ES2987392T3 - Lípidos para la liberación de principios activos de nanopartículas lípidas - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan compuestos que tienen la siguiente estructura: (I) o una sal, tautómero o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R1, R2, R3, R4, R5, L1, L2, L3, G1, G2 y G3 son como se definen en el presente documento. También se proporcionan el uso de los compuestos como un componente de formulaciones de nanopartículas lipídicas para la administración de un agente terapéutico, composiciones que comprenden los compuestos y métodos para su uso y preparación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Lípidos para la liberación de principios activos de nanopartículas lípidas
Antecedentes
Campo Técnico
La presente divulgación se refiere generalmente a nuevos lípidos catiónicos que se pueden usar en combinación con otros componentes lipídicos, tales como lípidos neutros, colesterol y lípidos conjugados con polímeros, para formar nanopartículas lipídicas con oligonucleótidos, para facilitar la administración intracelular de ácidos nucleicos terapéuticos (p. ej.,oligonudeótidos,ARN mensajero) tantoin vitrocomoin vivo.
Descripción de la técnica relacionada
Hay muchos desafíos asociados con la administración de ácidos nucleicos para afectar una respuesta deseada en un sistema biológico. Las terapias basadas en ácidos nucleicos tienen un enorme potencial, pero sigue existiendo la necesidad de una administración más eficaz de ácidos nucleicos a los sitios apropiados dentro de una célula u organismo para poder aprovechar este potencial. Los ácidos nucleicos terapéuticos incluyen, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), oligonucleótidos antisentido, ribozimas, ADNzimas, plásmidos, ácidos nucleicos inmunoestimulantes, antagomir, antimir, imitador, supermir y aptámeros. Algunos ácidos nucleicos, tales como ARNm o plásmidos, pueden usarse para efectuar la expresión de productos celulares específicos, lo que sería útil en el tratamiento de, por ejemplo, enfermedades relacionadas con una deficiencia de una proteína o enzima. Las aplicaciones terapéuticas de la administración de nucleótidos traducibles son extremadamente amplias, ya que se pueden sintetizar construcciones para producir cualquier secuencia de proteínas elegida, ya sea autóctona o no del sistema. Los productos de expresión del ácido nucleico pueden aumentar los niveles existentes de proteína, reemplazar versiones faltantes o no funcionales de una proteína, o introducir nueva proteína y funcionalidad asociada en una célula u organismo.
Algunos ácidos nucleicos, tales como inhibidores de miARN, pueden usarse para efectuar la expresión de productos celulares específicos que están regulados por miARN, lo que sería útil en el tratamiento de, por ejemplo, enfermedades relacionadas con la deficiencia de proteínas o enzimas. Las aplicaciones terapéuticas de la inhibición de miARN son extremadamente amplias ya que se pueden sintetizar construcciones para inhibir uno o más miARN que a su vez regularían la expresión de productos de ARNm. La inhibición de miARN endógeno puede aumentar su expresión de proteína endógena objetivo y restaurar la función adecuada en una célula u organismo como un medio para tratar enfermedades asociadas a un miARN específico o un grupo de miARN.
Otros ácidos nucleicos pueden regular negativamente los niveles intracelulares de ARNm específico y, como resultado, regular negativamente la síntesis de las proteínas correspondientes mediante procesos como la interferencia de ARN (ARNi) o la unión complementaria de a Rn antisentido. Las aplicaciones terapéuticas de oligonucleótidos antisentido y ARNi también son extremadamente amplias, ya que las construcciones de oligonucleótidos se pueden sintetizar con cualquier secuencia de nucleótidos dirigida contra un ARNm diana. Los objetivos pueden incluir ARNm de células normales, ARNm asociados con estados patológicos, como el cáncer, y ARNm de agentes infecciosos, como virus. Hasta la fecha, las construcciones de oligonucleótidos antisentido han demostrado la capacidad de regular negativamente específicamente las proteínas diana mediante la degradación del ARNm afín en modelos tantoin vitrocomoin vivo.Además, actualmente se están evaluando construcciones de oligonucleótidos antisentido en estudios clínicos.
Sin embargo, actualmente existen dos problemas a los que se enfrenta el uso de oligonucleótidos en contextos terapéuticos. En primer lugar, los ARN libres son susceptibles a la digestión con nucleasas en el plasma. En segundo lugar, los ARN libres tienen una capacidad limitada para acceder al compartimento intracelular donde reside la maquinaria de traducción relevante. Nanopartículas lipídicas formadas a partir de lípidos catiónicos con otros componentes lipídicos, como lípidos neutros, colesterol, PEG, lípidos pegilados y oligonucleótidos han sido utilizados para bloquear la degradación de los ARN en plasma y facilitar la absorción celular de los oligonucleótidos. WO2018/078053 describe lípidos catiónicos que difieren de los de la divulgación en ausencia de un sustituyente amino unido a la parte ácida de la amida.
Sigue existiendo la necesidad de lípidos catiónicos y nanopartículas de lípidos mejorados para la administración de oligonucleótidos. Preferiblemente, estas nanopartículas lipídicas proporcionarían proporciones óptimas de fármaco:lípido, protegerían el ácido nucleico de la degradación y eliminación en suero, ser adecuado para la administración sistémica o local y proporcionar la administración intracelular del ácido nucleico. Además, estas partículas de lípidos y ácidos nucleicos deben ser bien toleradas y proporcionar un índice terapéutico adecuado, de modo que el tratamiento del paciente con una dosis eficaz del ácido nucleico no esté asociado con una toxicidad y/o riesgos inaceptables para el paciente. La presente divulgación proporciona estas y ventajas relacionadas.
Descripción breve
En resumen, la presente divulgación proporciona compuestos lipídicos, incluidos estereoisómeros, sales farmacéuticamente aceptables o tautómeros de los mismos, que pueden usarse solos o en combinación con otros componentes lipídicos tales como lípidos neutros, lípidos cargados, esteroides (incluidos, por ejemplo, todos los esteroles) y/o sus análogos, y/o lípidos conjugados con polímeros para formar nanopartículas lipídicas para la administración de agentes terapéuticos. En algunos casos, las nanopartículas lipídicas se utilizan para administrar ácidos nucleicos como ARN antisentido y/o mensajero. También se proporcionan métodos para el uso de dichas nanopartículas lipídicas para el tratamiento de diversas enfermedades o afecciones, tales como las causadas por entidades infecciosas y/o insuficiencia de una proteína.
En una realización, se proporcionan compuestos que tienen la siguiente estructura (I):
o una sal, tautómero o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que R1, R2, R3, R4, R5, L1, L2, L3, G1, G2 y G3 son como se definen en el presente documento.
También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los compuestos anteriores de estructura (I) y un agente terapéutico. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden además uno o más componentes seleccionados entre lípidos neutros, lípidos cargados, esteroides y lípidos conjugados con polímeros. Tales composiciones son útiles para la formación de nanopartículas lipídicas para la administración del agente terapéutico.
En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para administrar un agente terapéutico a un paciente que lo necesita, comprendiendo el método preparar o proporcionar una composición de nanopartículas lipídicas que comprende el compuesto de estructura (I) y un agente terapéutico y entregar o administrar la composición al paciente.
Estos y otros aspectos de la divulgación serán evidentes haciendo referencia a la siguiente descripción detallada.
Descripcion detallada
En la siguiente descripción, se establecen ciertos detalles específicos para proporcionar una comprensión profunda de diversas realizaciones de la divulgación. Sin embargo, un experto en la técnica entenderá que la divulgación se puede practicar sin estos detalles.
La presente divulgación se basa, en parte, en el descubrimiento de nuevos (amino) lípidos catiónicos que proporcionan ventajas cuando se usan en nanopartículas lipídicas para la administración in vivo de un agente activo o terapéutico, como un ácido nucleico, en una célula de un mamífero. En particular, las realizaciones de la presente divulgación proporcionan composiciones de nanopartículas de ácido nucleico-lípido que comprenden uno o más de los nuevos lípidos catiónicos descritos en el presente documento que proporcionan una mayor actividad del ácido nucleico y una tolerabilidad mejorada de las composicionesin vivo,lo que da como resultado un aumento significativo en el índice terapéutico en comparación con las composiciones de nanopartículas de lípidos y ácido nucleico descritas anteriormente. En otras realizaciones, los lípidos divulgados y las nanopartículas lipídicas que los comprenden tienen mayor seguridad y/o tolerabilidad cuando se usan para la administración de agentes activos, tales como ácidos nucleicos.
En realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona nuevos lípidos catiónicos que permiten la formulación de composiciones mejoradas para la administraciónin vitroein vivode ARNm y/u otros oligonucleótidos. En algunas realizaciones, estas composiciones mejoradas de nanopartículas lipídicas son útiles para la expresión de proteínas codificadas por ARNm. En otras realizaciones, estas composiciones mejoradas de nanopartículas lipídicas son útiles para la regulación positiva de la expresión de proteínas endógenas mediante la administración de inhibidores de miARN dirigidos a un miARN específico o un grupo de miARN que regulan un ARNm objetivo o varios ARNm. En otras realizaciones, estas composiciones mejoradas de nanopartículas lipídicas son útiles para regular negativamente (por ejemplo, silenciar) los niveles de proteína y/o los niveles de ARNm de genes objetivo. En algunas otras realizaciones, las nanopartículas lipídicas también son útiles para la administración de ARNm y plásmidos para la expresión de transgenes. Aún en otras realizaciones, las composiciones de nanopartículas lipídicas son útiles para inducir un efecto farmacológico resultante de la expresión de una proteína, por ejemplo, una mayor producción de glóbulos rojos mediante la administración de un ARNm de eritropoyetina adecuado, o protección contra la infección mediante la administración de un ARNm que codifica para un antígeno adecuado o anticuerpo.
Las nanopartículas lipídicas y las composiciones de las realizaciones de la presente divulgación se pueden usar para una variedad de propósitos, incluida la administración de agentes terapéuticos encapsulados o asociados (por ejemplo, formando complejos), tales como ácidos nucleicos a las células, tantoin vitrocomoin vivo.Por consiguiente, las realizaciones de la presente divulgación proporcionan métodos de tratar o prevenir enfermedades o trastornos en un sujeto que lo necesita poniendo en contacto al sujeto con una nanopartícula lipídica que encapsula o está asociada con un agente terapéutico adecuado, en donde la nanopartícula lipídica comprende uno o más de los nuevos lípidos catiónicos descritos en el presente documento.
Como se describe en el presente documento, las realizaciones de las nanopartículas lipídicas de la presente divulgación son particularmente útiles para la administración de ácidos nucleicos, incluidos, por ejemplo, ARNm, oligonucleótidos antisentido, ADN plasmídico, microARN (miARN), inhibidores de miARN (antagomirs/antimirs), mensajeros. ARN complementario de interferencia de ARN (micRNA), ADN, ARN multivalente, ARN sustrato dicer, ADN complementario (cDNA), etc. Por lo tanto, las nanopartículas lipídicas y las composiciones de ciertas realizaciones de la presente divulgación se pueden usar para inducir la expresión de una proteína deseada. tantoin vitrocomoin vivoponiendo en contacto células con una nanopartícula lipídica que comprende uno o más lípidos catiónicos novedosos descritos en el presente documento, en donde la nanopartícula lipídica encapsula o está asociada con un ácido nucleico que se expresa para producir la proteína deseada (por ejemplo, un ARN mensajero o plásmido que codifica la proteína deseada) o inhibir procesos que terminan la expresión de ARNm (p. ej., inhibidores de miARN). Alternativamente, las nanopartículas lipídicas y las composiciones de realizaciones de la presente divulgación se pueden usar para disminuir la expresión de genes y proteínas diana tantoin vitrocomoin vivoponiendo en contacto las células con una nanopartícula lipídica que comprende uno o más lípidos catiónicos novedosos descritos en el presente documento, en donde la nanopartícula lipídica encapsula o está asociada con un ácido nucleico que reduce la expresión del gen objetivo (p. ej., un oligonucleótido antisentido o pequeño ARN de interferencia (ARNip)). Las nanopartículas lipídicas y las composiciones de las realizaciones de la presente divulgación también se pueden usar para la administración conjunta de diferentes ácidos nucleicos (por ejemplo, ARNm y ADN plasmídico) por separado o en combinación, de modo que pueda ser útil para proporcionar un efecto que requiera la colocalización de diferentes ácidos nucleicos (por ejemplo, ARNm que codifica una enzima modificadora de genes adecuada y segmento(s) de ADN para incorporación al genoma anfitrión).
Los ácidos nucleicos para uso con realizaciones de esta divulgación se pueden preparar según cualquier técnica disponible. Para el ARNm, la principal metodología de preparación es, entre otras, la síntesis enzimática (también denominada transcripciónin vitro),que actualmente representa el método más eficaz para producir ARNm de secuencia larga específica. La transcripciónin vitrodescribe un proceso de síntesis dirigida por plantilla de moléculas de ARN a partir de una plantilla de<a>D<n>diseñada, compuesta por una secuencia promotora de bacteriófago aguas arriba (p. ej., que incluye, entre otras, la del colifago T7, T3 y SP6) unida a una secuencia aguas abajo que codifica el gen de interés. El ADN plantilla se puede preparar para la transcripciónin vitroa partir de varias fuentes con técnicas apropiadas que son bien conocidas en la técnica, incluidas, entre otras, ADN plasmídico y amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (véase Linpinsel, J.L y Conn, G.L.,General protocols for preparation of plasmid DNA témplatey Bowman, J.C., Azizi, B., Lenz, T.K., Ray, P. y Williams, L.D enRNAin vitro transcription and RNA purification by denaturing PAGE in Recombinant and in vitro RNA synthesis methodsv. 941 Conn GL (ed), Nueva York, N.Y. Humana Press, 2012).
La transcripción del ARN se producein vitroutilizando la plantilla de ADN linealizado en presencia de la correspondiente ARN polimerasa y adenosina, guanosina, uridina y citidina ribonucleósidos trifosfatos (rNTP) en condiciones que apoyan la actividad de la polimerasa y al mismo tiempo minimizan la degradación potencial de las transcripciones de ARNm resultantes. La transcripciónin vitrose puede realizar utilizando una variedad de kits disponibles comercialmente que incluyen, entre otros,RiboMax Large Scale RNA Production System(Promega),MegaScript Transcription kits(Life Technologies), así como reactivos disponibles comercialmente que incluyen ARN polimerasas y rNTP. La metodología para la transcripciónin vitrode ARNm es bien conocida en la técnica. (ver, por ejemplo, Losick, R., 1972,In Vitro Transcription,Ann Rev Biochem v.41 409-46; Kamakaka, R. T. y Kraus, W. L. 2001.In Vitro Transcription. Current Protocols in Cell Biology.2:11.6:11.6. 1-11.6.17; Beckert, B. y Masquida, B., (2010)Synthesis of RNA by In Vitro Transcription in RNA in Methods in Molecular Biologyv. 703 (Neilson, H. Ed), Nueva York, N.Y. Humana Press, 2010; Brunelle, J.L. y Green, R., 2013,Chapter five: In vitro transcription from plasmid or PCR-amplified DNA, Methods in Enzymologyv. 530, 101-1] 4).
Luego, el ARNm transcritoin vitrodeseado se purifica a partir de los componentes no deseados de la transcripción o reacciones asociadas (incluidos rNTP no incorporados, enzimas proteicas, sales, oligos de ARN cortos, etc.). Las técnicas para el aislamiento de los transcritos de ARNm son bien conocidas en la técnica. Los procedimientos bien conocidos incluyen la extracción con fenol/cloroformo o la precipitación con alcohol (etanol, isopropanol) en presencia de cationes monovalentes o cloruro de litio. Ejemplos adicionales, no limitantes, de procedimientos de purificación que pueden usarse incluyen cromatografía de exclusión molecular (Lukaysky, P.J. y Puglisi, J.D., 2004,Large-scalepreparation and purification of polyacrylamide-free RNA oligonucleótidos, RNAv.10, 889-893), cromatografía de afinidad basada en sílice y electroforesis en gel de poliacrilamida (Bowman, J.C., Azizi, B., Lenz, T.K., Ray, P. y Williams, L.D. enRNA in vitro transcription and RNA purification by denaturing PAGE in Recombinant and in vitro RNA synthesis methodsv. 941 Conn G.L. (ed), Nueva York, N.Y. Humana Press, 2012). La purificación se puede realizar utilizando una variedad de kits disponibles comercialmente que incluyen, entre otros,SV Total Isolation System(Promega) yIn Vitro Transcription Cleanup and Concentration Kit(Norgen Biotek).
Además, si bien la transcripción inversa puede producir grandes cantidades de ARNm, los productos pueden contener una serie de impurezas de ARN aberrantes asociadas con actividad polimerasa no deseada que puede ser necesaria eliminar de la preparación de ARNm de longitud completa. Estos incluyen ARN cortos que resultan de un inicio abortivo de la transcripción, así como ARN bicatenario (ARNds) generado por la actividad de la ARN polimerasa dependiente de ARN, transcripción preparada con ARN a partir de plantillas de ARN y extensión 3' autocomplementaria. Se ha demostrado que estos contaminantes con estructuras de ARNbc pueden provocar una actividad inmunoestimuladora no deseada mediante la interacción con varios sensores inmunes innatos en células eucariotas que funcionan para reconocer estructuras específicas de ácidos nucleicos e inducir potentes respuestas inmunes. Esto, a su vez, puede reducir drásticamente la traducción del ARNm, ya que la síntesis de proteínas se reduce durante la respuesta inmune celular innata. Por lo tanto, se han desarrollado y se conocen en la técnica técnicas adicionales para eliminar estos contaminantes de ARNbc que incluyen, entre otras, limitado a la purificación por HPLC escalable (ver, por ejemplo, Kariko, K., Muramatsu, H., Ludwig, J. y Weissman, D., 2011,Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA,Nucl Acid Res, v. 39 e142 Weissman, D., Pardi, N., Muramatsu, H. y Kariko, K.,Purification of in vitro transcribed long RNA in Synthetic Messengere RNAyCell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biologyv.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013). Se ha informado que el ARNm purificado por HPLC se traduce a niveles mucho mayores, particularmente en células primarias ein vivo.
En la técnica se ha descrito una variedad significativa de modificaciones que se utilizan para alterar propiedades específicas del ARNm transcritoin vitroy mejorar su utilidad. Estos incluyen, entre otros, modificaciones en los extremos 5' y 3' del ARNm. El ARNm eucariota endógeno normalmente contiene una estructura de caperuza en el extremo 5' de una molécula madura que desempeña un papel importante en la mediación de la unión de la proteína de unión a la caperuza del ARNm (CBP), que a su vez es responsable de mejorar la estabilidad y la eficiencia del ARNm en la célula de la traducción del ARNm. Por lo tanto, los niveles más altos de expresión de proteínas se logran con transcripciones de ARNm encapsulado. La caperuza 5' contiene un enlace trifosfato 5'-5' entre el nucleótido más 5' y el nucleótido de guanina. El nucleótido de guanina conjugado está metilado en la posición N7. Las modificaciones adicionales incluyen la metilación del último y penúltimo 5'-nucleótidos en el grupo 2'-hidroxilo.
Se pueden utilizar múltiples estructuras de caperuza distintas para generar la caperuza 5' de ARNm sintético transcritoin vitro.La caperuza 5' de ARNm sintético se puede realizar cotranscripcionalmente con análogos de protección química (es decir, protección durante la transcripciónin vitro).Por ejemplo, la caperuzaAnti-Reverse Cap Analog(ARCA) contiene un enlace 5'-5'-trifosfato guanina-guanina donde una guanina contiene un grupo metilo N7 así como un grupo 3'-O-metilo. Sin embargo, hasta el 20% de las transcripciones permanecen sin encapsular durante este proceso cotranscripcional y el análogo de caperuza sintética no es idéntico a la estructura de caperuza 5' de un ARNm celular auténtico, lo que potencialmente reduce la traducibilidad y la estabilidad celular. Alternativamente, las moléculas de ARNm sintético también pueden bloquearse enzimáticamente de forma postranscripcional. Estos pueden generar una estructura de caperuza 5' más auténtica que imita más de cerca, ya sea estructural o funcionalmente, la caperuza 5' endógena que tiene una unión mejorada de las proteínas de unión a la caperuza, una vida media aumentada y una susceptibilidad reducida a las endonucleasas 5' y/o despuntado reducido de 5'. Se han desarrollado numerosos análogos sintéticos de la caperuza 5' y se sabe en la técnica que mejoran la estabilidad y traducibilidad del ARNm (véase, por ejemplo, Grudzien-Nogalska, E., Kowalska, J., Su, W., Kuhn, A.N., Slepenkov, S.V., Darynkiewicz, E., Sahin, U., Jemielity, J. y Rhoads, R.E.,Synthetic mRNAs withy superior translation and stability properties in Synthetic Messenger RNAyCell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biologyv.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013).
En el extremo 3', normalmente se añade una larga cadena de nucleótidos de adenina (cadena poli-A) a las moléculas de ARNm durante el procesamiento del ARN. Inmediatamente después de la transcripción, el extremo 3' de la transcripción se escinde para liberar un hidroxilo 3' al que la poli-A polimerasa añade una cadena de nucleótidos de adenina al ARN en un proceso llamado poliadenilación. Se ha demostrado ampliamente que la cadena poli-A mejora tanto la eficiencia traduccional como la estabilidad del ARNm (véase Bernstein, P. y Ross, J., 1989,Poly (A), poly (A) binding protein and the regulator of mRNA stability,Trends Bio Sci v. 14373-377; Guhaniyogi, J. y Brewer, G., 2001,Regulation of mRNA stability in mammalian cells,Gene, v. 265, 11-23; 2002,The poly (A) tail of mRNAs: Bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria,Cell, v.111, 611-613).
La cadena poli (A) del ARNm transcrito in vitro se puede lograr usando varios enfoques que incluyen, entre otros, la clonación de un tracto poli (T) en la plantilla de ADN o mediante adición postranscripcional usando poli (A) polimerasa. El primer caso permite la transcripciónin vitrode ARNm con cadenas poli (A) de longitud definida, dependiendo del tamaño del tracto poli (T), pero requiere manipulación adicional de la plantilla. El último caso implica la adición enzimática de una cadena poli (A) al ARNm transcrito in vitro usando poli (A) polimerasa que cataliza la incorporación de residuos de adenina en los extremos 3' del ARN, sin requerir manipulación adicional del molde de ADN, pero da como resultado ARNm con cadenas poli(A) de longitud heterogénea. La caperuza 5' y la cadena de poli (A) 3' se pueden realizar usando una variedad de kits disponibles comercialmente que incluyen, entre otros, el Poly (A) Polymerase Tailing kit (EpiCenter), mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit y Poly (A) Tailing kit (Life Technologies), así como reactivos disponibles comercialmente, varios encapsulamientos ARCA, poli (A) polimerasa, etc.
Además de la caperuza 5' y la poliadenilación 3', se ha informado que otras modificaciones de los transcritosin vitroproporcionan beneficios relacionados con la eficiencia de la traducción y la estabilidad. Es bien conocido en la técnica que el ADN y el ARN patógenos pueden ser reconocidos por una variedad de sensores dentro de eucariotas y desencadenar potentes respuestas inmunes innatas. Se ha demostrado que la capacidad de discriminar entre ADN y ARN patógenos y propios se basa, al menos en parte, en modificaciones estructurales y de nucleósidos, ya que la mayoría de los ácidos nucleicos de fuentes naturales contienen nucleósidos modificados. Por el contrario, el ARN sintetizadoin vitrocarece de estas modificaciones, lo que lo convierte en inmunoestimulante, lo que a su vez puede inhibir la traducción eficaz del ARNm como se describió anteriormente. La introducción de nucleósidos modificados en ARNm transcritoin vitrose puede utilizar para evitar el reconocimiento y la activación de sensores de ARN, mitigando así esta actividad inmunoestimuladora no deseada y mejorando la capacidad de traducción (véase, por ejemplo, Kariko, K. And Weissman, D. 2007,Naturally occuring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development,Curr Opin Drug Discov Devel, v.10 523-532; Pardi, N., Muramatsu, H., Weissman, D., Kariko, K.,In vitro transcription of long RNA containing modified nuclosides in Synthetic Messenger RNAyCell Matabolism Modulation in Molecular Biologyv.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013; Kariko, K., Muramatsu, H., Welsh, F.A., Ludwig, J., Kato, H., Akira, S., Weissman, D., 2008,Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields Superior Nonimmunogenic Vector With Increased Translational Capacity and Biological Stability,Mol Ther v.16, 1833-1840). Los nucleósidos y nucleótidos modificados usados en la síntesis de ARN modificados se pueden preparar, monitorear y utilizar usando métodos y procedimientos generales conocidos en la técnica. Está disponible una gran variedad de modificaciones de nucleósidos que pueden incorporarse solas o en combinación con otros nucleósidos modificados hasta cierto punto en el ARNm transcritoin vitro(véase, por ejemplo, US 2012/0251618). Se ha informado que la síntesisin vitrode ARNm modificado con nucleósidos tiene una capacidad reducida para activar sensores inmunes con una capacidad de traducción mejorada concomitante.
Otros componentes del ARNm que pueden modificarse para proporcionar beneficios en términos de traducibilidad y estabilidad incluyen las regiones no traducidas (UTR) 5' y 3'. Se ha demostrado que la optimización de las UTR (se pueden obtener UTR 5' y 3' favorables a partir de ARN celulares o virales), ya sea ambas o de forma independiente, aumenta la estabilidad del ARNm y la eficiencia traduccional del ARNm transcritoin vitro(véase, por ejemplo, Pardi, N., Muramatsu, H., Weissman, D., Kariko, K.,In vitro transcription of long RNA containing modified nucleosides in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biologyv.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013).
Además del ARNm, para esta divulgación se pueden usar otras cargas útiles de ácidos nucleicos. Para oligonucleótidos, los métodos de preparación incluyen, entre otros, síntesis química y enzimática, escisión química de un precursor más largo, transcripciónin vitrocomo se describió anteriormente, etc. Los métodos de síntesis de nucleótidos de ADN y ARN se usan ampliamente y son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Gait, M. J. (ed.)Oligonucleotide synthesis: a practical approach,Oxford [Oxfordshire], Washington, D.C.: IRL Press, 1984 y Herdewijn, P. (ed.)Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology,v. 288 (Clifton, Nueva Jersey) Totowa, Nueva Jersey: Humana Press, 2005).
Para el ADN plasmídico, la preparación para su uso con realizaciones de esta divulgación utiliza comúnmente, pero no se limita a, expansión y aislamiento del ADN plasmídicoin vitroen un cultivo líquido de bacterias que contiene el plásmido de interés. La presencia de un gen en el plásmido de interés que codifica la resistencia a un antibiótico particular (penicilina, kanamicina, etc.) permite que las bacterias que contienen el plásmido de interés crezcan selectivamente en cultivos que contienen antibióticos. Los métodos para aislar ADN plasmídico se usan ampliamente y son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Heilig, J., Elbing, K. L. y Brent, R., (2001),Large-Scale Preparation of Plasmid DNA, Current Protocols in Molecular Biology,41:11:1.7:1.7.1-1.7.16; Rozkov, A., Larsson, B., Gillstrom, S., Bjornestedt, R. y Schmidt, S. R., (2008),Large-scale production of endotoxin-free plasmids for transient expresión in mammalian cell culture,Biotechnol. Bioeng., 99: 557-566 y US 6,197,553 B1). El aislamiento de plásmidos se puede realizar utilizando una variedad de kits disponibles comercialmente que incluyen, entre otros, los kitsPlasmid Plus(Qiagen),GenJET plasmid MaxiPrep(Thermo) yPureYield MaxiPrep(Promega), así como con reactivos disponibles comercialmente.
Abajo se describen con más detalle varias realizaciones ejemplares de los lípidos catiónicos de la presente divulgación, nanopartículas lipídicas y composiciones que las comprenden, y su uso para administrar activos (por ejemplo, agentes terapéuticos), tales como ácidos nucleicos, para modular la expresión de genes y proteínas.
Tal como se utilizan en este documento, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuyen a menos que se especifique lo contrario.
A menos que el contexto requiera lo contrario, a lo largo de la presente especificación y reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones, tales como "comprende" y "que comprende" deben interpretarse en un sentido abierto e inclusivo, es decir, como "que incluye, pero no limitado a".
La referencia a lo largo de esta especificación a "una realización" o "alguna realización" significa que un rasgo, estructura o característica particular descrita en relación con la realización está incluida en al menos una realización de la presente divulgación. Por lo tanto, las apariciones de las frases "en una realización" o "en alguna realización" en varios lugares a lo largo de esta especificación no necesariamente se refieren todos a la misma realización. Además, las características, estructuras o características particulares se pueden combinar de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Tal como se utiliza en la especificación y las reivindicaciones, la forma singular "un", "una" y "el" incluye referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
La frase "inducir la expresión de una proteína deseada" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para aumentar la expresión de la proteína deseada. Para examinar el alcance de la expresión de proteínas, se puede utilizar una muestra de prueba (p. ej., una muestra de células en cultivo que expresan la proteína deseada) o un modelo de mamífero de prueba (p. ej., un mamífero como un ser humano o un animal), como un roedor (p. ej., ratón) o un modelo de primate no humano (por ejemplo, mono) se pone en contacto con un ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico en combinación con un lípido de la presente divulgación). La expresión de la proteína deseada en la muestra de prueba o en el animal de prueba se compara con la expresión de la proteína deseada en una muestra de control (por ejemplo, una muestra de células en cultivo que expresan la proteína deseada) o un mamífero de control (por ejemplo, un mamífero tal como un modelo humano o animal) tal como un modelo de roedor (por ejemplo, ratón) o primate no humano (por ejemplo, mono) que no entra en contacto con ni se le administra el ácido nucleico. Cuando la proteína deseada está presente en una muestra de control o un mamífero de control, a la expresión de una proteína deseada en una muestra de control o un mamífero de control se le puede asignar un valor de 1.0. En realizaciones particulares, inducir la expresión de una proteína deseada se logra cuando la relación entre la expresión de proteína deseada en la muestra de prueba o el mamífero de prueba y el nivel de expresión de proteína deseada en la muestra de control o el mamífero de control es mayor que 1, por ejemplo, aproximadamente 1.1, 1.5, 2.0, 5.0 o 10.0. Cuando una proteína deseada no está presente en una muestra de control o en un mamífero de control, la inducción de la expresión de una proteína deseada se logra cuando se alcanza cualquier nivel mensurable de la proteína deseada. Cuando una proteína deseada no está presente en una muestra de control o en un mamífero de control, la inducción de la expresión de una proteína deseada se logra cuando se alcanza cualquier nivel mensurable de la proteína deseada. Un experto habitual en la técnica comprenderá los ensayos apropiados para determinar el nivel de expresión de proteínas en una muestra, por ejemplo, transferencias puntuales, transferencias northern, hibridación in situ, ELISA, inmunoprecipitación, función enzimática y ensayos fenotípicos, o ensayos basados en proteínas indicadoras que pueden producir fluorescencia o luminiscencia bajo condiciones apropiadas.
La frase "expresión inhibidora de un gen diana" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para silenciar, reducir o inhibir la expresión de un gen diana. Para examinar el alcance del silenciamiento genético, se utiliza una muestra de prueba (p. ej., una muestra de células en cultivo que expresan el gen diana) o un modelo de mamífero de prueba (p. ej., un mamífero como un ser humano o un animal) como un modelo de roedor (por ejemplo, ratón) o un primate no humano (por ejemplo, mono) se pone en contacto con un ácido nucleico que silencia, reduce o inhibe la expresión del gen diana. La expresión del gen diana en la muestra de prueba o en el animal de prueba se compara con la expresión del gen diana en una muestra de control (por ejemplo, una muestra de células en cultivo que expresan el gen diana) o un mamífero de control (por ejemplo, un mamífero tal como un modelo humano o animal) tal como un modelo de roedor (por ejemplo, ratón) o primate no humano (por ejemplo, mono) que no entra en contacto con ni se le administra el ácido nucleico. A la expresión del gen diana en una muestra de control o en un mamífero de control se le puede asignar un valor del 100%. En realizaciones particulares, el silenciamiento, la inhibición o la reducción de la expresión de un gen diana se logra cuando el nivel de expresión del gen diana en la muestra de prueba o el mamífero de prueba en relación con el nivel de expresión del gen diana en la muestra de control o el mamífero de control es aproximadamente 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% o 0%. En otras palabras, los ácidos nucleicos son capaces de silenciar, reducir o inhibir la expresión de un gen diana en al menos aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%. 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% en una muestra de prueba o un mamífero de prueba en relación con el nivel del objetivo expresión genética en una muestra de control o en un mamífero de control no contactado con o administrado el ácido nucleico. Los ensayos adecuados para determinar el nivel de expresión del gen diana incluyen, sin limitación, el examen de los niveles de proteína o ARNm usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, transferencias puntuales, transferencias northern, hibridación in situ, ELISA, inmunoprecipitación, función enzimática, así como ensayos fenotípicos conocidos por los expertos en la técnica.
Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente activo o agente terapéutico tal como un ácido nucleico terapéutico es una cantidad suficiente para producir el efecto deseado, por ejemplo, un aumento o inhibición de la expresión de una secuencia diana en comparación con el nivel de expresión normal detectado en ausencia del
ácido nucleico. Se logra un aumento en la expresión de una secuencia diana cuando se detecta cualquier nivel mensurable en el caso de un producto de expresión que no está presente en ausencia del ácido nucleico. En el caso en que el producto de expresión esté presente en algún nivel antes del contacto con el ácido nucleico, se logra un aumento en la expresión cuando el aumento en el valor obtenido con un ácido nucleico tal como ARNm con respecto al control es aproximadamente 1.05, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.75, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000, 5000, 10000 o más. La inhibición de la expresión de un gen diana o una secuencia diana se logra cuando el valor obtenido con un ácido nucleico tal como un oligonucleótido antisentido con respecto al control es aproximadamente 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% o 0%. Los ensayos adecuados para medir la expresión de un gen diana o una secuencia diana incluyen, por ejemplo, examen de niveles de proteína o ARN usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica tales como transferencias puntuales, transferencias northern, hibridación in situ, ELISA, inmunoprecipitación, función enzimática, fluorescencia o luminiscencia de proteínas indicadoras adecuadas, así como ensayos fenotípicos conocidos por los expertos en la técnica.
El término "ácido nucleico" como se usa en el presente documento se refiere a un polímero que contiene al menos dos desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma monocatenaria o bicatenaria e incluye ADN, ARN e híbridos de estos. El ADN puede estar en forma de moléculas antisentido, ADN plasmídico, ADNc, productos de PCR o vectores. El ARN puede estar en forma de ARN en forma de horquilla pequeña (ARNsh),<a>R<n>mensajero (ARNm), ARN antisentido, miARN, micARN, ARN multivalente, ARN sustrato dicer o ARN viral (ARNv), y combinaciones de estos. Los ácidos nucleicos incluyen ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de cadena principal modificados, que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, y que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia. Ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metilribonucleótidos y ácidos péptidonucleicos (PNA). A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también implícitamente abarca variantes modificadas de forma conservadora de los mismos (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, polimorfismos de un solo nucleótido y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, se pueden lograr sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19: 5081 (1991); Ohtsuka y col., J. Biol., 260:2605-2608 (1985); Los "nucleótidos" contienen un azúcar desoxirribosa (ADN) o ribosa (ARN), una base y un grupo fosfato. Los nucleótidos están unidos entre sí a través de los grupos fosfato. Las "Bases" incluyen purinas y pirimidinas, que además incluyen compuestos naturales adenina, timina, guanina, citosina, uracilo, inosina y análogos naturales, y derivados sintéticos de purinas y pirimidinas, que incluyen, entre otros, modificaciones que colocan nuevos grupos reactivos tales como, entre otros, aminas, alcoholes, tioles, carboxilatos y haluros de alquilo.
El término "gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que comprende secuencias codificantes de longitud parcial o de longitud completa necesarias para la producción de un polipéptido o polipéptido precursor.
"Producto génico", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un producto de un gen tal como un transcrito de ARN o un polipéptido.
El término "lípido" se refiere a un grupo de compuestos orgánicos que incluyen, pero no se limitan a, ésteres de ácidos grasos y generalmente se caracterizan por ser pobremente solubles en agua, pero soluble en muchos disolventes orgánicos. Generalmente se dividen en al menos tres clases: (1) "lípidos simples", que incluyen grasas y aceites, así como ceras; (2) "lípidos compuestos", que incluyen fosfolípidos y glicolípidos; y (3) "lípidos derivados" tales como esteroides.
Un "esteroide" es un compuesto que comprende el siguiente esqueleto carbonado:
Ejemplos no limitantes de esteroides incluyen colesterol y similares.
Un "lípido catiónico" se refiere a un lípido capaz de cargarse positivamente. Los lípidos catiónicos ejemplares incluyen uno o más grupos amina que llevan la carga positiva. Los lípidos catiónicos preferidos son ionizables de modo que pueden existir en una forma neutra o cargada positivamente dependiendo del pH. La ionización del lípido catiónico afecta la carga superficial de la nanopartícula lipídica en diferentes condiciones de pH. Este estado de carga puede influir en la absorción de proteínas plasmáticas, el aclaramiento sanguíneo y la distribución tisular (Semple, S.C., et al., Adv. Drug Deliv Rev 32:3-17 (1998)), así como en la capacidad de formar estructuras endosomolíticas no bicapa. (Hafez, LM., et al., Gene Ther 8:1188-1196 (2001)) críticos para la administración intracelular de ácidos nucleicos.
El término "lípido conjugado con polímero" se refiere a una molécula que comprende tanto una porción lipídica como una porción polimérica. Un ejemplo de un lípido conjugado con polímero es un lípido pegilado. El término "lípido pegilado" se refiere a una molécula que comprende tanto una porción lipídica como una porción de polietilenglicol. Los lípidos pegilados son conocidos en la técnica e incluyen 1-(monometoxipolietilenglicol)-2,3-dimiristoilglicerol (PEG-DMG) y similares.
El término "lípido neutro" se refiere a cualquiera de varias especies de lípidos que existen en forma zwitteriónica neutra o sin carga a un pH seleccionado. A pH fisiológico, dichos lípidos incluyen, entre otros, fosfotidilcolinas tales como 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1-Palmitoy1-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), fosfatidiletanolaminas tales como 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), esfingomielinas (SM), ceramidas, esteroides tales como esteroles y sus derivados. Los lípidos neutros pueden ser sintéticos o de origen natural.
El término "lípido cargado" se refiere a cualquiera de varias especies de lípidos que existen en una forma con carga positiva o con carga negativa independiente del pH dentro de un rango fisiológico útil, por ejemplo, pH ~ 3 a pH ~ 9. Los lípidos cargados pueden ser sintéticos o de origen natural. Los ejemplos de lípidos cargados incluyen fosfatidilserinos, ácidos fosfatídicos, fosfatidilgliceroles, fosfatidilinositols, hemisuccinatos de esterol, dialkil trimetilammonio-propanos, (p. ej., DOTAP, DOTMA), dialquildimetilaminopranos, etil fosfocolines, dimethilaminoetano carbamoil de esterol (p. ej. DC-Chol).
El término "nanopartícula lipídica" se refiere a partículas que tienen al menos una dimensión del orden de nanómetros (por ejemplo, 1-1,00 nm) que incluyen uno o más de los compuestos de estructura (I) u otros lípidos catiónicos especificados. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que comprenden los lípidos catiónicos divulgados (p. ej., compuestos de estructura (I)) se incluyen en una formulación que se puede usar para administrar un agente activo o agente terapéutico, tal como un ácido nucleico (por ejemplo, ARNm) a un sitio diana de interés (por ejemplo, célula, tejido, órgano, tumor, y similares). En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas comprenden un compuesto de estructura (I) y un ácido nucleico. Estas nanopartículas lipídicas típicamente comprenden un compuesto de estructura (I) y uno o más excipientes seleccionados de lípidos neutros, lípidos cargados, esteroides y lípidos conjugados con polímeros. En algunas realizaciones, el agente activo o agente terapéutico, tal como un ácido nucleico, puede encapsularse en la porción lipídica de la nanopartícula lipídica o en un espacio acuoso envuelto por parte o toda la porción lipídica de la nanopartícula lipídica, protegiéndola así de la degradación enzimática. u otros efectos indeseables inducidos por los mecanismos del organismo o las células huésped, por ejemplo, una respuesta inmune adversa.
En diversas realizaciones, las nanopartículas lipídicas tienen un diámetro medio de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 80 nm, o aproximadamente 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, o 150 nm. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas son sustancialmente no tóxicas. En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos, cuando están presentes en las nanopartículas lipídicas, son resistentes en solución acuosa a la degradación con una nucleasa. Las nanopartículas lipídicas que comprenden ácidos nucleicos y su método de preparación se describen, por ejemplo, en patentes de<e E .>UU. Publicación de patentes Nos. 2004/0142025, 2007/0042031 y Publicación PCT Nos. WO 2013/016058 y WO 2013/086373.
Como se usa en el presente documento, "lípido encapsulado" se refiere a una nanopartícula lipídica que proporciona un agente activo o agente terapéutico, tal como un ácido nucleico (por ejemplo, ARNm), con encapsulación completa, encapsulación parcial o ambas. En una realización, el ácido nucleico (por ejemplo, ARNm) está completamente encapsulado en la nanopartícula lipídica.
Como se usa en el presente documento, el término "solución acuosa" se refiere a una composición que comprende agua.
"Estable en suero" en relación con las nanopartículas de ácido nucleico-lípido significa que el nucleótido no se degrada significativamente después de la exposición a un suero o un ensayo de nucleasa que degradaría significativamente el ADN o ARN libre. Los ensayos adecuados incluyen, por ejemplo, un ensayo de suero estándar, un ensayo de ADNasa o un ensayo de ARNasa.
"Administración sistémica", como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de un producto terapéutico que puede dar como resultado una exposición amplia de un agente activo dentro de un organismo. Algunas técnicas de administración pueden conducir a la administración sistémica de ciertos agentes, pero no de otros. La administración sistémica significa que una cantidad útil, preferiblemente terapéutica, de un agente se expone a la mayor parte del cuerpo. La administración sistémica de nanopartículas lipídicas puede realizarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluida, por ejemplo, la administración intravenosa, intraarterial, subcutánea e intraperitoneal. En algunas realizaciones, la administración sistémica de nanopartículas lipídicas se realiza mediante administración intravenosa.
"Entrega local", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la entrega de un agente activo directamente a un sitio objetivo dentro de un organismo. Por ejemplo, un agente puede administrarse localmente mediante inyección directa en un sitio de enfermedad tal como un tumor, otro sitio diana tal como un sitio de inflamación o un órgano diana tal como el hígado, corazón, páncreas, riñón y similares. La administración local también puede incluir aplicaciones tópicas o técnicas de inyección localizadas, como inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica. La administración local no excluye un efecto farmacológico sistémico.
"Alquilo" se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que está saturado y que tiene, por ejemplo, de uno a veinticuatro átomos de carbono (alquilo C<1>-C<24>), de cuatro a veinte átomos de carbono (alquilo C<4>-C<20>), de seis a dieciséis átomos de carbono (alquilo Ca-C-ia), de seis a nueve átomos de carbono (alquilo Ca-Cg), de uno a quince átomos de carbono (alquilo C<1>-C<15>), de uno a doce átomos de carbono (alquilo C<1>-C<12>), de uno a ocho átomos de carbono (alquilo C<1>-C<8>) o de uno a seis átomos de carbono (alquilo C<1>-Ca) y que está unido al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n -propilo, 1-metiletilo (isopropilo), n-butilo, n-pentilo, 1,1 -dimetiletilo (t-butilo), 3-metilhexilo, 2-metilhexilo, etenilo, prop-1-enilo, but-1-enilo , pent-1-enilo, penta-1,4-dienilo, etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo y similares. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo alquilo está opcionalmente sustituido.
"Alquileno" o "cadena de alquileno" se refiere a una cadena de hidrocarburo divalente lineal o ramificada que une el resto de la molécula a un grupo radical, que consiste únicamente en carbono e hidrógeno, que está saturado y que tiene, por ejemplo, de uno a veinticuatro átomos de carbono (alquileno C<1>-C<24>), de uno a quince átomos de carbono (alquileno C<1>-C<15>), de uno a doce átomos de carbono (alquileno C<1>-C<12>), de uno a ocho átomos de carbono (alquileno C<1>-C<8>), de uno a seis átomos de carbono (alquileno C<1>-Ca), de dos a cuatro átomos de carbono (alquileno C<2>-C<4>), de uno a dos átomos de carbono (alquileno C<1>-C<2>), por ejemplo, metileno, etileno, propileno, n-butileno, etenileno, propenileno, n-butenileno , propinileno, n-butinileno y similares. La cadena alquileno está unida al resto de la molécula mediante un enlace simple o doble y al grupo radical mediante un enlace simple o doble. Los puntos de unión de la cadena de alquileno al resto de la molécula y al grupo radical pueden ser a través de un carbono o dos carbonos cualesquiera dentro de la cadena. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, una cadena de alquileno puede estar opcionalmente sustituida.
"Cicloalquilo" o "anillo carbocíclico" se refiere a un radical hidrocarburo estable, monocíclico o policíclico, no aromático, que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que puede incluir sistemas de anillos condensados o con puentes, que tienen de tres a quince átomos de carbono, preferiblemente que tienen de tres a diez átomos de carbono, y que está saturado y unido al resto de la molécula mediante un enlace sencillo. Los radicales monocíclicos incluyen, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo. Los radicales policíclicos incluyen, por ejemplo, adamantilo, norbornilo, decalinilo, 7,7-dimetil-biciclo[2.2.1]heptanilo y similares. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo cicloalquilo puede estar opcionalmente sustituido.
"Cicloalquileno" es un grupo cicloalquilo divalente. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo cicloalquileno puede estar opcionalmente sustituido.
"Heterociclilo" o "anillo heterocíclico" se refiere a un radical de anillo no aromático estable de 3 a 18 miembros (por ejemplo, de 5, a o 7 miembros) que tiene de uno a doce átomos de carbono en el anillo (por ejemplo, de dos a doce) y de uno a seis heteroátomos de anillo seleccionados del grupo formado por nitrógeno, oxígeno y azufre. Ejemplos de tales radicales heterociclilo incluyen, entre otros, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, imidazolidinilo, tetrahidropirimidinilo y similares. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo heterociclilo puede estar opcionalmente sustituido.
"Heteroarilo" se refiere a un radical de sistema de anillo de 5 a 14 miembros que comprende átomos de hidrógeno, de uno a trece átomos de carbono en el anillo, de uno a seis heteroátomos en el anillo seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre, y al menos un anillo aromático. Los ejemplos incluyen, entre otros, pirrolilo, imidazolilo, triazolilo, tiazolilo, piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo y similares. A menos que se indique específicamente lo contrario en la especificación, un grupo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido.
El término "sustituido" utilizado significa cualquiera de los grupos anteriores (por ejemplo, alquilo, alquileno, cicloalquilo o cicloalquileno) en los que al menos un átomo de hidrógeno se reemplaza por un enlace a un átomo que no es de hidrógeno tal como, entre otros: un átomo halógeno tal como F, Cl, Br o I; grupos oxo (=O); grupos hidroxilo (-OH); grupos alquilo C<1>-C<12>; grupos cicloalquilo; -(C=O)OR; -O(C=O)R; -C(=O)R; -OR'; -S(O)xR; -S-SR'; C(=O)SR'; -SC(=O)R'; -NR'R'; -NR'C(=O)R'; -C(=O)NR'R'; -NR'C(=O)NR'R'; -OC(=O)NR'R'; -NR'C(=O)OR'; -NR'S(O)xNR'R'; -NR'S(O)xR'; y -S(O)xNR'R', donde: R' es, en cada aparición, independientemente H, alquilo C<1>-C<15>o cicloalquilo, y x es 0, 1 o 2. En algunas realizaciones, el sustituyente es un grupo alquilo C<1>-C<12>. En otras realizaciones, el sustituyente es un grupo cicloalquilo. En otras realizaciones, el sustituyente es un grupo halo, tal como fluoro. En otras realizaciones, el sustituyente es un grupo oxo. En otras realizaciones, el sustituyente es un grupo hidroxilo. En otras realizaciones, el sustituyente es un grupo alcoxi (-OR). En otras realizaciones, el sustituyente es un grupo carboxilo. En otras realizaciones, el sustituyente es un grupo amina (-NR'R').
"Opcional" u "opcionalmente" (por ejemplo, opcionalmente sustituido) significa que el evento de circunstancias descrito posteriormente puede ocurrir o no, y que la descripción incluye casos en los que dicho evento o circunstancia ocurre y casos en los que no. Por ejemplo, "alquilo opcionalmente sustituido" significa que el radical alquilo puede estar o no sustituido y que la descripción incluye tanto radicales alquilo sustituidos como radicales alquilo que no tienen sustitución.
La divulgación descrita en el presente documento también pretende abarcar todos los compuestos farmacéuticamente aceptables del compuesto de estructura (I) que están marcados isotópicamente teniendo uno o más átomos reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o un número de masa diferente. Los ejemplos de isótopos que se pueden incorporar en los compuestos divulgados incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor, cloro y yodo, tales como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F, 36Cl, 123I y 125I respectivamente. Estos compuestos radiomarcados podrían ser útiles para ayudar a determinar o medir la eficacia de los compuestos, caracterizando, por ejemplo, el sitio o modo de acción, o la afinidad de unión a un sitio de acción farmacológicamente importante. Ciertos compuestos de estructura (I), (IA) o (IB) marcados isotópicamente, por ejemplo, aquellos que incorporan un isótopo radiactivo, son útiles en estudios de distribución de fármacos y/o sustratos en tejidos. Los isótopos radiactivos tritio, es decir, 3H, y carbono-14, es decir, 14C, son particularmente útiles para este propósito en vista de su facilidad de incorporación y medios fáciles de detección.
La sustitución con isótopos más pesados como el deuterio, es decir, 2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una mayor vida mediain vivoo requisitos de dosificación reducidos y, por lo tanto, puede preferirse en algunas circunstancias.
La sustitución con isótopos emisores de positrones, como 11C, 18F, 15O y 13N, puede ser útil en estudios de topografía por emisión de positrones (PET) para examinar la ocupación del receptor de sustrato. Los compuestos de estructura (I) marcados isotópicamente pueden prepararse generalmente mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica o mediante procesos análogos a los descritos en las Preparaciones y Ejemplos que se exponen a continuación usando un reactivo marcado isotópicamente apropiado en lugar del reactivo no marcado previamente empleado.
Las realizaciones descritas aquí también pretenden abarcar los productos metabólicosin vivode los compuestos descritos. Dichos productos pueden resultar, por ejemplo, de la oxidación, reducción, hidrólisis, amidación, esterificación y similares del compuesto administrado, principalmente debido a procesos enzimáticos. Por consiguiente, las realizaciones de la divulgación incluyen compuestos producidos mediante un proceso que comprende administrar un compuesto de esta divulgación a un mamífero durante un período de tiempo suficiente para producir un producto metabólico del mismo. Dichos productos normalmente se identifican administrando un compuesto radiomarcado de la divulgación en una dosis detectable a un animal, tal como rata, ratón, conejillo de indias, mono o humano, dejando tiempo suficiente para que se produzca el metabolismo, y aislando sus productos de conversión de la orina, sangre u otras muestras biológicas.
"Compuesto estable" y "estructura estable" pretenden indicar un compuesto que es suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción y a la formulación en un agente terapéutico eficaz.
"Mamífero" incluye seres humanos y animales domésticos tales como animales de laboratorio y mascotas domésticas (por ejemplo, gatos, perros, cerdos, vacas, ovejas, cabras, caballos, conejos) y animales no domésticos tales como vida silvestre y similares.
"Vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye, entre otros, cualquier adyuvante, vehículo, excipiente, deslizante, agente edulcorante, diluyente, conservante, tinte/colorante, potenciador del sabor, tensioactivo, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, estabilizador, agente isotónico, disolvente o emulsionante que haya sido aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos como aceptable para su uso en humanos o animales domésticos.
"Sal farmacéuticamente aceptable" incluye sales de adición tanto de ácidos como de bases.
"Sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que conservan la eficacia biológica y las propiedades de las bases libres, que no son biológicamente o de otro modo indeseables, y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, entre otros, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como, entre otros, ácido acético, ácido 2,2-dicloroacético, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido 4-acetamidobenzoico, ácido alcanforico, ácido alcanfor-10-sulfónico, ácido cáprico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido carbónico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido ciclámico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galactárico, ácido gentísico, ácido glucoheptónico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutámico, ácido glutárico, ácido 2-oxoglutárico, ácido glicerofosfórico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido isobutírico, ácido láctico, ácido lactobiónico, ácido láurico, ácido maleico, ácido málico, ácido malónico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido múcico, ácido naftaleno-1,5-disulfónico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ácido 1- hidroxi-2-naftoico, ácido nicotínico, ácido oleico, ácido orótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido propiónico, ácido piroglutámico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido tiociánico, ácido p-toluenosulfónico, ácido trifluoroacético, ácido undecilénico y similares.
"Sal de adición de base farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que conservan la eficacia biológica y las propiedades de los ácidos libres, que no son biológicamente o de otro modo indeseables. Estas sales se preparan mediante la adición de una base inorgánica o una base orgánica al ácido libre. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen, entre otras, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Las sales inorgánicas preferidas son las sales de amonio, sodio, potasio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, entre otras, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, tales como amoníaco, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, dietanolamina, etanolamina, deanol, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, benetamina, benzatina, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, trietanolamina, trometamina , purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliamina y similares. Las bases orgánicas particularmente preferidas son isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetilamina, diciclohexilamina, colina y cafeína.
A menudo, las cristalizaciones producen un solvato de un compuesto de la divulgación (es decir, un compuesto de estructura (I)). Como se usa en el presente documento, el término "solvato" se refiere a un agregado que comprende una o más moléculas de un compuesto de la divulgación con una o más moléculas de disolvente. El disolvente puede ser agua, en cuyo caso el solvato puede ser un hidrato. Alternativamente, el disolvente puede ser un disolvente orgánico. Por tanto, los compuestos de la presente divulgación pueden existir como hidratos, incluidos monohidratos, dihidratos, hemihidratos, sesquihidratos, trihidratos, tetrahidratos y similares, así como las formas solvatadas correspondientes. Los solvatos del compuesto de la divulgación pueden ser verdaderos solvatos, mientras que en otros casos el compuesto de la divulgación puede simplemente retener agua adventicia o ser una mezcla de agua más algún disolvente adventicio.
Una "composición farmacéutica" se refiere a una formulación de un compuesto de la divulgación y un medio generalmente aceptado en la técnica para la administración del compuesto biológicamente activo a mamíferos, por ejemplo, humanos. Dicho medio incluye todos los vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables para el mismo.
"Cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto de la divulgación que, cuando se administra a un mamífero, preferentemente un ser humano, es suficiente para efectuar el tratamiento en el mamífero, preferentemente un ser humano. La cantidad de una nanopartícula lipídica de la divulgación que constituye una "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo del compuesto, la afección y su gravedad, la forma de administración y la edad del mamífero a tratar, pero se puede determinar de forma rutinaria. por un experto en la materia teniendo en cuenta su propio conocimiento y esta divulgación.
"Tratar" o "tratamiento" como se utiliza en el presente documento cubre el tratamiento de la enfermedad o afección de interés en un mamífero, preferiblemente un ser humano, que tiene la enfermedad o afección de interés, e incluye:
(i) evitar que la enfermedad o afección se produzca en un mamífero, en particular, cuando dicho mamífero está predispuesto a la afección, pero aún no se le ha diagnosticado que la padece;
(ii) inhibir la enfermedad o afección, es decir, detener su desarrollo;
(iii) aliviar la enfermedad o afección, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o afección; o
(iv) aliviar los síntomas resultantes de la enfermedad o afección, es decir, aliviar el dolor sin abordar la enfermedad o afección subyacente. Tal como se usan en, los términos "enfermedad" y "afección" pueden usarse indistintamente o pueden ser diferentes en el sentido de que la enfermedad o afección en particular puede no tener un agente causante conocido (de modo que la etiología aún no se ha determinado) y, por lo tanto aun no se reconoce como una enfermedad, sino sólo como una condición o síndrome indeseable, en el que los médicos han identificado un conjunto más o menos específico de síntomas.
Los compuestos de la divulgación, o sus sales farmacéuticamente aceptables, pueden contener uno o más estereocentros y, por tanto, pueden dar lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras formas estereoisoméricas que pueden definirse, en términos de estereoquímica absoluta, como (R)- o (S)- o, como (D)- o (L)- para aminoácidos. Se pretende que la presente divulgación incluya todos estos isómeros posibles, así como sus formas racémicas y ópticamente puras. Los isómeros ópticamente activos (+) y (-), (R)- y (S)-, o (D)- y (L)- pueden prepararse usando sintones quirales o reactivos quirales, o resolverse usando técnicas convencionales, por ejemplo, cromatografía y cristalización fraccionada. Las técnicas convencionales para la preparación/aislamiento de enantiómeros individuales incluyen la síntesis quiral a partir de un precursor ópticamente puro adecuado o la resolución del racemato (o el racemato de una sal o derivado) usando, por ejemplo, cromatografía líquida de alta presión (HPLC) quiral. Cuando los compuestos descritos en el presente documento contienen dobles enlaces olefínicos u otros centros de asimetría geométrica, y a menos que se especifique lo contrario, se pretende que los compuestos incluyan isómeros geométricos tanto E como Z. Asimismo, también se pretende incluir todas las formas tautoméricas.
Un "estereoisómero" se refiere a un compuesto formado por los mismos átomos unidos por los mismos enlaces pero que tienen diferentes estructuras tridimensionales, que no son intercambiables. La presente divulgación contempla varios estereoisómeros y mezclas de estos e incluye "enantiómeros", que se refiere a dos estereoisómeros cuyas moléculas son imágenes especulares no superponibles entre sí.
Un "tautómero" se refiere a un desplazamiento de protones de un átomo de una molécula a otro átomo de la misma molécula. La presente divulgación incluye tautómeros de cualquiera de dichos compuestos.
Compuestos
En un aspecto, la divulgación proporciona nuevos compuestos lipídicos que son capaces de combinarse con otros componentes lipídicos tales como lípidos neutros, lípidos cargados, esteroides y/o lípidos conjugados con polímeros para formar nanopartículas lipídicas con oligonucleótidos. Sin desear limitarse a ninguna teoría, se cree que estas nanopartículas lipídicas protegen a los oligonucleótidos de la degradación en el suero y proporcionan una administración eficaz de oligonucleótidos a las célulasin vitroein vivo.
En una realización, los compuestos tienen la siguiente estructura (I):
o una sal farmacéuticamente aceptable, tautómero o estereoisómero de este, en el que:
R1- es alquilo C<1>-C<24>opcionalmente sustituido o alquenilo C<2>-C<24>opcionalmente sustituido;
R2 y R3 son cada uno de ellos independientemente alquilo C<1>-C<36>opcionalmente sustituido;
R4 y R5 son cada uno de ellos independientemente alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido, o R4 y R5 se unen, junto con el N al que están unidos, para formar un heterociclilo o heteroarilo;
L1, L2 y L3 están cada uno de ellos alquilenos C<1>-C<18>opcionalmente sustituidos de forma independiente;
G1 es un enlace directo, -(CH<2>)nO(C=O)-, -(CH<2>)n(C=O)O-, o -(C=O)-;
G2 y G3 son cada uno independientemente -(C=O)O- o -O(C=O)-; y n es un número entero mayor que 0.
En algunas realizaciones, el compuesto tiene la siguiente estructura (IA):
En algunas realizaciones, el compuesto tiene la siguiente estructura (IB):
En algunas realizaciones, R1- es alquilo C<6>-C<18>o alquenilo C<14>-C<18>opcionalmente sustituido. En determinadas realizaciones, R1- es alquilo C8, alquilo C<9>, alquilo C<10>, alquilo C<12>, alquilo C<14>o alquilo C<16>. E más específicas, R1 es alquenilo C<16>. En ciertas realizaciones más específicas, R1 no está ramificado. En algunas realizaciones, R1 está ramificado. En determinadas realizaciones, R1 no está sustituido.
En algunas realizaciones, G1 es un enlace directo, -(CH<2>)nO(C=O)-, o -(CH<2>)n(C=O)O-. En determinadas realizaciones,
G1 es un enlace directo. En algunas realizaciones más específicas, G1 es -(CH<2>)n(C=O)O- y n es mayor que 1. En algunas realizaciones, n es 1-20. En algunas realizaciones, n es 1-10. En algunas realizaciones, n es 5-11. En algunas realizaciones, n es 6-10. En ciertas realizaciones más específicas, n es 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas realizaciones, n es 5. En algunas realizaciones, n es 6. En algunas realizaciones, n es 7. En ciertas realizaciones, n es 8. En algunas realizaciones, n es 9. En algunas realizaciones, n es 10.
En algunas realizaciones, L1 es alquileno C<1>-C<6>. En determinadas realizaciones, L1 es alquileno C<2>, alquileno C<3>o alquileno C<4>. En algunas realizaciones más específicas, L1 no está ramificado. En determinadas realizaciones más específicas, L1 no está sustituido.
En algunas realizaciones, R2 es alquilo C<8>-C<24>. En algunas realizaciones, R3 es alquilo C<8>-C<24>. En algunas realizaciones más específicas, R2 y R3 son ambos alquilo C<8>-C<24>. En algunas realizaciones, R2 y R3 son cada uno independientemente alquilo C<11>, alquilo C<12>, alquilo C<13>, alquilo C<14>, alquilo C<15>, alquilo C<16>, alquilo C<18>o alquilo C<20>.
En determinadas realizaciones, R2 está ramificado. En realizaciones más específicas, R3 está ramificado. En algunas realizaciones más específicas, R2 y R3 tienen cada uno independientemente una de las siguientes estructuras:
donde:
R6 y R7 son cada uno independientemente alquilo C<2>-C<12>.
En algunas realizaciones, R2y R3 tienen cada uno independientemente una de las siguientes estructuras:
En algunas realizaciones, L2 y L3 son cada uno independientemente alquileno C<4>-C<10>. En determinadas realizaciones, L2 y L3 son ambos alquileno C<5>. En algunas realizaciones más específicas, L2 y L3 son ambos alquileno C6. En determinadas realizaciones, L2 y L3 son ambos alquileno C8. En algunas realizaciones más específicas, L2 y L3 son ambos alquileno C<9>. En algunas realizaciones, L2 no está ramificada. En algunas realizaciones, L3 no está ramificado. En realizaciones más específicas, L2 no está sustituido. En algunas realizaciones, L2 no está sustituido.
En algunas realizaciones, R4y R5 son cada uno independientemente alquilo C<1>-C<6>. En realizaciones más específicas, R4 y R5 son ambos metilos. En determinadas realizaciones, R4 y R5 son ambos etilos. En determinadas realizaciones, R4 es metilo y R5 es n-butilo. En algunas realizaciones, R4 y R5 son ambos n-butilo. En diferentes realizaciones, R4 es metilo y R5 es n-hexilo.
En algunas realizaciones, R4 y R5 se unen, junto con el N al que están unidos, para formar un heterociclilo. En determinadas realizaciones, el heterociclilo es un heterociclilo de 5 miembros. En algunas realizaciones, el heterociclilo tiene la siguiente estructura:
En diversas realizaciones diferentes, el compuesto tiene una de las estructuras expuestas en la Tabla 1 a continuación. Tabla 1. Compuestos incluidos en realizaciones de compuestos de estructura (I)
Se entiende que cualquier realización de los compuestos de estructura (I), como se establece anteriormente, y cualquier sustituyente específico y/o variable en la estructura del compuesto (I), como se establece anteriormente, se puede combinar independientemente con otras realizaciones y/o o sustituyentes y/o variables de compuestos de estructura (I) para formar realizaciones de las divulgaciones no establecidas específicamente anteriormente. Además, en el caso de que se enumere una lista de sustituyentes y/o variables para cualquier grupo R, grupo G, grupo L o variable n particular, en una realización y/o reivindicación particular, se entiende que cada sustituyente y/o o variable puede eliminarse de la realización y/o reivindicación particular y que la lista restante de sustituyentes y/o variables se considerará que está dentro del alcance de la divulgación.
Se entiende que, en la presente descripción, las combinaciones de sustituyentes y/o variables de las fórmulas representadas son permisibles sólo si dichas contribuciones dan como resultados compuestos estables.
En algunas realizaciones, se proporcionan nanopartículas lipídicas que comprenden un compuesto de estructura (I). Las nanopartículas lipídicas incluyen opcionalmente excipientes seleccionados a partir de un lípido neutro, un esteroide y un lípido conjugado con polímero.
En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden uno cualquiera o más de los compuestos de estructura (I) y un agente terapéutico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones comprenden cualquiera de los compuestos de estructura (I) y un agente terapéutico y uno o más excipientes seleccionados entre lípidos neutros, esteroides y lípidos conjugados con polímeros. También se incluyen otros excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables en diversas realizaciones de las composiciones.
En algunas realizaciones, el lípido neutro se selecciona de DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE y SM. En algunas realizaciones, el lípido neutro es DSPC. En diversas realizaciones, la relación molar del compuesto al lípido neutro varía de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1.
En diversas realizaciones, las composiciones comprenden además un esteroide o un análogo de esteroide. En determinadas realizaciones, el esteroide o análogo de esteroide es colesterol. En algunas de estas realizaciones, la relación molar del compuesto con respecto al colesterol oscila entre aproximadamente 5:1 y 1:1.
En diversas realizaciones, el lípido conjugado con polímero es un lípido pegilado. Por ejemplo, algunas realizaciones incluyen un diacilglicerol pegilado (PEG-DAG) tal como 1-(monometoxi-polietilenglicol)-2,3-dimiristoilglicerol (PEG-DMG), una fosfatidiletanoloamina pegilada (PEG-PE), un diacilglicerol succinato de PEG (PEG - S-DAG) tal como 4-O-(2',3'-di(tetradecanoiloxi)propil1-1-O-(u>-metoxi(polietoxi)etil)butanodioato (PEG-S-DMG), una ceramida pegilada (PEG-cer), o un dialcoxipropilcarbamato de<p>E<g>tal como ei-metoxi(polietoxi)etil-N-(2,3-di(tetradecanoxi)propil) carbamato o 2,3-di(tetradecanoxi)propil-N-(u>-metoxi (polietoxi)etil)carbamato. En diversas realizaciones, la relación molar del compuesto al lípido pegilado varía de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 20:1.
En algunas realizaciones, la composición comprende un lípido pegilado que tiene la siguiente estructura (II):
o una sal, tautómero o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que:
R8 y R9 son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal o ramificada, saturada o insaturada que contiene de 10 a 30 átomos de carbono, en la que la cadena de alquilo está opcionalmente interrumpida por uno o más enlaces éster; y
w tiene un valor medio que oscila entre 30 y 60.
En algunas realizaciones, R8 y R9 son cada uno independientemente cadenas de alquilo saturadas, lineales que contienen de 12 a 16 átomos de carbono. En otras realizaciones, el w promedio oscila entre aproximadamente 42 y 55, por ejemplo, aproximadamente 49.
En algunas realizaciones de la composición anterior, el agente terapéutico comprende un ácido nucleico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el ácido nucleico se selecciona entre ARN antisentido y mensajero. En algunas de las realizaciones anteriores, la composición comprende una nanopartícula lipídica.
Algunas realizaciones relacionadas proporcionan una nanopartícula lipídica que comprende el compuesto de una cualquiera de las realizaciones anteriores (por ejemplo, un compuesto de estructura (I)). En determinadas realizaciones, la nanopartícula lipídica comprende además un agente terapéutico (por ejemplo, un ácido nucleico tal como ARN antisentido y mensajero).
En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica comprende además uno o más excipientes seleccionados entre lípidos neutros, esteroides y lípidos conjugados con polímeros. En algunas realizaciones, los lípidos neutros se seleccionan de DSPC, DP<p>C, D<m>PC, DOPC, POPC, DOPE y SM. En realizaciones más específicas, el lípido neutro es DSPC.
En algunas realizaciones más específicas, la relación molar del compuesto al lípido neutro varía de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1. En algunas realizaciones, el esteroide es colesterol. En algunas realizaciones, la relación molar del compuesto a colesterol varía de 5:1 a 1:1.
En determinadas realizaciones, el lípido conjugado con polímero es un lípido pegilado. En ciertas realizaciones más específicas, la relación molar del compuesto a lípido pegilado varía de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 20:1.
En algunas realizaciones, el lípido pegilado es PEG-DAG, PEG-PE, PEG-S-DAG, PEG-cer o un dialquioxipropilcarbamato de PEG. En otras realizaciones, el lípido pegilado tiene la siguiente estructura (II):
o una sal, tautómero o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que:
R8 y R9 son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal o ramificada, saturada o insaturada que contiene de 10 a 30 átomos de carbono, en la que la cadena de alquilo está opcionalmente interrumpida por uno o más enlaces éster; y
w tiene un valor medio que oscila entre 30 y 60.
En algunas realizaciones más específicas de la estructura (II), R8 y R9 son cada uno cadenas alquílicas saturadas, independientemente lineales, que contienen de 12 a 16 átomos de carbono. En realizaciones más específicas, el w promedio es aproximadamente 49.
En otras realizaciones diferentes, la divulgación se dirige a un método para administrar un agente terapéutico a un paciente que lo necesita, comprendiendo el método preparar o proporcionar cualquiera de las composiciones anteriores y administrar la composición al paciente.
Para fines de administración, las realizaciones de los compuestos de la presente divulgación (típicamente en forma de nanopartículas lipídicas en combinación con un agente terapéutico) pueden administrarse como una sustancia química cruda o pueden formularse como composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas de las realizaciones de la presente divulgación comprenden un compuesto de estructura (I) y uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, el compuesto de estructura (I) está presente en la composición en una cantidad que es eficaz para formar una nanopartícula lipídica y administrar el agente terapéutico, por ejemplo, para tratar una enfermedad o afección particular de interés. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las concentraciones y dosis apropiadas.
La administración de las composiciones de las realizaciones de la divulgación se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los modos aceptados de administración de agentes para servir a utilidades similares. Las composiciones farmacéuticas de realizaciones de la divulgación. Puede formularse en preparaciones en forma sólida, semisólida, líquida o gaseosa, como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, suspensiones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas y aerosoles. Las rutas típicas de administración de tales composiciones farmacéuticas incluyen, sin limitación, oral, tópica, transdérmica, por inhalación, parenteral, sublingual, bucal, rectal, vaginal e intranasal. El término parenteral tal como se utiliza incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraesternal o técnicas de infusión.
Las composiciones farmacéuticas de las realizaciones de la divulgación se formulan de manera que permitan que los ingredientes activos contenidos en ellas estén biodisponibles tras la administración de la composición a un paciente. Composiciones que serán administradas a un sujeto o paciente en algunas realizaciones toma la forma de una o más unidades de dosificación, donde, por ejemplo, una tableta puede ser una única unidad de dosificación, y un recipiente de un compuesto de una realización de la divulgación en forma de aerosol puede contener una pluralidad de unidades de dosificación. Los métodos reales para preparar dichas formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en esta técnica; por ejemplo, consulte Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20.a edición(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000). En algunas realizaciones, la composición a administrar contendrá, en cualquier caso, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la divulgación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para el tratamiento de una enfermedad o afección de interés de acuerdo con las enseñanzas de esta divulgación.
Una composición farmacéutica de las realizaciones de la divulgación puede estar en forma de sólido o líquido. En un aspecto, los vehículos son particulados, de modo que las composiciones están, por ejemplo, en forma de tableta o polvo. Los vehículos pueden ser líquidos, siendo las composiciones, por ejemplo, jarabe oral, líquido inyectable o un aerosol, que es útil, por ejemplo, en la administración por inhalación.
Cuando está destinada a la administración oral, la composición farmacéutica de ciertas realizaciones está preferiblemente en forma sólida o líquida, donde las formas semisólidas, semilíquidas, de suspensión y de gel se incluyen dentro de las formas consideradas sólidas o líquidas.
Como composición sólida para administración oral, la composición farmacéutica de algunas realizaciones se puede formular en forma de polvo, gránulo, tableta comprimida, píldora, cápsula, goma de mascar, oblea o formas similares. Dicha composición sólida normalmente contendrá una o más formas inertes. diluyentes o portadores comestibles. Además, pueden estar presentes uno o más de los siguientes: aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes desintegrantes tales como ácido algínico, alginato de sodio, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante de naranja; y un agente colorante.
Cuando la composición farmacéutica de algunas realizaciones está en forma de cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina puede contener, además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido tal como polietilenglicol o aceite.
La composición farmacéutica de algunas realizaciones puede estar en forma de líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para administración oral o para administración mediante inyección, como dos ejemplos. Cuando está destinada a la administración oral, la composición preferida contiene, además de un compuesto de estructura (I), uno o más de un agente edulcorante, conservantes, colorante/colorante y potenciador del sabor. En una composición destinada a ser administrada mediante inyección, se pueden incluir uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente suspensor, tampón, estabilizador y agente isotónico.
Las composiciones farmacéuticas líquidas de las realizaciones de la divulgación ya sean soluciones, suspensiones u otras formas similares, pueden incluir uno o más de los siguientes adyuvantes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferiblemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, solución isotónica, cloruro de sodio, aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes como el ácido ascórbico o el bisulfato de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa; agentes para actuar como crioprotectores como sacarosa o trehalosa. La preparación parenteral puede estar envasada en ampollas, jeringas desechables o viales multidosis de vidrio o plástico. La solución salina fisiológica es un adyuvante preferido. Una composición farmacéutica inyectable es preferiblemente estéril.
Una composición farmacéutica líquida de realizaciones de la divulgación destinada a administración parenteral u oral debe contener una cantidad de un compuesto de la divulgación tal que se obtenga una dosis adecuada.
La composición farmacéutica de las realizaciones de la divulgación puede estar destinada a la administración tópica, en cuyo caso el vehículo puede comprender adecuadamente una solución, emulsión, pomada o base de gel. La base, por ejemplo, puede comprender uno o más de los siguientes: vaselina, lanolina, polietilenglicoles, cera de abeja, aceite mineral, diluyentes tales como agua y alcohol, y emulsionantes y estabilizadores. Pueden estar presentes agentes espesantes en una composición farmacéutica para administración tópica. Si está destinada a la administración transdérmica, la composición puede incluir un parche transdérmico o un dispositivo de iontoforesis.
La composición farmacéutica de las realizaciones de la divulgación puede estar destinada a la administración rectal, en forma, por ejemplo, de un supositorio, que se derretirá en el recto y liberará el fármaco. Una composición para administración rectal puede contener una base oleaginosa como excipiente no irritante adecuado. Dichas bases incluyen, sin limitación, lanolina, manteca de cacao y polietilenglicol.
La composición farmacéutica de las realizaciones de la divulgación puede incluir diversos materiales que modifican la forma física de una unidad de dosificación sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que formen una cubierta de recubrimiento alrededor de los ingredientes activos. Los materiales que forman la cubierta de recubrimiento son típicamente inertes y pueden seleccionarse, por ejemplo, entre azúcar, goma laca y otros agentes de recubrimiento entérico. Alternativamente, los ingredientes activos pueden estar encerrados en una cápsula de gelatina.
La composición farmacéutica de las realizaciones de la divulgación en forma sólida o líquida puede incluir un agente que se une al compuesto de la divulgación y, por lo tanto, ayuda en la administración del compuesto. Los agentes adecuados que pueden actuar en esta capacidad incluyen un anticuerpo monoclonal o policlonal, o una proteína.
La composición farmacéutica de las realizaciones de la divulgación puede consistir en unidades de dosificación que pueden administrarse como un aerosol. El término aerosol se utiliza para designar una variedad de sistemas que van desde los de naturaleza coloidal hasta los sistemas que consisten en paquetes presurizados. La entrega puede realizarse mediante gas licuado o comprimido o mediante un sistema de bomba adecuado que dosifique los ingredientes activos. Los aerosoles de los compuestos de las realizaciones de la divulgación se pueden administrar en sistemas monofásicos, bifásicos o trifásicos para administrar los ingredientes activos. La entrega del aerosol incluye los contenedores, activadores, válvulas, subcontenedores y similares necesarios, que juntos pueden formar un kit. Un experto en la técnica, sin excesiva experimentación, puede determinar los aerosoles preferidos.
Las composiciones farmacéuticas de las realizaciones de la divulgación se pueden preparar mediante metodología bien conocida en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, una composición farmacéutica destinada a ser administrada mediante inyección se puede preparar combinando las nanopartículas lipídicas de la divulgación con agua destilada estéril u otro vehículo para formar una solución. Se puede añadir un tensioactivo para facilitar la formación de una solución o suspensión homogénea. Los tensioactivos son compuestos que interactúan de forma no covalente con el compuesto de la divulgación para facilitar la disolución o suspensión homogénea del compuesto en el sistema de administración acuoso.
Las composiciones de las realizaciones de la divulgación, o sus sales farmacéuticamente aceptables, se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz, que variará dependiendo de una variedad de factores que incluyen la actividad del agente terapéutico específico empleado; la estabilidad metabólica y la duración de la acción del agente terapéutico; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el modo y tiempo de administración; la tasa de excreción; la combinación de drogas; la gravedad del trastorno o afección particular; y el sujeto sometido a terapia.
Las composiciones de las realizaciones de la divulgación también se pueden administrar simultáneamente con, antes o después de la administración de uno o más agentes terapéuticos diferentes. Dicha terapia de combinación incluye la administración de una formulación de dosificación farmacéutica única de una composición de las realizaciones de la divulgación y uno o más agentes activos adicionales, así como la administración de la composición de las realizaciones de la divulgación y cada agente activo en su propia formulación de dosificación farmacéutica separada. Por ejemplo, una composición de las realizaciones de la divulgación y el otro agente activo se pueden administrar al paciente juntos en una única composición de dosificación oral tal como una tableta o cápsula, o cada agente se puede administrar en formulaciones de dosificación orales separadas. Cuando se usan dosis separadas, los compuestos de las realizaciones de la divulgación y uno o más agentes activos adicionales se pueden administrar esencialmente al mismo tiempo, es decir, simultáneamente, o en tiempos escalonados por separado, es decir, secuencialmente; se entiende que la terapia combinada incluye todos estos regímenes.
Los métodos de preparación para los compuestos y composiciones anteriores se describen a continuación y/o se conocen en la técnica.
Los expertos en la técnica apreciarán que en el proceso descrito en el presente documento es posible que sea necesario proteger los grupos funcionales de los compuestos intermedios mediante grupos protectores adecuados. Dichos grupos funcionales incluyen hidroxi, amino, mercapto y ácido carboxílico. Los grupos protectores adecuados para hidroxi incluyen trialquilsililo o diarilalquilsililo (por ejemplo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo o trimetilsililo), tetrahidropiranilo, bencilo y similares. Los grupos protectores adecuados para amino, amidino y guanidino incluyen tbutoxicarbonilo, benciloxicarbonilo y similares. Los grupos protectores adecuados para mercapto incluyen -C(O)-R" (donde R" es alquilo, arilo o arilalquilo), p-metoxibencilo, tritilo y similares. Los grupos protectores adecuados para el ácido carboxílico incluyen ésteres de alquilo, arilo o arilalquilo. Los grupos protectores se pueden agregar o eliminar de acuerdo con técnicas estándar, que son conocidas por un experto en la técnica y como se describen en el presente documento. El uso de grupos protectores se describe en detalle en Green, T.W. y P.G.M. Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis(1999), 3a ed., Wiley. Como apreciaría un experto en la técnica, el grupo protector también puede ser una resina polimérica tal como una resina Wang, una resina Rink o una resina de cloruro de 2-clorotritilo.
Los expertos en la técnica también apreciarán que, aunque dichos derivados protegidos de los compuestos de esta divulgación pueden no poseer actividad farmacológica como tales, pueden administrarse a un mamífero y luego metabolizarse en el cuerpo para formar compuestos de la divulgación que son farmacológicamente activo. Por tanto, dichos derivados pueden describirse como "profármacos".
Además, los compuestos de las realizaciones de la divulgación que existen en forma de base libre o ácido se pueden convertir en sus sales farmacéuticamente aceptables mediante tratamiento con la base o ácido inorgánico u orgánico apropiado mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. Las sales de compuestos de realizaciones de la divulgación se pueden convertir a su forma de base libre o ácida mediante técnicas estándar.
El siguiente Esquema de Reacción General 1 ilustra métodos ejemplares para preparar compuestos de esta divulgación, es decir, compuestos de estructura (I):
o una sal, tautómero o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que R1, R2, R3, R4, R5, L1, L2, L3, G2 y G3 son como se definen. Se entiende que un experto en la técnica puede preparar estos compuestos mediante métodos similares o combinando otros métodos conocidos por un experto en la técnica. También se entiende que un experto en la técnica podría preparar, de manera similar a la que se describe a continuación, otros compuestos de estructura (I) no ilustrados específicamente a continuación usando los componentes de partida apropiados y modificando los parámetros de la síntesis según sea necesario. En general, los componentes de partida pueden obtenerse de fuentes tales como Sigma Aldrich, Lancaster Synthesis, Inc., Maybridge, Matrix Scientific, TCI y Fluorochem USA, etc. o sintetizarse según fuentes conocidas por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo,Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure,5a edición (Wiley, diciembre de 2000)) o preparado como se describe en esta divulgación.
Esquema de reacción general 1
A5 Compuesto I
El Esquema de Reacción General I proporciona un método ejemplar para la preparación de compuestos de estructura (I). R1, R2, R3, R4, R5, L1, L2, L3, G1, G2 y G3 en el Esquema de reacción general 1 son como se definen. X1 y X2 son restos reactivos seleccionados para facilitar la reacción deseada (por ejemplo, halo). Los compuestos de estructura A1 se compran o preparan según métodos conocidos en la técnica. La reacción de A1 en condiciones reductoras apropiadas (por ejemplo, triacetoxiborohidruro de sodio) produce el producto de la aminación reductiva entre A1 y A2, A3. Luego se hace reaccionar A3 con A4 en condiciones básicas adecuadas (por ejemplo, usando trietilamina y<d>M<a>P) para proporcionar el compuesto A5. Luego se hace reaccionar A5 con la amina A6 usando condiciones apropiadas (por ejemplo, calor) para producir un compuesto de estructura (I) como se muestra.
Cabe señalar que los expertos en la técnica disponen de diversas estrategias alternativas para la preparación de compuestos de estructura (I). Por ejemplo, se pueden preparar otros compuestos de estructura (I) según métodos análogos usando el material de partida apropiado. El uso de grupos protectores según sea necesario y otras modificaciones del Esquema General de Reacción anterior serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no como limitación.
Ejemplo 1
Evaluación in vivo del ARNm de Luciferasa utilizando las
Composiciones de nanopartículas lípidas
Las nanopartículas lipídicas se prepararon y probaron según los procedimientos generales descritos en PCT Pub. Nos. WO 2015/199952 y WO 2017/004" 43 Brevemente, lípido catiónico.
Se solubilizaron DSPC, colesterol y PEG-lípido en etanol en una relación molar de aproximadamente 50:10:38.5:1.5 o aproximadamente 47.5:10:40.8:1.7. Se prepararon nanopartículas lipídicas (LNP) con una proporción en peso de lípidos totales a ARNm de aproximadamente 10:1 a 30:1. El ARNm se diluye a 0.2 mg/ml en tampón de citrato o acetato de 10 a 50 mM, pH 4. Se usaron bombas de jeringa para mezclar la solución lipídica etanólica con la solución acuosa de ARNm en una proporción de aproximadamente 1:5 a 1:3 (vol/vol) con caudales totales superiores a 15 ml/min. Luego se eliminó el etanol y el tampón externo se reemplazó con PBS mediante diálisis. Finalmente, las nanopartículas lipídicas se filtraron a través de un filtro estéril de poro de 0.2 pm. El tamaño de las partículas de nanopartículas lipídicas fue de aproximadamente 55 a 95 nm de diámetro y, en algunos casos, de aproximadamente 70 a 90 nm de diámetro, según se determinó mediante dispersión de luz cuasi elástica utilizando un Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, Reino Unido).
Los estudios se realizaron en ratones hembra C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (Charles River) o ratones CD-1 (Harlan) de 8 a 10 semanas de edad (Charles River) de acuerdo con las pautas establecidas por un comité institucional de cuidado de animales (ACC) y el Consejo Canadiense de Cuidado Animal (CCAC). Se administraron sistémicamente dosis variables de nanopartículas lipídicas de ARNm mediante inyección en la vena de la cola y los animales fueron sacrificados en un momento específico (por ejemplo, 4 horas) después de la administración. El hígado y el bazo se recogieron en tubos previamente pesados, se determinaron los pesos, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su procesamiento para su análisis.
Para el hígado, se diseccionaron aproximadamente 50 mg para análisis en tubos FastPrep de 2 ml (MP Biomedicals, Solon OH). Se añade una esfera cerámica de 1/4" (MP Biomedicals) a cada tubo y se añaden 500 pl de tampón de lisis Glo - GLB (Promega, Madison WI) equilibrado a temperatura ambiente al tejido hepático. Los tejidos hepáticos se homogeneizaron con el instrumento FastPrep24 (MP Biomedicals) a 2 x 6.0 m/s durante 15 segundos. El homogeneizado se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de una dilución 1:4 en GLB y se evaluó utilizando el sistema de ensayo SteadyGlo Luciferase (Promega).
Específicamente, se hicieron reaccionar 50 pl de homogeneizado de tejido diluido con 50 pl de sustrato SteadyGlo, se agitó durante 10 segundos seguido de una incubación de 5 minutos y luego se cuantificó utilizando un luminómetro CentroXS3 LB 960 (Berthold Technologies, Alemania). La cantidad de proteína analizada se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford IL). Luego se normalizaron las unidades de luminiscencia relativas (RLU) a los pg totales de proteína analizada. Para convertir RLU en ng de luciferasa, se generó una curva estándar con QuantiLum Recombinant Luciferase (Promega).
El ARNm de FLuc (L-6107 o L-7202) de Trilink Biotechnologies expresará una proteína luciferasa, originalmente aislada de la luciérnagaphotinus pyralis.FLuc se usa comúnmente en cultivos de células de mamíferos para medir tanto la expresión genética como la viabilidad celular. Emite bioluminiscencia en presencia del sustrato, luciferina. Este ARNm con caperuza y poliadenilado estaba completamente sustituido con respecto a los nucleósidos de uridina y/o citidina.
Ejemplo 2
Determinación del pKa de lípidos formulados
Como se describe en otra parte, el pKa de los lípidos catiónicos formulados es correlacionado con la eficacia de las LNP para la administración de ácidos nucleicos (ver Jayaraman et al,Angewandte Chemie, International Edition(2012), 51(34), 8529-8533; Semple et al,Nature Biotechnology28, 172-176 (2010)). El rango preferido de pKa es de ~5 a ~7. El pKa de cada lípido catiónico se determinó en nanopartículas lipídicas mediante un ensayo basado en la fluorescencia del ácido 2-(p-toluidino)-6-naftalenosulfónico (TNS). Se prepararon nanopartículas que comprendían lípido catiónico/DSPC/colesterol/PEG-lípido (50/10/38,5/1,5 mol%) en PBS a una concentración de lípido total de 0.4 mM usando el proceso en línea como se describe en el Ejemplo 1. Se preparó TNS como una solución madre de 100 pM en agua destilada. Las vesículas se diluyeron hasta lípidos de 24 pM en 2 ml de soluciones tamponadas que contenían HEPES 10 mM, MES 10 mM, acetato de amonio 10 mM, NaCl 130 mM, donde el pH osciló entre 2.5 y 11. Se añadió una alícuota de la solución de TNS para dar una concentración final de 1 pM y después de mezclar con vórtice se midió la intensidad de la fluorescencia a temperatura ambiente en un espectrofotómetro de luminiscencia SLM Aminco Serie 2 usando longitudes de onda de excitación y emisión de 321 nm y 445 nm. Se aplicó un análisis de mejor ajuste sigmoideo a los datos de fluorescencia y se determinó el pKa medido como el pH que da lugar a la mitad de la intensidad de fluorescencia máxima.
Ejemplo 3
Determinación de la eficacia de formulaciones de nanopartículas lípidas
Que contienen varios lípidos catiónicos utilizando un modelo in vivo
de roedor de expresión de ARNm de luciferasa
Los lípidos catiónicos que se muestran en la Tabla 2 se han probado previamente con ácidos nucleicos. Para fines comparativos, estos lípidos también se usaron para formular nanopartículas lipídicas que contienen el ARNm de FLuc (L-6107) usando un método de mezcla en línea, como descrito en el Ejemplo 1 y en PCT/US10/22614.
Las nanopartículas lipídicas se formularon utilizando la siguiente relación molar: 50% de lípido catiónico/10% de distearoilfosfatidilcolina (DSPC)/38.5% de colesterol/1.5% de lípido PEG ("PEG-DMG", es decir, 1-(monometoxipolietilenglicol)-2,3-dimiristoilglicerol, con un peso molecular medio de PEG de 2000). En realizaciones alternativas, el lípido catiónico, DSPC, colesterol y PEG-lípido se formulan en una relación molar de aproximadamente 47.5:10:40.8:1.7. La actividad relativa se determinó midiendo la expresión de luciferasa en el hígado 4 horas después de la administración mediante inyección en la vena de la cola como se describe en el Ejemplo 1. La actividad se comparó con una dosis de 0.3 y 1.0 mg de ARNm/kg y se expresó como ng de luciferasa/g de hígado medido 4 horas después de la administración, como se describe en el Ejemplo 1.
Tabla 2. Lípidos comparadores que muestran actividad con ARNm
Se formularon compuestos representativos de la divulgación mostrada en la Tabla 3 usando la siguiente relación molar: 50% de lípido catiónico/10% de distearoilfosfatidilcolina (DSPC)/38.5% de colesterol/1.5% de lípido PEG ("PEG-DMA" 2-[2-(u>)-metoxi(poliet¡lengl¡col2ooo) etoxi]-N,N-ditetradecilacetamida) o 47.5 % de lípido catiónico/10% de Ds PC/40.7% de colesterol/1.8% de lípido de PEG. La actividad relativa se determinó midiendo la expresión de luciferasa en el hígado 4 horas después de la administración a través de inyección en la vena de la cola como se describe en el Ejemplo 1. La actividad se comparó a una dosis de 0.5 mg de ARNm/kg y se expresó como ng de luciferasa/g de hígado medida 4 horas después de la administración, como se describe en el Ejemplo 1. Los números de los compuestos en la Tabla 3 se refieren a los números de los compuestos de la Tabla 1.
Tabla 3. Nuevos lípidos catiónicos y actividad asociada
Ejemplo 4
Síntesis de 10-(N-decil-5-(dimetilamino) pentanamidononadecanedioato de bis(2-butiloctil) (Compuesto I-7)
Compound I-7
Synthesis of Compound 4-2
Se agitó una solución de la cetona 4-1 (1.10 g, 1.62 mmol) y 1-decilamina (2.43 mmol, 382 mg, 0.486 ml) en DCE (10 ml) a temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido de la adición de triacetoxiborohidruro de sodio (2.43 mmol, 515 mg) y ácido acético (2.43 mmol, 146 mg, 0.138 ml). Después de agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 2 días, se concentró la mezcla de reacción. El residuo se diluyó con una mezcla de hexanos y se lavó con NaOH diluido, NaHCO<3>saturado y salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato sódico y se concentró (aceite incoloro, 1.41 g). El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc/Et<3>N, 95:5:0 a 80:20:1). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (863 mg de aceite incoloro, 1.05 mmol, rendimiento del 65%). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 6: 3.98 (d, 5.8 Hz, 4H), 2.54 (t, 7.1 Hz, 2H), 2.43 (tipo quinteto, 5.5 Hz, 1H), 2.30 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.68-1.57 (m, 6H), 1.50-1.41 (m, 2H), 1.41-1.08 (70H), 0.92-0.86 (m, 15H), 0.86-0.77 (br. 1H).
Síntesis del compuesto 4-3
A una solución agitada de ácido 5-bromovalérico (1.12 mmol, 204 mg) en CH<2>Ch (1 ml) a temperatura ambiente se le añadió una solución de cloruro de tionilo (3.36 mmol, 400 mg, 0.25 ml) en CH<2>Ch (5 ml) en un período de 1 minuto, seguido de la adición de DMF (aproximadamente 16 mg). Luego se calentó la mezcla a reflujo durante 2 horas.
Después la mezcla de reacción se concentró al vacío. El cloruro de ácido se utilizó directamente para el siguiente paso.
Se añadió gota a gota una solución del cloruro de 5-bromopentanoilo anterior en benceno (5 ml) a una solución de 4 2 (230 mg, 0.28 mmol) y trietilamina (5.6 mmol, 565 mg, 0.780 ml) y DMAP (5 mg) en benceno (5 ml) a temperatura ambiente en 2 minutos. Después de la adición, la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió metanol (1 ml) y la mezcla se agitó durante 2 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 98:2 a 85:15). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (250 mg, 0.25 mmol, 91%, aceite incoloro).
Síntesis del compuesto I-7
A 4-2 (250 mg, 0.25 mmol) se le añadió dimetilamina (2 M en THF, 10 ml). La solución se agitó a 64°C durante la noche. La mezcla de reacción se concentró. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una capa de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite de color marrón (aproximadamente 233 mg). El producto bruto (233 mg) se purificó mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 6% de metanol en cloroformo). El producto deseado se obtuvo como (194 mg, aceite incoloro, 0.20 mmol, 82%). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 6: 4.60-4.20 (br, estimado 0.3H, debido a la isomerización lenta sobre el enlace amida), 3.97, 3.96 (2 conjuntos de dobletes, 5.8 Hz, 4H), 3.60 (tipo quinteto, 7.0 Hz, 0.7 H), 3.06-2.99 (m, 2 H), 2.34-2.24 (m, 8 H), 2.21 (singlete, 6 H), 1.72-1.56 (m, 8 H), 1.56-1.37 (m, 8 H), 1.37-1.10 (66H), 0.91-0.85 (m, 15H).
Ejemplo 5
Síntesis de bis (2-butiloctil) 10-(N-decil-4-(dimetilamino)butanamido)nonadecanodioato
(COMPUESTO I-18)
Compuesto I-18
Síntesis del Compuesto I-18 (Método A)
A una solución agitada de clorhidrato de ácido 4-(dimetilamino)butírico (1.12 mmol, 188 mg) y DMF (10-20 pl) en CH<2>Cl<2>(10 ml) a temperatura ambiente se le añadió cloruro de oxalilo (5.6 mmol, 722 mg, 0.496 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción (rojo intenso) se concentró a presión reducida. El cloruro de ácido resultante (sólido rojo ladrillo) se usó directamente para el siguiente paso.
Se añadió gota a gota una solución del cloruro de acilo anterior en CH<2>CI<2>(10 ml) a una solución de 4-2 (230 mg, 0.28 mmol) y trietilamina (5.6 mmol, 565 mg, 0.780 j l) y DMAP (5 mg) en CH<2>Ch (5 ml) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se concentró a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtoAc/Et<3>N, de 80:20:0.1 a 75:25:1) y se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna de secado rápido sobre gel de sílice (0 a 5% de metanol en cloroformo). El producto deseado se obtuvo como (92 mg, aceite incoloro, 0.10 mmol, 35%). RMN 1H (400 MHz, CDCh)S:4.57-4.29 (br. 0.4H), 3.97, 3.96 (2 juegos de dobletes, 5.8 Hz, 5.8 Hz, 4H), 3.63 (tipo quinteto, 6.8 Hz, 0.6H), 3.06-3.00 (m, 2H), 2.35-2.26 (m, 8H), 2.213, 2.211 (2 series de singletes, 6H), 1.82 (tipo sexteto, 7.6 Hz, 2H), 1.65 1.56 (m, 6H), 1.54-1.48 (m, 2H), 1.47-1.37 (m, 4H), 1.36-1.06 (66H), 0.91-0.86 (m, 15H).
Síntesis del Compuesto I-18 (Método B)
A una solución de clorhidrato de ácido 4-dimetilaminobutírico (2 equiv, 3.04 mmol, 510 mg) y 4-dimetilaminopiridina (3 equiv, DMAP, 4.56 mmol, 557 mg) en acetonitrilo (30 ml) se le añadió DCC (2.2 equiv, 3.34 mmol, 690 mg) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 45 min. Se añadió una solución de 4-2 (1.25 g, 1.52 mmol) en C ^ C h (6 ml) y la mezcla resultante se agitó durante la noche. Al día siguiente, se añadió más DCC (450 mg) y la mezcla se agitó durante otro día.
Luego la mezcla se concentró bajo presión reductora. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una columna corta de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite incoloro. El producto se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 5% de metanol en cloroformo con una traza de Et<3>N). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (1.14 g, 81%).
Ejemplo 6
Síntesis de bis(N-decil-5-(dietilamino)pentanamido)nonadecanedioato de bis(2-butiloctil)
(Compuesto I-8)
Compuesto I-8
Síntesis del compuesto I-8
Se selló una mezcla de 4-3 (179 mg, 0,18 mmol), dietilamina (0,90 mmol, 66 mg, 0,093 ml), N,N-diisopropiletilamina (0,36 mmol, 46 mg, 0,063 ml) en acetonitrilo (6 ml) y Se calentó a 83°C durante 24 horas. La mezcla de reacción se concentró. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una capa de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite de color marrón (153 mg). El producto bruto (233 mg) se purificó mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 6% de MeOH en cloroformo). El producto deseado se obtuvo como (136 mg, aceite incoloro, 0.14 mmol, 77%).
Ejemplo 7
Síntesis de bis(2-butiloctil) 10-(N-decil-5-(Pirrolidina-I -il)pentanamido)nonadecanedioate
(Compuesto I-9)
Compuesto I-9
Síntesis del compuesto I-9
Se selló una mezcla de 4-3 (200 mg, 0.20 mmol), pirrolidina (50 eq. 0.83 ml, 10 mmol) en THE (10 ml) y se calentó a 64 °C durante 24 horas. La mezcla de reacción se concentró. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una capa de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite de color marrón. El producto bruto (233 mg) se purificó mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 6% de MeOH en cloroformo). El producto deseado se obtuvo como (158 mg, aceite incoloro, 0.16 mmol, 80%).
Ejemplo 8
Síntesis de bis(2-hexildecil) 7-(N-decil-4-(dimetilamino)butanamido)tridecanediodato
(Compuesto I-16)
Compuesto I-16
Síntesis de 8-2
Una solución de 8-1 (1 eq., 1.15 g, 1.62 mmol) y 1-decilamina (1.5 eq, 2.43 mmol, 382 mg, 0.486 ml) en DCE (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 min. A la solución se le añadió triacetoxiborohidmro de sodio (1.5 eq., 2.43 mmol, 515 mg) y AcOH (1.5 eq., 2.43 mmol, 146 mg, 0.14 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. Luego se concentró la mezcla de reacción. El residuo se diluyó con hexanos/EtOAc (99:1) y se lavó con solución diluida de NaOH, NaHCO<3>saturado y salmuera. El extracto orgánico se secó sobre sulfato de sodio y se vertió sobre una columna corta de gel de sílice. La columna se eluyó con una mezcla de hexano, EtOAc y Et<3>N (95:5:0 a 80:20:1). Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y concentraron. El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (1.28 g, 1.51 mmol, 93%). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 6: 3.97 (d, 5.8 Hz, 4H), 2.53 (t, 7.2 Hz, 2H), 2.43 (tipo quinteto, 5.5 Hz, 1H), 2.30 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.68-1.57 (m, 6H), 1.49-1.40 (m, 2H), 1.40-1.08 (74H), 0.91-0.85 (m, 15H), 0.83-0.74 (br. 1H).
Compuesto de síntesis I-16
A una solución agitada de clorhidrato de ácido 4-(dimetilamino)butírico (2.1 mmol, 352 mg) y DMF (aproximadamente 13 mg) en CH<2>Ch (15 ml) a temperatura ambiente se añadió cloruro de oxalilo (3 eq, 6.3 mmol, 800 mg , 0.55 ml) bajo Ar. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción (solución de color naranja claro) se concentró al vacío. El cloruro de ácido resultante (8-3, sólido de color marrón claro) se usó directamente para la siguiente reacción.
Se añadió una solución del cloruro de acilo anterior en CH<2>Ch (10 ml) a una solución de 8-2 (300 mg, 0.35 mmol) y trietilamina (10.5 mmol, 1.06 g, 1.5 ml) y DMAP (5 mg) en CH<2>Ch (5 ml) a temperatura ambiente. Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después de concentrar la mezcla, el producto se aisló mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano, EtOAc y Et<3>N, de 80:20:0.1 a 70:30:1) y el producto se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna de secado rápido sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo). El producto deseado se obtuvo como un aceite ligeramente amarillo (110 mg, 0.11 mmol, 32%). RMN 1H (400 MHz, CDCh a 7.26 ppm) 6: 4.57-4.34 (br. 0.4H), 3.98-3.94 (m, 4H), 3.64 (tipo quinteto, 6.8 Hz, 0.6H), 3.06-3.00 (m, 2H), 2.35-2.25 (m, 8H), 2.213, 2.210 (2 series de singletes, 6H), 1.82 (tipo sexteto, 7.4 Hz, 2H), 1.65-1.56 (m, 6H), 1.54-1.48 (m, 2H), 1.48-1.37 (m, 4H), 1.37-1.06 (70H), 0.91-0.86 (m, 15H).
Ejemplo 9
Síntesis de bis(2-butiloctil) 10-(4-(dimetilamino)-N-(2-etilhexil)butanamido)nonadecanedioato
(Compuesto I-20)
Compuesto I-20
Síntesis de 9-2
Una solución de 9-1 (1 eq., 0.82 g, 1.21 mmol) y 2-etiM-hexNamina (1.5 eq., 1.81 mmol, 234 mg) en DCE<( 8>ml) se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 min. A la solución se le añadió triacetoxiborohidruro de sodio (1.5 eq., 1.81 mmol, 384 mg) y AcOH (1.5 eq., 1.81 mmol, 109 mg). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. Luego se concentró la mezcla de reacción. El residuo se diluyó con hexanos y EtOAc (aproximadamente 99:5) y se lavó con NaOH diluido, NaHCO<3>saturado y salmuera. El extracto se filtró a través de una columna corta de gel de sílice. La columna se lavó con una mezcla de hexano y EtOAc (95:5) y luego con una mezcla de hexanos, EtOAc y Et<3>N (80:20:0,5). El filtrado del último lavado se concentró hasta sequedad. Esto dio el producto puro en forma de un aceite incoloro<( 888>mg, 1.12 mmol, 93%). RNM 1H (400 MHz, CDCh)<6>: 3.98 (d, 5.8 Hz, 4H), 2.45 (d, 5.1 Hz, 2H), 2.39 (tipo quinteto, 5.5 Hz, 1H), 2.30 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.68-1.57 (m,<6>H), 1.41-1.08 (65H), 0.92-0.85 (m, 18H), 0.84-0.78 (br. 1H).
Síntesis de 9-4
A una solución agitada de ácido 5-bromovalérico (2.24 mmol, 405 mg) en CH<2>Ch (2 ml) a temperatura ambiente se le añadió lentamente una solución de cloruro de tionilo (3 eq. 6.72 mmol, 800 mg, 0.49 ml) en CH<2>Ch (5 ml) en un período de 1 min. Se añadió DMF (dos pequeñas gotas, aproximadamente 16 mg) a la mezcla de reacción. Luego la mezcla se calentó a reflujo durante 2 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío. El cloruro de ácido resultante, 9-3, se usó directamente para el siguiente paso.
Se añadió una solución del cloruro de 5-bromopentanoilo anterior en benceno<(8>ml) a una solución de 9-2 (444 mg, 0.56 mmol) y trietilamina (1.56 ml) y DMAP (5 mg) en benceno (5 ml) a TA en 2 min. Después de la adición, la mezcla se agitó a TA durante la noche. Después de la evaporación de los disolventes al vacío, el producto se aisló mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 99:1 a 90:10). El producto deseado era lo suficientemente puro para la siguiente etapa (aceite incoloro, 527 mg, 0.55 mmol, 98%).
Síntesis del compuesto I-20
A un matraz a presión que contenía 9-4 (260 mg, 0.27 mmol) se añadió dimetilamina (2 M en THF, 10 ml). La solución se agitó a 64°C (temperatura del baño de aceite) durante la noche. Se evaporó el exceso de amina y disolvente. El residuo se recogió en una mezcla de acetato de etilo y hexano (95:5) y se filtró a través de un lecho de gel de sílice. El lecho se lavó con una mezcla de hexano y EtOAc (95:5) y luego con una mezcla de hexanos EtOAc y Et<3>N (80:20:1). El filtrado del último lavado se concentró hasta sequedad. Esto dio el producto bruto en forma de un aceite marrón (233 mg). El producto bruto se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (204 mg, 0.22 mmol, 82%). RMN 1H (400 MHz, CDCh a 7.27 ppm)<6>: 3.97 (d, 5.8 Hz, 4H), 3.66-3.57 (m, aproximadamente 1H), 3.19 2.99 (2 series de picos, 2H), 2.38-2.24 (m,<8>H), 2.22 (sencillo,<6>H), 1.72-1.37 (m, 15H), 1.37-1.10 (60H), 0.91-0.85 (m, 18H).
Ejemplo 10
Síntesis de bis(2-butioctil) 10-(3-(dimetilamino)-N-nonilpropanamido)nonadecanedioato
(Compuesto I-25)
Compuesto I-25
Síntesis de 10-1
A una solución de ácido 3-bromopropiónico (2.02 mmol, 311 mg) en CH<2>CI<2>(5 ml) y DIVIF (0.01 ml) se le añadió cloruro de oxalilo (5.05 mmol, 641 mg, 0.44 ml) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Luego la mezcla se concentró al vacío. El líquido/sólido residual (amarillo) se disolvió en 10 ml de CH<2>Cl<2>y se añadió a una solución de 4-2 (833 mg, 1.02 mmol) y trietilamina (5.05 mmol, 0.7 ml) y DMAP (5 mg) en CH<2>Ch (10 ml) a temperatura ambiente en 4 min. Después de la adición, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Después de la evaporación de los disolventes al vacío, el producto se aisló mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano/EtOAc, 99:1 a 90:10). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (794 mg, 0.83 mmol, 81%).
Síntesis del compuesto I-25
Una mezcla de 10-1 (283 mg, 0.30 mmol) y dimetilamina (2 M en THF, 12 ml) en un matraz a presión se agitó a<68>°C (temperatura del baño de aceite) durante la noche. La mezcla de reacción se concentró. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una capa de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite de color marrón (302 mg). El producto bruto (302 mg) se purificó mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo con una traza de Et<3>N). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (169 mg, 0.18 mmol, 61%).
1H RMN (400 MHz, CDCh a<7>.<2 6>)<6>: 4.50-4.31 (br, estimado 0.3H, debido a la isomerización lenta sobre el enlace amida), 3.97 (doblete con hombros, 5.8 Hz, 4H), 3.60 (tipo quinteto, 7.0 Hz, 0.7H), 3.07-3.00 (m, 2H), 2.65 (tipo q, 7.6 Hz, 2H), 2.48 (tipo q, 7.6 Hz, 2H), 2.29 (triplete con hombros, 7.6 Hz, 4H), 2.26, 2.25 (2 series de singletes,<6>H), 1.66 1.56 (m,<6>H), 1.56-1.48 (m, 2H), 1.48-1.37 (m, 4H), 1.37-1.10 (<6 6>H), 0.91-0.85 (m, 15H).
Ejemplo 11
S ín te s is d e b is (2 -h e x ild e c il) 7 - (N -d e c il-4 - (p ir ro l id in -1 - i l) b u ta n a m id o ) t r id e c n e d io a to
(C o m p u e s to I-29 )
Compuesto I-29
Síntesis del 11-1
A una solución de ácido 4-bromobutírico (0.97 mmol, 161 mg) en CH<2>CI<2>(3 ml) y DMF (0.01 ml) se le añadió cloruro de oxalilo (3 eq, 2.91 mmol, 370 mg, 0.25 ml) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después la mezcla de reacción se concentró al vacío. El líquido/sólido residual (ligeramente amarillo) se disolvió en 5 ml de CH<2>Ch y se añadió una solución de 8-2 (410 mg, 0.48 mmol), trietilamina (0.4 ml) y DMAP (2 mg) en CH<2>Ch (20 ml) a temperatura ambiente en 2 min. Después de la adición, la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2.5 h. La TLC (hexano/acetato de etilo = 9:1) mostró dos puntos principales. Después la mezcla de reacción se concentró a temperatura ambiente bajo presión reducida. El residuo se usó para la siguiente reacción sin ninguna purificación.
Síntesis del compuesto I-29
El residuo anterior que contenía 11-1 se recogió en una mezcla de pirrolidina (2.10 ml, 25 mmol) y THE (15 ml). La mezcla se transfirió a un matraz a presión y se calentó a<6 8>°C durante la noche. La mezcla se enfrió y se concentró a presión reducida. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una columna corta de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite/sólido de color amarillo. El producto bruto (300 mg) se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (0% a 10% de MeOH y 0% a 0,5% de Et<3>N en C ^C h). El producto deseado se obtuvo como un aceite amarillo (215 mg). El producto (215 mg) se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna de secado rápido sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (162 mg, 0.16 mmol, 34%). 1H RMN (400 MHz, CDCla a 7.26 ppm)<6>: 4.57-4.34 (br. 0.4H), 3.98-3.94 (m, 4H), 3.64 (tipo quinteto,<6 .8>Hz, 0.6H), 3.06-3.00 (m, 2H), 2.51-2.44 (m,<6>H), 2.37-2.21(m,<6>H), 1.86 (tipo sexteto, 7.6 Hz, 2H), 1.80 1.71 (m, 4H), 1.65-1.48 (m,<8>H), 1.48-1.37 (m, 4H), 1.37-1.06 (70H), 0.91-0.86 (m, 15H).
Ejemplo 12
S ín te s is d e b is (2 -b u t ilo c t i l) 10 - (4 - (d im e t i la m in o ) -N - (2 -e t i lh e x il)b u ta n a m id d o )n o n a d e c a n e d io a to
(C o m p u e s to I-30 )
Compuesto I-30
Síntesis del compuesto I-30
A una solución de clorhidrato de ácido 4-dimetilaminobutírico (0.50 mmol, 85 mg) y 4-dimetilaminopiridina (3 equiv., DMAP, 0.75 mmol, 92 mg) en acetonitrilo (5 ml) se le añadió DCC (1.1 mmol x 2, 226 mg) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 45 min. Se añadió una solución de 9-2 (160 mg, 0.20 mmol) en CH<2>Ch (1 ml) a la mezcla de reacción y la mezcla resultante se agitó durante el fin de semana. Se añadió más DCC (135 mg) y se agitó durante otro día. No se observó ningún progreso según el análisis de TLC. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El residuo se recogió en una mezcla de hexanos y EtOAc (aproximadamente 99:5) y se filtró a través de una columna corta de gel de sílice. La columna se lavó con una mezcla de hexano y EtOAc (95:5) y luego con una mezcla de hexanos, EtOAc y Et<3>N (80:20:1). El filtrado del último lavado se concentró hasta sequedad (133 mg). El producto bruto (133 mg) se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo con una traza de Et<3>N). El producto deseado se obtuvo como (48 mg, aceite incoloro, 0.053 mmol, 27%). 1H RMN (400 MHz, CDCh a 7,27 ppm)<6>: 3.97 (d, 5.8 Hz, 4H), 3.70-3.60 (m, aproximadamente 1H), 3.19-2,99 (2 series de picos, 2H), 2.39-2.25 (m,<8>H), 2.22 (singlete,<6>H), 1.86-1.76 (m, 2H), 1.72-1.37 (m, aproximadamente 11H), 1.37-1.10 (60H), 0.91-0.85 (m, 18H).
Ejemplo 13
Síntesis de bis(2-butiloctil) 10-(N-decil-5-(dibutilamino)pentanamidononadecanedioato
(Compuesto I-31)
Compuesto I-31
Síntesis del compuesto I-31
Una mezcla de 4-3 (284 mg, 0.29 mmol), THE (10 ml), yoduro de sodio (5 mg) y dibutilamina (10 mmol, 1.29 g, 1.68 ml) en un matraz a presión se agitó a 78°C durante la noche. La mezcla de reacción se concentró. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una capa de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite de color marrón (el producto y la dibutilamina). El aceite se diluyó con hexano y se lavó con solución acuosa diluida de HCl (0.5 M) dos veces, NaHCO<3>saturado y salmuera y se secó con sulfato de sodio. El extracto se concentró a presión reducida. El producto bruto (309 mg) se purificó mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo con una traza de Et<3>N). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (216 mg, 0.21 mmol, 72%). 1H RMN (400 MHz, CDCh)<6>: 4.50-4.35 (br, estimado 0.3H, debido a la isomerización lenta sobre el enlace amida), 3.97, 3.96 (2 juegos de dobletes, 5.8 Hz, 4H), 3.61 (tipo quinteto, 7.0 Hz, 0.7 h), 3.07-2.99 (m, 2 h), 2.45-2.36 (m,<6>h), 2.34-2.27 (m,<6>h), 1.70-1.56 (m,<8>h), 1.56-1.36 (m, 12 h), 1.37-1.10 (70 h), 0.97-0.85 (m, 21 h).
Ejemplo 14
Síntesis de 10-(4-(dimetilamino)-N-nonilbutanamido)nonadecano-1,19-diil bis(2-butiloctanoato)
(Compuesto I-32)
Compuesto I-32
Compuesto de síntesis I-32
A una solución de clorhidrato de ácido 4-dimetilaminobutírico (2 equiv, 1.08 mmol, 181 mg) y 4-dimetilaminopiridina (3 equiv, DMAP, 1.62 mmol, 198 mg) en acetonitrilo (10 ml) se le añadió DCC (2.2 equiv, 1.18 mmol, 245 mg) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 45 min. Luego se añadió una solución de 14-1 (442 mg, 0.54 mmol) en CH<2>Cl<2>(2 ml). La mezcla resultante se agitó durante la noche. Se añadió más DCC (140 mg) y la mezcla se agitó durante otro día. Después la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una columna corta de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite amarillo (381 mg). El producto bruto (381 mg) se purificó mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo con una traza de Et3N). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (345 mg, 0.38 mmol, 70%). 1H RMN (400 MHz, CDCl<3>a 7.26 ppm)<6>: 5.30-4.34 (br., 0.3H), 4.061,4.056 (dos conjuntos de tripletes, 6.7 Hz, 4H), 3.64 (tipo quinteto,<6 .8>Hz, 0.7H), 3.07-3.01 (m, 2H), 2.35-2.26 (m,<6>H), 2.214, 2.211 (dos series de singletes,<6>H), 1.82 (tipo sexteto, 7.6 Hz, 2H), 1.65-1.48 (m, 10H), 1.48-1.37 (m,<8>H), 1.37-1.02 (60H), 0.90-0.85 (m, 15H).
Ejemplo 15
Sintesis de bis-(2-butiloctil) 10-(N-decil-3-(pirrolidin-1-il)propanamido)nonadecanedioato
(Compuesto I-33)
Compuesto I-33
Síntesis del compuesto I-33
Se calentó a 64°C durante la noche una mezcla de 10-1 (283 mg, 0.30 mmol), pirrolidina (1.25 ml, 15 mmol) y THE (10 ml) en un tubo de presión. La mezcla se enfrió y se concentró a presión reducida. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una columna corta de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite amarillo. El producto bruto (314 mg) se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo con una traza de Et<3>N). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (113 mg, 0.12 mmol, 40%). 1H RNM (400 MHz, CDC13 a 7,26)<6>: 4.55-4.30 (br, estimado 0.3H, debido a la isomerización lenta sobre el enlace amida), 3.97 (doblete con hombros, 5.8 Hz, 4H), 3.61 (tipo quinteto, 7.0 Hz, 0.7H), 3.06-3.00 (tipo t, 2H), 2.81 (tipo q, 7.6 Hz, 2H), 2.58-2.51(m,<6>H), 2.292, 2.285 (2 conjuntos de tripletes, 7.5 Hz, 4H), 1.83-1.73 (m, 4H), 1.65-1.56 (m,<6>H), 1.56-1,48 (m, 2H), 1.48-1.37 (m, 4H), 1.37-1.10 (<6 6>H), 0.91-0.85 (m, 15H).
Ejemplo 16
Síntesis de bis(2-butiloctil) 10-(N-decil-5-(hexil(metil)amino)pentanamido)nonadecanedioato
(Compuesto I-34)
Compuesto I-34
Síntesis de 16-1
Una mezcla de 4-3 (200 mg, 0.20 mmol), hexilamina (20 mmol, 2 g), N,N-diisopropiletilamina (5 equiv., 1,0 mmol, 0.17 ml) y yoduro de sodio (10 mg) en acetonitrilo<( 6>ml) se selló y se calentó a 70°C durante 24 h. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida (aproximadamente 0.04 bar (30 mmHg)) de 75 a 85°C. La TLC mostró que se eliminó la mayor parte del exceso de hexilamina. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una columna corta de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite marrón (192 mg) que se usó para la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis del compuesto I-34
A una solución de 16-1 (192 mg, 0.19 mmol) en THE (5 ml) se le añadió una solución de formaldehído HCHO (500 mg, una solución al 37% en peso en agua) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó durante 30 min antes de introducir triacetoxiborohidruro de sodio (1.2 mmol, 243 mg). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró. El residuo se recogió en una mezcla de hexano y se lavó con solución diluida de NaOH, solución saturada de bicarbonato sódico y salmuera. Después de secar sobre sulfato de sodio, la solución se concentró hasta sequedad (aceite amarillo). El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una columna corta de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite amarillo (220 mg). El producto bruto (220 mg) se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo con una traza de Et<3>N). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (113 mg, 0.13 mmol, 69%). 1H RMN (400 MHz, CDCh a 7.26 ppm)<6>: 4.50-4.35 (br, estimado 0.3H, debido a la isomerización lenta sobre el enlace amida), 3.97, 3.96 (2 conjuntos de dobletes, 5.8 Hz, 4H), 3.60 (tipo quinteto, 7.0 Hz, 0.7H), 3.06-2.98 (m, 2H), 2.36-2.26 (m, 10H), 2.191, 2.189 (2 series de singletes, 3H), 1.70-1.56 (m,<8>H), 1.56 -1.36 (m, 10H), 1.37-1.10 (72H), 0.91-0.85 (m, 18H).
Ejemplo 17
S ín te s is d e b is (2 -h e x ild e c il) 7 - (N -d e c il-3 - (d im e t i la m in o )p ro p a n a m id o ) t r id e c a n e d io a to
(C o m p u e s to I-35 )
Síntesis del compuesto I-35
A una solución de clorhidrato de ácido 3-dimetilaminopropiónico (2 equiv, 0,62 mmol, 95 mg) y 4-dimetilaminopiridina (3 equiv, DMAP, 0.93 mmol, 114 mg) en acetonitrilo (10 ml) se le añadió DCC (2.2 equiv, 0.68 mmol, 141 mg) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 45 min. Se añadió una solución de 8-2 (262 mg, 0.31 mmol) en CH<2>Cl<2>(2 ml) y la mezcla resultante se agitó durante el fin de semana. La TLC (cloroformo/MeOH, 9:1) mostró una mancha importante en el frente del disolvente que podría ser el producto de eliminación, nada de material de partida y un poco de producto deseado. La mezcla de reacción se concentró. El posible producto de eliminación (107 mg de aceite incoloro) se aisló mediante cromatografía en columna (hexano-EtOAc, 95:5) y se trató con una solución de dimetilamina en THE (2 M, 9 ml) a temperatura ambiente durante 4 días. La mezcla se concentró. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una columna corta de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite amarillo. El producto bruto se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo con una traza de Et<3>N). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (62 mg). 1H RMN (400 MHz, CDCl<3>a 7.26)<6>: 4.50-4.36 (br, estimado 0.3H, debido a la isomerización lenta sobre el enlace amida), 3.97, 3.96 (dos conjuntos de dobletes, 5.8 Hz, 4H), 3.61 (tipo quinteto, 7.0 Hz, 0.7 H), 3.07-3.00 (m, 2 H), 2.65 (tipo q, 7.2 Hz, 2 H), 2.53-2.41 (m, 2 H), 2.31-2.26 (m, 4 H), 2.26, 2.25 (2 series de singletes,<6>H), 1.66-1.56 (m,<6>H), 1.56-1.48 (m, 2H), 1.48-1.37 (m, 4H), 1.37-1.10 (70H), 0.91-0.85 (m, 15H).
Ejemplo 18
S ín te s is d e b is (2 -h e x ild e c il) 7 - (3 - (d im e t i la m in o ) -N - (6 - ( (2 -e t i lh e x il)o x i) -6 -o x o h e x il)p ro p a n a m id o ) t r id e c a n e d io a to
(C O M P U E S T O I-36 )
Compuesto I-36
Síntesis de 18-2
A una solución de ácido 3-bromopropionílico (0.34 mmol, 52 mg) en CH<2>CI<2>(3 ml) y DIVIF (1 gota de una aguja fina) se le añadió cloruro de oxalilo (0.86 mmol, 109 mg, 74 ul) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Luego la mezcla se concentró a presión reducida durante 60 min a temperatura ambiente. El líquido/sólido residual (amarillo) se disolvió en 5 ml de CH<2>Ch y se añadió a una solución de 18-1 (160 mg, 0.17 mmol) y trietilamina (0.86 mmol, 0.12 ml) y DMAP (1 mg) en CH<2>Ch (5 ml) a temperatura ambiente en 1 min. Después de la adición, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 h y luego se concentró. El producto se aisló mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano, EtOAc y Et<3>N, de 95:5 a 85:15). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (99 mg, 0.09 mmol, 53%).
Síntesis del compuesto I-36
A un matraz a presión que contenía 18-2 (99 mg, 0.09 mmol) se añadió dimetilamina (2 M en THF, 5 ml). La solución se agitó a<68>°C (temperatura del baño de aceite) durante 2 días. La mezcla se enfrió y se concentró a presión reducida. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una columna corta de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite marrón (94 mg). El producto (94 mg) se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo con una traza de Et<3>N). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (71 mg, 0.069 mmol, 76%). 1H RMN (400 MHz, CDCh a 7.26)<6>: 4.53-4.35 (br, estimado 0.3H, debido a la isomerización lenta sobre el enlace amida), 4.02-3.93 (m,<6>H), 3.62 (tipo quinteto, 7.0 Hz, 0.7 H), 3.07-3.01 (m, 2H), 2.65 (tipo q, 7.6 Hz, 2H), 2.50-2.44 (m, 2H), 2.34-2.26 (m,<6>H), 2.26, 2.25 (2 series de singletes,<6>H), 1.69-1.56-1.48 (m, estimado 11H, superpuesto con el pico de agua), 1.49-1.37 (m, 4H), 1.37-1.10 (<6 6>H), 0.92-0.86 (m, 18H).
Ejemplo 19
S in te s is d e d i( tr id e c a n -7 - il) 10 - (N -d e c il-4 - (d im e t i la m in o )b u ta n a m id o )n o n a d e c a n e d io a to
(C o m p u e s to I-37 )
Compuesto I-37
Síntesis de 19-2
Una solución de 19-1 (1 eq., 0.493 g, 0.70 mmol) y 1-decilamina (1.5 eq, 1.05 mmol, 165 mg, 0.21 ml) en DCE (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 min. A la solución se le añadió triacetoxiborohidmro de sodio (1.5 eq., 1.05 mmol, 222 mg) y AcOH (1.5 eq., 1.05 mmol, 63 mg, 0.059 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. Luego se concentró la mezcla de reacción. El residuo se diluyó con hexanos y se lavó con NaOH diluido, NaHCO<3>saturado y salmuera. Después de secar el extracto orgánico sobre sulfato de sodio, se eliminó el disolvente a presión reducida. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una columna corta de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio el producto deseado en forma de un aceite incoloro (582 mg, 0.69 mmol, 98%). El producto se usó para el siguiente paso sin purificación adicional.
Síntesis del compuesto I-37
A una solución de clorhidrato de ácido 4-dimetilaminobutírico (1.71 mmol, 287 mg) y 4-dimetilaminopiridina (3 equiv., DMAP, 2.07 mmol, 253 mg) en acetonitrilo (15 ml) se le añadió DCC (2.2 equiv., 1.52 mmol, 313 mg) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 45 min. Se añadió una solución de 19-2 (582 mg, 0.69 mmol) en CH<2>Ch (3 ml) y la mezcla resultante se agitó durante la noche. Al día siguiente se añadió más DCC (200 mg) y se continuó la agitación durante el fin de semana (4 días). Después la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et<3>N (80:20:1) y se filtró a través de una columna corta de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite amarillo. El producto se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo con una traza de Et<3>N). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro.
Ejemplo 20
Síntesis de bis(2-hexildecil) 10-(N-decil-4-(dimetilamino)butanamido)nonadecanedioato
(Compuesto 1-38)
Una solución de la cetona 20-1 (0.92 g, 1.16 mmol) y 1-decilamina (2.03 mmol, 319 mg, 0.40 ml) en DCE<( 6>ml) se agitó a temperatura ambiente durante 15 min, seguido de la adición de triacetoxiborohidruro de sodio (2.03 mmol, 429 mg) y AcOH (2.03 mmol,<121>mg, 0.115 ml). Después de agitar la mezcla a temperatura ambiente durante<2>días, se concentró la mezcla de reacción. El residuo se diluyó con hexanos y se lavó con NaOH diluido, NaHCO<3>saturado y salmuera. La fase orgánica se separó y se secó sobre sulfato de sodio. El extracto se filtró a través de una columna corta de gel de sílice y la columna se lavó con una mezcla de hexano/EtOAc/Et3N (95:5:0 a 80:20:1). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (814 mg de aceite incoloro, 0,87 mmol, rendimiento del 75%).
Síntesis de la I-38
A una solución de clorhidrato de ácido 4-dimetilaminobutírico (2 equivalentes, 0.76 mmol, 127 mg), se añadió DCC (2.2 equivalentes, 0.84 mmol, 172 mg) de 4-dimetilaminopiridina (3 equivalentes, 1.14 mmol, 139 mg) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 45 min. Se añadió una solución de 20-2 (350 mg, 0.38 mmol) en DCM (1 ml) y la mezcla resultante se agitó durante la noche. Al día siguiente, se añadió más DCC (50 mg) y se agitó durante otro día. Después la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et3N (80:20:1) y se filtró a través de una columna corta de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite incoloro. El producto se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna seca ultrarrápida sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo con una traza de Et3N). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (260 mg).
Ejemplo 21
Sintesis de bis(2-hexildecil) 10-(N-decil-4-(pirrolidin-1-il)butanamido)nonadecanodiato
(Compuesto I-39)
Síntesis del 21-1
A una solución de ácido 4-bromobutírico (1.00 mmol, 167 mg) en DCM (3 ml) y DMF (una pequeña gota) se le añadió cloruro de oxalilo (3 eq, 3.00 mmol, 381 mg, 0.26 ml) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después la mezcla de reacción se concentró al vacío. El líquido/sólido residual (ligeramente amarillo) se disolvió en 5 ml de DCM y se añadió una solución de 20-2 (464 mg, 0.50 mmol) y trietilamina (0.42 ml) y DMAP (2 mg) en DCM (5 ml) a temperatura ambiente en 2 min. Después de la adición, la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2.5 h. La TLC (hexano/acetato de etilo = 9:1) mostró dos puntos principales. Después la mezcla de reacción se concentró a temperatura ambiente bajo presión reducida. El residuo se usó para la siguiente reacción sin ninguna purificación.
Síntesis de la I-39
El residuo anterior se recogió en una mezcla de pirrolidina (2.20 ml, 26 mmol) y THF (15 ml). La mezcla se transfirió a un matraz a presión y se calentó a<6 8>°C durante la noche. La mezcla se enfrió y se concentró a presión reducida. El residuo se recogió en una mezcla de hexano, acetato de etilo y Et3N (80:20:1) y se filtró a través de una columna corta de gel de sílice y se lavó con la misma mezcla de disolventes. La concentración del filtrado dio un aceite/sólido de color amarillo (359 mg). El producto bruto (359 mg) se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna de secado rápido sobre gel de sílice (0 a 5% de MeOH en cloroformo). El producto deseado se obtuvo como un aceite incoloro (165 mg).

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto que tiene la siguiente estructura (I):
    (I) o una sal, tautómero o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que: R1 es alquilo C<1>-C<24>opcionalmente sustituido o alquenilo C<2>-C<24>opcionalmente sustituido; R2 y R3 son cada uno de ellos alquilo C<1>-C<36>independientemente opcionalmente sustituido; R4 y R5 son cada uno de ellos alquilo C<1>-<06>independientemente opcionalmente sustituido, o R4 y R5 se unen, junto con el N al que están unidos, para formar un heterociclilo o heteroarilo; L1, L2 y L3 son cada uno de ellos independientemente alquileno C<1>-C<18>opcionalmente sustituido; G<1>es un enlace directo, -(CH<2>)nO(C=O)-, -(CH<2>)n(C=O)O-, o -(C=O)-; G<2>y G<3>son cada uno independientemente -(C=O)O- o -O(C=O)-; y n es un número entero mayor que<0>. 2. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene la siguiente estructura (IA):
    (IA) 3. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene la siguiente estructura (IB):
    (IB) 4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que R1 es: i) alquilo C<6>-C<18>o alquenilo C<14>-C<18>opcionalmente sustituido, preferiblemente en el que R1 es alquilo C8, alquilo Cg, alquilo C<10>, alquilo C<12>, alquilo C<14>, alquilo C<16>u alquenilo C<18>; ii) no ramificado; iii) ramificado; o iv) no sustituido. 5. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que G1 es un enlace directo, -(CH<2>)nO(C=O)-, o -(CH<2>)n(C=O)O-, preferiblemente en donde G1 es un enlace directo o -(CH2)n(C=O)O- y n es mayor que 1, más preferiblemente en donde G1 es -(CH<2>)n(C=O)O- y n es 5,<6>, 7,<8>, 9 o 10, lo más preferiblemente donde n es 7 u<8>. <6>. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que L1 es: i) alquileno C<1>-C<6>, preferiblemente alquileno C<2>, alquileno C<3>o alquileno C<4>; ii) no ramificado; o iii) no sustituido. 7. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que: i) R2 es alquilo C<8>-C<24>; ii) R3 es alquilo C<8>-C<24>; iii) R2 y R3 son ambos alquilo C<8>-C<24>, preferiblemente en donde R2 y R3 son cada uno independientemente alquilo C<11>, alquilo C<12>, alquilo C<13>, alquilo C<14>, alquilo C<15>, alquilo C<16>alquilo C<18>o alquilo C<20>; iv) R2 es ramificado; v) R3 es ramificado; vi) R2y R3 tienen cada uno independientemente una de las siguientes estructuras:
    donde: R6 y R7 son cada uno independientemente alquilo C<2>-C<12>, preferiblemente en donde R2 y R3 tienen cada uno independientemente una de las siguientes estructuras:
    <8>. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que: i) L2 y L3 son cada uno independientemente alquileno C<4>-C<10>, preferiblemente donde L2 y L3 son ambos alquileno C<5>, o ambos son alquileno C6, o ambos son alquileno C8 o ambos son alquileno Cg; ii) L2 no es ramificada; iii) L3 no es ramificado; iv) L2 no está sustituido; o v) L3 no está sustituido. 9. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que: i) R4 y R5 son cada uno independientemente alquilo C<1>-C<6>, preferiblemente R4 y R5 son ambos metilos o ambos son etilos o R4 es metilo y R5 es n-butilo; ii) R4 y R5 se unen, junto con el N al que están unidos, para formar un heterociclilo, preferiblemente en el que el heterociclilo es un heterociclilo de 5 miembros, más preferiblemente en el que el heterociclilo tiene la siguiente estructura:
    10. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto tiene una de las siguientes estructuras:
    ��
    11. Una composición que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y un agente terapéutico. 12. La composición de la reivindicación 11, en la que la composición comprende una nanopartícula lipídica. 13. La composición de la reivindicación 11 o 12 para uso como medicamento. 14. Una nanopartícula lipídica que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-10. 15. La nanopartícula lipídica de la reivindicación 14, que comprende, además: i) un agente terapéutico; o ii) un ácido nucleico, preferiblemente el ácido nucleico se selecciona entre ARN antisentido y mensajero.
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