriä arvoon, joka oli osoitusrajan 100/S alapuolella. Ilman detergenttilisäystä suori -. 25 tettujen erien kontrolliarvot olivat 106·9 ja vastaavasti 106 0 .

Tästä saadaan virusmuuntokertoimeksi vähintään 57,6 ja vastaavasti 49,5. Kokonaisvirustitterimuuntokertoimet olivat siis ainakin 67,0 ja vastaavasti 60,0. Fibrinogeenivalmiste, joka alistetaan yllä esitetyissä olosuhteissa lämpö- ja detergent-30 tikäsittelyyn, vastaa vähintään kokonaisvirusmuuntokerrointa - 60,0 ja sitä on pidettävä virusturvallisena.

Fibrinogeenin biologinen aktiivisuus määritettiin oktyyliglu-kosidi-pitoisen fraktion 8 %:sella etyylialkoholilla saoste-35 tussa sakassa fibriini-a-ketjujen silloitustestillä (T. See- lich, H. Redl "Theoretische Grundlagen des Fibrinklebers" julkaisussa K. Schimpf "Fibrinogen, Fibrin und Fibrinkleber", F.

K. Schattauer Verlag, Stuttgart-New York, 199 - 208, 1980) ja 12 105076 trombelastografiällä (H. Hartert julkaisussa "Thrombosis and Bleeding Disorders", (N.U. Bang et ai., eds.) Georg Thieme Verlag Stuttgart, Acad. Press New York, London, 70 - 76, 1971) kulloinkin lisäämällä hyytymätekijää XIII.

5 Käsitellyn fibrinogeenin aktiivisuus suhteessa COHN I-fraktion biologiseen aktiivisuuteen, oli 87 % silloituksessa mitattuna ja 56 % trombelastogrammissa mitattuna.

10 Esimerkki 5

Valittu plasma fraktioitiin Cohnin mukaisesti. COHN III-frak-tioon, joka sisälsi anti-tetanus-toksoidi-gamma-globuliinia, lisättiin 15 %: sen Triton® X-100:n läsnäollessa HIV-1- tai 15 vastaavasti Sindbis-virusta ja inkuboitiin 25 °C:ssa. Virusta lisättiin 30 kertaa minuutin välein. Kaikkiaan 30 minuuttia kestäneen inkubaation jälkeen virustitteri oli osoitusrajan 102'5 ja vastaavasti 101,5 alapuolella. Ilman detergenttilisäystä muodostetun erän kontrolliarvo oli 10s'7 ja vastaavasti 107-5.

20 Tästä saadaan kokonaisvirusmuuntokertoimeksi vähintään 30 x 3,2 = 96 ja vastaavasti 30 x 6 = 180. Gammaglobuliini-valmiste, joka alistetaan yllä esitettyyn detergenttikäsittelyyn, vastaa vähintään kokonaisvirusmuuntokerrointa 96 ja sitä pidetään virusturvallisena.

25

Biologinen aktiivisuus määritettiin aviditeetti-testillä. Tätä varten tetanus-toksoidi adsorboitiin mikrotiitterilevylle, peitettiin gelatiinilla ja pestiin. Tämän jälkeen testattava gamma-globuliini levitettiin useina laimennuksina preparoidul-30 le mikrotiitterilevylle ja adsorboitumaton immunoglobuliini pestiin pois. Tetanus-toksoidiin sitoutunut gamma-globuliini määritettiin adsorboimalla antihuman-IgG-peroksidaasi-konju-gaatti immunoglobuliinin Fc-osaan ja edelleen peroksidaasin värireaktiolla diaminobentsidiinin ja H202:n kanssa ja tämän 35 jälkeen ekstinktiomittauksella.

: Detergenttikäsittely vaikutti tuskin lainkaan tetanustoksoidin gamma-globuliinin aviditeettiin. Ennen käsittelyä ja käsitte- 13 105076 lyn jälkeen ei voitu havaita mitään merkittäviä aviditeetti-eroja.

Esimerkki 6 5 0,95 mitään liuosta, joka sisälsi Ci-esteraasi-inhibiittoria (valmistettu julkaisun Vogelaar E. F. et ai. (1973) Vox Sang. 26, 118 - 127 "Contributions to the Optimal Use of Human Blood") lisättiin 20 mg Triton® X-100:aa ja inkuboitiin 25 10 °C:ssa. Virusinaktivointikapasiteetin määrittämiseksi lisättiin VSVttä (10 μΐ) toistuvasti 5 minuutin välein. 5-kertaisen vi-ruslisäyksen jälkeen virustitteri oli osoitusrajan 100·5 alapuolella. Ilman detergenttilisäystä valmistetun erän kontrolliar-vo oli 107,5. Tästä saadaan virusmuuntokertoimeksi vähintään 5 15 X 7 = 3,5.

Ci-esteraasi-inhibiittori adsorboitiin aineeseen DEAE-Sephadex® ja sitä pestiin 8,80 g/l:n NaCl-liuoksella niin kauan, kunnes se oli detergentistä vapaa. Inhibiittori desorboitiin 59 g/l:n 20 NaCl-liuoksella ja sitten sitä dialysoitiin puskuria vastaan, joka sisälsi 1,0 g/1 natriumsitraattia ja 0,4 g/1 NaCl:ää (pH 6,8). Tähän liuokseen lisättiin uudelleen VSV-virusta ennen, kuin se lyofilisoitiin. Lyfilisoinnin ja tämän jälkeen suoritetun lämpökäsittelyn aikana virustitteri aleni 25 arvosta 107,2 osoitusarvon 100,5 alapuolelle. Virusmuuntokerroin oli siten vähintään 6,7.

Detergentti- ja lämpökäsittelyn virusmuuntokertoimista saadaan kokonaisvirusmuuntokertoimeksi vähintään 41,7. VSV-virusten 30 inaktivointi vaikutti tuskin ollenkaan inhibiittorin biologi-- seen aktiivisuuteen ja se oli lähes 100 %.

Claims (2)

105076 Patenttivaatimus Menetelmä sellaisen inaktivointikäsittelyn virusinaktivointi-kapasiteetin määrittämiseksi, joka käsittää vähintään yhden 5 inaktivointimenetelmän, jossa muuntokerroin määritetään testiviruksen avulla, tunnettu siitä, että testivirus lisätään toistuvasti vähintään yhden inaktivointimenetelmän aikana ja vähintään yhden inaktivointimenetelmän yksittäiset muuntokertoimet lasketaan mahdollisesti yhteen muiden 10 inaktivointimenetelmien muuntokertoimien kanssa kokonaisvirusmuuntokertoimeksi. 15

1. Förfarande för bestämning av virusinaktiveringskapaciteten hos en inaktiveringsbehandling som omfattar minst ett inakti-veringsförfarande, vid vilket reduktionsfaktorn bestäms med hjälp av ett testvirus, känneteckna t av att test-20 viruset tillsättes upprepade gänger under minst ett inakti- veringsförfarande och de enskilda reduktionsfaktorerna hos det minst ena inaktiveringsförfarandet eventullt tillsammans med reduktionsfaktorerna hos ytterligare inaktiveringsförfaranden adderas tili en sammanräknad virusreduktionsfaktor. 25