JP2015078933A - イムノアッセイ方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】従来のイムノアッセイ法よりも簡便且つ迅速にB/F分離を行うことが可能なイムノアッセイ方法の提供。【解決手段】被検出物質に結合する抗体を表面に有する粒子と、前記被検出物質とを接触させる工程、前記被検出物質が前記抗体に結合することにより前記粒子同士が複数凝集してなる凝集粒子と、前記被検出物質を結合していなために凝集していない前記粒子(非凝集粒子)とを分離する工程、及び、前記凝集粒子又は前記非凝集粒子を検出する工程、を含むイムノアッセイ方法であって、前記凝集粒子が通過せず、前記非凝集粒子が通過する微細孔を複数備えたフィルターデバイス1を用いて前記分離を行うことを特徴とするイムノアッセイ方法。【選択図】図1
Description
本発明は、ナノ流路が形成されたフィルター部を有する基板を使用して、試料中の被検出物質を定性的又は定量的に調べるイムノアッセイ方法に関する。
従来、検体中に含まれる被検出物質の有無又は含有量を調べる方法として、被検出物質に結合する抗体を利用する方法が知られている。具体的には、ラテックス凝集法(特許文献1)、化学発光免疫測定法(特許文献2)、イムノクロマト法(特許文献3)などが知られている。
従来のラテックス凝集法においては、ラテックス表面に担持させた抗体(若しくは抗原)と検体中の抗原(若しくは抗体)との抗原抗体反応の結果生じるラテックス粒子の凝集度合を、濁度測定により定量することが一般的である。この方法はB/F分離を行わない(未結合の抗体と抗原に結合した抗体との分離を行わない)で検出が行えるため装置の単純化が可能であるというメリットがある一方、検体中の夾雑物質の影響を受けやすく、検出感度が低いという問題がある。例えば検体中に数ng/mL以上の被検出物質が含まれていないと、検出が困難な場合が多い。
従来の化学発光免疫測定法の一例においては、磁性粒子表面に担持させた抗体(若しくは抗原)と検体中の抗原(若しくは抗体)との抗原抗体反応の結果、磁性粒子表面に抗体と抗原の複合体を形成する。この複合体を表面に結合した磁性粒子を磁力で容器の壁面に集めて、未反応物を含む溶液を除いた後、当該磁性粒子を洗浄し、さらに発光試薬を添加する。この結果、被検出物質を含む複合体の形成量に応じた発光を検出する。この方法は、いわゆるELISAと基本原理は同じであるが、B/F分離を行う際に又は夾雑物質の洗浄の際に、磁性粒子を磁力で一時的に固定し、さらに化学発光による検出を採用することにより、高感度測定を実現している。しかし、洗浄処理の際に、溶液中に分散している磁性粒子を集めて、溶液全体を置換する洗浄処理を複数回繰り返す操作は、煩雑であり、自動装置による処理を複雑化し、廃液が増加する問題がある。また、化学発光を定量するためには、高価な検出器(フォトマル)が必要である。
従来のイムノクロマト法の一例においては、抗体が表面に固定化された粒子と検体中の抗原との複合体を形成した後、この複合体を表面に結合した粒子をセルロース等の吸水性を有する材料からなるメンブレン上に展開する。メンブレン上の特定位置に予め固定化されているキャプチャー抗体は、複合体を表面に有する前記粒子を捕捉する。このため、メンブレン上に展開された前記粒子がキャプチャー抗体に捕捉された量を定量することにより、検体中の被検出物質を定量することができる。しかし、メンブレン上でB/F分離を行うため、B/F分離の精度が低く、メンブレンに被検出物質が非特異的に吸着して失われる恐れもあるため、他の方法に比べて測定感度や定量性が低くなる問題がある。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、従来のイムノアッセイ法よりも簡便且つ迅速にB/F分離を行うことが可能なイムノアッセイ方法の提供を課題とする。
(1)被検出物質に結合する抗体を表面に有する粒子と、前記被検出物質とを接触させる工程、前記被検出物質が前記抗体に結合することにより前記粒子同士が複数凝集してなる凝集粒子と、前記被検出物質を結合していなために凝集していない前記粒子(非凝集粒子)とを分離する工程、及び、前記凝集粒子又は前記非凝集粒子を検出する工程、を含むイムノアッセイ方法であって、前記凝集粒子が通過せず、前記非凝集粒子が通過する微細孔を複数備えたフィルターデバイスを用いて前記分離を行うことを特徴とするイムノアッセイ方法。
上記(1)のイムノアッセイ方法によれば、前記微細孔を複数備えたフィルターデバイスを用いているため、凝集粒子(B)と非凝集粒子(F)とを分離するB/F分離を簡便且つ迅速に行い、被検出物質を容易に定量することができる。
上記(1)のイムノアッセイ方法によれば、前記微細孔を複数備えたフィルターデバイスを用いているため、凝集粒子(B)と非凝集粒子(F)とを分離するB/F分離を簡便且つ迅速に行い、被検出物質を容易に定量することができる。
(2)前記フィルターデバイスの微細孔の周辺に集積した前記凝集粒子を定量することを特徴とする前記(1)に記載のイムノアッセイ方法。
上記(2)のイムノアッセイ方法によれば、フィルター部を構成する微細孔の端部に必然的に凝集粒子が集積するため、試料(検体)に含まれる凝集粒子の定量及び被検出物質の定量を容易に行うことができる。
上記(2)のイムノアッセイ方法によれば、フィルター部を構成する微細孔の端部に必然的に凝集粒子が集積するため、試料(検体)に含まれる凝集粒子の定量及び被検出物質の定量を容易に行うことができる。
(3)前記集積した凝集粒子を光学的手法によって定量することを特徴とする前記(2)に記載のイムノアッセイ方法。
上記(3)のイムノアッセイ方法によれば、試料(検体)に含まれる凝集粒子を目視で定量するよりも正確に定量することができる。
上記(3)のイムノアッセイ方法によれば、試料(検体)に含まれる凝集粒子を目視で定量するよりも正確に定量することができる。
(4)前記フィルターデバイスは、基体と、前記基体に内在された第一空間部及び第二空間部と、第一空間部と第二空間部を連通する複数の微細孔を有するフィルター部と、が備えられてなることを特徴とする前記(1)〜(3)の何れか一項に記載のイムノアッセイ方法。
上記(4)のイムノアッセイ方法によれば、凝集粒子及び非凝集粒子を含む試料を、第一空間部に流入し、フィルター部を通過させ、第二空間部へ流入させることにより、第一空間部に凝集粒子を留めて、第二空間部に非凝集粒子を分離することができる。
上記(4)のイムノアッセイ方法によれば、凝集粒子及び非凝集粒子を含む試料を、第一空間部に流入し、フィルター部を通過させ、第二空間部へ流入させることにより、第一空間部に凝集粒子を留めて、第二空間部に非凝集粒子を分離することができる。
(5)前記凝集粒子及び前記非凝集粒子を含む溶液を、前記第一空間部に注入し、前記フィルター部を構成する複数の微細孔を通過させて、前記第二空間部へ流入させることによって、前記第一空間部に開口する前記複数の微細孔の第一端部の周辺において前記凝集粒子を集積させるとともに、前記複数の微細孔を通過した前記非凝集粒子を前記第二空間部に流入させることを特徴とする前記(4)に記載のイムノアッセイ方法。
上記(5)のイムノアッセイ方法によれば、フィルター部を構成する微細孔の第一端部に必然的に凝集粒子を集積することができるため、試料(検体)に含まれる凝集粒子の定量及び被検出物質の定量を容易に行うことができる。また、第二空間部に流入した非凝集粒子を定量し、元の試料に含まれていた全粒子の量から非凝集粒子の量を差し引くことによって凝集粒子の量を推定し、試料に含まれる被検出物質を定量することもできる。
上記(5)のイムノアッセイ方法によれば、フィルター部を構成する微細孔の第一端部に必然的に凝集粒子を集積することができるため、試料(検体)に含まれる凝集粒子の定量及び被検出物質の定量を容易に行うことができる。また、第二空間部に流入した非凝集粒子を定量し、元の試料に含まれていた全粒子の量から非凝集粒子の量を差し引くことによって凝集粒子の量を推定し、試料に含まれる被検出物質を定量することもできる。
本発明のイムノアッセイ方法においては、前記微細孔を複数備えたフィルターデバイスを用いているため、凝集粒子(B)と非凝集粒子(F)とを分離するB/F分離を簡便且つ迅速に行い、被検出物質を容易に定量することができる。
<イムノアッセイ方法>
本発明の第一態様のイムノアッセイ方法は、粒子に被検出物質を接触させる工程(凝集工程)と、被検出物質を結合することによって凝集した凝集粒子と、被検出物質を結合せずに凝集していない非凝集粒子とを分離する工程(分離工程)と、凝集粒子又は非凝集粒子を検出する工程(検出工程)と、を有するアッセイ方法である。
本発明の第一態様のイムノアッセイ方法は、粒子に被検出物質を接触させる工程(凝集工程)と、被検出物質を結合することによって凝集した凝集粒子と、被検出物質を結合せずに凝集していない非凝集粒子とを分離する工程(分離工程)と、凝集粒子又は非凝集粒子を検出する工程(検出工程)と、を有するアッセイ方法である。
前記粒子の表面に前記被検出物質に結合する抗体を固定しておくことによって、当該粒子の表面の抗体を介して、粒子と被検出物質とを結合することができる。この結合は、いわゆる抗原抗体反応を利用している。第一の粒子の抗体に結合した抗原である被検出物質に対して、第二の粒子の抗体が結合することが可能である。これにより、第一の粒子と第二の粒子が、互いの粒子表面の抗体に結合した被検出物質を介して連結した状態となる。本明細書及び特許請求の範囲において、このように被検出物質を介して連結した複数の粒子をまとめて「凝集粒子」と呼ぶ。凝集粒子は、2個の粒子が連結してなる場合もあるし、3個以上の粒子が多数連結してなる場合もある。
試薬として、被検出物質に結合する抗体を表面に固定した粒子を含む溶液を準備する。この試薬と、被検出物質の有無又は含有量を確認する試料とを混合する。もしもこの試薬を含んだ試料中に被検出物質が含まれていれば、抗原抗体反応が起きることによって、凝集粒子が生成する(凝集工程)。この凝集粒子の有無を検出することによって、試料中に被検出物質が含まれていることを定性的に調べることができる。また、この凝集粒子の生成量を検出し、予め準備した凝集粒子の生成量と被検出物質の含有量との関係を示す検量線を参照することによって、試料中の被検出物質を定量的に調べることができる(検出工程)。
前記凝集工程は、従来のラテックス凝集法と同様の方法で行うことができる。
従来のラテックス凝集法においては、抗原抗体反応を起こした前記試料に測定光を照射して、その光の散乱の程度又は濁度の変化から凝集粒子の生成の有無又は生成量を測定している。通常、前記試料に含まれる被検出物質以外の多量の夾雑物質が測定に干渉するため、測定感度が落ちる問題がある。
また、従来の化学発光免疫測定法においては、前記試料中で抗原抗体反応を起こした凝集粒子と非凝集粒子とを区別せずに、全ての粒子を固定する。この固定化した粒子と、抗原抗体反応後の試料溶液を分離し、さらに、固定化した粒子を清浄な溶液で洗浄することによって、固定化した粒子に付着していた夾雑物質を洗い落とすことによって、測定感度を高めることが行われている。しかし、このような従来方法では、測定光による検出を行う前に、粒子を一時的又は定常的に固定化し、これを洗浄する、という多段階の処理を要する問題がある。
一方、本発明の第一態様のアッセイ方法によれば、後述するように、凝集工程における抗原抗体反応を終えた試料をナノ流路フィルターデバイス(以下、NFデバイスと呼ぶことがある。)に導入し、NFデバイスのフィルター部を通過させる、という簡単かつ迅速な処理によって、試料から凝集粒子を篩い分けて、夾雑物質や非凝集粒子と分離することができる(分離工程)。これが可能である理由は、NFデバイスのフィルター部には、凝集粒子が通過できない程度に孔径が小さく、非凝集粒子が通過できる程度に孔径が大きい、微小なナノ流路が形成されているからである。
上記の分離工程において試料をNFデバイスのフィルター部に通過させることによって、フィルター部に凝集粒子が集積する。この集積した凝集粒子を検出する方法としては、光学的手法が挙げられる。前記光学的手法としては、例えば、前記集積した凝集粒子に対して測定光を照射し、吸光度、散乱度、又は蛍光発光量を測定することにより、前記凝集粒子を定量する方法が挙げられる。より具体的には、例えば、粒子が蛍光物質を含有する場合には、蛍光顕微鏡で集積した凝集粒子を観察し、粒子からの蛍光を定量することにより、凝集粒子を定量する方法が挙げられる。この他の方法として、例えば、粒子が色素を含有する場合には、集積した粒子をその着色度合いにより目視で確認することで、定性的に調べるか若しくは大まかに定量する方法が挙げられる。また、前記色素含有粒子の凝集度合いをCCDやフォトダイオード等の光検出器を介してデジタル化し定量する方法が挙げられる。また、粒子が磁性体を含む場合には集積した凝集粒子の磁性量を磁気センサで定量する方法が挙げられる。
さらに、前記粒子が蛍光物質や色素を含有しない場合には、粒子表面に固定化された抗体(もしくは抗原)に対して特異的に結合するような抗体を予め酵素や蛍光基質で標識しておき、その標識抗体を凝集粒子に対して反応させる事で、凝集粒子の量に応じた酵素量や蛍光基質の量を定量する方法が挙げられる。
前記凝集工程で用いる粒子の材料は特に制限されず、有機材料でもよいし、無機材料でもよい。粒子の表面に抗体を固定することが容易であり、溶液中での分散性に優れる有機材料として、例えば有機高分子からなる粒子が好ましく、ラテックスからなる粒子がより好ましい。
前記粒子の粒子径は、使用するNFデバイスのナノ流路の孔径の短辺よりも小さく、ナノ流路を通過可能な大きさであることが好ましい。さらに、前記粒子が2個以上連結した凝集粒子がナノ流路を通過できない大きさであることがより好ましい。ここで、前記粒子の粒子径は、公知の動的光散乱法により測定した平均粒径値である。本実施態様に適した粒度分布を有する粒子について、後で詳述する。
前記粒子の表面に固定する抗体は、目的の被検出物質に結合することが可能であれば特に制限されない。前記抗体は、Fc領域を有する抗体であってもよいし、Fc領域を有さないFab又はF(ab’)からなる抗体であってもよい。抗体のクラスも特に制限されず、例えば、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等が挙げられる。
前記抗体は、従来公知の方法によって作製することができる。前記抗体としては、例えば、被検出物質で免疫したウサギやマウスの血清から精製して得られるポリクローナル抗体であってもよいし、免疫した動物の抗体産生細胞のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であってもよいし、さらにはファージディスプレイ法によって作製されたモノクローナル抗体であってもよい。
前記抗体として、被検出物質の1つのエピトープに結合する単一種類の抗体を単独で用いてもよいし、被検出物質の複数のエピトープに結合する複数種類の抗体を併用してもよい。
前記被検出物質としては、抗体に認識され得るエピトープ(抗原決定基)を有する物質であれば特に制限されず、生体由来物質であってもよいし、非生体由来物質であってもよい。生体由来物質としては、例えば、病原性微生物、ウイルス、癌、アレルゲン等が有するタンパク質、ペプチド、脂質、糖鎖、核酸などが挙げられる。
<フィルターデバイス>
本発明のイムノアッセイ方法に適用可能なフィルターデバイスとして、例えば、基体と、前記基体に内在され、抗体を介して被検出物質と結合した粒子が凝集してなる凝集粒子、及び非凝集粒子を含む溶液が注入される第一空間部と、前記基体に内在され、前記第一空間部に面して配置された、前記凝集粒子と前記非凝集粒子とが篩い分けられるフィルター部と、が少なくとも備えられているデバイスが挙げられる。
本発明のイムノアッセイ方法に適用可能なフィルターデバイスとして、例えば、基体と、前記基体に内在され、抗体を介して被検出物質と結合した粒子が凝集してなる凝集粒子、及び非凝集粒子を含む溶液が注入される第一空間部と、前記基体に内在され、前記第一空間部に面して配置された、前記凝集粒子と前記非凝集粒子とが篩い分けられるフィルター部と、が少なくとも備えられているデバイスが挙げられる。
上記フィルターデバイスによれば、凝集粒子(B)と非凝集粒子(F)とを分離するB/F分離を簡便且つ迅速に行い、被検出物質を容易に定量することが可能なイムノアッセイを実施できる。
前記フィルターデバイスには、前記第一空間部に注入された前記溶液が前記フィルター部を通過して、前記溶液から前記凝集粒子が除去された溶液が流入する第二空間部が、前記基体内に更に備えられていてもよい。このようなデバイスとして、例えば、後述する第一実施形態〜第三実施形態及び第五実施形態のNFデバイスが挙げられる。
第二空間部を備えた上記フィルターデバイスによれば、前記凝集粒子が除去された溶液を受け入れる別体の容器若しくは溶液吸収材を準備する必要がない。つまり、上記フィルターデバイスの外部に前記溶液を流出させずに、当該デバイス内のみで溶液の流通を完結することができる。
上記フィルターデバイスのフィルター部には、前記第一空間部と前記第二空間部とを連通する微細孔が複数配置されていることが好ましい。
凝集粒子及び非凝集粒子を含む溶液を、第一空間部から前記微細孔内を通過させて第二空間部へ流通させる際に、凝集粒子を通過させず、非凝集粒子及び溶媒を通過させることによって、前記篩い分けを効率よく行うことができる。
凝集粒子及び非凝集粒子を含む溶液を、第一空間部から前記微細孔内を通過させて第二空間部へ流通させる際に、凝集粒子を通過させず、非凝集粒子及び溶媒を通過させることによって、前記篩い分けを効率よく行うことができる。
前記微細孔が、前記第一空間部に開口する第一開口部、及び前記第二空間部に開口する第二開口部を有することが好ましい。
凝集粒子及び非凝集粒子を含む溶液を、第一空間部から前記微細孔内を通過させて第二空間部へ流通させることによって、第一空間部に開口する第一開口部及びその周辺に、凝集粒子を集積することができる。この凝集粒子を定量することにより、被検出物質を定量することができる。
凝集粒子及び非凝集粒子を含む溶液を、第一空間部から前記微細孔内を通過させて第二空間部へ流通させることによって、第一空間部に開口する第一開口部及びその周辺に、凝集粒子を集積することができる。この凝集粒子を定量することにより、被検出物質を定量することができる。
上記フィルターデバイスのフィルター部には、前記第一空間部と前記基体の外部とを連通する微細孔が複数配置されていてもよい。このようなデバイスとして、例えば、後述する第四実施形態のNFデバイスが挙げられる。
第二空間部を備えない上記フィルターデバイスは、その構造がシンプルであるため、デバイスの製造が容易である。また、使用時の必要に応じて、デバイスの外部に別体の溶液保持用の容器若しくは溶液吸収材を配置しても構わない。
第二空間部を備えない上記フィルターデバイスによれば、凝集粒子及び非凝集粒子を含む溶液を、第一空間部から前記微細孔内を通過させてデバイスの外部へ流通させる際に、凝集粒子を通過させず、非凝集粒子及び溶媒を通過させることによって、前記篩い分けを効率よく行うことができる。
第二空間部を備えない上記フィルターデバイスによれば、凝集粒子及び非凝集粒子を含む溶液を、第一空間部から前記微細孔内を通過させてデバイスの外部へ流通させる際に、凝集粒子を通過させず、非凝集粒子及び溶媒を通過させることによって、前記篩い分けを効率よく行うことができる。
本発明のイムノアッセイ方法に適用可能なフィルターデバイスのフィルター部には、前記第一空間部に開口する第一開口部、及び前記基体の外部に開口する第二開口部を有する微細孔が複数配置されていることが好ましい。
凝集粒子及び非凝集粒子を含む溶液を、第一空間部から前記微細孔内を通過させてデバイスの外部へ流通させることによって、第一空間部に開口する第一開口部及びその周辺に、凝集粒子を集積することができる。この凝集粒子を定量することにより、被検出物質を定量することができる。
凝集粒子及び非凝集粒子を含む溶液を、第一空間部から前記微細孔内を通過させてデバイスの外部へ流通させることによって、第一空間部に開口する第一開口部及びその周辺に、凝集粒子を集積することができる。この凝集粒子を定量することにより、被検出物質を定量することができる。
以下、各実施形態のフィルターデバイスをより詳細に説明する。
《第一実施形態》
ナノ流路を備えたフィルターデバイス(以下、NFデバイスと呼ぶことがある。)の第一実施形態は、凝集した粒子が通過せず、凝集していない粒子が通過可能なフィルター機構を構成するナノ流路(微細孔)を複数備えている。第一実施形態のNFデバイス1は、図1に示すように、試料を導入する第一空間部2S、フィルター部3、フィルター部を通過した試料を導出する第二空間部4Sを備えている。
ナノ流路を備えたフィルターデバイス(以下、NFデバイスと呼ぶことがある。)の第一実施形態は、凝集した粒子が通過せず、凝集していない粒子が通過可能なフィルター機構を構成するナノ流路(微細孔)を複数備えている。第一実施形態のNFデバイス1は、図1に示すように、試料を導入する第一空間部2S、フィルター部3、フィルター部を通過した試料を導出する第二空間部4Sを備えている。
NFデバイス1の第一基板5の上面5aには、第一空間部2Sを構成する第一凹部2と、第二空間部4Sを構成する第二凹部4が設けられている。第一凹部の側面2aと第二凹部の側面4aは互いに対向しており、複数のナノ流路7の第一端部と第二端部とが、それぞれ側面2aと側面4aに開口している。複数のナノ流路7は第一空間部2Sと第二空間部4Sを連通している。また複数のナノ流路7は、第一基板5の上面5aと平行になるように延在しており、複数のナノ流路7は互いに平行に設けられている。
すなわち、第一実施形態のNFデバイス1は、第一基板5及び第二基板6からなる基体と、第一基板の上面5aに設けられた、第一凹部2からなる第一空間部2S及び第二凹部4からなる第二空間部4Sと、第一基板5に内在され、互いに対向する第一空間部2S及び第二空間部4Sに対してそれぞれ面するように配置され、前記凝集粒子と前記非凝集粒子とが篩い分けられる複数のナノ流路7によって構成されたフィルター部3と、が少なくとも備えられたデバイスである。
フィルター部3を構成するナノ流路7及び第一基板5の断面を図2に示す。また、第一凹部の側面2aによって構成されるフィルター部の第一端面2aを図3に示す。第一端面2aに開口する複数のナノ流路の第一端部7aの形状及びナノ流路7の断面の形状は矩形として描かれているが、略矩形、楕円、円、その他の多角形であってもよい。ナノ流路7の第一端部7a及びナノ流路の断面の短辺(又は最短径:最も短く取った直径)は、試料に含まれる凝集していない粒子(非凝集粒子)の粒子径よりも長く、試料に含まれる凝集した粒子(凝集粒子)の粒子径よりも短いことが好ましい。ここで、凝集粒子の粒子径は、非凝集粒子の粒子径の約2倍以上である。また、ナノ流路の断面の長辺(又は最長径:最も長く取った直径)は、試料に含まれる非凝集粒子の粒子径よりも十分に長いことが好ましい。
この構成により、第一空間部2Sに流入された試料に含まれる粒子のうち、ナノ流路を通過できない大きさの粒子は第一空間部に留まる一方、ナノ流路を通過する大きさの粒子は、ナノ流路を通って第二空間部4Sへ流入する。このように、複数のナノ流路7が設けられたフィルター部3を備えるNFデバイス1は、試料に含まれる粒子を、その粒子径の違いによって篩い分ける手段として用いられる。
第一基板5に内在されてフィルター部3を構成するナノ流路7の数は特に制限されず、例えば5本〜500本程度を配置することができる。各ナノ流路は互いに平行に配置されていてもよいし、非平行に配置されていてもよい。また、フィルター部の第一端面2aの単位面積当たりに開口するナノ流路の第一端部7aの個数は特に制限されず、例えば任意の微細孔の開口部(第一端部)の1つを基準として、その短径の方向に0.01〜7個/マイクロメートル(μm)の開口部を配置することができる。この密度で開口部を有するフィルター部は、試料のろ過効率に優れる。
フィルター部3を構成するナノ流路7の長さは特に制限されないが、孔径に対して長さが長い程、試料を通過させるために必要な送液の圧力が高くなる傾向がある。これを考慮して、ナノ流路7の長さを、例えば3μm〜5,000μmとすることができる。
第一基板の上面5aには第二基板6が貼り合わされて、本実施形態のデバイスの基体をなしている。この基体の内部において、第一凹部2の上部が閉じられた第一空間部2Sと、第二凹部4の上部が閉じられた第二空間部4Sとが形成されている。第一空間部2SはNFデバイス1の第一側面に開口部を有し、第二空間部4SはNFデバイス1の第二側面に開口部を有する。第一側面と第二側面とは互いに対向する配置関係にある。
《第二実施形態》
第二実施形態のNFデバイス11は、図4に示すように、第一実施形態のNFデバイス1において、第一基板の第一凹部2の底面に複数のトレンチ(溝)が形成された構成を有する。第二実施形態のNFデバイス11において、第一基板15の第一凹部12の底面12bに形成された複数のトレンチ18の第一端部は、フィルター部13の第一端面12aにおいて、それぞれ複数のナノ流路17の第一端部と連通している。この構成において、フィルター部13の第一端面12aにおけるナノ流路17の孔径については、短辺は第一実施形態のNFデバイス1におけるナノ流路7の孔径の短辺と同じであるが、長辺については、トレンチの深さの分だけ、第一実施形態のそれよりも長くなっている。
第二実施形態のNFデバイス11は、図4に示すように、第一実施形態のNFデバイス1において、第一基板の第一凹部2の底面に複数のトレンチ(溝)が形成された構成を有する。第二実施形態のNFデバイス11において、第一基板15の第一凹部12の底面12bに形成された複数のトレンチ18の第一端部は、フィルター部13の第一端面12aにおいて、それぞれ複数のナノ流路17の第一端部と連通している。この構成において、フィルター部13の第一端面12aにおけるナノ流路17の孔径については、短辺は第一実施形態のNFデバイス1におけるナノ流路7の孔径の短辺と同じであるが、長辺については、トレンチの深さの分だけ、第一実施形態のそれよりも長くなっている。
すなわち、第二実施形態のNFデバイス11は、第一基板15及び第二基板16からなる基体と、第一基板の上面15aに設けられた、第一凹部12からなる第一空間部12S及び第二凹部14からなる第二空間部14Sと、第一基板15に内在され、互いに対向する第一空間部12S及び第二空間部14Sに対してそれぞれ面するように配置され、前記凝集粒子と前記非凝集粒子とが篩い分けられる複数のナノ流路17によって構成されたフィルター部13と、が少なくとも備えられたデバイスである。
さらに、第一凹部の底面12bには複数のトレンチ18がナノ流路17と略平行に形成されている。各トレンチ18の第一端部は、フィルター部13の第一端面12aを通過して更に第二空間部14Sの方向へ延び、フィルター部13の第二端面14aまで延びており、フィルター部13において、各微細孔に連通するように接続されている。各トレンチ18の第二端部(第一端部とは反対側の端部)は、第一基板15の側面に開口している。
第二実施形態のNFデバイス11の第一基板15のトレンチ18及びナノ流路17の断面を図5に示す。第一端面12aに開口するナノ流路17の孔径の長辺(基板厚み方向の辺)は、第二端面側14aのナノ流路17の孔径の長辺よりもトレンチ18の深さLの分だけ長くなっている。
第一凹部12の底面12bに形成された各トレンチ18の幅は、各トレンチが連通するナノ流路の短辺と同じであることが好ましい。すなわち、各トレンチ18の幅(基板平面方向の長さ)は、前記非凝集粒子が通過し、前記凝集粒子が通過しない長さであることが好ましい。この構成であると、第一凹部12の側面12aに加えて、底面12bもフィルター部13の第一端面12aと同様に機能することが可能となる。このため、フィルター部のフィルター面積が実質的に拡大され、フィルター機能が向上する。この結果、単位時間当たりに処理可能な試料を増量することができる。更に、フィルター部の目詰まりを確実に防ぐことができる。
第一基板15に内在されてフィルター部13を構成するナノ流路17の数と、ナノ流路17に接続されるトレンチの数は特に制限されず、例えば5本〜500本程度を配置することができる。各ナノ流路及びトレンチは互いに平行に配置されていてもよいし、非平行に配置されていてもよい。また、フィルター部の第一端面12aの単位面積当たりに開口するナノ流路17の第一端部の個数は特に制限されず、例えば任意の微細孔の開口部(第一端部)の1つを基準として、その短径の方向に0.01〜7個/マイクロメートル(μm)の開口部を配置することができる。この密度で開口部を有するフィルター部は、試料のろ過効率に優れる。
フィルター部13を構成するナノ流路17の長さは特に制限されないが、孔径に対して長さが長い程、試料を通過させるために必要な送液の圧力が高くなる傾向がある。これを考慮して、ナノ流路17の長さを、例えば3μm〜5,000μmとすることができる。また、トレンチ18の長さは特に制限されず、例えば3μm〜10,000μmとすることができる。
第一基板の上面15aには第二基板16が貼り合わされて、本実施形態のデバイスの基体をなしている。この基体の内部において、第一凹部12の上部が閉じられた第一空間部12Sと、第二凹部14の上部が閉じられた第二空間部14Sとが形成されている。第二実施形態のNFデバイス11の第一空間部12Sに、試料を導入すると、非凝集粒子は、フィルター部13の端面からナノ流路17内に侵入して第二空間部14Sへ通過することもできるし、第一空間部12Sの底面12bに設けられたトレンチ18内に潜って、フィルター部13へ侵入して第二空間部14Sへ通過することもできる。第二実施形態のNFデバイス11のフィルター部13を通過できる粒子は、ナノ流路17の孔径の短辺よりも小さい非凝集粒子のみであり、ナノ流路17の孔径の短辺よりも大きい凝集粒子は、第一空間部12Sに留まり、フィルター部13の第一端面12a付近に集積する。
《第三実施形態》
第三実施形態のNFデバイス21は、図6に示すように、第一実施形態のNFデバイス1において、第一基板の第一凹部2の底面に複数のトレンチ(溝)が形成され、更に、第二基板の第二凹部4の底面に複数のトレンチ(溝)が形成された構成を有する。
第三実施形態のNFデバイス21において、第一基板25の第一凹部22の底面22bに形成された複数のトレンチ28の第一端部は、フィルター部23の第一端面22aにおいて、それぞれ複数のナノ流路27の第一端部と連通している。第一凹部の底面22bのトレンチ28の第二端部は、第一基板25の側面に開口している。
更に、第一基板25の第二凹部24の底面24bに形成された複数のトレンチ29の第一端部は、フィルター部23の第二端面24aにおいて、それぞれ複数のナノ流路27の第二端部と連通している。第二凹部の底面24bのトレンチ29の第二端部は、第二凹部の底面24bの中央付近に位置している。
第三実施形態のNFデバイス21は、図6に示すように、第一実施形態のNFデバイス1において、第一基板の第一凹部2の底面に複数のトレンチ(溝)が形成され、更に、第二基板の第二凹部4の底面に複数のトレンチ(溝)が形成された構成を有する。
第三実施形態のNFデバイス21において、第一基板25の第一凹部22の底面22bに形成された複数のトレンチ28の第一端部は、フィルター部23の第一端面22aにおいて、それぞれ複数のナノ流路27の第一端部と連通している。第一凹部の底面22bのトレンチ28の第二端部は、第一基板25の側面に開口している。
更に、第一基板25の第二凹部24の底面24bに形成された複数のトレンチ29の第一端部は、フィルター部23の第二端面24aにおいて、それぞれ複数のナノ流路27の第二端部と連通している。第二凹部の底面24bのトレンチ29の第二端部は、第二凹部の底面24bの中央付近に位置している。
第三実施形態の構成において、フィルター部23の第一端面22aにおけるナノ流路27の孔径については、短辺は第一実施形態のNFデバイス1におけるナノ流路7の孔径の短辺と同じであるが、長辺については、トレンチの深さの分だけ、第一実施形態のそれよりも長くなっている。同様に、フィルター部23の第二端面24aにおけるナノ流路17の孔径についても、短辺は第一実施形態のNFデバイス1におけるナノ流路7の孔径の短辺と同じであるが、長辺については、トレンチの深さの分だけ、第一実施形態のそれよりも長くなっている。
すなわち、第三実施形態のNFデバイス21は、第一基板25及び第二基板26からなる基体と、第一基板の上面25aに設けられた、第一凹部22からなる第一空間部22S及び第二凹部24からなる第二空間部24Sと、第一基板25に内在され、互いに対向する第一空間部22S及び第二空間部24Sに対してそれぞれ面するように配置され、前記凝集粒子と前記非凝集粒子とが篩い分けられる複数のナノ流路27によって構成されたフィルター部23と、が少なくとも備えられたデバイスである。さらに、第一凹部の底面22b及び第二凹部の底面24bには複数のトレンチ28,29がナノ流路27と略平行に形成されている。
第一凹部の底面22bに形成された各トレンチ28の第一端部は、フィルター部23の第一端面22aを通過して更に第二空間部24Sの方向へ延び、フィルター部23の第二端面24aまで延びており、フィルター部23において、各微細孔に連通するように接続されている。各トレンチ28の第二端部(第一端部とは反対側の端部)は、第一基板25の側面に開口している。
第二凹部の底面24bに形成された各トレンチ29の第一端部は、フィルター部23の第二端面24aにおいて、第一凹部の底面から延びて来た各トレンチ28の第一端部と連通するように接続している。各トレンチ29の第二端部(第一端部とは反対側の端部)は、第一基板25の第二側面に向けて延び、その側面に達する前に行き止っている。
第三実施形態のNFデバイス21の第一基板25のトレンチ28,29及びナノ流路27の断面を図7に示す。第一端面22aに開口するナノ流路28の孔径の長辺、及び第二端面24aに開口するナノ流路28の孔径の長辺は、第一実施形態のNFデバイス1のナノ流路7の孔径よりもトレンチ28,29の深さLの分だけ長くなっている。
第一凹部22の底面22bに形成された各トレンチ28の幅は、各トレンチが連通するナノ流路の短辺と同じであることが好ましい。すなわち、各トレンチ28の幅(基板平面方向の長さ)は、前記非凝集粒子が通過し、前記凝集粒子が通過しない長さであることが好ましい。この構成であると、第一凹部22の側面22aに加えて、底面22bもフィルター部23の第一端面22aと同様に機能することが可能となる。このため、フィルター部のフィルター面積が実質的に拡大され、フィルター機能が向上する。この結果、単位時間当たりに処理可能な試料を増量することができる。更に、フィルター部の目詰まりを確実に防ぐことができる。
また、第二凹部24の底面24bに形成された各トレンチ29の幅についても同様に、各トレンチが連通するナノ流路の短辺と同じであることが好ましい。
また、第二凹部24の底面24bに形成された各トレンチ29の幅についても同様に、各トレンチが連通するナノ流路の短辺と同じであることが好ましい。
第一基板25に内在されてフィルター部23を構成するナノ流路27の数と、ナノ流路27に接続されるトレンチの数は特に制限されず、例えば5本〜500本程度を配置することができる。各ナノ流路及びトレンチは互いに平行に配置されていてもよいし、非平行に配置されていてもよい。また、フィルター部の第一端面22aの単位面積当たりに開口するナノ流路27の第一端部の個数は特に制限されず、例えば任意の微細孔の開口部(第一端部)の1つを基準として、その短径の方向に0.01〜7個/マイクロメートル(μm)の開口部を配置することができる。この密度で開口部を有するフィルター部は、試料のろ過効率に優れる。
フィルター部23を構成するナノ流路27の長さは特に制限されないが、孔径に対して長さが長い程、試料を通過させるために必要な送液の圧力が高くなる傾向がある。これを考慮して、ナノ流路27の長さを、例えば3μm〜5,000μmとすることができる。また、第一空間部22Sの底部に形成されるトレンチ28の長さは特に制限されず、例えば3μm〜10,000μmとすることができる。また、第二空間部24Sの底部に形成されるトレンチ29の長さは特に制限されず、例えば3μm〜10,000μmとすることができる。
第一基板の上面25aには第二基板26が貼り合わされて、本実施形態のデバイスの基体をなしている。この基体の内部において、第一凹部22の上部が閉じられた第一空間部22Sと、第二凹部24の上部が閉じられた第二空間部24Sとが形成されている。第三実施形態のNFデバイス21の第一空間部22Sに、試料を導入すると、非凝集粒子は、フィルター部23の端面からナノ流路27内に侵入して第二空間部24Sへ通過することもできるし、第一空間部22Sの底面22bに設けられたトレンチ28内に潜って、フィルター部23へ侵入して第二空間部24Sへ通過することもできる。第三実施形態のNFデバイス21のフィルター部23を通過できる粒子は、ナノ流路27の孔径の短辺よりも小さい非凝集粒子のみであり、ナノ流路27の孔径の短辺よりも大きい凝集粒子は、第一空間部22Sに留まり、フィルター部23の第一端面22a付近又は第一凹部22Sの底面22bに集積する。通常は、試料の流通する勢いによって凝集粒子が押されて、底面22bよりも第一端面22aに凝集粒子が集積し易い。
第三実施形態のNFデバイス21のフィルター部23を通過する試料の流量は、第一実施形態及び第二実施形態のNFデバイス1,11よりも多くなっている。これは、フィルター部23を構成する流路が、ナノ流路27及びトレンチ28,29によって構成されているためである。流量が多い第三実施形態のNFデバイス21は、第一実施形態及び第二実施形態のNFデバイス1,11よりも、単位時間当たりに多量の試料を処理することができる。
《第四実施形態》
第四実施形態のNFデバイス31は、図8に示すように、第一実施形態のNFデバイス1において、第一基板に第二凹部2が設けられていない構成を有する。このため、第四実施形態のNFデバイス31においては、ナノ流路37の長さ及びフィルター部33の長さがより長くなっている。また、ナノ流路37の第一端部は第一凹部32の側面32aに開口し、第二端部は、第一凹部の側面32aに対向する第一基板の側面に開口している。
第四実施形態のNFデバイス31は、図8に示すように、第一実施形態のNFデバイス1において、第一基板に第二凹部2が設けられていない構成を有する。このため、第四実施形態のNFデバイス31においては、ナノ流路37の長さ及びフィルター部33の長さがより長くなっている。また、ナノ流路37の第一端部は第一凹部32の側面32aに開口し、第二端部は、第一凹部の側面32aに対向する第一基板の側面に開口している。
すなわち、第四実施形態のNFデバイス31は、第一基板35及び第二基板36からなる基体と、第一基板の上面35aに設けられた第一凹部32からなる第一空間部32Sと、第一基板35に内在され、第一空間部32Sに対して面するように配置され、前記凝集粒子と前記非凝集粒子とが篩い分けられる複数のナノ流路37によって構成されたフィルター部33と、が少なくとも備えられたデバイスである。
ここでは第四実施形態のナノ流路37が第一実施形態のナノ流路7よりも長い場合を説明したが、第一実施形態のフィルター部3の中央部(第一凹部と第二凹部の中央部)を、ナノ流路を横断するように切断することによって、第一実施形態のNFデバイス1のナノ流路7よりも短いナノ流路を有する、第四実施形態と同様の形態を有するNFデバイスが得られる。
第四実施形態の構成において、フィルター部33の第一端面32aにおける各ナノ流路37の孔径については、短辺及び長辺の両方ともに、第一実施形態のNFデバイス1におけるナノ流路7の孔径の短辺及び長辺とそれぞれ同じである。
第一基板35に内在されてフィルター部33を構成するナノ流路37の数は特に制限されず、例えば5本〜500本程度を配置することができる。各ナノ流路は互いに平行に配置されていてもよいし、非平行に配置されていてもよい。また、フィルター部の第一端面32aの単位面積当たりに開口するナノ流路37の第一端部の個数は特に制限されず、例えば任意の微細孔の開口部(第一端部)の1つを基準として、その短径の方向に0.01〜7個/マイクロメートル(μm)の開口部を配置することができる。この密度で開口部を有するフィルター部は、試料のろ過効率に優れる。
フィルター部33を構成するナノ流路37の長さは特に制限されないが、孔径に対して長さが長い程、試料を通過させるために必要な送液の圧力が高くなる傾向がある。これを考慮して、ナノ流路37の長さを、例えば3μm〜5,000μmとすることができる。
第一基板の上面35aには第二基板36が貼り合わされて、本実施形態のデバイスの基体をなしている。この基体の内部において、第一凹部32の上部が閉じられた第一空間部32Sと、第二凹部34の上部が閉じられた第二空間部34Sとが形成されている。ナノ流路37の第二端部が開口している第一基板35の側面に、吸湿性部材(不図示)を接触させて設置し、第一空間部32Sに試料を導入すると、試料が吸湿性部材の方向へ吸引される。この結果、試料に含まれる凝集粒子は第一空間部32Sに留まる一方、非凝集粒子及び試料を構成する溶媒がフィルター部33を通過して、吸湿性部材に吸収される。この方法を利用すると、NFデバイス31に別途シリンジポンプ等を接続せずとも、試料をNFデバイス31のフィルター部33で篩い分けることができる。
《第五実施形態》
第五実施形態のNFデバイス41の第一基板45の上面45aには、図9に示すように、第一凹部42及び第二凹部44が設けられている。第一凹部42と第二凹部44は互いに対向する様に配置されている。第一基板45の上面45aに第二基板46の下面46aが貼り合わされて、本実施形態のデバイスの基体をなしている。この基体の内部において、第一凹部42の上部が閉じられた第一空間部42Sと、第二凹部44の上部が閉じられた第二空間部44Sとが形成されている。
第五実施形態のNFデバイス41の第一基板45の上面45aには、図9に示すように、第一凹部42及び第二凹部44が設けられている。第一凹部42と第二凹部44は互いに対向する様に配置されている。第一基板45の上面45aに第二基板46の下面46aが貼り合わされて、本実施形態のデバイスの基体をなしている。この基体の内部において、第一凹部42の上部が閉じられた第一空間部42Sと、第二凹部44の上部が閉じられた第二空間部44Sとが形成されている。
すなわち、第五実施形態のNFデバイス41は、第一基板45及び第二基板46からなる基体と、第一基板の上面45aに設けられた、第一凹部42からなる第一空間部42S及び第二凹部44からなる第二空間部44Sと、第二基板46に内在され、互いに対向する第一空間部42S及び第二空間部44Sに対してそれぞれ面するように配置され、前記凝集粒子と前記非凝集粒子とが篩い分けられる複数のナノ流路47によって構成されたフィルター部43と、が少なくとも備えられたデバイスである。
第二基板46の内部には、第一空間部42Sと第二空間部44Sを連通するナノ流路47が複数形成されている。このナノ流路47及び第二基板46の断面を図10に示す。ナノ流路47の第一端部47aは第一空間部42Sの上部(第二基板の下面46a)に開口し、ナノ流路47の第二端部47bは第二空間部44Sの上部(第二基板の下面46a)に開口している。ナノ流路47の経路は次の通りである。まず、第一空間部42Sの上部に開口するナノ流路の第一端部47aから、第二基板46の厚み方向(上向き)に延び、第二基板の上面46bに達する前に屈曲して第二空間部44Sの方向へ延び、第二空間部の上方まで延びたところで屈曲し、第二基板46の厚み方向(下向き)に延びて、ナノ流路の第二端部47bが第二空間部44Sの上部に開口する。
上記経路を有するナノ流路47が第二基板46の内部に複数設けられている。第二基板46に内在されるナノ流路47の数は特に制限されず、例えば5本〜500本程度を配置することができる。各ナノ流路は互いに平行に配置されていてもよいし、非平行に配置されていてもよい。ナノ流路の孔径の短辺及び長辺は第一実施形態のナノ流路の孔径の短辺及び長辺と同じである。本実施形態においては、第二基板に形成されたナノ流路47及びその周辺をフィルター部43と呼ぶ。
第一空間部42Sの上部の単位面積当たりに開口するナノ流路47の第一端部47aの個数、及び第二空間部44Sの上部の単位面積当たりに開口するナノ流路47の第二端部47bの個数は特に制限されず、例えば任意の微細孔の開口部(第一端部又は第二端部)の1つを基準として、その短径の方向に0.01〜7個/マイクロメートル(μm)の開口部を配置することができる。この密度で開口部を有するフィルター部は、試料のろ過効率に優れる。
フィルター部43を構成するナノ流路47の長さは特に制限されないが、孔径に対して長さが長い程、試料を通過させるために必要な送液の圧力が高くなる傾向がある。これを考慮して、ナノ流路47の長さを、例えば3μm〜5,000μmとすることができる。
第五実施形態のNFデバイス41の第一空間部42Sに、試料を導入すると、非凝集粒子は、フィルター部43の第一端面を構成する第一空間部の上部に開口するナノ流路47を通過して、第二空間部44Sへ到達することができる。第五実施形態のNFデバイス41のフィルター部43のナノ流路47を通過できる粒子は、ナノ流路47の孔径の短辺よりも小さい非凝集粒子のみであり、ナノ流路47の孔径の短辺よりも大きい凝集粒子は、第一空間部42Sに留まる。
第五実施形態のNFデバイス41においては、フィルター部43の第一端面が、第一空間部42Sの上部に位置している。このため、第一空間部において舞い上がり易い非凝集粒子を上方に吸引して第二空間部44Sへ流通することが容易である。一方、非凝集粒子と比べて舞い上がり難い凝集粒子は、第一空間部の比較的低層域に存在する確率が高く、ナノ流路の第一端部47aへ吸引される可能性が低い。この結果、凝集粒子が第一空間部42Sの上方に位置するナノ流路の第一端部47aを塞いだり、詰まらせたりする恐れが一層低減されている。
以上の第一実施形態〜第五実施形態のNFデバイスにおいては、第一空間部、第二空間部及びフィルター部が板状の基板に形成された場合を説明したが、基板の形状は板状である必要は無く、目的に応じた種々の形状の基板を用いることができる。なお、板状ではない基板を基材と読み換えることができる。また、第一基板(第一基材)と第二基板(第二基材)とを貼り合せた基体を有するNFデバイスにおいて、第一基板から第二基板を見る方向を下向き方向(下方)とし、第二基板から第一基板を見る方向を上向き方向(上方)とする。
NFデバイスを構成する基板の材料は特に制限されない。ナノ流路を形成する基板の材料は、レーザー加工によるナノ流路の形成を容易にする観点から、ケイ酸塩を主成分とする材料が好ましい。このような材料として、合成石英、ホウケイ酸ガラスなどが好適な材料として挙げられる。この他、結晶性の石英、サファイア等からなる基板を使用してもよい。また、ナノ流路を形成しない基板の材料としては、PDMS、PMMAなどの透明な合成樹脂を用いることができる。ナノ流路を形成しない基板の材料は、ナノ流路を形成する基板と同じ材料であってもよい。第一基板と第二基板の接合方法(貼り合せ方法)は特に制限されず、接合用レジスト等の接着剤を用いた間接的な接合であってもよいし、基板の表面同士を直接接合する公知の方法も適用可能である。
基板の内部にナノ流路を形成する方法として、例えば、フェムト秒レーザーによる改質部形成とウェットエッチングとを組み合わせた微細加工を適用することができる。レーザー照射においては、レーザーの走査方向とレーザーの偏波方向とを垂直にすることが好ましい。また、レーザー照射強度としては、集光部で電子プラズマ波と入射光の干渉が起こり、レーザーの偏波に対して垂直であり、偏波方向に沿って周期性をもつ周期構造が自己形成的に形成されることが起きるよりも弱く、且つ、改質部を形成し得る程度の強度であることが好ましい。通常、最適なレーザー照射強度は、使用する基板に応じて異なる。具体的には、再公表WO2012/008577号公報に記載の方法が適用できる。
<ラテックス粒子分散液の調製>
純水80.0g、スチレン20g、p−スチレンスルホン酸ナトリウム0.2gを、200mLセパラブルフラスコに投入し、撹拌しつつ窒素を液中に流しながら加熱し、72℃まで昇温した後、過硫酸カリウム0.06gを添加し、3.5時間重合反応を行った。その後、93℃まで昇温し、93℃で3時間の加熱処理を行って、ラテックス粒子分散液1aを得た。
得られたラテックス粒子分散液1aに含まれるラテックス粒子の平均粒径(体積平均粒子径)を、濃度が特に高い試料を測定する用途に適した粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子株式会社製)を使用して測定したところ、約100nmであった。
純水80.0g、スチレン20g、p−スチレンスルホン酸ナトリウム0.2gを、200mLセパラブルフラスコに投入し、撹拌しつつ窒素を液中に流しながら加熱し、72℃まで昇温した後、過硫酸カリウム0.06gを添加し、3.5時間重合反応を行った。その後、93℃まで昇温し、93℃で3時間の加熱処理を行って、ラテックス粒子分散液1aを得た。
得られたラテックス粒子分散液1aに含まれるラテックス粒子の平均粒径(体積平均粒子径)を、濃度が特に高い試料を測定する用途に適した粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子株式会社製)を使用して測定したところ、約100nmであった。
<蛍光色素内包ラテックス粒子の調製>
水100mLに、上記で作成したラテックス粒子分散液1aが1w/v%の濃度になるように投入し、さらにアセトン100mLを加えることによって、得られた溶液中において、ラテックス粒子を膨張させた。ついで、前記溶液に、ユーロピウム色素(蛍光色素)が1mg/mLの濃度になるように、ユーロピウム色素を含むアセトン溶液5mLを加え、室温で1時間撹拌することによって、ラテックス粒子に蛍光色素を内包させた。その後、エバポレーターを使用して減圧蒸留することによって、前記溶液からアセトンを除去し、蛍光色素を内包したラッテクス粒子(平均粒径:約100nm)を分散させた蛍光ラッテクス粒子分散液1bを得た。この粒子の粒度分布を前述の方法で測定したところ、下限〜上限が80nm〜130nmであった。
水100mLに、上記で作成したラテックス粒子分散液1aが1w/v%の濃度になるように投入し、さらにアセトン100mLを加えることによって、得られた溶液中において、ラテックス粒子を膨張させた。ついで、前記溶液に、ユーロピウム色素(蛍光色素)が1mg/mLの濃度になるように、ユーロピウム色素を含むアセトン溶液5mLを加え、室温で1時間撹拌することによって、ラテックス粒子に蛍光色素を内包させた。その後、エバポレーターを使用して減圧蒸留することによって、前記溶液からアセトンを除去し、蛍光色素を内包したラッテクス粒子(平均粒径:約100nm)を分散させた蛍光ラッテクス粒子分散液1bを得た。この粒子の粒度分布を前述の方法で測定したところ、下限〜上限が80nm〜130nmであった。
<抗体感作ラテックスの調製>
抗ヒトCRP(C-reactive protein)ヤギポリクローナル抗体(オリエンタル酵母工業株式会社製)1mg/mLを含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.5)4.9mLと、10w/v%のラテックス粒子分散液1a0.1mLとを混合し、25℃で3時間反応させた。その後、得られた懸濁液5mLとウシ血清アルブミン(BSA)を2.0w/v%含有する50mMホウ酸緩衝液(pH7.5)5mLとを混合し、25℃で3時間反応させた。次いで、遠心分離(40,000G、180分)により全ラテックス粒子を沈殿させ、上清を除去した。これに、0.1w/v%のTween20を含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.5)5mLを投入して、ラテックス粒子を懸濁することによってラッテクス粒子を洗浄した。続いて、遠心分離(40,000G、180分)により全ラテックス粒子を再び沈殿させ、上清を除去した後、BSAを0.5w/v%含有する50mMホウ酸緩衝液(pH6.5)5mLを投入して、ラテックス粒子を懸濁することによって、抗ヒトCRP抗体感作ラテックス1Aを得た。
また、蛍光ラテックス粒子分散液1bを用いて同様の操作を行い、抗ヒトCRP抗体感作蛍光ラテックス1Bを得た。
抗ヒトCRP(C-reactive protein)ヤギポリクローナル抗体(オリエンタル酵母工業株式会社製)1mg/mLを含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.5)4.9mLと、10w/v%のラテックス粒子分散液1a0.1mLとを混合し、25℃で3時間反応させた。その後、得られた懸濁液5mLとウシ血清アルブミン(BSA)を2.0w/v%含有する50mMホウ酸緩衝液(pH7.5)5mLとを混合し、25℃で3時間反応させた。次いで、遠心分離(40,000G、180分)により全ラテックス粒子を沈殿させ、上清を除去した。これに、0.1w/v%のTween20を含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.5)5mLを投入して、ラテックス粒子を懸濁することによってラッテクス粒子を洗浄した。続いて、遠心分離(40,000G、180分)により全ラテックス粒子を再び沈殿させ、上清を除去した後、BSAを0.5w/v%含有する50mMホウ酸緩衝液(pH6.5)5mLを投入して、ラテックス粒子を懸濁することによって、抗ヒトCRP抗体感作ラテックス1Aを得た。
また、蛍光ラテックス粒子分散液1bを用いて同様の操作を行い、抗ヒトCRP抗体感作蛍光ラテックス1Bを得た。
<ナノ流路フィルターデバイスAの作製>
フェムト秒レーザーとしてチタンサファイアレーザーを使用した。石英ガラス基板の第一の面からレーザー光Lを基板内部に入射させ、レーザー光Lの焦点を基板内部の所定位置に結び、レーザー光の伝搬方向(光軸)に対して垂直の方向にレーザー光の焦点を走査した。この際、走査方向に対してレーザー偏波が垂直となるように設定した。また、レーザー照射強度は、予め同じ種類の石英ガラス基板を用いて調べた加工下限閾値以上且つ加工上限閾値未満に設定した。
具体的には、以下の照射条件で行った。
フェムト秒レーザーとしてチタンサファイアレーザーを使用した。石英ガラス基板の第一の面からレーザー光Lを基板内部に入射させ、レーザー光Lの焦点を基板内部の所定位置に結び、レーザー光の伝搬方向(光軸)に対して垂直の方向にレーザー光の焦点を走査した。この際、走査方向に対してレーザー偏波が垂直となるように設定した。また、レーザー照射強度は、予め同じ種類の石英ガラス基板を用いて調べた加工下限閾値以上且つ加工上限閾値未満に設定した。
具体的には、以下の照射条件で行った。
《照射条件》
・波長(中心波長)=800nm、スペクトル幅=10nm(±5nm)、パルス時間幅=〜250fs、対物レンズの開口数(N.A.)=0.5、偏波=直線偏波、光軸と走査方向とのなす角度=約90度、で行った。
・ピーク強度(1パルス当りのレーザーフルエンス/パルス時間幅)=9TW/cm2、で行った。
・走査速度(μm/sec)=1,000μm/sec、繰り返し周波数(kHz)=200kHzで行った。
・1パルス毎の焦点が重なるようにシフトさせながら一定の速度で走査した。
・波長(中心波長)=800nm、スペクトル幅=10nm(±5nm)、パルス時間幅=〜250fs、対物レンズの開口数(N.A.)=0.5、偏波=直線偏波、光軸と走査方向とのなす角度=約90度、で行った。
・ピーク強度(1パルス当りのレーザーフルエンス/パルス時間幅)=9TW/cm2、で行った。
・走査速度(μm/sec)=1,000μm/sec、繰り返し周波数(kHz)=200kHzで行った。
・1パルス毎の焦点が重なるようにシフトさせながら一定の速度で走査した。
上記の照射条件により、焦点及びその近傍を含む集光部が走査した領域を改質させた。具体的に改質した領域(改質部)は、基板表面に対して略平行に延在する。この長手方向に対して垂直方向の断面の形状は、略矩形状であり、その縦の長さ(基板厚み方向の長さ)は約5μm、その横の長さ(基板平面方向の長さ)は約30nmであった。
上記のレーザー照射を繰り返して、平行に並んだ複数の改質部を形成した。
上記のレーザー照射を繰り返して、平行に並んだ複数の改質部を形成した。
複数の改質部が形成された基板の表面にフォトリソグラフィによってレジストパターンを形成した。次いで、ドライエッチングによって、基板表面に凹部を2個形成した。これにより、各凹部の底面及び側壁に、先に形成した改質部の断面が露出した。
改質部の断面が露出した基板を、フッ酸又は水酸化カリウム水溶液に浸漬してエッチングを行い、複数のナノ流路の開口部が、フィルター部の第一端面に平行に並んだ第一基板を作製した。第一基板の各ナノ流路の断面は略矩形であり、その縦の長さは最も長い部分で約5.5μmであり、その横の長さは約300nmであった。
基板に形成したナノ流路の構造は、前述した第一実施形態のNFデバイス1の第一基板5(図1)に相当する。
次に、図1に示すように、第一基板の表面にPDMSからなる第二基板を接着した。以上の方法により、側面に開口部を有する2つの空間部と、これら空間部を連通する複数のナノ流路が備えられた、第一実施形態のNFデバイス1(図1)と同様のナノ流路フィルターデバイスAを作製した。
[実施例1]
《各溶液の調製》
抗原であるCRPを所定濃度で含む生理食塩水を、CRP抗原溶液として調製した。
0.1w/v%BSA、150mMNaClを含む0.1Mトリス緩衝液(pH8.0)を、第一試薬として調製した。
抗ヒトCRP抗体感作蛍光ラテックス1Bを、0.5w/v%BSAを含有する50mMホウ酸緩衝液(pH6.5)に、0.1w/v%となるように懸濁し、第二試薬として得た。
《各溶液の調製》
抗原であるCRPを所定濃度で含む生理食塩水を、CRP抗原溶液として調製した。
0.1w/v%BSA、150mMNaClを含む0.1Mトリス緩衝液(pH8.0)を、第一試薬として調製した。
抗ヒトCRP抗体感作蛍光ラテックス1Bを、0.5w/v%BSAを含有する50mMホウ酸緩衝液(pH6.5)に、0.1w/v%となるように懸濁し、第二試薬として得た。
《抗原抗体反応》
CRP抗原溶液5μLと第一試薬150μLを混合し、37℃で5分静置した。この混合液と第二試薬50μLを混合し、37℃で5分静置した。
この反応液中で、抗原抗体反応が起きた結果、抗ヒトCRP抗体感作蛍光ラテックス1Bの粒子同士が凝集しているはずであるが、目視ではその凝集の有無は検知できなかった。
CRP抗原溶液5μLと第一試薬150μLを混合し、37℃で5分静置した。この混合液と第二試薬50μLを混合し、37℃で5分静置した。
この反応液中で、抗原抗体反応が起きた結果、抗ヒトCRP抗体感作蛍光ラテックス1Bの粒子同士が凝集しているはずであるが、目視ではその凝集の有無は検知できなかった。
《ナノ流路フィルターデバイスの使用》
上記で作製したナノ流路フィルターデバイスA(ナノ流路の孔径の短辺は約300nm)の第一の空間部に、マイクロシリンジポンプ(アズワン社製)を用いて、前記反応液50μLを注入した。注入された反応液は、第一の空間部からフィルター部を通過して、第二の空間部へ流入した。この際、反応液中の凝集したラテックス粒子は、フィルター部を通過せずに留まり、凝集していないラテックス粒子(平均粒径:約100nm)のみが第二の空間部へ流入した。フィルター部に留まったラテックス粒子の集積の度合を、蛍光顕微鏡(オリンパス社製)を用いて観察した。この結果を表1に示す。
上記で作製したナノ流路フィルターデバイスA(ナノ流路の孔径の短辺は約300nm)の第一の空間部に、マイクロシリンジポンプ(アズワン社製)を用いて、前記反応液50μLを注入した。注入された反応液は、第一の空間部からフィルター部を通過して、第二の空間部へ流入した。この際、反応液中の凝集したラテックス粒子は、フィルター部を通過せずに留まり、凝集していないラテックス粒子(平均粒径:約100nm)のみが第二の空間部へ流入した。フィルター部に留まったラテックス粒子の集積の度合を、蛍光顕微鏡(オリンパス社製)を用いて観察した。この結果を表1に示す。
[比較例1]
汎用自動分析機(日立ハイテクノロジーズ社製、型番:7170、主波長700nm)を使用して、実施例1と同じ試料5μL、第一試薬150μL及び第二試薬50μLを用いて、試料中のCRP濃度を測定した。測定は、2ポイントエンド法にて行った。この結果を表1に併記する。
汎用自動分析機(日立ハイテクノロジーズ社製、型番:7170、主波長700nm)を使用して、実施例1と同じ試料5μL、第一試薬150μL及び第二試薬50μLを用いて、試料中のCRP濃度を測定した。測定は、2ポイントエンド法にて行った。この結果を表1に併記する。
以上の結果から、ナノ流路フィルターデバイスによって、従来と同等以上の高い検出感度で、簡便且つ高速に測定結果(試料中のCRP濃度)を得ることができた。
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項(クレーム)の範囲によってのみ限定される。
本発明にかかるイムノアッセイ方法は、医療検査の分野等に広く利用することができる。
1…NFデバイス、2…第一凹部、2S…第一空間部、2a…第一凹部の側面、3…フィルター部、4…第二凹部、4S…第二空間部、4a…第二凹部の側面、5…第一基板、5a…第一基板の上面、6…第二基板、7…ナノ流路、7a…ナノ流路の第一端部、11…NFデバイス、12…第一凹部、12S…第一空間部、12a…第一凹部の側面(フィルター部の第一端面)、12b…第一凹部の底面、13…フィルター部、14…第二凹部、14S…第二空間部、14a…第二凹部の側面(フィルター部の第二端面)、15…第一基板、15a…第一基板の上面、16…第二基板、17…ナノ流路、18…トレンチ、21…NFデバイス、22…第一凹部、22S…第一空間部、22a…第一凹部の側面(フィルター部の第一端面)、22b…第一凹部の底面、23…フィルター部、24…第二凹部、24S…第二空間部、24a…第二凹部の側面(フィルター部の第二端面)、24b…第二凹部の底面、25…第一基板、25a…第一基板の上面、26…第二基板、27…ナノ流路、28…トレンチ、29…トレンチ、L…トレンチの深さ、31…NFデバイス、32…第一凹部、32S…第一空間部、32a…第一凹部の側面(フィルター部の第一端面)、33…フィルター部、35…第一基板、35a…第一基板の上面、36…第二基板、37…ナノ流路、41…NFデバイス、42…第一凹部、42S…第一空間部、43…フィルター部、44…第二凹部、44S…第二空間部、45…第一基板、45a…第一基板の上面、46…第二基板、46a…第二基板の下面、46b…第二基板の上面、47…ナノ流路、47a…ナノ流路の第一端部、47b…ナノ流路の第二端部
Claims (5)
- 被検出物質に結合する抗体を表面に有する粒子と、前記被検出物質とを接触させる工程、
前記被検出物質が前記抗体に結合することにより前記粒子同士が複数凝集してなる凝集粒子と、前記被検出物質を結合していなために凝集していない前記粒子(非凝集粒子)とを分離する工程、及び、前記凝集粒子又は前記非凝集粒子を検出する工程、
を含むイムノアッセイ方法であって、
前記凝集粒子が通過せず、前記非凝集粒子が通過する微細孔を複数備えたフィルターデバイスを用いて前記分離を行うことを特徴とするイムノアッセイ方法。 - 前記フィルターデバイスの微細孔の周辺に集積した前記凝集粒子を定量することを特徴とする請求項1に記載のイムノアッセイ方法。
- 前記集積した凝集粒子を光学的手法によって定量することを特徴とする請求項2に記載のイムノアッセイ方法。
- 前記フィルターデバイスは、基体と、前記基体に内在された第一空間部及び第二空間部と、第一空間部と第二空間部を連通する複数の微細孔を有するフィルター部と、が備えられてなることを特徴とする請求項1〜3の何れか一項に記載のイムノアッセイ方法。
- 前記凝集粒子及び前記非凝集粒子を含む溶液を、前記第一空間部に注入し、
前記フィルター部を構成する複数の微細孔を通過させて、前記第二空間部へ流入させることによって、
前記第一空間部に開口する前記複数の微細孔の第一端部の周辺において前記凝集粒子を集積させるとともに、
前記複数の微細孔を通過した前記非凝集粒子を前記第二空間部に流入させることを特徴とする請求項4に記載のイムノアッセイ方法。
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
JP2013216798A JP2015078933A (ja) | 2013-10-17 | 2013-10-17 | イムノアッセイ方法 |
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
JP2020134349A (ja) * | 2019-02-21 | 2020-08-31 | デンカ株式会社 | ラテックス凝集法による目的物質の測定方法、およびその試薬 |
-
2013
- 2013-10-17 JP JP2013216798A patent/JP2015078933A/ja active Pending
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JP2020134349A (ja) * | 2019-02-21 | 2020-08-31 | デンカ株式会社 | ラテックス凝集法による目的物質の測定方法、およびその試薬 |
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