ES2908677T3 - Composición, materiales particulados y métodos para fabricar materiales particulados - Google Patents

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Abstract

Una composición de suministro de fármaco que comprende: un material particulado que comprende nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas que tienen un tamaño entre 100 nm y 3000 nm, donde las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas comprenden un recubrimiento mesoporoso, cuya superficie externa presenta proyecciones, donde el tamaño de las proyecciones oscila entre 5 nm y 1000 nm, donde las proyecciones están separadas entre sí, y donde las proyecciones comprenden hebras o cilindros o fibras que se extienden hacia fuera del recubrimiento mesoporoso de las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas; las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas tienen una o más moléculas o compuestos activos en ellas, donde los compuestos se seleccionan entre: una proteína hidrofóbica, un fármaco hidrofóbico o un agente terapéutico hidrofóbico.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición, materiales particulados y métodos para fabricar materiales particulados
La presente invención se refiere a materiales particulados que se pueden utilizar en composiciones de acuerdo con aspectos de la invención reclamada.
Antecedentes de la invención
Australia es uno de los mayores y más exitosos productores de ganado comercial del mundo, que contribuye en un ~1% al producto interno bruto (PIB) australiano. La exportación de carne roja y ganado aportó un valor total de ~ 16 mil millones de dólares en 2012 - 2013. Sin embargo, las plagas de artrópodos suponen una grave amenaza para el sector. Se calcula que las garrapatas cuestan al sector ganadero entre 170 y 200 millones de dólares al año. Además, las infestaciones por el mosquito del búfalo y los piojos de ovejas han provocado pérdidas millonarias debido al coste de aplicación de las estrategias de control y a la pérdida de productividad. El coste elevado del tratamiento de los ectoparásitos se debe principalmente a las elevadas dosis y a los repetidos tratamientos de los compuestos activos necesarios para lograr la eficacia. Además, muchos de los plaguicidas que se utilizan en la actualidad tienen una toxicidad alta, efectos medioambientales negativos y riesgos potenciales para la salud humana y la seguridad alimentaria. Las plagas de artrópodos son igualmente amenazantes para los cultivos vegetales como los cereales, las hortalizas y las frutas.
Spinosad es un plaguicida de origen natural con impacto ambiental bajo y toxicidad baja para los mamíferos. Sin embargo, su uso está actualmente limitado en parte por su inestabilidad ante los rayos UV, que reduce su potencia, su baja solubilidad en agua y su hidrofobicidad, lo que dificulta su formulación en sistemas acuosos y su coste mayor en relación con los pesticidas químicos convencionales. Spinosad está actualmente registrado para su uso en el ganado ovino para tratar las infestaciones de piojos y mosquitos, pero su potencia reducida y duración de la eficacia contra los ectoparásitos del ganado ha impedido su registro como tratamiento para el mosquito del búfalo y la garrapata de ganado. Asimismo, estos inconvenientes han limitado el uso de Spinosad en aplicaciones de protección de cultivos en las que se suelen utilizar formulaciones acuosas y los pesticidas que residen en las superficies de las plantas después de su aplicación requieren estabilidad frente a los rayos UV.
Muchos otros compuestos que se utilizan como insecticidas o pesticidas también son hidrofóbicos. Como resultado, si se va a utilizar una composición a base de agua para la aplicación de esos pesticidas insecticidas, normalmente se requerirá una suspensión o emulsión. Las suspensiones o emulsiones pueden sufrir de una corta vida útil, debido a la tendencia a separarse en capas distintas. La aplicación por pulverización también puede ser difícil por la misma razón. También hay dificultades si los compuestos son sensibles a la luz o a la luz ultravioleta. En dichas circunstancias, los compuestos pueden tener un corto período de eficacia tras la aplicación debido a que el compuesto se descompone cuando se expone a la luz solar.
Otros compuestos hidrofóbicos tienen efectos beneficiosos cuando se utilizan en sistemas biológicos. Estos compuestos pueden incluir compuestos que tengan un efecto terapéutico en un animal o en un ser humano (como un antibiótico, un fármaco contra el cáncer u otro medicamento para tratar una enfermedad), proteínas y colorantes para su uso como agentes marcadores. La administración de estos agentes a los sistemas biológicos puede ser difícil.
En los sistemas biológicos, las interacciones hidrofóbicas se suelen considerar las más fuertes de todas las interacciones no covalentes de largo alcance. La interacción hidrofóbica es beneficiosa para la adsorción de biomoléculas, mejorando la interacción con las membranas celulares y aumentando la absorción de las nanopartículas para la administración celular, así como para adaptar la tasa de liberación de los fármacos. Para generar nanopartículas con propiedades hidrofóbicas, la elección de la composición hidrofóbica o la funcionalización son algunos de los enfoques convenientes. Los materiales hidrofóbicos, como los nanotubos de carbono (CNT por sus siglas en inglés), han demostrado ser muy prometedores como vehículos a nanoescala para la administración de fármacos; sin embargo, una de las principales preocupaciones es el hecho de que los CNT podrían ser peligrosos para el medio ambiente y la salud humana, lo que requiere una mayor funcionalización de la superficie para reducir su toxicidad intrínseca. Se han utilizado motivos hidrofóbicos, como los alcanotioles y las cadenas de alquilos, para modificar las superficies de varias nanopartículas, como las de oro y sílice, con el fin de mejorar la carga de fármacos/proteínas hidrofóbicas y mejorar el rendimiento de la administración celular. Sin embargo, los grupos hidrofóbicos injertados químicamente tienden a causar una toxicidad no deseada y el bloqueo de los poros de los nanotransportadores. Por lo tanto, es un reto diseñar un sistema de nanotransportador hidrofóbico seguro y eficiente empleando un enfoque alternativo.
Además de las dificultades encontradas en la formulación de agentes hidrofóbicos, muchas moléculas activas, aparte del Spinosad, que se utilizan como medicamentos, insecticidas o de otro modo, tienen una vida activa limitada en el campo debido a la degradación por los rayos UV. Este es especialmente el caso de las moléculas activas que se aplican por vía tópica y, por lo tanto, tienen más probabilidades de estar expuestas a la luz UV, incluidas las formulaciones tópicas utilizadas para los seres humanos y los animales y las utilizadas en la protección de los cultivos. La capacidad de formular estas moléculas activas en un sistema portador de protección UV podría permitir una mayor duración de la eficacia.
Por supuesto, no tiene mucho valor ampliar la duración de la acción de una molécula activa protegiéndola contra la luz ultravioleta si otros factores, como el lavado de la molécula activa desde el lugar de acción, se producen antes de que la molécula activa pueda hacer pleno efecto. En muchas aplicaciones, incluida la aplicación tópica de moléculas activas y en la protección de cultivos, el lavado de las moléculas activas por la lluvia, la abrasión del viento y otras fuerzas erosivas puede reducir significativamente la eficacia y la duración de la acción de una molécula activa.
En la terapia génica se han demostrado notables beneficios terapéuticos en el tratamiento de enfermedades causadas por trastornos genéticos, donde la eficacia de los vehículos de entrega es la clave para introducir los ácidos nucleicos en las células para lograr sus funciones. La vacunación con ADN es una de las formas más recientes de tratamiento, en la que un plásmido de ADN (p-ADN) que codifica un antígeno de interés se introduce en las células para inducir una inmunidad específica al antígeno. En este caso, en lugar de inyectar al paciente un antígeno vacunal, como se hace habitualmente en los casos de vacunación con vacunas de subunidades, se inyectan a los pacientes moléculas de p-ADN que proporcionan a las células del organismo el código para producir el antígeno in vivo, permitiendo así que el cuerpo produzca su propio antígeno. También están surgiendo estrategias de vacunación que utilizan otras formas de ácido nucleico, como el ARN mensajero (ARNm).
La administración eficaz del p-ADN en las células diana ha sido un reto importante para este prometedor enfoque. Las vacunas de ADN son candidatas a vacunas prometedoras, ya que son muy específicas, seguras y bien toleradas y relativamente baratas de fabricar. Sin embargo, la inmunogenicidad deficiente es un problema importante y una causa significativa de esto es la incapacidad del p-ADN para ser administrado de manera efectiva en el núcleo de la célula para que el ADN pueda ser incorporado para luego producir el antígeno de la vacuna. La administración ineficaz del p-ADN está causada por tres factores principales, todos combinados significan que sólo una pequeña proporción del p-ADN inyectado en el cuerpo llega realmente al núcleo de la célula para permitir la producción de antígenos de la vacuna:
1. Descomposición del p-ADN por las nucleasas después de la inyección o el suministro en el cuerpo y antes de que el p-ADN entre en la célula
2. Incapacidad de ser transportado eficientemente a través de la membrana celular hacia la célula
3. Incapacidad de entrar eficazmente en el núcleo celular una vez dentro de la célula
La administración de p-ADN mediante sistemas de administración virales (uno de los primeros sistemas de administración investigados) demostró ser eficaz en la administración de p-ADN a la célula, aunque los problemas de toxicidad han reducido la promesa de estos primeros candidatos a sistemas de administración. Desde entonces, las microesferas de polímero y los liposomas catiónicos han surgido como dos nuevas y prometedoras tecnologías de administración, aunque probablemente ninguna de ellas sea lo suficientemente buena como para permitir que las vacunas de ADN se adopten ampliamente.
Los liposomas catiónicos son capaces de cargar cantidades razonables de p-ADN y la carga es fácil, por lo que el p-ADN no se daña durante el proceso. La protección contra las nucleasas es buena, ya que el p-ADN puede quedar encapsulado dentro del liposoma. Sin embargo, los liposomas son partículas blandas, por lo que no son muy estables in vivo. La toxicidad también es motivo de gran preocupación. Las micropartículas de polímero también se utilizan como portadoras de p-ADN. Los polímeros suelen ser más rígidos que los liposomas, por lo que no tienen tendencia a degradarse mecánicamente in vivo. Las micropartículas poliméricas también proporcionan una buena protección para el p-ADN contra las nucleasas. Sin embargo, los principales polímeros que se han propuesto (ácido poliláctico y poli(ácido láctico-coglicólico)) forman partículas hidrofóbicas y están cargadas negativamente, por lo que pueden no encapsular adecuadamente el p-ADN. Además, los métodos de carga suelen ser bastante duros, lo que puede dañar el p-ADN durante el procesamiento. La eficacia de la transfección tiende a ser baja. Se ha demostrado que la polietilenimina (PEI) permite una mayor eficiencia de transfección, pero estos polímeros pueden ser extremadamente citotóxicos. La comprensión de la estructura de bucle única de las moléculas de p-ADN y el diseño racional de vehículos avanzados de entrega de p-ADN es muy deseable para las estrategias de terapia génica y vacunación de ADN eficientes.
Meng Wang et al. (J. Mater. Chem. A, 2013, 1, 11465-11472) describe la aplicación de microesferas de sílice adaptadas en revestimientos. Shuping Xu et al. (ACS Applied Materials & Interfaces, 2011, 3, 1865-1872) describe un aumento de la superficie de las nanopartículas de sílice que tienen una superficie rugosa.
Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a composiciones de suministro de fármaco como se define en las reivindicaciones 1 a 9 y una composición que comprende un material particulado como se define en las reivindicaciones 10 y 11.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición de suministro de fármaco que comprende: un material particulado que comprende nanopartículas huecas mesoporosas rugosas, que tienen un tamaño desde 100 nm hasta 3000 nm;
donde las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas comprenden un recubrimiento mesoporoso, cuya superficie externa tiene proyecciones en las mismas, donde el tamaño de las proyecciones oscila entre 5 nm y 1000 nm, donde las proyecciones están espaciadas entre sí , y donde las proyecciones comprenden hebras o cilindros o fibras que se extienden hacia fuera desde el recubrimiento mesoporoso de las nanopartículas de sílice hueca mesoporosa rugosa; las nanopartículas de sílice hueca mesoporosa rugosa tienen una o más moléculas o compuestos activos en ellas, donde los compuestos se seleccionan entre: una proteína hidrofóbica, un fármaco hidrofóbico o un agente terapéutico hidrofóbico.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un material particulado que comprende nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas que tienen un tamaño de 100 nm a 3000 nm; donde las nanopartículas de sílice hueca mesoporosa rugosa comprenden un recubrimiento mesoporoso, cuya superficie externa tiene proyecciones en la misma, donde el tamaño de las proyecciones oscila entre 5 nm y 1000 nm, donde las proyecciones están espaciadas entre sí, y donde las proyecciones comprenden hebras o cilindros o fibras que se extienden hacia fuera del recubrimiento mesoporoso de las nanopartículas de sílice hueca mesoporosa rugosa; donde las nanopartículas de sílice hueca mesoporosa rugosa está recubiertas, al menos parcialmente, con ácidos nucleicos.
Las nanopartículas huecas mesoporosas rugosas se definen como partículas o esferas huecas con un recubrimiento mesoporoso, cuya superficie externa tiene proyecciones, las cuales tienen tamaños más pequeños que el tamaño de la partícula. El tamaño de la partícula oscila entre 100 nm y 3000 nm, el tamaño de las proyecciones oscila entre 5 nm y 1000 nm, preferentemente entre 100nm y 500nm.
Las nanopartículas huecas mesoporosas rugosas comprenden nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas.
En una realización, las partículas están hechas de un material que normalmente es hidrofílico pero las partículas demuestran características hidrofóbicas.
Las nanopartículas de sílice hueca mesoporosa rugosa normalmente tendrán un núcleo hueco que está rodeado por un recubrimiento que tiene una estructura mesoporosa. Como el recubrimiento que rodea y define el núcleo hueco es poroso, los compuestos pueden pasar a través de los poros y entrar en el núcleo hueco. En el exterior del recubrimiento hay salientes presentes, lo que proporciona una superficie rugosa a las partículas. Aunque el material del que proceden las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas puede normalmente ser un material hidrofílico, la superficie rugosa hace que las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas presenten propiedades hidrofóbicas, permitiendo de este modo o incluso potenciando el movimiento de los compuestos hidrofóbicos hacia el núcleo hueco.
Las nanopartículas de sílice hueca mesoporosa rugosa tendrán normalmente un núcleo hueco con un diámetro de 100nm a 1000nm, o de 100nm a 700nm. El núcleo hueco estará definido por un recubrimiento de sílice que tiene una estructura mesoporosa. El recubrimiento (el recubrimiento de sílice) tendrá normalmente una estructura de poros que incluye poros en el rango de 2 nm a 20 nm. Como el recubrimiento que rodea y define el núcleo hueco es porosa, los compuestos pueden pasar a través de los poros y entrar en el núcleo hueco. El recubrimiento que rodea el núcleo hueco puede tener un grosor de entre 10 nm y 100 nm. Las nanopartículas de sílice hueca mesoporosa rugosa incluyen proyecciones o excrecencias en la superficie, espaciadas entre sí. Las proyecciones o excrecencias espaciadas proporcionan rugosidad superficial a las partículas. La rugosidad de la superficie es suficiente para que las nanopartículas huecas mesoporosas rugosas adquieran un carácter hidrofóbico, en algunos casos extremadamente hidrofóbico.
Las nanopartículas de sílice hueca mesoporosa rugosa tendrán normalmente un núcleo hueco con un diámetro de 100nm a 1000nm, o de 100nm a 700nm. El núcleo hueco estará definido por un recubrimiento de sílice que tiene una estructura mesoporosa. El recubrimiento de sílice suele tiene una estructura de poros que incluye poros en el rango de 2 nm a 20 nm. Como el recubrimiento de sílice que rodea y define el núcleo hueco es poroso, los compuestos pueden pasar a través de los poros y entrar en el núcleo hueco. El recubrimiento de sílice que rodea el núcleo hueco tiene un grosor de entre 10 nm y 100 nm. Las nanopartículas de sílice hueca mesoporosa rugosa incluyen proyecciones de sílice en la superficie, espaciadas entre sí. Las proyecciones de sílice espaciadas proporcionan rugosidad superficial a las partículas. La rugosidad de la superficie es suficiente para que las nanopartículas de sílice hueca mesoporosa rugosa adquieran un carácter hidrofóbico, en algunos casos extremadamente hidrofóbico.
Las proyecciones de sílice espaciadas comprenden filamentos o cilindros o fibras que se extienden hacia el exterior desde el recubrimiento hueco de las nanopartículas. La longitud de las proyecciones puede ser de 5 nm hasta el diámetro de la partícula hueca grande en la que residen, no obstante pueden hacerse más largas si se requeire por la aplicación. El diámetro de las proyecciones puede ser tan bajo como 2-3 nm o tan alto como 100 nm. El diámetro o el grosor de una proyección puede variar a lo largo de su longitud debido al proceso utilizado para formarla. La superficie específica de las nanopartículas puede oscilar entre 100m2/g y 1000m2/g, o entre 150 m2/g y 1000m2/g, o entre 175 m2/g y 1000m2/g .
Las proyecciones o excrecencias espaciadas comprenden proyecciones o excrecencias de sílice. Las proyecciones espaciadas de sílice comprenden hebras o cilindros o fibras de sílice que se extienden hacia fuera desde las nanopartículas huecas de sílice. La longitud de las proyecciones puede ser de 5 nm hasta el diámetro de la partícula hueca grande en la que residen, aunque pueden hacerse más largas si lo requiere la aplicación. El diámetro de las proyecciones puede ser tan bajo como 2-3 nm o tan alto como 100 nm o más, y el diámetro o grosor de una proyección puede variar a lo largo de su longitud debido al proceso utilizado para formarla. La superficie específica de las nanopartículas puede oscilar entre 100m2/g y 1000m2/g, o entre 150 m2/g y 1000m2/g, o de 175 m2/g a 1000m2/g.
La presente invención se define en las reivindicaciones y no está limitada a la compatibilidad con ninguna clase particular de molécula hidrofóbica, y como tal, se puede utilizar con una amplia gama de moléculas hidrofóbicas. De hecho, muchas de las nuevas moléculas farmacéuticamente activas que se están desarrollando en la actualidad sufren problemas de hidrofobicidad o degradación por los rayos UV y es probable que sean compatibles con las partículas de la presente invención.
Las nanopartículas huecas mesoporosas rugosas se pueden utilizar como vehículos eficientes para el suministro de material hidrofóbico a sistemas biológicos, como el suministro de fármacos hidrofóbicos y portadores y agentes de suministro de proteínas hidrofóbicas como se define en la reivindicación 1.
En una realización, la composición de suministro de fármaco puede comprender una proteína hidrofóbica, como la RNasa A, la insulina o la lisozima. La lisozima y otras enzimas que se utilizan en cosméticos, suplementos para piensos y otras aplicaciones también se pueden formular con las partículas de la presente invención. En este caso, las partículas pueden proporcionar una función de liberación lenta, que en el caso de la lisozima, por ejemplo, que tiene propiedades antibacterianas, puede resultar en una supresión sostenida de las bacterias a lo largo del tiempo. Durante la fabricación y el almacenamiento de las formulaciones enzimáticas, muchas enzimas sufren una degradación como resultado de la descomposición térmica, la hidrólisis o de otro modo, lo que requiere el uso de un exceso de enzimas en las formulaciones para compensar estas pérdidas de rendimiento. Por ejemplo, en el proceso de granulación al vapor utilizado para fabricar algunos alimentos para animales, la aplicación de vapor puede provocar la desnaturalización de parte del contenido enzimático, lo que obliga a agregar un exceso de enzima a la formulación o a utilizar un equipo costoso para rociar enzima en los gránulos resultantes después el proceso de granulación a vapor. La formulación de enzimas con las partículas de la presente invención puede proteger la enzima de la degradación. Estos ingredientes activos se pueden cargar en la cavidad interna proporcionada por las partículas, así como estar en el exterior de las partículas enredadas con los salientes. Estos ingredientes activos se pueden cargar en la cavidad interna proporcionada por las partículas, en el exterior de las partículas enredadas con los salientes o una combinación de ambos.
Sin pretender estar limitados por la teoría, los presentes inventores han postulado que las moléculas activas pueden adsorberse en la superficie de las partículas o insertarse en los huecos entre las proyecciones de las partículas y esto proporciona un grado de protección contra la degradación de los materiales activos, incluso si los materiales activos no entran (parcial o completamente) en el núcleo hueco de las partículas.
Los presentes inventores también han descubierto que las partículas utilizadas en las composiciones de la presente invención pueden funcionar como un sistema de entrega eficaz para ácidos nucleicos como el ADN plasmídico (p-ADN) y el ARN mensajero (ARNm) que se utilizan en las estrategias de vacunación emergentes. En el caso del p-ADN, es deseable poder proteger la molécula de p-ADN del ataque de las nucleasas al entrar el p-ADN en el cuerpo. Este modo de degradación del p-ADN es responsable de una reducción significativa de la eficacia de las vacunas de ADN. Debido al gran tamaño de las moléculas de p-ADN, cuando se formulan con las partículas de la presente invención el p-ADN se distribuye en gran medida en el exterior de las partículas, asegurado por las proyecciones de la superficie de las mismas. Esto es suficiente para proporcionar un alto grado de protección contra el ataque de las nucleasas. Al formular una vacuna basada en ADN o ARNm, las partículas de la presente invención se pueden revestir con sustancias que aumenten la afinidad de las partículas con estos ácidos nucleicos. Esto puede implicar el injerto covalente de grupos funcionales químicos en las partículas, o la aplicación de un recubrimiento que interactúe con la superficie de la partícula mediante enlaces de hidrógeno, atracción electrostática o algún otro medio conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede revestir las partículas con polietilenimina (PEI). Con una formulación sustancialmente estable frente al ataque de las nucleasas, el siguiente reto para un sistema de administración de vacunas de ADN es atravesar eficazmente la membrana celular que lleva el p-ADN. El tamaño de las partículas de la presente invención es adecuado para una captación celular eficiente por parte de las células huésped tras formar complejos con el p-ADN, el ARNm, el ARNsi u otros ácidos nucleicos. En algunos casos, donde las moléculas de ácido nucleico están situadas en el exterior del recubrimiento, fijadas a las partículas a través de un enredo en los salientes, puede no ser necesario utilizar un recubrimiento con alguna porosidad ya que las moléculas activas no entran sustancialmente en la cavidad interna.
Por consiguiente, en un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición como se define en las reivindicaciones 10 y 11 que comprenda nanopartículas al menos parcialmente, con ácidos nucleicos. Las nanopartículas rugosas pueden tener poca o ninguna porosidad. Las nanopartículas rugosas pueden tener un núcleo sólido o pueden tener un núcleo hueco. Las nanopartículas rugosas tienen una estructura mesoporosa pero, debido al tamaño de los ácidos nucleicos, puede haber poca o ninguna penetración de los poros de la nanopartícula por parte de los ácidos nucleicos.
El ácido nucleico puede ser seleccionado de uno o más de ADN plasmídico, (p-ADN) y ARN mensajero (ARNm).
En algunas realizaciones, se pueden utilizar dos o más ácidos nucleicos.
Cuando el ácido nucleico comprende ADN plasmídico, la composición puede comprender una composición de vacuna de ADN.
Las nanopartículas huecas mesoporosas rugosas pueden prepararse formando una nanopartícula de recubrimiento hueco y añadiendo nanopartículas con tamaños más pequeños sobre las nanopartículas de recubrimiento hueco de tamaño relativamente mayor, de modo que las partículas más pequeñas formen excrecencias o proyecciones en la superficie exterior del recubrmiento hueco mayor. Las nanopartículas de sílice huecas pueden ser mesoporosas. Según este enfoque, las partículas que formarán las proyecciones pueden sintetizarse por separado de los recubrimientos huecos más grandes.
Las nanopartículas de sílice huecas y rugosas pueden prepararse formando una nanopartícula de sílice hueca y añadiendo nanopartículas de sílice con tamaños más pequeños a las nanopartículas de sílice huecas de tamaño relativamente mayor, de modo que las partículas de sílice más pequeñas formen excrecencias o proyecciones en la superficie exterior del recubrimiento de sílice hueca más grande. Las nanopartículas de sílice huecas pueden ser mesoporosas. Según este enfoque, las partículas de sílice que formarán las proyecciones pueden sintetizarse por separado de los recubrimientos de sílice huecos más grandes.
Las nanopartículas huecas mesoporosas ásperas pueden formarse formando una partícula de sacrificio a partir de una mezcla de reacción, la partícula de sacrificio se forma a partir de un material a base de carbono, añadiendo un precursor de material del recubrimiento a la mezcla de reacción para formar una recubrimiento poroso alrededor de la partícula de sacrificio, el recubrimiento tiene excrecencias de material que contiene silicio que se extienden desde allí con material a base de carbono que se forma a partir de la mezcla de reacción y que se deposita entre las excrecencias de material y posteriormente se elimina el material a base de carbono. En este caso, el material de crecimiento o el precursor del material de crecimiento y el material a base de carbono se depositan conjuntamente en el recubrimiento poroso de forma espacialmente inhomogénea, de manera que la posterior eliminación del material a base de carbono deja proyecciones de material que sobresalen de la superficie del recubrimiento El material a base de carbono co-depositado con las proyecciones puede ser depositado a partir del precursor a base de carbono sobrante de la formación de las partículas de sacrificio o el precursor a base de carbono puede ser sub-secuencialmente añadido a la mezcla. Se cree que este método de fabricación es único.
Las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas y rugosas se pueden formar formando una partícula de sacrificio a partir de una mezcla de reacción, la partícula de sacrificio se forma a partir de un material a base de carbono, agregando un precursor de sílice a la mezcla de reacción para formar un recubrimiento poroso que contenga silicio alrededor de la partícula de sacrificio, el recubrimiento que contiene silicio tiene excrecencias de material que contiene silicio que se extienden a partir de la misma, con material a base de carbono que se forma a partir de la mezcla de reacción entre las excrecencias de material que contiene silicio y, posteriormente, se elimina el material a base de carbono. En este caso, el silicio y el material a base de carbono se depositan conjuntamente en el recubrimiento poroso de silicio de manera espacialmente no homogénea, de modo que la posterior eliminación del material a base de carbono deja proyecciones de silicio que sobresalen de la superficie de la capa de sílice. El material a base de carbono depositado en conjunto con las proyecciones de silicio puede ser depositado a partir del precursor a base de carbono sobrante de la formación de las partículas de sacrificio o el precursor a base de carbono puede ser añadido posteriormente a la mezcla.
Cualquiera de las características descritas en el presente documento puede combinarse con una o más de las otras características descritas en el presente documento dentro del ámbito de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Varias realizaciones de la invención se describirán con referencia a los siguientes dibujos, en los que:
La figura 1 muestra un diagrama esquemático de (a) MSHSs-RS y (b) MSHSs-SS, donde (b) muestra el revestimiento poroso que rodea la cavidad interior, R2 representa el radio de la cavidad, R1 representa el radio de las proyecciones esféricas en la superficie del recubrimiento y las áreas blancas entre las proyecciones esféricas muestran la presencia de aire cuando las partículas se sumergen en agua, proporcionando cierto carácter hidrofóbico a las partículas. Imágenes SEM (c y d), TEM (e y f) de MSHSs-RS y MSHSs-SS;
La figura 2 muestra imágenes ópticas (contraste de fases) de (A) piel de canguro, (B) nanopartículas de sílice MSHSs-RS, piel de canguro tratada con (C, E) MSHSs-SS y (D, F) MSHSs-RS (E y F son muestras lavadas con agua);
La figura 3 muestra los espectros FTIR de una serie de muestras que incluyen spinosad puro, nano-spinosad-X, nanopartículas de sílice y la mezcla física de spinosad y nanopartículas de sílice.
La figura 4 muestra (A) los perfiles TGA y (B) los perfiles DSC de (negro) spinosad puro, (rojo) nano-spinosad-0,4, (azul) nano-spinosad-0,5, (d) nano-spinosad-0,6. (El rosa en B es la curva DSC para la mezcla física de spinosad y nanopartículas de sílice);
La figura 5 muestra los patrones de XRD de gran ángulo de una serie de muestras que incluyen spinosad puro, nanospinosad-X, nanopartículas de sílice y la mezcla física de spinosad y nanopartículas de sílice;
La figura 6 muestra imágenes FE-SEM de nanopartículas de sílice puras en (A) aumentos bajos y (B) altos, (C) spinosad puro, (D) nano-spinosad-0,4, (E) nano-spinosad-0,5 y (F) nano-spinosad-0,6;
La figura 7 muestra los perfiles de liberación en función del tiempo de spinosad puro y nano-spinosad;
La figura 8 muestra los patrones de HPLC del spinosad puro y del nano-spinosad después de la irradiación UV;
La figura 9 muestra una ilustración esquemática de los procedimientos de síntesis de las esferas huecas de sílice rugosa monodispersa como se describe en el ejemplo 2;
La figura 10 muestra imágenes TEM (A, B, C) y mediciones DLS (D) de las esferas huecas de sílice de superficie rugosa S-1,4, S- 1,0 y S-1,2 realizadas en el ejemplo 2;
La figura 11 muestra cortes de tomografía electrónica de las esferas huecas de sílice de superficie rugosa S-1,4 (A), S-1,0 (B), S-0,6 (C);
La figura 12 muestra la isoterma de sorción de N2 (A) y la distribución del tamaño de los poros mediante la rama de adsorción BJH (B) de las esferas huecas de sílice rugosa fabricadas en el ejemplo 2;
La figura 13 muestra las imágenes SEM para la prueba del ángulo de contacto de la esfera hueca de sílice lisa (A), S-1,4 (B), S-1,0 (C) y S-0,6(D). En el recuadro se muestran las imágenes TEM de sus partículas correspondientes;
La figura 14 muestra la capacidad de adsorción de liso y rugoso de las esferas huecas de sílice;
La Figura 15 muestra el comportamiento de captación y liberación de las nanopartículas hacia moléculas hidrofóbicas e hidrofílicas. a) Capacidad de carga de MHS y RMHS sobre el fármaco y diferentes proteínas, b) tasa de captación de DR1; Las soluciones que contienen partículas fueron pretratadas con sonicación antes de añadir las proteínas o fármacos para su carga; c) el comportamiento de liberación de VAN para partículas de 400 nm y d) El comportamiento de liberación de VAN para partículas de 200 nm. Las barras de error reflejan la desviación estándar de las mediciones.
La figura 16 muestra el rendimiento antibacteriano. a) Actividad antibacteriana dependiente de la dosis contra E.coli de RMHS200- VAN, MHS200-VAN y VAN libre cultivados durante 18 h, utilizando PBS como control. b) Estudio antibacteriano dependiente del tiempo a la dosis de VAN de 25 mg ml-1 hasta 24 h. c) Imágenes TEM de E.coli tratada en PBS, d) E.coli tratada en VAN, e) E.coli tratada en MHS200-VAN y f) E.coli tratada en RMHS200-VAN a la dosis de 25 mg ml-1 durante 18 h. * indica una inhibición del 100%. Las barras de error reflejan la desviación estándar de las mediciones. Barra de escala = 500 nm (véase el ejemplo 3).
La figura 17 muestra una ilustración esquemática de la síntesis de MHCS invaginados, endoinvaginados e intactos mediante un mecanismo de nucleación heterogénea secuencial;
La Figura 18 muestra imágenes SEM (A, C) y TEM (B, D) de MHCS invaginados e intactos, respectivamente. Imágenes digitales (E) de dos MHCS dispersos en soluciones acuosas que muestran el efecto Tyndall y las curvas de distribución del tamaño de las partículas (F) por medición DLS;
La figura 19 muestra diapositivas de ET de MHCS invaginado (A) y MHCS intacto (C), reconstrucción de ET de MHCS invaginado (B) y MHCS intacto (D). Las barras de escala son de 100 nm;
La figura 20 muestra el tamaño de las partículas de sílice pura (curva I), RF pura (curva II), sílice@RF (curva III) y sílice@RF@sil- ica@RF (curva IV) en función del tiempo de reacción;
La figura 21 muestra el MHCS con el recubrimiento interna invaginada y la externa intacta. El diagrama (A) muestra la estructura interna de la partícula en relación con la orientación XYZ. Imágenes TEM inclinadas (B y C). La lámina (D) corta el plano YZ en el centro de la partícula, mientras que la lámina (E) y la lámina (F) cortan el plano XY en la posición a y b, como se indica en el diagrama (A), respectivamente. Las barras de escala son de 100 nm;
La Figura 22 muestra imágenes SEM de S-SHSs (a), R-MSHSs-B (b) y R-MSHSs (c) adheridas a la superficie de E. coli, y el análisis cuantitativo del contenido de sílice adherido a las bacterias a partir de ICP-OES (d), como se describe en el Ejemplo 4;
La figura 23 muestra (a) la carga de lisozima, (b) las actividades antibacterianas dependientes del tiempo de la lisozima libre y de las partículas de sílice cargadas de lisozima en la dosis de lisozima de 700|jg/mL, como se describe en el ejemplo 5;
La figura 24 muestra (a) imágenes de TEM de partículas de MSHS-RS fabricadas con resorcinol de 0,15 g con un diámetro de partícula de 307±18 nm, (b) partículas de resorcinol de 0,30 g con un diámetro de partícula de 564±20 nm, (c) partículas de resorcinol de 0,45 g con un diámetro de partícula de 704±25 nm y (d) partículas de resorcinol de 0,60 g con un diámetro de partícula de 837±35 nm (diámetro medido a partir de 20 partículas), como se describe en el ejemplo 8.
Descripción de las realizaciones
A lo largo de los ejemplos, se utilizarán las siguientes abreviaturas:
MSHS - esferas huecas de sílice mesoporosa (con una superficie relativamente lisa).
MSHS-RS - esferas huecas de sílice mesoporosa con superficie rugosa.
Ejemplo de referencia 1
Desarrollo de un nanopesticida con mayor seguridad y rendimiento.
Las garrapatas y el mosquito del búfalo causan más de 400 millones de dólares al año en pérdidas económicas a la industria ganadera australiana y actualmente se tratan con pesticidas sintéticos altamente tóxicos. Spinosad, un pesticida de origen natural con bajo impacto ambiental y baja toxicidad, se cargará en esferas huecas de sílice que mejorarán la adhesión a la piel y el pelo y protegerán contra la degradación por rayos UV. El plaguicida nano-spinosad tendrá una mayor eficacia y duración efectiva en condiciones de campo en comparación con los plaguicidas convencionales, lo que reducirá significativamente el coste del control de plagas.
Spinosad fue suministrado por Elanco Animal Health. Las esferas huecas de sílice mesoporosa con superficie rugosa (MSHSs-RS por sus siglas en inglés) y con superficie lisa (MSHSs-SS por sus siglas en inglés) se sintetizaron en el Grupo Yu del Instituto Australiano de Bioingeniería y Nanotecnología de la Universidad de Queensland. Se adquirieron muestras de piel de canguro con pelo en Skinny Shop, Australia, como modelo animal. Las muestras de piel se lavaron a fondo con agua destilada y se cortaron en pequeños trozos de 1 cm2 antes de las pruebas. Todos los demás reactivos eran de grado reactivo analítico.
Propiedad adhesiva de las nanopartículas sobre la piel de los animales
El comportamiento adhesivo de las nanopartículas sobre la piel de animales se evaluó en una piel de canguro tratada con piel como modelo animal. Las nanopartículas de sílice (2 mg/cm2) se dispersaron en una solución de etanol y la solución se goteó de forma homogénea sobre el lado de la piel de las piezas de piel de canguro (1 cm2). A continuación, se dejaron secar los trozos de piel a 40 °C durante la noche. La fijación de las nanopartículas en el pelo se observó mediante microscopía confocal (LSM ZEISS 710) antes y después de varios lavados con agua. También se observaron al microscopio muestras de piel pura y nanopartículas de sílice (utilizando MSHSs-RS como ejemplo). La cantidad cuantitativa de las nanopartículas adheridas antes y después del lavado se midió y comparó mediante espectrometría de emisión óptica con plasma acoplado inductivamente (ICPOES, un instrumento Vista-PRO, Varian Inc, Australia). Las muestras de piel que contenían las nanopartículas se disolvieron en 2M NaOH durante toda la noche con agitación para permitir la disolución de las nanopartículas de sílice y se midió la concentración de silicio. También se midió la cantidad de silicio de una piel de tamaño similar sin nanopartículas, como blanco.
Preparación de nano-spinosad
Se utilizó un método de evaporación rotatoria para encapsular el spinosad en las nanopartículas de sílice. En el procedimiento, se añadieron 34 mg de nanopartículas de sílice después de la calcinación a 8, 10 o 12 ml de spinosad en solución de etanal (1,7 mg/ml), con una proporción de alimentación de spinosad:sílice de 0,4:1, 0,5:1 y 0,6:1, respectivamente (en lo sucesivo denominada nano-spinosad- X, donde X es la proporción de spinosad:sílice). La mezcla se introdujo en un matraz cilíndrico largo acoplado a un evaporador rotatorio (BUCHI R-210) y se evaporó a 40 °C en un sistema de vacío en la oscuridad con una presión residual de 175 mbar hasta que se eliminó todo el disolvente. A efectos de comparación, se llevó a cabo un procedimiento similar con una solución de etanol de spinosad únicamente (sin presencia de nanopartículas).
Caracterización
Las morfologías de las nanopartículas de sílice antes y después de la carga de spinosad se observaron utilizando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (FE-SEM) JEOL JSM 7800 operado a 0,8-1,5 kV. Para las mediciones FE-SEM de las nanopartículas de sílice puras, las muestras se prepararon dispersando las muestras de polvo en etanol, tras lo cual se dejaron caer sobre las piezas de papel de aluminio y se fijaron a la película de carbono conductora sobre soportes SEM. Para las mediciones FE-SEM de nano-spinosad, las muestras se adhirieron directamente a la película de carbono conductora sobre montajes SEM. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM por sus siglas en inglés) de las nanopartículas de sílice se obtuvieron con JEOL 2100 operado a 200 kV. Para las mediciones de TEM, las muestras se prepararon mediante la dispersión y el secado de la dispersión de polvo en etanol sobre una película de carbono en una rejilla de Cu. Los espectros de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR por sus siglas en inglés) se recogieron en un espectrómetro FTIR ThermoNicolet Nexus 6700 equipado con un cristal Diamond ATR (reflexión total atenuada). Para cada espectro se recogieron 32 barridos con una resolución de 4 cm-1 en el rango de 400­ 4000 cm-1. Los patrones de difracción de rayos X de ángulo ancho (WA-XRD por sus siglas en inglés) de los materiales se registraron en un difractómetro de rayos X Bruker D8 alemán con radiación Cu Ka filtrada con Ni. Se utilizó una estación de análisis termogravimétrico (TGA por sus siglas en inglés) Metter Toledo GC200 para el estudio de la cantidad de carga y la calorimetría diferencial de barrido (DSC por sus siglas en inglés) a una velocidad de calentamiento de 2 °C min-1.
Ensayo de liberación de nano-spinosad
En un ensayo de liberación, se dispersaron 2,67 mg de nano-spinosad-X (que contiene 1 mg de spinosad) en 1 ml de agua destilada, respectivamente. Las mezclas se mantuvieron en la incubadora a 25 °C a 200 rpm. Se recogieron los sobrenadantes a diferentes tiempos y se midió y evaluó la cantidad liberada de spinosad utilizando un espectrofotómetro UV-Vis a una longitud de onda de 248 nm. También se probó la cantidad de liberación de spinosad puro en agua utilizando el mismo procedimiento.
Ensayo de estabilidad a la luz ultravioleta del nano-spinosad
En esta prueba, se añadieron 1,2 mg de spinosad puro y 4,2 mg de nano-spinosad-0,4 (que contiene 1,2 mg de spinosad) en dos recipientes de cuarzo transparentes, respectivamente. El uso de recipientes de cuarzo es para minimizar el apantallamiento de la luz ultravioleta de los recipientes. Cada una de las muestras se colocó bajo la luz UV con una longitud de onda de 365 nm y una potencia de 17,77 mV cm'3 Todas las muestras fueron irradiadas por la luz UV durante 2 horas. Después de la irradiación, el spinosad y sus productos de degradación se extrajeron con acetonitrilo (ACN por sus siglas en inglés) durante tres veces y la concentración final se diluyó a 0,5 mg/ml dispersados en 1 ml de agua destilada. Las condiciones de degradación UV tanto del spinosad puro como del nano-spinosad-0,4 se probaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC por sus siglas en inglés) utilizando ACN como fase móvil.
Bioensayo in vitro
Se evaluaron los efectos in vitro de spinosad y nano-spinosad sobre la garrapata del ganado, Rhipicephalus microplus. La prueba se llevó a cabo en el Laboratorio de Ciencias de la Bioseguridad (Gobierno de Queensland) utilizando una prueba estándar de I mersión de larvas con disolvente orgánico para extraer los activos.
Preparación de MSHSs-RS
Como se muestra en la Fig. 1a, las partículas de MSHSs-RS se prepararon añadiendo partículas de cáscara de sílice con tamaños más pequeños (~ 30 nm de diámetro) sobre MSHSs con tamaños relativamente más grandes (~ 400 nm). En la superficie de las partículas de MSHSs-RS, se genera un espacio vacío entre las pequeñas esferas de la cáscara con un radio de R1 (Fig. 1a) para el atrapamiento de aire. La bolsa de aire se amplía considerablemente en estas partículas de MSHS-RS porque la cavidad esférica interna con un radio de R2 (R2»R1) está conectada con el aire a través de los mesoporos de la cáscara de sílice. La repulsión del aire atrapado en los espacios vacíos hacia las moléculas de agua proporciona la barrera energética contra el proceso de humectación porque los grupos hidroxilos de la sílice tienden a absorber las moléculas de agua, como en el caso de las MSHSs (como se muestra en la Fig. 1 b). Por lo tanto, los MSHSs-RS diseñados deberían demostrar una mayor hidrofobicidad en comparación con los MSHSs aunque ambos materiales tengan la misma composición de sílice pura. También es ventajoso en comparación con una nanopartícula sólida con superficie rugosa, porque la nanopartícula sólida con superficie rugosa tiene menos bolsas de aire (sin núcleo hueco con radio R2) y una capacidad de carga limitada de fármacos hidrofóbicos. Los estudios anteriores se centraban principalmente en grandes superficies planas; no se ha informado de nanopartículas con composiciones hidrofílicas y propiedades hidrofóbicas mediante el control de la rugosidad de la superficie y no se ha demostrado su utilidad para las bioaplicaciones. Se tomaron imágenes de las MSHSs-RS preparadas utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM por sus siglas en inglés) y un microscopio electrónico de transmisión (TEM por sus siglas en inglés) (véase Figs.
1c, 1e). A modo de comparación, también se prepararon y caracterizaron MSHSs con una superficie lisa, como se muestra en las Figs. 1d y 1f. Ambas nanopartículas tienen una morfología esférica uniforme y hueca, con la superficie de las MSHS-RS homogéneamente decorada con partículas de sílice. De acuerdo con nuestra teoría, las nanopartículas de MSHSs- RS muestran unas propiedades hidrofóbicas inusuales. La hidrofobicidad se observó directamente mediante la dispersión de las nanopartículas en un disolvente mixto de agua/éter dietílico. Las MSHSs-RS descansan preferentemente en el fondo de la capa de éter dietílico (un disolvente hidrofóbico) mientras que las MSHSs se dispersan directamente en la capa de agua. Los perfiles de TGA presentaron una pequeña pérdida de peso del 0,9% por debajo de los 200 °C para las MSHSs-RS y del 7,2% para las MSHSs, que se puede atribuir a la evaporación de la humedad, lo que indica que la introducción de la rugosidad de la superficie hace que las MSHSs-RS sean más hidrofóbicas y, por tanto, absorban menos humedad de la atmósfera que las MSHSs.
Para proporcionar una comparación cuantitativa de la hidrofobicidad entre las MSHSs-RS y las MSHSs, se empleó una técnica de atrapamiento en gel (GTT por sus siglas en inglés) que reveló que las MSHSs-RS tienen un valor de ángulo de contacto de 107,5° ± 10 mientras que el de las MSHSs fue de 72,5° ± 5. El valor del ángulo de contacto de las MSHSs-RS es ligeramente inferior al obtenido para la sílice modificada con octadeciltrimetoxisilano (~136°). En comparación con las MSHS, las MSHSs-RS presentan una capacidad de carga sistemáticamente superior para una serie de moléculas hidrofóbicas, como la RNasa A (RNASE por sus siglas en inglés), la insulina (INS por sus siglas en inglés), la lisozima (LYS por sus siglas en inglés), un colorante hidrofóbico, el rojo disperso 1 (DR1 por sus siglas en inglés) y un fármaco hidrofóbico, la griseofulvina (GRIS por sus siglas en inglés). Estos resultados confirman además que la hidrofobicidad superficial mejorada de las nanopartículas de MSHS-RS aumenta la capacidad de carga de las moléculas hidrofóbicas.
Para comprobar la adhesión de las MSHSs-RS, se utilizó como modelo la piel de animales. Las MSHS-RS y los MSHS con el mismo peso se dispersaron en agua y se aplicaron homogéneamente a dos trozos de piel con el mismo tamaño. Después de secar y lavar con agua tres veces, se midió el contenido de sílice que quedaba en la piel. La Fig. 2A es la imagen óptica de la piel de canguro que ilustra la estructura típica del pelo. En comparación, la sílice pura muestra partículas blancas bajo el microscopio óptico debido a su naturaleza de polvo (Fig. 2B). Después de la aplicación de las nanopartículas de sílice en las muestras de piel, se observaron partículas blancas adheridas en la superficie de los pelos, lo que indica la adhesión de ambas nanopartículas de sílice (Figs. 2C y 2D). Después de tres lavados, hay más partículas blancas adheridas a los pelos de los canguros que en el caso de las MSHSs-RS (fig. 2E) en comparación con las MSHSs-SS (fig. 2F). Este fenómeno indica que las MSHSs-RS tienen una mayor capacidad de adhesión a los pelos de los animales. Esta conclusión también se apoya en los resultados de ICPOES. El porcentaje de peso de sílice que queda en el pelo para las MSHSs y las MSHSs-Rs fue del 28,5% y del 51,0%, respectivamente. Las MSHSs-RS muestran una adhesión significativamente mejorada debido a su superficie rugosa e hidrofobicidad. La adhesión mejorada de las nanopartículas de MSHSs-RS sobre el pelaje debería prolongar la duración efectiva de la nanoformulación de Spinosad-MSHSs-RS en condiciones de campo.
Se utilizó un método de evaporación rotatoria para encapsular spinosad en nanopartículas de sílice utilizando una solución de spinosad-etanol con una proporción de spinosad:sílice de 0,4:1, 0,5:1 y 0,6:1. Los compuestos de nano-spinosad se denominan nano-spinosad-X, donde X representa la proporción de spinosad y sílice. La figura 3 muestra el espectro FTIR del spinosad puro con picos característicos evidentes en 891, 987, 1041, 1099, 1213, 1263, 1371,1456, 1660, 1707 y en el rango de 2787-3012 cm_1. El espectro de las nanopartículas de sílice muestra un pico característico en 810 cm_1 que se puede atribuir a v(Si-O), y un pico amplio en el rango de 1050-1200 cm_1 que se puede atribuir al enlace -Si-O-Si. En los espectros de todas las nanopartículas X, se siguen observando los picos característicos 1371, 1456, 1660, 1707 y en el rango de 2787-3012 cm_1 además de solaparse con los picos característicos de la sílice. Los espectros FTIR confirman el éxito de la encapsulación de spinosad con nanopartículas de sílice.
La cantidad real de carga de spinosad se puede calcular por la pérdida de peso a partir de los resultados del TGA (Fig. 4A). El spinosad puro muestra una pérdida de peso completa del 99,9 % a 900°C. Las nanopartículas de sílice puras después de la calcinación muestran una pérdida de peso insignificante por la humedad adsorbida (datos no mostrados). Las pérdidas de peso de nano-spinosad-X son del 27,4, 32,8 y 38,1 % para X = 0,4, 0,5 y 0,6, respectivamente. Por consiguiente, se calcula que la cantidad de carga de nano-spinosad-X (X = 0,4, 0,5 y 0,6) es de 28,6, 33,3 y 37,5 %, respectivamente, lo que indica que la evaporación rotatoria puede lograr la carga completa (~100%) de spinosad.
El estado cristalino del spinosad antes y después de la encapsulación se caracteriza por WA-XRD (Fig. 5). El patrón de WA- XRD del spinosad puro muestra una serie de picos agudos en el rango de 5-40°, lo que indica que el spinosad puro está en estado cristalino. Las nanopartículas de sílice puras muestran un pico amplio centrado en ~ 22° que se puede atribuir a la sílice amorfa. En el patrón WA-XRD de todas las muestras de nano-spinosad-X no se observaron picos característicos nítidos, además del pico amplio a 22° de la sílice amorfa, lo que indica que en estas muestras no se forma spinosad cristalino. El comportamiento de cristalización del nano-spinosad-X también se ha estudiado mediante DSC (Fig. 4B). El spinosad puro muestra un pico endotérmico agudo a 129 °C que indica el punto de fusión del spinosad cristalino. Al igual que la sílice pura, todos los nano-spinosad-X no muestran picos evidentes en el rango de 25-350 °C, lo que indica un estado amorfo. En comparación, se observa un pequeño pico endotérmico a 129 °C para la mezcla física de spinosad y sílice (rosa), lo que indica la existencia de una estructura cristalina de spinosad. Los resultados anteriores indican que el spinosad se encapsuló en nanopartículas de MSHS-RS en una forma nano-dispersa utilizando la técnica de evaporación rotatoria.
Se utilizó el FE-SEM para observar directamente la morfología del nano-spinosad (Fig. 6). Las imágenes de FE-SEM muestran que las nanopartículas de sílice están agregadas en los aumentos bajos (Fig. 6A) y tienen una morfología esférica en los aumentos altos (Fig. 6B). Si se utiliza una solución pura de spinosad-etanol para la evaporación rotativa, se forma un spinosad grande y cristalino con un tamaño de ~ 20 |jm (Fig. 6C). En la misma ampliación, todos los nanospinosad-X muestran agregaciones de pequeñas partículas (Fig 6D- Fig 6F) que tienen exactamente la misma morfología que la sílice pura, sin cristales evidentes. Estos fenómenos indican que el spinosad se encapsula con éxito en la cavidad de las nanopartículas de MSHS-RS en diferentes proporciones de alimentación.
El perfil de liberación tanto del spinosad puro como del nano-spinosad se probó en agua. Como se muestra en la Fig. 7, en el caso del nano-spinosad, se liberó un 16% de spinosad en un corto periodo de tiempo de 5 minutos y este nivel se mantuvo hasta los 540 minutos (liberación en agua monitorizada por UV-Vis a 248 nm). Por otra parte, en el caso del spinosad puro, sólo se liberó un 2,4% de spinosad a los 5 minutos, mientras que la liberación acumulada es inferior al 8% incluso a los 540 minutos. El spinosad confinado en nanopartículas de sílice muestra una solubilidad de ~ 0,2 mg/ml, que es más de dos veces superior a la del spinosad puro, similar a la mejora de la solubilidad de la curcumina confinada en materiales mesoporosos. En consecuencia, el comportamiento de liberación del spinosad mejora en comparación con el spinosad puro. Se espera que la rápida liberación de una mayor concentración de spinosad sea beneficiosa para el desarrollo de una formulación de nano-spinosad "efectiva-inmediata".
Se estudió la estabilidad frente a los rayos UV del nano-spinosad. Tanto el spinosad como el nano-spinosad se irradiaron bajo luz UV (longitud de onda de 365 nm, 17,77 mV/cm3) durante 2 horas, seguidas de HPLC, que se utilizó para controlar el producto después del tratamiento UV utilizando ACN como medio de extracción y fase móvil. Como se muestra en la figura 8, el pico a un tiempo de retención de 3,5 minutos se atribuye al spinosad. También se observó un pico adicional a un tiempo de retención de 1,5 minutos en el grupo de spinosad puro, que puede atribuirse al producto degradado. Esta observación coincide con los informes de la literatura, que indican que el spinosad en sí mismo es lábil a la luz ultravioleta. Sin embargo, en el grupo de nano-spinosad, no se observa el pico de degradación, lo que sugiere que el recubrimiento de sílice tiene un efecto protector contra la irradiación UV para el spinosad cargado dentro de la nano-cavidad.
Para confirmar que el spinosad cargado en nanopartículas de sílice sigue siendo eficaz, evaluamos los efectos in vitro del spinosad y el nano-spinosad sobre la garrapata del ganado, Rhipicephalus microplus. La prueba se llevó a cabo en el Laboratorio de Ciencias de la Bioseguridad (Gobierno de Queensland) utilizando una prueba de inmersión de larvas estándar. En la prueba de inmersión de larvas, tanto el spinosad como el nano-spinosad se disolvieron primero en un disolvente orgánico (2% de Triton X-100 en acetona) para extraer los activos de la solución madre (10 mg/ml) y luego se diluyeron en agua. Tanto el spinosad como el nano-spinosad muestran una mortalidad dependiente de la dosis para las larvas de garrapata bovino. Se realizaron tres ensayos para reducir los rangos de LC. En el ensayo 3, spinosad muestra valores de LC50 y LC99 para las larvas de garrapatas del ganado de 54 y 196 ppm en 24 h, respectivamente. El nanospinosad muestra valores de LC50 y LC99 para garrapatas de ganado larvado de 46 y 159 ppm en 24 h, respectivamente. Estos resultados indican que el nano-spinosad presenta una toxicidad comparable y ligeramente superior a los modelos de larvas de garrapata. Este resultado confirma que, después de la encapsulación, el spinosad cargado en nanopartículas de sílice sigue siendo eficaz.
Este ejemplo muestra que las MSHSs-RS muestran un comportamiento de adhesión prolongado al pelaje de los animales. Utilizando un método de evaporación rotatoria, el spinosad puede cargarse en dichas nanopartículas huecas de MSHS-RS con una carga de ~ 100 %. La cantidad de carga puede alcanzar hasta el 28,6-37,5% (peso/peso), según se determinó en el análisis TGA, mientras que los análisis WA-XRD y DSC confirmaron que el spinosad estaba disperso en la nanocavidad del MSHS-RS en un estado amorfo. En consecuencia, el comportamiento de liberación del spinosad mejora en comparación con el spinosad puro. Además, el recubrimiento de sílice tiene un efecto protector contra la irradiación UV para el spinosad cargado dentro de la nano-cavidad, proporcionando así un blindaje contra la radiación UV y la protección del spinosad lábil. El nano-spinosad, tras cargarse en la cavidad de MSHS-RS, ha demostrado una eficacia comparable a la de las larvas de garrapata del ganado (Rhipicephalus microplus). Con una mayor solubilidad en el agua, estabilidad a los rayos UV y adhesión al pelaje de Spinosad-MSHSs- RS, se espera que esta nanoformulación tenga una duración prolongada de eficacia en condiciones de campo.
Ejemplo 2 - Formación de MSHS-RS
Este ejemplo describe una realización del método para formar nanopartículas de MSHS- RS.
Los procedimientos para la síntesis controlada de esferas huecas de sílice rugosa monodispersa se ilustran esquemáticamente en la Fig. 9. En una condición típica de síntesis Stober, se añadieron resorcinol (0,15g) y formaldehído (0,21mL) en una solución básica con 70 mL de etanol, 10 mL de agua y 3mL de amoníaco (28 % en peso) con un pH de aproximadamente 11,5 para formar nanoesferas de resorcinol-formaldehído (RF) a temperatura ambiente con un diámetro de 180 nm después de 6h de polimerización. Estas nanoesferas de RF formarán una partícula de sacrificio que se eliminará finalmente. A continuación, se añadió una cierta cantidad de ortosilicato de tetraetilo (TEOS por sus siglas en inglés) en la solución de reacción, seguida de otra adición de resorcinol y formaldehído 5 minutos después en la Etapa II. Debido a la diferencia entre las tasas de deposición de sílice y de RF en la Etapa II, se formó una cáscara de triple capa sobre las esferas de núcleo de RF preformadas. En concreto, se depositó primero una capa de sílice relativamente densa sobre la superficie de las esferas de RF preformadas, debido a la mayor velocidad de condensación de los oligómeros de sílice en comparación con los de RF. Después de un cierto tiempo, cuando los oligómeros de RF comenzaron a polimerizar, el intercrecimiento de RF junto con las especies de sílice comenzó en la superficie de la primera capa de sílice, seguido de un crecimiento preferentemente vertical de estas dos especies. Esto dio lugar a la formación de una segunda capa híbrida de sílice "en forma de varilla" y RF. Con el consumo de especies de sílice, los oligómeros de RF restantes se depositaron aún más en la segunda capa para formar una capa exterior de RF puro. Al ajustar la cantidad de TEOS de 1,4 a 0,6 mL agregados en la Etapa II, el espesor de la primera capa de sílice se redujo y la distancia entre las sílice "en forma de varilla" se amplió debido a la disminución de la tasa de condensación de las especies de sílice. Cabe señalar que, con sólo 0,6 mL de TEOS añadidos, la primera capa de sílice no es continua y existen algunas grietas. Esto puede deberse a la distribución discreta de los núcleos de sílice en la superficie preformada de RF y a su lento crecimiento antes de fusionarse para formar una capa de sílice interconectada relativamente continua. Después de la calcinación en aire en la Etapa III, se eliminaron las especies de RF en los compuestos híbridos, dejando las esferas huecas de sílice con superficie rugosa. Los productos finales de sílice se denotan como S-1,4, S-1,0 y S-0,6, donde el número representa la cantidad de volumen de adición de TEOS en la Etapa II.
Las imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión (TEM por sus siglas en inglés) de S-1,4, S-1,0 y S-0,6 se muestran en las figuras 10A-10C. En todas las muestras se observó una esfera hueca de sílice monodispersa con superficie rugosa. El tamaño medio de las partículas de S-1,4, S-1,0 y S-0,6 se estima en 300, 280 y 250 nm, respectivamente. El tamaño de la cavidad hueca de las tres muestras es casi el mismo, de unos 160nm, que es relativamente menor que el tamaño de las nanoesferas de RF preformadas (180nm). Esto podría deberse a la contracción durante la calcinación. La estructura rugosa en forma de varilla de la cáscara puede identificarse claramente en las imágenes de TEM, y también se puede revelar una densidad decreciente de la distribución de la "varilla" de sílice en el recubrimiento. También se utilizó el análisis de dispersión dinámica de la luz (DLS por sus siglas en inglés) para determinar el tamaño de las partículas y la monodispersidad. Como se muestra en la Fig. 10d , el diámetro hidrodinámico de S-1,4, S-1,0 y S-0,6 es de unos 295, 310 y 325 nm, respectivamente, que es ligeramente mayor que los determinados por TEM debido a las moléculas de agua rodeadas. Las estrechas curvas de distribución del tamaño de las partículas con un pequeño valor del índice de polidispersidad (PDI por sus siglas en inglés) (0,053, 0,086 y 0,101 para S-1,4, S-1,0 y S-0,6 respectivamente) indican que todas las esferas huecas de sílice poseen tamaños de partícula uniformes y una excelente monodispersidad.
Como se muestra en las imágenes TEM de la Figura 10, la estructura rugosa en "forma de varilla" se puede identificar claramente, sin embargo, la primera capa de sílice que se encuentra debajo apenas se revela, aunque apareció un mayor contraste dentro de la cáscara de sílice. Para explorar más a fondo las estructuras detalladas de esas esferas huecas de sílice rugosas, se utilizó una técnica de tomografía electrónica (ET por sus siglas en inglés) tomando una serie inclinada de 70° a 70° con una etapa de aumento de 1°. Los tomogramas se obtuvieron procesando las imágenes inclinadas con una alineación fiduciaria de 10 nm de Au mediante IMOD. Los cortes del tomograma referidos a la parte central de las esferas huecas de sílice rugosa se muestran en las figuras 11A-C. La cáscara de sílice observada a partir de las imágenes de TEM se componía en realidad de dos capas, una capa de sílice relativamente densa y otra capa rugosa con estructuras "en forma de varilla". El grosor de la capa de sílice densa disminuyó de 41nm en S-1,4 a 31nm en S-1,0, e incluso a 19nm en S-0,6. La disminución del grosor se puede deber a que la velocidad de condensación de la sílice es más lenta al agregar menos cantidad de TEOS. Curiosamente, la capa de sílice relativamente densa en S-1,4 (Fig 11 A) y S-1,0 (Fig 11 B) son ambas continuas sin ninguna estructura de poros que conecte la cavidad hueca. Sin embargo, la de S-0,6 mostraba varias grietas con una anchura de unos 1-2 nm distribuidas en esta capa (Fig 11C, flechas negras), que proporcionaban canales de transporte para que las moléculas pequeñas accedieran al espacio hueco interior.
Para caracterizar mejor esta estructura en "forma de varilla" y su distribución en la superficie de la esfera hueca, se realizó una comparación cuantitativa. Debido al tamaño similar de las partículas de estas esferas huecas rugosas, la distancia entre cada "varilla" de sílice puede representar indirectamente su densidad de distribución. Aunque la geometría intersticial entre las "varillas" de sílice es diferente de las estructuras de poro tradicionales, su espacio también puede ser revelado por el análisis de sorción de nitrógeno y su distribución de tamaño de poro (Ref Langmuir 1999, 15:8714; J. Colloid Interface Science, 2008, 317:442). Como se muestra en la Fig. 12A, los resultados de adsorción y desorción de nitrógeno de estas esferas huecas de sílice rugosa mostraron una isoterma de tipo IV, con un bucle de histéresis entre 0,5-1,0 de P/Po, lo que indica la existencia de estructuras de mesoporos en la superficie de la esfera hueca. La distribución del tamaño de los poros mediante la rama de adsorción BJH, como se muestra en la Fig. 12B, indica que la distancia entre cada "varilla" de sílice se amplió de unos 6,3 nm en S-1,4 a 7,5nm en S-1,0, y a 9,3nm en S-0,6. Con la ampliación de la distancia entre las "barras" de sílice, hay más espacios para que las moléculas de nitrógeno se condensen, lo que finalmente logrará una mayor cantidad de adsorción (Ref Langmuir 1999, 15:8714). Esto está en consonancia con el aumento del área superficial y del volumen de los poros de 133m2/g y 0,19 cm3/g de S-1,4, a 167m2/g y 0,26 cm3/g de S-1,0, y 182m2/g y 0,37 cm3/g de S-0,6 con la ampliación de la distancia intersticial.
La introducción de la rugosidad superficial en diversos sustratos se ha logrado mediante un enfoque biomimético tanto a microescala como a nanoescala. La rugosidad de la superficie resulta en una mayor hidrofobicidad a pesar de que la sílice de la que están hechas las nanopartículas es normalmente hidrofílica. Sin embargo, el enfoque tradicional de caracterización de los resultados del ángulo de contacto de las gotas de agua no puede relacionarse fácilmente con el ángulo de contacto de las partículas individuales, especialmente en la nanoescala. Por ello, se ha desarrollado una técnica de atrapamiento en gel (GTT por sus siglas en inglés), que se basa en el atrapamiento proporcional de las nanopartículas individuales en la superficie del agua-aceite [Ref: Langmuir, 2004, 20:9594]. Al extender las partículas sobre una superficie de aceite-agua y la posterior gelificación de la fase acuosa, las nanopartículas atrapadas en la fase acuosa se replican y levantan con el elastómero de poli(dimetilsiloxano) (PDMS por sus siglas en inglés), lo que permite obtener imágenes de las partículas parcialmente incrustadas en la superficie de PDMS con SEM [Ref Langmuir 2003, 19:7970]. Este método permite la comparación cuantitativa de la hidrofobicidad de la superficie para nanopartículas individuales con diferente rugosidad superficial para correlacionar la distancia intersticial de las estructuras rugosas y su hidrofobicidad. Para justificar el aumento de la hidrofobicidad de la superficie mediante estructuras rugosas, se seleccionó como control una esfera hueca de sílice lisa (inserto de la Fig. 5A), con un grosor de cáscara de sílice relativamente denso de 60 nm y sin mesoporos evidentes en la cáscara. Como se muestra en la Fig. 5, la partícula lisa presentaba un ángulo de contacto de sólo 61°, mientras que con la estructura rugosa surgida en la superficie, el ángulo de contacto aumentó a 73° para S-1,4 y 86° para S-1,0. Con una distancia intersticial aún mayor, el ángulo de contacto puede alcanzar los 102°, lo que indica un material de sílice hidrofílico equipado con una superficie hidrofóbica por la introducción de la rugosidad, y el aumento de la hidrofobicidad superficial de las partículas con la ampliación de la distancia entre las "varillas" de sílice.
Para demostrar la utilidad de las esferas huecas de sílice de superficie rugosa para la absorción de material hidrofóbico, se utilizaron las esferas huecas de sílice rugosa para la adsorción de lisozima. Para comparar, se empleó una esfera hueca de sílice lisa como grupo de control, que sólo alcanzó 82|jg/mg. En el caso de las esferas huecas de sílice rugosa, se observó una mejora evidente de la adsorción de lisozima en la Fig. 6, con un aumento de la capacidad de S-1,4 y S1,0 hasta 358 y 408 |jg/mg, respectivamente. Especialmente en el caso de S-0,6, la capacidad de adsorción puede llegar incluso a 641 jg/mg. El aumento de la capacidad de adsorción debe atribuirse a la mayor distancia intersticial, al aumento del volumen de los poros y a la mayor hidrofobicidad superficial introducida por la rugosidad de la superficie, así como al volumen proporcionado por los núcleos centrales huecos accesibles de las esferas.
Ejemplo 3 - Sistemas de administración para uso en sistemas biológicos
En los sistemas biológicos, las interacciones hidrofóbicas se suelen considerar las más fuertes de todas las interacciones no covalentes de largo alcance. La interacción hidrofóbica es beneficiosa para la adsorción de biomoléculas, mejorando la interacción con las membranas celulares y aumentando la absorción de las nanopartículas para la administración celular, así como para adaptar la tasa de liberación de los fármacos. Para generar nanopartículas con propiedades hidrofóbicas, la elección de la composición hidrofóbica o la funcionalización son algunos de los enfoques convenientes. Los materiales hidrofóbicos, como los nanotubos de carbono (CNT por sus siglas en inglés), han demostrado ser muy prometedores como vehículos a nanoescala para la administración de fármacos; sin embargo, una de las principales preocupaciones es el hecho de que los CNT podrían ser peligrosos para el medio ambiente y la salud humana, por lo que necesitan una mayor funcionalización de la superficie para reducir su toxicidad intrínseca. Se han modificado motivos hidrofóbicos, como los alcanotioles y las cadenas de alquilos, en las superficies de varias nanopartículas, como las de oro y sílice, para mejorar la carga de fármacos/proteínas hidrofóbicas y mejorar el rendimiento de la administración celular. Sin embargo, los grupos hidrofóbicos injertados químicamente tienden a causar una toxicidad no deseada y el bloqueo de los poros de los nanotransportadores. Por lo tanto, es un reto diseñar un sistema de nanotransporte seguro y eficiente empleando un enfoque alternativo.
En este ejemplo, la ingeniería de la rugosidad de la superficie se consiguió agregando partículas de recubrimiento de sílice con tamaños más pequeños (~13 o 30 nm de diámetro) sobre esferas huecas mesoporosas de sílice (MHS por sus siglas en inglés) con tamaños relativamente más grandes (~200 o 400 nm). La rugosidad de la superficie crea los vacíos (el espacio entre las pequeñas esferas de la cáscara con un radio de R1) en la superficie exterior para el atrapamiento de aire. La bolsa de aire se amplía considerablemente en este diseño porque la cavidad esférica interna con un radio de R2 (R2»R1) está conectada con el aire a través de los mesoporos de la cáscara de sílice. La repulsión del aire atrapado en los espacios vacíos hacia las moléculas de agua proporciona la barrera energética contra el proceso de humectación porque los grupos hidroxilos de la sílice tienden a adsorber las moléculas de agua como en el caso de la sílice hueca mesoporosa (MHS por sus siglas en inglés). En comparación con las nanopartículas de sílice sólidas rugosas (RSS por sus siglas en inglés), las esferas huecas mesoporosas rugosas de sílice (RMHS por sus siglas en inglés) proporcionan más espacio para atrapar el aire, lo que conduce a una mayor barrera de energía durante el proceso de humectación y, por lo tanto, a una hidrofobicidad más distinguida. La naturaleza de la composición hidrofílica de las RMHS proporciona una alta capacidad de carga del antibiótico de "último recurso" vancomicina (VAN), mientras que la propiedad hidrofóbica facilita la liberación controlada del VAN y la adhesión a las bacterias, lo que resulta en una mayor eficacia antibacteriana, en comparación con el VAN libre y el MHS-VAN.
Las nanopartículas de MHS se sintetizaron mediante una estrategia de grabado alcalino dirigida por tensioactivos. Las RMHS se prepararon mezclando MHS con carga positiva después de la funcionalización del grupo amino con nanopartículas de sílice Stober con carga negativa (~ 40 nm de diámetro), seguido de calcinación. Las imágenes de microscopio electrónico de barrido (SEM por sus siglas en inglés) y de microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM por sus siglas en inglés) muestran que se han preparado con éxito RMHS de 450 nm de tamaño medio con una morfología esférica uniforme (Figura 14a, 14c). Las superficies de RMHS están decoradas de forma homogénea con nanoesferas de sílice de 40 nm, lo que indica que las nanoesferas de sílice se adhieren con éxito a la superficie de MHS. En cambio, MHS (Figura 2b, 2d) tiene un tamaño medio de partícula de 350 nm. Las imágenes HRTEM (Figura 14c, 14d) indican claramente la estructura de núcleo hueco@cáscara porosa de RMHS y MHS. El núcleo hueco tiene un diámetro de ~ 230 nm y el recubrimiento porosa tiene un grosor de unos 60 nm. Las imágenes de SEM muestran el núcleo hueco de las nanopartículas con una morfología monodispersa tanto para las MHS como para las RMHS. El tamaño hidrodinámico de las MHS y las RMHS se midió además mediante dispersión dinámica de la luz (DLS por sus siglas en inglés), que muestra un tamaño de 396 nm para las MHS y de 459 nm para las RMHS, lo que concuerda con los resultados del SEM y el TEM. La distancia entre dos nanoesferas de sílice vecinas se mide en torno a 30 nm y el hueco entre ellas proporciona espacio para el atrapamiento de aire.
Tanto la MHS como la RMHS mostraron isotermas típicas de tipo IV con un bucle de histéresis de tipo H2, lo que indica la existencia de mesoporos bien definidos. Las distribuciones del tamaño de los poros calculadas a partir de las ramas de adsorción utilizando el método Barrett-Joyner-Halenda (BJH) mostraron que ambas muestras tienen mesoporos uniformes centrados en 3,5 nm. Las RMHS tiene una superficie relativamente menor en comparación con la MHS (342 frente a 427 m2 g-1) porque las partículas de la cáscara son sólidas. El mayor volumen de poros de las SSRM (0,46 frente a 0,31 cm3 g-1 de las SSM) se atribuye principalmente a los vacíos de empaquetamiento entre partículas, como refleja la etapa de condensación capilar que se produjo a una presión relativa (P/P0) superior a 0,95. La medición de la carga superficial mediante el potencial z mostró que tanto la RMHS como la MHS estaban cargadas negativamente en un grado similar. Ambas muestras tienen una composición de sílice pura, tal y como confirma la espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR), que muestra los picos característicos del agua fisorbida (-OH) a 1620 cm-1, del grupo silanol (Si-OH) a 790cm-1, así como del grupo siloxano (Si-O-Si) a 1062 y 449 cm-1.
La hidrofobicidad de las nanopartículas se observó mediante la dispersión de MHS y RMHS en un disolvente mixto de agua/éter dietílico. Las RMHS descansa preferentemente en el fondo de la capa de éter dietílico (un disolvente hidrofóbico) mientras que la MHS se dispersa directamente en la capa de agua (un disolvente hidrofílico) incluso sin agitación suave. SSR también mostraba un comportamiento similar al de SSR en la capa de agua/éter dietílico. Esto se produjo debido a la competencia entre la afinidad del Si-OH hacia las moléculas de agua y la repulsión del aire atrapado en los espacios vacíos hacia las moléculas de aceite y de agua (como se presenta en la Figura 1). Los perfiles del análisis termogravimétrico (TGA por sus siglas en inglés) presentaron una pequeña pérdida de peso del 0,9% por debajo de los 200°C en el caso de las RMHS, mientras que el 7,2% en el caso de las MHS, lo que se puede atribuir a la evaporación de la humedad. Los resultados del TGA indican que la introducción de la rugosidad de la superficie hace que las RMHS sea más hidrofóbica y, por tanto, absorba menos humedad de la atmósfera que las MHS.
También se empleó un método de adsorción de colorante (rosa de Bengala, RB) para determinar cuantitativamente la hidrofobicidad relativa de las nanopartículas. Se construyó un gráfico del cociente de partición (PQ por sus siglas en inglés) frente a la superficie de las nanopartículas por mililitro para RMHS, MHS y RSS. La pendiente de este gráfico es proporcional a la hidrofobicidad relativa de las nanopartículas. En comparación con el RSS, cuya pendiente es de 0,000675 X 10-9 mL jm -2, el RMHS arrojó un valor de pendiente más alto, de 0,00106 X 10-9 mL jm -2, lo que indica una mayor hidrofobicidad de las RMHS en comparación con el RSS. Las MHS, por otro lado, mostró la menor pendiente sin valor significativo, lo que sugiere una naturaleza hidrofílica.
Se utilizaron RMHS y MHS en la adsorción de tres proteínas hidrofóbicas, incluyendo la RNasa A (RNASE por sus siglas en inglés), la insulina (INS) y la lisozima (LYS por sus siglas en inglés), un colorante hidrofóbico, el rojo disperso 1 (DR1) y un fármaco hidrofóbico, la griseofulvina (GRIS). Como se muestra en la Figura 15a, se logró una mayor capacidad de carga exclusivamente para cinco sorbatos mediante RMHS que MHS. En comparación con MHS, también se observó una mayor velocidad de adsorción de DR1 (Figura 15b) y LYS al comparar la RMHS con las MHS. Estos resultados indican que la mayor hidrofobicidad superficial de las nanopartículas favorece una mayor y más rápida carga de moléculas hidrofóbicas. La capacidad de carga de RSS hacia lYs también se midió como 25,9 mg g-1. En comparación con las de RMHS (263,1 mg/g), la cantidad de carga de LYS mucho menor de la RSS puede atribuirse a su naturaleza sólida.
Para comprender mejor el papel del aire que induce la hidrofobicidad de RMHS, la capacidad de adsorción de la SSRM hacia la LYS se realizó en soluciones después de eliminar las burbujas de aire en condiciones de vacío. Se comprobó que la cantidad de adsorción del LYS sobre la RMHS se redujo en un 37,3% (de 263,1 mg g-1 a 172,1 mg g-1), comparable a la capacidad de adsorción de la MHS (161,5 mg g-1). Se realizó un experimento adicional eliminando el proceso de presonificación para retener la mayor parte del aire atrapado por las nanopartículas. Se logró una mayor carga de LYS mediante RMHS sin sonicación con un incremento del 27,5% en comparación con la adsorción utilizando RHMS sujeta a las etapas de presonificación en la Figura 15a. Estos resultados confirmaron el papel del aire como disolvente hidrofóbico en la estructura de la RMHS, que posteriormente mejora la adsorción para la proteína. Por el contrario, la rugosidad de la superficie no influye en la capacidad de carga de una molécula hidrofílica, VAN, como se muestra en la Figura 4c. Con esta molécula hidrofóbica se alcanzó un valor de carga similar tanto para las MHS como para las RMHS. Sin embargo, la propiedad hidrofóbica de la RMHS permitió un comportamiento de liberación sostenida de VAN hasta más de 36 h en relación con la liberación del 100% a las 8 h para la MHS (Figura 15c).
El tamaño de las nanopartículas del núcleo con una morfología similar se puede ajustar aún más con el mismo método de preparación. Los inventores han preparado con éxito MHS y RMHS con un tamaño medio de núcleo de 200 nm y un tamaño de partículas del recubrimiento de 13 nm, denominadas MHS200 y RMHS200. Ambas nanopartículas tienen una morfología superficial similar a la de las partículas más grandes (MHS y RMHS), como muestran las imágenes de TEM y SEM. MHS200 y RMHS200 tienen un tamaño de poro ligeramente menor (3,4 nm) y un volumen de poro relativamente mayor (0,38 cm3 g-1 para MHS200 y 0,62 cm3 g-1 para RMHS200) en comparación con las partículas de mayor tamaño.
El uso de nanopartículas como vehículo de administración de antibióticos proporciona una estrategia prometedora gracias a la prolongación de la vida media de circulación del fármaco, el aumento de la disponibilidad de los fármacos que interactúan con las moléculas de la membrana y la promoción de la liberación sostenida del fármaco. VAN es un antibiótico útil para el tratamiento de varias infecciones bacterianas, ya que inhibe la síntesis de la pared celular en las bacterias susceptibles. Para demostrar la eficacia antibacteriana del VAN administrado por los materiales de ingeniería de superficie, se incubaron nanopartículas cargadas de fármaco con Escherichia coli (E. coli). En este estudio se eligieron nanopartículas con un tamaño de 200 nm (MHS200 y RMHS200) porque la prueba de cribado demostró que, en comparación con las partículas más grandes (~400 nm), las más pequeñas presentaban un mayor efecto de toxicidad bacteriana. La actividad antibacteriana in vitro de VAN, MHS200-VAN y RMHS200-VAN se evaluó controlando la densidad óptica (DO) a 600 nm de una suspensión bacteriana. E.coli (1 X 106 CFU mL-1) se incubó en medio Luria-Bertani (LB) en un tubo de centrífuga de 1,5 ml con varias concentraciones de VAN durante 18 h. El valor de la concentración inhibitoria mínima (CIM) de VAN libre hacia E.coli se observó en 25 jg mL-1 (Figura 16a). Este valor se redujo a 20 jg ml-1 para RMHS200-v An , que es inferior a la dosis utilizada con el MCM-41 conjugado con VAN (200 jg ml-1) en el cultivo in vitro de E. Coli a las 18 h. En un experimento separado, MHS200-VAN, RMHS200- VAN y VAN libre con el mismo contenido de VAN de 25 jg ml-1 se incubaron con 1 X 106 UFC mL-1 E. Coli en medio LB y se midió la DO en función del tiempo. Se observó que RMHS200-VAN mantuvo una inhibición del 100% a lo largo de 24 h. Sin embargo, se observó un nuevo crecimiento de las bacterias, evidenciado por el aumento de la DO, tanto en el grupo MHS200-VAN como en el grupo VAN libre después de 18 h (Figura 16b).
Se informó que el nuevo crecimiento de las bacterias expuestas a VAN puede ocurrir si las bacterias inadecuadamente inhibidas sintetizan nuevo peptidyglocan para anular el efecto antibacteriano de VAN. La inhibición del 100% de E.Coli incluso a las 24 h en el caso de RMHS200-VAN se debe atribuir a dos ventajas procedentes del diseño de las nanopartículas: 1) las partículas de superficie rugosa tienen una mayor eficacia en comparación con sus homólogas lisas; y 2) la naturaleza hidrofóbica del RMHS200, que conduce a una liberación sostenida de VAN en comparación con el MHS200 (Figura 16d), similar a la de las nanopartículas de mayor tamaño (Figura 16c). Finalmente, la ventana de tiempo efectiva del fármaco se incrementa.
Para proporcionar evidencia directa sobre la eficacia antibacteriana de las nanopartículas, se empleó TEM para observar la morfología de E.coli cultivada a las 24 h (Figura 16(c-f)). En el grupo no tratado (Figura 16c), las morfologías cilíndricas típicas de E.coli permanecieron intactas. En comparación con el grupo no tratado, las bacterias tratadas con VAN mostraron daños en la membrana bacteriana (Figura 16d-f). En el caso de MHS200-VAN, se encontró MHS200 en la membrana bacteriana (Figura 16e) y se observó claramente un daño severo de la pared/membrana de E.coli (Figura 16f). También se evaluó la citotoxicidad celular de MHS200 y RMHS200 para el fibroblasto dérmico humano normal (HDF por sus siglas en inglés) mediante el ensayo MTT. No se observó ninguna citotoxicidad significativa de ambas nanopartículas, incluso a una concentración de hasta 500 |jg/mL, lo que demuestra la excelente bioinercia y seguridad de los materiales como sistema portador.
En conclusión, este ejemplo muestra que los inventores han preparado con éxito nuevas nanopartículas con una composición de sílice hidrofílica pero con propiedades hidrofóbicas a través de la modificación de la rugosidad de la superficie, que muestran una mayor capacidad de carga de moléculas hidrofóbicas y una liberación sostenida para fármacos hidrofílicos en comparación con sus homólogos con una superficie lisa. Los conocimientos fundamentales obtenidos en este estudio proporcionan una nueva estrategia para el desarrollo de nanotransportadores con una composición segura y un alto rendimiento en aplicaciones generalizadas de administración de fármacos.
Ejemplo de referencia 4 - Preparación de nanopartículas de carbono
En este ejemplo se describe una nueva vía de nucleación heterogénea secuencial (SHN por sus siglas en inglés) para preparar nanopartículas coloidales de carbono autoorganizadas con mesoestructuras y morfologías controlables en ausencia de agentes directores de estructura. El concepto de SHN se ilustra esquemáticamente en la Figura 17. La síntesis se lleva a cabo en un sistema etanol/agua con NHsH2O como catalizador, utilizando simplemente ortosilicato de tetraetilo (TEOS por sus siglas en inglés), resorcinol y formaldehído (RF por sus siglas en inglés) como precursores. En la etapa I, cuando se mezclan los precursores TEOS y RF, se forman esferas de Stober a través de un proceso de nucleación homogéneo debido a la velocidad de condensación relativamente más rápida en comparación con el sistema RF. Una vez formadas las esferas de sílice, los precursores de RF se condensan preferentemente en la superficie de la sílice mediante nucleación heterogénea. Para afinar la estructura de la pared, se introduce de nuevo TEOS en la etapa II, que forma nanopartículas de sílice distribuidas uniformemente en la superficie de la capa de RF mediante un proceso de nucleación heterogéneo posterior. Los oligómeros de RF residuales se condensan además en la parte superior de las nanopartículas de sílice para crear una segunda capa de RF. Después de la carbonización con o sin tratamiento hidrotérmico (etapa III) en atmósfera inerte, seguida de la eliminación de la sílice (etapa IV), se obtienen esferas huecas de carbono mesoestructuradas (MHCS por sus siglas en inglés) con una estructura bicapa. Controlando el grosor de las cáscaras de carbono/sílice, la morfología bicapa (esferas invaginadas, endoinvaginadas o intactas) y el tamaño de los mesoporos se pueden regular con precisión.
A partir de las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM por sus siglas en inglés) presentadas en la Figura 18 (A,C), las MHCS preparadas sin tratamiento hidrotérmico en la etapa III muestran una morfología esferoidal invaginada, muy parecida a la de un globo desinflado en el que un lado de la esfera se pliega hacia el otro. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM por sus siglas en inglés) de los MHCS invaginados muestran una estructura interna claramente bicapa y hueca (Fig. 18B). Cuando las MHCS se preparan con tratamiento hidrotérmico, se obtiene una morfología esferoidal intacta, como muestra la imagen de SEM (Fig. 18C). Las observaciones de TEM para estas partículas también muestran una estructura esférica concéntrica de dos capas (Fig. 18D).
Las MHCS invaginadas e intactas muestran diámetros exteriores uniformes de 250 y 270 nm, respectivamente. Además, ambas partículas se dispersan bien en solución acuosa y producen el característico efecto Tyndall que se observa habitualmente en las suspensiones coloidales monodispersas (Fig. 18E). Las mediciones de dispersión dinámica de luz (DLS por sus siglas en inglés) revelan un tamaño de partícula hidratada de 265 y 295 nm para las MHCS invaginadas e intactas, respectivamente (Fig. 18F). Las estrechas distribuciones de tamaño y el bajo índice de polidispersidad (PDI de 0,1) de las dos muestras indican que ambos MHCS poseen un tamaño de partícula altamente uniforme y una excelente dispersabilidad en agua. Las imágenes SEM de alta resolución revelan superficies externas altamente porosas y rugosas con entradas de poros abiertos para los MHCS invaginados. Por otro lado, los MHCS intactos presentan una morfología superficial relativamente suave y continua.
En el caso de los nanoobjetos tridimensionales (3D) con estructuras internas complejas, como las MHCS, la investigación mediante TEM convencional puede proporcionar información engañosa. Esto se debe a que las imágenes de TEM proporcionan la información estructural colectiva sobre un determinado grosor y la fusionan en una proyección 2D. Por ejemplo, las estructuras finas entre las capas internas y externas no están claras. Además, parece que las dos esferas mostradas en la Fig. 18B (indicadas con flechas) no están invaginadas, aunque este efecto podría ser el resultado de que el haz de electrones pase perpendicularmente al plano de invaginación. La tomografía electrónica (TE) es una técnica de rápido desarrollo para la obtención de imágenes 3D avanzadas de estructuras complejas, que permite la reconstrucción virtual de la estructura interna de un material mediante modelos 3D construidos a partir de una serie de cortes 2D (19, 20).
Utilizamos la técnica TE para estudiar las estructuras detalladas de las MHCS. Se tomó una serie de imágenes inclinadas en el rango de 70 a -70° con incrementos de 1°. Utilizando esta técnica, se puede observar claramente la partícula de MHCS invaginadas que aparentemente cambia de una estructura esférica invaginada a una intacta. Esto pone de manifiesto la ambigüedad de los datos proporcionados únicamente por la TEM convencional y confirma la importancia de la caracterización de la TE para los materiales con arquitecturas complejas y asimétricas. Para observar las estructuras internas detalladas de las MHCS, se generaron tomogramas electrónicos a partir de dos series de inclinación perpendicular utilizando el software IMOD (21). El corte de TE que corta perpendicularmente a la cara de invaginación de las MHCS (Fig. 19A) exhibe una morfología claramente bicapa, en forma de luna creciente. Las capas interna y externa están unidas por finos puentes de carbono de aproximadamente 1-2 nm de grosor (indicados por las flechas negras). Por el contrario, una serie de inclinación de las MHCS intactas revela una morfología esférica completa durante toda la rotación (datos no mostrados). La diapositiva TE de la Fig. 19C muestra una morfología parecida a la de la luna llena para el MHCS intacto, en la que las dos capas concéntricas están unidas por puentes de carbono más sustanciales con un grosor de aproximadamente 4-5 nm.
Las muestras invaginadas e intactas también difieren notablemente en el grosor y el grado de continuidad de las capas internas y externas. Las capas exteriores de las muestras invaginadas e intactas parecen relativamente continuas con un grosor medio de 6 y 12 nm respectivamente, sin embargo, la capa interior de la estructura invaginada muestra numerosos defectos e interrupciones que forman un recubrimiento interior más frágil y discontinua en comparación con la estructura intacta. Los tamaños medios de los espacios vacíos entre dos capas miden aproximadamente 15 y 20 nm radialmente desde la capa interior a la exterior para las MHCS invaginadas e intactas, respectivamente. Las estructuras reconstruidas digitalmente para dos MHCS con recubrimientos internos en naranja y externos en amarillo se muestran en las Figs. 19B y 19D, respectivamente. En las MHCS invaginadas se puede observar la invaginación de las capas internas y externas, mientras que en las MHCS intactas se observa una morfología esférica, lo que coincide con las observaciones morfológicas de TEM y SEM. Además, también se observan puentes de carbono que unen la capa interior y la exterior tanto en las MHCS invaginadas como en las intactas.
Los estudios de sorción de nitrógeno para las MHCS invaginadas e intactas muestran isotermas de adsorción de tipo IV. Los tamaños de poro BJH calculados a partir de la rama de adsorción indican tamaños de poro de 15,9 y 18,0 nm para las MHCS invaginadas e intactas, respectivamente. Estos tamaños de poro se corresponden estrechamente con la distancia medida entre las capas internas y externas observada en las micrografías de TE y TEM, lo que sugiere que este espacio confinado entre las capas es el responsable de la distribución del tamaño de los poros BJH. El área superficial BET y el volumen de poros de los MHCS invaginados (1032 m2 g-1 y 2,11 cm3 g-1, respectivamente) son ligeramente superiores a los obtenidos para los MHCS intactos (880 m2 g-1 y 1,44 cm3 g-1, respectivamente), lo que puede atribuirse a que las cáscaras son más finas y, por tanto, a que la relación volumen/superficie es mayor en los MHCS intactos de construcción más sólida. Los espectros de fotoelectrones de rayos X (XPS) muestran que sólo se detectan picos de C1s (~285 eV) y O1s (~534 eV), revelan que los principales componentes de las MHCS invaginadas e intactas son el carbono y el oxígeno (22). Se calcula que el porcentaje en masa del carbono y del oxígeno es del 92,9% y del 7,1%, respectivamente. Los patrones de difracción de rayos X (XRD por sus siglas en inglés) revelan la naturaleza amorfa de las MHCS.
Para entender el mecanismo de formación de las MHCS, estudiamos sistemáticamente los procesos de nucleación y crecimiento de las partículas de sílice-RF en función del tiempo. Dado que tanto el TEOS como el RF pueden polimerizar independientemente bajo las mismas condiciones para formar partículas sólidas uniformes (Figura 20, curva I y II), se investigó primero su cinética de reacción individual. En las condiciones de síntesis utilizadas, la polimerización de TEOS provoca la formación de partículas de sílice en 15 minutos (m), lo que coincide con el período de inducción típico que se observa habitualmente en la formación de esferas de Stober (23). A continuación, estas esferas aumentan rápidamente de tamaño hasta las 2 h, después de lo cual el tamaño de las partículas es relativamente constante. Por otro lado, la polimerización por RF en las mismas condiciones forma esferas con un crecimiento más lento. La formación de algunos núcleos irregulares de polímero de RF es observable a la 1 h, que continúan desarrollándose hasta convertirse en partículas esféricas a las 2 h. Las esferas de RF aumentan de tamaño con relativa rapidez de 2 a 6 h, seguidas de una región de crecimiento más lento hasta las 12 h. De la curva II puede deducirse que los oligómeros de RF libres persisten en el sistema sintético a las 12 h.
Cuando se añaden simultáneamente TEOS y RF, la curva III de la Fig. 20 revela que el tamaño de las partículas sigue inicialmente (hasta 1 h) la misma tendencia que en el sistema de sílice pura, formándose únicamente partículas de sílice. Después de 2 h, el tamaño de las partículas aumenta gradualmente hasta alcanzar los 250 nm a las 12 h, formando estructuras de núcleo-recubrimiento de sílice@RF con un grosor creciente de la cáscara de RF en función del tiempo. No se encuentran evidencias de esferas sólidas de RF ni de esferas sólidas de carbono después de la carbonización/grabación de la sílice, indicando que el sistema de polimerización por RF ha pasado de la nucleación homogénea a la heterogénea en la superficie de los núcleos de sílice, en consonancia con la teoría clásica de la nucleación según la cual la barrera de energía libre para la nucleación heterogénea en una superficie es considerablemente menor en comparación con la nucleación homogénea. Sin embargo, este enfoque da lugar a esferas de carbono huecas con paredes sólo microporosas, lo que tiene poco control sobre la morfología y las mesoestructuras de los productos finales y, por tanto, aplicaciones limitadas.
Cuando se introduce TEOS en la etapa II en un punto de tiempo cuidadosamente elegido de 6 h, se utilizó la TEM para controlar la evolución estructural durante las siguientes 2 h. A partir de las imágenes de TEM de las muestras después de la calcinación en aire, se puede ver que aparece una población secundaria de núcleos de sílice en la superficie de las partículas de sílice@RF dentro de los 15 m posteriores a la segunda adición de TEOS. Las nanopartículas de sílice secundarias aumentan de tamaño desde ~5 nm a los 15 m hasta -10 nm a los 30 m antes de fusionarse para formar una cáscara de sílice interconectada relativamente continua con un grosor radial de 18 nm a las 2 h. Después de la adición de TEOS secundario, el tamaño de las partículas aumenta constantemente (Fig. 20, curva IV) en relación con las partículas de sílice@RF mostradas en la curva III, alcanzando 30 nm adicionales de diámetro después de 12 h de crecimiento. Los datos de TEM confirman la ausencia de nanopartículas de sílice sólidas en los productos finales. Las observaciones anteriores indican que la capa de partículas de sílice@RF formada en la etapa I desencadena una posterior nucleación heterogénea de TEOS. Debido al comportamiento de polimerización más lento del sistema RF, los precursores RF restantes se nuclean preferentemente en la superficie de la sílice. La nucleación heterogénea secuencial de dos sistemas polimerizables y su interacción da lugar a una estructura de recubrimiento compuesta de sílice-RF interpenetrada. La eliminación de la sílice en el núcleo y el recubrimiento después de la carbonización da lugar a las estructuras finales de las MHCS.
Los resultados de ET de las estructuras finas de las MHCS están de acuerdo con el mecanismo de SHN. Los puentes entre dos capas de carbono proceden del intercrecimiento de RF con nanopartículas de sílice secundarias. El tratamiento hidrotérmico favorece una mayor condensación del sistema de RF, dando lugar a bicapas más gruesas, así como a puentes, y finalmente a MHCS intactos. Las MHCS invaginadas con superficie porosa expuesta se forman debido a las capas de RF más finas y a los puentes cuando no se utiliza el tratamiento hidrotérmico en la etapa III.
El mecanismo SHN se puede repetir en ciclos de nucleación adicionales. Como demostración, se introdujo en el sistema una tercera adición de precursores de sílice y RF. Las estructuras de MHCS de triple capa resultantes son consistentes con otro ciclo de nucleación heterogénea. El TEOS añadido nuclea heterogéneamente en la superficie de RF, formando una población adicional de nanopartículas de sílice, seguida de la nucleación heterogénea y el crecimiento de RF sobre la sílice. El uso de la vía SHN bajo las mismas condiciones de polimerización para múltiples ciclos proporciona un margen para el diseño de nanomateriales con estructuras elegantes.
La selección juiciosa de los puntos de tiempo para la adición de TEOS en la etapa II puede determinar la forma de las estructuras finales. Cuando se agregó TEOS antes (en el punto de tiempo de 3 h en lugar de 6 h), no se observaron estructuras bicapa obvias tanto para las partículas de carbono invaginadas como para las intactas. En su lugar, las estructuras muestran recubrimientos de carbono mesoporoso de una sola capa. Cuando se añadió TEOS a las 24 h, sólo se obtienen estructuras huecas de carbono microporoso con un grosor de 15 nm. Estos resultados demuestran que el control cuidadoso de la cinética de polimerización y la regulación elaborada del proceso de nucleación de los precursores TEOS y RF en secuencia permite la formación de MHCS bicapa.
Para investigar los parámetros que influyen en la invaginación de las partículas huecas, preparamos una serie de esferas de carbono huecas de una sola capa con espesores de pared controlados. El grosor de la pared se controló de 5 a 16 nm mediante el aumento del tiempo de agitación de 6 a 36 h (etapa I del esquema). Los resultados demuestran claramente que cuando el grosor de la esfera hueca de carbono monocapa es tan fino como 5 nm, la mayoría de las partículas muestran una morfología invaginada. Al aumentar el grosor a 8 nm, sólo se observa un pequeño número de esferas invaginadas, mientras que al aumentar a 13 nm sólo se obtienen esferas intactas. Este estudio demuestra que el grosor de la capa de carbono desempeña un papel crucial en el control de las morfologías invaginada o intacta de los productos finales.
La distancia entre los recubrimientos se ajustó de 7 a 27 nm aumentando la cantidad de TEOS de 0,5 a 2,5 ml agregada en la etapa II. Todas las muestras preparadas sin tratamiento hidrotérmico presentan una morfología invaginada, mientras que las muestras con tratamiento hidrotérmico presentan una morfología esférica intacta. Los tamaños de los poros, las áreas superficiales BET y los volúmenes de los poros de las muestras calculados a partir de la sorción de N2 son coherentes con los resultados obtenidos de las mediciones TEM. La tendencia general es que las muestras sin tratamiento hidrotérmico exhiben áreas superficiales y volúmenes de poros mucho mayores que las muestras con tratamiento hidrotérmico, lo que coincide con lo observado anteriormente. Además, cuanto mayor es la distancia entre recubrimientos, mayor es el área superficial y el volumen de poros observados. Esto se puede atribuir a la ampliación de la región intercalar mesoporosa en las muestras con una gran distancia intercalar. Las plantillas de sílice correspondientes muestran un aumento del tamaño y la continuidad de los recubrimientos de sílice con el aumento de la cantidad de TEOS agregada.
En particular, cuando el espacio entre capas se amplía a 27 nm y después del tratamiento hidrotérmico, se obtiene una estructura sin precedentes con la capa interna invaginada mientras que la capa externa permanece intacta (llamada estructura endo-invaginada) (Fig. 21A). Las figuras 20B y 20C muestran dos imágenes de TEM registradas a lo largo de los ejes x y z (paralelo y perpendicular al plano endo-invaginado), respectivamente. El corte de ET mostrado en la Fig. 21D revela la morfología transversal de media luna y esférica de las capas interna y externa respectivamente a lo largo del plano yz justo en el centro de la estructura endo-invaginada. Se dan dos cortes adicionales de ET a lo largo del plano xy (Fig. 21E y 21F) a la altura z de a y b como se indica en la Fig. 21A, respectivamente, mostrando dos anillos concéntricos y tres anillos concéntricos en consecuencia. Se pueden observar algunos puentes de carbono que conectan el anillo más externo con el anillo central (Figs. 21E y 21F). Sin embargo, en el anillo central no se observan puentes que conecten el anillo más interno, lo que indica que estas dos superficies que originalmente provienen de la esfera interna no están fusionadas. Estas características distintivas de la estructura serían imposibles de obtener utilizando técnicas convencionales de caracterización distintas de la TE.
La invaginación del recubrimiento interior puede atribuirse a la formación de una capa de sílice gruesa y continua durante la etapa II, que limita la interpenetración de RF y, por tanto, disminuye el grosor y la densidad de los puentes de carbono. También se observa que el espesor del recubrimiento de la esfera exterior es más grueso en comparación con el de la esfera interior invaginada (Figs. 21D- 21F), lo que se atribuye al tratamiento hidrotérmico. Al reducirse el apoyo de los puentes entre la cáscara externa y la interna, la esfera interna, más frágil y con paredes más delgadas, se desprende y colapsa separándose del revestimiento externo, más gruesa e intacta, formando el único MHCS endoinvaginado.
Probamos además la aplicación de MHCS para la adsorción de lisozima. Tanto para las partículas invaginadas como para las intactas, se puede alcanzar alrededor del 75% de la adsorción de saturación en 10 minutos, lo que sugiere una cinética de adsorción rápida hacia la lisozima. La cantidad máxima adsorbida de lisozima en las partículas invaginadas es de alrededor de 1250 |jg mg-1 después de 6 horas, mostrando la mayor capacidad de adsorción hacia la lisozima en comparación con los informes anteriores. La rápida tasa de adsorción y la elevada capacidad de adsorción se deben al gran tamaño de entrada, la área superficial elevada y la hidrofobicidad de las MHCS invaginadas.
Este ejemplo demuestra que se han diseñado partículas coloidales de carbono con estructuras sin precedentes (morfologías invaginadas, endoinvasadas e intactas de dos capas) a través de una vía de nucleación heterogénea secuencial mediante la autoorganización de dos sistemas polimerizables. Este mecanismo de SNH define los ciclos recurrentes de nucleación heterogénea a través de los cuales se pueden autoorganizar los compuestos interpenetrantes nanoestructurados y ajustar con precisión la estructura, la morfología de las nanopartículas de carbono coloidal.
Ejemplo 4: Demostración de una mayor adhesión a las paredes celulares bacterianas
Se empleó E. coli, una típica bacteria gramnegativa, y se incubó con esferas huecas de sílice (concentración de 100 jg m L -1) en medio de caldo Luria (LB por sus siglas en inglés). Se comparó la adhesión partícula-bacteria de las partículas de MSHS-SS y MSHS-RS para demostrar el efecto de la superficie rugosa de sílice mediante observación directa utilizando microscopía electrónica tras la fijación y tinción de las bacterias. Como se muestra en la figura 22a, E. coli presenta una morfología intacta en forma de varilla con menos partículas de MSHS-SS adheridas a la superficie bacteriana en comparación con las partículas de MSHS-RS-B (figura 22b) y MSHS-RS (figura 22c). Cabe destacar que algunas de las partículas de MSHS-RS están parcialmente engullidas en la pared celular de la bacteria, dejando una abolladura semiesférica en la superficie de la bacteria al desprenderse (Figura 22c, identificada con flechas negras). El proceso de engullimiento suele estar relacionado con la fuerza de las interacciones atractivas entre la membrana celular y la partícula, lo que indica una mayor adhesión entre las partículas de MSHS-RS y la pared celular de la bacteria. Por el contrario, la superficie lisa de las partículas de MSHS-SS proporciona un área de contacto limitada para la interacción interfacial, lo que hace que se adhieran menos partículas a la superficie de las bacterias. Además, la repulsión electrostática entre las nanopartículas de sílice cargadas negativamente y la superficie de las bacterias también dificulta su interacción. Es favorable mejorar la atracción electrostática hacia las bacterias para las nanopartículas de sílice mediante la modificación con aminas. Sin embargo, la toxicidad no deseada inducida por los grupos amina sigue siendo una preocupación. En este caso, mediante la ingeniería de la rugosidad de la superficie, las partículas de MSHS-RS muestran propiedades de adhesión bacteriana mejoradas, lo que se puede atribuir a las interacciones multivalentes inducidas por sus picos superficiales al entrar en contacto con la superficie de las bacterias peludas, que resulta en una fuerte adhesión a través de un gran número de contactos.
Para analizar cuantitativamente la cantidad de sílice adherida a la superficie de las bacterias, las bacterias cultivadas con las partículas de sílice se filtraron a través de una membrana de filtro de 450 nm de poro. Se aplicó un lavado exhaustivo para eliminar las partículas aisladas en la solución. También se analizaron muestras sin bacterias como control y para eliminar la interferencia de las partículas de sílice agregadas. Los resultados del ICP (Figura 22d) muestran que menos de 0,1 pg de partículas MSHS-SS se adhieren a la superficie de cada célula bacteriana, mientras que, 0,36 pg de partículas de MSHS-r S-B y 0,48 pg de MSHS-RS permanecen en cada bacteria.
Ejemplo 5: Formulación con lisozima
Para demostrar la eficacia de entrega de las partículas de sílice con agentes antimicrobianos, se inmovilizó lisozima en estas esferas huecas de sílice. Como se muestra en la Figura 23a, debido a la limitada superficie externa proporcionada para la adsorción de lisozima, las partículas de MSHS-SS muestran la capacidad de carga más baja de sólo 61 jg-m g'1 (mg de lisozima por mg de sílice). Por el contrario, las partículas de MSHS-RS muestran la mayor capacidad de carga de 270 jg-m g-1, que es el doble de la alcanzada por las partículas de MSHS-RS-B (135 jg-mg-1). Esto se atribuye al aumento del volumen del mesoporo de 0,117 cm3 g_1 (MSHS- RS-B) a 0,229 cm3 g_1 (MSHS-RS). El potencial zeta de la superficie de las esferas huecas de sílice antes y después de la carga de lisozima se caracterizó en una solución amortiguadora de fosfato (PBS por sus siglas en inglés) de 10 mM. Tras la carga de lisozima, el potencial zeta de las partículas de MSHS-SS cambia drásticamente de -29 mV a -3 mV, lo que indica que la lisozima con carga positiva se adsorbe en la superficie externa. Sin embargo, para las partículas de MSHS-RS-B y MSHS-RS, su carga superficial cambia de -19 mV y -18 mV a -8 mV y -6 mV, respectivamente. Esto sugiere que las moléculas de lisozima están típicamente inmovilizadas en los mesoporos de las partículas de MSHS- RS-B y MSHS-RS, lo que resulta en una neutralización limitada de la carga superficial.
Ejemplo 6: Liberación de lisozima
Se examinó el comportamiento de liberación de lisozima de las partículas de sílice en condiciones con una concentración inicial fija de lisozima (270 jgm L-1 ) en PBS. Las partículas de MSHS-SS exhiben una liberación acelerada de lisozima con más del 85% liberado en 18 h. En comparación con estas partículas lisas, las partículas de MSHS-RS-B muestran una tasa de liberación relativamente más lenta con alrededor del 75% de lisozima liberada después de 24 h. Las partículas de MSHS-RS exhiben el perfil de liberación más sostenido entre las tres partículas, con sólo el 74% de lisozima liberada a las 72 h. Sin embargo, se supone que las MSHS-RS con un tamaño de poro relativamente grande tienen un perfil de liberación rápido. La liberación retardada de las moléculas de proteína de las MSHS-RS puede ser el resultado de la mayor hidrofobicidad de la superficie inducida por la rugosidad de la superficie y la cavidad interna accesible.
Ejemplo 7: Actividad antibacteriana de la lisozima formulada
La actividad antibacteriana in vitro de la lisozima libre y de las partículas de sílice cargadas de lisozima formuladas mediante el procedimiento anterior se comparó mediante la medición de la densidad óptica (DO). E. coli (5X106 CFLmL-1) se incubó con varias concentraciones de lisozima y las correspondientes partículas de sílice cargadas de lisozima durante 24 h. En todas las muestras se observó un rendimiento antibacteriano dependiente de la dosis, en el que las concentraciones/cargas más altas de lisozima dieron lugar a una mayor actividad antibacteriana. La lisozima formulada en las partículas de sílice mostró una mayor actividad en comparación con la lisozima libre a la misma concentración de lisozima y este efecto es más significativo a una concentración de lisozima superior a 500 jg-m L'1. Las partículas de sílice rugosas muestran una mayor actividad antibacteriana frente a E. coli en relación con la lisozima libre y las partículas de MSHS- SS, especialmente para las partículas de MSHS-RS, mostrando un valor de concentración mínima inhibitoria (CMI) de 700 jg m L -1 para estas últimas. Por el contrario, la CIM de la lisozima libre frente a E. coli no puede alcanzarse ni siquiera a una concentración tan alta como 2 mgm L-1.
Para demostrar aún más las ventajas de las partículas de sílice como portadoras de lisozima, se comprobó la inhibición bacteriana a largo plazo mediante pruebas cinéticas de bacterias en cultivo por lotes. El crecimiento bacteriano dependiente del tiempo a una concentración de lisozima de 700 jg m L -1 se monitorizó durante 3 días (Figura 2b). Se empleó el ensayo en placa LB-agar para examinar la viabilidad bacteriana después de 3 días de tratamiento. Se observó que las partículas de MSHS-RS mantuvieron una inhibición bacteriana del 100% durante los tres días de prueba. Este resultado de inhibición durante tres días es comparable al rendimiento de las nanopartículas de sílice cargadas de plata a 80 jg m L -1, como se demostró en el ensayo cinético bacteriano. En cambio, se observa un crecimiento bacteriano dependiente del tiempo, evidenciado por el aumento del valor de DO, para las formulaciones MSHS-SS, MSHS-RS-B y lisozima libre. No se observan colonias viables en las placas de agar para las bacterias tratadas con las partículas de MSHS-RS cargadas de lisozima, lo que demuestra una fuerte actividad bactericida de las partículas de sílice en comparación con las otras muestras. La propiedad de inhibición bacteriana a largo plazo debe atribuirse a dos ventajas proporcionadas por el diseño de las partículas de sílice: 1) una mayor adhesión a la superficie bacteriana gracias a la rugosidad de la superficie, lo que resulta en una administración eficaz y específico de lisozima y a una mayor concentración local de lisozima en la superficie bacteriana, y 2) una actividad antimicrobiana prolongada gracias a la liberación sostenida de lisozima de las partículas de MSHS-RS. Sin embargo, debido a la interacción relativamente débil entre la partícula y la bacteria y a la rápida liberación de lisozima, MSHS-SS y MSHS-RS-B no logran controlar el crecimiento bacteriano con una concentración inadecuada de lisozima suministrada eficazmente hacia la superficie bacteriana.
Ejemplo 8: Formulación de partículas con ivermectina
La ivermectina se cargó mediante evaporación rotatoria en las partículas de MSHS-RS, MSHS-SS y MSHS-RS funcionalizadas con motivos octadecílicos hidrofóbicos para hacer la superficie más hidrofóbica. El análisis termogravimétrico (TGA por sus siglas en inglés) mostró un nivel de carga de ivermectina en las partículas de sílice de alrededor del 23 % en peso, lo que concuerda con la proporción de alimentación de ivermectina a las nanopartículas de sílice (1:3).
Para investigar las propiedades de protección UV de las partículas de sílice frente a la ivermectina, estas nanoformulaciones y la ivermectina pura (libre) fueron tratadas bajo irradiación UV durante 3 horas. Las muestras antes y después de la irradiación UV se analizaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC por sus siglas en inglés) para identificar sus composiciones. La ivermectina libre se degradó completamente tras 3 horas de irradiación. La ivermectina cargada en partículas de MSHS-SS mostró una degradación significativa de la ivermectina. Esto se puede deber al hecho de que la ivermectina sólo se carga parcialmente en la cavidad interna de las partículas de MSHS-SS, lo que da lugar a una protección sólo parcial. Por el contrario, el análisis por HPLC de las formulaciones de ivermectina utilizando partículas de MSHS-RS y partículas de MSHS-RS modificadas hidrofóbicamente no mostró una degradación significativa de la ivermectina, lo que indica que la composición de la ivermectina estaba bien protegida por las nanopartículas.
Ejemplo 9: Variación del tamaño de las partículas de MSHS-RS
Se sintetizaron nanopartículas de MSHS-RS con diferente tamaño de partícula variando la cantidad de resorcinol y formaldehído en la primera adición. Al aumentar la cantidad de resorcinol y formaldehído, se pueden formar nanoesferas de polímero de RF más grandes que actúan como núcleo, lo que lleva a un aumento de los diámetros de las partículas de MSHS-RS de 307 nm (resorcinol 0,15 g) a 564 nm (resorcinol 0,3 g), a 704 nm (resorcinol 0,45 g) y a 837 nm (resorcinol 0,6 g). Como se muestra en la Figura 24, las partículas de MSHS-RS resultantes, de distintos tamaños, siguen manteniendo la topografía superficial en forma de pico. Los resultados de la sorción de nitrógeno mostraron que las partículas resultantes tienen estructuras mesoporosas con un tamaño de poro alrededor de 10-20 nm. A medida que aumenta el tamaño de las partículas, el área superficial y el volumen de los poros de las partículas de MSHS-RS aumentan, como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1: Propiedades fisicoquímicas determinadas por la sorción de nitrógeno para las partículas de MSHS-RS.
Muestras Sb e t (m2/g) VTotal (cm3/g) d pore (nm)
resorcinol 0,15 g 178 0,434 12,1
resorcinol 0,30 g 227 0,548 16,5
resorcinol 0,45 g 268 0,665 16,5
resorcinol 0,60 g 275 0,831 16,5
Ejemplo 10: Formulación con p-ADN
Se sintetizaron partículas de MSHS-RS y MSHS-SS con un diámetro de unos 350 nm. Las cargas altamente negativas son una característica bien conocida de las moléculas de p-ADN, por lo que se introdujeron grupos funcionales catiónicos en las partículas de sílice para mejorar la atracción electrostática entre el p-ADN y la sílice, recubriendo las partículas de sílice con polietilenimina (PEI). Después de la modificación con PEI, las partículas de sílice siguen manteniendo su topografía en forma de pico. Los resultados de la sorción de nitrógeno mostraron que las partículas de MSHS-RS modificadas con PEI presentaban estructuras mesoporosas con un tamaño de poro de unos 11 nm. El tamaño de los poros puede ampliarse a 16 y 19 nm mediante el tratamiento hidrotermal a temperaturas de 100 y 130 °C respectivamente, y el tratamiento hidrotermal a 150 °C puede ampliar aún más el tamaño de los poros con una amplia distribución de 20 a 80 nm. El potencial zeta de estas partículas de MSHS-RS cambia de negativo (~-20 a -30 mV) a positivo (~+15 mV) después de la modificación con PEI, lo que indica que la introducción de grupos PEI en la superficie de las partículas de sílice ha sido un éxito.
Se realizaron mediciones Nanodrop y ensayos de retardo de gel para evaluar la capacidad de unión con el plásmido pcDNA3-EGFP que codifica para la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP por sus siglas en inglés). Las partículas de MSHS-RS modificadas con PEI muestran una capacidad de unión de pcDNA3-EGFP mucho mayor (29,7 ng/|jg) que las partículas MSHS-SS modificadas con PEI (14,7 ng/jg). Cabe destacar que las partículas de MSHS-RS sometidas a tratamiento hidrotérmico mostraron una capacidad de carga de p-ADN aún mayor en comparación con las partículas de MSHS-RS sin tratamiento hidrotérmico, debido al mayor tamaño y volumen de los poros. En el ensayo de retardo de gel, se mezcló una cantidad constante de pcDNA3-EGFP (0,5 jg ) con diversas cantidades de partículas de sílice modificadas con PEI de 0 a 80 mg.
En la presente especificación y en las reivindicaciones (si las hay), la palabra "que comprende" y sus derivados, incluyendo "comprende" y "comprende", incluyen cada uno de los enteros indicados, pero no excluye la inclusión de uno o más enteros adicionales.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de suministro de fármaco que comprende: un material particulado que comprende nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas que tienen un tamaño entre 100 nm y 3000 nm,
donde las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas comprenden un recubrimiento mesoporoso, cuya superficie externa presenta proyecciones, donde el tamaño de las proyecciones oscila entre 5 nm y 1000 nm, donde las proyecciones están separadas entre sí, y donde las proyecciones comprenden hebras o cilindros o fibras que se extienden hacia fuera del recubrimiento mesoporoso de las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas; las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas tienen una o más moléculas o compuestos activos en ellas, donde los compuestos se seleccionan entre: una proteína hidrofóbica, un fármaco hidrofóbico o un agente terapéutico hidrofóbico.
2. La composición de suministro de fármaco según la reivindicación 1, donde el tamaño de las proyecciones oscila entre 5nm y 500nm.
3. La composición de sumisito de fármaco según la reivindicación 1 o 2, donde las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas tienen un núcleo hueco definido por el recubrimiento mesoporoso.
4. La composición de suministro de fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el recubrimiento mesoporoso tiene una estructura de poros que incluye poros en el rango de 2 nm a 20 nm.
5. La composición de suministro de fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el recubrimiento mesoporoso que rodea el núcleo hueco tiene un grosor de entre 10 nm y 100 nm.
6. La composición de suministro de fármaco según la reivindicación 1, donde la longitud de las proyecciones es de 5 nm hasta el diámetro del recubrimiento donde residen.
7. La composición de suministro de fármaco según la reivindicación 1, donde un diámetro de las proyecciones oscila entre 2 nm y 100 nm.
8. La composición de suministro de fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde una superficie específica de las nanopartículas oscila entre 100m2/g y 1000m2/g, o entre 150 m2/g y 1000m2/g, o entre 175 m2/g y 1000m2/g.
9. La composición de suministro de fármaco según la reivindicación 1, donde el agente terapéutico hidrofóbico es un antibiótico.
10. Una composición que comprende un material particulado que comprende nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas que tienen un tamaño de 100 nm a 3000 nm;
donde las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas comprenden un recubrimiento mesoporoso, cuya superficie externa tiene proyecciones, donde el tamaño de las proyecciones oscila entre 5 nm y 1000 nm, donde las proyecciones están separadas entre sí, y donde las proyecciones comprenden hebras o cilindros o fibras que se extienden hacia fuera del recubrimiento mesoporoso de las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas; donde las nanopartículas de sílice huecas mesoporosas rugosas están recubiertas, al menos parcialmente, con ácidos nucleicos.
11. La composición según la reivindicación 10, donde el ácido nucleico se selecciona de uno o más de ADN plasmídico (p-ADN) y A r N mensajero (ARNm).
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