ES2856191T3

ES2856191T3 - Dispositivos microfluídicos y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2856191T3
Application number: ES14859826T
Authority: ES
Inventors: Scott Joseph Bornheimer; Jeffrey Sugarman; Wei Huang; Edward Michael Goldberg; Ming Tan
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2014-11-05
Publication date: 2021-09-27
Anticipated expiration: 2034-11-05
Also published as: US20180011090A1; EP3066190A4; BR112016009958A2; WO2015069789A1; US20150125882A1; US9797899B2; CN113477149A; CN113477149B; ZA201602792B; AU2014346787A1; AU2014346787B2; JP2016535992A; CN106029863A; JP6632525B2; US10073093B2; BR112016009958B1; EP3066190B1; EP3066190A1

Abstract

Un dispositivo microfluídico que comprende: un sitio de aplicación de la muestra; un canal de flujo en comunicación fluida con el sitio de aplicación de la muestra; y un componente poroso colocado entre el sitio de aplicación de la muestra y el canal de flujo, en donde el componente poroso llena una región que se extiende desde el sitio de aplicación de la muestra hasta el canal de flujo, comprendiendo el componente poroso una matriz porosa, un tampón; y un reactivo de ensayo colocado dentro de los poros de la matriz porosa.

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivos microfluídicos y métodos de uso de los mismos

Introducción

El diagnóstico en el punto de atención incluye las etapas de obtener una muestra biológica de un sujeto, realizar un análisis de la muestra para determinar la presencia o concentración de uno o más analitos diana y proporcionar un diagnóstico al sujeto en un solo lugar. El diagnóstico en el punto de atención proporciona resultados más rápidos y, a menudo, menos costosos para el sujeto que las pruebas de diagnóstico que requieren obtener una muestra en un lugar y realizar el análisis de la muestra en un lugar diferente.

El diagnóstico rápido de enfermedades infecciosas a partir de una gota de sangre con una sola punción digital utilizando una tecnología económica y fácil disponible en el punto de atención mejoraría enormemente las iniciativas de salud mundial. Los inmunoensayos de micropartículas basados en citometría de flujo proporcionan una excelente precisión y multiplexación, pero son inapropiados para entornos de punto de atención debido a la complicada preparación de la muestra y la costosa instrumentación. En vista de lo anterior, varios campos de la medicina y la biotecnología avanzarían significativamente con la disponibilidad de técnicas capaces de funcionar en el punto de atención, que permitieran medidas fáciles y flexibles de marcadores celulares, particularmente en fluidos biológicos tal como la sangre. El documento WO2008/137212A1 como un ejemplo describe un dispositivo microfluídico para analizar una muestra.

Compendio

Los aspectos de la presente descripción incluyen un dispositivo microfluídico para analizar una muestra. Los dispositivos microfluídicos según ciertas realizaciones incluyen un sitio de aplicación de la muestra, un canal de flujo en comunicación fluida con el sitio de aplicación de la muestra y un componente poroso que contiene una matriz porosa y un reactivo de ensayo colocado entre el sitio de aplicación de la muestra y el canal de flujo. También se describen sistemas y métodos adecuados para analizar una muestra, tal como una muestra biológica, que emplean los dispositivos microfluídicos objeto. La invención está definida por la reivindicación 1.

Como se resumió anteriormente, los aspectos de la presente descripción incluyen un dispositivo microfluídico para analizar una muestra que tiene un sitio de aplicación de la muestra, un canal de flujo en comunicación fluida con el sitio de aplicación y un componente poroso colocado entre el sitio de aplicación de la muestra y el canal de flujo. En las realizaciones, el componente poroso incluye una matriz porosa y un reactivo de ensayo. En algunos casos, la matriz porosa es una frita, tal como una frita de vidrio. En otros casos, la matriz porosa es una matriz polimérica. En algunas realizaciones, la matriz porosa está configurada para no filtrar con respecto a los componentes de la muestra. En ciertos casos, la matriz porosa está configurada para proporcionar la mezcla del reactivo de ensayo con la muestra que fluye a través de la matriz porosa. La matriz porosa puede tener poros que tienen diámetros de entre 1 pm y 200 pm y volúmenes de poros de entre 1 pl y 25 pl. Por ejemplo, el volumen del poro puede estar entre el 25% y el 75% del volumen de la matriz porosa, tal como entre el 40% y el 60% del volumen de la matriz porosa.

El reactivo de ensayo incluye un reactivo para unirse a uno o más componentes de la muestra. En algunas realizaciones, el reactivo es un miembro de unión específico del analito. Por ejemplo, el miembro de unión específico del analito puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En ciertos casos, el miembro de unión específico del analito es un anticuerpo que se une específicamente a un compuesto tal como CD14, CD4, CD45RA, CD3 o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el miembro de unión específico del analito se une a un marcador detectable, tal como un marcador ópticamente detectable. Por ejemplo, el marcador ópticamente detectable puede ser un tinte fluorescente tal como rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetina, pireno, difluoruro de boro dipirrometeno, naftalimida, ficobiliproteína, proteínas de clorofila de peridinio o una combinación de los mismos. En ciertos casos, el tinte es ficoeritrina (PE), ficoeritrina-cianina 5, (PE-cy5) o aloficocianina APC. En algunas realizaciones, los tampones incluyen albúmina de suero bovino (BSA), trehalosa, polivinilpirrolidona (PVP) o ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico o una combinación de los mismos. Por ejemplo, el tampón puede incluir BSA, trehalosa y PVP. Los tampones también pueden incluir uno o más agentes quelantes, tal como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis-(beta-aminoetiléter) N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), 2,3-ácido dimercaptopropanel-1-sulfónico (DMPS) y ácido 2,3-dimercaptosuccínico (DMSA). En ciertas realizaciones, el tampón incluye EDTA. El reactivo de ensayo puede estar presente en la matriz porosa como un líquido. En otros casos, el reactivo de ensayo está seco. En otros casos más, el reactivo de ensayo se liofiliza.

En algunas realizaciones, el canal de flujo está configurado para recibir una muestra que tiene un volumen que va de 1 ml a 1000 ml. En ciertos casos, el canal de flujo es un canal capilar configurado para transportar la muestra a través del canal de flujo por acción capilar. En ciertas realizaciones, el canal de flujo incluye una o más paredes ópticamente transmisivas. En un ejemplo, el canal de flujo es ópticamente transmisivo a la luz ultravioleta. En otro ejemplo, el canal de flujo es ópticamente transmisivo a la luz visible. En otro ejemplo más, el canal de flujo es ópticamente transmisivo a la luz del infrarrojo cercano. En otro ejemplo más, el canal de flujo es transmisivo a la luz ultravioleta y luz visible. En otro ejemplo más, el canal de flujo es transmisivo a la luz visible y a la luz del infrarrojo cercano. En otro ejemplo más, el canal de flujo es transmisivo a la luz ultravioleta, luz visible y luz infrarroja cercana.

Los dispositivos microfluídicos según ciertas realizaciones incluyen una frita porosa que contiene microcanales que definen una trayectoria de flujo tortuosa que tiene una longitud suficiente para la mezcla de un reactivo y una muestra. El volumen del poro puede ser del 40 al 60% del volumen total de la frita porosa, tal como 2 gl o más, tal como 5 gl, 10 gl e incluso 20 gl o más. En algunas realizaciones, los microcanales proporcionan el flujo a través de sustancialmente todos los componentes de la muestra. En algunas realizaciones, los microcanales tienen un diámetro medio de poro que atraviesa entre 5 gm y 200 gm, tal como entre 5 gm y 60 gm o entre 30 gm y 60 gm.

La mezcla de ensayo incluye un reactivo y un tampón. En algunos casos, la mezcla de ensayo proporciona la disolución sustancialmente uniforme del reactivo en la muestra durante un período de tiempo predeterminado. El período de tiempo predeterminado puede estar entre 5 segundos y 5 minutos, tal como entre 20 segundos y 3 minutos o entre 50 segundos y 2 minutos. En algunas realizaciones, los componentes del tampón incluyen albúmina de suero bovino (BSA), trehalosa y polivinilpirrolidona (PVP). La relación en peso de BSA:trehalosa:PVP puede ser 21:90:1. El peso total de los componentes del tampón puede estar entre 0,01 g/gl y 2 g/gl del volumen del poro de la matriz porosa. En algunas realizaciones, los componentes del tampón incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). En ciertas realizaciones, los componentes del tampón comprenden ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES). En algunos casos, el reactivo incluye uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpos conjugados con un marcador detectable. El anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo pueden unirse a una diana, tal como una diana seleccionada entre CD14, CD4, CD45RA, CD3 o una combinación de los mismos. En algunos casos, el marcador detectable es un tinte fluorescente. Por ejemplo, el tinte puede ser un compuesto tal como rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetina, pireno, difluoruro de boro dipirrometeno, naftalimida, ficobiliproteína, proteínas de clorofila de peridinio, conjugados de los mismos y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el tinte puede ser ficoeritrina (PE), ficoeritrinacianina 5, (PE-cy5) o aloficocianina APC. En realizaciones de la presente descripción, la mezcla de ensayo puede incluir enzimas, sustratos, catalizadores, ácidos nucleicos o una combinación de los mismos. En ciertos casos, los dispositivos microfluídicos pueden incluir además una muestra biológica como sangre, orina, saliva o una muestra de tejido.

Los aspectos de la presente descripción también incluyen un método para analizar una muestra para un analito donde el método incluye poner en contacto una muestra con un sitio de aplicación de la muestra de un dispositivo microfluídico que tiene un canal de flujo en comunicación fluida con el sitio de aplicación de la muestra y un componente poroso colocado entre el sitio de aplicación de la muestra y el canal de flujo, que ilumina la muestra en el canal de flujo con una fuente de luz y que detecta la luz de la muestra para determinar la presencia o concentración de uno o más componentes en la muestra.

En algunas realizaciones, la muestra se mezcla con un reactivo de ensayo presente en la matriz porosa del componente poroso mediante el movimiento de la muestra a través de la matriz porosa. El movimiento de la muestra a través de la matriz porosa es, en ciertas realizaciones, no filtrante con respecto a los componentes de la muestra. En algunas realizaciones, el canal de flujo es un canal capilar y la muestra se mueve a través de la matriz porosa por acción capilar. La mezcla de la muestra con el reactivo de ensayo puede incluir marcar uno o más componentes de la muestra con un marcador detectable. En algunos casos, el marcado incluye poner en contacto uno o más componentes de la muestra con un miembro de unión específico del analito, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En ciertos casos, el miembro de unión específico del analito es un anticuerpo que se une específicamente a un compuesto tal como CD14, CD4, CD45RA, CD3 o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el miembro de unión específico del analito se une a un marcador detectable, tal como un marcador ópticamente detectable. Ejemplos de marcadores ópticamente detectables incluyen tintes fluorescentes tales como rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetina, pireno, difluoruro de boro dipirrometeno, naftalimida, ficobiliproteína, proteínas de clorofila de peridinio, conjugados de los mismos y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el tinte es ficoeritrina (PE), ficoeritrina-cianina 5, (PE-cy5) o aloficocianina APC.

Los métodos según algunas realizaciones incluyen iluminar la muestra en el canal de flujo con una fuente de luz de amplio espectro. En algunas realizaciones, la fuente de luz de amplio espectro es una fuente de luz ultravioleta, una fuente de luz visible o una fuente de luz infrarroja, o una combinación de las mismas. En ciertas realizaciones, la muestra se ilumina con luz que tiene una longitud de onda entre 200 nm y 800 nm.

En algunas realizaciones, los métodos también incluyen la detección de luz de la muestra en el canal de flujo. La luz detectada de la muestra puede incluir fluorescencia, luz transmitida, luz dispersa o una combinación de las mismas. En algunos casos, los métodos incluyen la detección de fluorescencia de la muestra. En ciertos casos, la detección de luz de la muestra incluye capturar una imagen de la muestra en el canal de flujo.

También se proporcionan métodos para analizar una muestra, tal como una muestra biológica, con los dispositivos microfluídicos objeto. En algunas realizaciones, los métodos incluyen aplicar una muestra líquida a un sitio de aplicación de la muestra que está en comunicación fluida con un elemento poroso y un canal capilar, dirigiendo el flujo de muestra desde el sitio de aplicación de la muestra, a través del elemento poroso, al canal capilar. El canal capilar puede incluir una pared ópticamente transmisiva y el elemento poroso incluye al menos un reactivo ópticamente activo y uno o más componentes tampón.

Los métodos pueden incluir además disolver el reactivo en la muestra donde la disolución del reactivo es sustancialmente constante durante una cantidad de tiempo predeterminado, tal como entre 5 segundos y 5 minutos o como 20 segundos y 3 minutos o entre 1 minuto y 2 minutos. En algunas realizaciones, la mezcla de la muestra y el reactivo se realiza en una frita porosa que proporciona una serie de microcanales que definen una trayectoria de flujo tortuosa que tiene una longitud suficiente para mezclar la muestra y el reactivo. La mezcla puede facilitar la unión del reactivo a uno o más componentes de la muestra y es seguida por interrogar ópticamente a la muestra a través de la pared ópticamente transmisiva. La mezcla puede ser pasiva (difusiva), convectiva, activa o cualquier combinación de las mismas. La muestra puede fluir por una fuerza de acción capilar a través del elemento poroso y a través del canal capilar. En ciertas realizaciones, la interrogación óptica incluye obtener una imagen de la muestra a través de una pared transmisiva, determinar una señal de fondo que corresponde al reactivo y la muestra no unidos y restar la señal de fondo de la imagen de la muestra. En algunas realizaciones, la señal de fondo es sustancialmente constante (varía por 75% o menos, tal como por 50%) a lo largo de la pared transmisiva. En algunos casos, la muestra fluye a través del elemento poroso sustancialmente sin filtrar. En realizaciones, la muestra puede ser una muestra biológica, tal como sangre, orina, tejido, saliva o similares. En algunas realizaciones, el reactivo ópticamente activo incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado fluorescentemente y la mezcla proporciona la formación de uno o más componentes marcados fluorescentemente en la muestra biológica.

Los aspectos de la presente descripción también incluyen sistemas para practicar los métodos objeto. Los sistemas según ciertas realizaciones incluyen una fuente de luz, un detector óptico para detectar una o más longitudes de onda de luz y un dispositivo microfluídico para analizar una muestra que tiene un sitio de aplicación de la muestra, un canal de flujo en comunicación fluida con el sitio de aplicación y un componente poroso colocado entre el sitio de aplicación de la muestra y el canal de flujo.

Definición de term inología exclusiva

Generalmente, los términos utilizados en esta memoria que no se definen específicamente de otra manera, tienen significados correspondientes a su uso convencional en los campos relacionados con la invención, que incluye la química analítica, bioquímica, biología molecular, biología celular, microscopía, análisis de imágenes y similares, tal como se representa en la siguientes tratados: Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, cuarta edición (Garland, 2002); Nelson and Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, cuarta edición (W.H. Freeman, 2004); Murphy, Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging (Wiley-Liss, 2001); Shapiro, Practical Flow Cytometry, cuarta edición (Wiley-Liss, 2003); Owens et al (Editores), Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice: Quality Assurance for Quantitative Immunophenotyping (Wiley-Liss, 1994); Ormerod (Editor) Flow Cytometry: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000); y similares.

"Anticuerpo" o "inmunoglobulina" significa una proteína o natural o producida sintéticamente por medios químicos o recombinantes, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno particular o determinante antigénico. Los anticuerpos son normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150000 Dalton, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. "Fragmento de anticuerpo", y todas las variantes gramaticales del mismo, como se emplea en esta memoria, se definen como una parte de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto, en donde la parte está libre de los dominios de cadena pesada constante (es decir, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y fragmentos Fv. El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) como se emplea en esta memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada mAb está dirigido contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que pueden sintetizarse mediante cultivo de hibridoma, no contaminados por otras inmunoglobulinas. Se puede encontrar el guiado en la producción y selección de anticuerpos para uso en inmunoensayos en textos y manuales fácilmente disponibles, p. ej., Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1988); Howard and Bethell, Basic Methods in Antibody Production and Characterization (CRC Press, 2001); Wild, editor, The Immunoassay Handbook (Stockton Press, Nueva York, 1994), y similares.

"Dispositivo microfluídico" significa un sistema integrado de una o más cámaras, puertos y canales que están interconectados y en comunicación fluida y diseñados para llevar a cabo una reacción o proceso analítico, o solo o en cooperación con un aparato o instrumento que proporciona funciones de apoyo, tales como introducción de muestras, medios de activación de fluidos y/o reactivos, control de temperatura, sistemas de detección, recopilación de datos y/o sistemas de integración, y similares. Los dispositivos microfluídicos pueden incluir además válvulas, bombas y revestimientos funcionales especializados en las paredes interiores, p. ej., para evitar la adsorción de componentes de muestra o reactivos, facilitar el movimiento del reactivo por electroósmosis o similares. Dichos dispositivos se fabrican normalmente en o como un sustrato sólido, que puede ser vidrio, plástico u otros materiales poliméricos sólidos, y normalmente tienen un formato plano para facilitar la detección y la monitorización del movimiento de muestras y reactivos, especialmente mediante métodos ópticos o electroquímicos. Las características de un dispositivo microfluídico normalmente tienen dimensiones de sección transversal de menor que unos pocos cientos de micrómetros cuadrados y los pasos normalmente tienen dimensiones capilares, p. ej., tienen dimensiones de sección transversal máximas de aproximadamente 500 pm a aproximadamente 0,1 pm. Los dispositivos microfluídicos tienen normalmente capacidades de volumen en el intervalo de desde 1 pl a menos que 10 nl, p. ej., 10-100 nl. La fabricación y el funcionamiento de dispositivos microfluídicos son bien conocidos en la técnica, como se ejemplifica en las siguientes referencias: Ramsey, patentes de EE.UU. 6,001,229; 5,858,195; 6,010,607; y 6,033,546; Soane et al, patentes de EE.UU. 5,126,022 y 6,054,034; Nelson et al, patente de EE.u U. 6,613,525; Maher et al, patente de EE.UU.

6,399,952; Ricco et al, publicación internacional de patente WO 02/24322; Bjornson et al, publicación internacional de patente WO 99/19717; Wilding et al, patentes de EE.UU. 5,587,128; 5,498,392; Sia et al., Electrophoresis 24: 3563 3576 (2003); Unger et al., Science, 288: 113-116 (2000); Enzelberger et al, patente de EE.UU 6,960,437.

"Muestra" significa una cantidad de material de una fuente biológica, ambiental, médica o del paciente en la que se busca la detección o medida de células, partículas, perlas y/o analitos predeterminados. Una muestra puede comprender material de fuentes naturales o de fuentes artificiales, tales como cultivos de tejidos, cultivos de fermentación, biorreactores y similares. Las muestras pueden comprender animales, que incluyen humanos, fluidos, sólidos (p. ej., heces) o tejidos, así como alimentos e ingredientes líquidos y sólidos, tal como productos lácteos, verduras, carne y subproductos cárnicos y desechos. Las muestras pueden incluir materiales extraídos de un paciente que incluyen, pero no se limitan a, cultivos, sangre, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, leche, linfa, esputo, semen, aspirados con aguja y similares. Las muestras pueden obtenerse de todas las diversas familias de animales domésticos, así como de animales salvajes o asilvestrados, que incluyen pero no se limita a, animales tal como los ungulados, osos, peces, roedores, etc. Las muestras pueden incluir material ambiental tal como la materia superficial, tierra, agua y muestras industriales, así como muestras obtenidas de instrumentos, aparatos, equipos, utensilios, artículos desechables y no desechables de procesamiento de alimentos y lácteos. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes de los tipos de muestras aplicables a la presente invención. Los términos "muestra", "muestra biológica" y "espécimen" se utilizan indistintamente.

Breve descripción de las figuras

La invención puede entenderse mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras:

FIG. 1 representa una ilustración de una vista superior de un dispositivo microfluídico según ciertas realizaciones.

FIG. 2A representa un esquema que muestra una vista superior de un dispositivo microfluídico según ciertas realizaciones.

FIG. 2B representa un esquema que muestra la vista lateral de un dispositivo microfluídico según ciertas realizaciones.

FIG. 3A representa una ilustración de los componentes de detección de una muestra en el dispositivo microfluídico según ciertas realizaciones.

FIG. 3B representa una ilustración de la mejora de imágenes de componentes de una muestra en el dispositivo microfluídico según ciertas realizaciones.

Descripción detallada

Se describen un dispositivo microfluídico y el método para usar el mismo. El dispositivo puede incluir un sitio de aplicación de la muestra en comunicación con un componente poroso y un canal de flujo. Las dimensiones del dispositivo pueden proporcionar que la acción capilar sea la fuerza principal para transmitir una muestra a través del elemento poroso y el canal de flujo. El dispositivo puede usarse para interrogar analitos o componentes en una muestra que se ha marcado con una etiqueta detectable. El componente poroso consta de una matriz porosa, tal como una frita y un reactivo de ensayo. El componente poroso puede proporcionar una matriz para el reactivo de ensayo y tener dimensiones suficientes para proporcionar un camino tortuoso para la mezcla de la muestra y un reactivo de ensayo. La mezcla puede ser pasiva o convectiva y no requiere fuerza adicional más allá de la fuerza capilar para proporcionar una muestra que se mezcla sustancialmente de manera uniforme con un reactivo de ensayo al salir de la matriz porosa. El reactivo de ensayo puede proporcionar la disolución uniforme de un reactivo tal como un marcador detectable en la muestra durante un período de tiempo definido.

La práctica de la presente invención puede emplear, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (que incluye técnicas recombinantes), biología celular, tecnología de inmunoensayos, microscopía, análisis de imágenes y química analítica, que están dentro de las habilidades de la técnica. Tales técnicas convencionales incluyen, pero no se limitan a, detección de señales fluorescentes, análisis de imágenes, selección de fuentes de iluminación y componentes de detección de señales ópticas, etiquetado de células biológicas y similares. Tales técnicas y descripciones convencionales se pueden encontrar en manuales de laboratorio estándar tal como Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (vol. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (todo de Cold Spring Harbor Laboratory Press); Murphy, Fundamentáis of Light Microscopy and Electronic Imaging (Wiley-Liss, 2001); Shapiro, Practica! Flow Cytometry, cuarta edición (Wiley-Liss, 2003); Herman et al, Fluorescence Microscopy, 2a edición (Springer, 1998).

Antes de que la presente invención se describa con mayor detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, como tal pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en esta memoria tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Donde se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta el décimo de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio en ese intervalo indicado, está incluido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también están incluidos dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el rango indicado. Donde el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en esta memoria tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en esta memoria también puede usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen métodos y materiales ilustrativos representativos.

Se observa que, como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración está destinada a servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con la recitación de elementos de reclamación o el uso de una limitación "negativa".

Como se resumió anteriormente, los aspectos de la presente descripción incluyen un dispositivo microfluídico para analizar una muestra. Al describir realizaciones adicionales de la descripción, los dispositivos microfluídicos de interés se describen primero con mayor detalle. A continuación, se describen métodos para analizar una muestra que emplea el dispositivo microfluídico objeto. Se describen sistemas adecuados para practicar los métodos objeto para analizar una muestra para un analito. También se proporcionan kits.

Dispositivos m icrofluídicos

Como se resumió anteriormente, los aspectos de la presente descripción incluyen un dispositivo microfluídico para analizar una muestra para uno o más analitos. El término "ensayar" se usa en esta memoria en su sentido convencional para referirse a evaluar cualitativamente la presencia o medir cuantitativamente una cantidad de una especie de analito diana en la muestra. Como se describe con mayor detalle a continuación, se puede analizar una variedad de muestras diferentes con el dispositivo microfluídico objeto. En algunos casos, la muestra es una muestra biológica. El término "muestra biológica" se usa en su sentido convencional para incluir un organismo completo, planta, hongo o un subconjunto de tejidos, células o componentes animales que, en ciertos casos, pueden encontrarse en sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, lavado broncoalveolar, líquido amniótico, sangre del cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen. Como tal, una "muestra biológica" se refiere tanto al organismo nativo o un subconjunto de sus tejidos así como a un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir del organismo o un subconjunto de sus tejidos, incluidos, que incluye pero no se limita a, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, secciones de la piel, tractos respiratorio, gastrointestinal, cardiovascular y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos. Las muestras biológicas pueden incluir cualquier tipo de material orgánico, que incluye tanto componentes sanos como enfermos (p. ej., cancerosos, malignos, necróticos, etc.). En ciertas realizaciones, la muestra biológica es una muestra líquida, tal como sangre completa o derivado de la misma, plasma, lágrimas, sudor, orina, semen, etc., donde en algunos casos la muestra es una muestra de sangre, que incluye sangre completa, tal como sangre obtenida por punción venosa o punción digital (donde la sangre puede o no combinarse con cualquier reactivo antes del ensayo, tal como conservantes, anticoagulantes, etc.).

En ciertas realizaciones, la fuente de la muestra es un "mamífero" donde este término se usa ampliamente para describir organismos que están dentro de la clase mammalia, que incluyen los órdenes carnívoros (p. ej., perros y gatos), roedores (p. ej., ratones, conejillos de indias y ratas) y primates (p. ej., humanos, chimpancés y monos). En algunos casos, los sujetos son humanos. Pueden obtenerse muestras biológicas de interés de sujetos humanos de ambos géneros y en cualquier etapa de desarrollo (es decir, recién nacidos, bebés, jóvenes, adolescentes, adultos), donde en determinadas realizaciones el sujeto humano es un joven, adolescente o adulto. Mientras la presente descripción puede aplicarse a muestras de un sujeto humano, debe entenderse que los dispositivos microfluídicos también pueden emplearse con muestras de otros sujetos animales no humanos tales como, pero no se limitan a, pájaros, ratones, ratas, perros, gatos, ganado y caballos.

En realizaciones de la presente descripción, los dispositivos microfluídicos incluyen un sitio de aplicación de la muestra, un canal de flujo en comunicación fluida con el sitio de aplicación de la muestra y un componente poroso que contiene una matriz porosa y un reactivo de ensayo colocado entre el sitio de aplicación de la muestra y el canal de flujo. El sitio de aplicación de la muestra del dispositivo microfluídico es una estructura configurada para recibir una muestra con un volumen que va de 5 pl a 1000 pl, tal como de 10 pl a 900 pl, tal como de 15 pl a 800 pl, tal como de 20 pl a 700 pl, tal como de 25 pl a 600 pl, tal como de 30 pl a 500 pl, tal como de 40 pl a 400 pl, tal como de 50 pl a 300 pl e incluso de 75 pl a 250 pl. El sitio de aplicación de la muestra puede tener cualquier forma conveniente, siempre y cuando proporcione acceso para el fluido, o directamente o a través de un componente intermedio que proporciona comunicación fluídica al canal de flujo. En algunas realizaciones, el sitio de aplicación de la muestra es plano. En otras realizaciones, el sitio de aplicación de la muestra es cóncavo, tal como en la forma de un cono invertido que termina en el orificio de entrada de la muestra. Dependiendo de la cantidad de muestra aplicada y la forma del sitio de aplicación de la muestra, el sitio de aplicación de la muestra puede tener un área superficial que va de 0,01 mm2 a 1000 mm2, tal como de 0,05 mm2 a 900 mm2, tal como de 0,1 mm2 a 800 mm2, tal como de 0,5 mm2 a 700 mm2, tal como de 1 mm2 a 600 mm2, tal como de 2 mm2 a 500 mm2 e incluso de 5 mm2 a 250 mm2.

La entrada del dispositivo microfluídico está en comunicación fluídica con el sitio de aplicación de la muestra y el canal de flujo y puede tener cualquier forma adecuada, donde las formas de sección transversal de las entradas de interés incluyen, pero no se limitan a: formas de sección transversal rectilínea, p. ej., cuadrados, rectángulos, trapezoides, triángulos, hexágonos, etc., formas de sección transversal curvilínea, p. ej., círculos, óvalos, etc., así como formas irregulares, p. ej., una parte inferior parabólica unida a una parte superior plana. Las dimensiones del orificio de la boquilla pueden variar, en algunas realizaciones van de 0,01 mm a 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, tal como de 0,1 mm a 80 mm, tal como de 0,5 mm a 70 mm, tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm e incluso de 5 mm a 25 mm. En algunas realizaciones, la entrada es un orificio circular y el diámetro de la entrada va de 0,01 mm a 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, tal como de 0,1 mm a 80 mm, tal como de 0,5 mm a 70 mm., tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm e incluso de 5 mm a 25 mm. En consecuencia, dependiendo de la forma de la entrada, el orificio de entrada de la muestra puede tener una abertura que varía, va de 0,01 mm2 a 250 mm2, tal como de 0,05 mm2 a 200 mm2, tal como de 0,1 mm2 a 150 mm2, tal como de 0,5 mm2 a 100 mm2, tal como de 1 mm2 a 75 mm2, tal como de 2 mm2 a 50 mm2 e incluso de 5 mm2 a 25 mm2.

En realizaciones, la entrada de la muestra está en comunicación fluida con un componente poroso que contiene una matriz porosa y un reactivo de ensayo colocado entre el sitio de aplicación de la muestra y el canal de flujo. Por "matriz porosa" se entiende un sustrato que contiene una o más estructuras de poros configuradas para la permeación de componentes líquidos a su través. En algunas realizaciones, la matriz porosa contiene una red de poros interconectados que proporciona un medio para mezclar una muestra aplicada (p. ej., una muestra biológica como se analiza con mayor detalle a continuación) con un reactivo de ensayo presente en la matriz porosa. En otras realizaciones, la matriz porosa contiene una red de poros interconectados que no filtra a la muestra. Por "no filtrante" se entiende que la red de poros interconectados no restringe sustancialmente el paso de los componentes de la muestra a través de la matriz porosa (es decir, al canal de flujo), tal como donde el paso del 1% o menos de los componentes de la muestra está restringido por los poros de la matriz porosa, tal como 0,9% o menos, tal como 0,8% o menos, tal como 0,7% o menos, tal como 0,5% o menos, tal como 0,1% o menos, tal como 0,05% o menos, tal como 0,01% o menos, tal como 0,001% o menos e incluso donde el 0,0001% o menos de los componentes de la muestra están restringidos por los poros de la matriz porosa. En otras palabras, el 1% o menos de la muestra permanece en la matriz porosa después del paso de la muestra, tal como 0,9% o menos, tal como 0,8% o menos, tal como 0,7% o menos, tal como 0,5% o menos, tal como 0,1% o menos, tal como 0,05% o menos, tal como 0,01% o menos, tal como 0,001% o menos e incluso 0,0001% o menos de la muestra permanece en la matriz porosa después del paso de la muestra. Dicho de otra manera, las matrices porosas de interés incluyen una red de poros interconectados que está configurada para proporcionar el paso de sustancialmente toda la muestra a través de la matriz porosa, tal como donde el 99% o más de la muestra pasa a través de la matriz porosa, tal como 99,5% o más, tal como 99,9% o más, tal como 99,99% o más, tal como 99,999% o más e incluso el paso de 99,9999% o más de la muestra a través de la matriz porosa. En ciertas realizaciones, toda (es decir, el 100%) de la muestra pasa a través de la matriz porosa.

La matriz porosa colocada entre el sitio de aplicación de la muestra y el canal de flujo puede tener cualquier forma adecuada, tal como formas poligonales planas que incluyen, pero no se limitan a, un círculo, óvalo, semicírculo, en forma de media luna, en forma de estrella, cuadrado, triángulo, romboide, pentágono, hexágono, heptágono, octágono, rectángulo u otro polígono adecuado. En otras realizaciones, las matrices porosas de interés son tridimensionales, tal como en forma de un cubo, cono, media esfera, estrella, prisma triangular, prisma rectangular, prisma hexagonal u otro poliedro adecuado. En ciertas realizaciones, la matriz porosa tiene forma de disco. En otras realizaciones, la matriz porosa es cilíndrica. Las dimensiones de la matriz porosa pueden variar, en algunas realizaciones va de 0,01 mm a 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, tal como de 0,1 mm a 80 mm, tal como de 0,5 mm a 70 mm, tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm e incluso de 5 mm a 25 mm. En algunas realizaciones, la matriz porosa es circular y el diámetro de la matriz porosa va de 0,01 mm a 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, tal como de 0,1 mm a 80 mm, tal como de 0,5 mm a 70 mm, tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm e incluso de 5 mm a 25 mm y tiene una altura de 0,01 mm a 50 mm, tal como de 0,05 mm a 45 mm, tal como de 0,1 mm a 40 mm, tal como de 0,5 mm a 35 mm, tal como de 1 mm a 30 mm, tal como de 2 mm a 25 mm , tal como de 3 mm a 20 mm, tal como de 4 mm a 15 mm e incluso de 5 mm a 10 mm.

Los tamaños de los poros de la matriz porosa también pueden variar, dependiendo de la muestra biológica y los reactivos de ensayo presentes y pueden variar de 0,01 gm a 200 gm, tal como de 0,05 gm a 175 gm, tal como de 0,1 gm a 150 gm, tal como 0,5 gm a 125 gm, tal como 1 gm a 100 gm, tal como 2 gm a 75 gm e incluso 5 gm a 50 gm. En realizaciones, la matriz porosa puede tener un volumen de poro suficiente para contener toda o parte de la muestra aplicada según se desee. Por ejemplo, el 50% o más del volumen de la muestra puede caber dentro de la matriz porosa, tal como 55% o más, tal como 60% o más, tal como 65% o más, tal como 75% o más, tal como 90% o más, tal como 95% o más, tal como 97% o más e incluso 99% o más del volumen de muestra puede caber dentro de la matriz porosa. En ciertas realizaciones, la matriz porosa tiene un volumen del poro que es suficiente para contener toda (es decir, el 100%) de la muestra. Por ejemplo, el volumen del poro de la matriz porosa puede variar de 0,01 gl a 1000 gl, tal como de 0,05 gl a 900 gl, tal como de 0,1 gl a 800 gl, tal como de 0,5 gl a 500 gl, tal como de 1 gl a 250 gl, tal como 2 gl a 100 gl e incluso 5 gl a 50 gl. En las realizaciones, la fracción de huecos (es decir, la relación entre el volumen de huecos dentro de los poros y el volumen total) de las matrices porosas de interés oscila de 0,1 a 0,9, tal como de 0,15 a 0,85, tal como de 0,2 a 0,8, tal como de 0,25 a 0,75, tal como de 0,3 a 0,7, tal como de 0,35 a 0,65 e incluso de 0,4 a 0,6. Dicho de otra manera, el volumen del poro es del 10% y el 90% del volumen total de la matriz porosa, tal como del 15% y el 85%, tal como del 20% y el 80%, tal como del 25% y el 75%, tal como del 30% y el 70%, tal como del 35% y el 65% e incluso un volumen del poro del 40% y el 60% del volumen total de la matriz porosa.

En algunas realizaciones, las matrices porosas de interés están configuradas para proporcionar un caudal predeterminado de la muestra a través de la matriz porosa. Como se analizó anteriormente, la muestra puede mezclarse con un reactivo de ensayo dentro de los poros de la matriz porosa y fluir a través de la matriz porosa hasta el canal de flujo por acción capilar. En ciertos casos, la matriz porosa está configurada para proporcionar un caudal a través de la matriz porosa al canal de flujo que es 0,0001 gl/min o más, tal como 0,0005 gl/min o más, tal como 0,001 gl/min o más, tal como 0,005 gl/min o más, tal como 0,01 gl/min o más, tal como 0,05 gl/min o más, tal como 0,1 gl/min o más, tal como 0,5 gl/min o más, tal como 1 gl/min o más, tal como 2 gl/min o más, tal como 3 gl/min o más, tal como 4 gl/min o más, tal como 5 gl/min o más, tal como 10 gl/min o más, tal como 25 gl/min o más, tal como 50 gl/min o más, tal como 100 gl/min e incluso una velocidad de flujo a través de la matriz porosa de 250 gl/min o más. Por ejemplo, la matriz porosa puede configurarse para pasar la muestra a través de la matriz porosa (donde la muestra se mezcla con el reactivo de ensayo) a una velocidad que va de 0,0001 gl/min a 500 gl/min, tal como de 0,0005 gl/min a 450 gl/min, tal como de 0,001 gl/min a 400 gl/min, tal como de 0,005 gl/min a 350 gl/min, tal como de 0,01 gl/min a 300 gl/min, tal como de 0,05 gl/min a 250 gl/min, tal como de 0,1 gl/min a 200 gl/min, tal como de 0,5 gl/min a 150 gl/min e incluso el paso de la muestra a través de la matriz porosa a una velocidad de 1 gl/min a 100 gl/min.

En algunas realizaciones, las matrices porosas objeto están configuradas para pasar la muestra a través de la matriz porosa durante un período de tiempo predeterminado. Por ejemplo, la matriz porosa puede tener una estructura de poros donde la muestra pasa a través de la matriz porosa en una cantidad de tiempo tal como durante una duración de 5 segundos o más, tal como más de 10 segundos o más, tal como más de 30 segundos o más, tal como más de 60 segundos o más, tal como más de 2 minutos o más, tal como más de 3 minutos o más, tal como más de 5 minutos o más, tal como más de 10 minutos o más e incluso pasar la muestra a través de la matriz porosa durante una duración de 30 minutos o más. En ciertos casos, la matriz porosa está configurada para tener una estructura de poros donde la muestra pasa a través de la matriz porosa durante una duración que va de 1 segundo a 60 minutos, tal como de 2 segundos a 30 minutos, tal como de 5 segundos a 15 minutos, tal como de 10 segundos a 10 minutos, tal como de 15 segundos a 5 minutos e incluso de 20 segundos a 3 minutos.

La matriz porosa puede ser cualquier sustrato macroporoso o microporoso adecuado e incluye, pero no se limita a, matrices cerámicas, fritas, tales como vidrio fritado, matrices poliméricas así como matrices poliméricas organometálicas. En algunas realizaciones, la matriz porosa es una frita. El término "frita" se usa en esta memoria en su sentido convencional para referirse a la composición porosa formada a partir de un sólido granulado sinterizado, tal como vidrio. Las fritas pueden tener un constituyente químico que varía, dependiendo del tipo de granulado sinterizado utilizado para preparar la frita y pueden incluir, pero no se limita a, fritas compuestas de aluminosilicato, trióxido de boro, vidrio de borofosfosilicato, vidrio de borosilicato, esmalte cerámico, vidrio de cobalto, vidrio de arándano, vidrio de fluorofosfato, vidrio de fluorosilicato, cuarzo fundido, dióxido de germanio, borosilicato incrustado de metal y sulfuro, vidrio emplomado, vidrio de fosfato, vidrio de pentóxido de fósforo, vidrio de fosfosilicato, silicato de potasio, vidrio de cal sodada, vidrio de hexametafosfato de sodio, silicato de sodio, vidrio de telurito, vidrio de uranio, vitrito y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la matriz porosa es una frita de vidrio, tal como un borosilicato, aluminosilicato, fluorosilicato, silicato de potasio o frita de vidrio de borofosfosilicato.

En algunas realizaciones, la matriz porosa es un polímero orgánico poroso. Los polímeros orgánicos porosos de interés varían dependiendo del volumen de la muestra, los componentes de la muestra así como el reactivo de ensayo presente y pueden incluir, pero no se limitan a, polietileno poroso, polipropileno, politetrafluoroetileno (PTFE), fluoruro de polivinilideno (PVDF), acetato de etilvinilo (EVA), policarbonato, aleaciones de policarbonato, poliuretano, polietersulfona, copolímeros y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, los polímeros porosos de interés incluyen homopolímeros, heteropolímeros y copolímeros compuestos de unidades monoméricas tales como estireno, monómeros de monoalquileno alileno tales como etilestireno, a-metilestireno, viniltolueno y viniletilbenceno; ésteres (met)acrílicos tales como (met)acrilato de metilo, (met)acrilato de etilo, (met)acrilato de butilo, (met)acrilato de isobutilo, (met)acrilato de isodecilo, (met)acrilato de 2-etilhexilo, (met)acrilato de laurilo, (met)acrilato de estearilo, (met)acrilato de ciclohexilo y (met)acrilato de bencilo; monómeros que contienen cloro tales como cloruro de vinilo, cloruro de vinilideno y clorometilestireno; compuestos de acrilonitrilo tales como acrilonitrilo y metacrilonitrilo; y acetato de vinilo, propionato de vinilo, n-octadecil acrilamida, etileno, propileno y butano y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la matriz porosa es una matriz de polímero organometálico, por ejemplo, una matriz de polímero orgánico que tiene una estructura principal que contiene un metal tal como aluminio, bario, antimonio, calcio, cromo, cobre, erbio, germanio, hierro, plomo, litio, fósforo, potasio, silicio, tantalio, estaño, titanio, vanadio, zinc o circonio. En algunas realizaciones, la matriz orgánica de metal porosa es un polímero de organosiloxano que incluye, pero no se limita a, polímeros de metiltrimetoxisilano, dimetildimetoxisilano, tetraetoxisilano, metacriloxipropiltrimetoxisilano, bis(trietoxisilil)etano, bis(trietoxisilil)butano, bis(trietoxisilil)pentano, bis(trietoxisilil)hexano, bis(trietoxisilil)heptano, bis(trietoxisilil)octano y combinaciones de los mismos.

En realizaciones de la presente descripción, el componente poroso también incluye un reactivo de ensayo. Los reactivos de ensayo están presentes dentro de los poros de la matriz porosa y están configurados para mezclarse con los componentes de la muestra aplicada mientras la muestra pasa a través de la matriz porosa. Los reactivos de ensayo de interés presentes en el componente poroso pueden incluir miembros de unión específicos del analito, tales como enzimas, anticuerpos, sustratos, oxidantes, entre otros miembros de unión específicos del analito. En ciertos casos, el miembro de unión específico del analito incluye un dominio de unión. Por "unión específica" o "se une específicamente" se entiende la unión preferencial de un dominio (p. ej., un miembro de un par de unión al otro miembro del par de unión del mismo par de unión) con relación a otras moléculas o restos en una disolución o mezcla de reacción. El dominio de unión específico puede unirse (p. ej., de forma covalente o no covalente) a un epítopo específico de un analito de interés. En ciertos casos, el dominio de unión específico se une de forma no covalente a un objetivo. Por ejemplo, el acoplamiento entre el miembro de unión específico del analito y el analito diana puede caracterizarse por una constante de disociación, tal como una constante de disociación de 10-5 M o menos, 10-6 M o menos, tal como 10-7 M o menos, incluso 10-8 M o menos, p. ej., 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, 10-13 M o menos, 10-14 M o menos, 10-15 M o menos e incluso 10-16 M o menos.

Los miembros de unión específicos del analito pueden variar dependiendo del tipo de muestra biológica y componentes de interés y pueden incluir, pero no se limitan a, agentes de unión a anticuerpos, proteínas, péptidos, haptenos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos. En algunas realizaciones, el miembro de unión específico del analito es una enzima. Ejemplos de enzimas pueden incluir, pero no se limitan a, peroxidasa de rábano picante, piruvato oxidasa, oxalacetato descarboxilasa, creatinina amidohidrolasa, creatina amidinohidrolasa, sarcosina oxidasa, malato deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, FAD, TPP, P-5-P, NADH rojo amplex y combinaciones de las mismas.

En ciertas realizaciones, el miembro de unión específico de analito es un agente de unión a anticuerpos. El término "agente de unión a anticuerpos" se usa en la presente memoria en su sentido convencional para referirse a anticuerpos policlonales o monoclonales o fragmentos de anticuerpos que son suficientes para unirse a un analito de interés. Los fragmentos de anticuerpos pueden ser, por ejemplo, fragmentos Fab monoméricos, fragmentos Fab' monoméricos o fragmentos F(ab)'2 diméricos. También dentro del alcance del término "agente de unión a anticuerpos" están las moléculas producidas por ingeniería de anticuerpos, tales como las moléculas de anticuerpos de cadena única (scFv) o los anticuerpos humanizados o quiméricos producidos a partir de anticuerpos monoclonales mediante el reemplazo de las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera para producir anticuerpos quiméricos o el reemplazo tanto de las regiones constantes como de las porciones marco de las regiones variables para producir anticuerpos humanizados. En determinadas realizaciones, el miembro de unión específico del analito es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un compuesto tal como el grupo de diferenciación 14 (CD14), el grupo de diferenciación 4 (CD4), el grupo de diferenciación 45 RA (CD45RA) y el grupo de diferenciación 3 (CD3) o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el miembro de unión específico del analito se une a un marcador detectable. Puede emplearse cualquier marcador detectable adecuado, que incluye pero no se limita a, marcadores radiactivos, marcadores detectables mediante técnicas de espectroscopia tales como la resonancia magnética nuclear, así como marcadores detectables ópticamente como marcadores detectables mediante espectrometría UV-vis, espectroscopia infrarroja, espectroscopia de absorción transitoria y espectroscopia de emisión (p. ej., fluorescencia, fosforescencia, quimioluminiscencia). En ciertas realizaciones, el miembro de unión específico de analito se une a un marcador detectable ópticamente. En un ejemplo, el marcador ópticamente detectable es un fluoróforo. Ejemplos de fluoróforos pueden incluir, pero no se limitan a, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilben-2,2'disulfónico; acridina y derivados tales como acridina, naranja de acridina, amarillo de acridina, rojo de acridina e isotiocianato de acridina; acido 5-(2'-aminoetil)aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS); 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato (Lucifer Yellow VS); N-(4-anilino-1 -naftil) maleimida; antranilamida; amarillo brillante; cumarina y derivados tales como cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Coumarin 120), 7-amino-4-trifluorometilculuarina (Coumaran 151); cianina y derivados tales como cianosina, Cy3, Cy5, Cy5.5 y Cy7; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5',5"-dibromopirogalolsulfoneftaleína (rojo de bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; dietilaminocumarina; pentaacetato de dietilentriamina; ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfónico, ácido 4,4'-diisotiocianatostilbeno-2,2'-disulfónico, cloruro de 5-[dimetilamino]naftalen-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo), ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados tales como eosina e isotiocianato de eosina; eritrosina y derivados tales como eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etidio; fluoresceína y derivados tales como 5-carboxifluoresceina (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il) aminofluoresceína (DTAF), 2'7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), isotiocianato de fluoresceína (FITC), clorotriazinilo de fluoresceína, naftofluoresceína y QFITC (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; proteína verde fluorescente (GFP); proteína fluorescente de coral (RCFP); Lisamina™; Lisamina rodamina, amarillo Lucifer; isotiocianato de verde de malaquita; 4-metilumbeliferona; orto-cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Rojo del Nilo; verde Oregon; rojo Fenol; B-ficoeritrina; o-ftaldialdehído; pireno y derivados tales como pireno, butirato de pireno y butirato de succinimidil 1-pireno; rojo reactive 4 (Cibacron™ rojo brillante 3B-A); rodamina y derivados tales como 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), lisamina de 4,7-diclororrodamina, cloruro de sulfonilo rodamina B, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina X isotiocianato, sulforrodamina B, sulforrodamina 101, derivado de cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101 (rojo Texas), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), tetrametilrodamina e isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC); riboflavina; ácido rosólico y derivados de quelato de terbio; xanteno o combinaciones de los mismos, entre otros fluoróforos. En ciertas realizaciones, el fluoróforo es un colorante fluorescente tal como rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetino, pireno, difluoruro de boro dipirrometeno, naftalimida, ficobiliproteína, proteínas de clorofila de peridinio, conjugados de los mismos o una combinación de los mismos. Como se describe con mayor detalle a continuación, los fluoróforos pueden detectarse mediante máximos de emisión, dispersión de luz, coeficiente de extinción, polarización de fluorescencia, duración de la fluorescencia o combinaciones de los mismos.

La cantidad de miembro de unión específico del analito presente en el reactivo de ensayo puede variar dependiendo del volumen y tipo de muestra aplicada. En algunos casos, la cantidad de miembro de unión específico del analito es suficiente para proporcionar una concentración de miembro de unión específico del analito en la muestra presente en el canal de flujo de 0,0001 Mg/ml a 250 Mg/ml, tal como de 0,0005 Mg/ml a 240 Mg/ml, tal como de 0,001 Mg/ml a 230 Mg/ml, tal como de 0,005 Mg/ml a 220 Mg/ml, tal como de 0,01 Mg/ml a 210 Mg/ml, tal como de 0,05 Mg/ml a 200 Mg/ml, tal como de 0,1 Mg/ml a 175 Mg/ml, tal como de 0,5 Mg/ml a 150 Mg/ml e incluso una cantidad de miembro de unión específico del analito suficiente para proporcionar una concentración de miembro de unión específico del analito en la muestra presente en el canal de flujo de 1 Mg/ml a 100 Mg/ml. Por ejemplo, el peso seco del miembro de unión específico del analito presente en el componente poroso puede variar de 0,001 ng a 500 ng, tal como de 0,005 ng a 450 ng, tal como de 0,01 ng a 400 ng, tal como de 0,05 ng a 350 ng, tal como de 0,1 ng a 300 ng, tal como de 0,5 ng a 250 ng e incluso una masa seca de miembro de unión específico de analito de 1 ng a 200 ng.

En las realizaciones inventivas, el componente poroso también incluye uno o más tampones. El término "tampón" se usa en su sentido convencional para referirse a un compuesto que ayuda a estabilizar (es decir, mantener) la composición, tal como por ejemplo durante la disolución del reactivo de ensayo en la muestra aplicada. Los tampones de interés pueden contener, pero no se limitan a, proteínas, polisacáridos, sales, aglutinantes químicos y combinaciones de los mismos. Abarcados por la invención son formatos de tampón tanto líquidos como secos, por ejemplo, composiciones acuosas que incluyen los siguientes componentes o versiones deshidratadas de los mismos.

En algunas realizaciones, los tampones incluyen polisacáridos, tal como por ejemplo glucosa, sacarosa, fructosa, galactosa, manitol, sorbitol, xilitol, entre otros polisacáridos. En algunos casos, los tampones incluyen una proteína tal como BSA. En otros casos más, los tampones de interés en un aglutinante químico, que incluyen pero no se limitan a, dextranos de bajo peso molecular, ciclodextrina, polietilenglicol, éster de polietilenglicol polivinilpirrolidona (PVP) u otros polímeros hidrófilos seleccionados del grupo que consiste en ácido hialurónico, polivinilpirrolidona (PVP), copolímeros de N-vinilpirrolidona, hidroxietilcelulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, dextrano, polietilenglicol (PEG), copolímeros de bloque PEG/PPG, homo y copolímeros de ácido acrílico y metacrílico, poliuretanos, alcohol polivinílico, poliviniléteres, copolímeros basados en anhídrido maleico, poliésteres, vinilaminas, polietileniminas, óxidos de polietileno, poli(ácidos carboxílicos), poliamidas, polianhídridos, polifosfacenos y mezclas de los mismos..

En ciertas realizaciones, los tampones de interés incluyen un tampón biológico, que incluye pero no se limita a, ácido N-(2-acetamido)-aminoetanosulfónico (ACES), acetato, ácido N-(2-acetamido)-iminodiacético (ADA), ácido 2-aminoetanosulfónico (AES), amoníaco, 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP), 2-amino-2-metil-1,3-propanodiol (AMPD), ácido N-(1,1-dimetil-2-hidroxietil)-3-amino-2-hidroxipropanosulfónico (AMPSO), ácido N,N-bis-(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES), bicarbonato, N,N'-bis-(2-hidroxietil)-glicina, [Bis-(2-hidroxietil)-imino]-tris-(hidroximetilmetano) (BIS-Tris), 1,3-Bis[tris (hidroximetil)-metilamino] propano (BIS-Tris-propano), ácido bórico, ácido dimetilarsínico, albúmina de suero bovino (BSA), ácido 3-(ciclohexilamino)-propanosulfónico (CAPS), ácido 3-(ciclohexilamino)-2-hidroxi-1-propanosulfónico (CAPSO), carbonato, ácido ciclohexilaminoetanosulfónico (CHES), citrato, ácido 3-[N-bis(hidroxietil)amino]-2-hidroxipropanosulfónico (DIPSO), formiato, glicina, glicilglicina, ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-etanosulfónico (HEPES), ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-3-propanosulfónico (HEPPS, EPPS), ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-2-hidroxipropanosulfónico (HEPPSO), imidazol, malato, maleato, ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)-propanosulfónico (MOPS), ácido 3-(N-morfolino)-2-hidroxipropanosulfónico (MOPSO), fosfato, ácido piperazina-N,N'-bis(2-etanosulfónico) (PIPES), ácido piperazina-N,N'bis (2-hidroxipropanosulfónico) (POPSO), piridina, polivinilpirrolidona (PVP), succinato, ácido 3-{[N-tris (hidroximetil)-metil]-amino}-propanosulfónico (TAPS), ácido 3-[N-tris(hidroximetil)-metilamino]-2-hidroxipropanosulfónico (TAPSO), ácido 2-aminoetanosulfónico, AES (taurina), trehalosa, trietanolamina (TEA), ácido 2-[tris(hidroximetil)-metilamino]-etanosulfónico (TES), N-[Tris(hidroximetil)-metil]-glicina (tricina), Tris(hidroximetil)-aminometano (Tris), gliceraldehídos, manosa, glucosamina, manoheptulosa, sorbosa-6-fosfato, trehalosa-6-fosfato, maleimida, yodoacetatos citrato de sodio, acetato de sodio, fosfato de sodio, tartrato de sodio, succinato de sodio, maleato de sodio, acetato de magnesio, citrato de magnesio, fosfato de magnesio, acetato de amonio, citrato de amonio, fosfato de amonio, entre otros tampones.

La cantidad de cada componente tampón presente en la matriz porosa puede variar, dependiendo del tipo y tamaño de la muestra y el tipo de matriz porosa empleada (frita inorgánica, polímero orgánico poroso, como se ha descrito anteriormente) y puede variar de 0,001% a 99%. en peso, tal como de 0,005% a 95% en peso, tal como de 0,01% a 90% en peso, tal como de 0,05% a 85% en peso, tal como de 0,1% a 80% en peso, tal como de 0,5% a 75% en peso, tal como de 1% a 70% en peso, tal como de 2% a 65% en peso, tal como de 3% a 60% en peso, tal como de 4% a 55% en peso e incluso de 5% a 50% en peso. Por ejemplo, el peso seco del tampón presente en la matriz porosa puede variar de 0,001 gg a 2000 gg, tal como de 0,005 gg a 1900 gg, tal como de 0,01 gg a 1800 gg, tal como de 0,05 gg a 1700 gg, tal como de 0,1 ng a 1500 gg, tal como de 0,5 gg a 1000 gg e incluso un peso seco de tampón de 1 gg a 500 gg.

En algunas realizaciones, el peso total de tampón presente en la matriz porosa depende del volumen de huecos (es decir, el volumen dentro de los poros) de la matriz porosa y varía de 0,001 g a 5 g de tampón por ml de volumen de huecos en la matriz porosa, tal como de 0,005 g a 4,5 g, tal como de 0,01 g a 4 g, tal como de 0,05 g a 3,5 g, tal como de 0,1 g a 3 g, tal como de 0,5 g a 2,5 g e incluso de 1 g a 2 g de tampón por ml de volumen de huecos en la matriz porosa.

En un ejemplo, el tampón presente en la matriz porosa incluye albúmina de suero bovino (BSA). Donde el tampón presente en la matriz porosa incluye BSA, la cantidad de BSA varía, va de 1% al 50% en peso, tal como de 2% a 45% en peso, tal como de 3% a 40% en peso, tal como de 4% a 35% en peso e incluso de 5% a 25% en peso. Por ejemplo, el peso seco de BSA en el tampón puede variar de 0,001 gg a 2000 gg, tal como de 0,005 gg a 1900 gg, tal como de 0,01 gg a 1800 gg, tal como de 0,05 gg a 1700 gg, tal como de 0,1 ng a 1500 gg, tal como 0,5 gg a 1000 gg e incluso un peso seco de BSA de 1 gg a 500 gg.

En otro ejemplo, el tampón presente en la matriz porosa incluye polivinilpirrolidona (PVP). Donde el tampón presente en la matriz porosa incluye PVP, la cantidad de PVP varía, va de 0,01% a 10% en peso, tal como de 0,05% a 9% en peso, tal como de 0,1% a 8% en peso, tal como de 0,5% a 7% en peso e incluso de 1% a 5% en peso. Por ejemplo, el peso seco de PVP en el tampón puede variar de 0,001 gg a 2000 gg, tal como de 0,005 gg a 1900 gg, tal como de 0,01 gg a 1800 gg, tal como de 0,05 gg a 1700 gg, tal como de 0,1 ng a 1500 gg, tal como de 0,5 gg a 1000 gg e incluso un peso seco de PVP de 1 gg a 500 gg.

En otro ejemplo más, el tampón presente en la matriz porosa incluye trehalosa. Donde el tampón presente en la matriz porosa incluye trehalosa, la cantidad de trehalosa varía, va de 0,001% a 99% en peso, tal como de 0,005% a 95% en peso, tal como de 0,01% a 90% en peso, tal como de 0,05% a 85% en peso, tal como de 0,1% a 80% en peso, tal como de 0,5% a 75% en peso, tal como de 1 % a 70% en peso, tal como de 2% a 65% en peso, tal como de 3% a 60% en peso, tal como de 4% a 55% en peso e incluso de 5% a 50% en peso. Por ejemplo, el peso seco de trehalosa en el tampón puede variar de 0,001 gg a 2000 gg, tal como de 0,005 gg a 1900 gg, tal como de 0,01 gg a 1800 gg, tal como de 0,05 gg a 1700 gg, tal como de 0,1 ng a 1500 gg, tal como 0,5 gg a 1000 gg e incluso un peso seco de trehalosa de 1 gg a 500 gg.

En ciertas realizaciones, el tampón presente en la matriz porosa incluye BSA, trehalosa y polivinilpirrolidona. Por ejemplo, el tampón puede incluir BSA, trehalosa y polivinilpirrolidona en una relación en peso de BSA: trehalosa: PVP que varía de 1: 1: 1 y 25: 100: 1 En ciertos casos, la relación en peso de BSA: trehalosa: PVP es 21: 90: 1.

En algunas realizaciones, los tampones pueden incluir además uno o más agentes complejantes. Un "agente complejante" se usa en su sentido convencional para referirse a un agente que ayuda en la mezcla de la muestra con el reactivo de ensayo y también puede servir para inmovilizar iones (p. ej., hierro u otros iones) y prevenir la formación de precipitados durante la mezcla. Un agente complejante puede ser un agente que es capaz de formar complejos con un ión metálico. En algunos casos, el agente complejante es un agente quelante, tal como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentacético (DTPA), ácido nitrolotriacético (NTA), etilendiaminediacetato (EDDA), ácido etilendiaminedi(o-hidroxifenilacético) (EDDHA), ácido hidroxietiletilendiaminotriacético (HEDTA), ácido ciclohexano diamino tetraacético (CDTA), ácido etilenglicol-bis-(betaaminoetiléter) N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), ácido 2,3-dimercaptopropanol-1-sulfónico (DMPS) y ácido 2,3-dimercaptosuccínico (DMSA) y similares. También se pueden emplear agentes quelantes de origen natural. Por agente quelante de origen natural se entiende que el agente quelante es un agente quelante que se encuentra en la naturaleza, es decir, no un agente que se sintetizó por primera vez mediante intervención humana. El agente quelante de origen natural puede ser un agente quelante de bajo peso molecular, donde por agente quelante de bajo peso molecular se entiende que el peso molecular del agente quelante no excede aproximadamente 200 daltons. En ciertas realizaciones, el peso molecular del agente quelante es mayor que aproximadamente 100 dalton. En algunas realizaciones, los reactivos de ensayo de interés incluyen ácido etilendiaminotetraacetático (EDTA). Donde está presente un agente quelante en la matriz porosa, la cantidad de agente quelante puede variar de 0,001% a 10% en peso, tal como de 0,005% a 9,5% en peso, tal como de 0,01% a 9% en peso, tal como de 0,05% a 8,5% en peso, como de 0,1% a 8% en peso, tal como de 0,5% a 7,5% en peso e incluso de 1% a 7% en peso. Por ejemplo, el peso seco del agente quelante en el reactivo de ensayo puede variar de 0,001 gg a 2000 gg, tal como de 0,005 gg a 1900 gg, tal como de 0,01 gg a 1800 gg, tal como de 0,05 gg a 1700 gg, tal como de 0,1 ng a 1500 gg, tal como de 0,5 gg a 1000 gg e incluso un peso seco de agente quelante de 1 gg a 500 gg.

Toda o parte de la matriz porosa puede contener el reactivo de ensayo y los componentes tampón. Por ejemplo, el 5% o más de la matriz porosa puede contener reactivo de ensayo y componentes tampón, tal como 10% o más, tal como 25% o más, tal como 50% o más, tal como 75% o más, tal como 90 % o más, tal como 95% o más e incluso 99% o más. En ciertas realizaciones, toda la matriz porosa contiene reactivo de ensayo y componentes tampón. El reactivo de ensayo y los componentes tampón pueden distribuirse homogéneamente a lo largo de toda la matriz porosa o pueden colocarse en ubicaciones discretas dentro de la matriz porosa, o alguna combinación de los mismos. Por ejemplo, en un ejemplo, el reactivo de ensayo y los componentes tampón se distribuyen homogéneamente a lo largo de toda la matriz porosa. En otro ejemplo, el reactivo del ensayo y los componentes tampón se colocan en ubicaciones discretas en la matriz porosa, tal como en incrementos discretos de cada 0,1 mm o más, como 0,5 mm o más, tal como 1 mm o más e incluso el posicionamiento de la matriz porosa a cada 2 mm o más de la matriz porosa. En otro ejemplo más, el reactivo de ensayo y los componentes tampón pueden distribuirse homogéneamente a lo largo de una primera mitad de la matriz porosa y en incrementos discretos a lo largo de una segunda mitad de la matriz porosa. En ciertas realizaciones, el reactivo del ensayo y los componentes tampón se colocan en la matriz porosa como un gradiente, donde la cantidad de reactivo del ensayo y los componentes tampón aumentan desde un extremo proximal (p. ej., más cerca del sitio de aplicación de la muestra) hasta el extremo distal (p. ej., más cerca del canal de flujo). En un caso, la cantidad de reactivo de ensayo aumenta linealmente a lo largo de la trayectoria del flujo de la muestra a través de la matriz porosa. En otro caso, la cantidad de reactivo de ensayo y componentes tampón aumenta exponencialmente a lo largo de la trayectoria del flujo de la muestra a través de la matriz porosa.

Los reactivos de ensayo y los componentes tampón pueden estar presentes en el componente poroso en cualquier estado físico adecuado, tal como un líquido, un sólido seco o pueden estar liofilizados. En algunas realizaciones, los reactivos de ensayo y los componentes tampón están presentes como un sólido seco. En otras realizaciones, los reactivos de ensayo y los componentes tampón se liofilizan. Todos o parte de los reactivos del ensayo y los componentes tampón pueden estar en el mismo estado físico. Por ejemplo, el 5% o más de los reactivos de ensayo y los componentes tampón pueden estar presentes en la matriz porosa como un sólido seco, tal como el 10% o más, tal como el 25% o más, tal como el 50% o más, tal como el 75% o más, tal como 90% o más e incluso 95% o más de los reactivos de ensayo y componentes tampón. En algunas realizaciones, el 5% o más de los reactivos de ensayo y los componentes tampón están liofilizados, tal como el 10% o más, tal como el 25% o más, tal como el 50% o más, tal como el 75% o más, tal como el 90% o más e incluso donde el 95% o más de los reactivos de ensayo y los componentes tampón están liofilizados.

En las realizaciones de la presente descripción, se coloca un canal de flujo adyacente al componente poroso y en comunicación fluida con la muestra mezclada con el reactivo de ensayo y los componentes tampón en la matriz porosa. Como se analiza con mayor detalle a continuación, la muestra se puede pasar y mezclar con el reactivo de ensayo en la matriz porosa mediante una fuerza (p. ej., fuerza centrífuga, fuerza electrostática, acción capilar) y en el canal de flujo. En algunas realizaciones, el canal de flujo es un canal alargado encerrado por una o más paredes. Dependiendo del tamaño de la muestra, el canal de flujo puede variar. En algunas realizaciones, el canal de flujo es lineal. En otras realizaciones, el canal de flujo no es lineal. Por ejemplo, el canal de flujo puede ser curvilíneo, circular, sinuoso, retorcido o tener una configuración helicoidal.

La longitud del canal de flujo puede variar, va de 10 mm a 1000 mm, tal como de 15 mm a 950 mm, tal como de 20 mm a 900 mm, tal como de 20 mm a 850 mm, tal como de 25 mm a 800 mm, tal como de 30 mm a 750 mm, tal como de 35 mm a 700 mm, tal como de 40 mm a 650 mm, tal como de 45 mm a 600 mm, tal como de 50 mm a 550 mm e incluso de 100 mm a 500 mm.

En las realizaciones, la forma de la sección transversal del canal de flujo puede variar, donde los ejemplos de formas de la sección transversal incluyen, pero no se limitan a, formas de sección transversal rectilíneas, por ejemplo, cuadrados, rectángulos, trapezoides, triángulos, hexágonos, etc., formas de sección transversal curvilíneas, por ejemplo, círculos, óvalos, etc., así como formas irregulares, por ejemplo, una parte inferior parabólica unida a una parte superior plana, etc. En realizaciones, las dimensiones de la sección transversal del canal de flujo pueden variar, que van de 0,01 mm a 25 mm, tal como de 0,05 mm a 22,5 mm, tal como de 0,1 mm a 20 mm, tal como de 0,5 mm a 17,5 mm, tal como de 1 mm a 15 mm, tal como de 2 mm a 12,5 mm, tal como de 3 mm a 10 mm e incluso de 5 mm a 10 mm. Por ejemplo, donde el canal de flujo es cilíndrico, el diámetro del canal de flujo puede variar de 0,01 mm a 25 mm, tal como de 0,05 mm a 22,5 mm, tal como de 0,1 mm a 20 mm, tal como de 0,5 mm a 15 mm, tal como de 1 mm a 10 mm e incluso de 3 mm a 5 mm.

La relación de la longitud a la altura de la sección transversal puede variar, va de 2 a 5000, tal como de 3 a 2500, tal como de 4 a 2000, tal como de 5 a 1500, tal como de 10 a 1000, tal como de 15 a 750 e incluso de 25 a 500. En algunos casos, la relación de la longitud a la altura de la sección transversal es 10. En otros casos, la relación de la longitud a la altura de la sección transversal es 15. En otros casos, la relación de la longitud a la altura de la sección transversal es 25.

En algunas realizaciones, el canal de flujo está configurado para tener una altura de sección transversal que es sustancialmente equivalente a las dimensiones del analito diana. Por "sustancialmente equivalente" a las dimensiones del analito diana se entiende que una o más de la altura o el ancho del canal de flujo difiere del tamaño del analito diana en un 5% o menos, tal como 4% o menos, tal como 3% o menos, tal como 2% o menos, tal como 1% o menos, tal como 0,5% o menos, tal como 0,1% o menos e incluso 0,01% o menos. En estas realizaciones, las dimensiones de la sección transversal del canal de flujo son sustancialmente las mismas que el tamaño del analito diana y los analitos diana están configurados para fluir a través del canal de flujo un analito a la vez. En ciertos casos, el analito diana son células, tales como glóbulos blancos o glóbulos rojos. En algunas realizaciones, el canal de flujo está configurado para tener una altura de sección transversal sustancialmente equivalente al diámetro de un glóbulo rojo. En otras realizaciones, el canal de flujo está configurado para tener una altura de sección transversal que es sustancialmente equivalente al diámetro de un glóbulo blanco.

En las realizaciones de la presente descripción, el canal de flujo es una estructura configurada para recibir y retener una muestra que tiene un volumen que va de 5 gl a 5000 gl, tal como de 10 gl a 4000 gl, tal como de 15 gl a 3000 gl, tal como de 20 gl a 2000 gl, tal como de 25 gl a 1000 gl, tal como de 30 gl a 500 gl, tal como de 40 gl a 400 gl, tal como de 50 gl a 300 gl e incluso de 75 gl a 250 gl.

En algunas realizaciones, el canal de flujo es un canal capilar y está configurado para mover una muestra líquida a través del canal de flujo mediante una acción capilar. El término "acción capilar" se usa en esta memoria en su sentido convencional para referirse al movimiento de un líquido por fuerzas intermoleculares entre el líquido (es decir, cohesión) y las paredes circundantes (es decir, adhesión) de un canal estrecho sin la ayuda de (y a veces en oposición a) la gravedad. En estas realizaciones, el ancho de la sección transversal del canal de flujo es suficiente para proporcionar la acción capilar de la muestra en el canal de flujo y puede tener un ancho que va de 0,1 mm a 20 mm, tal como de 0,5 mm a 15 mm, tal como de 1 mm a 10 mm e incluso de 3 mm a 5 mm.

En algunas realizaciones, el canal de flujo incluye una o más paredes ópticamente transmisivas. Por "ópticamente transmisiva" se entiende que las paredes del canal de flujo permiten la propagación de una o más longitudes de onda de luz a través de ellas. En algunas realizaciones, las paredes del canal de flujo son ópticamente transmisivas a una o más de luz ultravioleta, luz visible y luz del infrarrojo cercano. En un ejemplo, el canal de flujo es ópticamente transmisivo a la luz ultravioleta. En otro ejemplo, el canal de flujo es ópticamente transmisivo a la luz visible. En otro ejemplo más, el canal de flujo es ópticamente transmisivo a la luz del infrarrojo cercano. En otro ejemplo más, el canal de flujo es transmisivo de luz ultravioleta y luz visible. En otro ejemplo más, el canal de flujo es transmisivo a la luz visible y a la luz del infrarrojo cercano. En otro ejemplo más, el canal de flujo es transmisivo a la luz ultravioleta, luz visible y luz infrarroja cercana. Dependiendo de las propiedades transmisivas deseadas de las paredes del canal de flujo, la pared ópticamente transmisiva puede ser de cualquier material adecuado, tal como cuarzo, vidrio o polímero, que incluye pero no se limita a, polímeros ópticamente transmisivos tal como acrílicos, acrílicos/estirenos, polímeros de cicloolefinas, policarbonatos, poliésteres y poliestirenos, entre otros polímeros ópticamente transmisivos.

En las realizaciones de la presente descripción, el sitio de aplicación de la muestra del dispositivo microfluídico es una estructura configurada para recibir una muestra que tiene un volumen que va de 5 gl a 1000 gl, tal como de 10 gl a 900 gl, tal como de 15 gl a 800. gl, tal como de 20 gl a 700 gl, tal como de 25 gl a 600 gl, tal como de 30 gl a 500 gl, tal como de 40 gl a 400 gl, tal como de 50 gl a 300 gl e incluso de 75 gl a 250 gl. El sitio de aplicación de la muestra puede tener cualquier forma conveniente, siempre y cuando proporcione acceso para el fluido, o directamente o a través de un componente intermedio que proporcione comunicación fluídica al canal de flujo. En algunas realizaciones, el sitio de aplicación de la muestra es plano. En otras realizaciones, el sitio de aplicación de la muestra es cóncavo, tal como en forma de un cono invertido que termina en el orificio de entrada de la muestra. Dependiendo de la cantidad de muestra aplicada y la forma del sitio de aplicación de la muestra, el sitio de aplicación de la muestra puede tener un área superficial que va de 0,01 mm2 a 1000 mm2, tal como de 0,05 mm2 a 900 mm2, tal como de 0,1 mm2 a 800 mm2, tal como de 0,5 mm2 a 700 mm2, tal como de 1 mm2 a 600 mm2, tal como de 2 mm2 a 500 mm2 e incluso de 5 mm2 a 250 mm2.

La entrada del dispositivo microfluídico está en comunicación fluídica con el sitio de aplicación de la muestra y el canal de flujo y puede tener cualquier forma adecuada, donde las formas de sección transversal de las entradas de interés incluyen, pero no se limitan a: formas de sección transversal rectilínea, por ejemplo, cuadrados , rectángulos, trapezoides, triángulos, hexágonos, etc., formas de sección transversal curvilínea, por ejemplo, círculos, óvalos, etc., así como formas irregulares, por ejemplo, una parte inferior parabólica unida a una parte superior plana. Las dimensiones del orificio de la boquilla pueden variar, en algunas realizaciones van de 0,01 mm a 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, tal como de 0,1 mm a 80 mm, tal como de 0,5 mm a 70 mm, tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm e incluso de 5 mm a 25 mm. En algunas realizaciones, la entrada es un orificio circular y el diámetro de la entrada varía de 0,01 mm a 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, tal como de 0,1 mm a 80 mm, tal como de 0,5 mm a 70 mm, tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm e incluso de 5 mm a 25 mm. En consecuencia, dependiendo de la forma de la entrada, el orificio de entrada de la muestra puede tener una abertura que varía de 0,01 mm2 a 250 mm2, tal como de 0,05 mm2 a 200 mm2, tal como de 0,1 mm2 a 150 mm2, tal como de 0,5 mm2 a 100 mm2, tal como de 1 mm2 a 75 mm2, tal como de 2 mm2 a 50 mm2 e incluso de 5 mm2 a 25 mm2.

En algunas realizaciones, los dispositivos microfluídicos objeto incluyen un canal de ventilación. Los canales de ventilación de interés pueden tener una variedad de configuraciones diferentes y están configurados para unir en comunicación fluida una salida de ventilación (p. ej., colocada adyacente al sitio de aplicación de la muestra) con el extremo distal del canal de flujo (es decir, el más alejado del sitio de aplicación de la muestra). El canal de ventilación puede ser una estructura alargada, similar a las descritas anteriormente para el canal de flujo, que incluye una configuración que tiene una longitud que es mayor que su ancho. Mientras la relación de largo a ancho puede variar, en algunos casos la relación de largo a ancho varía de 5 a 2000, tal como de 10 a 200, e incluye de 50 a 60. En algunos casos, la longitud del canal de ventilación varía de 5 a 200, tal como 10 a 100 e incluso 50 a 75 mm. En algunos casos, los canales de ventilación de interés tienen una dimensión de sección transversal larga de tamaño micrométrico, por ejemplo, una dimensión de sección transversal más larga (por ejemplo, el diámetro en el caso del canal tubular) que va de 0,1 a 10, tal como 0,5 a 5 e incluso 1 a 2 mm. En algunos casos, la anchura del canal de ventilación varía de 0,1 a 10, tal como de 0,5 a 5 e incluso de 1 a 2 mm. En algunos casos, la altura del canal varía de 0,5 a 5, tal como de 0,2 a 2 e incluso de 0,5 a 1 mm. La forma de la sección transversal de los canales de ventilación puede variar, en algunos casos, las formas de la sección transversal de los canales de ventilación de interés incluyen, pero no se limitan a: formas de sección transversal rectilíneas, por ejemplo, cuadrados, rectángulos, trapecios, triángulos, hexágonos , etc., formas de sección transversal curvilínea, por ejemplo, círculos, óvalos, etc., así como formas irregulares, por ejemplo, una parte inferior parabólica unida a una parte superior plana. En las realizaciones, las dimensiones de la sección transversal del canal de ventilación pueden variar, van de 0,01 mm a 25 mm, tal como de 0,05 mm a 22,5 mm, tal como de 0,1 mm a 20 mm, tal como de 0,5 mm a 17,5 mm, tal como de 1 mm a 15 mm, tal como de 2 mm a 12,5 mm, tal como de 3 mm a 10 mm e incluso de 5 mm a 10 mm. Por ejemplo, donde el canal de ventilación es cilíndrico, el diámetro del canal de ventilación puede variar de 0,01 mm a 25 mm, tal como de 0,05 mm a 22,5 mm, tal como de 0,1 mm a 20 mm, tal como de 0,5 mm a 15 mm, tal como de 1 mm a 10 mm e incluso de 3 mm a 5 mm.

Donde los dispositivos microfluídicos objeto incluyen un canal de ventilación, el canal de flujo puede estar separado del canal de ventilación por una región hidrófoba. Por región hidrófoba se entiende una región o dominio que es resistente a ser mojado por agua, por ejemplo, repele medios acuosos. La región hidrófoba puede ser una que tenga una energía superficial que es menor que la energía superficial de las superficies del canal capilar. La magnitud de la diferencia en las energías superficiales puede variar, va en algunos casos de 5 a 500, tal como de 10 a 30 dinas/cm. La energía superficial de la región hidrófoba también puede variar, en algunos casos va de 20 a 60, tal como 30 a 45 dinas/cm, por ejemplo, según se mide usando el protocolo descrito en ASTM Std. D2578. Las dimensiones de la región hidrófoba están configuradas para, al menos parcialmente, si no completamente, impedir el flujo de líquido de la muestra más allá de la región hidrófoba. Las dimensiones de la región hidrófoba pueden variar, en algunos casos con un área superficial que va de 0,01 mm2 a 100 mm2, tal como de 0,05 mm2 a 90 mm2, tal como de 0,1 mm2 a 80 mm2, tal como de 0,5 mm2 a 75 mm2 e incluso de1 mm2 a 50 mm2.

Con referencia a la Figura 1, se muestra un dispositivo microfluídico para analizar una muestra según ciertas realizaciones, tal como con un aparato de formación de imágenes como se describe en Goldberg, publicación de patente de EE.UU. 2008/0212069. La Figura 1 representa un ejemplo de un dispositivo microfluídico que tiene un sitio de aplicación de la muestra (1), un componente poroso (elemento poroso 2) y un canal de flujo (por ejemplo, un canal capilar 3). Como se muestra en la Figura 1, el dispositivo microfluídico también incluye una unión hidrófoba (4) y un canal de ventilación (5). Para visualizar la muestra en el canal de flujo, este ejemplo representa un canal de flujo que tiene una pared ópticamente transmisiva (6). El sitio de aplicación de la muestra está configurado para recibir una muestra de fluido, tal como un fluido biológico (por ejemplo, sangre, saliva, suero, semen, plasma o similares). En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de sangre. Como se analizó anteriormente, el sitio de aplicación de la muestra está en comunicación fluida con el componente poroso de una manera que dirige la muestra de una muestra a través del componente poroso. El componente poroso puede disponerse en una cámara o canal de tal manera que la muestra se dirija a través del elemento poroso. El elemento poroso puede estar al ras con las paredes del dispositivo microfluídico dispuestas o en una cámara ajustada en el dispositivo o a lo largo de un capilar u otro canal. En algunas realizaciones, el sitio de aplicación de la muestra y el componente poroso están configurados de una manera que proporciona el flujo de una muestra desde el sitio de aplicación de la muestra a través de la matriz porosa del componente poroso y el canal capilar mediante una fuerza capilar, pero son posibles otros medios de movimiento de la muestra. La fuerza centrífuga, la fuerza electrostática o cualquier otra fuerza puede usarse sola o en conjunto con la fuerza capilar para transmitir la muestra a través del elemento poroso. El sitio de aplicación de la muestra puede soportar la aplicación de una muestra dispensada por cualquier medio, tal como una pipeta o directamente de un organismo, como a través de una muestra de sangre con una punción digital de un humano.

En algunas realizaciones, el componente poroso incluye una frita porosa formada de una pluralidad de microcanales que sirven como una matriz para una mezcla de ensayo. Como se ha descrito anteriormente, los microcanales pueden formar un volumen de huecos en la frita que está entre el 40 y el 60% del volumen total de la frita. En algunas realizaciones, la frita puede ocupar un volumen de aproximadamente 10 gl y el volumen de huecos total puede estar entre 4 y 6 gl. En algunas realizaciones, los poros son tan estrechos como sea posible para proporcionar un área superficial suficiente para la suspensión de reactivo seco y un camino tortuoso para mezclar, sin filtrar células u otros objetos de hasta 15-20 micrómetros. La mezcla de ensayo puede secarse o conservarse de otro modo dentro del volumen de huecos de la frita y puede comprender componentes tampón y uno o más reactivos tales como una etiqueta detectable que se une a una o más dianas o analitos en la muestra. Los componentes tampón pueden proporcionar una velocidad de disolución uniforme del reactivo en la muestra durante un período de tiempo definido. Los componentes tampón pueden comprender cualquier combinación de una proteína, azúcar y/o un aglutinante químico. El componente proteico puede ser una albúmina tal como albúmina de suero bovino (BSA). El azúcar puede ser cualquier azúcar, tal como un mono, di o polisacárido. Por ejemplo, sacarosa, manitol, trehalosa (tal como D+ trehalosa) pueden estabilizar biomoléculas u otros reactivos en la frita porosa y proporcionar protección a reactivos tales como biomoléculas. En el desarrollo de reactivos liofilizados o conservados, se pueden añadir proteínas o azúcares (sacáridos y polioles) a la formulación para mejorar la estabilidad y proporcionar una disolución uniforme de los reactivos u otras biomoléculas y, además, prolongar la vida útil de los reactivos en el dispositivo.

Se pueden usar dextrano de bajo peso molecular, ciclodextrina, polietilenglicol, éster de polietilenglicol polivinilpirrolidona (PVP) u otros polímeros hidrófilos seleccionados del grupo que consiste en ácido hialurónico, polivinilpirrolidona (PVP), copolímeros de N-vinilpirrolidona, hidroxietilcelulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa dextrano, polietilenglicol (PEG), copolímeros de bloque PEG/PPG, homo- y copolímeros de ácido acrílico y metacrílico, poliuretanos, alcohol polivinílico, éteres polivinílicos, copolímeros a base de anhídrido maleico, poliésteres, vinilaminas, polietileniminas, óxidos de polietileno, poli(ácidos carboxílicos), poliamidas, polianhídridos, polifosfacenos y mezclas de los mismos para estabilizar el reactivo y ayudar en la disolución continua del reactivo en la muestra.

Los componentes tampón se pueden ensamblar en la proporción y concentración apropiadas para proporcionar la disolución continua de un reactivo en una muestra. La cantidad total de componentes tampón puede depender del volumen de huecos de la frita porosa. En algunas realizaciones, el peso combinado de los componentes tampón (por ejemplo, BSA, trehalosa y PVP) puede estar entre 0,01 y 2 gramos por pl de volumen de huecos de frita, tal como 0,1 gramos/pl de volumen de huecos. En algunas realizaciones, los componentes tampón de esta invención pueden contener una relación en peso de BSA: trehalosa: PVP que es del orden de 21: 90: 1. La relación en peso de los componentes tampón puede variar tanto como 5, 10 o 20% siempre que se mantenga la propiedad de disolución uniforme del reactivo en una muestra líquida durante un período de tiempo predeterminado. El período de tiempo predeterminado puede ser del orden de segundos o minutos, tal como entre 5 segundos y 5 minutos o entre 20 segundos y 3 minutos, o entre 1 y 2 minutos durante los cuales se mantiene una disolución uniforme del reactivo en la muestra. Esto proporciona una uniformidad mejorada de la distribución del reactivo no unido en la muestra a través del canal capilar y la interrogación de la muestra. La concentración de reactivo sin reaccionar normalmente puede desviarse en menos del 1%, 5%, 10%, 20% o 50% a lo largo del curso del canal capilar. En algunas realizaciones, los componentes tampón pueden contener componentes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) o similares o cualquier otro material útil para mantener la estabilidad de la muestra o reactivos durante el curso del ensayo. La mezcla de ensayo puede comprender enzimas, sustratos, catalizadores o cualquier combinación de los mismos para la reacción con la muestra (p. ej., peroxidasa de rábano picante, piruvato oxidasa, oxalacetato descarboxilasa, creatinina amidohidrolasa, creatina amidinohidrolasa, sarcosina oxidasa, malato deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, FAD, TPP, P-5-P, NADH, rojo amplex). Se pueden usar otros componentes de la mezcla de ensayo para regular el pH, la velocidad de disolución o la estabilidad de la muestra y/o la mezcla de ensayo (por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa). Mientras la muestra fluye a través del elemento poroso, los microcanales proporcionan la mezcla de la muestra y el reactivo, mientras que la velocidad de disolución uniforme del reactivo proporciona una distribución sustancialmente uniforme del reactivo sin reaccionar a medida que fluye fuera de la matriz porosa hacia el flujo canal.

Como se analizó anteriormente, los reactivos de ensayo pueden incluir cualquier material capaz de reaccionar o unirse a un analito en una muestra biológica según se desee. En algunas realizaciones, el reactivo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a componentes de la muestra, como un objetivo específico de la superficie celular en la muestra. Puede haber uno o más reactivos distintos en la mezcla de ensayo. En algunas realizaciones, el anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo pueden unirse específicamente a dianas celulares tales como CD14, CD4, CD45RA, CD3 o cualquier combinación de los mismos. El anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo se pueden conjugar con un tinte u otro marcador detectable, tal como un tinte fluorescente o partícula magnética. En algunas realizaciones, el marcador detectable es un colorante seleccionado del grupo que comprende rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetina, pireno, difluoruro de boro dipirrometeno, naftalimida, ficobiliproteína, proteínas de clorofila de peridinio, conjugados de los mismos y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el tinte puede ser ficoeritrina (PE), ficoeritrina-cianina 5, (PE-cy5) o aloficocianina (APC). El marcador detectable puede ser magnético, fosforescente, fluorescente u ópticamente activo de cualquier forma.

Como se representa en la Figura 1, los dispositivos microfluídicos de interés según ciertas realizaciones incluyen una cámara capilar que tiene una geometría plana con grandes dimensiones de ancho y largo y una altura o (a) sustancialmente equivalente a la profundidad de campo de una lente objetivo de un detector, o (b) apenas un poco más grande que las células que se analizarán en una muestra. La muestra puede interrogarse ópticamente a través de una o más paredes transmisivas en el dispositivo microfluídico. La distribución uniforme del reactivo sin reaccionar en la muestra proporciona observaciones mejoradas de la señal de fondo a lo largo de la pared transmisiva. Esto proporciona beneficiosamente una detección más fácil del reactivo unido a medida que se observan concentraciones de señal detectable por encima del fondo.

Otro ejemplo de un dispositivo microfluídico (100) se ilustra con mayor detalle en las Figs. 2A y 2B e incluyen un sitio de aplicación de la muestra 10 en comunicación fluídica con un componente poroso 20 y un canal de flujo 30. En esta realización, el canal de flujo incluye una pared ópticamente transmisiva 40. La parte de frita del componente poroso puede prepararse a partir de cualquier material adecuado tal como plástico (por ejemplo, polietileno, polipropileno, politetrafluoroetileno, fluoruro de polivinilideno, acetato de etilvinilo, policarbonato, aleaciones de policarbonato, poliuretano, polietersulfona o cualquier combinación de los mismos), como se analizó anteriormente. En algunas realizaciones, la matriz porosa es polietileno de alta densidad. La matriz porosa puede ser un sólido de cualquier tamaño o forma que llene una región entre el canal de flujo y el sitio de aplicación. El elemento poroso puede estar dispuesto en una cámara distinta o simplemente ocupando una región del canal capilar. Las dimensiones externas de la frita porosa están diseñadas en sintonía con el dispositivo general, por lo que la frita porosa cabe perfectamente en el dispositivo general y, esencialmente, ninguna muestra pasa alrededor de la frita porosa. En algunas realizaciones, la frita porosa está integrada como parte del canal de flujo. La frita porosa puede ser un material sólido que consta de una serie de microcanales y que tenga un volumen vacío de entre el 25 y el 75%, tal como el 40-60% o el 45-55%. Los microcanales pueden proporcionar la mezcla de la mezcla de ensayo y una muestra a través de una pluralidad de caminos tortuosos. En algunas realizaciones, el diámetro medio de los poros a través de los microcanales puede estar entre 5 y 200 micrones, tal como entre 30 y 60 micrones; y el volumen medio de huecos puede ser 40-60% del volumen total de frita. El diámetro medio y el camino tortuoso de los microcanales pueden proporcionar beneficiosamente la mezcla de la muestra y el reactivo, mientras que permite que la muestra fluya a través del elemento poroso sustancialmente sin filtrar. El dispositivo puede utilizar cualquier fuerza tal como la gravedad o la fuerza centrífuga además de la fuerza capilar para proporcionar movimiento de la muestra a través del canal de flujo.

Donde los dispositivos microfluídicos en cuestión emplean acción capilar, los dispositivos microfluídicos lo hacen porque las superficies de flujo son hidrófilas y la humectación de las superficies es energéticamente favorable. Tales dispositivos requieren que la muestra entrante desplace el aire residente en el dispositivo. Es deseable que tanto la muestra aplicada así como el aire ventilado estén contenidos dentro del cartucho para proteger a los usuarios de material potencialmente biopeligroso. En algunas realizaciones de la presente descripción, se puede utilizar en el dispositivo cualquier combinación de las siguientes características. Por ejemplo, el canal capilar o el sitio de aplicación de la muestra puede incluir una cámara de mezcla donde los reactivos conservados pueden ubicarse separados del canal capilar. Las dimensiones del canal capilar pueden afectar la formación de imágenes y el flujo de la muestra en el dispositivo. En algunas realizaciones, el canal puede tener entre 2 y 10 mm de ancho, tal como entre 3 y 5 mm o entre 3 y 4 mm de ancho. En algunas realizaciones, el canal capilar puede tener una profundidad de entre 1 y 1000 micrones de profundidad, tal como entre 20 y 60 micrones de profundidad o entre 40 y 60 micrones de profundidad. Las profundidades menores que 60 micrones pueden proporcionar beneficiosamente la obtención de imágenes de glóbulos blancos en una muestra de sangre completa minimizando los efectos de oscurecimiento de los glóbulos rojos. El canal capilar puede tener cualquier longitud que proporcione flujo capilar a lo largo de un canal. En algunas realizaciones, el canal capilar puede tener entre 10 y 100 mm de longitud.

Como se analizó anteriormente, el dispositivo es adecuado para ensayos para detectar analitos en una muestra que comprende un fluido biológico, tal como orina, saliva, plasma, sangre, en particular, sangre completa. Los componentes específicos de la muestra pueden marcarse de forma distinguible utilizando tintes fluorescentes que se distingan entre sí. De esta manera, los componentes se pueden distinguir por sus emisiones fluorescentes.

Métodos para analizar una muestra

Los aspectos de la descripción también incluyen métodos para analizar una muestra. Como se analizó anteriormente, el término "ensayo" se usa en la presente memoria en su sentido convencional para referirse a evaluar cualitativamente o medir cuantitativamente la presencia o cantidad de una especie de analito diana. Se puede analizar una variedad de muestras diferentes mediante los métodos objeto. En algunos casos, la muestra es una muestra biológica. El término "muestra biológica" se usa en su sentido convencional para incluir un organismo completo, una planta, un hongo o un subconjunto de tejidos, células o componentes animales que, en ciertos casos, pueden encontrarse en sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, lavado broncoalveolar, líquido amniótico, sangre del cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen. Como tal, una "muestra biológica" se refiere tanto al organismo nativo o un subconjunto de sus tejidos así como a un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir del organismo o un subconjunto de sus tejidos, que incluye pero no se limita a, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, secciones de la piel, tractos respiratorio, gastrointestinal, cardiovascular y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos. Las muestras biológicas pueden incluir cualquier tipo de material orgánico, que incluye componentes tanto sanos como enfermos (por ejemplo, cancerosos, malignos, necróticos, etc.). En ciertas realizaciones, la muestra biológica es una muestra líquida, tal como sangre completa o derivado de la misma, plasma, lágrimas, sudor, orina, semen, etc., donde en algunos casos la muestra es una muestra de sangre, que incluye sangre completa, tal como sangre obtenida por punción venosa o punción digital (donde la sangre puede o no combinarse con reactivos antes del ensayo, tal como conservantes, anticoagulantes, etc.).

En ciertas realizaciones, la fuente de la muestra es un "mamífero", donde este término se usa ampliamente para describir organismos que están dentro de la clase mammalia, que incluye los órdenes carnívoros (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo, ratones, conejillos de indias y ratas) y primates (por ejemplo, humanos, chimpancés y monos). En algunos casos, los sujetos son humanos. Pueden obtenerse muestras biológicas de interés de sujetos humanos de ambos géneros y en cualquier etapa de desarrollo (es decir, recién nacidos, bebés, jóvenes, adolescentes, adultos), donde en ciertas realizaciones el sujeto humano es un joven, un adolescente o un adulto. Mientras la presente descripción se puede aplicar a muestras de un sujeto humano, debe entenderse que los métodos del sujeto se pueden emplear para analizar muestras de otros sujetos animales no humanos tales como, pero no se limitan a, aves, ratones, ratas, perros, gatos, ganado y caballos.

En las realizaciones, la cantidad de muestra analizada en los métodos objeto puede variar, por ejemplo, va de 0,01 |ul a 1000 |ul, tal como de 0,05 |ul a 900 |ul, tal como de 0,1 |ul a 800 |ul, tal como de 0,5 |ul a 700 |ul, tal como de 1 |ul a 600 |ul, tal como de 2,5 |ul a 500 |ul, tal como de 5 |ul a 400 |ul, tal como de 7,5 |ul a 300 |ul e incluso de 10 |ul a 200 |ul de muestra.

La muestra se puede aplicar al sitio de aplicación de la muestra usando cualquier protocolo conveniente, por ejemplo, mediante gotero, pipeta, jeringa y similares. La muestra puede aplicarse en conjunto o incorporarse en una cantidad de un líquido adecuado, por ejemplo, tampón, para proporcionar un flujo de fluido adecuado. Puede emplearse cualquier líquido adecuado, que incluye pero no se limita a, tampones, medios de cultivo celular (por ejemplo, DMEM), etc. Los tampones incluyen, pero no se limitan a: tris, tricina, MOPS, HEPES, PIPES, MES, PBS, TBS, y similares. Donde se desee, pueden estar presentes detergentes en el líquido, por ejemplo, detergentes NP-40, TWEEN™ o TritonX100.

En algunas realizaciones, la muestra biológica se precarga en un dispositivo microfluídico (como se ha descrito anteriormente) y se almacena durante un período de tiempo predeterminado antes de medir la muestra biológica en el canal de flujo. Por ejemplo, la muestra biológica puede precargarse en el dispositivo microfluídico, como se describe con mayor detalle a continuación, durante un período de tiempo antes de que se mida la muestra biológica en el canal de flujo según los métodos objeto. La cantidad de tiempo que se almacena la muestra biológica después de la precarga puede variar, tal como 0,1 horas o más, tal como 0,5 horas o más, tal como 1 hora o más, tal como 2 horas o más, tal como 4 horas o más, tal como 8 horas o más, tal como 16 horas o más, tal como 24 horas o más, tal como 48 horas o más, tal como 72 horas o más, tal como 96 horas o más, tal como 120 horas o más, tal como 144 horas o más, tal como 168 horas o más y que incluye la precarga de la muestra biológica en el recipiente 240 horas o más antes de analizar la muestra biológica o puede variar tal como de 0,1 horas a 240 horas antes de analizar la muestra biológica, tal como 0,5 horas a 216 horas, tal como de 1 hora a 192 horas e incluso de 5 horas a 168 horas antes de analizar la muestra biológica.

En ciertas realizaciones, la muestra biológica se precarga en el dispositivo microfluídico y la muestra en el canal de flujo se mide en una ubicación remota (por ejemplo, un laboratorio para realizar análisis de acuerdo con los métodos objeto). Por "ubicación remota" se entiende una ubicación distinta a la ubicación en la que la muestra está contenida y precargada en el recipiente. Por ejemplo, una ubicación remota podría ser otra ubicación (por ejemplo, oficina, laboratorio, etc.) en la misma ciudad, otra ubicación en una ciudad diferente, otra ubicación en un estado diferente, otra ubicación en un país diferente, etc., con relación a la ubicación del dispositivo de procesamiento, por ejemplo, como se describe con mayor detalle a continuación. En algunos casos, dos ubicaciones son remotas entre sí si están separadas entre sí por una distancia de 10 m o más, tal como 50 m o más, incluso 100 m o más, por ejemplo, 500 m o más, 1000 m o más, 10000 m o más, etc.

Al prácticar los métodos según ciertas realizaciones, una muestra se pone en contacto con un sitio de aplicación de la muestra de un dispositivo microfluídico (como se ha descrito anteriormente), pasando la muestra desde el sitio de aplicación de la muestra a través de un componente poroso donde la muestra se mezcla con un reactivo de ensayo en una matriz y en un canal de flujo. Como se resumió anteriormente, al pasar la muestra a través del componente poroso se mezcla la muestra con un reactivo de ensayo. En algunas realizaciones, la muestra pasa a través de la matriz porosa en el canal de flujo sin pérdida de ninguno de los componentes de la muestra. El término "sin pérdida" se entiende que la red de poros interconectados de la matriz porosa no restringe sustancialmente el paso de los componentes de la muestra a través del canal de flujo, tal como donde el 99% o más de la muestra pasa a través de la matriz porosa en el canal de flujo, tal como 99,5% o más, tal como 99,9% o más, tal como 99,99% o más, tal como 99,999% o más e incluso el paso de 99,9999% o más de la muestra a través de la matriz porosa. En ciertas realizaciones, toda (es decir, el 100%) de la muestra pasa a través de la matriz porosa. En otras palabras, el 1% o menos de los componentes de la muestra están restringidos por los poros de la matriz porosa, tal como 0,9% o menos, tal como 0,8% o menos, tal como 0,7% o menos, tal como 0,5% o menos, tal como 0,1% o menos, tal como 0,05% o menos, tal como 0,01% o menos, tal como 0,001% o menos e incluso donde el 0,0001% o menos de los componentes de la muestra están restringidos por los poros de la matriz porosa. Dicho de otra manera, el 1% o menos de la muestra permanece en la matriz porosa después del paso de la muestra al canal de flujo, tal como 0,9% o menos, tal como 0,8% o menos, tal como 0,7% o menos, tal como 0,5 % o menos, tal como 0,1% o menos, tal como 0,05% o menos, tal como 0,01% o menos, tal como 0,001% o menos e incluso el 0,0001% o menos de la muestra permanece en la matriz porosa después del paso de la muestra al canal de flujo.

En las realizaciones, el paso de la muestra a través de la matriz porosa permite mezclar la muestra con un reactivo de ensayo en la matriz porosa. En algunas realizaciones, mezclar la muestra con el reactivo de ensayo incluye unir uno o más componentes de la muestra con un miembro de unión específico del analito. Por "acoplamiento" se entiende que el componente de la muestra y el miembro de unión específico del analito forman uno o más enlaces físicos o químicos entre sí, que incluyen, pero no se limita a, el acoplamiento por iónico, dipolar, hidrófobo, coordinativo, covalente, van der Waals o interacciones de enlace de hidrógeno para unir el componente de la muestra con el miembro de unión específico del analito. En algunos casos, unir el componente de la muestra a un miembro de unión específico del analito incluye unir covalentemente el componente de muestra al miembro de unión específico del analito. En ciertos casos, unir el componente de la muestra a un miembro de unión específico del analito incluye unir no covalentemente (por ejemplo, a través de enlace de hidrógeno) el componente de la muestra al miembro de unión específico del analito. Por ejemplo, el acoplamiento entre el miembro de unión específico del analito y el analito diana puede caracterizarse por una constante de disociación, tal como una constante de disociación de 10-5 M o menos, 10 6 M o menos, tal como 10-7 M o menos, incluso 10-8 M o menos, p. ej., 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, 10-13 M o menos, 10-14 M o menos, 10-15 M o menos e incluso 10-16 M o menos.

Como se analizó anteriormente, los miembros de unión específicos del analito pueden variar dependiendo de la muestra que se esté analizando y los analitos diana de interés y pueden incluir, pero no se limitan a, agentes de unión a anticuerpos, proteínas, péptidos, haptenos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos. En algunas realizaciones, el miembro de unión específico del analito es una enzima. Ejemplos de enzimas de unión específicas del analito pueden ser peroxidasa de rábano picante, piruvato oxidasa, oxalacetato descarboxilasa, creatinina amidohidrolasa, creatina amidinohidrolasa, sarcosina oxidasa, malato deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, FAD, TPP, P-5-P, NADH, rojo ampex y combinaciones de los mismos. .

En ciertas realizaciones, los métodos incluyen pasar la muestra a través del componente poroso para unir uno o más componentes de la muestra a un agente de unión a anticuerpos. El agente de unión a anticuerpos puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal o monoclonal o un fragmento suficiente para unirse al analito de interés. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser en algunos casos fragmentos Fab monoméricos, fragmentos Fab' monoméricos o fragmentos F(ab)'2 diméricos. También dentro del alcance del término "agente de unión a anticuerpos" están las moléculas producidas por ingeniería de anticuerpos, tal como las moléculas de anticuerpos de cadena única (scFv) o los anticuerpos humanizados o quiméricos producidos a partir de anticuerpos monoclonales mediante el reemplazo de las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera para producir anticuerpos quiméricos o el reemplazo tanto de las regiones constantes como de las porciones marco de las regiones variables para producir anticuerpos humanizados. En ciertas realizaciones, uno o más componentes de la muestra se unen a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un compuesto tal como CD14, CD4, CD45RA y CD3 o una combinación de los mismos.

En las realizaciones, el agente de unión específico del analito puede unirse a un marcador detectable, tal como marcadores radiactivos, marcadores detectables mediante técnicas de espectroscopia tal como resonancia magnética nuclear así como marcadores detectables ópticamente. En algunas realizaciones, mezclar la muestra con el reactivo de ensayo en la matriz porosa incluye unir uno o más componentes de la muestra a un miembro de unión específico del analito conjugado con un marcador ópticamente detectable. En ciertos casos, el marcador detectable ópticamente es detectable por espectroscopia de emisión, tal como por espectroscopia de fluorescencia. En estos casos, el marcador ópticamente detectable es un fluoróforo tal como ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilben-2,2'disulfónico; acridina y derivados tales como acridina, naranja de acridina, amarillo de acridina, rojo de acridina e isotiocianato de acridina; ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS); 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato (Lucifer Yellow VS); N-(4-anilino-1-naftil)maleimida; antranilamida; amarillo brillante; cumarina y derivados tales como cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Coumarin 120), 7-amino-4-trifluorometilculuarina (Coumaran 151); cianina y derivados tales como cianosina, Cy3, Cy5, Cy5.5 y Cy7; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5',5"-dibromopirogalol-sulfoneftaleína (rojo de bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; dietilaminocumarina; pentaacetato de dietilentriamina; ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfónico, ácido 4,4'-diisotiocianatostilbeno-2,2'-disulfónico, cloruro de 5-[dimetilamino]naftalen-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo), ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo) benzoico (DABCYL); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados tales como eosina e isotiocianato de eosina; eritrosina y derivados tales como eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etidio; fluoresceína y derivados tales como 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2'7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), isotiocianato de fluoresceína (FITC), clorotriazinilo de fluoresceína, naftofluoresceína, y QFITC (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; proteína verde fluorescente (GFP); proteína fluorescente de coral (RCFP); Lisamina™; Lisamina rodamina, amarillo Lucifer; Isotiocianato de verde de malaquita; 4-metilumbeliferona; orto-cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Rojo del Nilo; verde Oregon; rojo fenol; B-ficoeritrina; o-ftaldialdehído; pireno y derivados tales como pireno, butirado de pireno y butirado de succinimidil-1-pireno; rojo reactivo 4 (Cibacron™ rojo brillante 3B-A); rodamina y derivados tales como 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), 4,7-diclororrodamina de lisamina, cloruro de sulfonilo de rodamina B, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina X isotiocianato, sulforrodamina B, sulforrodamina 101, derivado de cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101 (rojo Texas), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), tetrametilrodamina e isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC); riboflavina; ácido rosólico y derivados de quelato de terbio; xanteno o combinaciones de los mismos, entre otros fluoróforos. En ciertas realizaciones, el fluoróforo es un colorante fluorescente tal como rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetino, pireno, difluoruro de boro dipirrometeno, naftalimida, ficobiliproteína, proteínas de clorofila de peridinio, conjugados de los mismos o una combinación de los mismos.

Al practicar los métodos objeto, después de que la muestra se ha mezclado con el reactivo de ensayo en la matriz porosa y se ha pasado al canal de flujo (p. ej., por acción capilar), la muestra se ilumina en el canal de flujo con una fuente de luz. Dependiendo del tipo de muestra y analitos diana que se analicen, la muestra puede iluminarse en el canal de flujo inmediatamente después de que la muestra haya pasado a través de la matriz porosa y dentro del canal de flujo. En otras realizaciones, la muestra se ilumina después de un período de tiempo predeterminado después de que la muestra se pone en contacto con los reactivos de ensayo en la matriz porosa, tal como un período de tiempo que va de 10 segundos a 1 hora, tal como 30 segundos a 30 minutos, p. ej., de 30 segundos a 10 minutos, incluso 30 segundos a 1 minuto. La muestra puede iluminarse con una o más fuentes de luz. En algunas realizaciones, la muestra se ilumina con una o más fuentes de luz de banda ancha. El término "banda ancha" se usa en esta memoria en su sentido convencional para referirse a una fuente de luz que emite luz que tiene un amplio intervalo de longitudes de onda, tal como por ejemplo, que alcanza 50 nm o más, tal como 100 nm o más, tal como 150 nm o más, tal como 200 nm o más, tal como 250 nm o más, tal como 300 nm o más, tal como 350 nm o más, tal como 400 nm o más e incluso un alcance de 500 nm o más. Por ejemplo, una fuente de luz de banda ancha adecuada emite luz que tiene longitudes de onda de 400 nm a 700 nm. Otro ejemplo de una fuente de luz de banda ancha adecuada incluye una fuente de luz que emite luz con longitudes de onda de 500 nm a 700 nm. Puede emplearse cualquier protocolo de fuente de luz de banda ancha conveniente, tal como una lámpara halógena, lámpara de arco de deuterio, lámpara de arco de xenón, fuente de luz de banda ancha unida a fibra estabilizada, un LED de banda ancha con espectro continuo, diodo emisor superluminiscente, diodo emisor de luz semiconductor, fuente de luz blanca LED de amplio espectro, una fuente de luz blanca integrada multi-LED, entre otras fuentes de luz de banda ancha o cualquier combinación de las mismas.

En otras realizaciones, la muestra se ilumina con una o más fuentes de luz de banda estrecha que emiten una longitud de onda particular o un intervalo estrecho de longitudes de onda. El término "banda estrecha" se usa en esta memoria en su sentido convencional para referirse a una fuente de luz que emite luz que tiene un intervalo estrecho de longitudes de onda, tal como por ejemplo 50 nm o menos, tal como 40 nm o menos, tal como 30 nm. o menos, tal como 25 nm o menos, tal como 20 nm o menos, tal como 15 nm o menos, tal como 10 nm o menos, tal como 5 nm o menos, tal como 2 nm o menos e incluso fuentes de luz que emiten una longitud de onda de luz específica (es decir, luz monocromática). Puede emplearse cualquier protocolo conveniente de fuente de luz de banda estrecha, tal como un LED de longitud de onda estrecha, un diodo láser o una fuente de luz de banda ancha unida a uno o más filtros ópticos de paso de banda, rejillas de difracción, monocromadores o cualquier combinación de los mismos.

En ciertas realizaciones, los métodos incluyen irradiar la muestra en el canal de flujo con uno o más láseres. El tipo y el número de láseres variarán dependiendo de la muestra, así como la luz emitida deseada recogida y puede ser un láser de gas, tal como un láser de helio-neón, láser de argón, láser de criptón, láser de xenón, láser de nitrógeno, láser de CO2, láser de CO, láser excímer de argón-flúor (ArF), láser excímer de criptón-flúor (KrF), láser excímer de xenón cloro (XeCI) o láser excímer de xenón-flúor (XeF) o una combinación de los mismos. En otros casos, los métodos incluyen irradiar la muestra en el canal de flujo con un láser de colorante, tal como un láser de estilbeno, cumarina o rodamina. En otros casos más, los métodos incluyen irradiar la muestra en el canal de flujo con un láser de vapor de metal, tal como un láser de helio-cadmio (HeCd), láser de helio-mercurio (HeHg), láser de helio-selenio (HeSe), láser de helio-plata (HeAg), láser de estroncio, láser de neón-cobre (NeCu), láser de cobre o láser de oro y combinaciones de los mismos. Todavía en otros casos, los métodos incluyen irradiar la muestra en el canal de flujo con un láser de estado sólido, tal como un láser de rubí, un láser Nd:YAG, un láser NdCrYAG, un láser Er:YAG, un láser Nd:YLF, un láser Nd:YVO4, láser Nd:YCa4O(BO3)3, láser Nd:YCOB, láser de zafiro de titanio, láser de thulim YAG, láser de iterbio YAG, láser de iterbio2O3 o láseres dopados con láser o cerio y combinaciones de los mismos.

Dependiendo del analito que se esté analizando, así como de los interferentes presentes en la muestra biológica, la muestra biológica puede iluminarse usando una o más fuentes de luz, tal como dos o más fuentes de luz, tal como tres o más fuentes de luz, tal como cuatro o más fuentes de luz, tal como cinco o más fuentes de luz e incluso diez o más fuentes de luz. Puede usarse cualquier combinación de fuentes de luz, según se desee. Por ejemplo, donde se emplean dos fuentes de luz, una primera fuente de luz puede ser una fuente de luz blanca de banda ancha (p. ej., LED de luz blanca de banda ancha) y la segunda fuente de luz puede ser una fuente de luz de infrarrojo cercano de banda ancha (p. ej., LED de IR cercano de banda ancha). En otros casos, donde se emplean dos fuentes de luz, una primera fuente de luz puede ser una fuente de luz blanca de banda ancha (p. ej., LED de luz blanca de banda ancha) y la segunda fuente de luz puede ser una fuente de luz de espectro estrecho (p. ej., una luz visible de banda estrecha o LED de IR cercano). En otros casos más, la fuente de luz es una pluralidad de fuentes de luz de banda estrecha, cada una de las cuales emite longitudes de onda específicas, tal como un conjunto ordenado de dos o más LEDs, tal como un conjunto ordenado de tres o más LEDs, tal como un conjunto ordenado de cinco o más LEDs, que incluye un conjunto ordenado de diez o más LEDs.

Donde se emplea más de una fuente de luz, la muestra puede iluminarse con las fuentes de luz de forma simultánea o secuencial, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, donde la muestra se ilumina con dos fuentes de luz, los métodos objeto pueden incluir iluminar de forma simultánea la muestra con ambas fuentes de luz. En otras realizaciones, la muestra puede iluminarse de forma secuencial mediante dos fuentes de luz. Donde la muestra se ilumina de forma secuencial con dos o más fuentes de luz, el tiempo que cada fuente de luz ilumina la misma puede ser independientemente 0,001 segundos o más, tal como 0,01 segundos o más, tal como 0,1 segundos o más, tal como 1 segundo o más, tal como 5 segundos o más, tal como 10 segundos o más, tal como 30 segundos o más e incluso 60 segundos o más. En las realizaciones donde la muestra se ilumina de forma secuencial mediante dos o más fuentes de luz, la duración de la iluminación de la muestra con cada fuente de luz puede ser la misma o diferente.

El período de tiempo entre la iluminación de cada fuente de luz también puede variar, según se desee, separándose independientemente por un retraso de 1 segundo o más, tal como 5 segundos o más, tal como 10 segundos o más, tal como 15 segundos o más, tal como por 30 segundos o más e incluso por 60 segundos o más. En las realizaciones en las que la muestra se ilumina de forma secuencial por más de dos (es decir, tres o más) fuentes de luz, el retraso entre la iluminación de cada fuente de luz puede ser el mismo o diferente.

Dependiendo del protocolo de ensayo, la iluminación de la muestra puede ser continua o en intervalos discretos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la muestra se puede iluminar continuamente durante todo el tiempo que se analiza la muestra. Donde la luz incluye dos o más fuentes de luz, la muestra se puede iluminar continuamente por todas las fuentes de luz de forma simultánea. En otros casos, la muestra se ilumina de forma continua con cada fuente de luz de forma secuencial. En otras realizaciones, la muestra puede iluminarse a intervalos regulares, tal como iluminar la muestra cada 0,001 microsegundos, cada 0,01 microsegundos, cada 0,1 microsegundos, cada 1 microsegundo, cada 10 microsegundos, cada 100 microsegundos e incluso cada 1000 microsegundos. La muestra se puede iluminar con la fuente de luz una o más veces en cualquier período de medida dado, tal como 2 o más veces, tal como 3 o más veces, e incluso 5 o más veces en cada período de medida.

Dependiendo de la fuente de luz y las características del canal de flujo (p. ej., ancho del canal de flujo), el canal de flujo puede irradiarse desde una distancia que varía, tal como 1 mm o más del canal de flujo, tal como 2 mm o más, como 3 mm o más, tal como 4 mm o más, tal como 5 mm o más, tal como 10 mm o más, tal como 15 mm o más, tal como 25 mm o más e incluso 50 mm o más del canal de flujo. Además, el ángulo al que se irradia el canal de flujo también puede variar, va de 10° y 90°, tal como de 15° y 85°, tal como de 20° y 80°, tal como de 25° y 75° e incluso de 30° a 60°. En ciertas realizaciones, el canal de flujo es irradiado por la fuente de luz en un ángulo de 90° con respecto al eje del canal de flujo.

En ciertas realizaciones, irradiar el canal de flujo incluye mover una o más fuentes de luz (p. ej., láseres) a lo largo del eje longitudinal del canal de flujo. Por ejemplo, la fuente de luz se puede mover hacia arriba o hacia abajo a lo largo del eje longitudinal del canal de flujo irradiando el canal de flujo a lo largo de una longitud predeterminada del canal de flujo. Por ejemplo, los métodos pueden incluir mover la fuente de luz a lo largo del eje longitudinal del canal de flujo durante 1 mm o más, tal como 2,5 mm o más, tal como 5 mm o más, tal como 10 mm o más, tal como 15 mm o más, tal como 25 mm o más e incluso 50 mm o más del canal de flujo. La fuente de luz se puede mover de forma continua o en intervalos discretos. En algunas realizaciones, la fuente de luz se mueve de forma continua. En otras realizaciones, la fuente de luz se mueve a lo largo del eje longitudinal del canal de flujo en intervalos discretos, tal como por ejemplo en incrementos de 0,1 mm o mayores, tal como incrementos de 0,25 mm o mayores e incluso incrementos de 1 mm o mayores.

Al practicar métodos según aspectos de la presente descripción, la luz emitida por la muestra en el canal de flujo se mide en una o más longitudes de onda. En las realizaciones, la luz emitida se mide a una o más longitudes de onda, tal como a 5 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 10 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 25 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 50 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 100 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 200 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 300 o más longitudes de onda diferentes e incluso la medida de la luz emitida por la muestra en el canal de flujo a 400 o más longitudes de onda diferentes.

En algunas realizaciones, medir la luz emitida por la muestra en el canal de flujo incluye medir la luz emitida en un intervalo de longitudes de onda (p. ej., 200 nm-800 nm). Por ejemplo, los métodos pueden incluir medir la luz emitida por la muestra en el canal de flujo en uno o más de los intervalos de longitud de onda de: 200 nm-800 nm; 400 nm-500 nm; 500 nm-600 nm; 600 nm-700 nm; 700 nm-800 nm; 550 nm-600 nm; 600 nm-650 nm; 650 nm-700 nm y cualquier parte o combinaciones de los mismos. En un caso, los métodos incluyen medir la luz emitida por la muestra en el canal de flujo en las longitudes de onda que van de 200 nm-800 nm. En otro caso, los métodos incluyen medir la luz emitida por la muestra en el canal de flujo en las longitudes de onda que van de 500 nm-600 nm y 650 nm-750 nm. En ciertos casos, los métodos incluyen medir la luz emitida por la muestra en el canal de flujo a 575 nm, 660 nm y 675 nm o una combinación de los mismos.

Medir la luz emitida por la muestra en el canal de flujo en un intervalo de longitudes de onda, en ciertos casos, incluye recoger los espectros de la luz emitida en el intervalo de longitudes de onda. Por ejemplo, los métodos pueden incluir recoger los espectros de luz emitida por la muestra en el canal de flujo en uno o más de los intervalos de longitud de onda de: 200 nm-800 nm; 400 nm-500 nm; 500 nm-600 nm; 600 nm-700 nm; 700 nm-800 nm; 550 nm-600 nm; 600 nm-50 nm; 650 nm-700 nm y cualquier parte o combinaciones de los mismos. En un caso, los métodos incluyen recoger los espectros de luz emitida de la muestra en el canal de flujo en las longitudes de onda que van de 400 nm a 800 nm. En otro caso, los métodos incluyen recoger los espectros de luz emitida de la muestra en el canal de flujo en las longitudes de onda que van de 500 nm a 700 nm.

En ciertas realizaciones, la luz emitida por la muestra en el canal de flujo se detecta en una o más longitudes de onda específicas. Por ejemplo, los métodos pueden incluir la detección de la luz emitida por la muestra en el canal de flujo a 2 o más longitudes de onda específicas, tal como a 3 o más longitudes de onda específicas, tal como a 4 o más longitudes de onda específicas, tal como a 5 o más longitudes de onda específicas, tal como a 10 o más longitudes de onda específicas e incluso la detección de luz emitida de la muestra en el canal de flujo a 25 o más longitudes de onda específicas. En ciertas realizaciones, la luz emitida se detecta a 575 nm. En otras realizaciones, la luz emitida se detecta a 660 nm. En otras realizaciones más, la luz emitida se detecta a 675 nm.

Dependiendo del protocolo de ensayo específico, la luz emitida por la muestra en el canal de flujo puede medirse de forma continua o en intervalos discretos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la medida de la luz emitida es continua durante todo el tiempo que se analiza la muestra. Donde medir la luz emitida incluye medir dos o más longitudes de onda o intervalos de longitudes de onda, las longitudes de onda o intervalos de longitudes de onda pueden medirse todas de forma simultánea, o cada longitud de onda o intervalo de longitudes de onda puede medirse de forma secuencial.

En otras realizaciones, la luz emitida se mide en intervalos discretos, tal como medir la luz emitida por la muestra en el canal de flujo cada 0,001 microsegundos, cada 0,01 microsegundos, cada 0,1 microsegundos, cada 1 microsegundo, cada 10 microsegundos, cada 100 microsegundos e incluso cada 1000 microsegundos. La luz emitida por la muestra desde el canal de flujo puede medirse una o más veces durante los métodos objeto, como 2 o más veces, tal como 3 o más veces, tal como 5 o más veces e incluso 10 o más veces.

La luz emitida por la muestra en el canal de flujo puede medirse mediante cualquier protocolo conveniente de detección de luz, que incluye pero no se limita a, sensores ópticos o fotodetectores, como sensores de píxeles activos (APS), fotodiodos de avalancha, sensores de imagen, dispositivos de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga acoplada intensificada (ICCD), diodos emisores de luz, contadores de fotones, bolómetros, detectores piroeléctricos, fotorresistores, células fotovoltaicas, fotodiodos, tubos fotomultiplicadores, fototransistores, fotoconductores de punto cuántico o fotodiodos y combinaciones de los mismos, entre otros fotodetectores. En ciertas realizaciones, la luz emitida se mide con un dispositivo de carga acoplada (CCD), dispositivos semiconductores de carga acoplada (CCD), sensores de píxeles activos (APS), sensores de imagen de semiconductores de óxido de metal complementarios (CMOS) o sensores de imagen de semiconductores de óxido de metal tipo-N (NMOS). En ciertas realizaciones, la luz se mide con un dispositivo de carga acoplada (CCD). Donde la luz emitida se mide con un CCD, el área superficial de detección activa del CCD puede variar, tal como, de 0,01 cm2 a 10 cm2, tal como de 0,05 cm2 a 9 cm2, tal como de 0,1 cm2 a 8 cm2, tal como de 0,5 cm2 a 7 cm2 e incluso de 1 cm2 a 5 cm2.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen ajustar ópticamente de la luz emitida desde el canal de flujo. Por ejemplo, la luz emitida puede pasar a través de una o más lentes, espejos, agujeritos, rendijas, rejillas, refractores de luz y cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, la luz emitida pasa a través de una o más lentes de enfoque, tal como para reducir el perfil de la luz propagada sobre la superficie activa del detector. En otros casos, la luz emitida se hace pasar a través de una o más lentes de reducción de aumento, tal como para aumentar el perfil de la luz propagada sobre la superficie activa del detector. En otros casos más, los métodos incluyen colimar la luz. Por ejemplo, la luz emitida puede colimarse pasando la luz a través de una o más lentes de colimación o espejos de colimación o una combinación de los mismos.

En ciertas realizaciones, los métodos incluyen pasar la luz emitida recogida del canal de flujo a través de fibras ópticas. Los protocolos de fibra óptica adecuados para propagar luz desde el canal de flujo a la superficie activa de un detector incluyen, pero no se limitan a, protocolos de fibra óptica tales como los descritos en la patente de Estados Unidos No.

6,809,804.

En ciertas realizaciones, los métodos incluyen pasar la luz emitida a través de uno o más separadores de longitud de onda. La separación de longitudes de onda, según ciertas realizaciones, puede incluir pasar o bloquear selectivamente longitudes de onda específicas o intervalos de longitudes de onda de la luz policromática. Para separar las longitudes de onda de la luz, la luz puede pasar a través de cualquier protocolo conveniente de separación de longitudes de onda, que incluye pero no se limita a, vidrio coloreado, filtros de paso de banda, filtros de interferencia, espejos dicroicos, rejillas de difracción, monocromadores y combinaciones de los mismos, entre otros protocolos de separación de longitudes de onda.

En otras realizaciones, los métodos incluyen separar las longitudes de onda de la luz pasando la luz emitida desde el canal de flujo a través de uno o más filtros ópticos, tales como uno o más filtros de paso de banda. Por ejemplo, los filtros ópticos de interés pueden incluir filtros de paso de banda que tienen anchos de banda mínimos que van de 2 nm a 100 nm, tal como de 3 nm a 95 nm, tal como de 5 nm a 95 nm, tal como de 10 nm a 90 nm, tal como de 12 nm a 85 nm, tal como de 15 nm a 80 nm e incluye filtros de paso de banda que tienen anchos de banda mínimos que van de 20 nm a 50 nm.

En ciertas realizaciones, el ensayo de fluorescencia objeto puede incluir métodos para obtener imágenes de muestras en canales capilares tal como los descritos en las patentes de EE.UU. Nos. 8,248,597; 7,927,561 y 7,738,094 así como los descritos en la solicitud de patente de EE.UU. en tramitación con las presentes, Nos. 13/590,114 presentada el 20 de agosto del 2012, 61/903,804 presentada el 13 de noviembre del 2013 y 61/949,833 presentada el 7 de marzo del 2014

En ciertas realizaciones, los métodos incluyen capturar una imagen del canal de flujo. La captura de una o más imágenes del canal de flujo puede incluir iluminar el canal de flujo con una o más fuentes de luz (como se ha descrito anteriormente) y capturar la imagen con un dispositivo de carga acoplada (CCD), dispositivo semiconductor de carga acoplada (CCD), sensor de píxel activo (APS), sensor de imagen de semiconductor de óxido de metal complementario (CMOS) o sensor de imagen de semiconductor de óxido de metal de tipo N (NMOS). Las imágenes del canal de flujo se pueden capturar de forma continua o en intervalos discretos. En algunos casos, los métodos incluyen capturar imágenes de forma continua. En otros casos, los métodos incluyen capturar imágenes en intervalos discretos, tal como capturar una imagen de la corriente de flujo cada 0,001 milisegundos, cada 0,01 milisegundos, cada 0,1 milisegundos, cada 1 milisegundo, cada 10 milisegundos, cada 100 milisegundos e incluso cada 1000 milisegundos, o algún otro intervalo. Donde las imágenes del canal de flujo se capturan con un detector de cámara CCD, el área superficial de detección activa del CCD puede variar, tal como de 0,01 cm2 a 10 cm2, tal como de 0,05 cm2 a 9 cm2, tal como de 0,1 cm2 a 8 cm2, tal como de 0,5 cm2 a 7 cm2 e incluso de 1 cm2 a 5 cm2.

Todo o parte del canal de flujo se puede capturar en cada imagen, tal como el 5% o más del canal de flujo, tal como el 10% o más, tal como el 25% o más, tal como el 50% o más, tal como el 75% o más, tal como el 90% o más, tal como el 95% o más e incluso el 99% o más del canal de flujo se puede capturar en cada imagen. En ciertas realizaciones, todo el canal de flujo se captura en cada imagen. Se pueden capturar una o más imágenes, según se desee, tal como 2 o más imágenes, tal como 3 o más imágenes, tal como 5 o más imágenes, tal como 10 o más imágenes, tal como 25 o más imágenes e incluso 100 o más imágenes. Donde se captura más de una imagen del canal de flujo, la pluralidad de imágenes se pueden unir o promediar automáticamente mediante un procesador que tiene un algoritmo de procesamiento de imágenes digitales.

Las imágenes del canal de flujo se pueden capturar a cualquier distancia adecuada del canal de flujo siempre y cuando se capture una imagen utilizable del canal de flujo. Por ejemplo, las imágenes del canal de flujo pueden capturarse a 0,01 mm o más de la corriente de flujo, tal como 0,05 mm o más, tal como 0,1 mm o más, tal como 0,5 mm o más, tal como 1 mm o más, tal como 2,5 mm o más, tal como 5 mm o más, tal como 10 mm o más, tal como 15 mm o más, tal como 25 mm o más e incluso 50 mm o más de la corriente de flujo del citómetro de flujo. Las imágenes del canal de flujo también se pueden capturar a cualquier ángulo con relación al canal de flujo. Por ejemplo, las imágenes del canal de flujo pueden capturarse a un ángulo con respecto al eje longitudinal del canal de flujo que varía de 10° a 90°, tal como de 15° a 85°, tal como de 20° a 80°, tal como de 25° a 75° e incluso de 30° a 60°. En ciertas realizaciones, las imágenes del canal de flujo se capturan a un ángulo de 90° con respecto al eje longitudinal del canal de flujo.

En algunas realizaciones, la captura de imágenes de la corriente de flujo incluye mover uno o más sensores de formación de imágenes junto a la trayectoria de la corriente de flujo. Por ejemplo, el sensor de formación de imágenes se puede mover hacia arriba o hacia abajo junto a la corriente de flujo capturando imágenes en una pluralidad de campos de detección. Por ejemplo, los métodos pueden incluir capturar imágenes de la corriente de flujo en dos o más campos de detección diferentes, tales como 3 o más campos de detección, tales como 4 o más campos de detección e incluso 5 o más campos de detección. El sensor de formación de imágenes se puede mover de forma continua o en intervalos discretos. En algunas realizaciones, el sensor de formación de imágenes se mueve de forma continua. En otras realizaciones, el sensor de formación de imágenes puede moverse a lo largo de la trayectoria de la corriente de flujo en intervalos discretos, tal como por ejemplo en incrementos de 1 mm o mayores, tal como incrementos de 2 mm o mayores e incluso incrementos de 5 mm o mayores.

En ciertas realizaciones, los métodos incluyen reducir la señal de fondo de las imágenes capturadas del canal de flujo. En estas realizaciones, los métodos incluyen capturar una imagen del canal de flujo con miembros de unión específicos del analito marcados ópticamente no unidos (es decir, reactivo de ensayo no mezclado con la muestra) y reducir (p. ej., restar) la señal de fondo de las imágenes capturadas de la muestra en el canal de flujo. En algunos casos, los métodos incluyen capturar una imagen de la muestra en el canal de flujo, determinar la señal de fondo de los miembros de unión específicos del analito marcados ópticamente no unidos y reducir el fondo de la imagen capturada de la muestra en el canal de flujo. En realizaciones de la presente descripción, la señal de fondo puede determinarse una o más veces, tal como 2 o más veces, tal como 3 o más veces, tal como 5 o más veces e incluso 10 o más veces. Donde se desee, se puede promediar la señal de fondo para proporcionar una señal de fondo promedio. En ciertas realizaciones, determinar la señal de fondo incluye capturar una o más imágenes del canal de flujo en ausencia de muestra.

Dependiendo de los reactivos del ensayo, el reactivo no unido en el canal de flujo es sustancialmente constante. En otras palabras, la distribución del reactivo no unido presente en el canal de flujo es homogénea y la variación en la cantidad de reactivo no unido en diferentes regiones del canal de flujo varía en un 10% o menos, tal como en 5% o menos, tal como en 4 % o menos, tal como en 3% o menos, tal como en 2% o menos, tal como en 1% o menos, tal como en 0,5% o menos e incluso 0,1% o menos. En consecuencia, la señal de fondo varía a lo largo del eje longitudinal del canal de flujo en 10% o menos, tal como en 5% o menos, tal como en 4% o menos, tal como en 3% o menos, tal como en 2% o menos, tal como en 1% o menos, tal como en 0,5% o menos e incluso en 0,1% o menos. En ciertas realizaciones, los métodos incluyen reducir la señal de fondo de la imagen capturada de la muestra en el canal de flujo donde la señal de fondo varía en 10% o menos, tal como en 5% o menos, tal como en 4% o menos, tal como en 3% o menos, tal como en 2% o menos, tal como en 1% o menos, tal como en 0,5% o menos e incluso en 0,1% o menos a lo largo del eje longitudinal del canal de flujo.

Como se ilustra en las Figuras 1 y 2A-B, los dispositivos microfluídicos de interés pueden usarse para detectar concentraciones serológicas de anticuerpos humanos en volúmenes de punción digital (5-50 gl) de sangre completa en un formato sin lavado. En algunas ciertas realizaciones, los métodos incluyen aplicar una muestra líquida al lugar de aplicación de la muestra y dirigir el flujo de la muestra mediante fuerza capilar al elemento poroso. Mientras la muestra entra en el elemento poroso, una preparación de reactivo se disuelve en la muestra a una velocidad sustancialmente continua. La mezcla de ensayo puede comprender un reactivo ópticamente activo para el marcado específico del componente de la muestra y un conjunto de componentes tampón que proporcionan la disolución continua del reactivo en la muestra. En algunas realizaciones, los componentes tampón pueden comprender albúmina de suero bovino (BSA), trehalosa (tal como D+ trehalosa), polivinilpirrolidona (PVP) o cualquier combinación de los mismos. El reactivo ópticamente activo puede ser cualquier marcador detectable, tal como un conjugado de anticuerpo marcado con fluorescencia. El tampón y la muestra pueden mezclarse en el elemento poroso mediante mezcla pasiva a través de una red de caminos tortuosos en el elemento poroso, lo que da como resultado un reactivo que se une a los componentes de la muestra y reactivo no unido. La muestra marcada con un marcador detectable puede interrogarse luego como se describió anteriormente, tal como ópticamente o magnéticamente a lo largo del canal capilar del dispositivo microfluídico. En algunas realizaciones, la muestra puede interrogarse obteniendo una señal o imagen de la muestra a través de una pared transmisiva. El procesamiento de la señal puede incluir restar una señal de fondo del reactivo no unido. La cantidad de reactivo no unido a lo largo de la transmisiva puede ser sustancialmente constante. En algunas realizaciones, la cantidad de reactivo no unido varía menos que 50%, 40%, 30%, 20% o 10%, a lo largo de la pared transmisiva, proporcionando beneficiosamente una detección mejorada del reactivo unido a componentes de la muestra. La detección puede comprender la sustracción de señales ópticas de fondo y la observación del número, propiedades ópticas, morfológicas o configuración de las señales por encima del fondo.

Sistemas para ensayar una muestra para un analito

Los aspectos de la presente descripción incluyen además sistemas para practicar los métodos objeto. En las realizaciones, se proporcionan sistemas que incluyen uno o más de los dispositivos microfluídicos objeto y un sistema de interrogación óptico que tiene una fuente de luz y un detector para detectar una o más longitudes de onda de luz emitida por la muestra en el canal de flujo. En ciertas realizaciones, los sistemas incluyen además uno o más de los dispositivos microfluídicos objeto integrados directamente en el sistema de interrogación óptico.

Como se resumió anteriormente, los aspectos de la presente descripción incluyen analizar una muestra para uno o más analitos. Los sistemas incluyen una o más fuentes de luz para interrogar un canal de flujo que contiene una muestra de interés mezclada con un reactivo de ensayo. En algunas realizaciones, la fuente de luz es una fuente de luz de banda ancha, que emite luz que tiene un amplio intervalo de longitudes de onda, tal como por ejemplo, alcanza 50 nm o más, tal como 100 nm o más, tal como 150 nm o más, tal como 200 nm o más, tal como 250 nm o más, tal como 300 nm o más, tal como 350 nm o más, tal como 400 nm o más e incluso un alcance de 500 nm o más. Por ejemplo, una fuente de luz de banda ancha adecuada emite luz que tiene longitudes de onda de 200 nm a 800 nm. Puede emplearse cualquier protocolo de fuente de luz de banda ancha conveniente, como una lámpara halógena, lámpara de arco de deuterio, lámpara de arco de xenón, fuente de luz de banda ancha acoplada a fibra estabilizada, un LED de banda ancha con espectro continuo, diodo emisor superluminiscente, diodo emisor de luz semiconductor, fuente de luz blanca LED de amplio espectro, fuente de luz blanca integrada multi-LED, entre otras fuentes de luz de banda ancha o cualquier combinación de las mismas.

En otras realizaciones, la fuente de luz es una fuente de luz de banda estrecha que emite una longitud de onda particular o un intervalo estrecho de longitudes de onda. En algunos casos, las fuentes de luz de banda estrecha emiten luz que tiene un intervalo estrecho de longitudes de onda, tal como por ejemplo 50 nm o menos, tal como 40 nm o menos, tal como 30 nm o menos, tal como 25 nm o menos, tal como 20 nm o menos, tal como 15 nm o menos, tal como 10 nm o menos, tal como 5 nm o menos, tal como 2 nm o menos e incluso fuentes de luz que emitan una longitud de onda de luz específica (es decir, luz monocromática). Puede emplearse cualquier protocolo conveniente de fuente de luz de banda estrecha, tal como un LED de longitud de onda estrecha, un diodo láser o una fuente de luz de banda ancha acoplada a uno o más filtros ópticos de paso de banda, rejillas de difracción, monocromadores o cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, la fuente de luz de banda estrecha es un láser, tal como un láser de gas, tal como un láser de helio-neón, láser de argón, láser de criptón, láser de xenón, láser de nitrógeno, láser de CO2, láser de CO, láser excímer de argón-flúor (ArF), láser excímer de criptón-flúor (KrF), láser excímer de xenón-cloro (XeCI) o láser excímer de xenón-flúor (XeF), un láser de colorante, tal como un láser de estilbeno, cumarina o rodamina. En otros casos más, los métodos incluyen irradiar la muestra en el canal de flujo con un láser de vapor de metal, tal como un láser de helio-cadmio (HeCd), láser de helio-mercurio (HeHg), láser de helioselenio (HeSe), láser de helio-plata (HeAg), láser de estroncio, láser de neón-cobre (NeCu), láser de cobre o láser de oro o un láser de estado sólido, tal como un láser de rubí, un láser Nd:YAG, láser NdCrYAG, láser Er:YAG, láser Nd:YLF, láser Nd:YVO4, láser Nd:YCa4O(BO3)3, láser Nd:YCoB, láser de zafiro de titanio, láser de thulim YAG, láser de iterbio YAG, láser de iterbio2O3 o láseres dopados con cerio así como combinaciones de los mismos.

Los sistemas objeto pueden incluir una o más fuentes de luz, según se desee, tal como dos o más fuentes de luz, como tres o más fuentes de luz, tal como cuatro o más fuentes de luz, tal como cinco o más fuentes de luz e incluso diez o más fuentes de luz. En las realizaciones, las fuentes de luz emiten luz que tiene longitudes de onda que varían de 200 nm a 1000 nm, tal como de 250 nm a 950 nm, tal como de 300 nm a 900 nm, tal como de 350 nm a 850 nm e incluso de 400 nm a 800 nm.

Como se resumió anteriormente, los sistemas objeto están configurados para recibir un dispositivo microfluídico que tiene un sitio de aplicación de la muestra, un canal de flujo en comunicación fluida con el sitio de aplicación de la muestra y un componente poroso que tiene una matriz porosa y un reactivo de ensayo colocado entre el sitio de aplicación de la muestra y el canal de flujo. En estas realizaciones, los sistemas también pueden incluir un soporte del cartucho para recibir el microfluido en el sistema objeto. Por ejemplo, el soporte del cartucho puede incluir un soporte para recibir el dispositivo microfluídico y uno o más retenedores de cartucho para mantener el dispositivo microfluídico en el soporte del cartucho. En algunos casos, el soporte del cartucho incluye amortiguadores de vibraciones para reducir la agitación del dispositivo microfluídico colocado en el soporte del cartucho, así como uno o más indicadores de presencia de cartucho configurados para indicar que hay un dispositivo microfluídico en el soporte del cartucho.

En algunas realizaciones, los sistemas incluyen una lanzadera de cartucho unida al soporte del cartucho para mover el dispositivo microfluídico dentro y fuera del sistema de interrogación. En algunas realizaciones, la lanzadera de cartucho está unida a uno o más protocolos de traslación o movimiento lateral para mover el dispositivo microfluídico. Por ejemplo, la lanzadera de cartucho se puede unir a una etapa de traslación accionada mecánicamente, conjunto de husillo mecánico, dispositivo deslizante mecánico, dispositivo de movimiento lateral mecánico, dispositivo de traslación con engranajes accionado mecánicamente, una etapa de traslación accionada por motor, conjunto de traslación de husillo, dispositivo de traslación engranado, tales como los que emplean un motor paso a paso, servomotor, motor eléctrico sin escobillas, motor DC con escobillas, motor de accionamiento de micropasos, motor paso a paso de alta resolución, entre otros tipos de motores. Los sistemas también pueden incluir un conjunto de rieles para colocar la lanzadera de cartucho para facilitar el movimiento lateral del soporte del cartucho.

Como se ha descrito anteriormente, la luz emitida por la muestra en el canal de flujo se recoge y detecta usando uno o fotodetectores. En ciertas realizaciones, los sistemas incluyen una o más lentes de objetivo para recoger la luz emitida desde el canal de flujo. Por ejemplo, la lente del objetivo puede ser una lente de aumento con un aumento nominal que va de 1,2 a 5, tal como un aumento nominal de 1,3 a 4,5, tal como un aumento nominal de 1,4 a 4, tal como un aumento nominal de 1,5 a 3,5, tal como un aumento nominal o de 1,6 a 3, incluso el paso de la luz transmitida a través de una lente de aumento que tenga un aumento nominal de 1,7 a 2,5. Dependiendo de la configuración de la fuente de luz, la cámara de muestra y el detector, pueden variar las propiedades de la lente del objetivo. Por ejemplo, la apertura numérica de la lente del objetivo objeto también puede variar, va de 0,01 a 1,7, tal como de 0,05 a 1,6, tal como de 0,1 a 1,5, tal como de 0,2 a 1,4, tal como de 0,3 a 1,3, tal como de 0,4 a 1,2, tal como de 0,5 a 1,1 e incluso una apertura numérica que va de 0,6 a 1,0. Asimismo, la distancia focal de la lente del objetivo varía, va de 10 mm y 20 mm, tal como de 10,5 mm a 19 mm, tal como de 11 mm a 18 mm e incluso de 12 mm a 15 mm.

En algunas realizaciones, la lente objetivo está acoplada a un módulo de enfoque automático para enfocar la luz emitida desde el canal de flujo sobre el detector para su detección. Por ejemplo, un módulo de enfoque automático adecuado para enfocar la luz emitida desde el canal de flujo puede incluir, pero no se limita a, los descritos en la patente de Estados Unidos No. 6,441,894, presentada el 29 de octubre de 1999.

Los sistemas de la presente descripción también pueden incluir uno o más separadores de longitud de onda. El término "separador de longitud de onda" se usa en su sentido convencional para referirse a un componente óptico configurado para separar la luz policromática en longitudes de onda de componentes de manera que cada longitud de onda pueda detectarse adecuadamente. Ejemplos de separadores de longitud de onda adecuados en los sistemas objeto pueden incluir, pero no se limitan a, vidrio coloreado, filtros de paso de banda, filtros de interferencia, espejos dicroicos, rejillas de difracción, monocromadores y combinaciones de los mismos, entre otros protocolos de separación de longitudes de onda. Dependiendo de la fuente de luz y la muestra que se analice, los sistemas pueden incluir uno o más separadores de longitud de onda, tal como dos o más, tal como tres o más, tal como cuatro o más, tal como cinco o más e incluso 10 o más separadores de longitud de onda. En un ejemplo, los sistemas incluyen dos o más filtros de paso de banda. En otro ejemplo, los sistemas incluyen dos o más filtros de paso de banda y una rejilla de difracción. En otro ejemplo más, los sistemas incluyen una pluralidad de filtros de paso de banda y un monocromador. En ciertas realizaciones, los sistemas incluyen una pluralidad de filtros de paso de banda y rejillas de difracción configurados en una configuración de rueda de filtros. Donde los sistemas incluyen dos o más separadores de longitud de onda, los separadores de longitud de onda pueden utilizarse individualmente o en serie para separar la luz policromática en longitudes de onda de componentes. En algunas realizaciones, los separadores de longitud de onda están dispuestos en serie. En otras realizaciones, los separadores de longitud de onda están dispuestos individualmente.

En algunas realizaciones, los sistemas incluyen una o más rejillas de difracción. Las rejillas de difracción de interés pueden incluir, pero no se limitan a, rejillas de difracción de transmisión, dispersivas o reflectantes. Los espacios adecuados de la rejilla de difracción pueden variar, van de 0,01 |um a 10 |um, tal como de 0,025 |um a 7,5 |um, tal como de 0,5 |um a 5 |um, tal como de 0,75 |um a 4 |um, tal como de 1 |um a 3,5 |um e incluso de 1,5 |um a 3,5 |um.

En algunas realizaciones, los sistemas incluyen uno o más filtros ópticos. En ciertos casos, los sistemas incluyen filtros de paso de banda que tienen anchos de banda mínimos que van de 2 nm a 100 nm, tal como de 3 nm a 95 nm, tal como de 5 nm a 95 nm, tal como de 10 nm a 90 nm, tal como de 12 nm a 85 nm, tal como de 15 nm a 80 nm e incluso filtros de paso de banda que tienen anchos de banda mínimos que van de 20 nm a 50 nm.

Los sistemas de la presente descripción también incluyen uno o más detectores. Ejemplos de detectores adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, sensores ópticos o fotodetectores, tal como sensores de píxeles activos (APS), fotodiodos de avalancha, sensores de imagen, dispositivos de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga acoplada intensificada (ICCD), diodos emisores de luz, contadores de fotones, bolómetros, detectores piroeléctricos, fotorresistores, células fotovoltaicas, fotodiodos, tubos fotomultiplicadores, fototransistores, fotoconductores de punto cuántico o fotodiodos y combinaciones de los mismos, entre otros fotodetectores. En ciertas realizaciones, la luz emitida por el canal de flujo se mide con un dispositivo de carga acoplada (CCD). Donde la luz emitida se mide con un CCD, el área superficial de detección activa del CCD puede variar, tal como de 0,01 cm2 a 10 cm2, tal como de 0,05 cm2 a 9 cm2, tal como de 0,1 cm2 a 8 cm2, tal como de 0,5 cm2 a 7 cm2 e incluso de 1 cm2 a 5 cm2.

En algunas realizaciones, los sistemas incluyen una o más cámaras o sensores de cámara para capturar una imagen del canal de flujo. Las cámaras adecuadas para capturar una imagen del flujo incluyen, pero no se limitan a, dispositivos con carga acoplada (CCD), dispositivos semiconductores con carga acoplada (CCD), sensores de píxeles activos (APS), sensores de imagen de semiconductores de óxido metálico complementarios (CMOS) o sensores de imagen semiconductores de óxido metálico de tipo N (NMOS).

En realizaciones de la presente descripción, los detectores de interés están configurados para medir la luz emitida por el canal de flujo a una o más longitudes de onda, tal como a 2 o más longitudes de onda, tal como a 5 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 10 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 25 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 50 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 100 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 200 o más longitudes de onda diferentes, tal como a 300 o más longitudes de onda diferentes e incluso la medida de luz transmitida a través de la cámara de muestra a 400 o más longitudes de onda diferentes.

En las realizaciones, el detector puede configurarse para medir la luz de forma continua o en intervalos discretos. En algunos casos, los detectores de interés están configurados para medir la luz de forma continua. En otros casos, los detectores de interés están configurados para tomar medidas en intervalos discretos, tal como medir la luz cada 0,001 milisegundos, cada 0,01 milisegundos, cada 0,1 milisegundos, cada 1 milisegundo, cada 10 milisegundos, cada 100 milisegundos e incluso cada 1000 milisegundos, o algún otro intervalo.

En ciertas realizaciones, la luz emitida por la muestra en el canal de flujo se mide con un sistema de formación de imágenes tal como los descritos las patentes de EE.UU. Nos. 8,248,597; 7,927,561; 7,738,094 y en la solicitud de patente de EE.UU. en tramitación con las presentes Nos. 13/590,114 presentada el 20 de agosto de 2012, 61/903,804 presentada el 13 de noviembre de 2013 y 61/949,833 presentada el 7 de marzo del 2014.

En ciertos casos, los sistemas de interés incluyen uno o más de los dispositivos microfluídicos objeto (como se ha descrito anteriormente) integrados en el sistema de formación de imágenes. En consecuencia, en estas realizaciones, los sistemas objeto no están configurados para recibir un dispositivo microfluídico descrito anteriormente, sino que están configurados para recibir la muestra de fluido directamente, que posteriormente se retira después del ensayo de la muestra. Por "retirado" se entiende que ninguna cantidad de muestra permanece en contacto con los sistemas objeto, incluyendo cualquier canal de flujo, el sitio de aplicación de la muestra, la entrada, así como la matriz porosa. En otras palabras, cuando se retira la muestra, todos los rastros de la muestra se eliminan de los componentes del sistema. En algunas realizaciones, los sistemas pueden incluir además uno o más dispositivos de lavado para limpiar el dispositivo microfluídico integrado. Por ejemplo, los dispositivos de lavado pueden incluir microconductos con o sin boquillas de pulverización para suministrar tampón de lavado para limpiar el dispositivo microfluídico. En ciertas realizaciones, estos sistemas incluyen un depósito para el almacenamiento de uno o más tampones de lavado.

Kits

Los aspectos de la invención incluyen además kits, donde los kits incluyen uno o más dispositivos microfluídicos como se describe en la presente memoria. En algunos casos, los kits pueden incluir uno o más componentes de ensayo (p. ej., reactivos marcados, tampones, etc., como se ha descrito anteriormente). En algunos casos, los kits pueden incluir además un dispositivo de recogida de muestras, p. ej., una lanza o aguja configurada para pinchar la piel para obtener una muestra de sangre completa, una pipeta, etc., según se desee. Los diversos componentes de ensayo de los kits pueden estar presentes en recipientes separados, o algunos de ellos o todos pueden estar combinados previamente. Por ejemplo, en algunos casos, uno o más componentes del kit, p. ej., los dispositivos microfluíficos, están presentes en una bolsa sellada, p. ej., una bolsa o sobre de lámina estéril.

Además de los componentes anteriores, los kits objeto pueden incluir además (en ciertas realizaciones) instrucciones para practicar los métodos objeto. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits objeto en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, p. ej., una hoja u hojas de papel en las que está impresa la información, en el embalaje del kit, en un prospecto, y similares. Otra forma más de estas instrucciones es un medio legible por ordenador, p. ej., disquete, disco compacto (CD), unidad flash portátil y similares, en el que se ha grabado la información. Otra forma más de estas instrucciones que puede estar presente es una dirección de sitio web que se puede utilizar a través de Internet para acceder a la información en un sitio retirado.

Utilidad

Los métodos, dispositivos y kits de la presente descripción encuentran uso en una variedad de aplicaciones diferentes y pueden usarse para determinar si un analito está presente en una multitud de tipos de muestras diferentes de una multitud de posibles fuentes. Dependiendo de la aplicación y el resultado deseado de los métodos descritos en esta memoria, un analito puede detectarse de manera cualitativa ("presente" vs "ausente"; "sí, por encima de un umbral predeterminado" vs "no, no por encima de un umbral predeterminado"; etc.) o de manera cuantitativa, p. ej., como una cantidad en una muestra (tal como la concentración en la muestra). Muchos tipos diferentes de analitos pueden ser analitos de interés, que incluyen pero no se limitan a: proteínas (que incluyen tanto proteínas libres como proteínas unidas a la superficie de una estructura, tal como una célula), ácidos nucleicos, partículas virales y similares. Además, las muestras pueden ser de fuentes in vitro o in vivo y las muestras pueden ser muestras de diagnóstico.

En la práctica de los métodos de la presente descripción, las muestras se pueden obtener de fuentes in vitro (p. ej., extracto de un cultivo celular desarrollado en laboratorio) o de fuentes in vivo (p. ej., un sujeto mamífero, un sujeto humano, un animal de investigación, etc.). En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de una fuente in vitro. Las fuentes in vitro incluyen, pero no se limitan a, cultivos de células procariotas (p. ej., bacterianas), cultivos de células eucariotas (p. ej., mamíferos, hongos) (p. ej., cultivos de líneas celulares establecidas, cultivos de líneas celulares conocidas o compradas, cultivos de líneas celulares inmortalizadas, cultivos de células primarias, cultivos de levaduras de laboratorio, etc.), cultivos de tejidos, eluyentes de cromatografía en columna, lisados/extractos celulares (p. ej., lisados/extractos que contienen proteínas, lisados/extractos que contienen ácidos nucleicos, etc.), sobrenadantes de empaquetamiento viral y similares. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de una fuente in vivo. Las fuentes in vivo incluyen organismos multicelulares vivos y pueden producir muestras de diagnóstico.

En algunas realizaciones, el analito es un analito de diagnóstico. Un "analito de diagnóstico" es un analito de una muestra que se ha obtenido o derivado de un organismo multicelular vivo, p. ej., un mamífero, para realizar un diagnóstico. En otras palabras, la muestra se ha obtenido para determinar la presencia de uno o más analitos de enfermedad para diagnosticar una enfermedad o afección. En consecuencia, los métodos son métodos de diagnóstico. Como los métodos son "métodos de diagnóstico", son métodos que diagnostican (es decir, determinan la presencia o ausencia de) una enfermedad (p. ej., enfermedad, diabetes, etc.) o afección (p. ej., embarazo) en un organismo vivo, tal como un mamífero (p. ej., un ser humano). Como tal, ciertas realizaciones de la presente descripción son métodos que se emplean para determinar si un sujeto vivo tiene una enfermedad o afección dada (p. ej., diabetes). Los "métodos de diagnóstico" también incluyen métodos que determinan la gravedad o el estado de una enfermedad o afección dada.

En ciertas realizaciones, los métodos son métodos para determinar si un analito está presente en una muestra de diagnóstico. Como tales, los métodos son métodos de evaluación de una muestra en la que el analito de interés puede estar presente o no. En algunos casos, se desconoce si el analito está presente en la muestra antes de realizar el ensayo. En otros casos, antes de realizar el ensayo, se desconoce si el analito está presente en la muestra en una cantidad mayor que (excede) una cantidad umbral predeterminada. En tales casos, los métodos son métodos para evaluar una muestra en la que el analito de interés puede estar presente o no en una cantidad que es mayor que (excede) un umbral predeterminado.

Muestras de diagnóstico incluyen aquellas obtenidas de fuentes in vivo (p. ej., un sujeto mamífero, un sujeto humano y similares) y pueden incluir muestras obtenidas de tejidos o células de un sujeto (p. ej., biopsias, muestras de tejido, sangre completa, sangre fraccionada, cabello, piel y similares). En algunos casos, las células, los líquidos o los tejidos derivados de un sujeto se cultivan, almacenan o manipulan antes de la evaluación y dicha muestra puede considerarse una muestra de diagnóstico si los resultados se utilizan para determinar la presencia, ausencia, estado o gravedad de una enfermedad (p. ej., náusea, diabetes, etc.) o afección (p. ej., embarazo) en un organismo vivo.

En algunos casos, una muestra de diagnóstico es una muestra de tejido (p. ej., sangre completa, sangre fraccionada, plasma, suero, saliva y similares) o se obtiene de una muestra de tejido (p. ej., sangre completa, sangre fraccionada, plasma, suero, saliva, piel, cabello y similares). Un ejemplo de muestra de diagnóstico incluye, pero no se limita a, cultivos de células y tejidos derivados de un sujeto (y derivados del mismo, tales como sobrenadantes, lisados y similares); muestras de tejidos y fluidos corporales; muestras no celulares (p. ej., eluyentes de columna; biomoléculas acelulares tales como proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos; mezclas de reacción de síntesis; mezclas de reacción de amplificación de ácido nucleico; reacciones bioquímicas o enzimáticas in vitro o disoluciones de ensayo; o productos de otras reacciones in vitro e in vivo, etc.); etc.

Los métodos objeto se pueden emplear con muestras de una variedad de diferentes tipos de sujetos. En algunas realizaciones, una muestra es de un sujeto dentro de la clase mammalia, que incluye, p. ej., los órdenes carnívoros (p. ej., perros y gatos), roedores (p. ej., ratones, cobayas y ratas), lagomorfa (p. ej., conejos) y primates. (p. ej., humanos, chimpancés y monos), y similares. En ciertas realizaciones, los animales o huéspedes, es decir, los sujetos, son humanos.

Experimental

El siguiente ejemplo se ofrece a modo de ilustración y no a modo de limitación. El ejemplo se proporciona solo con fines ilustrativos y no pretende limitar el alcance de la presente descripción de ninguna manera. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (p. ej., cantidades, temperaturas, etc.), pero, por supuesto, se deben permitir algunos errores y desviaciones experimentales.

Se carga una cantidad de punción digital (5-50 gl) de sangre completa en un sitio de aplicación de la muestra de un dispositivo capilar de esta invención (mostrado en las Figs. 2A y B) donde se introduce en el elemento poroso mediante fuerza capilar. El elemento poroso es una frita porosa y una mezcla de ensayo asociada. La composición de la reacción es un tampón conservado que consta de BSA, MES, D+ trehalosa, EDTA, PVP y una mezcla de reactivos. La relación BSA: trehalosa: PVP en peso seco es 21: 90: 1. La mezcla de reactivos consta de un conjunto de conjugados anticuerpo-colorante, específicos para los antígenos CD14, CD4, CD45RA y CD3 en la muestra de sangre. Una vez cargado, se coloca una tapa sobre el sitio de aplicación de la muestra, que sella el sitio de aplicación de la muestra y una salida de ventilación del canal capilar. El flujo capilar de la sangre procede a través del elemento poroso y a lo largo del canal, sin impedimentos por la tapa que sella el capilar del ambiente exterior. El flujo puede terminar en una unión hidrófoba. Los anticuerpos anti-CD14, CD4, CD45RA y CD3 presentes en el elemento poroso se disuelven en la muestra de sangre a una velocidad sustancialmente constante a medida que la muestra fluye a través del elemento poroso y a lo largo del canal capilar durante aproximadamente 2 minutos desde el momento en que se aplicó la muestra. La muestra de sangre fluye a través del elemento poroso sustancialmente sin obstáculos y sin filtrar. Los componentes específicos de la muestra de sangre se unirán a los conjugados colorante-anticuerpo, lo que permitirá la detección y cuantificación de analitos en la muestra. La detección se lleva a cabo usando un LED para iluminar el cartucho donde se localiza la región de la pared transmisiva. La señal óptica se mide mediante la formación de imágenes a través de la pared ópticamente transmisiva del canal capilar usando un microscopio de baja potencia con un detector de cámara CCD y un filtro apropiado. Un diagrama esquemático de la imagen se muestra en la Fig. 3A a través de la pared transmisiva 50 del canal capilar 60. Un diagrama esquemático de los resultados del análisis de la imagen (Fig. 3B) muestra que, después del procesamiento, la distribución de la señal de los conjugados coloranteanticuerpo unidos al analito en las células es mediblemente más alto que el conjugado libre en el flujo de muestra. El procesamiento de imágenes permite la reducción de la señal de fondo 70 para formar una imagen más clara de las células marcadas con los conjugados colorante-anticuerpo y determinar el número de células que dan positivo en anticuerpos CD14, CD4, CD45RA, CD3.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo microfluídico que comprende:

un sitio de aplicación de la muestra;

un canal de flujo en comunicación fluida con el sitio de aplicación de la muestra; y

un componente poroso colocado entre el sitio de aplicación de la muestra y el canal de flujo,

en donde el componente poroso llena una región que se extiende desde el sitio de aplicación de la muestra hasta el canal de flujo,

comprendiendo el componente poroso una matriz porosa,

un tampón; y

un reactivo de ensayo colocado dentro de los poros de la matriz porosa.

2. El dispositivo microfluídico según la reivindicación 1, en donde la matriz porosa está configurada para proporcionar la mezcla del reactivo de ensayo con una muestra que fluye a través de la misma, por medio de una red de poros interconectados, cuya red proporciona un medio para mezclar una muestra aplicada con un ensayo reactivo presente en la matriz porosa.

3. El dispositivo microfluídico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la matriz porosa comprende poros que tienen diámetros entre 1 pm y 200 pm.

4. El dispositivo microfluídico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la matriz porosa comprende un volumen de poros entre 1 pl y 25 pl.

5. El dispositivo microfluídico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el volumen del poro está entre el 25% y el 75% del volumen de la matriz porosa.

6. El dispositivo microfluídico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la matriz porosa es una frita.

7. El dispositivo microfluídico según la reivindicación 1, en donde el tampón comprende albúmina de suero bovino (BSA), trehalosa, polivinilpirrolidona (PVP) o ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico o una combinación de los mismos.

8. El dispositivo microfluídico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el reactivo comprende un miembro de unión específico del analito.

9. El dispositivo microfluídico según la reivindicación 8, en donde el miembro de unión específico del analito se une a un marcador detectable.

10. El dispositivo microfluídico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el dispositivo está configurado para que sea portátil.

11. Un método que comprende:

poner en contacto una muestra con un sitio de aplicación de la muestra de un dispositivo microfluídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14;

iluminar la muestra en el canal de flujo con una fuente de luz; y

detectar luz de la muestra.

12. Un sistema que comprende:

una fuente de luz;

un detector óptico para detectar una o más longitudes de onda de luz; y

un dispositivo microfluídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14.

13. Un kit que comprende:

un dispositivo microfluídico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14; y

un recipiente que aloja el dispositivo.

14. El dispositivo según la reivindicación 6, en donde la frita comprende un sólido granulado sinterizado.

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