CN107614430B - 组合物、粒状材料和用于制造粒状材料的方法 - Google Patents

组合物、粒状材料和用于制造粒状材料的方法 Download PDF

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Abstract

包括粗糙的介孔中空纳米颗粒的粒状材料。所述粗糙的介孔中空纳米颗粒可以包括介孔壳，所述介孔壳的外表面具有在其上的凸起，所述凸起具有比颗粒尺寸更小的尺寸。可以将粒状材料用于递送活性试剂如杀虫剂和农药。所述活性试剂可以进入颗粒的中空核并且受保护免受太阳光降解。颗粒的粗糙表面将颗粒保持在植物的叶或动物毛发上。还描述了形成颗粒的方法。还描述了碳颗粒和用于形成碳颗粒的方法。

Description

组合物、粒状材料和用于制造粒状材料的方法
技术领域
本发明涉及粒状材料和涉及用于形成粒状材料的方法。本发明还涉及组合物。本发明还涉及包含疏水性化合物的组合物；和/或具有疏水性质的组合物。一些所述粒状材料可以用于根据本发明的方面的组合物中。
背景技术
澳大利亚处于世界上最大的和最成功的商业牲畜生产者中，其为澳大利亚的国内生产总值(GDP)贡献了～1％。红色肉类和牲畜的出口在2012-2013年中贡献了～$160亿的总价值。然而，节肢动物害虫对工业造成严重威胁。据估计，蜱每年花费养牛业约$1.7–2亿。此外，水牛虻和羊虱侵扰已由于实施控制策略的成本和生产力损失而导致百万元计的损失。体外寄生物处理的高成本主要是由于实现效率所需要的活性化合物的高剂量率和重复处理。此外，目前使用的许多农药具有高毒性、负面的环境影响和对人类健康和食品安全的潜在风险。节肢动物害虫同样威胁着种植作物如谷类、蔬菜和水果。
多杀菌素是具有低环境影响和低哺乳动物毒性的天然来源的农药。然而，其使用在目前部分地受到其降低效力的UV不稳定性、低水溶解度和疏水性的限制，使得水性体系中配制困难和相对于常规化学农药更高的成本。多杀菌素目前已注册用于绵羊以处理虱和蝇侵扰，然而，其对抗牛的体外寄生物的降低的效力和功效的持续时间已妨碍其作为水牛虻和牛蜱的处理注册。类似地，这些缺点已限制了多杀菌素用于作物保护应用中，其中通常使用水性制剂并且由于农药在施用之后停留在植物表面上而需要UV稳定性。
用作杀虫剂或农药的许多其它化合物也是疏水性的。因此，如果待将水基组合物用于那些杀虫的农药的应用，则典型地需要悬浮剂或乳剂。悬浮剂或乳剂可能由于分离成分开的层的倾向而遭受短的贮存期。经由喷雾施用出于相同的原因也可能是困难的。如果化合物对光或紫外光敏感，则面对另外的困难。在这样的情况下，化合物可能由于化合物在暴露至阳光时分解而具有在施用之后的短的有效期。
许多其它疏水性化合物在用于生物体系中时具有有益的效果。这些化合物可以包括具有对动物或人的治疗效果的化合物(如抗生素、抗癌药或用于治疗疾病的其它药物)、蛋白质和用作标记物试剂的染料。将这样的试剂递送至生物体系可能是困难的。
在生物体系中，疏水性相互作用通常被认为是所有长程非共价相互作用中最强的。疏水性相互作用对于生物分子的吸附、改进与细胞膜的相互作用增加用于细胞递送的纳米颗粒的摄取以及调制药物的释放速率而言是有益的。为了产生具有疏水性质的纳米颗粒，选择疏水性组合物或官能化是便利的途径之一。疏水性材料如碳纳米管(CNT)已显示出作为用于药物递送的纳米尺度的媒介物很大前景，然而主要的关注点之一在于这样的事实：CNT可能对环境和人类健康有害，需要另外的表面官能化以降低它们的固有毒性。已将疏水性结构部分如烷烃硫醇和烷基链用于使各种纳米颗粒(包括金和二氧化硅)的表面改性，以增强疏水性药物/蛋白质的负载和改进细胞递送性能。然而，化学接枝的疏水性基团倾向于导致纳米载体的不希望的毒性和孔堵塞。因此设计使用替代性途径的安全和有效的疏水性纳米载体体系成为挑战。
除了在配制疏水性试剂中所面对的困难以外，作为药物、杀虫剂或以其它方式使用的除多杀菌素以外的许多活性分子在田间由于UV降解而遭受有限的活性寿命。局部施加并且因此更可能暴露至UV光的活性分子(包括用于人类和动物的局部制剂和用于作物保护中的那些)尤其如此。将这些活性分子配制成UV保护性载体体系的能力可以使更长的持续时间的有效性成为可能。
当然，如果在活性分子可以充分发挥作用之前出现其它因素如从作用的位置洗掉活性分子，则在通过保护活性分子免受UV光而延长其作用的持续时间方面没有什么价值。在许多应用(包括活性分子的局部应用)中和在作物保护中，活性分子被雨水、风磨耗和其它侵蚀力洗掉可以明显降低活性分子的效力和作用的持续时间。
在基因疗法中，已证实了在由遗传障碍引起的疾病的治疗方面的卓越治疗益处，其中递送媒介物的效力是将核酸引入细胞以实现它们的功能的关键。DNA疫苗接种是最近的治疗形式，其中将编码感兴趣的抗原的质粒DNA(p-DNA)递送至细胞中以诱导抗原特异性免疫。在此，并不是如在使用亚单位疫苗的疫苗接种情况下通常进行那样为患者注射疫苗抗原，而是为患者注射p-DNA分子，所述p-DNA分子为身体细胞提供编码，以在体内产生抗原，有效使身体产生其自身的抗原。使用其它核酸形式如信使RNA(mRNA)的疫苗接种策略也在不断涌现。
p-DNA到靶细胞中的有效递送已是对于该有前景的途径的重大挑战。DNA疫苗是有前景的疫苗候选物，因为它们是非常特异性的、安全和良好地耐受和相对便宜地制造。然而，差的免疫原性是主要的问题并且其重要原因在于不能将p-DNA有效递送至细胞核，从而可以引入所述DNA，然后产生疫苗抗原。由三个主要因素引起p-DNA的低效的递送，所有这些因素结合起来意味着注射进身体的p-DNA的仅一小部分实际上使其进入细胞核而能够产生疫苗抗原：
1.在注射或递送至身体中之后并且在p-DNA进入细胞之前通过核酸酶分解所述p-DNA
2.不能有效地跨细胞膜转运至细胞内
3.一旦在细胞内部不能有效地进入细胞核
已证明使用病毒递送体系(待研究的第一递送体系之一)递送p-DNA在将p-DNA递送至细胞方面是有效的，然而毒性问题已降低了这些早期递送体系候选者的前景。自那时以来，聚合物微球和阳离子脂质体已经成为两种有前景的新型递送技术，尽管这两者很可能都不足够好以使DNA疫苗被广泛采用。
阳离子脂质体能够负载合理的量的p-DNA并且容易负载，从而在方法期间不破坏p-DNA。针对核酸酶进行保护是良好的，因为可以将p-DNA包封在脂质体内。然而，脂质体是软颗粒并且因此在体内并不非常稳定。毒性也非常重要。聚合物微粒也被用作p-DNA的载体。聚合物典型地比脂质体更刚性，因此不具有在体内机械降解的倾向。聚合物微粒还为p-DNA提供了针对核酸酶的良好保护。然而，已提出的关键聚合物(聚乳酸和聚(乳酸-共-乙醇酸))形成疏水性颗粒并且带负电，因此可能不恰当地包封p-DNA。此外，负载方法通常相当严苛，这可能在加工期间破坏p-DNA。转染效率倾向于低。聚乙烯亚胺(PEI)已显示出使更高的转染效率成为可能，然而这些聚合物可能是极其细胞毒性的。对于有效的基因疗法和DNA疫苗接种策略，非常期望理解p-DNA分子的独特环结构和高级p-DNA媒介物的合理设计。
将会清楚地理解的是，如果在本文中引用现有技术出版物，则该参考文献并不构成承认该出版物形成在澳大利亚或任何其它国家的本领域公知常识的一部分。
发明简述
本发明涉及组合物，其包括一种或多种疏水性化合物；和/或具有疏水性质的纳米结构。在本发明的其它方面，提供了粒状材料和用于形成粒状材料的方法。
在第一方面，本发明提供了包括粗糙的介孔中空纳米颗粒的粒状材料。
将粗糙的介孔中空纳米颗粒定义为具有介孔壳的中空颗粒或球，所述介孔壳的外表面具有在其上的凸起，所述凸起具有比颗粒尺寸更小的尺寸。所述颗粒尺寸可以在100nm至3000nm的范围内，凸起的尺寸可以在5nm至1000nm，优选100nm至500nm的范围内。在一个实施方案中，凸起可以包括在壳上的纳米球。
在一个实施方案中，介孔壳可以包括二氧化硅、Ag、Au、磷酸钙或二氧化钛或碳或碳基材料。在一个实施方案中，粗糙的介孔中空纳米颗粒包括粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒。
在一个实施方案中，颗粒由通常亲水性材料制成，但是所述颗粒展示疏水特性。
粗糙的介孔中空纳米颗粒将典型地具有被具有介孔结构的壳包围的中空核。因为包围和限定中空核的壳是多孔的，所以化合物可以穿过孔并且进入所述中空核。可具有球状或其它形状的凸起存在于壳的外侧上，为颗粒提供粗糙表面。尽管制成粗糙的介孔中空纳米颗粒的材料(如二氧化硅)通常可以亲水性材料，但是粗糙的表面导致显示出疏水性质的粗糙的介孔中空纳米颗粒，由此允许或甚至增强疏水性化合物到中空核中的移动。
粗糙的介孔中空纳米颗粒将典型地具有直径为100nm至1000nm，或100nm至700nm的中空核。中空核将由具有介孔结构的壳如在粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒情况下的二氧化硅的壳限定。所述壳(如二氧化硅的壳)将典型地具有包括在2nm至20nm范围内的孔的孔结构。因为包围和限定中空核的壳是多孔的，所以化合物可以穿过所述孔并且进入中空核。包围中空核的壳可以具有10nm至100nm的厚度。粗糙的介孔中空纳米颗粒可以包括在表面上的彼此间隔开的凸起或突出部。隔开的凸起或突出部为颗粒提供表面粗糙度。表面粗糙度足以产生呈现疏水特性，在一些情况下极其疏水的粗糙的介孔中空纳米颗粒。
在粗糙的介孔中空纳米颗粒包括粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒的实施方案中，粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒将典型地具有直径为100nm至1000nm或100nm至700nm的中空核。所述中空核将由具有介孔结构的二氧化硅壳限定。二氧化硅壳将典型地具有包括在2nm至20nm范围内的孔的孔结构。因为包围和限定中空核的二氧化硅壳是多孔的，所以化合物可以穿过所述孔并且进入中空核。包围中空核的二氧化硅壳可以具有10nm至100nm的厚度。粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒可以包括在表面上的彼此间隔开的二氧化硅凸起或突出部。隔开的二氧化硅凸起或突出部为颗粒提供表面粗糙度。表面粗糙度足以产生呈现疏水特性，在一些情况下极其疏水的粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒。
隔开的凸起可以包括连接至更大的中空纳米颗粒的外表面的纳米颗粒。连接至更大的中空纳米颗粒的外表面的纳米颗粒可以具有与更大的中空纳米颗粒相同的组成或具有与更大的中空纳米颗粒不同的组成。用于构造凸起的纳米颗粒可以具有在5nm至100nm范围内的直径和中空纳米颗粒可以具有在100nm至1000nm范围内的直径。替代性地，隔开的二氧化硅凸起可以包括从纳米颗粒的中空壳向外延伸的束或圆柱体或纤维或结节。凸起的长度可以为5nm直至它们所在的大的中空颗粒的直径，然而如果应用需要的话可以使它们更长。凸起的直径可以低至2-3nm或高至100nm以上和凸起的直径或厚度可以由于用于形成它的方法而沿着其长度变化。纳米颗粒的比表面积可以在100m2/g至1000m2/g，或150m2/g至1000m2/g，或175m2/g至1000m2/g内的范围。
在粗糙的介孔中空纳米颗粒包括粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒的实施方案中，粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒、隔开的凸起或突出部适当地包括二氧化硅凸起或突出部。隔开的二氧化硅的凸起可以包括连接至更大的中空二氧化硅纳米颗粒的外表面的二氧化硅纳米颗粒。用于构造凸起的二氧化硅纳米颗粒可以具有在5nm至100nm范围内的直径和中空二氧化硅纳米颗粒可以具有在100nm至1000nm范围内的直径。替代性地，隔开的二氧化硅凸起可以包括从中空二氧化硅纳米颗粒向外延伸的二氧化硅的束或圆柱体或纤维或结节。凸起的长度可以为5nm直至它们所在的大的中空颗粒的直径，然而如果应用需要的话可以使它们更长。凸起的直径可以低至2-3nm或高至100nm以上和凸起的直径或厚度可以由于用于形成它的方法而沿着其长度变化。纳米颗粒的比表面积可以在100m2/g至1000m2/g，或150m2/g至1000m2/g，或175m2/g至1000m2/g内的范围。
在其它实施方案中，粗糙的介孔中空纳米颗粒包括粗糙的介孔中空碳纳米颗粒。
在第二方面，本发明提供了包括在其中或在其上具有一种或多种疏水性材料的粗糙的介孔中空纳米颗粒的组合物。
在本发明的第二方面的一个实施方案中，疏水性材料包括杀虫剂或农药。在优选的实施方案中，疏水性材料包括多杀菌素。疏水性材料可以遍及颗粒分布，分布在内核中，分布在壳的孔内和/或分布在多孔的壳的表面上，和分布在凸起之间和凸起上，或这些的组合。
如上文所述，多杀菌素是非常疏水的，具有低的水溶解度并且由于暴露至UV光(如在暴露至太阳光时发生)而极其易于降解。因此，尚未发现多杀菌素用于在牲畜(如牛和绵羊)和植物中通过将包含多杀菌素的组合物外部施用至动物或植物而处理体外寄生物和昆虫侵扰的广泛用途。本发明人已出人意料地发现粗糙的介孔中空纳米颗粒如粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒可以以保护疏水性分子免受UV光降解的方式占据(take up)多杀菌素和其它疏水性分子，由此增强光稳定性和杀虫活性的持续时间。此外，粗糙的介孔中空纳米颗粒的中空核促进多杀菌素或其它疏水性分子在颗粒中的高负载量，使得开发商业上相关的制剂。此外，粗糙的介孔中空纳米颗粒的中空和粗糙的表面形态增加了颗粒的疏水性并且进一步增强了多杀菌素负载容量。还已发现粗糙的介孔中空纳米颗粒更强地粘附至皮、毛发和其它表面如植物的叶，因此进一步延长在田间条件下的多杀菌素的杀虫活性的持续时间。粗糙的介孔中空纳米颗粒很可能更强地粘附至植物的叶，特别是在它们上具有毛的叶。该改进的粘附通过使在施用之后的杀虫剂残留物的洗掉最小化而进一步增强了杀虫剂的效力和寿命。因此，使用更低标签剂量的更环境友好的制剂对于本发明可以是可行的。
本发明并不限于与任意特别类型的疏水性分子的相容性，并且本身可以与宽范围的疏水性分子一起使用。可以与本发明的颗粒一起配制的其它疏水性农药包括但不限于，拟除虫菊酯、印楝素(印楝油)和除虫菊。类似于多杀菌素，这些是安全使用但在阳光下快速分解的天然产物。事实上，目前在开发中的许多新的药学活性分子遭受疏水性或UV降解的问题并且这些很可能与本发明的颗粒相容。
在一个实施方案中，本发明提供了用于外部施用至动物或植物的杀虫组合物，所述组合物包括在其中具有一种或多种疏水性杀虫材料的粗糙的介孔中空纳米颗粒。在一个实施方案中，粗糙的介孔中空纳米颗粒包括粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒。
一种或多种疏水性材料将合适地存在于纳米颗粒的中空核中。一种或多种疏水性材料同样很可能存在于产生纳米颗粒的表面粗糙度的升起或凸起的区域之间的空间中。
还可以将粗糙的介孔中空纳米颗粒作为有效的媒介物用于将疏水性材料递送至生物体系，如疏水性药物的药物递送，用于疏水性蛋白质的递送试剂和载体，和作为可用作标记物试剂的疏水性染料的递送试剂和载体。可以将在进一步用疏水性化合物改性以生成超疏水性颗粒之后的粗糙的介孔中空纳米颗粒用于水污染物的去除中以及自清洁应用的表面涂层中。使用硅烷和其它试剂的包括含有疏水性基团的结构部分的共价连接的表面例如二氧化硅的疏水改性的方法是本领域技术人员公知的。
在一个实施方案中，疏水性材料可以包括疏水性蛋白质，如RNase A，胰岛素或溶菌酶，疏水性染料如分散红1、溶剂红、玫瑰红，疏水性药物或治疗剂如灰黄霉素、姜黄素、布洛芬或红霉素或万古霉素，或精油如牛至油。在精油的情况下，本发明可以提供用于增加疏水性精油的溶解度、使它们更生物可利用并且因此使得剂量节约策略成为可能，以使制剂制造中的精油成本最小化的手段。还已知精油是相对挥发性的化合物并且大量的油可能在精油制剂的制造、储存和使用期间蒸发而损失。通过将精油负载至本发明的颗粒中，可以使到蒸发的损失最小化和可以降低制造制剂中的精油成本，而不负面地影响产物的效力。溶菌酶和用于化妆品、动物饲料添加剂和其它应用中的其它酶也可以与本发明的颗粒一起配制。在此，颗粒可以提供缓释功能，其在例如具有抗菌性质的溶菌酶的情况下，可以导致随着时间推移的细菌的持续抑制。在酶制剂的制造和储存期间，许多酶由于热分解、水解或其它原因而经历降解，需要将过量的酶用于制剂中，从而补偿这些产率损失。例如，在用于制备一些动物饲料的蒸汽造粒方法中，施加蒸汽可以导致一些酶内容物的变性，需要将过量的酶添加至制剂或使用昂贵的设备以在蒸汽造粒方法之后将酶喷雾至产生的粒料上。用本发明的颗粒配制酶可以保护所述酶免于降解。可以将这些活性成分负载至通过颗粒提供的内部空腔中，在与凸起缠结的颗粒的外侧上或二者的组合。活性成分在内部空腔和外表面之间如何分布取决于期望的释放速率、分子的尺寸、期望的负载水平、活性成分所需要的保护程度和其它因素。
不希望受制于理论，本发明人已假设活性分子可以吸附至颗粒的表面上或插入颗粒上的凸起之间的空隙并且即使活性材料并不(部分或完全)进入颗粒的中空核，这也提供针对活性材料的降解的一定程度的保护。
本发明人还已发现，可以将粗糙的介孔中空纳米颗粒用于提供在其中占据的化合物的持续释放。因此，在第三方面，本发明提供了用于提供化合物的持续释放的组合物，所述组合物包括具有在其中占据的化合物的粗糙的介孔中空纳米颗粒。在该方面，化合物可以为疏水性化合物或可以为亲水性化合物。所述化合物可以包括描述为适合用于本发明的第一方面的任意材料。所述化合物可以为治疗剂，如抗生素。所述抗生素可以例如为万古霉素或甲硝唑。
在其它方面，本发明的相容性并不限于与疏水性分子一起使用。许多亲水性分子可以受益于本发明的颗粒提供的有利之处如缓释、针对UV降解的保护和对植物、动物或其它表面的增强的粘附。
因此，在第四方面，本发明提供了包括在其中具有一种或多种亲水性材料的粗糙的介孔中空纳米颗粒的组合物。
在第五方面，本发明还可以涉及包括在其中或在其上具有一种或多种活性分子的粗糙的介孔中空纳米颗粒的组合物。在一些实施方案中，活性分子可以为本文中所描述的任意活性分子。
本发明人还已发现，本发明的颗粒可以起用于新兴的疫苗接种策略中的核酸如质粒DNA(p-DNA)和信使RNA(mRNA)的有效递送体系的作用。在p-DNA的情况下，期望能够保护p-DNA分子在p-DNA进入身体时免受核酸酶的攻击。p-DNA的该降解模式为DNA疫苗的效力方面的明显降低负责。由于p-DNA分子的大的尺寸，当与本发明的颗粒配制时，p-DNA大量分布在颗粒的外侧上，由颗粒的表面上的凸起固定。这足以提供针对受核酸酶攻击的高度保护。在配制DNA或mRNA基疫苗中，可以将本发明的颗粒用增加颗粒对这些核酸的亲和性的物质涂覆。这可能涉及将化学官能团共价接枝至颗粒上或施加经由氢键、静电吸引或本领域技术人员已知的一些其它手段与颗粒表面相互作用的涂层。例如，可以将聚乙烯亚胺(PEI)涂覆至颗粒上。由于针对受核酸酶的攻击基本上稳定的制剂，DNA疫苗递送体系的下一个挑战是有效地穿过携带p-DNA的细胞膜。本发明的颗粒的尺寸良好地适合于在与p-DNA、mRNA、siRNA或其它核酸形成络合物之后宿主细胞的高效细胞摄取。在一些情况下，当核酸分子位于壳的外侧上，经由凸起中的缠结固定至颗粒时，可能没必要使用具有任意孔隙度的壳，因为活性分子基本上并不进入内部空腔。
因此，在第六方面，本发明提供了包括用一种或多种核酸至少部分地涂覆的粗糙的纳米颗粒的组合物。粗糙的纳米颗粒可以具有很少或不具有孔隙度。粗糙的纳米颗粒可以具有实心核或它们可以具有中空核。粗糙的纳米颗粒可以具有介孔结构，但是由于一种或多种核酸的尺寸，存在很少或不存在纳米颗粒的孔被一种或多种核酸穿透。
在第七方面，本发明提供了包括粗糙的纳米颗粒的粒状材料，所述粗糙的纳米颗粒包括核、具有在其上的凸起的外表面、具有比颗粒尺寸更小的尺寸的凸起，所述粗糙的纳米颗粒具有在100nm至3000nm范围的颗粒尺寸，凸起的尺寸在5nm至1000nm范围内。
在该方面，凸起的尺寸可以在100nm至500nm范围内。凸起可以包括在壳上的纳米球或在壳上的突出部。所述核可以包括二氧化硅、Ag、Au、磷酸钙或二氧化钛或碳或碳基材料。纳米颗粒可以具有直径为100nm至1000nm的核。所述核可以为实心核或中空核。纳米颗粒具有很少或不具有孔隙度。
在第八方面，本发明提供了包括用核酸至少部分地涂覆的根据权利要求79至85任一项所述的粗糙的纳米颗粒的组合物。核酸可以选自质粒DNA(p-DNA)和信使RNA(mRNA)的一种或多种。
在第九方面，本发明提供了根据本发明的第七方面的粗糙的介孔中空纳米颗粒用于媒介物将疏水性材料递送至生物体系的用途。
在第十方面，本发明提供了根据本发明的第七方面的粗糙的介孔中空纳米颗粒用于疏水性药物的药物递送、作为疏水性蛋白质的递送试剂和载体，和作为可用作标记物试剂的疏水性染料的递送试剂和载体的用途。
在第十一方面，本发明提供了根据本发明的第七方面的粗糙的介孔中空纳米颗粒用于水污染物的去除或自清洁应用的表面涂层中的用途。可以将颗粒用疏水性化合物改性以生成超疏水性颗粒。
在第十二方面，本发明提供了包括以下步骤的用于形成粗糙的纳米颗粒的方法：由反应混合物形成颗粒，所述颗粒由第一材料形成；将第二材料的前体添加至反应混合物以形成围绕所述颗粒的第二材料的壳，所述壳具有从其延伸的第二材料的突出部，其中在第二材料的突出部之间由反应混合物形成第一材料；和随后去除位于壳外部的第一材料。所述壳可以包括具有很少或不具有孔隙度的实心壳。去除位于壳外部的第一材料的步骤可以留下在壳内部的第一材料的核。
在一些实施方案中，核酸可以为质粒DNA或mRNA。可以使用两种或更多种核酸。
当核酸包括质粒DNA时，所述组合物可以包括DNA疫苗组合物。
在本发明的一个实施方案中，粗糙的介孔中空纳米颗粒可以通过以下制备：形成中空壳纳米颗粒和将具有较小尺寸的纳米颗粒添加至相对较大尺寸的中空壳纳米颗粒上，从而较小的颗粒在较大的中空壳的外表面上形成突出部或凸起。中空二氧化硅纳米颗粒可以是介孔的。根据该途径，可以独立于较大的中空壳合成将会形成凸起的颗粒。
在本发明的一个实施方案中，粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒可以通过以下制备：形成中空二氧化硅壳纳米颗粒和将具有较小尺寸的二氧化硅纳米颗粒添加至相对较大尺寸的中空二氧化硅壳纳米颗粒上，从而较小的二氧化硅颗粒在较大的中空二氧化硅壳的外表面上形成突出部或凸起。中空二氧化硅壳纳米颗粒可以是介孔的。根据该途径，可以独立于较大的中空二氧化硅壳合成将会形成凸起的二氧化硅颗粒。
在另一实施方案中，粗糙的介孔中空纳米颗粒可以通过以下形成：由反应混合物形成牺牲颗粒，所述牺牲颗粒由碳基材料形成；将壳材料前体添加至反应混合物以形成围绕所述牺牲颗粒的多孔壳，所述壳具有从其延伸的含硅材料的突出部，其中由反应混合物形成碳基材料并且将其沉积在材料的突出部之间；和随后去除碳基材料。在此，将突出部材料或突出部材料前体和碳基材料以空间上不均匀的方式共沉积至多孔壳上，使得随后的碳基材料的去除留下从壳的表面伸出的材料的凸起。与凸起共沉积的碳基材料可以由从形成牺牲颗粒而留下的碳基前体沉积或可以将碳基前体随后添加至混合物。据信该制造方法是独特的。
在另一实施方案中，粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒可以通过如下形成：由反应混合物形成牺牲颗粒，所述牺牲颗粒由碳基材料形成；将二氧化硅前体添加至所述反应混合物以形成围绕所述牺牲颗粒的包含硅的多孔壳，包含硅的壳具有从其延伸的含硅材料的突出部，其中在含硅材料的突出部之间由反应混合物形成碳基材料；和随后去除碳基材料。在此，将硅和碳基材料以空间上不均匀的方式共沉积至多孔硅壳上，使得随后的碳基材料的去除留下从二氧化硅壳的表面伸出的硅的凸起。与硅凸起共沉积的碳基材料可以由从形成牺牲颗粒而留下的碳基前体沉积或可以将碳基前体随后添加至混合物。
因此，在第十三方面，本发明提供了用于形成粗糙的介孔中空纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：由反应混合物形成牺牲颗粒，所述牺牲颗粒由第一材料形成；将壳材料的前体添加至反应混合物以形成围绕所述牺牲颗粒的第二材料的壳，所述壳具有从其延伸的材料的突出部，其中在第二材料的突出部之间由反应混合物形成第一材料；和随后去除第一材料。
在该方法的一个实施方案中，第一材料为碳基材料和第二材料为硅或二氧化硅基材料。在该实施方案中，用于形成粗糙的介孔中空纳米颗粒的方法包括以下步骤：由反应混合物形成牺牲颗粒，所述牺牲颗粒由碳基材料形成；将壳材料的前体添加至反应混合物以形成围绕所述牺牲颗粒的壳，所述壳具有从其延伸的材料的突出部，其中在材料的突出部之间由反应混合物形成碳基材料；和随后去除碳基材料。牺牲颗粒可以由各种聚合前体例如氨基酚-甲醛或多巴胺制成。
在一个实施方案中，碳基材料包括通过两种或更多种单体或聚合物前体的反应形成的聚合物。在一个实施方案中，包含硅的壳和含硅材料的突出部包括二氧化硅。在该实施方案中，二氧化硅前体形成具有从其延伸的二氧化硅的突出部的围绕牺牲颗粒的二氧化硅壳。
在一个实施方案中，二氧化硅前体材料以比形成含碳材料更快的速率形成二氧化硅。因此，将二氧化硅的壳首先沉积在预形成的牺牲颗粒表面上。典型地，一旦已形成二氧化硅的壳，则已经过足够的时间使碳基材料的前体开始形成另外的碳基材料。因此，在二氧化硅的壳上，碳基材料的生长与二氧化硅物类的生长竞争，这导致各物类的优选垂直的突出部。这导致形成“棒状”二氧化硅凸起和在凸起之间的碳基材料的层。当消耗反应混合物中的二氧化硅物类时，碳基材料的剩余的前体另外沉积或反应以形成碳基材料的最外层。可以通过任何合适的方法，典型地通过加热如煅烧或通过使用适当的溶剂去除碳基材料。该方法也可以与不同于二氧化硅的材料如Ag、Au、磷酸钙和二氧化钛制成的颗粒使用。
在期望形成具有实心核的纳米颗粒的情况下，可以控制去除第一材料的步骤，从而不去除核材料。在期望形成具有很少或不具有孔隙度的颗粒的情况下，形成围绕核的壳，从而使其为具有很少或不具有孔隙度的壳。
在一个实施方案中，由包括间苯二酚-甲醛、氨基酚-甲醛或多巴胺的反应混合物形成碳基材料。牺牲颗粒可以在氨水溶液、去离子水和乙醇且pH＝11.5在室温的典型
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合成条件下形成。TEOS的二氧化硅前体比间苯二酚和甲醛的重量比分别典型地为1:0.71和1:0.81。二氧化硅前体可包括原硅酸四乙酯(TEOS)、原硅酸四丙酯(TPOS)或四丁氧基硅烷(TBOS)、原硅酸四甲酯(TMOS)或本领域技术人员已知的其它二氧化硅前体。在所使用的反应条件下，二氧化硅前体可以形成二氧化硅。替代性地，二氧化硅前体可以形成可以随后转变成二氧化硅的含硅材料。
在本发明的第十三方面的一个实施方案中，将二氧化硅前体添加至反应混合物和随后在之后的时间进行碳基材料的前体的另外的添加。
在一个实施方案中，反应混合物中的碳基材料的前体的一种或多种在形成牺牲颗粒中基本上完全消耗，这之后添加壳材料的前体和在添加壳材料前体之后的预定时间段添加另外的所述碳基材料的前体。这允许围绕牺牲颗粒形成壳。在最终的粗糙的介孔中空纳米颗粒中该壳将会包围中空核。在另一实施方案中，壳材料前体以比碳基材料的前体明显更快的速率形成材料。这还将会导致围绕牺牲颗粒形成壳。然而，仍然将会发生由其前体形成碳基材料并且这将会倾向于发生在壳或含硅的壳的表面上与另外的壳材料的沉积竞争。因此，在壳的表面上将会形成碳基材料和壳材料的分开的岛。碳基材料的另外的沉积将会倾向于发生在碳基材料的岛上，导致碳基材料的突出部。类似地，壳材料的另外的沉积将会倾向于在壳材料的岛上发生，导致壳材料的突出部。因此，将会出现每种材料的棒状突出部。一旦壳材料前体已耗尽，则将会沉积另外的碳基材料以形成碳基材料的外壳。碳基材料的去除(如通过在空气中煅烧)导致形成粗糙的介孔中空纳米颗粒。
在粗糙的介孔中空纳米颗粒包括粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒的一个实施方案中，反应混合物中的碳基材料的前体的一种或多种在形成牺牲颗粒中基本上完全消耗，这之后添加二氧化硅前体和在添加二氧化硅前体之后的预定时间段添加另外的所述碳基材料的前体。这允许围绕牺牲颗粒形成二氧化硅或含硅的壳。在最终的粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒中该二氧化硅或含硅的壳将会包围中空核。在另一实施方案中，二氧化硅前体以比碳基材料的前体明显更快的速率形成二氧化硅或含硅材料。这还将会导致形成围绕牺牲颗粒的二氧化硅壳或含硅的壳。然而，仍然将会发生由其前体形成碳基材料并且这将会倾向于发生在二氧化硅壳或含硅的壳的表面上与另外的二氧化硅或含硅材料的沉积竞争。因此，在二氧化硅/含硅材料壳的表面上将会形成碳基材料和二氧化硅/含硅材料的分开的岛。碳基材料的另外的沉积将会倾向于发生在碳基材料的岛上，导致碳基材料的突出部。类似地，二氧化硅/含硅材料的另外的沉积将会倾向于发生在二氧化硅/含硅材料的岛上，导致二氧化硅/含硅材料的突出部。因此，将会出现每种材料的棒状突出部。一旦二氧化硅前体已耗尽，则将会沉积另外的碳基材料以形成碳基材料的外壳。碳基材料的去除(如通过在空气中煅烧)导致形成粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒。
可以控制添加至反应混合物的壳材料前体的量，以控制壳的厚度、壳的孔隙度和突出部之间的间隔。在一些实施方案中，在牺牲颗粒表面上形成的壳可以包括具有在其中的间隙或空间的不连续的壳。事实上，在一些实施方案中，壳可以包括不连续的材料层或相对连续的互连的材料层。
可以控制反应条件和反应时间，从而控制首先形成的牺牲颗粒的尺寸。这当然将会允许控制最终的粗糙的介孔中空纳米颗粒的中空核的尺寸。将会意识到的是，限定最终的粗糙的介孔中空纳米颗粒的中空核的壳在去除碳基材料的步骤期间可能收缩。
在第十四方面，本发明提供了用于形成碳纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：形成包含二氧化硅前体和碳基材料的一种或多种前体的反应混合物，其中形成二氧化硅或含硅的颗粒和在二氧化硅或含硅的颗粒上形成碳基材料，以由此形成在二氧化硅或含硅的颗粒上的碳基材料的壳，将另外的二氧化硅前体添加至反应混合物以在碳基材料的壳上形成另外的二氧化硅或含硅材料，其中在另外的二氧化硅或含硅材料之间和之上形成和沉积另外的碳基材料，和去除二氧化硅或含硅材料以由此获得碳纳米颗粒。二氧化硅或含硅材料可以被其它材料替换，例如来源于异丙醇铝的二氧化钛或来自丁醇钛(IV)的氧化铝。获得的纳米颗粒可以为通过将RF用含N的氨基酚-甲醛或多巴胺在醇-水体系中作为聚合前体替换的碳纳米颗粒的N-掺杂的组合物。
在第十五方面，本发明提供了用于形成碳纳米颗粒的方法，包括以下步骤：形成包含第一材料的前体和碳基材料的一种或多种前体的反应混合物，其中形成第一材料的颗粒和在第一材料的颗粒上形成碳基材料，以由此形成在第一材料的颗粒上的碳基材料的壳，将另外的第一材料前体添加至反应混合物以在碳基材料的壳上形成另外的第一材料，其中在所述另外的第一材料之间和之上形成和沉积另外的碳基材料，和除去第一材料以由此获得碳纳米颗粒。
在一个实施方案中，将碳基材料碳化。可以在去除第一材料之前将碳基材料碳化。在一个实施方案中，在碳化步骤之前使颗粒经受水热处理。
在本发明的第八和第九方面的方法中形成的碳纳米颗粒包括具有双层结构的介观结构的中空碳球。通过控制碳/二氧化硅或碳/第一材料壳的厚度，可以调整颗粒的双层的形态和介孔尺寸。双层形态可以包括凹入的、内凹的或完整的球。可以将碳纳米颗粒的直径和中空核尺寸控制至100-1000nm的范围内，可以将包围中空核的壁的厚度调节至5-100nm。双层的碳纳米颗粒的孔体积和表面积可以分别在1-3cm3g-1和800-1300m2g-1的范围内。
在第十六方面，本发明提供了包括具有双层结构的介观结构的中空碳球的碳颗粒。双层形态可以包括凹入的、内凹的或完整的球。碳纳米颗粒的直径和中空核尺寸可以在100-1000nm的范围内，包围中空核的壁的厚度可以在5-100nm范围内。双层的碳纳米颗粒的孔体积和表面积可以分别在1-3cm3g-1和800-1300m2g-1的范围内。双层结构可以包括两个隔开的部分或完整的碳壳，其中内壳基本上是中空的。碳颗粒可以具有多层结构，具有2或更多隔开的部分或完全的碳壳。
在能量储存领域，实现更高能量密度的要求正在驱动新的高容量电极材料的研究。然而，不同于既定的材料如用于锂离子电池组中的石墨，这些有前景的高容量候选材料的一些遭受差的电子电导率并且在一些情况下它们的循环涉及明显的体积改变。这些限制可以分别导致差的功率容量和循环寿命。本发明的发明人已发现，可以将本发明的碳纳米颗粒用作遭受这些挑战的电极材料的载体或包封剂。可以将电池组活性材料负载至碳颗粒中，所述碳颗粒固有地是电子的良好导体，使得活性材料位于内部空腔内、在碳壁之间、在颗粒的外侧上，或这些位置的任意组合。通过与碳颗粒非常紧密地接触，使活性材料的电子电导率挑战最小化。此外，活性材料的包封对其进行约束并且限制由于再循环期间的体积改变的活性材料从电极的移动和随后的损失，导致电池组的改进的循环寿命。可以用于本发明中的电池组活性材料的组成包括遭受差的电子电导率和差的循环寿命的那些材料。这些材料是本领域技术人员公知的并且包括硫和硫衍生物如硫化硒(SeS2)。其它电极活性材料可以包括硫和含硫化合物、硅和含硅混合物、锡和含锡合金和混合物、锑和含锑合金和混合物或这些的任意组合。事实上，本发明包括本领域技术人员已知的本身适合使用的任意材料。
因此，在另外的方面，本发明提供了用于电池组或其它蓄电装置中的材料，其包括负载有一种或多种电极活性材料的上述碳颗粒。
“电极活性电学材料”意指可以接受电荷以达到充电状态并且随后放电而向放电状态移动的材料。
在本发明的该方面的实施方案中，可以将所述材料用作电池组电极材料，用于电池组电极中，或用于电池组电池中，或用于电容器、超级电容器或赝电容器中，或用于电致变色装置中或实际上用于需要使用可以充电和放电的材料的任意应用中。
在本发明的第七、第八或第九方面的一个实施方案中，二氧化硅前体包括原硅酸四乙酯(TEOS)。碳基材料的前体可以包括间苯二酚和甲醛。
在一个实施方案中，通过蚀刻或通过溶解去除二氧化硅或含硅材料。例如，可以通过在HF(5％)水溶液或氢氧化钠(1M)溶液中蚀刻或溶解去除二氧化硅或含硅材料。
在一个实施方案中，本发明提供了用于外部施用至动物或植物的包括杀虫组合物的组合物，所述组合物包括在其中或在其上具有一种或多种疏水性杀虫材料的粗糙的介孔中空纳米颗粒，所述粗糙的介孔中空纳米颗粒包括粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒，所述一种或多种疏水性材料存在于纳米颗粒的中空核中和/或在产生纳米颗粒的表面粗糙度的升起或凸起的区域之间的空间中。
在本发明的范围内可以将本文中所描述的任意特征以与本文中所描述的其它特征的任意一个或多个的任意组合的方式组合。
附图说明
本发明的各种实施方案将会参考以下附图进行描述，其中：
图1显示了如下的示意图：(a)MHCS-RS和(b)MHCS-SS，其中(b)显示了包围内部空腔的多孔壳，R2表示空腔的半径，R1表示壳的表面上的球状凸起的半径并且球状凸起之间的白色区域显示当将颗粒浸入水中时存在空气，将一些疏水特性提供给颗粒。MHCS-RS和MHCS-SS的SEM(c和d)，TEM图(e和f)；
图2显示了(A)袋鼠毛皮，(B)二氧化硅纳米颗粒MHCS-RS，用(C,E)MHCS-SS和(D,F)MHCS-RS处理的袋鼠毛皮(E和F是通过水洗涤的样品)的光学图像(相位对比)；
图3显示了包括纯多杀菌素、纳米多杀菌素-X、二氧化硅纳米颗粒以及多杀菌素与二氧化硅纳米颗粒的物理混合物的一系列样品的FTIR光谱。
图4显示了(黑)纯多杀菌素、(红)纳米多杀菌素-0.4、(蓝)纳米多杀菌素-0.5、(d)纳米多杀菌素-0.6的(A)TGA分布和(B)DSC分布。(B中的粉色为多杀菌素与二氧化硅纳米颗粒的物理混合物的DSC曲线)；
图5显示了包括纯多杀菌素、纳米多杀菌素-X、二氧化硅纳米颗粒以及多杀菌素与二氧化硅纳米颗粒的物理混合物的一系列样品的宽角度XRD图；
图6显示了纯二氧化硅纳米颗粒在(A)低和(B)高放大率下、(C)纯多杀菌素、(D)纳米多杀菌素-0.4、(E)纳米多杀菌素-0.5和(F)纳米多杀菌素-0.6的FE-SEM图像；
图7显示了纯多杀菌素和纳米多杀菌素的时间依赖性释放分布；
图8显示了纯多杀菌素和纳米多杀菌素在UV照射之后的HPLC图；
图9显示了如实施例2中所描述的根据本发明的第三方面的实施方案的单分散的粗糙的二氧化硅中空球的合成程序的示意图；
图10显示了在实施例2中制得的粗糙表面二氧化硅中空球S-1.4、S-1.0和S-1.2的TEM图像(A,B,C)和DLS测量(D)；
图11显示了粗糙表面二氧化硅中空球S-1.4(A)、S-1.0(B)、S-0.6(C)的电子断层摄影层；
图12显示了实施例2中制得的粗糙的二氧化硅中空球的通过BJH吸附分支的孔尺寸分布(B)和N2吸附等温线(A)；
图13显示了光滑的二氧化硅中空球(A)、S-1.4(B)、S-1.0(C)和S-0.6(D)的接触角测试的SEM图像。插入的是其相应颗粒的TEM图像；
图14显示了光滑和粗糙的二氧化硅中空球的溶菌酶吸附能力；
图15显示了纳米颗粒对疏水性和亲水性分子的吸收和释放行为。a)MHS和RMHS在药物和不同的蛋白质上的负载容量，b)DR1的吸收率；将包含颗粒的溶液用超声预处理，然后添加蛋白质或药物用于负载；c)VAN对于400nm颗粒的释放行为，和d)VAN对于200nm颗粒的释放行为。误差条反映了测量的标准偏差。
图16显示了抗菌性能。a)针对RMHS200-VAN、MHS200-VAN和游离VAN培养18h的大肠杆菌的剂量依赖性抗菌活性，使用PBS作为对照。b)在25mg ml-1的VAN剂量至多24h的时间依赖性抗菌研究。c)在PBS中处理的大肠杆菌的TEM图像，d)在VAN中处理的大肠杆菌，e)在MHS200-VAN中处理的大肠杆菌，和f)在RMHS200-VAN中在25mg ml-1的剂量处理18h的大肠杆菌。*表明100％抑制。误差条反映了测量的标准偏差。比例尺条＝500nm(参见实施例3)。
图17显示了根据本发明的第四方面实施方案通过顺序非均相成核机理合成凹入的、内凹的和完整的MHCS的示意图；
图18分别显示了凹入的和完整的MHCS的SEM(A,C)和TEM(B,D)图像。分散于水溶液中的两种MHCS的数字图像(E)显示丁达尔效应和通过DLS测量的颗粒尺寸分布曲线(F)；
图19显示了凹入的MHCS(A)和完整的MHCS(C)的ET切片，凹入的MHCS(B)和完整的MHCS(D)的ET重建。比例尺条为100nm；
图20显示了作为反应时间的函数的纯二氧化硅(曲线I)、纯RF(曲线II)、二氧化硅@RF(曲线III)和二氧化硅@RF@二氧化硅@RF(曲线IV)的颗粒尺寸；
图21显示了具有凹入的内壳和完整的外壳的MHCS。图(A)显示了颗粒相对于XYZ方位的内部结构。倾斜的TEM图像(B和C)。切片(D)在颗粒中心切割YZ平面，而切片(E)和切片(F)分别在如图(A)所指明的位置a和b处切割XY平面。比例尺条为100nm；
图22显示了粘附至大肠杆菌表面上的S-SHS(a)、R-MHCS-B(b)和R-MHCS(c)的SEM图像，和来自ICP-OES的粘附至细菌上的二氧化硅含量的定量分析(d)，如实施例4中所描述；
图23显示了(a)溶菌酶负载量，(b)游离溶菌酶和负载溶菌酶的二氧化硅颗粒在700μg/mL的溶菌酶剂量的时间依赖性抗菌活性，如实施例5中所描述；
图24显示了(a)具有307±18nm的颗粒直径的使用0.15g间苯二酚制得的MSHS-RS颗粒，(b)具有564±20nm的颗粒直径的间苯二酚0.30g颗粒，(c)具有704±25nm的颗粒直径的间苯二酚0.45g颗粒，和(d)具有837±35nm的颗粒直径的间苯二酚0.60g颗粒(由20个颗粒测量的直径)的TEM图像，如实施例8中所描述；和
图25显示了(a)原样制备的碳颗粒和(b)SeS2/碳复合材料的TEM图像(插图：线扫描EDX)和(c)纯SeS2和SeS2/碳复合材料在200mA/g的循环性能。
实施方案描述
在实施例通篇中使用以下缩写词：
MSHS–介孔二氧化硅中空球(具有相对光滑的表面)。
MSHS-RS–具有粗糙表面的介孔二氧化硅中空球。
实施例1
开发具有改进的安全性和性能的纳米农药。
蜱和水牛虻对澳大利亚畜牧业造成超过$4亿/年的经济方面的损失并且目前采用高毒性合成农药进行处理。将要把多杀菌素(具有低环境影响和低毒性的天然来源的农药)负载至二氧化硅中空球中，这将会改进对皮/毛的粘附并且针对UV降解提供保护。纳米多杀菌素农药在田间条件下与常规农药相比将会具有增强的效力和有效持续时间，明显降低有害生物控制的成本。
多杀菌素由Elanco Animal Health提供。具有粗糙表面的介孔二氧化硅中空球(MHCS-RS)和具有光滑表面的介孔二氧化硅中空球(MHCS-SS)由昆士兰大学澳大利亚生物工程和纳米技术研究所的Yu课题组合成。具有毛皮的袋鼠皮样品购自澳大利亚的SkinnyShop作为动物模型。将皮样品通过蒸馏水彻底洗涤并且切割成1cm2的小片，然后测试。全部其它试剂为分析试剂级。
纳米颗粒在动物毛皮上的粘附性质
在作为动物模型的经处理的具有毛皮的袋鼠皮上评价纳米颗粒在动物毛皮上的粘附行为。将二氧化硅纳米颗粒(2mg/cm2)分散在乙醇溶液中并且将溶液均匀地滴在袋鼠皮片(1cm2)的毛皮侧上。然后使皮片在40℃过夜干燥。在用水洗涤几次之前和之后通过共聚焦显微镜(LSM ZEISS710)观察纳米颗粒在毛上的附着。同样在显微镜下观察纯皮样品和二氧化硅纳米颗粒(使用MHCS-RS作为实例)。通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICPOES，Vista-PRO仪器，Varian Inc，澳大利亚)测量和比较在洗涤之前和之后的附着的纳米颗粒的定量的量。在搅拌下将包含纳米颗粒的皮样品在2M NaOH中溶解过夜以使二氧化硅纳米颗粒溶解并且测量硅浓度。还测量没有纳米颗粒的类似尺寸皮的硅的量作为空白。
制备纳米多杀菌素
将旋转蒸发法用于将多杀菌素包封至二氧化硅纳米颗粒中。在所述程序中，将34mg煅烧后的二氧化硅纳米颗粒添加至8、10或12ml在乙醇中的多杀菌素溶液(1.7mg/ml)，其中多杀菌素:二氧化硅进料比分别为0.4:1、0.5:1和0.6:1(下文称为纳米多杀菌素-X，其中X为多杀菌素:二氧化硅的比例)。将混合物移至连接至旋转蒸发仪(BUCHI R-210)的长的圆柱形烧瓶并且在40℃在真空体系中在暗中用175mbar的剩余压力蒸发直至已除去全部溶剂。出于比较的目的，仅采用多杀菌素-乙醇溶液(不存在纳米颗粒)进行类似程序。
表征
使用在0.8-1.5kV运行的JEOL JSM 7800场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)观察在负载多杀菌素之前和之后的二氧化硅纳米颗粒的形态。对于纯二氧化硅纳米颗粒的FE-SEM测量，通过将粉末样品分散在乙醇中制备样品，之后将其滴加至铝箔片并且附着至SEM基座上的导电碳膜。对于纳米多杀菌素的FE-SEM测量，将样品直接附着至在SEM底座上的导电碳膜。采用在200kV运行的JEOL 2100获得二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)图像。对于TEM测量，通过在Cu格栅上的碳膜上分散和干燥粉末样品-乙醇分散体制备样品。在配备有Diamond ATR(衰减全反射)Crystal的ThermoNicolet Nexus 6700FTIR光谱仪上收集傅里叶变换红外(FTIR)光谱。对于每个光谱在400-4000cm-1范围内以4cm-1的分辨率收集32次扫描。在具有Ni过滤的Cu Kα辐射的German Bruker D8X射线衍射仪上记录材料的广角X射线衍射(WA-XRD)图案。将Metter Toledo GC200热重分析(TGA)工作站以2℃min-1的加热速率用于负载量和差示扫描量热法(DSC)研究。
纳米多杀菌素的释放测试
在释放测试中，分别将2.67mg纳米多杀菌素-X(包含1mg多杀菌素)分散于1ml蒸馏水中。将混合物以200rpm保持在25℃培养箱中。在不同的时间收集上清液并且通过使用UV-Vis分光光度计在248nm的波长测量和评价多杀菌素的释放量。还使用相同的程序测试纯多杀菌素在水中的释放量。
纳米多杀菌素的UV稳定性测试
在该测试中，将1.2mg纯多杀菌素和4.2mg纳米多杀菌素-0.4(包含1.2mg多杀菌素)分别添加至两个透明石英容器中。使用石英容器在于使容器对UV光的屏蔽最小化。将每个样品放置在具有365nm波长和17.77mV cm-3功率的UV光下。将全部样品通过UV光辐照2小时。在辐照之后，将多杀菌素及其降解产物通过乙腈(ACN)提取三次并且将最终浓度稀释至0.5mg/ml分散于1ml蒸馏水中。通过高效液相色谱(HPLC)使用ACN作为移动相测试纯多杀菌素和纳米多杀菌素-0.4二者的UV降解条件。
体外生物检测
评价多杀菌素和纳米多杀菌素对牛蜱(微小扇头蜱，Rhipicephalus microplus)的体外效果。在生物安全实验室(Biosecurity Sciences Laboratory，昆士兰政府)使用标准幼虫浸没测试(Larval Immersion Test)使用有机溶剂提取活性物质进行测试。
制备MHCS-RS
如图1a中所示，通过将具有较小尺寸(～30nm直径)的二氧化硅壳颗粒添加至具有相对较大尺寸(～400nm)的MHCS上制备MHCS-RS颗粒。在MHCS-RS颗粒的表面上产生具有R1的半径的小的壳球之间的空隙空间(图1a)用于空气捕集。这些MSHS-RS颗粒中的气穴明显扩大，因为具有R2(R2>>R1)的半径的内部球形空腔与空气通过二氧化硅壳中的介孔连接。空隙空间中捕获的空气对水分子的排斥提供了针对润湿过程的能垒，因为二氧化硅中的羟基倾向于吸收水分子，如在MHCS的情况中那样(如图1b中所示)。因此，所设计的MHCS-RS应当展现出与MHCS相比增加的疏水性，尽管两种材料都具有相同的纯二氧化硅组成。其与具有粗糙表面的实心纳米颗粒相比也是有利的，因为具有粗糙表面的实心纳米颗粒具有较少的气穴(没有具有半径为R2的中空核)和有限的疏水性药物负载容量。在先的研究主要关注于大的平坦表面；具有通过表面粗糙度控制的疏水性质和亲水性组成的纳米颗粒尚未得到报道并且尚未展现出生物应用。使用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)拍摄制备的MHCS-RS的图像(参见图1c、1e)。为了比较，还制备并且表征了具有光滑表面的MHCS，如图1d和1f中所示。两种纳米颗粒都具有均匀和中空的球形形态，其中MSHS-RS的表面均匀地被二氧化硅壳颗粒修饰。根据我们的理论，MHCS-RS纳米颗粒显示出不寻常的疏水性质。通过纳米颗粒在水/乙醚的混合溶剂中分散来直接观察疏水性。MHCS-RS优选在乙醚层(疏水溶剂)的底部静止，而MHCS直接分散在水层中。TGA分布对于MHCS-RS在低于200℃呈现0.9％的小的重量损失和对于MHCS呈现7.2％的重量损失，这可以归因于水分的蒸发，表明引入表面粗糙度使得MHCS-RS更疏水并且因此其比MHCS从大气中吸收更少的水分。
为了提供MHCS-RS与MHCS之间的疏水性的定量比较，使用凝胶捕获技术(GTT)并且其揭示MHCS-RS具有107.5°±10的接触角值，而MHCS为72.5°±5。MHCS-RS的接触角值稍低于十八烷基三甲氧基硅烷改性的二氧化硅获得的值(～136°)。与MHCS相比，MHCS-RS显示出对许多疏水性分子，包括RNase A(RNASE)、胰岛素(INS)、溶菌酶(LYS)、疏水性染料、分散红1(DR1)和疏水性药物、灰黄霉素(GRIS)的始终较高的负载容量。这些结果进一步证实了MSHS-RS纳米颗粒的增强的表面疏水性增加了疏水性分子的负载容量。
为了测试MHCS-RS的粘附性，将动物毛皮用作模型。将具有相同重量的MHCS-RS和MHCS分散在水中并且均匀地施加至两片具有相同尺寸的毛皮。在干燥和用水洗涤三次之后，测量保留在毛皮上的二氧化硅含量。图2A是说明典型的毛结构的袋鼠毛皮的光学图像。在比较中，纯二氧化硅由于其粉末特性而在光学显微镜下显示出白色颗粒(图2B)。在将二氧化硅纳米颗粒施加至毛皮样品上之后，观察到白色颗粒连接在毛的表面上，表明两种二氧化硅纳米颗粒的附着(图2C和2D)。在三次洗涤之后，在MHCS-RS的情况下(图2E)，与MHCS-SS情况下相比(图2F)，更多的白色颗粒附着至袋鼠毛上。该现象表明MHCS-RS具有在动物毛发上更强的粘附能力。该结论也得到ICPOES结果的支持。留在毛皮上的二氧化硅重量百分比对于MHCS和MHCS-RS而言分别为28.5％和51.0％。MHCS-RS由于其粗糙表面和疏水性而显示出明显改进的粘附。MHCS-RS纳米颗粒在毛皮上增强的粘附应当延长多杀菌素-MHCS-RS纳米制剂在田间条件下的有效持续时间。
将旋转蒸发法用于将多杀菌素包封至二氧化硅纳米颗粒中，其中使用具有0.4:1、0.5:1和0.6:1的多杀菌素:二氧化硅比例的多杀菌素-乙醇溶液。纳米多杀菌素复合物被表示为纳米多杀菌素-X，其中X表示多杀菌素与二氧化硅的比例。图3显示了具有在891、987、1041、1099、1213、1263、1371、1456、1660、1707处和在2787-3012cm-1范围内的明显特征峰的纯多杀菌素的FTIR光谱。二氧化硅纳米颗粒的光谱显示可被归属于ν(Si-O)的在810cm-1处的特征峰，和可被归属于-Si-O-Si键的在1050-1200cm-1范围内的宽峰。在全部纳米多杀菌素-X的光谱中，除了与二氧化硅的特征峰重叠以外，仍然可以观察到特征峰1371、1456、1660、1707和在2787-3012cm-1范围内的特征峰。FTIR光谱证实用二氧化硅纳米颗粒成功地包封多杀菌素。
多杀菌素的实际负载量可以通过来自TGA结果(图4A)的重量损失计算。纯多杀菌素在900℃显示出99.9％的完全的重量损失。纯二氧化硅纳米颗粒在煅烧之后显示出来自吸附的水分的微不足道的重量损失(数据未示出)。纳米多杀菌素-X的重量损失对于X＝0.4、0.5和0.6分别为27.4、32.8和38.1％。因此，将纳米多杀菌素-X的负载量(X＝0.4、0.5和0.6)分别计算为28.6、33.3和37.5％，表明旋转蒸发可以实现多杀菌素的完全负载(～100％)。
多杀菌素在包封之前和之后的晶态通过WA-XRD来表征(图5)。纯多杀菌素的WA-XRD图案显示出在5-40°范围内的一系列尖峰，表明纯多杀菌素处于晶态。纯二氧化硅纳米颗粒显示出在～22°居中的宽峰，可以将其归属于无定形二氧化硅。除了无定形二氧化硅的在22°处的宽峰以外，不能在纳米多杀菌素-X的全部样品的WA-XRD图案中观察到尖锐的特征峰，表明在这些样品中没有结晶的多杀菌素。还已通过DSC(图4B)研究纳米多杀菌素-X的结晶行为。纯多杀菌素显示出在129℃处的尖锐吸热峰，其表明结晶多杀菌素的熔点。类似于纯二氧化硅，全部纳米多杀菌素-X不显示出在25-350℃范围内的明显的峰，表明无定形态。在比较中，对于多杀菌素与二氧化硅的物理混合物观察到在129℃处的小的吸热峰(粉色)，表明存在结晶多杀菌素结构。上述结果表明通过使用旋转蒸发技术以纳米分散的形式将多杀菌素包封至MSHS-RS纳米颗粒中。
将FE-SEM用于直接观察纳米多杀菌素的形态(图6)。FE-SEM图像显示二氧化硅纳米颗粒在低放大率下聚结(图6A)和在高放大率下为球形形态(图6B)。如果将纯多杀菌素-乙醇溶液用于旋转蒸发，则形成具有～20μm的尺寸的大的结晶多杀菌素(图6C)。在相同放大率下，全部纳米多杀菌素-X都显示出小颗粒的聚结(图6D-图6F)，其与没有明显晶体的纯二氧化硅是恰好相同的形态。这些现象表明将多杀菌素以不同的进料比例包封在MSHS-RS纳米颗粒的空腔中。
在水中测试纯多杀菌素和纳米多杀菌素二者的释放特性。如图7中所示，对于纳米多杀菌素，在5min的短时间段内释放16％的多杀菌素并且将该水平保持直至540min(通过UV-Vis在248nm处监控在水中的释放)。另一方面，对于纯多杀菌素，在5min释放仅2.4％的多杀菌素，而甚至在540min时累积释放为小于8％。约束在二氧化硅纳米颗粒中的多杀菌素显示出～0.2mg/ml的溶解度，这是纯多杀菌素的溶解度的两倍以上，类似于介孔材料内约束的姜黄素的溶解度增强。因此，与纯多杀菌素相比，改进了多杀菌素的释放行为。预期较高浓度的多杀菌素的快速释放对于开发“即刻起效”的纳米多杀菌素制剂是有益的。
研究了纳米多杀菌素的UV稳定性。将多杀菌素和纳米多杀菌素二者在UV光(波长365nm，17.77mV/cm3)下照射2h，然后是HPLC，将其用于在UV处理之后利用ACN作为提取介质和移动相监控产物。如图8中所示，将在3.5min的停留时间时的峰归属于多杀菌素。在纯多杀菌素组中同样观察到在1.5min的停留时间的另外的峰，可以将其归属于降解的产物。该观察为根据文献报道，表明多杀菌素本身是UV不稳定的。然而，在纳米多杀菌素组中，未观察到降解峰，暗示二氧化硅壳对于负载在纳米空腔内的多杀菌素具有针对UV照射的保护作用。
为了确认负载至二氧化硅纳米颗粒中的多杀菌素仍然有效，我们评价了多杀菌素和纳米多杀菌素对牛蜱(微小扇头蜱，Rhipicephalus microplus)的体外效果。在生物安全实验室(Biosecurity Sciences Laboratory，昆士兰政府)使用标准幼虫浸没测试进行测试。在幼虫浸没测试中，将多杀菌素和纳米多杀菌素二者首先溶于有机溶剂(2％Triton X-100于丙酮中)中，以提取储备溶液的活性物质(10mg/ml)，然后将其在水中稀释。多杀菌素和纳米多杀菌素二者显示出对牛蜱幼虫的剂量依赖性死亡率。进行三次检测以缩小LC范围。在检测3中，多杀菌素分别在24h内对牛蜱幼虫显示出54和196ppm的LC50和LC99值。纳米多杀菌素分别在24h内对牛蜱幼虫显示出46和159ppm的LC50和LC99值。这些结果表明纳米多杀菌素显示出对蜱幼虫模型的相当和稍微更好的毒性。该结果确认在包封之后，负载在二氧化硅纳米颗粒中的多杀菌素仍然有效。
该实施例显示了，MHCS-RS显示出对动物毛皮延长的粘附行为。使用旋转蒸发法，可以将多杀菌素以～100％的负载量负载至这样的中空MSHS-RS纳米颗粒中。负载量可以达到最多28.6-37.5％(wt/wt)，如通过TGA分析测定，而WA-XRD和DSC分析确认，多杀菌素以无定形态分散在MSHS-RS的纳米空腔中。因此，多杀菌素的释放行为与纯多杀菌素相比得以改进。此外，二氧化硅壳对于负载在纳米空腔内的多杀菌素具有针对UV照射的保护作用，因此提供UV屏蔽和不稳定的多杀菌素的保护。已证明纳米多杀菌素在负载在MSHS-RS的空腔中之后对牛蜱幼虫(Rhipicephalus microplus)相对有效。由于多杀菌素-MHCS-RS的增强的水溶性、UV稳定性和毛皮粘附性，预期该纳米制剂在田间条件下具有延长的效力持续时间。
实施例2-形成MSHS-RS
该实施例描述了用于形成MSHS-RS纳米颗粒的本发明第三方面的方法的实施方案
单分散的粗糙的二氧化硅中空球的受控合成程序示意性地描述于图9中。在典型的
Figure BDA0001469173320000271
合成条件下，将间苯二酚(0.15g)和甲醛(0.21mL)添加至具有70mL乙醇、10mL水和3mL氨(28重量％)的pH约11.5的碱性溶液，以在室温以180nm直径在6h聚合之后形成间苯二酚-甲醛(RF)纳米球。这些RF纳米球将会形成将会被最终去除的牺牲颗粒。然后，将某个量的原硅酸四乙酯(TEOS)添加至反应溶液，然后在步骤II中5分钟之后另一次添加间苯二酚和甲醛。由于在步骤II中的二氧化硅与RF沉积速率之间的差异，在预形成的RF核球上形成三层壳。具体而言，因为与RF低聚物相比二氧化硅低聚物的较快的缩合速度，所以首先在预形成的RF球表面上沉积相对致密的二氧化硅层。在经过某段时间之后，当RF低聚物开始聚合，在第一二氧化硅层的表面上开始RF沿着二氧化硅物类的共生，然后是这两种物类的优选垂直的生长。这导致形成“棒状”二氧化硅与RF的混合第二层。随着二氧化硅物类的消耗，剩余的RF低聚物进一步沉积在第二层上，以形成纯RF的最外层。通过将步骤II中添加的TEOS的量从1.4调节至0.6mL，由于降低二氧化硅物类的缩合速率，第一二氧化硅层的厚度降低并且“棒状”二氧化硅之间的距离扩大。应当理解的是，随着仅添加0.6mL的TEOS，第一二氧化硅层并不是连续的，具有一些裂缝存在。这可由在预形成的RF表面上的二氧化硅核心的离散分布产生并且在合并在一起之前缓慢生长以形成相对连续的互连的二氧化硅层。在步骤III中在空气中煅烧之后，去除混合复合物中的RF物类，留下具有粗糙表面的二氧化硅中空球。将最终的二氧化硅产物表示为S-1.4、S-1.0和S-0.6，其中数字表示在步骤II中添加的TEOS体积量。
S-1.4、S-1.0和S-0.6的代表性透射电子显微镜法(TEM)图像示于图10A-10C中。在全部样品中观察到具有粗糙表面的单分散的二氧化硅中空球。将S-1.4、S-1.0和S-0.6的平均颗粒尺寸分别估计为300、280和250nm。三种样品的中空空腔尺寸几乎相同，为约160nm，其相对地小于预形成的RF纳米球的尺寸(180nm)。这可能通过在煅烧期间的收缩引起。壳上的“棒状”粗糙结构可以从TEM图像清晰地识别，并且也可以揭示在壳上的二氧化硅“棒”分布的降低的密度。将动态光散射(DLS)分析进一步用于测定颗粒尺寸和单分散性。如图10D中所示，S-1.4、S-1.0和S-0.6的流体动力学直径分别为约295、310和325nm，其由于包围的水分子而稍大于通过TEM测定的那些。具有小的多分散性指数(PDI)值(对于S-1.4、S-1.0和S-0.6分别为0.053、0.086和0.101)的窄的颗粒分布曲线表明全部二氧化硅中空球具有均匀的颗粒尺寸和优异的单分散性。
如在图10中所示的TEM图像中所示，可以清楚地鉴别“棒状”粗糙结构，然而，难于显露在下方的第一二氧化硅层，尽管二氧化硅壳内出现较高的对比度。为了进一步探索那些粗糙的二氧化硅中空球的精细结构，通过以1°的增加的步进采用+70°至70°的倾斜系列使用电子断层摄影(ET)技术。通过经由IMOD采用10nm Au基准对齐处理倾斜图像获得断层图像。关于粗糙的二氧化硅中空球的中部的断层图像片示于图11A-C中。由TEM图像观察到的二氧化硅壳实际上由两个层组成：一个相对致密的二氧化硅层和另一个具有“棒状”结构的粗糙的层。致密的二氧化硅层的厚度从S-1.4中的41nm降低至S-1.0中的31nm，并且甚至降低至S-0.6中的19nm。降低厚度可以由采用较少量TEOS添加而较缓慢的二氧化硅缩合速率产生。有趣的是，在S-1.4(图11A)和S-1.0(图11B)中的相对致密的二氧化硅壳都是连续的，而没有任何连接中空空腔的孔结构。然而，在S-0.6中的那种显示出分布在该层上的若干具有约1-2nm宽度的裂隙(图11C，黑色箭头)，其提供了小分子进入内部中空空间的输送通道。
为了进一步表征该“棒状”结构及其在中空球表面上的分布，进行定量比较。由于这些粗糙中空球的类似的颗粒尺寸，每个二氧化硅“棒”之间的距离可以间接地代表其分布密度。尽管二氧化硅“棒”之间的间隙几何不同于传统的孔结构，但是其空间可以通过氮气吸附分析及其孔尺寸分布来揭示(参考：Langmuir 1999,15:8714；J.Colloid InterfaceScience,2008,317:442)。如图12A中所示，这些粗糙的二氧化硅中空球的氮气吸附和解吸结果显示IV型等温线(滞后回线在P/P0的0.5-1.0之间)，表明在中空球表面上存在介孔结构。如图12B中所示的通过BJH吸附分支的孔尺寸分布表明每个二氧化硅“棒”之间的距离从S-1.4中的约6.3nm扩大至S-1.0中的7.5nm，和扩大至S-0.6中的9.3nm。随着二氧化硅“棒”之间距离扩大，存在为氮气分子凝聚所提供的更多的空间，其将会最终实现更高的吸附量(参考Langmuir 1999,15:8714)。这与表面积和孔体积随着扩大的间隙距离从S-1.4的133m2/g和0.19cm3/g增加至S-1.0的167m2/g和0.26cm3/g和S-0.6的182m2/g和0.37cm3/g一致。
已通过仿生途径在微米尺度和纳米尺度二者上实现了在各种基质上引入表面粗糙度。表面粗糙度导致增强的疏水性，虽然制成纳米颗粒的二氧化硅通常为亲水的。然而，不能将水滴接触角结果的传统表征途径容易地与单独的颗粒的接触角相关(特别是在纳米尺度上)。因此，已开发了凝胶捕获技术(GTT)，其基于单独的纳米颗粒在油-水表面上的成比例的捕集[参考：Langmuir,2004,20:9594]。通过在油-水表面上铺展颗粒和随后的水相的胶凝，然后将水相上捕获的纳米颗粒用聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)弹性体复制并且提起，这允许部分包埋在PDMS表面中的颗粒用SEM成像[参考：Langmuir 2003,19:7970]。该方法允许定量比较具有不同表面粗糙度的单独纳米颗粒的表面疏水性以关联粗糙结构的间隙距离与其疏水性。为了证明通过粗糙表面增强的表面疏水性，选择光滑的二氧化硅中空球(图5A，插入)作为对照，其具有60nm的相对致密的二氧化硅壳厚度并且没有在壳上的明显的介孔。如图5中所示，光滑的颗粒显示仅61°的接触角，而采用出现在表面上的粗糙结构，接触角增加至S-1.4的73°和S-1.0的86°。采用甚至更大的间隙距离，接触角可以达到102°，表明通过引入粗糙度配备有疏水性表面的亲水性二氧化硅材料，并且随着扩大二氧化硅“棒”之间的距离增加了颗粒的表面疏水性。
为了显示粗糙表面中空二氧化硅球用于疏水性材料的占据的有用性，将粗糙的二氧化硅中空球用于溶菌酶吸附。为了比较，将光滑的二氧化硅中空球用作对照组，其仅实现82μg/mg。对于粗糙的二氧化硅中空球，在图6中观察到溶菌酶吸附的明显增强，其中S-1.4和S-1.0的容量分别增加至358和408μg/mg。特别是对于S-0.6，吸附容量甚至可以达到高至641μg/mg。增加吸附容量应当归因于较大的间隙距离、升高孔体积和通过引入表面粗糙度而增强的表面疏水性以及由球的可到达的中空中心核提供的体积。
实施例3–用于生物体系中的递送体系
在生物体系中，通常认为疏水性相互作用是所有长程非共价相互作用中最强的。疏水性相互作用有益于生物分子的吸附，改进与细胞膜的相互作用增加细胞递送的纳米颗粒的摄取以及调制药物的释放速率。为了产生具有疏水性质的纳米颗粒，选择疏水性组合物或官能化是便利的途径之一。疏水性材料如碳纳米管(CNT)已显示出有很大希望作为用于药物递送的纳米尺度媒介物，然而主要关注之一在于这样的事实：CNT可能对环境和人类健康有危险，其需要进一步表面官能化以降低它们的固有毒性。已将疏水性结构部分如烷烃硫醇和烷基链改性至各种纳米颗粒(包括金和二氧化硅)的表面以增强疏水性药物/蛋白质的负载和改进细胞递送性能。然而，化学接枝的疏水性基团倾向于导致纳米载体的不希望的孔堵塞和毒性。因此，设计使用替代途径的安全和有效的纳米载体体系成为挑战。
在该实施例中，通过将具有较小尺寸(～13或30nm直径)的二氧化硅壳颗粒添加至具有相对较大尺寸(～200或400nm)的介孔中空二氧化硅球(MHS)上实现表面粗糙度设计。表面粗糙化产生用于空气捕集的在外表面上的空隙(具有R1半径的小壳球之间的空间)。在该设计中，气穴明显扩大，因为具有R2(R2>>R1)的半径的内部球形空腔与空气通过二氧化硅壳中的介孔连接。空隙空间中捕获的空气对水分子的排斥提供了针对润湿过程的能垒，因为二氧化硅中的羟基倾向于吸收水分子，如在介孔中空二氧化硅(MHS)的情况中那样。与粗糙的实心
Figure BDA0001469173320000311
(RSS)二氧化硅纳米颗粒相比，粗糙介孔中空二氧化硅球(RMHS)提供更多的空间以捕获空气，导致在润湿过程期间的较高的能垒和因此更显著的疏水性。RMHS的亲水性组合物的特性提供了“最后手段”抗生素万古霉素(VAN)的高负载容量，同时疏水性质促进VAN的控制释放和对细菌的粘附性，导致与游离VAN和MHS-VAN相比增强的抗菌效力。
使用表面活性剂引导的碱性蚀刻策略合成MHS纳米颗粒。通过混合在氨基官能化之后带正电的MHS与带负电的
Figure BDA0001469173320000312
二氧化硅纳米颗粒(直径～40nm)，然后煅烧制备RMHS。扫描电子显微镜(SEM)和高分辨率透射电子显微镜法(HRTEM)图像显示，已成功地制备具有均匀的球状形态的平均尺寸为450nm的RMHS(图14a、14c)。RMHS的表面被40nm二氧化硅纳米球均匀地修饰，表明将二氧化硅纳米球成功附着至MHS的表面。相反地，MHS(图2b、2d)具有350nm的平均颗粒尺寸。HRTEM图像(图14c、14d)清楚地表明RMHS和MHS的中空核@多孔壳结构。中空核的直径为～230nm并且多孔壳的厚度为约60nm。SEM图像对于MHS和RMHS二者显示具有单分散形态的纳米颗粒的中空核。通过动态光散射(DLS)进一步测量MHS和RMHS的流体力学尺寸，其显示MHS的396nm的尺寸和RMHS的459nm的尺寸，与SEM和TEM结果二者一致。两个相邻的二氧化硅纳米球之间的距离经测量为大约30nm并且它们之间的间隔提供用于空气捕集的空间。
MHS和RMHS二者显示出具有H2型滞后回线的典型IV型等温线，表明存在良好限定的介孔。使用Barrett–Joyner–Halenda(BJH)法由吸附分支计算的孔尺寸分布显示两个样品具有在3.5nm居中的均匀的介孔。RMHS具有与MHS相比相对更低的表面积(342比427m2g-1)，因为壳颗粒是实心的。RMHS的较高的孔体积(0.46比MHS的0.31cm3g-1)主要归因于颗粒间填充空隙，如通过在高于0.95的相对压力(P/P0)发生的毛细凝结步骤所反映。通过ζ电势的表面电荷测量显示RMHS和MHS二者带负电至相似程度。两个样品在组成方面都具有纯二氧化硅，如通过傅里叶变换红外光谱法(FTIR)确认，显示在1620cm-1处的物理吸附的水(-OH)，在790cm-1处的硅醇基团(Si-OH)以及在1062和449cm-1处的硅氧烷基团(Si-O-Si)的特征峰。
通过在水/乙醚的混合溶剂中分散MHS和RMHS观察纳米颗粒的疏水性。RMHS优选静止在乙醚层(疏水性溶剂)的底部处，而MHS直接分散在水层(亲水性溶剂)中，甚至没有轻轻摇晃。RSS也显示与RMHS在水/乙醚层中的类似的行为。这是由于Si-OH对水分子的亲和力和空隙空间中捕获的空气对油和水分子二者的排斥之间的竞争而发生的(如图1中所呈现)。热重分析(TGA)分布对于RMHS呈现低于200℃的0.9％的小的重量损失，而对于MHS为7.2％，这可以归因于水分的蒸发。TGA结果表明引入表面粗糙度使RMHS更疏水并且因此其比MHS从大气中吸收更少的水分。
还将染料(玫瑰红，RB)吸附法用于定量测定纳米颗粒的相对疏水性。为RMHS、MHS和RSS构造分割商(PQ)相对每毫升纳米颗粒表面积的绘图。该绘图的斜率与纳米颗粒的相对疏水性成比例。与具有0.000675×10-9mLμm-2的斜率的RSS相比，RMHS产生0.00106×10- 9mLμm-2的更高的斜率值，表明RMHS相比于RSS更高的疏水性。MHS在另一方面显示出不具有明显的值的最低的斜率，暗示亲水性特性。
将RMHS和MHS用于三种疏水性蛋白质(包括RNase A(RNASE)、胰岛素(INS)和溶菌酶(LYS))、疏水性染料、分散红1(DR1)和疏水性药物灰黄霉素(GRIS)的吸附中。如图15a中所示，排他性地对于五种吸着物由RMHS实现了比MHS更高的负载容量。与MHS相比，在将RMHS与MHS比较时还观察到DR1(图15b)和LYS的更快的吸附速率。这些结果表明纳米颗粒的增强的表面疏水性有助于疏水性分子的更高和更快的负载。RSS对LYS的负载容量也被测量为25.9mg g-1。与RMHS的LYS负载量(263.1mg/g)相比，RSS的低得多的LYS负载量可以归因于其固体特性。
为了进一步理解诱导RMHS疏水性的空气的作用，RMHS对LYS的吸附能力在溶液中在真空条件下去除空气泡之后进行。发现LYS在RMHS上的吸附量降低37.3％(从263.1mg g-1到172.1mg g-1)，与MHS的吸附容量(161.5mg g-1)相当。通过消除预超声方法以保持最多的被纳米颗粒捕获的空气而进行另外的实验。通过没有超声的RMHS以与使用经受图15a中的预超声步骤的RHMS的吸附相比27.5％增量来实现LYS的更高的负载。这些结果确认空气作为疏水性溶剂对RMHS结构的作用，其随后改进了蛋白质的吸附。相反地，表面粗糙度对亲水性分子VAN的负载容量没有影响，如图4c中所示。对于MHS和RMHS二者利用该疏水性分子实现了类似的负载值。然而，RMHS的疏水性质使得VAN的缓释行为能够达到最多大于36h，相比之下MHS在8h时100％释放(图15c)。
可以采用相同的制备方法进一步精细调节具有类似形态的核纳米颗粒的尺寸。本发明人已成功地制备了具有200nm的平均核尺寸和13nm壳颗粒尺寸的MHS和RMHS，称为MHS200和RMHS200。两种纳米颗粒具有与较大的颗粒(MHS和RMHS)相比类似的表面形态，如通过TEM和SEM图像所示。MHS200和RMHS200与更大尺寸的颗粒相比具有稍小的孔尺寸(3.4nm)和相对更高的孔体积(MHS200为0.38cm3g-1和RMHS200为0.62cm3g-1)。
使用纳米颗粒作为抗生素的递送媒介物通过延长的药物循环半衰期、与膜分子相互作用而增加的药物的可用性和经促进的持续药物释放提供了有前景的策略。VAN是可用于治疗许多细菌感染的抗生素，因为其在敏感细菌中抑制细胞壁合成。为了说明通过经表面设计的材料递送的VAN的抗菌效力，将经药物负载的纳米颗粒与大肠杆菌(Escherichiacoli(E.coli))一起温育。在该研究中选择具有200nm尺寸的纳米颗粒(MHS200和RMHS200)，因为筛选测试显示与较大的颗粒(～400nm)相比，较小的颗粒显示出较高的细菌毒性作用。通过监控细菌悬液在600nm处的光密度(OD)评价VAN、MHS200-VAN和RMHS200-VAN的体外抗菌活性。将大肠杆菌(1×106CFU mL-1)在1.5ml离心管中的Luria-Bertani(LB)介质中以各种VAN浓度温育18h。在25μg mL-1观察游离VAN对大肠杆菌的最小抑制浓度(MIC)值(图16a)。该值对于RMHS200-VAN降低至20μg ml-1，其低于在18h在体外大肠杆菌培养中与VAN缀合使用的MCM-41的剂量(200μg ml-1)。在单独的实验中，将具有25μg ml-1的相同VAN含量的MHS200-VAN、RMHS200-VAN和游离VAN与1×106CFU mL-1大肠杆菌在LB介质中温育并且作为时间的函数测量OD。已观察到RMHS200-VAN在整个24h内保持100％抑制。然而，在18h之后在MHS200-VAN和游离VAN组中观察到通过OD方面的增加证明的细菌的重新生长(图16b)。
已报道如果不足地抑制的细菌合成新的肽基葡聚糖(peptidyglocan)而推翻VAN的抗菌作用，则可能发生暴露至VAN的细菌的再次生长。在RMHS200-VAN的情况下甚至在24h的大肠杆菌的100％抑制应当归因于来自纳米颗粒设计的两个有利之处：1)粗糙表面颗粒具有与它们的光滑配对物相比更高的效力；和(2)RMHS200的疏水性特性，其导致与MHS200相比的VAN的缓释(图16d)，类似于较大尺寸的纳米颗粒(图16c)。最终增加了药物的有效时间窗口。
为了提供纳米颗粒的抗菌效力的直接证据，将TEM用于在24h时观察培养的大肠杆菌的形态(图16(c-f))。对于未处理的组(图16c)，大肠杆菌的典型圆柱形形态保持完整。与未处理的组相比，经VAN处理的细菌显示出细菌膜的破坏(图16d-f)。对于MHS200-VAN，在细菌膜中发现MHS200(图16e)并且清楚地观察到大肠杆菌的壁/膜的严重破坏(图16f)。还通过MTT检测评价了MHS200和RMHS200对正常的人真皮成纤维细胞(HDF)的细胞毒性。两种纳米颗粒甚至在高至500μg/mL的浓度也没有观察到明显的细胞毒性，提供了优异的生物惰性和作为载体体系的材料的安全性的证据。
结论是，该实施例显示了本发明人已成功地制备了新颖的纳米颗粒，其具有亲水性二氧化硅组成，但是通过表面粗糙度改性而具有疏水性质，其与它们的具有光滑表面的配对物相比显示出较高的疏水性分子负载容量和对亲水性药物缓释。从该研究获得的基本理解提供了用于开发在广泛的药物递送应用中具有安全的组成和高性能的纳米载体的新策略。
实施例4–制备含碳的纳米颗粒
在该实施例中报道了新的顺序异质成核(SHN)途径以在不存在结构导向剂下制备具有可控制的介观结构和形态的自组织胶体碳纳米颗粒。SHN概念示意性说明于图17中。在具有NH3·H2O作为催化剂的乙醇/水体系中，简单地使用原硅酸四乙酯(TEOS)、间苯二酚和甲醛(RF)作为前体进行合成。在步骤I中，当将TEOS和RF前体混合在一起时，由于与RF体系相比相对更快的缩合速率，通过均质成核过程形成
Figure BDA0001469173320000351
球。一旦形成二氧化硅球，则RF前体优选在二氧化硅表面上通过异质成核缩合。为了调节壁结构，在步骤II中再次引入TEOS，其在RF壳表面上通过随后的异质成核过程形成均匀分布的二氧化硅纳米颗粒。残留的RF低聚物在二氧化硅纳米颗粒顶部上进一步缩合以产生第二RF层。在惰性气氛下采用或不采用水热处理进行碳化(步骤III)，然后去除二氧化硅(步骤IV)之后，获得具有双层结构的介观结构的中空碳球(MHCS)。通过控制碳/二氧化硅壳的厚度，可以精细地调整双层形态(凹入的、内凹的或完整的球)和介孔尺寸。
由在图18(A,C)中呈现的扫描电子显微镜法(SEM)图像，不采用步骤III中的水热处理制备的MHCS显示出凹入的球状形态，非常像放气的气球，其中球的一侧变得向另一侧包裹。凹入的MHCS的透射电子显微镜法(TEM)图像显示了清楚的双层和中空的内部结构(图18B)。当采用水热处理制备MHCS时获得完整的球状形态，如通过SEM图像(图18C)所示。对这些颗粒的TEM观察还显示了双层同中心球形结构(图18D)。
凹入和完整的MHCS分别显示出250和270nm的均匀外径。此外，两种颗粒良好地分散于水溶液中并且产生对于单分散的胶体悬浮液通常观察到的特征性丁达尔效应(图18E)。动态光散射(DLS)测量分别揭示了对于凹入的和完整的MHCS的265和295nm的水合的颗粒尺寸(图18F)。两个样品的窄的颗粒分布和低的多分散性指数(0.1的PDI)表明两种MHCS具有高度均匀的颗粒尺寸和优异的水可分散性。高分辨率SEM图像揭示了凹入的MHCS的具有开孔入口的高度多孔的粗糙外表面。完整的MHCS在另一方面显示出相对光滑和连续的表面形态。
对于具有复杂内部结构的三维(3D)纳米物体如MHCS，通过常规TEM研究可能提供令人误解的信息。这是因为TEM图像提供在某个厚度上的集体的结构信息并且将其融合至2D投影中。例如，内层与外层之间的精细结构并不清楚。此外，看起来示于图18B中的两个球(由箭头指示)并不是凹入的，尽管该效果可以由通过垂直于凹入的平面的电子束产生。电子断层摄影(ET)是用于复杂结构的高级3D成像的快速发展的技术，其允许使用由一系列2D切片建造的3D模型虚拟重建材料的内部结构(19,20)。
我们使用了ET技术来研究MHCS的详细结构。在+70至-70°范围内以1°的增量拍摄一系列倾斜的图像。使用该技术，可以清楚地观察凹入的MHCS颗粒明显从凹入的改变至完整的球形结构。这突出了通过单独的常规TEM提供的数据的模糊性并且确认了ET表征对于具有复杂和不对称架构的材料的重要性。为了观察MHCS的详细内部结构，使用IMOD软件由两个垂直的倾斜系列产生电子断层图像(21)。垂直于MHCS的研究面切割的ET切片(图19A)显示出清楚的双层新月状形态。内层和外层通过大约1-2nm厚度的薄的碳桥连接(由黑色箭头标明)。相反地，完整的MHCS的倾斜系列揭示了贯穿旋转的完整的球形形态(数据未示出)。图19C中的ET切片显示了完整的MHCS的满月状形态，其中两个同中心的层通过具有大约4-5nm厚度的更实质性的碳桥连接。
凹入的和完整的样品还在厚度和内壳和外壳的连续性程度方面明显不同。凹入的和完整的样品的外层显得相对连续，分别具有6和12nm的平均厚度，然而凹入的结构的内层显示了许多缺陷和中断，这形成了在与完整的结构相比时更易碎和不连续的内壳。两个层之间的空隙空间的平均尺寸对于凹入的和完整的MHCS而言从内壳向外壳径向测量分别为大约15和20nm。具有橙色的内壳和黄色的外壳的两个MHCS的数字重建的结构分别示于图19B和19D中。对于凹入的MHCS可以观察内壳和外壳二者的凹入，而对于完整的MHCS可见球形形态，这与来自TEM和SEM的形态学观察一致。此外，对于凹入的和完整的MHCS二者，也可以观察到连接内壳和外壳的碳桥。
凹入的和完整的MHCS二者的氮气吸附研究显示了IV型吸附等温线。由吸附分支计算的BJH孔尺寸分别表明凹入的和完整的MHCS的15.9和18.0nm的孔尺寸。这些孔尺寸与在ET和TEM显微照片中观察到的内壳与外壳之间的测量的层间距离密切对应，暗示该经约束的层间空间对BJH孔尺寸分布负责。凹入的MHCS的BET表面积和孔体积(分别为1032m2g-1和2.11cm3g-1)稍微高于对于完整的MHCS获得的那些(分别为880m2g-1和1.44cm3g-1)，这可以归因于更坚固构造的完整的MHCS的较薄的壳和因此的体积比表面比例方面的增加。X射线光电子光谱(XPS)显示了仅检测到来自C1(～285eV)和O1(～534eV)的峰，揭示凹入的和完整的MHCS二者的主要组分都是碳和氧(22)。碳和氧的质量百分比经计算分别为92.9％和7.1％。X射线衍射(XRD)图案揭示MHCS的无定形特性。
为了理解MHCS的形成机理，我们系统性研究了作为时间的函数的二氧化硅-RF颗粒的成核和生长过程。因为TEOS和RF二者可以在相同条件下独立地聚合以形成均匀的实心颗粒(图20，曲线I和II)，所以首先研究它们的单独的反应动力学。在所利用的合成条件下，TEOS的聚合导致在15分钟内形成二氧化硅颗粒(m)，与在
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球形成中通常观察到的典型诱导期一致(23)。然后这些球在尺寸方面增加最多2h，这之后颗粒尺寸相对一致。在相同条件下的RF聚合在另一方面形成具有缓慢生长的球。在1h时可观察到一些不规则的RF聚合物成核物的形成，其通过2h连续发展成球形颗粒。RF球在尺寸方面的增加在2至6h相对快，之后是较慢的生长范围直至12h。由曲线II可以推断，游离的RF低聚物在12h时存留在合成体系中。
当同时添加TEOS和RF时，图20曲线III揭示了颗粒尺寸一开始(至多1h)遵循与仅形成二氧化硅颗粒的纯二氧化硅体系相同的趋势。在2h之后，颗粒尺寸逐渐增加至在12h时的250nm，形成具有作为时间的函数增加的RF壳厚度的二氧化硅@RF核壳结构。不能发现碳化/二氧化硅蚀刻之后的实心RF球或实心碳球的证据，表明RF聚合体系在二氧化硅核的表面上已从均质成核改变至异质成核，与在表面上的异质成核的自由能垒与均质成核相比低得多的经典成核理论一致。然而，该途径导致仅具有微孔壁的中空碳球，其对最终产物的形态和介观结构很少进行控制并且因此具有有限的应用。
当在步骤II中以仔细选择的6h时间点引入TEOS时，在接下来的2h内将TEM用于监控结构演变。由在空气中煅烧之后的样品的TEM图像可以看出，二氧化硅核心的次级群体在第二TEOS添加之后的15m内出现在二氧化硅@RF颗粒的表面上。次级二氧化硅纳米颗粒在尺寸方面从在15m的～5nm增加直至在30m的～10nm，然后融合在一起以在2h时形成具有18nm径向厚度的相对连续的互连的二氧化硅壳。在第二TEOS添加之后，相对于示于曲线III中的二氧化硅@RF颗粒，颗粒尺寸稳定地增加(图20，曲线IV)，在生长12h之后在直径方面达到了另外的30nm。TEM数据确认在最终产物中不存在任何实心二氧化硅纳米颗粒。上述观察表明在步骤I中形成的二氧化硅@RF颗粒的RF层引发了TEOS的随后的异质成核。由于RF体系的较慢的聚合行为，剩余的RF前体优选在二氧化硅表面上成核。两个可聚合体系的顺序异质成核和它们的相互作用产生了相互渗透的二氧化硅-RF复合壳结构。在碳化之后去除核和壳中的二氧化硅导致MHCS的最终结构。
MHCS的精细结构的ET结果与SHN机理一致。两个碳层之间的桥来自RF与次级二氧化硅纳米颗粒的共生。水热处理有助于RF体系的进一步缩合，导致较厚的双层以及桥并且最终导致完整的MHCS。在步骤III中不使用水热处理时，由于较薄的RF层和桥形成具有暴露的多孔表面的凹入的MHCS。
SHN机理可以在另外的成核循环内再次发生。作为证明，将第三次添加二氧化硅和RF前体引入体系。产生的三层MHCS结构与异质成核的另一循环一致。所添加的TEOS在RF表面上异质成核，形成另外的二氧化硅纳米颗粒群体，然后是在二氧化硅上的RF的异质成核和生长。将在相同聚合条件下的SHN途径用于多次循环提供了具有上等的结构的纳米材料的设计的范围。
在步骤II中明智地选择添加TEOS的时间点可以确定最终结构的形式。当较早添加TEOS(在3h时间点而不是6h)时，对于凹入的和完整的碳颗粒二者没有观察到明显的双层结构。反而，结构显示出单层介孔碳壳。当在24h添加TEOS时，仅获得具有15nm厚度的中空微孔碳结构。这些结果证明仔细地控制聚合动力学和依次精心地调整TEOS和RF前体的成核过程能够形成双层MHCS。
为了研究影响中空颗粒的凹入的参数，我们制备了一系列具有受控的壁厚度的单层中空碳球。经由6至36h的在搅拌时间方面的增加将壁厚度控制在5至16nm(方案中的步骤I)。结果清楚地证明当单层中空碳球的厚度薄至5nm时，大多数颗粒显示了凹入的形态。随着厚度增加至8nm，仅可以观察到少量凹入的球，而增加至13nm仅生成完整的球。该研究证明了碳层的厚度在控制最终产物的凹入的或完整的形态的方面具有关键作用。
通过将步骤II中添加的TEOS的量从0.5增加至2.5ml而将壳之间的距离从7调节至27nm。没有水热处理制备的全部样品显示出凹入的形态，而采用水热处理的样品显示出完整的球形形态。由N2吸附计算的样品的孔尺寸、BET表面积和孔体积与从TEM测量获得的结果一致。一般性倾向是没有水热处理的样品显示出比采用水热处理的那些高得多的表面积和孔体积，与我们之前观察的一致。此外，壳之间的距离越大，观察到的表面积和孔体积越高。这可以归因于具有大层间间隔的样品中的扩大的介孔层间区域。对应的二氧化硅模板显示了随着添加的TEOS量的增加而二氧化硅壳的增加的尺寸和连续性。
值得注意的是，当层间间隔扩大至27nm时并且在水热处理之后，获得具有内层凹入而外层保持完整的前所未有的结构(所谓的内凹的结构)(图21A)。图20B和20C分别显示了沿着x轴和z轴(平行和垂直于内凹的平面)记录的两个TEM图像。图21D中所示的ET切片揭示了正好在内凹的结构中间分别沿着yz平面的内层和外层的横截的新月和球形形态。在如图21A中指明的a和b的z高度处沿着xy平面分别给出两个另外的ET切片(图21E和21F)，因此显示了两个同中心的环和三个同中心的环。可以观察到一些碳桥将最外侧的环连接至中间的环(图21E和21F)。然而中间的环不具有可观察的连接最内侧的环的桥，表明最初来自内球的这些两个表面并未融合。使用除ET以外的常规的表征技术将不可能获得这些不同的结构特征。
内壳的凹入可以归因于在步骤II期间形成厚的和连续的二氧化硅层，这限制了RF的相互渗透并且因此降低了碳桥的厚度和密度。还要注意的是，外球的壳厚度比凹入的内球的壳厚度更厚(图21D-21F)，这归因于水热处理。随着来自外壳与内壳之间的桥的降低的支持，具有更薄的壁的更易碎的内球从更厚的完整的外壳部分地分离和崩塌，形成独特的内凹的MHCS。
我们进一步测试了MHCS用于溶菌酶吸附的应用。对于凹入的和完整的颗粒二者，在10分钟内可以实现大约75％的饱和吸附，暗示对溶菌酶的快速吸附动力学。在凹入的颗粒上的溶菌酶的最大吸附量在6h之后为大约1250μg mg-1，显示与先前的报道相比对溶菌酶的最高的吸附能力。快的吸附速率和高吸附能力应当归因于凹入的MHCS的大的入口尺寸、高表面积和疏水性。
该实施例证明了经由顺序异质成核途径通过两个可聚合体系的自组织已设计了具有前所未有的结构(凹入的、内凹的和完整的双层形态)的胶体碳颗粒。该SNH机理定义了重复出现的异质成核循环，通过所述循环可以使纳米结构的相互渗透性复合物自组织并且可以精确调节胶体碳纳米颗粒的结构、形态。
实施例4：证明对细菌细胞壁的增强的粘附性
使用大肠杆菌(典型的革兰氏阴性菌)并且将其在LuriaBroth(LB)介质中与二氧化硅中空球(浓度为100μg·mL-1)温育。比较MSHS-SS和MSHS-RS颗粒的颗粒-细菌粘附性，以在细菌固定和染色之后通过使用电子显微镜法直接观察证明粗糙二氧化硅表面的效果。如图22a中所示，大肠杆菌显示出完整的棒状形态，其中与MSHS-RS-B(图22b)和MSHS-RS颗粒(图22c)相比，更少的MSHS-SS颗粒粘附至细菌表面。要注意，一些MSHS-RS颗粒部分地陷于细菌细胞壁中，在分离时在细菌表面上留下半球形凹痕(图22c，由黑色箭头标识)。陷入过程典型地涉及有吸引力的细胞膜-颗粒相互作用的强度、MSHS-RS颗粒与细菌细胞壁之间的增强的粘附性的指示。相反地，MSHS-SS颗粒的光滑表面提供了有限的用于界面相互作用的接触面积，导致更少的粘附至细菌表面上的颗粒。此外，带负电的二氧化硅纳米颗粒和细菌表面二者之间的静电排斥也阻碍了它们的相互作用。有利的是通过胺改性增强二氧化硅纳米颗粒对细菌的静电吸引。然而，通过胺基团引起的不希望的毒性仍然受到关注。在此，通过设计表面粗糙度，MSHS-RS颗粒显示出增强的细菌粘附性质，这可以归因于由它们的表面尖状物在与多毛的细菌表面接触时引起的多价相互作用，经由大量接触导致强的粘附性。
为了定量分析粘附在细菌表面上的二氧化硅量，将与二氧化硅颗粒培养的细菌通过450nm孔过滤膜过滤。应用大量洗涤以去除溶液中的单独的颗粒。还将不含细菌的样品作为对照进行分析和消除聚结的二氧化硅颗粒的干扰。ICP结果(图22d)显示小于0.1pg的MSHS-SS颗粒粘附在每个细菌细胞表面上，而0.36pg的MSHS-RS-B和0.48pg的MSHS-RS颗粒保留在每个细菌上。
实施例5：具有溶菌酶的制剂
为了证明具有抗菌剂的二氧化硅颗粒的递送效率，将溶菌酶固定在这些二氧化硅中空球中。如图23a中所示，由于为溶菌酶吸附提供有限的外表面，MSHS-SS颗粒显示了仅61μg·mg-1(μg溶菌酶/mg二氧化硅)的最低的负载容量。相反地，MSHS-RS颗粒显示出270μg·mg-1的最高的负载容量，这是通过MSHS-RS-B颗粒实现的负载容量(135μg·mg-1)的两倍。这归因于介孔体积从0.117cm3·g-1(MSHS-RS-B)增加至0.229cm3·g-1(MSHS-RS)。在10mM磷酸盐缓冲溶液(PBS)中表征在溶菌酶负载之前和之后的二氧化硅中空球的表面ζ电势。在溶菌酶负载之后，MSHS-SS颗粒的ζ电势从-29mV显著改变至-3mV，表明带正电的溶菌酶吸附在外表面上。然而，对于MSHS-RS-B和MSHS-RS颗粒，它们的表面电荷从-19mV和-18mV分别改变至-8mV和-6mV。这暗示典型地将溶菌酶分子固定至MSHS-RS-B和MSHS-RS颗粒的介孔中，导致表面电荷的有限中和。
实施例6：溶菌酶释放
在具有在PBS中的固定初始溶菌酶浓度(270μg·mL-1)的条件下检验来自二氧化硅颗粒的溶菌酶释放行为。MSHS-SS颗粒显示出在18h内具有大于85％释放的溶菌酶的推动的释放。与这些光滑的颗粒相比，MSHS-RS-B颗粒显示了在24h后具有大约75％的释放的溶菌酶的相对缓慢的释放速率。MSHS-RS颗粒显示出三种颗粒中最缓慢的释放特性，其中在72h仅74％的溶菌酶释放。然而，具有相对大的孔尺寸的MSHS-RS应该具有快速释放特性。蛋白质分子从MSHS-RS的延迟的释放可以从由表面粗糙度和可到达的内部空腔引起的增强的表面疏水性产生。
实施例7：配制的溶菌酶的抗菌活性
通过光密度(OD)测量比较游离溶菌酶和使用上述程序配制的负载溶菌酶的二氧化硅颗粒的体外抗菌活性。将大肠杆菌(5×106CFU·mL-1)与各种浓度的溶菌酶和相应的负载溶菌酶的二氧化硅颗粒一起温育24h。观察全部样品的剂量依赖性抗菌性能，其中较高的浓度/负载的溶菌酶导致较大的抗菌活性。配制到二氧化硅颗粒中的溶菌酶在相同的溶菌酶浓度时显示出与游离溶菌酶相比更高的活性，并且该效果在高于500μg·mL-1的溶菌酶浓度时更明显。粗糙的二氧化硅颗粒相对于游离溶菌酶和MSHS-SS颗粒，特别是MSHS-RS颗粒显示出对大肠杆菌的增强的抗菌活性，后者显示700μg·mL-1的最小抑制浓度(MIC)值。相反地，甚至在高达2mg·mL-1的浓度也不能达到游离溶菌酶对大肠杆菌的MIC。
为了进一步证明二氧化硅颗粒作为溶菌酶载体的有利之处，在分批培养下经由细菌动力学测试来测试长期细菌抑制。在700μg·mL-1的溶菌酶浓度监控时间依赖性细菌生长3天(图2b)。在3天处理之后将LB-琼脂板检测用于检验细菌生存能力。观察到MSHS-RS颗粒在贯穿三天的测试中保持100％细菌抑制。该三天抑制结果与在80μg·mL-1的负载银的二氧化硅纳米颗粒的性能相当，如通过细菌动力学检测所证明。相反地，对于MSHS-SS、MSHS-RS-B和游离溶菌酶制剂观察到通过OD值增加所证实的时间依赖性细菌生长。在琼脂板上对于用负载溶菌酶的MSHS-RS颗粒处理的细菌不能观察到有活力的菌落，显示了二氧化硅颗粒与其它产品相反的强杀菌活性。长期细菌抑制性质应当归因于由二氧化硅颗粒的设计所提供的两个有利之处：1)由于表面粗糙度成为可能的对细菌表面的增强的粘附，其产生溶菌酶的有效的靶向递送和在细菌表面上的溶菌酶的富集的局部浓度，和2)通过溶菌酶从MSHS-RS颗粒缓释实现的延长的抗菌活性。然而，由于相对弱的颗粒-细菌相互作用和快速溶菌酶释放，MSHS-SS和MSHS-RS-B不能用向细菌表面有效递送的不充足的溶菌酶浓度控制细菌生长。
实施例8：具有伊维菌素的颗粒的制剂
使用旋转蒸发将伊维菌素负载至用疏水性十八烷基结构部分官能化以使表面更疏水的MSHS-RS、MSHS-SS和MSHS-RS颗粒中。热重分析(TGA)显示了二氧化硅颗粒中的伊维菌素负载水平为大约23重量％，其与伊维菌素比二氧化硅纳米颗粒的进料比(1:3)一致。
为了研究二氧化硅颗粒对伊维菌素的UV保护性质，将这些纳米制剂以及纯(游离)伊维菌素在UV照射下处理3h。使用高效液相色谱法(HPLC)分析在UV照射之前和之后的样品以鉴定它们的组成。游离伊维菌素在3h的照射之后完全降解。负载至MSHS-SS颗粒中的伊维菌素显示了伊维菌素的明显降解。这可能由伊维菌素仅部分负载至MSHS-SS颗粒的内部空腔的事实导致，这导致仅部分保护。相反地，使用MSHS-RS颗粒和疏水改性的MSHS-RS颗粒的HPLC分析伊维菌素制剂显示了伊维菌素没有明显降解，表明伊维菌素组合物被纳米颗粒良好保护。
实施例9：改变MSHS-RS颗粒的尺寸
通过改变在第一次添加中的间苯二酚和甲醛的量合成具有不同颗粒尺寸的MSHS-RS纳米颗粒。通过增加间苯二酚和甲醛量，可以形成较大的RF聚合物纳米球来充当核，导致MSHS-RS颗粒直径从307nm(间苯二酚0.15g)增加至564nm(间苯二酚0.3g)，至704nm(间苯二酚0.45g)和至837nm(间苯二酚0.6g)。如图24中所示，所产生的变化的尺寸的MSHS-RS颗粒仍然保持尖峰状的表面形貌。氮气吸附结果显示了所产生的颗粒具有孔尺寸为大约10-20nm的介孔结构。随着颗粒尺寸增大，MSHS-RS颗粒的表面积和孔体积增加，如表1中所示。
表1：MSHS-RS颗粒的氮气吸附测定的物理化学性质。
Figure BDA0001469173320000441
实施例10：具有p-DNA的制剂
合成具有大约350nm的直径的MSHS-RS和MSHS-SS颗粒。高度负电荷是p-DNA分子的公认的特征，因此通过用聚乙烯亚胺(PEI)涂覆二氧化硅颗粒而将阳离子官能团引入二氧化硅颗粒，以增强p-DNA与二氧化硅之间的静电吸引。在PEI改性之后，二氧化硅颗粒仍然保持它们的尖峰状的表面形貌。氮气吸附结果显示，经PEI改性的MSHS-RS颗粒显示出孔尺寸为大约11nm的介孔结构。通过在100和130℃的温度的水热处理可以分别将孔尺寸扩大至16和19nm，并且在150℃的水热处理可以以20至80nm的宽的分布进一步扩大孔尺寸。这些MSHS-RS颗粒的ζ电势在PEI改性之后从负(～-20至-30mV)改变至正(～+15mV)，表明在二氧化硅颗粒表面上成功引入PEI基团。
进行Nanodrop测量和凝胶延迟检测以评价与编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pcDNA3-EGFP的结合能力。经PEI改性的MSHS-RS颗粒显示出比经PEI改性的MSHS-SS颗粒(14.7ng/μg)高得多的pcDNA3-EGFP结合能力(29.7ng/μg)。要注意，已经历水热处理的MSHS-RS颗粒与没有水热处理的MSHS-RS颗粒相比由于扩大的孔尺寸和孔体积而显示出甚至更大的p-DNA负载容量。在凝胶延迟检测中，将恒定量的pcDNA3-EGFP(0.5μg)与0至80μg的各种量的PEI改性的二氧化硅颗粒混合。
实施例11：电池组电极和电池组电池的制剂
根据本发明通过简单的熔体浸渍将SeS2浸入碳颗粒以获得SeS2/碳复合物。SeS2/碳的透射电子显微镜(TEM)图像示于图25b中。清楚可见的是层间空间中的对比度高于中空空腔中。在裸露的颗粒的TEM图像(图25a)中没有观察到该差异，表明SeS2主要位于两个碳壳之间的层间空间中而不是在空腔中。根本原因可能是由于较小的纳米空间中的吸引SeS2的较高的毛细力，这解释了我们在试验性试验中的观察：具有微孔壁的单层碳中空球不能在它们的空腔中负载S/SeS2。因此，选择多层中空碳如本发明的碳在我们的设计中是必要的。电化学评估暗示SeS2/碳复合材料显示出优异的循环稳定性、高比容量和高库仑效率(图25c)。使用SeS2/碳颗粒作为阴极的基础构造电池组并且将锂金属用作阳极。在100个循环之后，可逆容量仍然保持在930mAh/g而在200mA/g没有容量衰减。库仑效率从第二次循环趋平于99.5％。为了比较，纯SeS2显示了差得多的循环性能。容量贯穿所述循环而连续降低，使得在100次循环之后观察到75mAh/g的低容量。这些概念验证结果强调了本发明的碳球是优异的SeS2主体并且SeS2/碳复合材料是用于下一代Li-SeSx电池组的有前景的电极材料。
在本说明书和权利要求书(如果有的话)中，词语“包括”及其衍生词(包括“包含”和“含有”)包括所述整体中的每一个，但不排除包含一个或多个其它整体。
贯穿本说明书对“一个实施方案”或“实施方案”的引用意味着使关于该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施例中。因此，贯穿本说明书各处出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”并不必然都指同一实施方案。此外，特定的特征、结构或特性可以以任何合适的方式以一种或多种组合进行组合。
根据该法规，本发明已经或多或少地针对结构或方法特征用语言进行了描述。应该理解的是，本发明不限于所示出或描述的具体特征，因为本文中描述的措施包括使本发明生效的优选形式。因此，在本领域技术人员适当解释的所附权利要求(如果有的话)的适当范围内，本发明以其任何形式或改型中要求保护。

Claims (17)

1.粒状材料，其包括粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒，其具有100nm至3000nm的尺寸，其中所述粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒包括由介孔壳限定的中空核，所述介孔壳的外表面具有在其上的凸起，其中所述凸起彼此间隔开，其中所述凸起的尺寸在5nm至1000nm范围内，和其中所述凸起包括从所述粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒的介孔壳向外延伸的束或圆柱体或纤维。
2.根据权利要求1所述的粒状材料，其中所述凸起的尺寸在5nm至500nm的范围内。
3.根据权利要求1或2所述的粒状材料，其中所述介孔壳具有包括在2nm至20nm范围内的孔的孔结构。
4.根据权利要求1或2所述的粒状材料，其中包围所述中空核的介孔壳具有10nm至100nm的厚度。
5.根据权利要求1或2所述的粒状材料，其中所述凸起的长度为5nm直至它们所在的壳的直径。
6.根据权利要求1或2所述的粒状材料，其中所述凸起的直径在2nm直至100nm的范围内。
7.根据权利要求1或2所述的粒状材料，其中所述纳米颗粒的比表面积在100m2/g至1000m2/g，或150m2/g至1000m2/g，或175m2/g至1000m2/g范围内。
8.组合物，其包括根据前述权利要求任一项所述的粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒，所述纳米颗粒在其中或在其上具有一种或多种活性分子。
9.组合物，其提供化合物的缓释，所述组合物包括根据权利要求1至7任一项所述的粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒，所述纳米颗粒具有在其中或其上占据的化合物。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述化合物包括疏水性蛋白质、疏水性药物或治疗剂，或精油。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述治疗剂为抗生素。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述化合物包括疏水性化合物或杀虫剂或农药。
13.组合物，其包括用核酸至少部分涂覆的根据权利要求1至7任一项所述的粗糙的介孔中空二氧化硅纳米颗粒。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述核酸选自质粒DNA(p-DNA)和信使RNA(mRNA)的一种或多种。
15.用于形成根据权利要求1-7任一项所述的粗糙的介孔中空纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：由反应混合物形成牺牲颗粒，所述牺牲颗粒由第一材料形成；将壳材料前体添加至所述反应混合物以形成围绕所述牺牲颗粒的包含硅或二氧化硅基材料的壳，所述壳具有从其延伸的硅或二氧化硅基材料的突出部，其中在所述硅或二氧化硅基材料的突出部之间由所述反应混合物形成第一材料；和随后去除第一材料，其中所述第一材料为碳基材料和第二材料为硅或二氧化硅基材料，和所述方法包括以下步骤：由反应混合物形成牺牲颗粒，所述牺牲颗粒由碳基材料形成；将第二材料的前体添加至所述反应混合物以形成围绕所述牺牲颗粒的包含硅或二氧化硅的壳，所述壳具有从其延伸的材料的突出部，其中在所述材料的突出部之间由所述反应混合物形成碳基材料；和随后去除碳基材料。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述碳基材料包括通过两种或更多种单体或聚合物前体的反应形成的聚合物，或者其中由包括间苯二酚-甲醛、氨基酚-甲醛或多巴胺的反应混合物形成所述碳基材料，所述牺牲颗粒可以在氨水溶液、去离子水和乙醇且pH＝11.5在室温的
Figure FDA0002963032830000031
合成条件下形成，和所述二氧化硅前体包括原硅酸四乙酯(TEOS)、原硅酸四丙酯(TPOS)或四丁氧基硅烷(TBOS)、原硅酸四甲酯(TMOS)，和其中控制添加至所述反应混合物的壳材料前体的量，以控制所述壳的厚度、所述壳的孔隙度和所述突出部之间的间隔。
17.能够通过权利要求15或16所述的方法获得的产物。
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