CN109330991B - 一种中药纳米药物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种中药纳米药物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药物技术领域，具体为一种中药纳米药物及其制备方法与应用，该制备中药纳米药物及其制备方法与应用的具体构建方法：将介孔载体二氧化硅与小分子中药(如：和厚朴酚、姜黄素、桔梗皂苷等)以合适的比例称量混匀，溶于适量有机溶剂(如：无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇等)，置于混匀仪，避光震荡过夜，除去有机溶剂，加入去离子水。该制备方法的优点是介孔载体二氧化硅通过吸附难溶于水的小分子中药容纳到二氧化硅纳米颗粒的介孔结构中，形成载药纳米颗粒药物。介孔载体二氧化硅具有良好的生物相容性，可以吸附在细胞表面被细胞迅速摄取，进入细胞后，不断将介孔中的药物释放，自身发生崩解，由泌尿系统排出体外，安全高效的药物输送。

Description

一种中药纳米药物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及药物技术领域，具体为一种中药纳米药物及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，针对冠心病晚期的治疗，大多需行经皮冠状动脉介入治疗。支架的植入改善冠脉狭窄的同时也严重破坏了冠脉内膜的完整性，诱导各类细胞因子的生成及分泌，细胞因子作用于血管中膜的平滑肌细胞，使平滑肌细胞由安静状态下的收缩型去分化成增殖型，细胞表型的改变引起平滑肌细胞的大量增殖和迁移，在冠脉中形成新的血栓[马绍骏.转化生长因子β1在血管损伤后再狭窄形成中的作用[J].中国组织工程研究与临床康复,2008(30):5965-5968.]。
球囊成形术早期，血管损伤后再狭窄的发生率高达40％，裸露金属支架的问世，将再狭窄的发生率降至25％，药物洗脱支架的研发，大大的降低了再狭窄的发生率，但是，同时带来了新的问题，一方面，支架释放的药物容易引起局部炎症；另一方面，抑制平滑肌细胞增殖的同时，也抑制了内皮细胞的生成，间接破坏了血管内皮的完整性[余敏,孙勇.MicroRNAs对血管损伤后的再狭窄和血栓形成的抑制[J].心血管康复医学杂志,2018,27(02):228-230.]。因此，药物洗脱支架中药物的选择尤为重要，对药物的要求相当复杂，既要抑制平滑肌细胞的增殖和迁移，预防血栓的形成，又要不影响内皮细胞的修复，形成完整的血管内膜。
近年来，对防治血管损伤后再狭窄的研究颇多，也大多集中在药物及其传递体的研究，紫杉醇和雷帕霉素作为药物洗脱支架使用的传统药物[Yang J,Zeng Y,Zhang C等人.VEGF基因和紫杉醇洗脱支架应用于体内预防血管损伤后再狭窄.[J].生物材料杂志,2013,34(6):1635-1643.]，具有一定的弊端，比如毒性太大，破坏内膜完整性等。和厚朴酚，是厚朴中的一个活性成分，可以有效地抑制平滑肌细胞的增殖和迁移，分子机制研究相对明确，但是其差的水溶性和易被氧化的性质影响其被细胞摄取的效率，从而增加了和厚朴酚的毒性，降低了药效[国瑞琪,王秋红,王向涛,匡海学.和厚朴酚脂质体的制备及其体内外抗乳腺癌作用研究[J].药物评价研究,2017,40(01):48-53.]。因此，选择合适的药物传递体对和厚朴酚进行有效的细胞内输送尤为重要。
近年来，科学家们就和厚朴酚的水溶性差、利用率低、副作用高等缺陷研究了一系列的药物传递体；其中研究最广的便是高分子材料和脂质体，高分子材料属于新型无毒材料，而且表面的诸多基团还可以连接相关抗体对药物进行靶向，因为高分子材料是采用疏水区的内核包载药物，所以高分子材料存在释药可控性差的缺点。[刘海峰,常津,姚康德.纳米高分子材料在医用载体方面的应用[J].化学通报,2001(06):332-338.]。传统脂质体包载和厚朴酚，大多包载于脂质体双层膜上的疏水区，药脂比低，和厚朴酚具有苯酚基团，易与溶剂中的各种离子发生作用而不稳定。二氧化硅载药靠介孔结构的吸附作用，只要储存稳定，保证纳米颗粒被细胞摄取的时候，药物及其容易从介孔结构中释放出来导致二氧化硅结构的崩解即可[Zhang S,Chu Z,Yin C,et al.二氧化硅药物纳米结构可控性释药后并崩解[J].美国化学会杂志,2013,135(15):5709-5716.]。因此，我们选择了介孔结构二氧化硅纳米颗粒，与和厚朴酚组装成二氧化硅/和厚朴酚药物传递系统。
介孔二氧化硅是一种新型的药物传递体，介孔通过吸附作用容纳和厚朴酚后，将其制成粉末可以长期保存，防止药物从介孔中释放，水合后，二氧化硅具有很好的生物相容性，可以被细胞迅速摄取，进入细胞后，药物从介孔中缓慢释放伴随二氧化硅的崩解排出。本次发明的介孔二氧化硅/和厚朴酚系统增加了和厚朴酚的水溶性，融膜作用强可以将和厚朴酚迅速输送入细胞，提高药物的药效，降低用药剂量和副作用，是一种发挥其本身优点并突破药物弊端的药物传递系统。
发明内容
本发明解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供一种移动式大功率快速紫外灭菌仪。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种中药纳米药物，包括适量的介孔载体、适量的小分子中药和适量的去离子水。
优选的，所述介孔载体为二氧化硅。
优选的，所述小分子中药为和厚朴酚、姜黄素和桔梗皂苷，其中一种或多种混合构成。
优选的，所述有机溶液为无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇和丙酮，其中一种构成。
本发明实施例还公开了一种中药纳米药物的制备方法，应用于上述任一项中药纳米药物，所述方法包括如下步骤：
S1.混合材料的制备：
(1)选取适量的二氧化硅，等待下一步骤；
(2)选取适量的小分子中药，等待下一步骤；
(3)将选取后的二氧化硅以及小分子中药按照合适的比例进行混匀，等
待下一步骤；
(4)选取适量的有机溶液，等待下一步骤。
S2.材料的混合反应：
(1)将S1的3步骤中获得的二氧化硅/小分子中药混合材料加入至S1的4步骤中获得的有机溶液中，等待下一步骤；
(2)将上一步骤中获得的二氧化硅/小分子中药/有机溶液混合材料加入混匀仪进行混合，等待下一步骤；
(3)将上一步骤中获得的二氧化硅/小分子中药/有机溶液的混匀溶液，通过氮气吹干，等待下一步骤；
(4)选取适量的去离子水，等待下一步骤；
(5)将S2的3步骤中获得的干燥的二氧化硅/小分子中药的混合材料加
入S2的4步骤中获得的去离子水中，制成悬浊液，等待下一步骤；
(6)将上一步骤中获得的二氧化硅/小分子中药/去离子水的悬浊液进行冷冻干燥，并将干燥后的二氧化硅/小分子中药的冻干粉末存储备用。
优选的，所述二氧化硅与小分子中药的质量比为1:1～10:1，且制成悬浊液后的二氧化硅的浓度为1-2mg/ml。
优选的，所述S2的2步骤中的混匀仪的运作频率为运作频率为750rpm,作用温度为4℃，且混匀条件及周期为避光反应过夜。
本发明实施例还公开了上述任一项所述的一种中药纳米药物或任一项所述的一种中药纳米药物的制备方法在介孔载体二氧化硅纳米颗粒作为体内系统或局部输送和厚朴酚体系中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该中药纳米药物及其制备方法与应用，选用二氧化硅作为就被介孔的介孔载体，通过其表面的介孔吸附、包裹或化学键修饰小分子中药，通过介孔具有的容纳能力和吸附性，药物可以通过介孔的吸附能力和自身的扩散进入介孔结构；或可以把药物包裹在介孔载体里；或在介孔表面通过环境响应性化学键修饰中药，介孔载体二氧化硅具有良好的生物相容性，可以吸附在细胞表面被细胞迅速摄取，进入细胞后，不断将介孔中的药物释放，自身发生崩解，并由泌尿系统排出体外，实现安全高效的药物输送，药效学方面的研究显示纳米颗粒抑制细胞增殖和迁移，促进平滑肌细胞凋亡的效果优于裸药。治疗血管损伤后再狭窄的药物可以抑制平滑肌细胞增殖和迁移的同时促进平滑肌细胞的凋亡，防治支架植入后血管内部血栓的形成。
附图说明
图1：实施例一中介孔载体二氧化硅/和厚朴酚复合物的构建示意图。
图2：实施例二中介孔载体二氧化硅/和厚朴酚复合物的形态学检测，可以看到生物透射电镜下二氧化硅的介孔结构。
图3：实施例三中介孔载体二氧化硅/和厚朴酚复合物对血管平滑肌细胞活力的影响。
图4：实施例四中介孔载体二氧化硅/和厚朴酚复合物和裸药和厚朴酚对血管平滑肌细胞增殖的抑制效应的同浓度比较及其浓度梯度的比较，分别检测了80uM和120uM两个浓度条件下的抑制增殖率。
图5：实施例四中介孔载体二氧化硅/和厚朴酚复合物和裸药和厚朴酚对血管平滑肌细胞的促凋亡作用的比较。
图6：实施例四中介孔载体二氧化硅/和厚朴酚复合物和裸药和厚朴酚抑制血管平滑肌细胞迁移的检测，使用了transwell技术对迁移进行分析。
图7：实施例五中介孔载体二氧化硅/和厚朴酚复合物和裸药和厚朴酚分别作用于血管平滑肌细胞后，对血管平滑肌细胞的核蛋白-PCNA的表达调控作用。其中图a代表对照组；图b代表和厚朴酚浓度80uM；图c代表介孔载体二氧化硅/和厚朴酚复合物浓度80uM；图d代表和厚朴酚浓度120uM；图e代表介孔载体二氧化硅/和厚朴酚复合物浓度120uM。第一行是对细胞核的荧光观察；第二行是对细胞核内PCNA表达强度的荧光观察；第三列是前面两幅图合并后的结果。
图8：实施例五中介孔载体二氧化硅/和厚朴酚复合物和裸药和厚朴酚作用于血管平滑肌细胞，抑制细胞增殖、迁移和促进凋亡的分子机制方面的考察。利用western blot检测技术对信号通路上的蛋白进行分析。代表加入生长因子诱导后，下游蛋白的表达
图9：实施例五中介孔载体二氧化硅/和厚朴酚复合物和裸药和厚朴酚作用于血管平滑肌细胞，抑制细胞增殖、迁移和促进凋亡的分子机制方面的考察。利用western blot检测技术对信号通路上的蛋白进行分析。代表加入通路中蛋白抑制剂后，下游蛋白的表达。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-9，本发明提供一种技术方案：
一种中药纳米药物，包括适量的介孔载体、适量的小分子中药和适量的去离子水。
作为本发明的一种技术优化方案，所述介孔载体为二氧化硅。
作为本发明的一种技术优化方案，所述小分子中药为和厚朴酚、姜黄素和桔梗皂苷，其中一种或多种混合构成。
作为本发明的一种技术优化方案，所述有机溶液为无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇和丙酮，其中一种构成。
本发明实施例还公开了一种中药纳米药物的制备方法，应用于上述任一项中药纳米药物，所述方法包括如下步骤：
S1.混合材料的制备：
(1)选取适量的二氧化硅，等待下一步骤；
(2)选取适量的小分子中药，等待下一步骤；
(3)将选取后的二氧化硅以及小分子中药按照合适的比例进行混匀，等
待下一步骤；
(4)选取适量的有机溶液，等待下一步骤。
S2.材料的混合反应：
(1)将S1的3步骤中获得的二氧化硅/小分子中药混合材料加入至S1
的4步骤中获得的有机溶液中，等待下一步骤；
(2)将上一步骤中获得的二氧化硅/小分子中药/有机溶液混合材料加入混匀仪进行混合，等待下一步骤；
(3)将上一步骤中获得的二氧化硅/小分子中药/有机溶液的混匀溶液，通过氮气吹干，等待下一步骤；
(4)选取适量的去离子水，等待下一步骤；
(5)将S2的3步骤中获得的干燥的二氧化硅/小分子中药的混合材料加入S2的4步骤中获得的去离子水中，制成悬浊液，等待下一步骤；
(6)将上一步骤中获得的二氧化硅/小分子中药/去离子水的悬浊液进行冷冻干燥，并将干燥后的二氧化硅/小分子中药的冻干粉末存储备用。
作为本发明的一种技术优化方案，所述二氧化硅与小分子中药的质量比为1:1～10:1，且制成悬浊液后的二氧化硅的浓度为1-2mg/ml。
作为本发明的一种技术优化方案，所述S2的2步骤中的混匀仪的运作频率为运作频率为750rpm,作用温度为4℃，且混匀条件及周期为避光反应过夜。
本发明实施例还公开了上述任一项所述的一种中药纳米药物或任一项所述的一种中药纳米药物的制备方法在介孔载体二氧化硅纳米颗粒作为体内系统或局部输送和厚朴酚体系中的用途。
原理：该中药纳米药物及其制备方法与应用的具体构建方法：将介孔载体二氧化硅与小分子中药(如：和厚朴酚、姜黄素、桔梗皂苷等)以合适的比例称量混匀，溶于适量有机溶剂(如：无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇等)，置于混匀仪，避光震荡过夜，然后除去有机溶剂，加入适量的去离子水。该制备方法的优点是介孔载体二氧化硅可以通过吸附难溶于水的小分子中药容纳到二氧化硅纳米颗粒的介孔结构中，形成载药纳米颗粒药物。介孔载体二氧化硅具有良好的生物相容性，可以吸附在细胞表面被细胞迅速摄取，进入细胞后，不断将介孔中的药物释放，自身发生崩解，并由泌尿系统排出体外，实现安全高效的药物输送。
第一方面，本发明涉及一种介孔二氧化硅/和厚朴酚组装的新型载体，所述和厚朴酚载体是内部具有密集的介孔结构，介孔结构的表面具有较强的吸附能力；所述和厚朴酚载体的介孔结构可以吸附容纳脂溶性的小分子药物，改善药物的水溶性；所述和厚朴酚载体自身也有很好的生物相容性，易于被细胞摄取；所述和厚朴酚载体进入细胞后，可以将和厚朴酚释放出来，自身发生崩解并从泌尿系统排出体外。所述药物载体是均一稳定的纳米级新型材料。
优选的，所述新型材料选择的是介孔载体二氧化硅纳米颗粒，安全无毒，易于被排出体外。
优选的，所述介孔载体二氧化硅具有有效的容纳能力，可以改善脂溶性小分子药物的理化性质的缺点。
优选的，所述介孔载体二氧化硅进入细胞后，可以缓慢释放药物，维持持久的药效，降低药物的毒副作用。
优选的，所述介孔载体二氧化硅的溶液为去离子水。
优选的，所述化学药物为疏水性化学药物。所述疏水性化学药物包载于二氧化硅介孔结构中。
上述药物中，所述脂溶性活性药物为和厚朴酚。
第二方面，本发明还涉及一种前述的介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒药的制备方法，所述方法包括如下步骤：
A、将介孔载体二氧化硅与和厚朴酚溶于无水乙醇，置于转速为750rpm的混匀仪反应24h.
B、以和厚朴酚1mg/ml的浓度加入去离子水溶解纳米颗粒，得稳定均一的和厚朴酚和二氧化硅的复合物。
所述和厚朴酚与所述介孔二氧化硅的质量比可为1:1-10，优选使用1:2。
所述介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒，可以在电镜下看到其介孔结构。药效学方面的研究显示纳米颗粒抑制细胞增殖和迁移，促进平滑肌细胞凋亡的效果优于裸药。
第三方面，本发明还涉及一种前述的介孔二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒药物载体作为体内系统输送和厚朴酚的用途。
本发明所述新型材料可用于包载一种治疗血管损伤后再狭窄的药物。
本发明进一步提供了介孔二氧化硅包载和厚朴酚的制备。
上述提到的治疗血管损伤后再狭窄的药物可以抑制平滑肌细胞增殖和迁移的同时促进平滑肌细胞的凋亡，防治支架植入后血管内部血栓的形成。
实施例一、介孔载体二氧化硅/和厚朴酚的制备方法
将介孔载体二氧化硅与和厚朴酚以质量比2:1的比例称量混匀，置于避光的ep管中，加入适量的无水乙醇，使介孔载体二氧化硅在无水乙醇中的浓度为2mg/ml，和厚朴酚的浓度为1mg/ml，将ep管置于混匀仪震荡过夜，使和厚朴酚小分子充分被介孔结构吸附容纳，将无水乙醇用氮气吹干后，加入同等体积的去离子水，使介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒均匀的悬浮于去离子水中，为防止和厚朴酚从介孔中释放出来，导致二氧化硅的崩解，将介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒的水溶液冻干，冻干粉末保存于4℃备用，需要时，称量一定质量的冻干粉末，溶于去离子水进行后续实验。
合成构建示意图详见图1。
实施例二、介孔载体二氧化硅/和厚朴酚的形态学检测
采用透射电镜对前期制备的介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒进行形态学的观察。具体方法为使用去离子水作为分散介质稀释上述制备的冻干粉末，然后取10ul稀释后的冻干粉末滴加到铺有碳膜的铜网上，1min后用滤纸将多余的溶液吸干，使用生物透射电镜对介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒进行观察。
纳米颗粒的形态学结构见图2，可以看到介孔二氧化硅中的介孔结构。
实施例三、和厚朴酚和介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒对血管平滑肌细胞 活力的影响
按照上述步骤制备和厚朴酚浓度为1mg/ml的介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒以及浓度为1mg/ml的裸药和厚朴酚，用于细胞实验。
本次试验设置的分组为和厚朴酚组和介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒组，每一个分组有六个浓度梯度，分别是60uM、80uM、100uM、120uM、140uM、160uM，每一个分组对应的浓度设置三个复孔。
首先，T25细胞培养瓶内的细胞长满后，将其消化成细胞悬浊液置于无菌离心管中计数后，以每孔1×104个细胞种于96孔板中，每孔的培养基定容到200ul,孵育24小时，使细胞充分贴壁。
细胞贴壁后，每孔加入上述设置好的浓度梯度和分组对应的制剂，孵育24h后将96孔板从细胞培养箱取出，每孔加入100ul培养基和10ul的WST-1试剂，用锡箔纸包被细胞孔板放回培养箱，每半个小时用酶标仪检测一次孔板在579nm条件下的OD值，直至OD值的范围在0.2-0.8之间，保存数据，用Graphpad做结果分析,以上操作均避光操作。
和厚朴酚和介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒对血管平滑肌细胞活力的影响结果见图3。
实施例四、和厚朴酚和介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒对血管平滑肌细胞 的药效学的检测
从图3和厚朴酚和介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒对血管平滑肌细胞活力的影响结果中分析，选择80uM和120uM作为最佳浓度进行后续药效学的检测。
一、抑制血管平滑肌细胞增殖
本实验使用流式细胞计数手段检测细胞核内细胞增值标志物—PCNA的表达情况。设置的分组为阴性组、对照组、和厚朴酚80uM组、和厚朴酚120uM组、介孔载体二氧化硅/和厚朴酚80uM组、介孔载体二氧化硅/和厚朴酚120uM组。
首先，T75细胞培养瓶内的细胞长满后，将其消化成细胞悬浊液置于无菌离心管中计数后，以每孔2.5×105个细胞种于六孔板中，每孔的培养基定容到2ml，孵育24小时，使细胞充分贴壁。
细胞贴壁后，每孔加入上述设置好的浓度梯度和分组对应的制剂，孵育24h后将六孔板从细胞培养箱取出，吸去上层培养基，每孔加入150ul的胰酶，将六孔板内的细胞消化下来，制成细胞悬浮液置于流式管内，将细胞悬浮液用1×的PBS清洗两遍，每管加入500ul的Foxp3Fixation/permeabilizationworking solution室温孵育30-60min，对细胞进行固定；然后每管加入1×的permeabilization buffer 1ml进行离心(离心机设置500rpm/5min)；弃上清，再加入1×的permeabilization buffer 1ml离心，对细胞进行透膜；弃上清，加入100ul0.5％的BSA-permeabilization buffer室温下对细胞进行封闭；封闭15min后，每管加入0.5ul的抗体混匀，室温下孵育30min；每管加入staining buffer 500ul洗涤两次，将多余的抗体洗净后，加入700ul staining buffer进行流式细胞计数分析。
和厚朴酚和介孔载体二氧化硅/和厚朴酚对平滑肌细胞的PCNA的表达见图4，可以看出介孔载体二氧化硅/和厚朴酚对平滑肌细胞增殖的抑制作用优于裸药和厚朴酚，充分显示了介孔载体二氧化硅/和厚朴酚可以顺利将和厚朴酚带入细胞，发挥最佳的药效，降低其毒副作用。
二、促进血管平滑肌细胞凋亡
本次试验设置的分组为和厚朴酚组和介孔载体二氧化硅/和厚朴酚组，每一个分组有两个浓度梯度，分别是80uM、120uM，另外有一个阴性组，一个FITC的补偿组，一个PI的补偿组，一个对照组，共有八个分组。
首先，T75细胞培养瓶内的细胞长满后，将其消化成细胞悬浊液置于无菌离心管中计数后，以每孔2.5×105个细胞种于六孔板中，每孔的培养基定容到2ml,孵育24小时，使细胞充分贴壁。
细胞贴壁后，每孔加入上述设置好的浓度梯度和分组对应的制剂，孵育24h后将六孔板从细胞培养箱取出，将每孔的上清液收集到流式管中，将每孔用1×PBS清洗两遍后，每孔加入150ul不含EDTA的胰酶(EDTA会影响凋亡试剂盒和凋亡细胞的结合)，消化2min，将细胞消化下来收集到流式管，用1×PBS将细胞清洗两遍后，用100ul 1×凋亡缓冲buffer将每管细胞重悬后进行染色，每管加入5ul AnnexinV-FITC染色十分钟后，再加入5ul PI染色五分钟，用500ul 1×凋亡缓冲buffer稀释细胞(此步染色后无需清洗)，一小时内用流式细胞仪读取细胞凋亡结果。
促进细胞凋亡的实验结果见图5。
三、抑制血管平滑肌细胞迁移
本实验使用trans well技术检测细胞的迁移能力。设置的分组为阴性组、对照组、和厚朴酚80uM组、和厚朴酚120uM组、介孔载体二氧化硅/和厚朴酚80uM组、介孔载体二氧化硅/和厚朴酚120uM组。
实验前选定一T25瓶长满的细胞，细胞形态良好，长势呈指数生长，无血清培养24h，弃去无血清培养基，加入400ul胰酶将细胞消化下来，用含有FBS的DMEM终止消化，然后离心，弃掉上清液，用无血清培养基重悬，制成浓度为4×105/ml的细胞悬浮液。将细胞悬浮液接种于trans well上室，每孔150ul(此处应避免形成气泡，接种的细胞悬浊液，液面要平整)，在上室内接种细胞半小时后加入需要干预的药物和制剂，加入药物后，将trans well小室放入细胞培养箱预处理1h，预处理后，于trans well下室，加入含有10％FBS的DMEM培养基，总量大约600-700ul(此处也应避免形成气泡，特别是上室的膜于下室的培养基接触面不能有气泡)。放入培养箱培养24h后，从细胞培养箱取出trans well耗材，吸弃上室和下室的培养基，用PBS清洗两遍，耗材略干后，用4％的多聚甲醛固定20min，然后吸弃固定液，用pbs清洗两遍，加入0.1％的结晶紫对细胞进行染色，染色20min后，再用PBS清洗两遍，洗净结晶紫，用棉签擦拭上室的上层面，擦去未穿过膜的细胞(此步应小心谨慎，既要擦净未穿过膜的细胞，又不能擦破trans well小室的膜)，将小室晾干，倒扣于载玻片上，于显微镜下拍摄，计数。
本发明制备的介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米微粒可以有效抑制血管平滑肌细胞的迁移，药效优于和厚朴酚。抑制细胞迁移的实验结果见图6。
实施例五、和厚朴酚和介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒分子机制学的检测
一、免疫荧光检测信号通路下游的最终蛋白—PCNA的表达
选取长势良好的平滑肌细胞，将其消化成细胞悬浮液备用。将24孔板爬片种在12孔板(方便后续扣片固定)，设定五个分组，分别是对照组、和厚朴酚80uM组、和厚朴酚120uM组、介孔载体二氧化硅/和厚朴酚80uM组、介孔载体二氧化硅/和厚朴酚120uM组。
将先前备好的细胞悬浮液以每孔1×105/ml种于爬片上，将孔板置于细胞培养箱孵育24h，待细胞贴于爬片上，每孔加入上述设置好的浓度梯度对应的药物和制剂，药物孵育24h后，从细胞培养箱取出孔板，去除培养基，用PBS清洗一遍，加入500ul免疫荧光细胞固定液，室温下固定15min，吸去固定液，用PBS洗涤三遍，加入0.5％的triton(250ul triton+50mlPBS)500ul室温下透膜20min,吸去透膜剂，用PBS洗涤两次，加入1％的BSA(用PBS配制)溶液室温下封闭30min，用封闭液将抗体稀释成5ug/ml,每孔加入1ml置于四度冰箱中避光过夜。次日，取出孔板用PBS清洗三次，将多余的抗体洗净，每片滴加DAPI20ul盖住爬片即可，对细胞核就行染色，染核5min后，再用1×PBS清洗孔板三遍，清洗掉多余的DAPI，最后将爬片扣出，晾干，扣在滴加了10ul的防荧光淬灭剂的载玻片上，用透明指甲油对爬片周边进行封片。
用共聚焦显微镜观察平滑肌细胞内PCNA的表达情况，结果表明介孔二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒可以更加有效地下调细胞核内PCNA的表达。
实验结果见图7。
二、western blot对和厚朴酚和介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒抑制平滑肌细胞增殖信号通路方面的研究
本实验利用TGF-β、smad3抑制剂、ERK抑制剂分别和药物一起孵育细胞，检测细胞中信号通路上相关蛋白的表达，分别是用TGF-β和药物一起孵育细胞，检测smad3和ERK的磷酸化表达的影响；用smad3抑制剂和药物一起孵育细胞，检测ERK磷酸化的表达；用ERK抑制剂和药物共同孵育细胞，检测信号通路终点蛋白PCNA的表达。
首先，进行细胞中蛋白上清液的制备和浓度测定。收集细胞，配制融解RIPA裂解液(取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入酶抑制剂三联装)，按照细胞压积加入50μl裂解液，在振荡器上充分震荡数次，把细胞充分裂解后，12000rpm离心5分钟，取上清。取部分上清蛋白用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，按如下步骤：①按试剂盒说明书将A液和B液以50：1的比例配制成工作液；②取2000μg/ml的BSA标准品，用PBS(pH 7.4)稀释成2000μg/ml、1500μg/ml、1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、25μg/ml、0μg/ml共9个浓度梯度；③取蛋白提取液10μl，用PBS稀释5倍；④每管中加25μl蛋白标准品或稀释后的组织蛋白提取液，再加上述工作液200μl，37℃孵育30min，562nm处测吸光度，记录OD值；⑤根据OD值及蛋白标准品浓度绘制标准曲线，计算样品总蛋白浓度。对总蛋白浓度就行半定量分析后，进行p-smad3、p-ERK、PCNA的表达的检测。
配置蛋白胶。蒸馏水清洗灌胶玻璃板，竖直晾干，配制12％分离胶10ml，加TEMED10μl、10％过硫酸铵100μl，混匀后立即灌胶，灌至齿梳下缘2～3mm(事先做好标记)，用异丙醇封闭液面以去除气泡并隔绝空气，室温静置45分钟待胶完全聚合。待分离胶完全聚合后，倾去其顶部的去离子水，用滤纸将水吸干。配制5％浓缩胶5ml，加TEMED 5μl、10％APS 50μl，混匀立即灌胶，灌至顶部，并垂直插入Teflon齿梳，室温静置20分钟待胶聚合。待胶完全聚合后拔出梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，用电泳缓冲液冲洗上样孔以去除气泡。
电泳。取各个处理组蛋白提取液，调整蛋白浓度，和等体积5×上样缓冲液混合，即为上样液。将上样液于100℃沸水中煮沸5min，使蛋白变性，冰上骤冷，3000转/min离心1min。每孔加上样液20μg，留一孔加10μl预染的Marker。加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用70v恒压电泳，约30min，当指示剂溴芬兰进入分离胶后改用90v恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm处时关闭电源，取出胶板。
最后，转印蛋白及进行免疫检测。在电泳即将结束前，预先将PVDF膜浸泡在甲醇中15s，然后用ddH2O漂洗2min，浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作。在水中撬胶，修胶后将胶浸泡于转移缓冲液中平衡15min。按黑面(负极)→海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→海绵→红面(正极)的顺序制备转膜“三明治”，每层铺好后先赶走气泡再铺另一层。在转移缓冲液中制备三明治可避免气泡的产生。接上正负极，按膜向正极的方向将转移盒放入电转仪中，加入转膜缓冲液。将电转仪置于冰水中，200mA恒流转膜70min。转膜结束后，快速取出PVDF膜，放入5％BSA室温封闭2h。取出膜，于摇床上用TBST洗膜5min×3次。孵育袋中分别加入TBST稀释的P-Smad3(immunoway1：1000)、P-ERK(immunoway 1：1000)和PCNA(immunoway 1：1000)，4℃孵育过夜。TBST洗膜5min×3次，辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗绵羊二抗(康成1：2000)室温孵育2h。TBST洗膜10min×3次。膜于化学发光检测试剂(试剂A：试剂B＝1：1)反应2min，取出膜，甩去多余的液体，用保鲜膜包好PVDF膜，暗室中用X胶片感光、显影、定影。
信号通路方面的检测见于图8及图9。
综上所述，本发明用具有介孔结构的二氧化硅纳米材料，介孔通过主动吸附容纳小分子药物而药物通过被动扩散进入介孔中，制得二氧化硅包载的和厚朴酚纳米颗粒，用于防治血管损伤后再狭窄。同时介孔载体二氧化硅通过它的生物相容性和平滑肌细胞表面相吸，迅速局部定位到细胞表面，细胞通过强大的吞噬作用迅速将细胞表面的二氧化硅摄取。该载体的优势是利用人体安全的新型生物材料构建出能够紧密包裹和厚朴酚、迅速定位细胞表面，并顺利进入细胞浆缓释药物，药物释放后，二氧化硅自身发生崩解并从泌尿系统排出体外。该载体的具体构建方法：通过混匀仪将小分子和厚朴酚包载到介孔中，并选择合适的方法进行存储，从而形成可以有效将疏水性药物和厚朴酚带入细胞，并顺利释药，发挥药效，从而降低给药剂量和副作用的复合物。由于所用的材料都是安全的新型材料，和细胞膜具有极好的相容性，被人体所接受，所以该载体具有药用的潜质。
上述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
上述实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
上述实施例中，
1、实验试剂和细胞来源：
介孔二氧化硅购自美国Sigma公司；和厚朴酚购自上海金穗生物科技有限公司；无水乙醇，分析纯，购自上海国药集团试剂有限公司；DMEM高糖培养基、0.25％胰酶购自BI公司；青霉素-链霉素混合溶液(100×双抗)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)购自美国Gibco公司；免疫荧光细胞固定液、抗荧光淬灭封片液、WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、4％多聚甲醛和结晶紫染色剂购自碧云天公司；Fluoroshield Mounting Medium WithDAPI购自英国Abcam公司；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I购自美国BD公司；胰蛋白酶1:250购自上海翊圣生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)购自上海生物工程股份有限公司；Alexa
Figure BDA0001859862520000171
594anti-human/mouse/rat PCNA抗体和PE anti-human/mouse/rat PCNA抗体购自biolegend公司；Foxp3/Transcription Factor StainingBuffer和staining buffer购自thermofisher公司；用于western blot实验的一抗(PCNA抗体、p-ERK抗体、p-smad2/3)购自immunoway公司。
A7r5大鼠胸主动脉平滑肌细胞购自中国科学院上海细胞所。
2、实验仪器：
混匀仪：Eppendorf有限公司；生物型透射电镜：FEI公司；荧光共聚焦显微镜：德国徕卡；酶标仪；流式仪：美国BD公司；CO2恒温培养箱：美国ThermoFisher科技有限公司；Centrifuge 5418R离心机：Eppendorf公司；超净工作台、4℃冰箱：海尔公司；BS 210S电子天平：Sartorius公司。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (1)

1.一种用于抑制血管平滑肌细胞增殖、促进血管平滑肌细胞凋亡或抑制血管平滑肌细胞迁移的中药纳米药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括，将介孔载体二氧化硅与和厚朴酚以质量比2:1的比例称量混匀，置于避光的ep管中，加入适量的无水乙醇，使介孔载体二氧化硅在无水乙醇中的浓度为2mg/ml，和厚朴酚的浓度为1mg/ml，将ep管置于混匀仪震荡过夜，使和厚朴酚小分子充分被介孔结构吸附容纳，将无水乙醇用氮气吹干后，加入同等体积的去离子水，使介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒均匀的悬浮于去离子水中，为防止和厚朴酚从介孔中释放出来，导致二氧化硅的崩解，将介孔载体二氧化硅/和厚朴酚纳米颗粒的水溶液冻干，冻干粉末保存于4℃备用。
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