ES2785034T3 - Métodos para el tratamiento de infecciones de virus de filoviridae - Google Patents

Métodos para el tratamiento de infecciones de virus de filoviridae Download PDF

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Edward Doerffler
Hon Chung Hui
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Adrian S Ray
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Abstract

Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: **(Ver fórmula)** o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para el tratamiento de infecciones de virus de filoviridae
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La invención se refiere generalmente a compuestos para uso en métodos de tratamiento de infecciones de virus Filoviridae, en particular los métodos y nucleósidos para el tratamiento de virus del Ébola, virus de Marburg y virus Cueva.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] Los filovirus (por ejemplo, virus del Ébola (EBOV) y el virus de Marburg (MARV)) se encuentran entre los virus más letales y destructivas. Causan fiebres hemorrágicas virales severas, a menudo fatales en humanos y primates no humanos (por ejemplo, monos, gorilas y chimpancés). Los filovirus son especialmente preocupantes como posibles armas biológicas, ya que tienen el potencial de diseminación de aerosol y de armamento.
[0003] El período de incubación para la infección por Filovirus varía de 2 a 21 días. La aparición de la enfermedad es abrupta y se caracteriza por fiebre alta, dolores de cabeza, dolores musculares y articulares, dolor de garganta, fatiga, diarrea, vómitos y dolor de estómago. Una erupción cutánea, ojos rojos, hipo y hemorragia interna y externa pueden verse en algunos pacientes. Dentro de una semana de haberse infectado con el virus, la mayoría de los pacientes experimentan dolores en el pecho y falla orgánica múltiple, entran en shock y mueren. Algunos pacientes también experimentan ceguera y sangrado extenso antes de morir.
[0004] Los Filoviridae son una familia de virus de ARN. Se han identificado dos miembros de la familia Filoviridae: EBOV y MARV. Se han identificado dos tipos patógenos clave de familia Filoviridae: Ébolavirus y MARV. Hay una variante identificada de MARV y cinco especies identificadas de Ébolavirus: Zaire (es decir, virus Ébola, EBOV), Sudán, Tai Forest, Bundibugyo y Reston. Se desconocen el origen exacto, las ubicaciones y el hábitat natural de Filoviridae. Sin embargo, sobre la base de la evidencia disponible y la naturaleza de virus similares, se postula que los Filoviridae son zoonóticos ( es decir, transmitidos por animales) y normalmente se mantienen en un huésped animal que es nativo del continente africano.
[0005] Durante más de 30 años, los Ébolavirus se han asociado con episodios periódicos de fiebre hemorrágica en África Central que producen enfermedades graves en pacientes infectados. Las tasas de mortalidad en los brotes han oscilado entre el 50% para las especies de Ébolavirus de Sudán (SEBOV) hasta el 90% para las especies de Ébolavirus de Zaire (EBOV, ZEBOV) (Sanchez et al., Filoviridae: Marburg and Ébola Viruses, in Fields Virology (eds. Knipe, DM y Howley, PM) 1409-1448 (Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia)). Un brote a fines de 2007 causado por una especie aparentemente nueva de Ébolavirus en Uganda resultó en una tasa de mortalidad de alrededor del 25% (Towner et al., PLoS Pathog., 4:e1000212 (2008)). ZEBOV también ha diezmado las poblaciones de simios salvajes en esta misma región de África (Walsh et al., Nature, 422: 611-614 (2003)).
[0006] La prevención y el tratamiento de las infecciones por filovirus, incluidos los Ébolavirus (es decir, EBOV) presentan muchos desafíos. De hecho, no hay vacunas o modalidades de tratamiento post exposición disponibles para prevenir o controlar las infecciones por EBOV. En cambio, los pacientes reciben terapia de apoyo, es decir, equilibrio de electrolitos y líquidos, oxígeno, mantenimiento de la presión arterial y tratamiento para cualquier infección secundaria.
[0007] Por lo tanto, hay una necesidad de composiciones y métodos para tratar infecciones EBOV. La presente invención aborda estas y otras necesidades.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0008] La presente invención proporciona un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0009] La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y, opcionalmente, al menos otro agente terapéutico.
[0010] La presente invención también proporciona el compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de una infección por el virus Filoviridae; para uso en el tratamiento de una infección por Ébolavirus; y para su uso en el tratamiento de una infección por el virus de Marburg.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
I. DEFINICIONES
[0011] A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos y frases como se usa aquí se pretende que tengan los siguientes significados:
[0012] Cuando los nombres comerciales se utilizan en el presente documento, los solicitantes pretenden incluir de manera independiente el nombre comercial de producto y el ingrediente o ingredientes farmacéuticos activos del nombre comercial del producto.
[0013] Como se usa en este documento, "un compuesto de la invención" significa un compuesto de una estructura denotado en la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. De manera similar, con respecto a los intermedios aislables, la frase "un compuesto de Fórmula (número)" significa un compuesto de esa fórmula y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
[0014] A menos que se especifique lo contrario, los átomos de carbono de los compuestos de la invención están destinados a tener una valencia de cuatro. En algunas representaciones de estructuras químicas donde los átomos de carbono no tienen un número suficiente de variables unidas para producir una valencia de cuatro, se debe suponer que los sustituyentes de carbono restantes necesarios para proporcionar una valencia de cuatro son hidrógeno. Por ejemplo,
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tiene el mismo significado que
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[0015] "Grupo protector" se refiere a un resto de un compuesto que enmascara o altera las propiedades de un grupo funcional o las propiedades del compuesto en su conjunto. La subestructura química de un grupo protector varía ampliamente. Una función de un grupo protector es servir como intermediario en la síntesis de la sustancia farmacológica parental. Los grupos protectores químicos y las estrategias para la protección/desprotección son bien conocidos en la técnica. Ver: "Protective Groups in Organic Chemistry", Theodora W. Greene (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1991. Ver también Protective Groups in Organic Chemistry, Peter GM Wuts y Theodora W. Greene, 4a ed., 2006 Los grupos protectores a menudo se utilizan para enmascarar la reactividad de ciertos grupos funcionales, para ayudar en la eficiencia de las reacciones químicas deseadas, por ejemplo, hacer y romper enlaces químicos de una manera ordenada y planificada. La protección de los grupos funcionales de un compuesto altera otras propiedades físicas además de la reactividad del grupo funcional protegido, como la polaridad, la lipofilia (hidrofobia) y otras propiedades que pueden medirse mediante herramientas analíticas comunes. Los intermedios químicamente protegidos pueden ser biológicamente activos o inactivos. "Grupos protectores de hidroxi" se refiere a aquellos que protegen grupos útiles para proteger los grupos hidroxi (-OH).
[0016] Compuestos protegidos también pueden exhibir propiedades alteradas, y en algunos casos, optimizadas in vitro y in vivo, como el paso a través de las membranas celulares y la resistencia a la degradación enzimática o al secuestro. En esta función, los compuestos protegidos con los efectos terapéuticos previstos pueden denominarse profármacos. Otra función de un grupo protector es convertir el fármaco parental en un profármaco, por lo que el fármaco parental se libera tras la conversión del profármaco in vivo. Debido a que los profármacos activos pueden absorberse más eficazmente que el fármaco parental, los profármacos pueden poseer una mayor potencia in vivo que el fármaco parental. Los grupos protectores se eliminan in vitro, en el caso de productos químicos intermedios, o in vivo, en el caso de los profármacos. Con productos químicos intermedios, no es particularmente importante que los productos resultantes después de la desprotección, por ejemplo, los alcoholes, sean fisiológicamente aceptables, aunque en general es más deseable si los productos son farmacológicamente inocuos.
[0017] El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superponibilidad del compañero de imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que son superponibles en su compañero de imagen especular.
[0018] El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen constitución química idéntica, pero que difieren con respecto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.
[0019] "Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen diferentes propiedades físicas, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales, reactividades y propiedades biológicas. Todos estos diastereómeros y sus usos descritos en el presente documento están abarcados por la presente invención. Las mezclas de diastereómeros pueden separarse bajo procedimientos analíticos de alta resolución, tales como electroforesis, cristalización y/o cromatografía. Los diastereómeros pueden tener diferentes atributos físicos tales como, pero no se limitan a, solubilidad, estabilidad química y cristalinidad, y también pueden tener diferentes propiedades biológicas como, pero no se limitan a, estabilidad enzimática, absorción y estabilidad metabólica.
[0020] Los "enantiómeros" se refieren a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí.
[0021] El modificador "aproximadamente" usado en relación con una cantidad incluye el valor establecido y tiene el significado dictado por el contexto (por ejemplo, incluye el grado de error asociado con la medición de la cantidad particular).
[0022] El término "tratar", como se usa aquí, a menos que se indique otra cosa, significa invertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir el trastorno o afección al que se aplica dicho término, o uno o más síntomas de tal trastorno o afección. El término "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere al acto de tratar, ya que "tratar" se define inmediatamente antes.
[0023] El término "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa aquí, es la cantidad de compuesto de la presente invención presente en una composición descrita en la presente memoria que se necesita para proporcionar un nivel deseado de fármaco en las secreciones y los tejidos de las vías respiratorias y los pulmones o, alternativamente, en el torrente sanguíneo de un sujeto a tratar para dar una respuesta fisiológica anticipada o un efecto biológico deseado cuando dicha composición se administra por la ruta de administración elegida. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores, por ejemplo, el compuesto particular, la actividad específica de la composición, el dispositivo de administración empleado, las características físicas de la composición, su uso previsto, así como las consideraciones del paciente, como la gravedad del estado de la enfermedad, cooperación del paciente, etc., y puede ser determinado fácilmente por un experto en la materia basándose en la información proporcionada en este documento.
[0024] El término "solución salina normal" significa una solución de agua que contiene 0,9% (p/v) de NaCl.
[0025] El término "solución salina hipertónica" significa una solución de agua que contiene más de 0,9% (p/v) de NaCl. Por ejemplo, el 3% de solución salina hipertónica contendría el 3% (p/v) de NaCl.
[0026] "La formación de una mezcla de reacción" se refiere al proceso de poner en contacto al menos dos especies distintas, tales que se mezclen juntos y pueden reaccionar. Sin embargo, debe apreciarse que el producto de reacción resultante puede producirse directamente a partir de una reacción entre los reactivos añadidos o a partir de un intermedio de uno o más de los reactivos añadidos que pueden producirse en la mezcla de reacción.
[0027] "Agente de acoplamiento" se refiere a un agente capaz de acoplar dos compuestos dispares. Los agentes de acoplamiento pueden ser catalíticos o estequiométricos. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento pueden ser un agente de acoplamiento basado en litio o un agente de acoplamiento basado en magnesio tal como un reactivo de Grignard. Agentes de acoplamiento ejemplares incluyen, pero no se limitan a, n-BuLi, MgCl2, iPrMgCl, tBuMgCl, PhMgCl o combinaciones de los mismos.
[0028] El "agente de desprotección" se refiere a cualquier agente capaz de eliminar un grupo protector. El agente de desprotección dependerá del tipo de grupo protector utilizado. Los agentes de desprotección representativos son conocidos en la técnica y se pueden encontrar en Protective Groups in Organic Chemistry, Peter GM Wuts y Theodora W. Greene, 4a Ed., 2006.
II. COMPUESTOS DE LA PRESENTE INVENCIÓN
[0029] Ahora se hará referencia en detalle a ciertas realizaciones de la invención, ejemplos de las cuales se ilustran en la descripción adjunta, las estructuras y fórmulas. Si bien la invención se describirá junto con las realizaciones enumeradas, se entenderá que no están destinadas a limitar la invención a esas realizaciones. Por el contrario, la invención está destinada a cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes, pero solo en la medida en que estén cubiertas por las reivindicaciones.
[0030] Se proporciona un compuesto para uso en un método para tratar una infección por Filoviridae en un ser humano que lo necesite, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que tiene una estructura indicada en la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0031] En otra realización, la presente invención proporciona un compuesto que es
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0032] Los nombres de los compuestos de la presente divulgación se proporcionan usando el software ACD/Nombre para nombrar compuestos químicos (Advanced Chemistry Development, Inc., Toronto, Canadá). Otros compuestos o radicales pueden nombrarse con nombres comunes o nombres sistemáticos o no sistemáticos.
[0033] Cualquier referencia a los compuestos de la invención descrita en este documento también incluye una referencia a una sal fisiológicamente aceptable de los mismos. Los ejemplos de sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de la invención incluyen sales derivadas de una base apropiada, tal como un metal alcalino o una tierra alcalina (por ejemplo, Na+, Li+, K+, Ca+2 y Mg+2), amonio y NR4+ (en donde R se define aquí). Las sales fisiológicamente aceptables de un átomo de nitrógeno o un grupo amino incluyen (a) sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácidos sulfámico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (b) sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido isetiónico, ácido lactobiónico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido naftalenodisulfónico, ácido poligalacturónico, ácido malónico, ácido sulfosalicílico, ácido glicólico 3-hidroxi naftoato, pamoato, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido ftálico, ácido mandélico, ácido láctico, ácido etanosulfónico, lisina, arginina, ácido glutámico, glicina, serina, treonina, alanina, isoleucina, leucina y similares; y (c) sales formadas a partir de aniones elementales, por ejemplo, cloro, bromo y yodo. Las sales fisiológicamente aceptables de un compuesto de un grupo hidroxi incluyen el anión de dicho compuesto en combinación con un catión adecuado tal como Na+ y NR4+.
[0034] El compuesto de la presente invención y sus sales farmacéuticamente aceptables pueden existir en forma de diferentes polimorfos o pseudopolimorfos. Como se usa en este documento, el polimorfismo cristalino significa la capacidad de un compuesto cristalino de existir en diferentes estructuras cristalinas. El polimorfismo cristalino puede ser el resultado de diferencias en el empaque de cristal (polimorfismo de empaque) o diferencias en el empaque entre diferentes conformadores de la misma molécula (polimorfismo conformacional). Como se usa en el presente documento, pseudopolimorfismo cristalino significa la capacidad de un hidrato o solvato de un compuesto para existir en diferentes estructuras cristalinas. Los pseudopolimorfos de la presente invención pueden existir debido a diferencias en el empaquetamiento de cristal (pseudopolimorfismo de empaquetamiento) o debido a diferencias en el empaquetamiento entre diferentes conformadores de la misma molécula (pseudopolimorfismo conformacional). La presente invención comprende todos los polimorfos y seudopolimorfos de los compuestos de la presente invención y sus sales farmacéuticamente aceptables.
[0035] El compuesto de la presente invención y sus sales farmacéuticamente aceptables también pueden existir como un sólido amorfo. Como se usa en este documento, un sólido amorfo es un sólido en donde no hay un orden de largo alcance de las posiciones de los átomos en el sólido. Esta definición también se aplica cuando el tamaño del cristal es de dos nanómetros o menos. Se pueden usar aditivos, incluidos disolventes, para crear las formas amorfas de la presente invención. La presente invención comprende todas las formas amorfas de los compuestos de la presente invención y sus sales farmacéuticamente aceptables.
[0036] Para uso terapéutico, las sales de los ingredientes activos de los compuestos de la invención serán fisiológicamente aceptables, es decir, serán sales derivadas de un ácido o base fisiológicamente aceptable. Sin embargo, las sales de ácidos o bases que no son fisiológicamente aceptables también pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto fisiológicamente aceptable. Todas las sales, derivadas o no de un ácido o base fisiológicamente aceptable, están dentro del alcance de la presente invención.
[0037] Finalmente, es de entenderse que las composiciones de esta invención comprenden compuestos de la invención en su forma no ionizada, así como de ion híbrido, y combinaciones con cantidades estequiométricas de agua como en hidratos.
[0038] Es de señalar que todos los enantiómeros, diastereómeros, y mezclas racémicas, tautómeros, polimorfos, pseudopolimorfos de los compuestos de la presente invención y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos son abrazados por la presente invención. Todas las mezclas de tales enantiómeros y diastereómeros están dentro del alcance de la presente invención.
[0039] Los compuestos de la invención tienen centros quirales, por ejemplo, átomos de carbono o de fósforo quirales. Las mezclas racémicas se separan en sus isómeros individuales, sustancialmente ópticamente puros, a través de técnicas bien conocidas, tales como, por ejemplo, la separación de sales diastereoméricas formadas con adyuvantes ópticamente activos, por ejemplo, ácidos o bases, seguido de la conversión a las sustancias ópticamente activas. En la mayoría de los casos, el isómero óptico deseado se sintetiza por medio de reacciones estereoespecíficas, comenzando con el estereoisómero apropiado del material de partida deseado.
[0040] Las definiciones y convenciones estereoquímicas usadas en el presente documento generalmente siguen a SP Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de la luz polarizada en el plano. Al describir un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L o R y S se usan para denotar la configuración absoluta de la molécula sobre su centro o centros quirales. Los prefijos d y 1, D y L, o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación de la luz polarizada en plano por el compuesto, con S, (-) o 1 que significa que el compuesto es levorotatorio mientras que un compuesto con el prefijo R, (+), o d es dextrorrotatorio. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos, excepto que son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico también puede denominarse enantiómero, y una mezcla de tales isómeros a menudo se denomina mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se conoce como una mezcla racémica o un racemato, que puede ocurrir donde no ha habido estereoselección o estereoespecificidad en una reacción química o proceso. Los términos "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, desprovistas de actividad óptica.
[0041] Los compuestos de la invención también pueden existir como isómeros tautómeros en ciertos casos. Aunque solo se puede representar una estructura de resonancia deslocalizada, todas estas formas se contemplan dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, pueden existir tautómeros de eno-amina para los sistemas de purina, pirimidina, imidazol, guanidina, amidina y tetrazol y todas sus formas tautoméricas posibles están dentro del alcance de la invención.
[0042] Cualquier fórmula o estructura dada en este documento también pretende representar formas no etiquetadas, así como formas isotópicamente marcadas de los compuestos. Los compuestos marcados isotópicamente tienen estructuras representadas por las fórmulas dadas aquí, excepto que uno o más átomos son reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o número de masa seleccionado. Los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en los compuestos de la divulgación incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor y cloro, tales como, pero sin limitación, 2H (deuterio, D), 3H (tritio), 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 36Cl y 125I. Diversos compuestos marcados isotópicamente de la presente descripción, por ejemplo, aquellos en los que los isótopos radiactivos tales como 3H, 13C y 14C se incorporan. Dichos compuestos marcados isotópicamente pueden ser útiles en estudios metabólicos, estudios cinéticos de reacción, técnicas de detección o formación de imágenes, como la tomografía por emisión de positrones (PET) o la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), incluidos los ensayos de distribución de fármacos o sustratos o en el tratamiento radiactivo de pacientes.
[0043] La divulgación también incluye compuestos de la presente invención en la que de 1 a n hidrógenos unidos a un átomo de carbono es/son reemplazado(s) por deuterio, en donde n es el número de hidrógenos en la molécula. Dichos compuestos exhiben una mayor resistencia al metabolismo y, por lo tanto, son útiles para aumentar la vida media de cualquier compuesto de la presente invención cuando se administra a un mamífero, particularmente a un humano. Ver, por ejemplo, Foster, " Deuterium Isotope Effects in Studies of Drug Metabolism", Trends Pharmacol. Sci.
5 (12): 524-527 (1984). Dichos compuestos se sintetizan por medios bien conocidos en la técnica, por ejemplo empleando materiales de partida en los que uno o más hidrógenos han sido reemplazados por deuterio.
[0044] El deuterio etiquetado o compuestos terapéuticos sustituidos de la divulgación pueden haber mejorado DMPK (metabolismo de fármacos y farmacocinética), en relación a la distribución, metabolismo y excreción (ADME). La sustitución por isótopos más pesados, como el deuterio, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas que resultan de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una vida media in vivo aumentada, requisitos de dosificación reducidos y/o una mejora en el índice terapéutico. Un compuesto marcado con 18F puede ser útil para estudios de PET o SPECT. Los compuestos marcados isotópicamente de esta descripción y los profármacos de los mismos pueden prepararse generalmente llevando a cabo los procedimientos descritos en los esquemas o en los ejemplos y preparaciones descritas a continuación sustituyendo un reactivo marcado isotópicamente fácilmente disponible por un reactivo marcado no isotópicamente.
[0045] La concentración de un isótopo más pesado, específicamente deuterio, puede ser definido por un factor de enriquecimiento isotópico. En los compuestos de esta descripción, cualquier átomo no designado específicamente como un isótopo particular está destinado a representar cualquier isótopo estable de ese átomo. A menos que se indique lo contrario, cuando una posición se designa específicamente como "H" o "hidrógeno", se entiende que la posición tiene hidrógeno en su composición isotópica de abundancia natural. Por consiguiente, en los compuestos de esta descripción, cualquier átomo específicamente designado como deuterio (D) está destinado a representar el deuterio.
[0046] Las líneas onduladas •A'w '/w-’, ¡ndican el sitio de los enlaces covalentes a las subestructuras, grupos, restos o átomos adyacentes.
[0047] Los compuestos de la presente invención se pueden preparar por métodos conocidos para un experto en la técnica. Por ejemplo, los compuestos de la presente invención pueden prepararse de acuerdo con los métodos descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 8.008.264 y la Publicación de Solicitud de los Estados Unidos Núm. US 2012/0027752
III. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS
[0048] Los compuestos de esta invención se formulan con vehículos y excipientes convencionales, que se seleccionarán de acuerdo con la práctica ordinaria. Las tabletas contendrán excipientes, deslizantes, rellenos, aglutinantes y similares. Las formulaciones acuosas se preparan en forma estéril y, cuando están destinadas a ser administradas por otra vía que no sea la administración oral, generalmente serán isotónicas. Todas las formulaciones contendrán opcionalmente excipientes tales como los establecidos en el "Handbook of Pharmaceutical Excipients" (1986). Los excipientes incluyen ácido ascórbico y otros antioxidantes, agentes quelantes como EDTA, carbohidratos como dextrano, hidroxialquilcelulosa, hidroxialquilmetilcelulosa, ácido esteárico y similares. El pH de las formulaciones varía de aproximadamente 3 a aproximadamente 11, pero normalmente es de aproximadamente 7 a 10. En algunas realizaciones, el pH de las formulaciones varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, pero normalmente es de aproximadamente 3 a aproximadamente 4. En algunas realizaciones, el pH de las formulaciones varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, pero normalmente es de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 8,5.
[0049] Aunque es posible que los ingredientes activos para ser administrados solos pueden ser preferibles para presentarlos como formulaciones farmacéuticas. Las formulaciones, tanto para uso veterinario como humano, de la invención comprenden al menos un ingrediente activo, como se definió anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables para el mismo y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos, particularmente aquellos ingredientes terapéuticos adicionales como se discute en el presente documento. Los vehículos deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y fisiológicamente inocuos para el receptor de los mismos.
[0050] Las formulaciones incluyen las adecuadas para las vías de administración anteriores. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Las técnicas y formulaciones generalmente se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Dichos métodos incluyen el paso de asociar el ingrediente activo con el vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima el ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, moldeando el producto.
[0051] Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, sellos o tabletas que contienen cada una una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como polvo o gránulos; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de aceite de agua. El ingrediente activo también puede administrarse como un bolo, electuario o pasta.
[0052] Un comprimido se fabrica mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas se pueden preparar comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo en una forma que fluye libremente, como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, tensioactivo o agente dispersante. Las tabletas moldeadas pueden prepararse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del ingrediente activo en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden recubrirse o ranurarse y, opcionalmente, formularse para proporcionar una liberación lenta o controlada del ingrediente activo a partir de los mismos.
[0053] Para las infecciones del ojo u otros tejidos externos, por ejemplo boca y piel, las formulaciones se aplican preferiblemente como una pomada o crema tópica que contiene el ingrediente activo en una cantidad de, por ejemplo, 0,075 a 20% p/p (incluidos los ingredientes activos en un intervalo entre 0,1% y 20% en incrementos de 0,1% p/p, como 0,6% p/p, 0,7% p/p, etc.), preferiblemente 0,2 a 15% p/p y lo más preferiblemente del 0,5 al 10% p/p. Cuando se formula en una pomada, los ingredientes activos se pueden emplear con una base de pomada parafínica o miscible con agua. Alternativamente, los ingredientes activos pueden formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua.
[0054] Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al menos 30% p/p de un polihídrico alcohol, es decir, un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo tales como propilenglicol, butano 1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol (incluido PEG 400) y mezclas de los mismos. Las formulaciones tópicas pueden incluir deseablemente un compuesto que mejora la absorción o penetración del ingrediente activo a través de la piel u otras áreas afectadas. Los ejemplos de tales potenciadores de penetración dérmica incluyen dimetilsulfóxido y análogos relacionados.
[0055] La fase oleosa de las emulsiones de esta invención puede estar constituida por ingredientes conocidos de una manera conocida. Mientras que la fase puede comprender simplemente un emulsionante (también conocido como un emulgente), deseablemente comprende una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o con una grasa y un aceite. Preferiblemente, se incluye un emulsionante hidrófilo junto con un emulsionante lipófilo que actúa como estabilizador. También se prefiere incluir tanto un aceite como una grasa. Juntos, el (los) emulsionante(s) con o sin estabilizador(es) forman la denominada cera emulsionante, y la cera junto con el aceite y la grasa forman la base denominada de ungüento emulsionante que forma la fase oleosa dispersa de las formulaciones de crema.
[0056] Los emulgentes y estabilizadores de emulsión adecuados para uso en la formulación de la invención incluyen Tween® 60, Span® 80, alcohol cetoestearílico, alcohol bencílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerilo y laurilsulfato de sodio. Otros emulgentes y estabilizantes de emulsión adecuados para su uso en la formulación de la invención incluyen Tween® 80.
[0057] La elección de aceites o grasas adecuadas para la formulación se basa en conseguir las propiedades cosméticas deseadas. La crema debe ser preferiblemente un producto no grasoso, no manchable y lavable con una consistencia adecuada para evitar fugas de tubos u otros recipientes. Ésteres de alquilo mono o dibásicos de cadena recta o ramificada, como diisoadipato, estearato de isocetilo, diéster de propilenglicol de ácidos grasos de coco, miristato de isopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etilhexilo o una combinación de cadena ramificada pueden usarse ésteres conocidos como Crodamol CAP, siendo los tres últimos ésteres preferidos. Estos pueden usarse solos o en combinación dependiendo de las propiedades requeridas. Alternativamente, se usan lípidos de alto punto de fusión tales como parafina blanda blanca y/o parafina líquida u otros aceites minerales.
[0058] Las formulaciones farmacéuticas según la presente invención comprenden una combinación según la invención junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Las formulaciones farmacéuticas que contienen el ingrediente activo pueden estar en cualquier forma adecuada para el método de administración previsto. Cuando se usa para uso oral, por ejemplo, se pueden preparar tabletas, pastillas, comprimidos, suspensiones acuosas o aceitosas, polvos dispersables o gránulos, emulsiones, cápsulas duras o blandas, jarabes o elixires. Las composiciones destinadas para uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más agentes que incluyen agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservantes, para proporcionar una preparación de sabor agradable. Las tabletas que contienen el ingrediente activo mezclado con un excipiente no tóxico farmacéuticamente aceptable que son adecuadas para la fabricación de tabletas son aceptables. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio o sodio, lactosa, fosfato de calcio o sodio; agentes de granulación y desintegración, tales como almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina o acacia; y agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden no estar recubiertas o pueden estar recubiertas por técnicas conocidas que incluyen microencapsulación para retrasar la desintegración y adsorción en el tracto gastrointestinal y, por lo tanto, proporcionar una acción sostenida durante un período más largo. Por ejemplo, puede emplearse un material de retardo de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solo o con una cera.
[0059] Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio de aceite, como aceite de maní, parafina líquida o aceite de oliva.
[0060] Las suspensiones acuosas de la invención contienen los materiales activos en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes incluyen un agente de suspensión, como carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga, y agentes dispersantes o humectantes como una fosfatida natural (p. ej., lecitina), un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso (por ejemplo, estearato de polioxietileno), un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga (por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol), un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol anhídrido (por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitán). Otros ejemplos no limitantes de agentes de suspensión incluyen Captisol® (betaciclodextrina de éter de sulfobutilo, SBE-p-CD). La suspensión acuosa también puede contener uno o más conservantes tales como p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.
[0061] Las suspensiones de aceite se pueden formular suspendiendo el ingrediente activo en un aceite vegetal, tal como aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones orales pueden contener un agente espesante, como cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden agregar agentes edulcorantes, como los establecidos anteriormente, y agentes aromatizantes para proporcionar una preparación oral agradable al paladar. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.
[0062] Los polvos y gránulos de la invención adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo en mezcla con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión, y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados se ejemplifican por los descritos anteriormente. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes .
[0063] Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, como el aceite de oliva o el aceite de arachis, un aceite mineral, como parafina líquida, o una mezcla de estos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas naturales, tales como goma arábiga y goma de tragacanto, naturalmente fosfatos de curado, tales como lecitina de soja, ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, como el monooleato de sorbitán, y productos de condensación de estos ésteres parciales con óxido de etileno, como el monooleato de sorbitán y polioxietileno. La emulsión también puede contener agentes edulcorantes y aromatizantes. Los jarabes y elixires pueden formularse con agentes edulcorantes, tales como glicerol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un demulcente, un conservante, un saborizante o un agente colorante.
[0064] Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en la forma de una preparación inyectable estéril, tal como una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con la técnica conocida usando aquellos agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados que se han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, tal como una solución en 1,3-butanodiol o preparada como un polvo liofilizado. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se pueden emplear convencionalmente como un disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico también pueden usarse en la preparación de inyectables. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la solución isotónica de cloruro de sodio de Ringer, la solución hipertónica de cloruro de sodio y la solución hipotónica de cloruro de sodio.
[0065] La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con el material portador para producir una forma de dosis única variará dependiendo del huésped tratado y del modo particular de administración. Por ejemplo, una formulación de liberación prolongada destinada a la administración oral a humanos puede contener aproximadamente 1 a 1000 mg de material activo compuesto con una cantidad apropiada y conveniente de material portador que puede variar de aproximadamente 5 a aproximadamente 95% de las composiciones totales (peso:peso). La composición farmacéutica se puede preparar para proporcionar cantidades fácilmente medibles para la administración. Por ejemplo, una solución acuosa destinada a infusión intravenosa puede contener de aproximadamente 3 a 500 gg del ingrediente activo por mililitro de solución para que pueda producirse una infusión de un volumen adecuado a una velocidad de aproximadamente 30 ml/h.
[0066] Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en el ojo también incluyen gotas para los ojos en las que el ingrediente activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso para el ingrediente activo. El ingrediente activo está presente preferiblemente en tales formulaciones en una concentración de 0,5 a 20%, ventajosamente de 0,5 a 10%, y particularmente de aproximadamente 1,5% p/p.
[0067] Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base aromatizada, generalmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado.
[0068] Las formulaciones para administración rectal pueden presentarse como un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato.
[0069] Las formulaciones adecuadas para administración intrapulmonar o nasal tienen un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de 0,1 a 500 micras, tal como 0,5, 1, 30, 35, etc., que se administra por inhalación rápida a través del paso nasal o por inhalación. a través de la boca para alcanzar los sacos alveolares. Las formulaciones adecuadas incluyen soluciones acuosas u oleosas del ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para la administración de aerosol o polvo seco pueden prepararse de acuerdo con métodos convencionales y pueden administrarse con otros agentes terapéuticos tales como compuestos utilizados hasta ahora en el tratamiento o profilaxis de infecciones por Filoviridae como se describe a continuación.
[0070] Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol que contienen además del ingrediente activo los portadores que se conocen en la técnica como apropiados.
[0071] Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes.
[0072] Las formulaciones se presentan en recipientes de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo ampollas selladas y viales, y pueden almacenarse en una condición secada por congelación (liofilizada) que requiere sólo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyección, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporánea se preparan a partir de polvos, gránulos y tabletas estériles del tipo descrito anteriormente. Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis diaria o subdosis unitaria diaria, como se menciona anteriormente en el presente documento, o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente activo.
[0073] Debe entenderse que además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión, por ejemplo los adecuados para administración oral pueden incluir agentes aromatizantes.
[0074] La invención proporciona además composiciones veterinarias que comprenden al menos un ingrediente activo como anteriormente definido junto con un vehículo veterinario para el mismo.
[0075] Los vehículos veterinarios son materiales útiles para el propósito de administrar la composición y pueden ser materiales sólidos, líquidos o gaseosos que son de otro modo inertes o aceptables en la técnica veterinaria y son compatibles con el ingrediente activo. Estas composiciones veterinarias pueden administrarse por vía oral, parenteral o por cualquier otra vía deseada.
[0076] Los compuestos de la invención se utilizan para proporcionar formulaciones farmacéuticas de liberación controlada que contienen como un ingrediente activo uno o más compuestos de la invención ("formulaciones de liberación controlada") en las que la liberación del ingrediente activo se controlan y regulan para permitir menos frecuencia de dosificación o para mejorar el perfil farmacocinético o de toxicidad de un ingrediente activo dado.
IV. VÍAS DE ADMINISTRACIÓN
[0077] Uno o más compuestos de la invención (en adelante referidos como los ingredientes activos) se administran por cualquier vía apropiada para la afección a tratar. Las vías adecuadas incluyen oral, rectal, nasal, pulmonar, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural) y similares. Se apreciará que la vía preferida puede variar con, por ejemplo, la condición del destinatario. Una ventaja de los compuestos de esta invención es que son biodisponibles por vía oral y pueden dosificarse por vía oral.
[0078] Los compuestos de la presente invención pueden administrarse en cualquier momento a un humano que pueda entrar en contacto con humanos que padecen infección por Filoviridae o que ya padece infección por Filoviridae. En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invención pueden administrarse profilácticamente a humanos que entran en contacto con humanos que padecen infección por Filoviridae. En algunas realizaciones, la administración de los compuestos de la presente invención puede ser a seres humanos que dan positivos para la infección por Filoviridae pero aún no muestran síntomas de infección por Filoviridae. En algunas realizaciones, la administración de los compuestos de la presente invención puede ser a humanos al comienzo de los síntomas de infección por Filoviridae.
[0079] La dosis eficaz de ingrediente activo depende al menos de la naturaleza de la afección a tratar, la toxicidad, si el compuesto se está utilizando profilácticamente (dosis más bajas) o contra una infección viral activa, el método de administración, y la formulación farmacéutica, y será determinado por el clínico utilizando estudios convencionales de aumento de dosis. Se puede esperar que sea de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día; típicamente, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día; más típicamente, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por día; más típicamente, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal por día. Por ejemplo, la dosis candidata diaria para un humano adulto de aproximadamente 70 kg de peso corporal oscilará entre 1 mg y 1000 mg, preferiblemente entre 5 mg y 500 mg, y puede tomar la forma de dosis únicas o múltiples.
[0080] La dosis eficaz de un compuesto de la presente invención para el tratamiento de la infección por Filoviridae puede depender de si la dosis es para ser utilizada profilácticamente o para tratar a un humano que ya padece infección por Filoviridae. Además, la dosis puede depender de si el ser humano que padece la infección por Filoviridae todavía no muestra síntomas o si ya muestra síntomas de infección por Filoviridae. Es posible que se necesiten dosis mayores para tratar a los humanos que resulten positivos para la infección por Filoviridae y para los humanos que muestran síntomas de infección por Filoviridae en comparación con los humanos que reciben tratamiento profiláctico.
[0081] Se contempla cualquier periodo de tiempo adecuado para la administración de los compuestos de la presente invención. Por ejemplo, la administración puede ser de 1 día a 100 días, incluidos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 días. La administración también puede ser de 1 semana a 15 semanas, incluyendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 semanas. También se contemplan períodos más largos de administración. El tiempo de administración puede depender de si el compuesto se administra profilácticamente o para tratar a un humano que padece una infección por Filoviridae. Por ejemplo, una administración profiláctica puede ser por un período de tiempo mientras el humano está en contacto regular con otros humanos que padecen una infección por Filoviridae, y por un período de tiempo adecuado después del último contacto con un humano que padece una infección por Filoviridae. Para los humanos que ya padecen una infección por Filoviridae, el período de administración puede ser por cualquier período de tiempo necesario para tratar al paciente y un período de tiempo adecuado después de una prueba negativa para la infección por Filoviridae para asegurar que no regrese la infección por Filoviridae.
V. TERAPIA DE COMBINACIÓN
[0082] Las composiciones de la invención también se utilizan en combinación con otros ingredientes activos. Para el tratamiento de infecciones por el virus Filoviridae, preferiblemente, el otro agente terapéutico activo es activo contra las infecciones por el virus Filoviridae, particularmente las infecciones por el virus de Marburg, el virus del Ébola y el virus de Cueva. Ejemplos no limitantes de estos otros agentes terapéuticos activos son ribavirina, palivizumab, motavizumab, Rs V-IGIV (RespiGam®), MEDI-557, A-60444, MDT-637, BMS-433771, amiodarona, dronedarona, verapamilo, plasma convaleciente de ébola (ECP), TKM-100201, BCX4430 ((2S, 3S, 4R, 5R)-2-(4-amino-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-7-ilo)-5-(hidroximetilo)pirrolidina-3,4-diol), favipiravir (también conocido como T-705 o Avigan), monofosfato T-705, difosfato T-705, trifosfato T-705, FGI-106 (1-N,7-N-bis[3-(dimetilamino)propilo]-3,9-dimetilquinolino[8,7-h]quinolona-1,7-diamina), JK-05, TKM-Ébola, ZMapp, rNAPc2, VRC-EBOADC076-00-VP, OS-2966, MVA-BN filo, brincidofovir, vacuna contra ébola de vector adenovirus Vaxart 5, Ad26-ZEBOV, vacuna FiloVax, GOVX-E301, GOVX-E302, inhibidores de entrada de virus del Ébola (inhibidores de NPC1) y rVSV-EBOV, y mezclas de los mismos. Los compuestos y composiciones de la presente invención también pueden usarse en combinación con oligómeros de morfolino fosforamidato (PMO), que son análogos de oligonucleótidos antisentido sintéticos diseñados para interferir con los procesos de traducción formando dúplex de pares de bases con secuencias de ARN específicas. Los ejemplos de PMO incluyen AVI-7287, AVI-7288, AVI-7537, AVI-7539, AVI-6002 y AVI-6003. Los compuestos y composiciones de la presente invención también están destinados a su uso con cuidado general en pacientes con infecciones virales por Filoviridae, que incluyen fluidos parenterales (que incluyen solución salina de dextrosa y lactato de Ringer) y antibióticos nutricionales (que incluyen metronidazol y cefalosporina, como ceftriaxona y cefuroxima) y/o profilaxis antifúngica, medicamentos para la fiebre y el dolor, antieméticos (como metoclopramida) y/o agentes antidiarreicos, suplementos vitamínicos y minerales (incluida la vitamina K y sulfato de zinc), agentes antiinflamatorios (como ibuprofeno), medicamentos para el dolor, y medicamentos para otras enfermedades comunes en la población de pacientes, tales como agentes antipalúdicos (incluida la terapia combinada de arteméter y artesunato-lumefantrina), fiebre tifoidea (incluidos antibióticos de quinolona, como ciprofloxacina, antibióticos macrólidos, como azitromicina, antibióticos de cefalosporina, como ceftriaxona o aminopenicilinas, como ampicilina) o shigelosis.
[0083] También es posible combinar cualquier compuesto de la invención con uno o más agentes terapéuticos activos adicionales en una forma de dosificación unitaria para la administración simultánea o secuencial a un paciente. La terapia combinada puede administrarse como un régimen simultáneo o secuencial. Cuando se administra secuencialmente, la combinación se puede administrar en dos o más administraciones.
[0084] La administración conjunta de un compuesto de la invención con uno o más agentes terapéuticos activos generalmente se refiere a la administración simultánea o secuencial de un compuesto de la invención y uno o más agentes terapéuticos activos adicionales, de modo que cantidades terapéuticamente efectivas del compuesto de la invención y uno o más agentes terapéuticos activos adicionales están presentes en el cuerpo del paciente.
[0085] La administración conjunta incluye la administración de dosis unitarias de los compuestos de la invención antes 0 después de la administración de dosis unitarias de uno o más de otros agentes terapéuticos activos, por ejemplo, la administración de los compuestos de la invención en segundos, minutos u horas de la administración de uno o más agentes terapéuticos activos. Por ejemplo, una dosis unitaria de un compuesto de la invención puede administrarse primero, seguido en segundos o minutos por la administración de una dosis unitaria de uno o más de otros agentes terapéuticos activos. Alternativamente, se puede administrar primero una dosis unitaria de uno o más de otros agentes terapéuticos, seguido de la administración de una dosis unitaria de un compuesto de la invención en segundos o minutos. En algunos casos, puede ser deseable administrar primero una dosis unitaria de un compuesto de la invención, seguido, después de un período de horas (por ejemplo, 1-12 horas), por la administración de una dosis unitaria de uno o más otros agentes terapéuticos activos. En otros casos, puede ser deseable administrar una dosis unitaria de uno o más agentes terapéuticos activos primero, seguido, después de un período de horas (por ejemplo, 1 -12 horas), por la administración de una dosis unitaria de un compuesto de la invención.
[0086] La terapia de combinación puede proporcionar "sinergia" y ''sinérgico'', es decir, el efecto logrado cuando los activos ingredientes utilizados juntos es mayor que la suma de los efectos que resulta de utilizar los compuestos por separado. Se puede lograr un efecto sinérgico cuando los ingredientes activos son: (1) co-formulados y administrados o administrados simultáneamente en una formulación combinada; (2) administrados por alternancia o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) por algún otro régimen. Cuando se administra en terapia de alternancia, se puede lograr un efecto sinérgico cuando los compuestos se administran o administran secuencialmente, por ejemplo, en tabletas, píldoras o cápsulas separadas, o mediante diferentes inyecciones en jeringas separadas. En general, durante la terapia de alternancia, una dosis efectiva de cada ingrediente activo se administra secuencialmente, es decir, en serie, mientras que en la terapia de combinación, las dosis efectivas de dos o más ingredientes activos se administran juntas. Un efecto antivírico sinérgico denota un efecto antiviral que es mayor que los efectos puramente aditivos predichos de los compuestos individuales de la combinación.
[0087] En todavía otra realización más, la presente solicitud proporciona el compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en procedimientos de inhibición de polimerasa de Filoviridae en una célula, que comprende: poner en contacto una célula infectada con un Filovirus con una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por lo que se inhibe la polimerasa de Filoviridae.
[0088] En todavía otra realización más, la presente solicitud proporciona el compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en procedimientos de inhibición de polimerasa de Filoviridae en una célula, que comprende: poner en contacto una célula infectada con Filovirus con una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y al menos un agente terapéutico activo adicional, mediante el cual se inhibe la polimerasa de Filoviridae.
[0089] En todavía otra realización más, la presente solicitud proporciona el compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en procedimientos de inhibición de polimerasa de Filoviridae en una célula, que comprende: poner en contacto una célula infectada con virus Filoviridae con una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y al menos un agente terapéutico activo adicional.
[0090] En todavía otra realización más, la presente solicitud proporciona el compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en métodos de tratamiento de infección por virus Filoviridae en un ser humano, que comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0091] En todavía otra realización más, la presente solicitud proporciona el compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en métodos de tratamiento de infección por el virus Filoviridae en un ser humano, que comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y al menos un agente terapéutico activo adicional, mediante el cual se inhibe la polimerasa de Filoviridae.
[0092] En todavía otra realización más, la presente solicitud proporciona el compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en métodos de tratamiento de infección por el virus Filoviridae en un ser humano, que comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y al menos un agente terapéutico activo adicional.
[0093] También se proporciona un kit que incluye un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Cada uno de los kits individuales descritos en el presente documento puede comprender una etiqueta y/o instrucciones para el uso del compuesto en el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto (por ejemplo, humano) que lo necesite. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es una infección viral por Filoviridae humana, que incluye una infección viral por Ébola o una infección viral por Marburg. En otras realizaciones, cada kit separado también puede contener instrucciones para el uso de agentes médicos adicionales en combinación con el compuesto de la presente invención en el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto (por ejemplo, humano) que lo necesite. En ciertas de estas realizaciones, la enfermedad o afección es una infección viral por Filoviridae humana, que incluye una infección viral por Ébola o una infección viral por Marburg. En cada uno de los kits de la presente memoria existe una realización adicional en la que el kit comprende unidades de dosis individuales de un compuesto como se describe en la presente memoria, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Los ejemplos de unidades de dosificación individuales pueden incluir píldoras, tabletas, cápsulas, jeringas precargadas o cartuchos de jeringas, bolsas IV, etc., cada una de las cuales comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto en cuestión, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el kit puede contener una única unidad de dosificación y en otras están presentes múltiples unidades de dosificación, como el número de unidades de dosificación requeridas para un régimen o período específico.
[0094] También se proporcionan artículos de fabricación que incluyen un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un recipiente. En un aspecto, el artículo de fabricación comprende el compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un recipiente. En realizaciones separadas, el recipiente del artículo de fabricación puede ser un vial, frasco, ampolla, jeringa precargada, paquete de ampolla, lata, botella, caja o una bolsa intravenosa.
VI. MÉTODOS DE INHIBICIÓN DE UNA POLIMERASA DE FILOVIRIDAE
[0095] Otro aspecto de la invención se refiere al compuesto o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la presente invención, o la composición farmacéutica de la presente invención, para su uso en procedimientos de inhibición de la actividad de polimerasa de Filoviridae que comprende el paso de tratar una muestra sospechosa de contener Filoviridae con un compuesto o composición de la invención.
[0096] Los Filoviridae que pueden tratarse usando los compuestos de la presente invención son virus de ARN de sentido negativo monocatenarios que típicamente infectan a los primates. Los filovirus pueden multiplicarse en prácticamente todos los tipos de células. Los antígenos y viriones de Filovirus se encuentran principalmente en fibroblastos e intersticio de un individuo infectado. Hay tres géneros identificados de Filoviruses: el virus del Ébola (EBOV; cinco especies); el virus de Marburg (MARV); y el virus Cueva, también conocido como el virus Lloviu (LLOV). Los viriones (partículas virales) tienen forma característica como partículas largas, cilíndricas, filamentosas que pueden ser rectas, curvas, enrolladas o encontradas en una configuración en forma de "6" o "U". En ocasiones se ramifican y las partículas varían mucho en longitud, pero el diámetro (aproximadamente 80 nm) es consistente. El genoma del filovirus comprende siete genes que codifican 4 proteínas estructurales de virión (VP30, VP35, nucleoproteína (NP) y una proteína polimerasa (Lpol)) y 3 proteínas asociadas a la membrana (VP40, glicoproteína (GP) y VP24).
[0097] El género del virus del Ébola incluye cinco especies conocidas: (1) Bundibugyo Ebolavirus, también conocido como virus Bundibugyo (BDBV, previamente BEBOV); (2) Reston Ebolavirus, también conocido como virus Reston o Ébola-Reston (RESTV, anteriormente REBOV); (3) virus del Ébola de Sudán, también conocido como virus de Sudán o Ébola-Sudán (SUDV, anteriormente SEBOV); (4) Tai Forest Ebolavirus, también conocido como virus de Tai Forest o Ébola-Tai (TAFV, anteriormente CIEBOV); y (5) Zaire Ebolavirus, también conocido como virus de Ébola o Ébola-Zaire (EBOV, previamente ZEBOV).
[0098] El género de virus de Marburg incluye las especies Marburg marburgyirus, también conocido como el virus de Marburg (MARV) o virus de Ravn (RAVV). El género Cuevavirus incluye la especie Cuevavirus Lloviu, también conocido como el virus Lloviu (LLOV).
[0099] Las composiciones de la invención pueden actuar como inhibidores de la polimerasa de Filoviridae, como intermedios para tales inhibidores o tener otras utilidades como se describe a continuación. Los inhibidores se unirán a ubicaciones en la superficie o en una cavidad de la polimerasa de Filoviridae que tiene una geometría única para la polimerasa de Filoviridae. Las composiciones que se unen a la polimerasa de Filoviridae pueden unirse con diversos grados de reversibilidad. Aquellos compuestos que se unen de manera sustancialmente irreversible son candidatos ideales para el uso en este método de la invención. Una vez marcadas, las composiciones de unión sustancialmente irreversibles son útiles como sondas para la detección de la polimerasa de Filoviridae. Por consiguiente, la divulgación se refiere a métodos para detectar polimerasa de Filoviridae en una muestra sospechosa de contener polimerasa de Filoviridae que comprende los pasos de: tratar una muestra sospechosa de contener polimerasa de Filoviridae con una composición que comprende un compuesto de la invención unido a una etiqueta; y observando el efecto de la muestra en la actividad de la etiqueta. Los marcadores adecuados son bien conocidos en el campo del diagnóstico e incluyen radicales libres estables, fluoróforos, radioisótopos, enzimas, grupos quimioluminiscentes y cromógenos. Los compuestos de la presente invención se marcan de manera convencional usando grupos funcionales tales como hidroxilo, carboxilo, sulfhidrilo o amino.
[0100] Dentro del contexto de la invención, las muestras sospechosas de contener polimerasa de Filovirídae incluyen materiales naturales o artificiales tales como organismos vivos; cultivos de tejidos o células; muestras biológicas tales como muestras de material biológico (sangre, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, esputo, saliva, muestras de tejido y similares); muestras de laboratorio; muestras de comida, agua o aire; muestras de bioproductos tales como extractos de células, particularmente células recombinantes que sintetizan una glicoproteína deseada; y similares. Típicamente, se sospechará que la muestra contiene un organismo que produce la polimerasa de Filovirídae, frecuentemente un organismo patógeno como el virus Filovirídae. Las muestras pueden estar contenidas en cualquier medio, incluyendo agua y solvente orgánico/mezclas de agua. Las muestras incluyen organismos vivos como los humanos y materiales hechos por el hombre como los cultivos celulares.
[0101] La etapa de tratamiento de la divulgación comprende agregar la composición de la invención a la muestra o comprende agregar un precursor de la composición a la muestra. La etapa de adición comprende cualquier método de administración como se describe anteriormente.
[0102] Si se desea, la actividad de la polimerasa de Filovirídae después de la aplicación de la composición puede observarse mediante cualquier método que incluya métodos directos e indirectos para detectar la actividad de la polimerasa de Filovirídae. Se contemplan métodos cuantitativos, cualitativos y semicuantitativos para determinar la actividad de la polimerasa de Filovirídae. Normalmente, se aplica uno de los métodos de detección descritos anteriormente, sin embargo, cualquier otro método, como la observación de las propiedades fisiológicas de un organismo vivo, también es aplicable.
[0103] Los organismos que contienen polimerasa de Filovirídae incluyen el virus Filovirídae. Los compuestos de esta invención son útiles en el tratamiento o profilaxis de infecciones por Filovirídae en animales o en el hombre.
[0104] Sin embargo, en el cribado de compuestos capaces de inhibir virus de Filovirídae humano, se debe tener en cuenta que los resultados de la enzima de ensayos pueden no correlacionarse con los ensayos de cultivo celular. Por lo tanto, un ensayo basado en células debería ser la principal herramienta de detección.
[0105] En otra realización, la presente solicitud proporciona el compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la presente invención, o la composición farmacéutica de la presente invención, para usar en métodos para tratar la infección por el virus Filovirídae en un ser humano, que comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, la infección por Filovirídae es causada por un virus Filovirídae. En algunas realizaciones, la infección por Filovirídae es causada por un virus del Ébola. En algunas realizaciones, la infección por Filovirídae es causada por el Ébolavirus de Bundibugyo, el Ébolavirus de Fieston, el Ébolavirus de Sudán, el Ébolavirus de Tai Forest o el Ébolavirus de Zaire. En algunas realizaciones, la infección por Filovirídae es causada por un virus de Marburg. En algunas realizaciones, la infección por Filoviridae es causada por un virus Lloviu. En algunas realizaciones, se inhibe una polimerasa de Filoviridae.
[0106] Los compuestos de la presente invención se pueden usar en el tratamiento de un humano que ya padece una infección de Filoviridae, o se pueden administrar profilácticamente para reducir o prevenir la posibilidad de una infección de Filoviridae. Las infecciones por Filoviridae pueden caracterizarse por fiebre hemorrágica, hematemesis, diarrea, dolor abdominal retroesternal y postración. El período de incubación es de aproximadamente 21 días después del contacto con un ser humano que padece la infección por Filoviridae. El resultado de la infección por Filoviridae es típicamente la muerte.
VII. CRIBADOS PARA INHIBIDORES DE POLIMERASA DE FILOVIRIDAE.
[0107] Las composiciones de la invención se seleccionan para la actividad inhibitoria contra la polimerasa de Filoviridae por cualquiera de las técnicas convencionales para evaluar la actividad enzimática. Dentro del contexto de la invención, típicamente las composiciones se seleccionan primero para la inhibición de la polimerasa de Filoviridae in vitro y las composiciones que muestran actividad inhibidora se seleccionan luego para la actividad in vivo. Las composiciones que tienen Ki in vitro (constantes inhibitorias) de menos de aproximadamente 5 X 10-6 M y preferiblemente menos de aproximadamente 1 X 10-7 M se prefieren para uso in vivo.
[0108] Los cribados in vitro útiles se han descrito en detalle y no se elaborarán aquí. Sin embargo, los ejemplos describen ensayos in vitro adecuados.
VIII. PREPARACIÓN DE COMPUESTOS
EJEMPLOS
[0109] Se usan ciertas abreviaturas y acrónimos para describir los detalles experimentales. Aunque la mayoría de estos serían entendidos por un experto en la materia, la Tabla 1 contiene una lista de muchas de estas abreviaturas y acrónimos.
Tabla 1. Lista de abreviaturas y acrónimos.
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A. Preparación de compuestos
[0110] Ejemplos 12 (diastereómero R), 20-a, 20-b, 24-34 y 35-a son ejemplos de acuerdo con a la invención. Los ejemplos restantes son ejemplos de referencia.
Ejemplo 1. (2S)-etilo 2-(cloro(fenoxi)fosforilamino)propanoato (clorurato A)
[0111]
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[0112] Sal de clorhidrato de éster de alanina etilénica (1,69 g, 11 mmol) se disolvió en CH2CL anhidro (10 mL) y la mezcla agitada con enfriamiento a 0°C bajo N2 (g). Se añadió diclorofosfato de fenilo (1,49 ml, 10 mmol) seguido de adición gota a gota de Et3N durante aproximadamente 10 min. La mezcla de reacción se calentó luego lentamente a TA y se agitó durante aproximadamente 12 h. Et2O anhidro (50 ml) se añadió y la mezcla se agitó durante aproximadamente 30 min. El sólido que se formó se eliminó por filtración, y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con 0-50% de EtOAc en hexanos para proporcionar el intermedio A. 1H RMN (300 MHz, CDCla) 57,39-7,27 (m, 5H), 4,27 (m, 3H), 1,52 (m, 3H), 1,32 (m, 3H). 31P RMN (121,4 MHz, CDCla) 58,2, 7,8.
Ejemplo 2. (2S)-2-etilbutilo 2-(cloro(fenoxi)fosforilamino)propanoato (Cloridato B)
[0113]
Figure imgf000020_0002
[0114] El éster B de 2-etilbutilo alanina clorofosforamidato se preparó usando el mismo procedimiento que el cloridato A, excepto sustituyendo éster de alanina 2-etilbutilo para éster de etilo alanina. El material se usa crudo en la siguiente reacción. El tratamiento con metanol o etanol forma el producto desplazado con la señal LCMS requerida.
Ejemplo 3. (2S)-isopropilo 2-(cloro(fenoxi)fosforilamino)propanoato (Cloridato C)
[0116] El éster C de clorofosforamidato de isopropilo alanina se preparó usando el mismo procedimiento que el cloridato A , excepto la sustitución del éster de isopropilo alanina por el éster de etilo alanina. El material se usa crudo en la siguiente reacción. El tratamiento con metanol o etanol forma el producto desplazado con la señal LCMS requerida.
Ejemplo 4. (2R. 3R, 4S, 5R)-2-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3.4-dihidroxi-5-(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo (Compuesto 1)
[0117]
Figure imgf000020_0003
[0118] La preparación de (2R, 3R, 4S, 5R)-2-(4-aminopirrolo[1,2-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo se describe a continuación.
Figure imgf000021_0001
[0119] El lactol disponible comercialmente (10 g, 23,8 mmol) se disolvió en DMSO anhidro (30 ml) bajo N2 (g). Se añadió Ac2O (20 ml) y la mezcla de reacción resultante se agitó a TA durante aproximadamente 48 h. La mezcla de reacción se vertió sobre hielo H2O (500 ml) y se agitó la mezcla durante 20 min. La mezcla se extrajo con EtOAc (3 x 200 ml) y los extractos orgánicos combinados luego se lavaron con H2O (3 x 200 ml). El extracto orgánico se secó sobre anhidro MgSO4, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en CH2CL y se sometió a cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc al 25% en hexanos para proporcionar la lactona. 1H RMN (400 MHz, DMSO) 57,30-7,34 (m, 13H), 7,19-7,21 (m, 2H), 4,55-4,72 (m, 6H), 4,47 (s, 2H), 4,28 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 3,66 (m, 2H). LCMS m/z 436,1 [M+H2O], 435,2 [m OH]- Tr = 2,82 min. HPLC Tr = 4,59 [2-98% de ACN en H2) durante 5 min a 2 ml/min de flujo.
Figure imgf000021_0002
[0120] El bromopirazol (preparado de acuerdo con WO2009/132135) (0,5 g, 2,4 mmol) se suspendió en THF anhidro (10 ml) bajo N2 (g). La suspensión se agitó y se añadió TMSCl (0,67 ml, 5,28 mmol). La mezcla se agitó durante 20 min. a TA y luego se enfrió a aproximadamente -78°C, después de lo cual se añadió lentamente una solución de n-BuLi (6 ml, 1,6 N en hexanos, 9,6 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a aproximadamente -78°C y luego se añadió la lactona (1 g, 2,4 mmol) mediante una jeringa. Cuando se completó la reacción medida por LCMS, se añadió AcOH para apagar la reacción. La mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se disolvió en una mezcla de CH2CL y H2O (100 ml, 1:1). La capa orgánica se separó y se lavó con H2O (50 ml). La capa orgánica fue luego secada sobre MgSO4 anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc al 0-50% en hexanos para proporcionar el producto como una mezcla 1:1 de anómeros. LCMS m/z 553 [M+H].
Figure imgf000021_0003
[0121] El nucleósido hidroxi (1,1 g, 2,0 mmol) se disolvió en CH2CL anhidro (40 ml) y la solución enfriada con agitación a aproximadamente -78°C en atmósfera de N2 (g). Se añadió TMSCN (0,931 ml, 7 mmol) y la mezcla se agitó durante 10 minutos más. Se añadió lentamente TMSOTf (1,63 ml, 9,0 mmol) a la reacción y la mezcla se agitó durante 1 h. La reacción se diluyó entonces la mezcla con CH2Cl2 (120 ml) y acuosa NaHCO3 (120 ml) se añadió para sofocar la reacción. La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos más y la capa orgánica se separó. La capa acuosa se extrajo con CH2CL (150 ml) y los extractos orgánicos combinados se secaron sobre MgSO4 anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en una cantidad mínima de CH2Cl2 y se sometió a cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 0-75% de EtOAc y hexanos para proporcionar el nucleósido de tribencilo ciano como una mezcla de anómeros. 1H RMN (300 MHz, CD3CN) 57,94 (s, 0,5H), 7,88 (s, 0,5H), 7,29-7,43 (m, 13H), 7,11-7,19 (m, 1H), 6,82-6,88 (m, 1H), 6,70-6,76 (m, 1H), 6,41 (bs, 2H), 5,10 (d, J = 3,9 Hz, 0,5H), 4,96 (d, J = 5,1 Hz, 0,5H), 4,31-4,85 (m, 7H), 4,09-4,18 (m, 2H), 3,61-3,90 (m, 2H). LCMS m/z 562 [M+H].
Figure imgf000022_0001
[0122] El nucleósido de tribencilo ciano (70 mg, 0,124 mmol) se disolvió en CH2CI2 anhidro (2 ml) y se enfrió a aproximadamente -20°C en atmósfera de N2 (g). Se añadió una solución de BCl3 (IN en CH2Cl2, 0,506 ml, 0,506 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h a -78°C. Cuando la reacción se completó por LC/MS, se añadió MeOH para apagar la reacción. La mezcla de reacción se dejó calentar a TA y el disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se sometió a HPLC C18 de fase inversa, eluyendo durante 5 min con H2O (0,1% de TFA), seguido de un gradiente de 0-70% de MeCN en H2O (0,1% de TFA) durante 35 min, para eluir el a-anómero y p-anómero 1. (a-anómero) 1H RMN (300 MHz, D2O) 57,96 (s, 1H), 7,20 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 4,97 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 4,56-4,62 (m, 1H), 4,08-4,14 (m, 1H), 3,90 (dd, J = 12,9, 2,4 Hz, 1H), 3,70 (dd, J = 13,2, 4,5 Hz, 1H). (p-anómero) 1H RMN (400 MHz, DMSO) 57,91 (s, 1H), 7,80-8,00 (br s, 2H), 6,85-6,89 (m, 2H), 6,07 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,17 (br s, 1H), 4,90 (br s, 1H), 4,63 (t, J = 3,9 Hz, 1H), 4,02-4,06 (m, 1H), 3,94 (br s, 1H), 3,48-3,64 (m, 2 H). LCMS m/z 292,2 [M+H], 290,0 [MH]. Tr = 0,35 min. 13C RMN (400 MHZ, DMSO), 156,0, 148,3, 124,3, 117,8, 117,0, 111,2, 101,3, 85,8, 79,0, 74,7, 70,5, 61,4. HPLC Tr = 1,32 min.
Preparación______de______(3R,______4R______5R)-2-(4-aminopirrolof2.1-f1f1,2.41triazina-7-ilo)-3.4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol usando LaCls-2LiCl
[0123]
Figure imgf000022_0002
[0124] Una solución de 7-yodopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-4-amina (7,5 g, 28,8 mmol, 1,0 equiv.) se preparó en THF (67 ml). La solución se enfrió a aproximadamente 0°C y se añadió TMSCl (3,3 ml, 30,3 mmol, 1,05 equiv.). La mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 30 minutos, y luego se añadió PhMgCl (2 M en THF; 28 ml, 56,8 mmol, 1,97 equiv.) mientras se mantenía una temperatura interna por debajo de 5°C. La mezcla de reacción se agitó a aproximadamente 0°C durante aproximadamente 35 minutos, y luego se enfrió a aproximadamente -15°C. Después, se añadió /'PrMgCl (2 M en THF, 14 ml, 30,2 mmol, 1,05 equiv) mientras se mantiene una temperatura interna por debajo de aproximadamente -10°C. Después de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente -15°C, se añadió LaCl3-2LiCl (0,6 M en THF, 50 ml, 14,4 mmol, 0,5 equiv.) mientras se mantenía una temperatura interna por debajo de aproximadamente -15°C. La mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 25 minutos a aproximadamente -20°C.
[0125] En un matraz separado, una solución de (3R, 4R, 5R)-3,4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)dihidrofurano-2(3H)-ona (10,0 g, 23,9 mmol, 0,83 equiv.) se preparó en THF (45 ml). La solución se enfrió a aproximadamente -20°C, y luego se transfirió a la solución de Grignard mientras se mantenía una temperatura interna por debajo de aproximadamente -15°C. La mezcla de reacción resultante se agitó a aproximadamente -20°C durante aproximadamente 30 minutos.
[0126] La reacción se inactivó con 2 M HCl (53 ml), y la mezcla se calentó a aproximadamente 15°C. Se añadió PrOAc (38 ml) y se separaron las fases orgánica y acuosa. La capa acuosa inferior se descargó, y la capa orgánica superior se lavó secuencialmente con 2,5% en peso de NaHCO3 (53 ml), 2,5% en peso de NaHCO3 (53 ml), y 10% en peso de NaCl (53 ml).
[0127] La fase orgánica se concentró hasta aproximadamente 45 ml, y luego se diluyó con /PrOAc (75 ml). La solución se concentró nuevamente a aproximadamente 45 ml y luego se diluyó con /PrOAc (23 ml). La solución se concentró hasta aproximadamente 45 ml y luego se filtró sobre una almohadilla de Celite. La solución filtrada se concentró hasta aproximadamente 26 ml y luego se diluyó con MTBE (75 ml). Después de 2 h, se añadió lentamente heptano (23 ml) y la suspensión se agitó a aproximadamente 25°C durante aproximadamente 2 h, y luego se enfrió a aproximadamente -5°C durante aproximadamente 8 h. Los sólidos se aislaron por filtración, y la torta del filtro se lavó con MTBE/heptano (4:1,23 ml). Los sólidos se secaron en un horno de vacío a no más de aproximadamente 35°C para proporcionar (3R, 4R, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol.
Preparación______de______(3R,______4R______5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f1[1,2.41triazina-7-ilo)-3.4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol utilizando CeCl3
[0128]
Figure imgf000023_0001
[0129] El yodopirazol (5,02 g, 19,3 mmol) se disolvió en THF (45 g) y la solución se enfrió a aproximadamente 0°C con agitación. Se añadió TMSCl (2,04 g, 18,7 mmol), y después de aproximadamente 1 h se añadió cloruro de fenilmagnesio (2,0 M en THF, 19,9 g, 38,2 mmol). La mezcla de reacción se enfrió a aproximadamente -20°C y se añadió lentamente cloruro de /'so-propilmagnesio (2,0 M en THF, 9,99 g, 20,5 mmol). Después de aproximadamente 30 minutos, la mezcla de reacción se transfirió a una mezcla de cloruro de cerio anhidro (4,75 g, 19,3 mmol) en THF (22 g) a aproximadamente -20°C. Después de aproximadamente 1,5 h a, se añadió lentamente solución de lactona (6,73 g, 16,1 mmol) en THF (22 g), y la mezcla de reacción resultante se agitó durante aproximadamente 1 h. Se añadió 2 M HCl (41 g), la mezcla se calentó a aproximadamente 15°C y se añadió acetato de /so-propilo (35 g). Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con 2,5% NaHCO3 (2 x 40 g), 10% de NaCl (1 x 35 g) y se concentraron a aproximadamente 30 ml de volumen. Se cargó acetato de /so-propilo (44 g) y la solución se concentró hasta aproximadamente 30 ml de volumen. Se cargó acetato de /so-propilo (43 g) y la solución se concentró hasta aproximadamente 30 ml de volumen. La solución se filtró y el filtrado se concentró hasta aproximadamente 18 ml de volumen. Se añadió ferc-butilmetilo éter (37 g) seguido de cristales de semillas del producto (10,7 mg). Después de aproximadamente 14 h, se añadió n-heptano (10,5 g) y la mezcla se enfrió a aproximadamente -5°C y se filtró. Los sólidos se lavaron con ferc-butilmetilo éter (9 g) a aproximadamente -5°C y se secaron al vacío a aproximadamente 34°C durante aproximadamente 15 h para proporcionar el producto.
Preparación______de______(3R,______4R______5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f1[1.2.41triazina-7-ilo)-3,4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol utilizando CeCls y iPrMgCl-LiCl
[0130]
Figure imgf000023_0002
[0131] El yodopirazol (5,03 g, 19,3 mmol) se disolvió en THF (45 g) y la solución se enfrió a aproximadamente 0°C con agitación bajo N2 (g). Se añadió TMSCl (2,06 g, 19,0 mmol), y después de aproximadamente 1 h se añadió cloruro de fenilmagnesio (2,0 M en THF, 20,23 g, 38,8 mmol). La mezcla de reacción se enfrió a aproximadamente -20°C y se añadió lentamente complejo de cloruro de /so-propilmagnesio cloruro-litio (2,0 M en THF, 15,37 g, 21,0 mmol). Después de aproximadamente 1 h, la mezcla de reacción se transfirió a una mezcla de cloruro de cerio (4,77 g, 19,4 mmol) en THF (22 g) a aproximadamente -20°C. Después de aproximadamente 1 h a solución de lactona (6,75 g, 16,1 mmol) en THF (23 g) se añadió lentamente, y la mezcla de reacción resultante se agitó durante aproximadamente 1,5 h. Se añadió 2 M HCl (40 g), la mezcla se calentó a aproximadamente 15°C y se añadió acetato de /so-propilo (35 g). Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con 2,5% NaHCO3 (2 x 40 g), 10% de NaCl (1 x 36 g) y se concentraron a aproximadamente 30 ml de volumen. Se añadió acetato de /'so-propilo (44 g) y la solución se concentró hasta aproximadamente 30 ml de volumen. La solución se filtró y el filtrado se concentró hasta aproximadamente 18 ml de volumen. Se añadió ferc-butilmetilo éter (37 g) seguido de cristales de semillas del producto (10,5 mg). Después de aproximadamente 14 h, se añadió n-heptano (11 g) y la mezcla se enfrió a aproximadamente -52C y se filtró. Los sólidos se lavaron con ferc-butilmetilo éter (9 g) a aproximadamente -5°C y se secaron al vacío a aproximadamente 34°C durante aproximadamente 15 h para proporcionar el producto.
Preparación______de______(3R,______4R______5R)-2-(4-aminopirrolof2.1-f1f1,2.41triazina-7-ilo)-3.4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol usando YCl3
[0132]
Figure imgf000024_0001
[0133] El yodopirazol (4,99 g. 19,2 mmol) se disolvió en THF (44 g) y la solución se enfrió a aproximadamente 0°C con agitación. Se añadió TMSCl (2,45 ml, 19,4 mmol), y después de aproximadamente 30 minutos se añadió cloruro de fenilmagnesio (2,0 M en THF, 20,29 g, 39,0 mmol). La mezcla de reacción se enfrió a aproximadamente -20°C y se añadió lentamente cloruro de /so-propilmagnesio (2,0 M en THF, 9,85 g, 20,1 mmol). Después de aproximadamente 30 minutos, la mezcla de reacción se transfirió a una mezcla de cloruro de itrio anhidro (3,76 g, 19,3 mmol) y lactona (6,68 g, 16,0 mml) en THF (24 g) a aproximadamente -20°C. Después de aproximadamente 2,5 h, se añadió 2 M HCl (30 g), la mezcla se calentó a aproximadamente 15°C y se añadió acetato de /so-propilo (22 g). Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con 2,5% de NaHCÜ3 (2 x 40 g), 10% de NaCl (1 x 35 g) y se concentraron a aproximadamente 30 ml de volumen. Se cargó acetato de /so-propilo (44 g) y la solución se concentró hasta aproximadamente 30 ml de volumen. Se cargó acetato de /so-propilo (45 g) y la solución se concentró hasta aproximadamente 30 ml de volumen. La solución se filtró y el filtrado se concentró hasta aproximadamente 18 ml de volumen. Se añadió ferc-butilmetilo éter (37 g) seguido de cristales de semillas del producto (11,5 mg). Después de aproximadamente 1 h, se añadió n-heptano (15 ml) y la mezcla se enfrió a aproximadamente -5°C y se agitó durante aproximadamente 17 h. La suspensión se filtró y los sólidos se lavaron con una mezcla de tertbutilmetilo éter (8 g)/nheptano (2 g) previamente enfriada a aproximadamente -5°C. Los sólidos resultantes se secaron al vacío a aproximadamente 34°C durante aproximadamente 22 h para proporcionar el producto.
Preparación______de______(3R,______4R______5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f1[1.2.41triazina-7-ilo)-3,4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol usando NdCh
[0134]
Figure imgf000024_0002
[0135] El yodopirazol (5,02 g, 19,3 mmol) se disolvió en THF (38 g) y la solución se enfrió a aproximadamente 0°C con agitación bajo N2 (g). Se añadió TMSCl (2,45 ml, 19,4 mmol), y después de aproximadamente 1 h se añadió cloruro de fenilmagnesio (2,0 M en THF, 19,75 g, 38,0 mmol). La mezcla de reacción se enfrió a aproximadamente -20°C y se añadió lentamente cloruro de /so-propilmagnesio (2,0 M en THF, 9,40 g, 19,2 mmol). Después de aproximadamente 1,5 h, la mezcla de reacción se transfirió a una mezcla de cloruro de neodimio (III) anhidro (4,03 g, 16,1 mmol) y lactona (6,70 g, 16,0 mml) en THF (22 g) a aproximadamente -20°C. Después de aproximadamente 1,5 h, la mezcla de reacción se calentó a -10°C y, después de 2 h adicionales, se añadió 2 M HCl (36 g). La mezcla se calentó a aproximadamente 15°C y se añadió acetato de /so-propilo (23 g). Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con 2,5% NaHCÜ3 (2 x 44 g), 10% de NaCl (1 x 41 g) y se concentraron hasta aproximadamente 30 ml de volumen. Se cargó acetato de /so-propilo (44 g) y la solución se concentró hasta aproximadamente 30 ml de volumen.
Se cargó acetato de /so-propilo (45 g) y la solución se concentró hasta aproximadamente 30 ml de volumen. La solución se filtró y el filtrado se concentró hasta aproximadamente 18 ml de volumen. Se añadió ferc-butilmetilo éter (37 g) seguido de cristales de semillas del producto (11,9 mg). Después de aproximadamente 1 h, se añadió n-heptano (15 ml) y la mezcla se enfrió a aproximadamente -52C y se agitó durante aproximadamente 15 h. La suspensión se filtró y los sólidos se lavaron con una mezcla de ferc-butilmetilo éter (8 g)/n-heptano (11 g) preenfriada a aproximadamente -5°C. Los sólidos resultantes se secaron al vacío a aproximadamente 34°C durante aproximadamente 25 h para proporcionar el producto.
Preparación de (2R, 3R, 4R, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f1[1.2.41triazina-7-ilo)-3.4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo
[0136]
Figure imgf000025_0001
[0137] A una solución preenfriada (-40°C) de (3R. 4R. 5R)-2-(4-am¡nopirrolo[2.1-f][1.2.4]tr¡az¡na-7-¡lo)-3,4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol (10.0 gramos. 18.1 mmol. 1.0 equiv.) en DCM (100 ml) se cargó ácido trifluoroacético (6.19 gramos. 54.3 mmoles. 3.0 equiv.). seguido de una solución preenfriada (-30°C) de TMSOTf (24.1 gramos. 108.6 mmoles. 6.0 equiv.) y TMSCN (10.8 gramos. 108.6 mmol. 6.0 equiv.) en DCM (50 ml) mientras se mantiene la temperatura interna por debajo de aproximadamente -25°C. La mezcla de reacción se agitó a menos de aproximadamente -30°C durante no menos de 10 minutos y se inactivó en una solución preenfriada (aproximadamente -10°C) de 20% en peso. % KOH ac. (120 ml). La mezcla bifásica se calentó a temperatura ambiente. La capa orgánica se separó y se lavó con 10% en peso. % NaCl ac. (3 X 50 ml). La fase orgánica se filtró. se concentró al vacío hasta aproximadamente 50 ml. se diluyó nuevamente con tolueno (200 ml) y se concentró al vacío hasta 140 ml a aproximadamente 50°C. La solución se sembró con (2R. 3R. 4R. 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.41triazina-7-ilo)-3.4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo a aproximadamente 55°C. Se agitó a aproximadamente 55°C durante aproximadamente una hora y se enfrió a aproximadamente 0°C durante aproximadamente 6 horas. Los sólidos se aislaron por filtración y la torta del filtro se lavó con tolueno (30 ml). Los sólidos se secaron al vacío a aproximadamente 50°C.
Preparación de (2R. 3R. 4R. 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f1[1.2.41triazina-7-ilo)-3.4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo mediante química de flujo
[0138]
Figure imgf000025_0002
[0139] Soluciones de (3R. 4R. 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f1[1.2.41triazina-7-ilo)-3.4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol (23.0 g en 460.07 g de DCM). TMSOTf (55.81 g en 138.07 g de DCM) y se bombeó secuencialmente TMSCN (25.03 g en 138.10 g de DCM) en un reactor tubular a aproximadamente -40°C. La mezcla de reacción se recogió en un matraz. mantenido en baño de hielo. que contenía una solución acuosa de KOH al 20% (46.91 g de KOH y 210 g de agua). Las capas se separaron y la fase orgánica se lavó secuencialmente con solución acuosa de KOH al 10% (10 g de KOH y 90 ml de agua) y con salmuera al 10% (2 x 100 g). La fase orgánica se concentró al vacío hasta aproximadamente 4 volúmenes. se cargó alcohol isopropílico (162.89 g) y la mezcla se concentró al vacío hasta aproximadamente 10 volúmenes. El contenido se calentó a aproximadamente 60°C. luego se ajustó a aproximadamente 0°C durante aproximadamente 6.5 h y se agitó a aproximadamente 0°C durante aproximadamente 15.5 h. La suspensión resultante se filtró. los sólidos se enjuagaron con alcohol isopropílico (61.79 g) y luego se secaron a aproximadamente 50°C a presión reducida durante la noche para proporcionar el producto.
Preparación_____de_____(2R._____3R_____4S_____5R)-2-(4-aminopirrolo[1.2-f1[1.2.41triazina-7-ilo)-3.4-dihidroxi-5(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo
[0140]
Figure imgf000026_0001
[0141] El nucleósido de tribencilo ciano (48,8 g, 86,9 mmol, 1,0 equiv.) se disolvió en CH2Cl2 anhidro (244 ml) y se enfrió a aproximadamente -20°C. Se añadió gota a gota una solución de BCl3 (1 M en CH2Cl2 s, 295 ml, 295 mmol, 3,4 equiv.), manteniendo la temperatura interna por debajo de aproximadamente -15°C. Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a aproximadamente -20°C. Se añadió MeOH (340 ml) gota a gota, manteniendo la temperatura interna por debajo de -15°C. La solución resultante se destiló a aproximadamente 250 ml, luego se rellenó con aproximadamente 250 ml de MeOH. La solución resultante se destiló nuevamente a aproximadamente 250 ml, luego se rellenó con aproximadamente 250 ml de MeOH y finalmente se destiló a aproximadamente 125 ml. Se añadió agua (125 ml), seguido de solución de K2CO3 (20% en peso en agua, 125 ml). Se comprobó el pH y se encontró que era ~ 3. Se añadió solución de K2CO3 (20% en peso en agua, 50 ml), y se encontró que el pH era ~ 8. La suspensión resultante se agitó durante la noche, luego se filtró y se lavó con agua (50 ml) y MeOH (50 ml). La torta del producto húmedo se secó durante la noche a aproximadamente 40°C durante la noche. 1H RMN (300 MHz, D2O) 57,96 (s, 1H), 7,20 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 4,97 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 4,56-4,62 (m, 1H), 4,08-4,14 (m, 1H), 3,90 (dd, J = 12,9, 2,4 Hz, 1H), 3,70 (dd, J = 13,2, 4,5 Hz, 1H).
Ejemplo 11. (2S)-isopropilo 2-((((2R. 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]triaz¡na-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi) (fenoxi)-fosforilamino)propanoato (Compuesto 8)
[0142]
Figure imgf000026_0002
[0143] El nucleósido 1 (45 mg, 0,15 mmol) se disolvió en fosfato de trimetilo anhidro (0,5 ml) y la solución se agitó bajo N2 (g) a aproximadamente 0°C. Se añadió metilo imidazol (36 ml, 0,45 mmol) a la solución. El clorofosforamidato C (69 mg, 0,225 mmol) se disolvió en THF anhidro (0,25 ml) y se añadió gota a gota a la mezcla de nucleósidos. Cuando la reacción era completa por LCMS, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO3, NaCl saturado, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía de gel de sílice de elución con 0-5% de MeOH en CH2CL seguido por HPLC preparativa para dar el producto. 1H RMN (300 MHz, CD3OD) 5 7,95 (m, 1H), 7,31-6,97 (m, 7H), 4,94 (m, 1H), 4,78 (m, 1H), 4,43 (m, 3H), 4,20 (m, 1H), 3,80 (d, 1H), 1,30-1,18 (m, 9H). 31P RMN (121,4 MHz, CD3OD) 53,8. LCMS m/z 561,0 [M+H], 559,0 [M-H].
Ejemplo 12. (2S)-2-etilbut¡lo 2-((((2R. 3S. 4R. 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]tr¡azina-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilamino)propanoato (Compuesto 9)
[0144] El Compuesto 9 puede prepararse mediante varios métodos descritos a continuación.
Procedimiento 1
[0145]
Figure imgf000027_0001
[0146] Preparado a partir del Compuesto 1 y cloridato B de acuerdo con el mismo método que para la preparación del compuesto 8. 1H RMN (300 MHz, CD3OD) 57,87 (m, 1H), 7,31-7,16 (m, 5H), 6,92-6,89 (m, 2H), 4,78 (m, 1H), 4,50­ 3,80 (m, 7H), 1,45-1,24 (m, 8H), 0,95-0,84 (m, 6H). 31P RMN (121,4 MHz, CD3OD) 5 3,7. LCMS m/z 603,1 [M+H], 601,0 [M-H].
Procedimiento 2
[0147]
Figure imgf000027_0002
[0148] (2S)-2-etilbutilo 2-(((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nopirrolo[2.1-f][1.2.4]tr¡az¡na-7-¡lo)-5-c¡ano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato. El (2S)-2-etilbutilo 2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (1,08 g, 2,4 mmol) se disolvió en DMF anhidro (9 ml) y se agitó en una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. (2R, 3R, 4S, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo (350 mg, 1,2 mmol) se añadió a la mezcla de reacción en una porción. Una solución de cloruro de f-butilmagnesio luego se añadió gota a gota en THF (1 M, 1,8 ml, 1,8 mmol) a la reacción durante aproximadamente 10 minutos. La reacción se agitó durante aproximadamente 2 h, momento en donde la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (50 ml) y se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (3 x 15 ml) seguido de una solución acuosa saturada de cloruro de sodio (15 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. El aceite resultante se purificó con cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH al 0-10% en DCM) para proporcionar (2S)-2-etilbutilo 2-((((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (311 mg, 43 %, 1:0,4 mezcla diastereomérica en fósforo) como un sólido blanco. 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 57,85 (m, 1H), 7,34-7,23 (m, 2H), 7,21-7,09 (m, 3H), 6,94-6,84 (m, 2H), 4,78 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,46 - 4,33 (m, 2H), 4,33 - 4,24 (m, 1H), 4,18 (m, 1H), 4,05 - 3,80 (m, 3H), 1,52 - 1,39 (m, 1H), 1,38 -1,20 (m, 7H), 0,85 (m, 6H). 31P RMN (162 MHz, CD3OD) 53,71,3,65. LCMS m/z 603,1 [M+H], 600,9 [M-H]. HPLC (2-98% de MeCN - H2O gradiente con 0,1% de TFA modificador de más de 8,5 min, 1,5 ml/min, Columna: Phenomenex Kinetex C18, 2,6 um 100 Á, 4,6 x 100 mm) fn = 5,544 min, 5,601 min.
Separación de los diastereómeros (S) y (R)
[0149] (2S)-2-etilbutilo 2-((((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato se disolvió en acetonitrilo. La solución resultante se cargó en una columna quiral Lux Cellulose-2, se equilibró en acetonitrilo y se eluyó con acetonitrilo/metanol isocrático (95:5 vol/vol). El primer diastereómero eluyente tuvo un tiempo de retención de 17,4 min, y el segundo diastereómero eluyente tuvo un tiempo de retención de 25,0 min.
[0150] El primer diastereómero eluyente es (S)-2-etilbutilo 2-(((R)-(((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato:
Figure imgf000028_0001
1H RMN (400 MHz, CD3OD) 58,05 (s, 1H), 7,36 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,29 (br t, J = 7,8 Hz, 2H), 7,19 - 7,13 (m, 3H), 7,11 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 4,73 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,48 - 4,38 (m, 2H), 4,37 - 4,28 (m, 1H), 4,17 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,08 - 3,94 (m, 2H), 3,94 - 3,80 (m, 1H), 1,48 (sep, J = 12,0, 6,1 Hz, 1H), 1,34 (p, J = 7,3 Hz, 4H), 1,29 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 0,87 (t, J = 7,4 Hz, 6H). 31P RMN (162 MHz, CD3OD) 53,71 (s). HPLC (2-98% de MeCN - H2O gradiente con 0,1% de TFA modificador de más de 8,5 min, 1,5 ml/min, Columna: Phenomenex Kinetex C18, 2,6 um 100 Á, 4,6 x 100 mm) tn = 5,585 min.
[0151] El segundo diastereómero de elución es (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina- 7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato:
Figure imgf000028_0002
1H RMN (400 MHz, CD3OD) 58,08 (s, 1H), 7,36 - 7,28 (m, 3H), 7,23 - 7,14 (m, 3H), 7,08 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 4,71 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,45 - 4,34 (m, 2H), 4,32 - 4,24 (m, 1H), 4,14 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 4,08 - 3,94 (m, 2H), 3,93 - 3,85 (m, 1H), 1,47 (sep, J = 6,2 Hz, 1H), 1,38 - 1,26 (m, 7H), 0,87 (t, J = 7,5 Hz, 6H). 31P RMN (162 MHz, CD3OD) 53,73 (s). HPLC (2-98% de MeCN-H2O gradiente con 0,1% de TFA modificador de más de 8,5 min, 1,5 ml/min, Columna: Phenomenex Kinetex C18, 2,6 um 100 Á, 4,6 x 100 mm) tn = 5,629 min.
Ejemplo 13. (2S)-etilo 2-((((2R. 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[1.2-f][1.2.4]tr¡azina-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxQ(fenoxi)fosforilamino)propanoato (Compuesto 10)
[0152]
Figure imgf000028_0003
[0153] La preparación de (2S)-etilo 2-((((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato se describe a continuación.
Procedimiento 1. Preparación a través de clorurato A
[0154]
Figure imgf000029_0001
[0155] Preparado a partir del Compuesto 1 y clorurato A usando el mismo método que para la preparación del compuesto 8.1H RMN (300 MHz, CD3OD) 57,95 (m, 1H), 7,32-6,97 (m, 7H), 4,78 (m, 1H), 4,43-4,08 (m, 6H), 3,83 (m, 1H), 1,31-1,18 (m, 6H). 31P RMN (121,4 MHz, CD3OD) 53,7. LCMS m/z 547,0 [M+H], 545,0 [M-H].
Procedimiento 2. Preparación a través del compuesto L de nitro-benceno
[0156]
Figure imgf000029_0002
[0157] El Compuesto 1 (50 mg, 0,17 mmol) se disolvió en NMP-THF (1:1 ml)) y se enfrió con baño de hielo. Luego se añadió tBuMgCl (0,257 mL, 0,257 mmol) durante aproximadamente 5 min. La mezcla resultante se dejó calentar a TA y se agitó durante aproximadamente 30 minutos. Luego se añadió una solución del compuesto L (preparada de acuerdo con el documento US20120009147, 74,6 mg, 0,189 mmol) en THF (2 ml). Después de aproximadamente 30 minutos, la mezcla de reacción se purificó por HPLC (acetonitrilo del 10 al 80% en agua) para dar el compuesto 29 como un sólido amarillo. El sólido se purificó adicionalmente mediante cromatografía de gel de sílice (MeOH al 020% DCM) para proporcionar el compuesto 29. 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 57,76 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 7,25-7,14 (m, 2H), 7,11 - 6,99 (m, 3H), 6,87 - 6,72 (m, 2H), 4,70 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,39 - 4,24 (m, 2H), 4,20 (dddd, J = 9,7, 7,9, 5,1, 2,8 Hz, 1H), 4,10 (dt, J = 12,8, 5,5 Hz, 1H), 4,06 - 3,91 (m, 2H), 3,72 (ddq, J = 14,3, 9,3, 7,1 Hz, 1H), 1,17 (dd, J = 7,1, 1,0 Hz, 1H), 1,14 - 1,06 (m, 5H). 31P RMN (162 MHz, CD3OD) 53,73, 3,68. MS m/z = 547 (M+1)+.
Ejemplo 15. (2S.2’S)-dietilo 2,2’-((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[1.2-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi) fosforilo)bis(azanediilo) dipropanoato (Compuesto 12)
[0158]
Figure imgf000029_0003
[0159] El nucleósido 1 (14,6 mg, 0,05 mmol) se disolvió en fosfato de trimetilo anhidro (0,5 ml) y se agitó en atmósfera de N2 (g) a TA. Se añadió POCl3 (9,2 pl, 0,1 mmol) y la mezcla se agitó durante aproximadamente 60 min. Alanina etilo éster clorhidrato (61 mg, 0,4 mmol) y después se añadió Et3N (70 pL, 0,5 mmol). La mezcla resultante se agitó durante aproximadamente 15 minutos y luego se añadió Et3N adicional (70 pl, 0,5 mmol) para dar un pH de la solución de 9-10. La mezcla se agitó durante aproximadamente 2 h. y después se diluyó con EtOAc, se lavó con solución acuosa saturada NaHCO3 seguido de solución acuosa de NaCl. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se sometió a HPLC preparativa (columna C18) para proporcionar el producto 12.1H RMN (400 MHz, CD3OD) 58,13 (s, 1H), 7,41 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,18 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 4,78 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,36 (m, 1H), 4,25-4,08 (m, 7H), 3,83 (m, 2H), 1,33-1,23 (m, 12H). 31P RMN (121,4 MHz, CD3OD) 513,8.
LCMS m/z 570,0 [M+H], 568,0 [M-H].
Ejemplo 18. S, S'-2.2’-((((2R. 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolof1.2-f1f1.2.41tr¡az¡na-7-ilo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metox0fosforilo)bis(oxQbis(etano-2.1-diilo)bis(2.2-dimetilpropanetioato) (Compuesto 15)
[0160]
Figure imgf000030_0001
[0161] El nucleósido 1 (0,028 g, 0,096 mmol) se disolvió en fosfato de trimetilo (1 ml). La reacción se agitó en atmósfera de N2 (g) y después se trató con 1 H-tetrazol (0,021 g, 0,29 mmol). La mezcla de reacción se enfrió a 0°C y el fosfano (Nucleoside Nucleotides, Nucleic acids; 14; 3-5; 1995; 763 - 766. Lefebvre, Isabelle; Pompon, Alain; Perigaud, Christian; Girardet, Jean-Luc; Gosselin, Gilles; et al.) (87 mg, 0,192 mmol) se añadió. La reacción se agitó durante 2 h. y luego se enfrió con agua oxigenada al 30% (0,120 mL). La mezcla se agitó durante 30 minutos a TA y luego se trató con tiosulfato de sodio acuoso saturado (1 ml). La mezcla se agitó durante 10 minutos y luego se concentró a presión reducida. El residuo se sometió a HPLC preparativa para aislar el producto del título 15.1H RMN (300 MHz, CD3CN) 57,98 (s, 1H), 6,92 (d, 1H), 6,81 (d, 1H), 6,44 (bs, 2H), 4,82 (m, 2H), 4,47 (m, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,00 (m, 4H), 3,80 (bs, 1H), 3,11 (m, 4H), 1,24 (s, 9H). 31P RMN (121,4 MHz, CD3CN) 5 -1,85 (s). LCMS m/z 661 [M+H].
Ejemplo 20. ((2R. 3S. 4R.5R)-5-(4-aminop¡rrolo[1.2-f1[1 ■2.41tr¡az¡na-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dih¡drox¡tetrah¡drofurano-2-¡lo)metilo trifosfato de tetrahidrógeno (Compuesto 17)
[0162]
Figure imgf000030_0002
[0163] El compuesto 17 se preparó a partir del compuesto 1 usando un procedimiento similar como se ha descrito previamente (WO2012012776). El producto se aisló como la sal de sodio. 1H RMN (400 MHz, D2O) 5 7,76 (s, 1H), 6,88 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,73 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 4,86 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,39 (m, 1H), 4,05 (m, 1H), 3,94 (m, 1H). 31P RMN (121,4 MHz, D2O) 5 -5,4 (d, 1P), -10,8 (d, 1P), -21,1 (t, 1P). LCMS m/z 530 [MH], 531,9 [M+H] Tr = 0,22 min. Intercambio de iones por HPLC Tr = 9,95 min.
Ejemplo 20-a. ((2R. 3S. 4R. 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolô 2■1-f1^1■2■41tr¡az¡na-7-¡lo)-5-c¡ano-3■4-dihidroxitetrahidrofurano-2- ¡lo)metilo fosfato (compuesto 33)
[0164]
Figure imgf000030_0003
[0165] Una mezcla de alrededor de 0,05 mmol de compuesto 1 y aproximadamente 0,5 ml de fosfato de trimetilo se selló en un recipiente de aproximadamente uno a aproximadamente 48 h. La mezcla se enfrió a aproximadamente -10 a aproximadamente 10°C y se añadieron aproximadamente 0,075 mmol de oxicloruro de fósforo. Después de aproximadamente una a aproximadamente 24 horas, la reacción se interrumpió con aproximadamente 0,5 ml de bircarbonato de tetraetilamonio 1 M y las fracciones deseadas se aislaron por cromatografía de intercambio aniónico para proporcionar el compuesto del título.
[0166] El compuesto 33 se preparó como la sal de bis-trietilamonio a partir del compuesto 1 como se describió previamente (documento WO2011150288). 1H RMN (400 MHz, D2O) 57,82 (s, 1H), 6,91 - 6,88 (m, 1H), 6,81 - 6,78 (m, 1H), 4,87 - 4,84 (m, 1H), 4,40 - 4,30 (m, 2H), 3,95 - 3,77 (m, 2H), 3,10 - 3,00 (m, 6H), 1,20 - 1,10 (m, 9H). 31P RMN (162 MHz, D2O) 52,33. MS m/z 371.
Ejemplo 20-b. ((2R. 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.4]tr¡azina-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo) difosfato de metilo trihidrógeno (Compuesto 34)
[0167]
Figure imgf000031_0001
[0168] El compuesto 34 se preparó como la sal de tri-litio del compuesto 1 como se describió previamente (WO2002057425) 31P RMN (162 MHz, D2O) 5 -5,34 (d), -9,75 (d). MS m/z 451.
Ejemplo 24. (2S)-etilo 2-((((((2R. 3S. 4R. 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.4]triaz¡na-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-3-fenilpropanoato (21)
[0169]
Figure imgf000031_0002
[0170] La preparación de (2S)-etilo 2-(((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-3-fenilpropanoato se describe a continuación.
Preparación de clorhidrato de (S)-etilo 2-amino-3-fenilpropanoato.
[0171]
Figure imgf000031_0003
[0172] Se recogió L-fenilalanina (5 g, 30 mmol) en EtOH (30 ml). Se añadió TMSCl (6,915 ml, 54 mmol) a la reacción a TA. El recipiente de reacción se equipó con un condensador de reflujo y la reacción se colocó en un baño a 802C. La reacción se agitó durante la noche. Al día siguiente la reacción se enfrió a RT, se concentró a presión reducida y el residuo resultante se recogió en Et2Ü. La suspensión resultante se filtró y los sólidos del aislante se lavaron adicionalmente con Et2Ü. Los sólidos lavados se colocaron bajo alto vacío para producir el (S)-etilo 2-amino-3-fenilpropanoato hidrocloruro de ejemplo. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,52 (s, 3H), 7,30 (m, 5H), 4,24 (ABX, Jax= 7,8 Hz, Jbx = 6,2 Hz, 1H), 4,11 (m, 2H), 3,17, 3,05 (ABX, Jab = -14 Hz, Jbx = 5,8 Hz, Jax= 7,6 Hz, 2H), 1,09 (t, J = 6,8 Hz, 3H).
Preparación de (2S)-etilo 2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-3-fenilpropanoato (Compuesto D)
[0173]
Figure imgf000032_0001
[0174] (S)-etilo 2-amino-3-fenilpropanoato hidrocloruro (1,01 g, 4,41 mmol) se disolvió en DCM (50 ml). Esta solución se enfrió a aproximadamente 0°C y se añadió PhOP(O)Cl2 (0,656 ml, 4,41 mmol), seguido de la adición lenta de Et3N (1,62 mL, 11,5 mmol) durante 5 min. El baño frío se retiró y la reacción se dejó calentar a TA y agitar durante un período de 80 minutos. Se añadió p-NO2PhOH (0,583 g, 4,19 mmol), seguido por más Et3N (0,3 ml, 2,1 mmol). El progreso de la reacción se controló por LC/MS. Una vez completada la reacción, se diluyó con Et2O, y los sólidos resultantes se eliminaron por filtración. El filtrado se concentró y el compuesto D se aisló mediante cromatografía en columna de gel de sílice (cartucho de carga seca de 25 g, columna de 120 g; eluyente: 100% de hexanos que aumentaron a EtOAc al 55% en hexanos). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 58,17 (m, 2H), 7,33 (m, 2H), 7,09 - 7,25 (m, 10H), 4,17 (m, 1H), 4,07 (m, 2H), 3,08 (m, 1H), 2,84 (m, 1H), 1,14 (m, 3H). 31P RMN (162 MHz, DMSO-ds) 5 -1,479 (s), - 1,719 (s). MS m/z = 471,01 [M+1].
Preparación de (2S)-etilo 2-(((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-3-fenilpropanoato (Compuesto 21)
[0175]
Figure imgf000032_0002
[0176] El compuesto 1 (0,030 g, 0,103 mmol) se disolvió en DMF (1 ml) y luego se añadió THF (0,5 ml). Se añadió t-BuMgCl (1M/THF, 154,5 pl, 0,154 pmol) a la reacción de forma gota a gota con agitación vigorosa. La suspensión blanca resultante se agitó a TA durante aproximadamente 30 minutos. Se añadió una solución del compuesto D (0,058 g, 0,124 mmol) en THF (1 ml) gota a gota a la reacción a temperatura ambiente. El progreso de la reacción se controló por LC/MS. Cuando la reacción progresó a una conversión del 50%, la reacción se enfrió en un baño de hielo y se inactivó con ácido acético glacial (70 ml). La reacción se concentró y el compuesto 21 se aisló del residuo mediante HPLC de fase inversa. 1H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 57,91 (d, J = 4 Hz, 1H), 7,90 (brs, 2H), 7,09-7,30 (m, 8H), 7,01, (t, J = 8,2 Hz, 2H), 6,89 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 6,82 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 6,27 (m, 1H), 6,14 (m, 1H), 5,34 (m, 1H), 4,62 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,15 (m, 1H), 3,78-4,01 (m, 6H), 2,92 (m, 1H), 2,78 (m, 1H), 1,04 (m, 3H). 31P RMN (162 MHz, DMSO-de) 53,69 (s), 3,34 (s). MS m/z = 623,0 [M+H].
Ejemplo 25. (2S)-etilo 2-(((((2R. 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.4]triaz¡na-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metox0(fenoxi)fosforilo)amino)-3-metilbutanoato (22)
[0177]
Figure imgf000033_0001
[0178] La preparación de (2S)-etilo 2-(((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-a continuación se describe ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-3-metilbutanoato.
Preparación de (2S)-etilo 3-metilo-2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)butanoato (Compuesto E)
[0179]
Figure imgf000033_0002
[0180] El (S)-etilo 2-amino-3-metilbutanoato (0,351 g, 1,932 mmol) se disolvió en DCM (17 ml). Esta solución se enfrió en un baño de hielo y PhOP(O)Cl2 se añadió (0,287 ml, 1,932 mmol), seguido de la adición lenta de Et3N (1,62 ml, 11,4 mmol) durante aproximadamente 5 min. El baño frío se retiró y la reacción se dejó calentar a TA y se agitó durante un período de 1 h. p-NO2PhOH se añadió (0,255 g, 1,836 mmol), y el progreso de la reacción se controló por LC/MS. Una vez completada la reacción, la mezcla se diluyó con Et2O, y los sólidos resultantes se eliminaron por filtración. El filtrado se concentró y el compuesto E se aisló por cromatografía en columna de gel de sílice (cartucho de carga seca de 12 g, columna de 80 g; eluyente: aumento de hexanos al 100% a EtOAc al 55% en hexanos). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,30 (d, J = 9,2 Hz, 2H), 7,48 (t, J = 9,6 Hz, 2H), 7,40 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 7,20 -7,27 (m, 3H), 6,60 (cuarto, J = 11,6 Hz, 1H), 4,01 (m, 2H), 3,61 (m, 1H), 1,93 (m, 1H), 1,11 (m, 3H), 0,79 (m, 6H). 31P RMN (162 MHz, DMSO-ds) 5 -0,342 (s), -0,578 (s). MS m/z = 422,9 [M+H].
Preparación de (2S)-etilo 2-(((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.41triazina-7-ilo)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-3-metilbutanoato (Compuesto 22)
[0181]
Figure imgf000033_0003
[0182] El compuesto 1 (0,040 g, 0,137 mmol) se disolvió en NMP (1,5 ml) y luego se añadió THF (0,25 ml). Esta solución se enfrió en un baño de hielo y se añadió f-BuMgCl (1 M/THF, 425,7 pl, 0,426 pmol) de forma gota a gota con agitación vigorosa. El baño de hielo se retiró y la suspensión blanca resultante se agitó a TA durante aproximadamente 15 minutos. Se añadió una solución del compuesto E (0,081 g, 0,192 mmol) en THF (0,5 ml) de forma gota a gota a la reacción a temperatura ambiente. El progreso de la reacción se controló por LC/MS. Cuando la reacción progresó a una conversión del 50%, la reacción se enfrió en un baño de hielo y se inactivó con ácido acético glacial (70 ml). La reacción se concentró y el compuesto 22 se semipurificó del residuo mediante HPLC de fase inversa. El material semipuro se purificó adicionalmente mediante gel de sílice cromatografía en columna (12 g de cartucho de carga seca, columna de 40 g; eluyente: 100% de EtOAc en rampa a 10% de MeOH en EtOAc) para dar el compuesto 22.1H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 57,91 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,88 (brs, 2H), 7,32 (m, 2H), 7,15 (m, 3H), 6,90 (t, J = 4,2 Hz, 1H), 6,84 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,26 (dd, J = 13,4, 6,2 Hz, 1H), 5,87 (cuarto J = 11,2 Hz, 1H), 5,35 (m, 1H), 4,64 (m, 1H), 4,25 (m, 2H), 3,93-4,15 (m, 4H), 3,45 (m, 1H), 1,87 (m, 1H), 1,09-1,16 (m, 3H), 0,70-0,83 (m, 6H). 31P RMN (162 MHz, DMSO-de) 54,59 (s), 4,47 (s). MS m/z = 575,02 [M+H].
Ejemplo 26. (S)-isopropilo 2-(((R)-(((2R. 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolof2.1-f1f1.2.41tr¡az¡na-7-ilo)-5-c¡ano-3.4-d¡h¡drox¡tetrah¡drofurano-2-ilo)metox¡)(fenox¡)fosfor¡lo)am¡no)propanoato (23)
[0183]
Figure imgf000034_0001
[0184] La preparación de (S)-isopropilo 2-(((R)-(((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato se describe a continuación.
Figure imgf000034_0002
[0185] El compuesto 1 (60,0 mg, 206 pmol) se disolvió en NMP (0,28 ml). Se añadió THF (0,2 ml) seguido de cloruro de tertbutilo magnesio (solución 1,0 M en tetrahidrofurano, 0,309 ml) a TA bajo una atmósfera de argón. Después de 20 min, una solución del compuesto F (preparado de acuerdo a Cho, A. et al J. Med. Chem. 2014, 57, 1812-1825., 81 mg, 206 pmol) en THF (0,2 ml) se añadió, y la mezcla resultante se calentó a aproximadamente 50°C. Después de 3 h, la mezcla de reacción se dejó enfriar a TA y se purificó directamente por HPLC preparatoria (columna Phenominex Synergi 4u Hydro-RR 80Á 150 x 30 mm, gradiente de acetonitrilo/agua al 5-100%) para proporcionar el compuesto 23.
1H RMN (400 MHz, CD3OD) 57,86 (s, 1H), 7,34 - 7,26 (m, 2H), 7,21 - 7,12 (m, 3H), 6,91 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 4,92 (sept, J = 6,3 Hz, 1H), 4,80 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,43 - 4,34 (m, 1H), 4,33 - 4,24 (m, 1H), 4,18 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 3,82 (dq, J = 9,7, 7,1 Hz, 2H), 1,27 (dd, J = 7,1, 1,0 Hz, 3H), 1,18 (dd, J = 6,3, 4,8 Hz, 6H). 31P RMN (162 MHz, CD3OD) 5 3,72 (s). LC/MS: tn = 1,39 min, MS m/z = 561,11 [M+H]; Sistema LC: Thermo Accela 1250 UHPLC; Sistema MS: Thermo LCQ Fleet; Columna: Kinetex 2,6 m XB-C18 100A, 50 x 4,6 mm; Disolventes: ACN con ácido acético al 0,1%, agua con ácido acético al 0,1%; Gradiente: 0 min-2,0 min 2-100% ACN, 2,0 min-3,05 min 100% ACN, 3,05 min-3,2 min 100%-2% ACN, 3,2 min-3,5 min 2% ACN a 2 pl/min. HPLC: tn = 2,523 min; Sistema HPLC: serie Agilent 1100.; Columna: Gemini 5 p C1811 üA, 50 x 4,6 mm; Disolventes: ACN con 0,1% de TFA, agua con 0,1% de TFA; Gradiente: 0 min-5,0 min 2-98% ACN, 5,0 min-6,0 min 98% ACN a 2 mL/min.
Ejemplo 27. (2S)-ciclobutilo 2-((((((2R. 3S. 4R. 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f1[1.2.41triaz¡na-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (24)
[0186]
Figure imgf000034_0003
[0187] La preparación de (2S)-ciclobutilo 2-(((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4 -dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato se describe a continuación.
Preparación de (2S)-ciclobutilo 2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (Compuesto G)
[0188]
Figure imgf000035_0001
[0189] Se disolvió diclorofosfato de fenilo (1,49 ml, 10 mmol) en 10 ml de DCM anhidro y se agitó en atmósfera de nitrógeno en un baño de hielo. Se añadió hidrocloruro de éster isobutilo de L-alanina (0,9 g, 5 mmol) en una porción. Luego se añadió gota a gota trietilamina (765 gl, 5,5 mmol). La reacción se agitó durante aproximadamente 1 h. Se añadió más trietilamina (765 gl, 5,5 mmol) gota a gota y la reacción se agitó durante aproximadamente 45 minutos. Se añadió p-nitrofenol (1,25 g, 9 mmol) en una porción y se agitó durante aproximadamente 30 minutos. Se añadió trietilamina (765 gl, 5,5 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 2 h. Luego se añadieron p-nitrofenol adicional (1,25 g, 9 mmol) y trietilamina (765 gl, 5,5 mmol), y la reacción se agitó durante otras 2 h aproximadamente. La reacción de la mezcla fue concentrada a baja presión. El crudo resultante se diluyó con EtOAc y se lavó dos veces con solución acuosa de ácido cítrico al 5%, seguido de solución saturada acuosa de cloruro de sodio. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo en bruto se purificó con columna de gel de sílice (0-20-50% de EtOAc en hexanos) para dar el compuesto G. 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 58,33-8,23 (m, 2H), 7,52 - 7,33 (m, 4H), 7,33 - 7,17 (m, 3H), 4,96 - 4,85 (m, 1H), 4,07 - 3,96 (m, 1H), 2,27 (m, 2H), 2,07 - 1,91 (m, 2H), 1,83 - 1,70 (m, 1H), 1,70 - 1,55 (m, 1H), 1,32 (m, 3H). 31P RMN (162 MHz, CD3OD) 5 -1,36, -1,59. MS m/z = 420,9 [M+H].
Preparación (2S)-ciclobutilo 2-(((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f1[1.2.41triazina-7-ilo)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (Compuesto 24)
[0190]
Figure imgf000035_0002
[0191] El compuesto 1 (58 mg, 0,2 mmol) se mezcló con el compuesto G (101 mg, 0,24 mmol) en 2 ml de DMF anhidro. Se añadió cloruro de magnesio (42 mg, 0,44 mmol) en una porción. La mezcla de reacción se calentó a aproximadamente 50°C. Se añadió DIPEA (87 gl, 0,5 mmol), y la reacción se agitó durante aproximadamente 2 ha aproximadamente 50°C. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc y se lavó con solución acuosa de ácido cítrico al 5% seguido de solución acuosa saturada de cloruro de sodio. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo en bruto se purificó con columna de gel de sílice (0-2-5% MeOH en DCM) para proporcionar el compuesto 24.1H RMN (400 MHz, Metanol-a4) 57,85 (m, 1H), 7,34 - 7,22 (m, 2H), 7,22 - 7,08 (m, 3H), 6,94 - 6,84 (m, 2H), 4,95 - 4,85 (m, 1H), 4,79 (m, 1H), 4,46 - 4,34 (m, 2H), 4,34 - 4,24 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 3,81 (m, 1H), 2,27 (m, 2H), 2,01 (m, 2H), 1,84 - 1,68 (m, 1H), 1,62 (m, 1H), 1,30 - 1,16 (m, 3H). 31P RMN (162 MHz, CD3OD) 53,70, 3,65. MS m/z = 573,0 [M+H].
Ejemplo 28. (2S)-isopropilo 2-((((((2R. 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.4]tr¡azina-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metox0(fenoxi)fosforilo)amino)-3-fenilpropanoato (25)
[0192]
Figure imgf000035_0003
[0193] La preparación de (2S)-isopropilo 2-((((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-3-fenilpropanoato se describe a continuación.
Preparación de (2S)-isopropilo 2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-3-fenilpropanoato (Compuesto H)
[0194]
Figure imgf000036_0001
[0195] Se disolvió diclorofosfato de fenilo (718 pl, 4,8 mmol) en 10 ml de DCM anhidro y se agitó bajo una atmósfera de nitrógeno en un baño de hielo. Se añadió clorhidrato de éster isopropílico de L-fenilalanina (1 g, 4,1 mmol) en una porción. Se añadieron otros 10 ml de DCM anhidro. Se añadió trietilamina (736 pl, 5,3 mmol) gota a gota y la mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 30 minutos. Luego se añadió más trietilamina (736 pl, 5,3 mmol) gota a gota y la mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos. Luego se añadió trietilamina adicional (736 pl, 5,3 mmol) gota a gota y la mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 15 minutos. Luego se añadió p-nitrofenol (600 mg, 4,32 mmol). Luego se retiró el baño de hielo y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante aproximadamente 2 h. Se añadieron más pnitrofenol (50 mg) y trietilamina (736 pl, 5,3 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 1 h.
[0196] La mezcla de reacción se concentró luego a presión reducida, y se diluyó con EtOAc y se lavó dos veces con solución de ácido cítrico acuoso al 5%, seguido con solución saturada de cloruro de sodio acuoso. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. El crudo se purificó con columna de gel de sílice (0-15% EtOAc en hexanos) para dar el compuesto H.1H RMN (400 MHz, CDCh) 58,17 (m, 2H), 7,38 - 7,13 (m, 10H), 7,13 - 7,02 (m, 2H), 4,95 (m, 1H), 4,31 (m, 1H), 3,69 (m, 1H), 3,02 (dd, J = 6,1, 1,8 Hz, 2H), 1,21 - 1,08 (m, 6H) 31P RMN (162 MHz, cdcl3) 5 -2,96, -2,98. MS m/z = 485,0 [M+H].
Preparación de (2S)-isopropilo 2-((((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.41triazina-7-ilo)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-3-fenilpropanoato (Compuesto 25)
[0197]
Figure imgf000036_0002
[0198] El compuesto 1 (58 mg, 0,2 mmol) y el compuesto H (116 mg, 0,24 mmol) se mezclaron y se añadieron 2 ml de DMF anhidro. La mezcla de reacción se agitó bajo una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. Se añadió 1M tBuMgCl en THF (300 pl, 0,3 mmol) gota a gota durante 3 minutos y la mezcla de reacción se agitó luego durante aproximadamente 16 h. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con solución acuosa de ácido cítrico al 5%, solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y luego solución acuosa saturada de cloruro de sodio. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo en bruto se purificó con columna de gel de sílice (0-5% de MeOH en DCM) para dar el compuesto 25.1H RMN (400 MHz, CD3OD) 57,84 (m, 1H), 7,27 - 7,08 (m, 8H), 7,08 - 6,97 (m, 2H), 6,88 (m, 2H), 4,91 - 4,84 (m, 1H), 4,74 (m, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,19 - 4,04 (m, 2H), 4,04 - 3,91 (m, 2H), 2,97 (m, 1H), 2,82 (m, 1H), 1,14 (m, 3H), 1,06 (m, 3H). 31P RMN (162 MHz, CD3OD) 5 3,63, 3,25. MS m/z = 637,0 [M+H].
Ejemplo 29.(s)-metilo 2-(((S)-(((2R. 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.4]tr¡azina-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metox0(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (26)
[0199]
Figure imgf000037_0001
[0200] La preparación de (S)-metilo 2-(((S)-(((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato se describe a continuación.
Figure imgf000037_0002
[0201] El compuesto 1 (100 mg, 0,34 mmol) se disolvió en THF (2 ml) y se enfrió con un baño de agua con hielo. Luego se añadió lentamente 1M t-BuMgCl (0,52 ml, 0,77 mmol) gota a gota. La mezcla resultante se agitó durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se añadió el compuesto I (preparado según el documento WO 2012142085, 219 mg, 0,52 mmol) en THF (2 ml) durante 5 minutos y la mezcla resultante se agitó durante aproximadamente 24 h a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc, se enfrió bajo un baño de hielo-agua, se lavó con solución acuosa de NaHCO3 (2 ml), se lavó con salmuera, se secó con sodio sulfato, y se concentró a vacío. La mezcla resultante se purificó mediante cromatografía en columna de sílice gel (MeOH al 0 a 20% en DCM) y prep-HPLC (acetonitrilo del 10 al 80% en agua) para dar el compuesto 26.1H RMN (400 MHz, CD3OD) 57,86 (s, 1H), 7,29 (dd, J = 8,6, 7,2 Hz, 2H), 7,21 - 7,09 (m, 3H), 6,94 - 6,81 (m, 2H), 4,79 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,38 (ddq, J = 10,8, 5,3, 2,7 Hz, 2H), 4,33 - 4,23 (m, 1H), 4,18 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 3,86 (dq, J = 9,9, 7,1 Hz, 1H), 3,62 (s, 3H), 1,27 (dd, J = 7,2, 1,1 Hz, 3H). MS m/z = 533 (M+1)+.
Ejemplo 30.(s)-neopentil 2-(((S)-(((2R. 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.4]triaz¡na-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-d¡h¡drox¡tetrah¡drofurano-2-ilo)metox¡)(fenox¡)fosfor¡lo)am¡no)propanoato (27)
[0202]
Figure imgf000037_0003
[0203] La preparación de (S)-neopentilo-(((S)-(((2R, 3S, 4R, SR)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato se describe a continuación.
Figure imgf000037_0004
[0204] El compuesto 1 (100 mg, 0,34 mmol) se disolvió en THF (2 ml) y se enfrió en un baño de agua con hielo. Luego se añadió gota a gota lentamente 1M tBuMgCl (0,52 ml, 0,77 mmol). La mezcla resultante se agitó durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se añadió el compuesto J (preparado según WO2012075140, 248 mg, 0,52 mmol) durante aproximadamente 5 min y la mezcla resultante se agitó durante aproximadamente 24 h a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc, se enfrió en un baño de agua con hielo, se trató con NaHCO3 acuoso (2 ml), se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio y se concentró al vacío. La mezcla resultante se purificó por cromatografía en columna de sílice gel (MeOH del 0 al 20% en DCM) y prep-HPLC (acetonitrilo del 10 al 80% en agua) para dar el Compuesto 27.1H RMN (400 MHz, CD3OD) 57,86 (s, 1H), 7,36 - 7,24 (m, 2H), 7,23 - 7,10 (m, 3H), 6,96 - 6,85 (m, 2H), 4,78 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,38 (tdd, J = 10,0, 4,9, 2,5 Hz, 2H), 4,32 -4,24 (m, 1H), 4,17 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 3,91 (dq, J = 9,8, 7,1 Hz, 1H), 3,81 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 3,69 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 1,31 (dd, J = 7,2, 1,1 Hz, 3H), 0,89 (s, 9H). MS m/z = 589 (M+1)+.
Ejemplo 31. (2S)-ciclopentilo 2-((((((2R. 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.4]triaz¡na-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-d¡h¡drox¡tetrah¡drofurano-2-ilo)metox¡)(fenox¡)fosfor¡lo)am¡no)propanoato (28)
[0205]
Figure imgf000038_0001
[0206] La preparación de (2S)-ciclopentilo 2-(((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato se describe a continuación.
Figure imgf000038_0002
[0207] El compuesto 1 (100 mg, 0,34 mmol) se disolvió en THF (2 ml) y se enfrió en un baño de agua con hielo. Luego se añadió gota a gota lentamente 1M tBuMgCl (0,52 ml, 0,77 mmol). La mezcla resultante se agitó durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se añadió el compuesto K (preparado según WO2012075140, 247 mg, 0,52 mmol) en THF (2 ml) durante aproximadamente 5 minutos y la mezcla resultante se agitó durante aproximadamente 24 h a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc, se enfrió bajo agua con hielo, se trató con solución acuosa de NaHCO3 (2 ml), se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio y se concentró a vacío. La mezcla resultante se purificó mediante cromatografía en columna de sílice gel (MeOH del 0 al 20% en DCM) y prepHPLC (acetonitrilo del 10 al 80% en agua) para dar el Ejemplo 28.1H RMN (400 MHz, CD3OD) 57,85 (s, 1H), 7,33 - 7,22 (m, 2H), 7,14 (tdd, J = 7,6, 2,1, 1,1 Hz, 3H), 6,95 - 6,87 (m, 2H), 5,13 - 5,00 (m, 1H), 4,78 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,48 - 4,35 (m, 2H), 4,30 (ddd, J = 10,6, 5,7, 3,6 Hz, 1H), 4,19 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 3,78 (dq, J = 9,2, 7,1 Hz, 1H), 1,81 (dtd, J = 12,5, 5,9, 2,4 Hz, 2H), 1,74 - 1,49 (m, 6H), 1,21 (dd, J = 7,1, 1,2 Hz, 3H). MS m/z = 587 (M+1)+.
Ejemplo 32. (2S)-ciclohexil 2-((((((2R. 3S. 4R. 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.4]tr¡azina-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (29)
[0208]
Figure imgf000038_0003
Figure imgf000039_0001
[0209] A una mezcla del compuesto 1 (50 mg, 0,343 mmol), compuesto M (Preparado de acuerdo con US20130143835, 93 mg, 0,209 mmol), y MgCl2 (24,5 mg, 0,257 mmol) en DMF (1 ml) se añadió diisopropiletilamina (0,075 ml, 0,43 mmol) gota a gota durante aproximadamente 5 min a aproximadamente 0°C. La mezcla resultante se agitó a aproximadamente 50°C durante aproximadamente 1 h. La mezcla de reacción se enfrió luego con un baño de agua con hielo, se trató con ácido cítrico 1 M (0,5 ml) y se purificó directamente por HPLC prep. (ACN 0 a 70% en agua) para proporcionar el compuesto 29. 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 57,84 (s, 1H), 7,32 - 7,23 (m, 2H), 7,18 - 7,10 (m, 3H), 6,93 - 6,87 (m, 2H), 4,78 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,67 (td, J = 8,7, 4,2 Hz, 1H), 4,48 - 4,35 (m, 2H), 4,30 (ddd, J = 10,8, 5,7, 3,7 Hz, 1H), 4,20 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 3,88 - 3,71 (m, 1H), 1,83 - 1,63 (m, 4H), 1,58 - 1,46 (m, 1H), 1,46 - 1,24 (m, 5H), 1,24 (s, 3H). 31P RMN (162 MHz, CD3OD) 53,75. MS m/z = 601 (M+1)+.
E em lo 33. Etilo 2- 2R. 3S 4R 5R -5- 4-am no rrolo[2.1-f][1.2.4]tr¡azina-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-
Figure imgf000039_0005
propanoato (30)
[0210]
Figure imgf000039_0002
[0211] La preparación de etilo 2-((((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-2-metilpropanoato se describe a continuación.
Preparación de etilo 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-metilpropanoato
[0212]
Figure imgf000039_0003
[0213] Tomar trifenilfosfina (6,18 g, 25,00 mmol) en THF (30 ml). A continuación, cargue DIAD (4,92 ml, 25,00 mmol) y agite a temperatura ambiente durante 10 min. Disolver el 2-((terc-butoxicarbonil)amino)-2-ácido metilpropanoico (5,08 g, 25,00 mmol) en THF (20 ml) y agregar a la mezcla de reacción seguido de la adición de etanol (2,19 ml, 37,49 mmol). Permita que la reacción se agite a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h. Los disolventes se retiraron a presión reducida y el producto bruto se recogió en 1:1 Et2O: hexanos (120 ml). El óxido de trifenilfosfina sólido se separó por filtración y el disolvente se eliminó a presión reducida. El producto bruto se recogió en CH2Cl2 mínimo y se purificó por cromatografía en gel de sílice EtOAc al 0-50%/Hex para proporcionar 2-((tercbutoxicarbonilo)amino)-2-metilpropanoato de etilo. 1H RMN (400 MHz, cloroformo d) 54,18 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 1,49 (s, 6H), 1,43 (s, 9H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H).
Preparación de clorhidrato de 2-amino-2-metilpropanoato de etilo
[0214]
Figure imgf000039_0004
[0215] Tomar etilo 2-((terc-butoxicarbonilo)amino)-2-metilpropanoato (2,71 g, 11,72 mmol) en CH2CI2 (25 ml) y lentamente agregue 4N HCl en dioxano (25 mmol) y agite a temperatura ambiente. A las 1 h, se determinó que la reacción se completaba por TLC. Los disolventes se retiraron a presión reducida y el crudo se coevaporó con Et2O dos veces y luego se colocó bajo alto vacío para proporcionar acetato de hidrocloruro de 2-amino-2-metilpropanoato.
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 58,70 (s, 3H), 4,18 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 1,46 (s, 6H), 1,21 (t, J = 7,1 Hz, 3H).
Preparación de etilo 2-metilo-2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (Compuesto N)
[0216]
Figure imgf000040_0001
[0217] Tomar diclorofosfato de fenilo (0,97 mL, 6,50 mmol) y etilo 2-amino-2-metilpropanoato clorhidrato (1,09 g, 6,50 mmol) en CH2Cl2 (50 ml). Enfriar la mezcla de reacción a aproximadamente 0°C y agregar lentamente TEA (1,75 mL, 12,45 mmol). Retire el baño frío y permita que la mezcla de reacción se agite a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 2 h, se determinó que la adición del aminoácido estaba completa por 31P RMN. Cargue p-nitrofenol (0,860 g, 6,17 mmol) seguido de la adición de TEA (0,87 g, 7,69 mmol). Permita que la reacción se agite a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 2 h, se determinó que la reacción se completaba por LCMS. La reacción se diluyó con Et2O y la TEA • sales de HCl se separaron por filtración. El crudo se concentró y se purificó por cromatografía en gel de sílice (0-50% EtOAc/Hex) para dar el compuesto N.1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 58,37-8,21 (m, 2H), 7,55 - 7,44 (m, 2H), 7,43 - 7,33 (m, 2H), 7,30 - 7,09 (m, 3H), 6,57 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 3,99 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 1,39 (s, 6H), 1,08 (t, J = 7,1 Hz, 3H).31P RMN (162 MHz, DMSO-ds) 5 -2,87. LC/MS: tn = 1,65 min, MS m/z = 408,97 [M+1].; Sistema LC: Thermo Accela 1250 UHPLC; Sistema MS: Thermo lCq Fleet; Columna: Kinetex 2,6 m XB-C18 100A, 50 x 3,00 mm; Disolventes: acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1%, agua con ácido fórmico al 0,1% ; Gradiente: 0 min-2,4 min 2-100% ACN, 2,4 min-2,80 min 100% ACN, 2,8 min-2,85 min 100% -2% ACN, 2,85 min-3,0 min 2% ACN a 1,8mL/min.
Preparación de etilo 2-((((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.41triazina-7-ilo)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-2-metilpropanoato (Compuesto 30)
[0218]
Figure imgf000040_0002
[0219] Tome el compuesto 1 (66 mg, 0,23 mmol) en NMP (2,0 mL). Enfríe la mezcla a aproximadamente 0°C y agregue lentamente tBuMgCl (1,0M en THF, 0,34 mL, 0,34 mmol). Permita que la reacción se agite a aproximadamente 0°C durante aproximadamente 30 minutos, luego agregue una solución de compuesto N (139 mg, 0,34 mmol) disuelto en THF (1,0 mL). Retire el baño frío y coloque la reacción en un baño de aceite precalentado a aproximadamente 50°C. Después de aproximadamente 2 h, la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se inactivó con ácido acético y metanol. El producto bruto se concentró y se purificó por HPLC de fase inversa sin modificador para proporcionar el compuesto 30.1H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 57,89 (m, 3H), 7,31 (q, J = 8,1 Hz, 2H), 7,22 - 7,05 (m, 3H), 6,87 (d, J = 4,5, 1H), 6,80 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 6,27 (d, J = 11,7, 1H), 5,81 (d, J = 9,7, 1H), 5,35 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,64 (dt, J = 9,0, 5,6 Hz, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,11 (m, 1H), 4,04 -3,90 (m, 3H), 1,39 - 1,23 (m, 6H), 1,10 (t, J = 7,1, 3H). 31P RMN (162 MHz, DMSO-de) 52,45, 2,41. LC/MS: tn = 1,03 min, MS m/z = 561,03 [M+1]; Sistema LC: Thermo Accela 1250 UHPLC; Sistema m S: Thermo LCQ Fleet; Columna: Kinetex 2,6 m XB-C18 100A, 50 x 3,00 mm; Disolventes: acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1%, agua con ácido fórmico al 0,1%; Gradiente: 0 min-2,4 min 2-100% ACN, 2,4 min-2,80 min 100% ACN, 2,8 min-2,85 min 100% -2% ACN, 2,85 min-3,0 min 2% ACN a 1,8mL/min.
Ejemplo 34. Isopropilo 2-((((((2R. 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.4]tr¡azina-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-2-metilpropanoato (31)
[0220]
Figure imgf000041_0001
[0221] La preparación de Isopropilo 2-((((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano A continuación se describe-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-2-metilpropanoato.
Preparación de isopropilo 2-((terc-butoxicarbonilo)amino)-2-metilpropanoato
[0222]
Figure imgf000041_0002
[0223] Tomar trifenilfosfina (6,17 g, 25,00 mmol) en THF (30 ml). A continuación, cargue DIAD (4,92 ml, 25,00 mmol) y agite a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Disuelva el 2-((terc-butoxicarbonilo)amino)-2-ácido metilpropanoico (5,07 g, 25,00 mmol) disuelto en THF (20 ml) y agregar a la mezcla de reacción seguido de la adición de isopropanol (1,91 mL, 25,00 mmol). Permita que la reacción se agite a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h. Los disolventes se eliminaron bajo presión reducida y el producto bruto se recogió en 1:1 Et2O: hexanos (120 ml). El óxido de trifenilfosfina sólido se separó por filtración y el disolvente se eliminó a presión reducida. El producto bruto se recogió en CH2Cl2 mínimo y se purificó por cromatografía en gel de sílice (0-50% EtOAc/Hex) para proporcionar isopropilo 2-((terc-butoxicarbonilo)amino)-2-metilpropanoato. 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 5 5,03 (p, J = 6,2 Hz, 1H), 1,48 (s, 6H), 1,40 (d, J = 6,2 Hz, 9H), 1,24 (d, J = 6,3 Hz, 6H).
Preparación de isopropilo 2-amino-2-metilpropanoato clorhidrato
[0224]
Figure imgf000041_0003
[0225] Tomar isopropilo 2-((terc-butoxicarbonilo)amino)-2-metilpropanoato (4,09 g, 16,67 mmol) en CH2Cl2 (50 ml) y lentamente agregue 4N HCl en dioxano (50 mmol) y agite a temperatura ambiente. Aproximadamente 1 h, se determinó que la reacción se completaba por TLC. Los disolventes se retiraron a presión reducida y el crudo se coevaporó con Et2O dos veces y luego se colocó bajo alto vacío para proporcionar clorhidrato de isopropilo 2-amino-2-metilpropanoato. 1H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 58,61 (s, 3H), 4,96 (p, J = 6,2 Hz, 1H), 1,44 (s, 6H), 1,22 (d, J = 6,2 Hz, 6H).
Preparación de isopropilo 2-metilo-2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (Compuesto O)
[0226]
Figure imgf000041_0004
[0227] Tomar diclorofosfato de fenilo (0,83 ml, 5,58 mmol) e isopropilo 2-amino-2-metilpropanoato clorhidrato (1,01 g, 5,58 mmol) en CH2CL (50 ml). Enfriar la mezcla de reacción a 0°C y agregar lentamente TEA (1,61 ml, 11,45 mmol).
Retire el baño frío y permita que la mezcla de reacción se agite a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 2 h, se determinó que la adición del aminoácido estaba completa por 31P RMN. Cargar p-nitrofenol (0,74 g, 5,30 mmol) seguido de la adición de TEA (0,81, 5,84 mmol). Permita que la reacción se agite a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 2 h, se determinó que la reacción se completaba por LCMS. La reacción se diluyó con Et2O y la TEA • sales de HCl se separaron por filtración. El crudo se concentró y se purificó por cromatografía en gel de sílice (0-50% EtOAc/Hex) para dar el compuesto O . 1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 8,42 - 8,19 (m, 2H), 7,55 - 7,43 (m, 2H), 7,39 (dd, J = 8,6, 7,2 Hz, 2H), 7,30 - 7,12 (m, 3H), 6,53 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 4,82 (hept, J = 6,3 Hz, 1H), 1,38 (s, 6H), 1,09 (d, J = 6,3, 6H). 31P RMN (162 MHz, DMSO-ds) 5 -2,84. LC/MS: tR = 1,73 min, MS m/z = 422,92 [M+1]; Sistema lC: Thermo Accela 1250 UHPLC; Sistema MS: Thermo LCQ Fleet; Columna: Kinetex 2,6 m XB-C18 100A, 50 x 3,00 mm; Disolventes: acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1%, agua con ácido fórmico al 0,1%; Gradiente: 0 min-2,4 min 2-100% ACN, 2,4 min-2,80 min 100% ACN, 2,8 min-2,85 min 100% -2% ACN, 2,85 min-3,0 min 2% ACN a 1,8mL/min.
Preparación de isopropilo 2-((((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.41triazina-7-ilo)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)-2-metilpropanoato (Compuesto 31)
[0228]
Figure imgf000042_0001
[0229] Tomar el compuesto 1 (66 mg, 0,23 mmol) en NMP (2,0 mL). Enfríe la mezcla a aproximadamente 0°C y agregue lentamente tBuMgCl (1,0M en THF, 0,57 mL, 0,57 mmol). Permita que la reacción se agite a aproximadamente 0°C durante aproximadamente 30 minutos, luego agregue una solución de compuesto O (143 mg, 0,34 mmol) disuelto en THF (1,0 mL). Retire el baño frío y coloque la reacción en un baño de aceite precalentado a aproximadamente 50°C. Después de aproximadamente 2 h, la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se inactivó con ácido acético y metanol. El producto bruto se concentró y se purificó por HPLC de fase inversa sin modificador para proporcionar compuesto 31.1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 57,88 (m, 3H), 7,30 (td, J = 8,5, 7,0 Hz, 2H), 7,20 - 7,04 (m, 3H), 6,87 (d, J = 4,5, 1H), 6,80 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 6,27 (d, 6,1 Hz, 1H), 5,75 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 5,34 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,81 (p, J = 6,3 Hz, 1H), 4,71 - 4,50 (m, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,11 (m, 1H), 4,03 -3,83 (m, 1H), 1,37 - 1,23 (m, 6H), 1,18 - 1,04 (m, 6H). 31P RMN (162 MHz, DMSO) 5 2,47, 2,43. LC/MS: tR = 1,08 min, MS m/z = 575,06 [M+1]; Sistema LC: Thermo Accela 1250 UHPLC; Sistema MS: Thermo LCQ Fleet; Columna: Kinetex 2,6 m XB-C18 100A, 50 x 3,00 mm; Disolventes: acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1%, agua con ácido fórmico al 0,1%; Gradiente: 0 min-2,4 min 2-100% ACN, 2,4 min-2,80 min 100% ACN, 2,8 min-2,85 min 100% -2% ACN, 2,85 min-3,0 min 2% ACN a 1,8mL/min.
Ejemplo 35. (S)-2-et¡lbut¡lo 2-(((S)-(((2R. 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.4]tr¡az¡na-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-d¡h¡drox¡tetrah¡drofurano-2-¡lo)metox¡)(fenox¡)fosfor¡lo)am¡no)propanoato (32)
[0230]
Figure imgf000042_0002
[0231] La preparación de (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato se describe a continuación.
Preparación de (3R, 4R, 5R)-3.4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)dihidrofurano-2(3H)-ona.
[0232]
Figure imgf000043_0001
[0233] (3R, 4R, 5R)-3,4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol (15,0 g) se combinó con MTBE (60,0 ml), KBr (424,5 mg), solución acuosa de K2HPO4 (2,5 M, 14,3 ml) y TEMPO (56 mg). Esta mezcla se enfrió a aproximadamente 1°C. La solución acuosa de blanqueador (7,9% en peso) se cargó lentamente en porciones hasta el consumo completo del material de partida como se indica mediante una prueba de almidón/yoduro. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con MTBE. La fase orgánica combinada se secó sobre MgSO4 y se concentró bajo presión reducida para producir el producto como un sólido.
Preparación (4-amino-7-vodopirrolo[2.1-f1M.2.41triazina)
[0234]
Figure imgf000043_0002
[0235] A una solución fría de 4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]-triazina (10,03 g; 74,8 mmol) en N,N-dimetilformamida (70,27 g), N-yodosuccinimida (17,01 g; 75,6 mmol) se cargó en porciones, mientras se mantenía el contenido a aproximadamente 0°C. Una vez completada la reacción (aproximadamente 3 h a aproximadamente 0°C), la mezcla de reacción se transfirió a una solución acuosa de hidróxido de sodio 1 M (11 g de NaOH y 276 ml de agua) mientras se mantenía el contenido a aproximadamente 20-30°C. La suspensión resultante se agitó a aproximadamente 22°C durante 1,5 h y luego se filtró. Los sólidos se enjuagan con agua (50 ml) y se secan a aproximadamente 50°C al vacío para producir 4-amino-7-yodopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina como un sólido. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 57,90 (s, 1H), 7,78 (br s, 2H), 6,98 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 4,4 Hz, 1H). 13C RMN (101 MHz, DMSO-d6) 5155,7, 149,1, 118,8, 118,1, 104,4, 71,9. MS m/z = 260,97 [M+H].
Preparación________ (3R,________ 4R________ 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f1[1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-bis(benciloxi)-5-((benciloxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol vía (4-amino-7-vodopirrolo[2.1-f1[1.2.41triazina)
[0236]
Figure imgf000043_0003
[0237] A un reactor bajo una atmósfera de nitrógeno se le cargó yodobase 2 (81 g) y THF (1,6 L). La solución resultante se enfrió a aproximadamente 5°C y se cargó TMSCl (68 g). Luego se cargó lentamente PhMgCl (345 ml, 1,8 M en THF) mientras se mantenía una temperatura interna de aproximadamente < 5°C. La mezcla de reacción se agitó a aproximadamente 0°C durante 30 minutos, y luego se enfrió a aproximadamente -15°C. /'PrMgCl- LiCl (311 ml, 1,1 M en THF) se cargó lentamente mientras se mantiene una temperatura interna por debajo de aproximadamente -12°C. Después de aproximadamente 10 minutos de agitación a aproximadamente -15°C, la mezcla de reacción se enfrió a aproximadamente -20°C, y se cargó una solución de lactona 1 (130 g) en THF (400 ml). La mezcla de reacción se agitó luego a aproximadamente -20°C durante aproximadamente 1 h y se inactivó con AcOH (57 ml). La mezcla de reacción se calentó a aproximadamente 0°C y se ajustó a pH 7-8 con solución acuosa de NaHCO3 (5% en peso, 1300 ml). La mezcla de reacción se diluyó luego con EtOAc (1300 ml), y las capas orgánica y acuosa se separaron. La capa orgánica se lavó con 1N HCl (1300 ml), NaHCO3 acuoso (5% en peso, 1300 ml), y salmuera (1300 mL), y después se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a sequedad. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice usando un gradiente que consiste en una mezcla de MeOH y EtOAc proporcionó el producto.
Preparación ((2S)-2-etilbutilo 2-(((perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato) (mezcla de Sp y Rp):
[0238]
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000044_0004
[0239] L-Alanina 2-etilbutilo éster hidrocloruro (5,0 g, 23,84 mmol) se combinaron con cloruro de metileno (40 ml), se enfriaron a aproximadamente -78°C y se añadió diclorofosfato de fenilo (3,65 ml, 23,84 mmol). Se añadió trietilamina (6,6 ml, 47,68 mmol) durante aproximadamente 60 minutos a aproximadamente -78°C y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La mezcla de reacción se enfrió a aproximadamente 0°C y se añadió pentafluorofenol (4,4 g, 23,84 mmol). Se añadió trietilamina (3,3 ml, 23,84 mmol) durante aproximadamente 60 minutos. La mezcla se agitó durante aproximadamente 3 h a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en EtOAc, se lavó con una solución acuosa de carbonato de sodio varias veces y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando un gradiente de EtOAc y hexanos (0 a 30%). Las fracciones que contenían el producto se concentraron a presión reducida para dar (2S)-2-etilbutilo 2-((((perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato como un sólido. 1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 5 7,41 - 7,32 (m, 4H), 7,30 - 7,17 (m, 6H), 4,24 - 4,16 (m, 1H), 4,13 - 4,03 (m, 4H), 4,01 -3,89 (m, 1H), 1,59 - 1,42 (m, 8H), 1,40 - 1,31 (m, 8H), 0,88 (t, J = 7,5 Hz, 12H). 31P RMN (162 MHz, cloroformo-d) 5 -1,52. 19F RMN (377 MHz, cloroformo-d) 5 -153,63, -153,93 (m), -160,05 (td, J = 21,9, 3,6 Hz), -162,65 (qd, J = 22,4, 20,5, 4,5 Hz). MS m/z = 496 [M+H].
Preparación ((2S)-2-etilbutilo 2-(((perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato):
[0240]
Figure imgf000044_0002
[0241] Se disolvió clorhidrato de L-alanina-2-etilbutilester (40,10 g, 0,191 mmol) en diclorometano (533 g) y la solución se enfrió con agitación a aproximadamente -15°C en atmósfera de N2 (g). Se añadió diclorofosfato de fenilo (40,32 g, 0,191 mol) seguido de la adición lenta de trietilamina (41,58 g, 0,411 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a aproximadamente -15°C durante aproximadamente 1,5 h. Se añadió pentafluorofenol (35,14 g, 0,191 mol), seguido de trietilamina (19,23 g, 0,190 mol) y la mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 2 h. La mezcla de reacción se calentó a aproximadamente 0°C y se añadió 0,5 M HCl (279,19 g). La mezcla se calentó a aproximadamente 22°C y la capa orgánica se separó y se lavó con solución acuosa de KHCO3 al 5% (281 g), después agua (281 g). Una parte alícuota de la capa orgánica (453,10 g de la solución de 604,30 g) se concentró hasta aproximadamente 120 ml de volumen, se añadió acetato de isopropilo (157 g) y la solución se concentró hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetato de isopropilo (158 g). La solución resultante se concentró a aproximadamente 120 ml de volumen y la temperatura se ajustó a aproximadamente 45°C. Se añadió n-heptano (165 g) y la mezcla se enfrió a 22°C durante aproximadamente 1 h. Se añadió n-heptano (167 g) y la mezcla se enfrió a aproximadamente 0°C. Se añadió trietilamina (2,90 g, 0,0287 mol) y la mezcla se agitó a 0°C durante aproximadamente 17 h. La mezcla se filtró, los sólidos se enjuagaron con n-heptano (145 g) y los sólidos se secaron al vacío a aproximadamente 40°C durante aproximadamente 15 h para proporcionar 2-etilbutilo ((S)-(pentafluorofenoxi)(fenoxi)fosforilo)-L-alaninato.
Preparación 2-etilbutilo ((S)-(4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforilo)-L-alaninato:
[0242]
Figure imgf000044_0003
[0243] Una suspensión de clorhidrato de L-alanina-2-etilbutilester (20,08 g, 95,8 mmol) e isopropilo el acetato (174 g) se enfrió con agitación a aproximadamente -20°C). Se añadió diclorofosfato de fenilo (20,37 g, 96,5 mmol), seguido de la adición lenta de trietilamina (20,97 g, 207,2 mmol) y la mezcla se agitó a aproximadamente -20°C durante aproximadamente 1 h. Se añadió 4-nitrofenol (13,23 g, 95,1 mmol), seguido de la adición lenta de trietilamina (10,01 g, 98,8 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 1,5 h. La mezcla de reacción se calentó a aproximadamente 0°C y se añadió 0,5 M HCl (140 g). La capa orgánica se separó y se lavó con Na2CO3 al 5% (2 x 100 g) y 10% de NaCl (2 x 100 g). La capa orgánica se concentró luego a un volumen de aproximadamente 80 ml y se añadió acetato de isopropilo (4 g), seguido de n-heptano (110 g). Se añadieron cristales de semillas del producto (0,100 g) seguido de una segunda porción de n-heptano (110 g) y la mezcla se enfrió a aproximadamente 0°C. Se añadió 1,8-diazabicicloundec-7-eno (1,49 g, 9,79 mmol) y la mezcla se agitó a aproximadamente 0°C durante aproximadamente 21 h. Los sólidos resultantes se filtraron y se lavaron primero con n-heptano (61 g) y después con H2O (2 x 100 g). Los sólidos se agitaron con H2O (200 g) durante aproximadamente 1,5 h, se filtraron y se aclararon con H2O (3 x 100 g), a continuación, n-heptano (61 g). Los sólidos obtenidos se secaron al vacío a aproximadamente 40°C durante aproximadamente 19 h para proporcionar 2-etilbutilo ((S)-(4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforilo)-L-alaninato.
Preparación del compuesto del título (mezcla de Sp y Rp):
[0244]
Figure imgf000045_0001
[0245] El nucleósido (29 mg, 0,1 mmol) y la fosfonamida (60 mg, 0,12 mmol) y N,N-dimetilformamida (2 ml) se combinaron a temperatura ambiente. Se añadió lentamente cloruro de terc-butilmagnesio (1 M en THF, 0,15 ml). Después de aproximadamente 1 h, la reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con solución de ácido cítrico acuoso (5% en peso), la solución acuosa saturada de NaHCO3 y solución saturada de salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando un gradiente de metanol y CH2Cl2 (0 a 5%). Las fracciones que contenían el producto se concentraron a presión reducida para proporcionar el producto.
Preparación de (3aR, 4R, 6R, 6aR)-4-(4-aminopirrolo[2.1-f1[1.2.41triazina-7-ilo)-6-(hidroximetilo)-2.2-dimetiltetrahidrofuro[3.4-d1[1.31dioxol-4-carbonitrilo:
[0246]
Figure imgf000045_0002
[0247] A una mezcla de (2R, 3R, 4S, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo (5,8 g, 0,02 mol), 2,2-dimetoxipropano (11,59 ml, 0,09 mol) y acetona (145 ml) a temperatura ambiente se añadió ácido sulfúrico (18 M, 1,44 ml). La mezcla se calentó a aproximadamente 45°C. Después de aproximadamente 30 minutos, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se añadieron bicarbonato de sodio (5,8 g) y agua 5,8 ml). Después de 15 minutos, la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se recogió en acetato de etilo (150 ml) y agua (50 ml). La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 50 ml). La fase orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida para dar (2R, 3R, 4S, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo crudo. 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 57,84 (s, 1H), 6,93 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 5,40 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 5,00 (dd, J = 6,7, 3,3 Hz, 1H), 4,48 - 4,40 (m, 1H), 3,81 -3,72 (m, 2H), 1,71 (s, 3H), 1,40 (s, 3H). MS m/z = 332,23 [M+1].
Preparación de (3aR, 4R, 6R, 6aR)-4-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.41triazina-7-ilo)-6-(hidroximetilo)-2,2-dimetiltetrahidrofuro[3.4-d1[1.31dioxol-4-carbonitrilo. sal de TsOH:
[0248]
Figure imgf000046_0001
[0249] A una mezcla de (2R, 3R, 4S, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo (5,0 g, 17,2 mmol, 1,0 equiv.), 2,2-dimetoxipropano (10,5 ml, 86 mmol, 5,0 equiv.) y acetona (25 ml) a temperatura ambiente se añadió ácido p-tolilsulfónico (3,59 g, 1,1 equiv.). La mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 30 minutos, se añadió acetato de isopropilo (25 ml) durante aproximadamente una hora. La suspensión resultante se filtró y se enjuagó con heptano:acetato de isopropilo 2:1 (25 ml). El producto se secó al vacío a aproximadamente 40°C.
Preparación de (3aR, 4R, 6R, 6aR)-4-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.41triazina-7-ilo)-6-(hidroximetilo)-2.2-dimetiltetrahidrofuro[3.4-d][1.31dioxol-4-carbonitrilo:
[0250]
Figure imgf000046_0002
[0251] A una mezcla de (2R, 3R, 4S, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo (5 g, 17,2 mmol, 1,0 equiv.), 2,2-dimetoxipropano (10,5 mL, 86 mmol, 5,0 equiv.) y acetona (25 mL) a temperatura ambiente se añadió ácido p-tolilsulfónico (3,59 g, 1,1 equiv.). La mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, se añadió acetato de isopropilo (25 ml) durante una hora. La suspensión resultante se filtró y se enjuagó con heptano:acetato de isopropilo 2:1 (25 ml). El producto se secó al vacío a 40°C. El aislado sólido se añadió a un reactor y K2CO3 al 5% se añadieron una solución (50 ml) y acetato de etilo (50 ml). Las capas se separaron y la capa acuosa se lavó con acetato de etilo (25 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (25 ml), luego se concentraron hasta aproximadamente 25 ml. El reactor se rellenó con acetato de isopropilo (25 ml) y se concentró hasta aprox. 25 ml. El reactor se rellenó nuevamente con acetato de isopropilo (25 ml) y se concentró hasta 25 ml. La solución resultante se sembró, produciendo una suspensión espesa. A esto se le añadió heptano (25 ml) durante una hora. La suspensión resultante se filtró y se enjuagó con heptano:acetato de isopropilo 2:1 (25 ml). El producto se secó al vacío a 40°C. () (2R, 3R, 4S, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo. 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 57,84 (s, 1H), 6,93 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 5,40 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 5,00 (dd, J = 6,7, 3,3 Hz, 1H), 4,48 - 4,40 (m, 1H), 3,81 -3,72 (m, 2H), 1,71 (s, 3H), 1,40 (s, 3H). MS m/z = 332,23 [M+1].
Preparación de (2S)-2-etilbutilo 2-((((((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato:
[0252]
Figure imgf000046_0003
[0253] Acetonitrilo (100 ml) se combinó con (2S)-2-etilbutilo 2-(((4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforilo)-amino)propanoato (9,6 g, 21,31 mmol), el alcohol de sustrato (6,6 g, 0,02 mol),), cloruro de magnesio ((1,9 g, 19,91 mmol) a temperatura ambiente La mezcla se agitó durante aproximadamente 15 minutos y se añadió W,W-diisopropiletilamina (8,67 ml, 49,78 mmol). Después de aproximadamente 4 h, la reacción se diluyó con acetato de etilo (100 ml), se enfrió a aproximadamente 0°C y se combinó con solución acuosa de ácido cítrico (5% en peso, 100 ml). La fase orgánica se lavó con solución acuosa de ácido cítrico (5% en peso, 100 ml) y solución acuosa saturada de cloruro de amonio (40 ml), solución acuosa de carbonato de potasio (10 % en peso, 2 x 100 ml) y solución acuosa saturada de salmuera (100 ml). La fase orgánica se secó con sulfato de sodio a se concentró bajo presión reducida para proporcionar producto crudo. 1H RMN (400 MHz, CD3OD) 57,86 (s, 1H), 7,31 - 7,22 (m, 2H), 7,17 - 7,09 (m, 3H), 6,93 - 6,84 (m, 2H), 5,34 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 4,98 (dd, J = 6,6, 3,5 Hz, 1H), 4,59 - 4,50 (m, 1H), 4,36 - 4,22 (m, 2H), 4,02 (dd, J = 10,9, 5,7 Hz, 1H), 3,91 (dd, J = 10,9, 5,7 Hz, 1H), 3,83 (dq, J = 9,7, 7,1 Hz, 1H), 1,70 (s, 3H), 1,50 - 1,41 (m, 1H), 1,39 (s, 3H), 1,36 - 1,21 (m, 7H), 0,86 (t, J = 7,4 Hz, 6H). MS m/z = 643,21 [M+1].
Preparación de (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.-f1[1.2.41triazina-7-ilo)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (Compuesto 32)
[0254]
Figure imgf000047_0001
[0255] El acetónido bruto (12,85 g) se combinó con tetrahidrofurano (50 ml) y se concentró bajo presión reducida. El residuo se recogió en tetrahidrofurano (100 ml), se enfrió a aproximadamente 0°C y se añadió lentamente HCl concentrado (20 ml). La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente. Después del consumo del acetónido de partida como se indica por análisis de HPLC, se añadió agua (100 ml) seguido de solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (200 ml). La mezcla se extrajo con acetato de etilo (100 ml), la fase orgánica se lavó con solución acuosa saturada de salmuera (50 ml), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando un gradiente de metanol y acetato de etilo (0 a 20%). Las fracciones que contenían el producto se concentraron a presión reducida para proporcionar el producto.
Preparación de (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (Compuesto 32)
[0256]
Figure imgf000047_0002
[0257] A un vial que contiene (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(((3aR, 4R, 6R, 6aR)-6-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-6-ciano-2,2-dimetiltetrahidrofuro[3.4-d][1,3]dioxol-4-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (30 mg, 0,05 mmol) se añadió una solución de ácido fórmico acuoso al 80% (1,5 ml). Después de 18 h a aproximadamente 20°C, se confirmó la conversión completa por HPLC y LC-MS. MS (m/z) = 603 (M+1)+.
Preparación de (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (Compuesto 32) mediante acoplamiento directo
[0258]
Figure imgf000048_0001
[0259] A una mezcla de (2R, 3R, 4S, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo (0,5 g, 2 mmol), (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato de metilo (0,9 g, 2 mmol), y MgCl2 (0,2 g, 2 mmol), se cargó N,N-dimetilacetamida (10 ml). La mezcla resultante se calentó a aproximadamente 30°C con agitación constante. Luego se añadió lentamente N,N-diisopropiletilamina (0,7 mL, 4 mmol), y la mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 6 h. Agua (10 ml) se cargó H2O, seguido de 2-MeTHF (10 ml), y se separaron las fases orgánica y acuosa. La capa acuosa se extrajo nuevamente con 2-MeTHF (10 ml). Las capas orgánicas se combinaron, y se lavaron con 10% en peso de solución de ácido cítrico (10 ml), seguido de 10% en peso de solución K2CO3 (10 ml) y H2O (10 ml). Se añadió una pequeña cantidad de salmuera para resolver las emulsiones en el lavado con agua antes de separar las capas. La capa orgánica se evaporó a sequedad para proporcionar 0,65 g de una espuma. /'PrOAc (2,6 ml) se añadió después se añadió, y la mezcla se calentó a aproximadamente 40°C para lograr la disolución. La solución se enfrió a aproximadamente 20°C y la mezcla se agitó durante aproximadamente 3 días. Los sólidos se aislaron por filtración y la torta del filtro se lavó con una pequeña cantidad de /PrOAc. Los sólidos se secaron para proporcionar (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato.
Figure imgf000048_0002
[0260] A una mezcla de (2R, 3R, 4S, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo (0,2 g, 0,7 mmol), (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (0,3 g, 0,7 mmol), y MgCl2 (0,1 g, 1 mmol), se cargó N,N-dimetilacetamida (4 mL). La mezcla resultante se calentó a aproximadamente 30°C con agitación constante. Luego se añadió lentamente N,N-diisopropiletilamina (0,3 ml, 2 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 5 h. La conversión al producto se confirmó mediante análisis UPLC.
Preparación de (3R, 4R, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f1[1.2.41triazina-7-ilo)-3.4-bis((tertbutildimetilsililo)oxi)-5-(((tercbutildimetilsililo)oxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol
[0261]
Figure imgf000048_0003
[0262] Una solución de 7-yodopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-4-amina (13,9 g, 53,5 mmol) se preparó en THF (280 ml). La solución se enfrió a aproximadamente 0°C y se añadió TMSCl (13,6 ml, 107 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 20 minutos, y luego se añadió PhMgCl (2 M en THF; 53,5 ml, 56,8 mmol) mientras se mantenía una temperatura interna por debajo de aproximadamente 5°C. La mezcla de reacción se agitó a aproximadamente 0°C durante aproximadamente 30 minutos, y luego se enfrió a aproximadamente -20°C. Después, se añadió /PrMgCl-LiCl (1,3 M en THF, 43,1 ml, 56 mmol) mientras se mantenía una temperatura interna por debajo de aproximadamente -15°C. La mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente -20°C.
[0263] En un matraz separado, una solución de (3R, 4R, 5R)-3,4-bis((terc-butildimetilsililo)oxi)-5-((((tercbutildimetilsililo)oxi)metilo)dihidrofurano-2(3H)-ona (25,0 g, 50,9 mmol, 0,83 equiv.) se preparó en LaCl3-2LiCl (0,6 M en THF, 85 ml, 50,9 mmol). La solución se transfirió luego a la solución de Grignard mientras se mantenía una temperatura interna por debajo de -20°C. La mezcla de reacción resultante se agitó a aproximadamente -20°C durante aproximadamente 4 h.
[0264] La reacción se inactivó con 1 M HCl (140 ml), y la mezcla se calentó a temperatura ambiente. Se añadió EtOAc (140 ml), y las fases orgánica y acuosa se separaron. La capa de agua se extrajo con EtOAc (200 ml). Las capas de EtOAc combinadas se extrajeron secuencialmente con solución acuosa saturada de NaHCO3 (2 x 200 ml), agua (200 ml), y salmuera (200 ml). La capa orgánica se concentró y luego se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (30% EtOAc/hexano) para proporcionar (3R, 4R, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-bis((tercbutildimetilsililo)oxi)-5-(((terc-butildimetilsililo)oxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol. 1H Rm N (300 MHz, CDCL) 5 8,15-7,88 (m, 1H), 7,51 (d, J = 4,8 Hz, 0,5H), 7,02 - 6,92 (m, 0,5H), 6,65 - 6,57 (m, 1H), 5,66 - 5,24 (m, 3H), 4,49 -3,50 (m, 4H), 0,97 - 0,78 (26H), 0,65 (s, 1,5H), 0,19 - 0,00 (m, 15,5H), -0,22 (s, 1H), -0,55 (s, 1H). MS m/z = 626 (M+H).
Preparación de (2R, 3R, 4R, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f1M.2.41triazina-7-ilo)-3.4-bis((tertbutildimetilsililo)oxi)-5-(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo
[0265]
Figure imgf000049_0001
[0266] Una solución de (3R, 4R, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-bis((terc-butildimetilsililo)oxi)-5-(((terc-butildimetilsililo)oxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol (1,50 g, 2,40 mmol) en CH2CL (15 ml) se enfrió a aproximadamente -40°C. Se añadió ácido trifluoroacético (0,555 mL, 7,20 mmol) manteniendo la temperatura por debajo de -20°C. En un matraz separado, trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (2,60 ml, 14,4 mmol) se añadió a 5 ml de CH2Cl2 (5 ml) a aproximadamente 15°C, seguido por cianuro de trimetilsililo (1,92 ml, 14,4 mmol), y la solución se enfrió a aproximadamente -30°C. La solución enfriada se añadió a la solución de (3R, 4R, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-bis((terc-butildimetilsililo)oxi)-5-(((terc-butildimetilsililo)oxi)metilo)tetrahidrofurano-2-ol manteniendo la temperatura por debajo de -25°C. La mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a aproximadamente -30°C. La reacción se inactivó con trietilamina (3,34 ml, 24,0 mmol) y la mezcla se calentó a aproximadamente 0°C. Se añadió agua (50 ml) mientras se mantenía la temperatura por debajo de aproximadamente 20°C. Cuando se completó la adición, la mezcla se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó secuencialmente con KOH (20 ml), agua (20 ml) y salmuera (20 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se concentró y después se purificó por cromatografía en gel de sílice (EtOAc 30%/hexano) para proporcionar el producto como una mezcla de diastereómeros 3,8:1). La mezcla se purificó adicionalmente por HPLC prep. (ACN 0 a 95% en agua) para proporcionar el producto como un diastereómero único.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,14-7,92 (m, 2H), 7,89 (s, 1H), 6,95 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,27 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 5,10 (dd, J = 7,7, 4,6 Hz, 1H), 4,31 (dd, J = 4,7, 1,4 Hz, 1H), 4,12 (ddd, J = 5,9, 4,1, 1,4 Hz, 1H), 3,80 -3,69 (m, 1H), 3,56 (td, J = 7,8, 3,9 Hz, 1H), 0,93 (s, 9H), 0,75 (s, 9H), 0,11 (s, 3H), 0,09 (s, 3H), -0,15 (s, 3H), -0,62 (s, 3H). MS m/z = 520 (M+H).
Preparación de (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(((2R, 3R, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f1[1.2.41triazina-7-ilo)-3.4-bis((tercbutildimetilsililo)oxi)-5-cianotetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato
[0267]
Figure imgf000049_0002
[0268] A una mezcla de (2R, 3R, 4R, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-bis((tercbutildimetilsililo)oxi)-5-(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo (16 mg, 0,03 mmol), (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(4-nitrofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (17 mg, 0,04 mmol) y MgCl2 (4 mg, 0,05 mmol), se cargó THF (0,3 ml). La mezcla resultante se calentó a aproximadamente 50°C con agitación constante. Luego se añadió N,N-diisopropiletilamina (0,013 mL, 0,08 mmol), y la mezcla de reacción se agitó durante 21 h. La conversión al producto se confirmó mediante análisis UpLC y LC-Ms . MS m/z = 831 (M+H).
Figure imgf000050_0001
[0269] Una solución de (2R, 3R, 4R, 5R)-2-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-bis((tercbutildimetilsililo)oxi)-5-(hidroximetilo)tetrahidrofurano-2-carbonitrilo (16 mg, 0,03 mmol) en THF (0,3 mL) se enfrió a -10°C. fBuMgCl se añadió gota a gota (0,07 ml, 0,07 mmol), seguido de una solución de (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(perfluorofenoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato (22 mg, 0,04 mmol) en THF (0,15 ml). La mezcla de reacción se calentó a 5°C y se agitó durante 16 h. La reacción se inactivó con MeOH, se concentró y luego se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc/hexanos) para proporcionar el producto. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 57,97 (s, 1H), 7,38 - 7,29 (m, 2H), 7,25 - 7,21 (m, 2H), 7,21 - 7,13 (m, 1H), 7,11 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 6,65 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 5,88 (br s, 2H), 5,35 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 4,49 - 4,41 (m, 1H), 4,41 - 4,35 (m, 1H), 4,32 - 4,26 (m, 1 H), 4,24 (dd, J = 4,5, 1,7 Hz, 1H), 4,10 -3,99 (m, 2H), 3,96 (dd, J = 10,9, 5,7 Hz, 1H), 3,80 - 3,72 (m, 1H), 1,48 (h, J = 6,2 Hz, 1H), 1,39 -1,28 (m, 7H), 0,96 (s, 9H), 0,85 (t, J = 7,5 Hz, 6H), 0,80 (s, 9H), 0,08 (s, 3H), 0,07 (s, 3H), -0,13 (s, 3H), -0,56 (s, 3H).
31 P RMN (162 MHz, CDCl3) 52,74 (s). MS m/z = 831 (M+H).
Preparación de (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.41triazina-7-ilo)-5-ciano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato
[0270]
Figure imgf000050_0002
[0271] Una solución cruda de (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(((2R, 3R, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-bis((terc-butildimetilsililo)oxi)-5-cianotetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato se enfrió a aproximadamente 0°C y se añadió lentamente HCl concentrado (0,05 ml, 0,62 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 72 horas a aproximadamente 20°C. La conversión al producto se confirmó mediante análisis UPLC y LC-MS. MS m/z = 603 (M+H).
Figure imgf000050_0003
[0272] Una solución de (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(((2R, 3R, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-3,4-bis((tercbutildimetilsililo)oxi)-5-cianotetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato en un fluoruro o ácido puede desproteger a una solución de (S)-2-etilbutilo 2-(((S)-(((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)amino)propanoato. Los fluoruros representativos incluyen, entre otros, TBAF, KF, fluorhidrato de piridinio, fluorhidrato de trietilamonio, fluoruro de hidrógeno, ácido clorhídrico, ácido toluenosulfónico o cualquier otra fuente de fluoruro adecuada. Los ácidos representativos incluyen, pero no se limitan a los encontrados en Greene, TW; Wuts, Protective Groups In Organic Synthesis, 4a ed., John Wiley & Sons: Nueva York, 2006.
Ejemplo 35-a. (((((2R. 3S, 4R, 5R)-5-(4-am¡nop¡rrolo[2.1-f][1.2.4]tr¡azina-7-¡lo)-5-c¡ano-3.4-dihidroxitetrahidrofurano- 2-ilo)metoxi)oxidofosforilo)alaninato (Compuesto 35)
[0273]
Figure imgf000051_0001
[0274] 2-etilbutilo ((S)-(((2R, 3S, 4R, 5R)-5-(4-aminopirrolo[2.1-f][1.2.4]triazina-7-ilo)-5-ciano-3,4-dihidroxitetrahidrofurano-2-ilo)metoxi)(fenoxi)fosforilo)-L-alaninato (130 mg, 0,216 mmol) se disolvió en una mezcla de acetonitrilo (6 ml) y agua (2 ml). Se añadió gota a gota solución acuosa de hidróxido de sodio (2 N, 0,5 ml) durante 5 minutos a temperatura ambiente y la mezcla de reacción se agitó. Después de 2 h, la mezcla resultante se concentró a presión reducida y el residuo se purificó por HPLC en una columna C18 eluyendo con agua para proporcionar el producto deseado como la sal de bis-sodio. 1H RMN (400 MHz, D2O) 57,79 (s, 1H), 6,86 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 6,80 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 4,86 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,40 - 4,34 (m, 1H), 4,30 (dd, J = 5,3, 3,0 Hz, 1H), 3,75 (qdd, J = 11,6, 4,5, 3,1 Hz, 2H), 3,20 (dq, J = 8,6, 7,1 Hz, 1H), 0,86 (d, J = 7,0 Hz, 3H). 31P RMN (162 MHz, D2O) 57,30. LCMS m /z442,95 [M+H]. HPLC (2-98% de MeCN - H2O gradiente con 0,1% TFA modificador de más de 8,5 min, 1,5 ml/min, Columna: Phenomenex Kinetex C18, 2,6 um 100 Á, 4,6 x 100 mm) tn = 2,694 min.
B. Actividad antiviral
[0275] Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para inhibir infecciones virales, que comprende la etapa de tratar una muestra o sujeto sospechoso de necesitar tal inhibición con una composición de la invención.
[0276] Dentro del contexto de la invención, las muestras sospechosas de contener un virus incluyen materiales naturales o artificiales tales como organismos vivos; cultivos de tejidos o células; muestras biológicas tales como muestras de material biológico (sangre, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, esputo, saliva, muestras de tejido y similares); muestras de laboratorio; muestras de comida, agua o aire; muestras de bioproductos tales como extractos de células, particularmente células recombinantes que sintetizan una glicoproteína deseada; y similares. Típicamente, se sospechará que la muestra contiene un organismo que induce una infección viral, con frecuencia un organismo patógeno como un virus tumoral. Las muestras pueden estar contenidas en cualquier medio, incluyendo agua y solvente orgánico/mezclas de agua. Las muestras incluyen organismos vivos como los humanos y materiales hechos por el hombre como los cultivos celulares.
[0277] Si se desea, la actividad antivirus de un compuesto de la invención después de la aplicación de la composición se puede observar mediante cualquier método que incluya métodos directos e indirectos para detectar dicha actividad. Se contemplan métodos cuantitativos, cualitativos y semicuantitativos para determinar dicha actividad. Normalmente, se aplica uno de los métodos de detección descritos anteriormente, sin embargo, cualquier otro método, como la observación de las propiedades fisiológicas de un organismo vivo, también es aplicable.
[0278] La actividad antiviral de un compuesto de la invención se puede medir usando protocolos de detección estándar que se conocen. Por ejemplo, la actividad antiviral de un compuesto se puede medir usando los siguientes protocolos generales.
Figure imgf000052_0001
Ejemplo 36. Actividad antiviral del virus del Ébola y ensayos de citotoxicidad
[0279] La actividad antiviral del Compuesto 1 y el Compuesto 9 se midió contra el virus del Ébola (EBOV), el virus de Marburg (MARV) (Tabla 2) y el virus Nipah (NiV) (Tabla 3) utilizando virus informadores que se replican completamente y que expresan luciferasa o proteína verde fluorescente (GFP) (Uebelhoer, LS, 2014. AVR; Hoenen, T., 2013. AVR). Se midió la actividad antiviral adicional del Compuesto 1 y el Compuesto 9 contra el virus del Ébola (EBOV), el virus de Marburg (MARV) (Tabla 2-a), usando virus informadores de replicación completa que expresan luciferasa o proteína fluorescente verde (GFP) (Uebelhoer, LS, 2014 AVR; Hoenen, T., 2013. AVR). Todos los estudios se realizaron en contención de nivel 4 de bioseguridad (BSL-4) en los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC). Los ensayos antivirales del virus del Ébola se realizaron en células endoteliales microvasculares humanas primarias inmortalizadas con la proteína catalítica de la telomerasa (HMVEC-TERT) y en células Huh-7 (Shao, R., 2004, BBRC). La actividad antiviral del virus Nipah se midió en células HMVEC-TERT y Hela.
[0280] Se realizaron ensayos antivirales en placas de 96 pocillos. Se diluyeron entre ocho y diez concentraciones de compuesto en incrementos de dilución en serie de 3 veces en medio y se transfirieron 100 pl/pocillo de cada dilución por triplicado a placas que contenían monocapas de células preestablecidas. Las placas se transfirieron a contención BSL-4 y la dilución apropiada del stock de virus, previamente determinada por valoración y preparada en medios de cultivo celular, se añadió a las placas de prueba que contenían células y compuestos diluidos en serie. Cada placa incluía tres pocillos de células infectadas no tratadas y tres pocillos de células no infectadas que servían como 0% y 100% de control de inhibición del virus, respectivamente. Después de la infección, las placas de prueba se incubaron durante 3 a 4 días en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, la replicación del virus se midió en un lector de placas Envision por fluorescencia directa para virus informadores de GFP o después de la posterior adición de sustrato de luciferasa para virus informadores de luciferasa. Para los ensayos de rendimiento de virus, se eliminaron los medios de las células infectadas y se usó una porción para cuantificar el ARN viral mediante reacción de transcripción inversa en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR). Los medios restantes se diluyeron en serie y se midió la cantidad de virus infeccioso usando los medios diluidos para infectar monocapas de células frescas para determinar la dosis infecciosa de cultivo de tejidos que causó 50% de efectos citopáticos (TCID50) usando el reactivo Cell TiterGlo (Promega, Madison, WI)) Para los ensayos de efecto citopático del virus (CPE), se midió la viabilidad de las células infectadas usando el reactivo Cell TiterGlo.
[0281] El porcentaje de inhibición se calculó para cada concentración probada en relación con los controles de inhibición del 0% y 100% y el valor de CE50 para cada compuesto se determinó por regresión no lineal como la concentración efectiva del compuesto que inhibió la replicación del virus en un 50%.
Ejemplo 37. Células EBOV-GFP HMVEC-TERT
[0282] Se sembraron células HMVEC-TERT en placas de 96 pocilios. Se diluyeron de ocho a diez concentraciones de compuesto en incrementos de dilución en serie de 3 veces en medio y se transfirieron 100 pl/pocillo de cada dilución por triplicado a placas de 96 pocillos que contenían monocapas HMVEC-TERT preestablecidas. Las placas se transfirieron a contención BSL-4 y la dilución apropiada del stock de virus EBOV-GFP, previamente determinado por valoración y preparada en medios de cultivo celular, se añadió a las placas de prueba que contenían células y compuestos diluidos en serie. Cada placa incluía tres pocillos de células infectadas no tratadas y tres pocillos de células no infectadas que servían como 0% y 100% de control de inhibición del virus, respectivamente. Después de la infección, las placas de prueba se incubaron durante 3 a 4 días en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, la replicación del virus se midió en un lector de placas Envision por fluorescencia directa para medir la expresión de GFP del virus informador. El porcentaje de inhibición se calculó para cada concentración probada en relación con los controles de inhibición de 0% y 100% y el valor de CE50 para cada compuesto se determinó por regresión no lineal como la concentración efectiva del compuesto que inhibió la replicación del virus en un 50%.
Ejemplo 38. Células EBOV-GFP Huh-7
[0283] Se sembraron células Huh-7 en placas de 96 pocillos. Se diluyeron de ocho a diez concentraciones de compuesto en incrementos de dilución en serie de 3 veces en medio y se transfirieron 100 pl/pocillo de cada dilución por triplicado a placas de 96 pocillos que contenían monocapas Huh-7 preestablecidas. Las placas se transfirieron a contención BSL-4 y la dilución apropiada del stock de virus EBOVGFP, previamente determinado por valoración y preparada en medios de cultivo celular, se añadió a las placas de prueba que contenían células y compuestos diluidos en serie. Cada placa incluía tres pocillos de células infectadas no tratadas y tres pocillos de células no infectadas que servían como 0% y 100% de control de inhibición del virus, respectivamente. Después de la infección, las placas de prueba se incubaron durante 3 a 4 días en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, la replicación del virus se midió en un lector de placas Envision por fluorescencia directa para medir la expresión de GFP del virus informador. El porcentaje de inhibición se calculó para cada concentración probada en relación con los controles de inhibición de 0% y 100% y el valor de CE50 para cada compuesto se determinó por regresión no lineal como la concentración efectiva del compuesto que inhibió la replicación del virus en un 50%.
Ejemplo 39. Células EBOV-Luc Huh-7
[0284] Se sembraron células Huh-7 en placas de 96 pocillos. Se diluyeron de ocho a diez concentraciones de compuesto en incrementos de dilución en serie de 3 veces en medio y se transfirieron 100 pl/pocillo de cada dilución por triplicado a placas que contenían monocapas de células preestablecidas. Las placas se transfirieron a contención BSL-4 y la dilución apropiada del stock de virus EBOV-Luc, previamente determinado por valoración y preparada en medios de cultivo celular, se añadió a las placas de prueba que contenían células y compuestos diluidos en serie. Cada placa incluía tres pocillos de células infectadas no tratadas y tres pocillos de células no infectadas que servían como 0% y 100% de control de inhibición del virus, respectivamente. Después de la infección, las placas de prueba se incubaron durante 3 a 4 días en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, se midió la replicación del virus en un lector de placas Envision después de la posterior adición de sustrato de luciferasa. El porcentaje de inhibición se calculó para cada concentración probada en relación con los controles de inhibición de 0% y 100% y el valor de CE50 para cada compuesto se determinó por regresión no lineal como la concentración efectiva del compuesto que inhibió la replicación del virus en un 50%.
Ejemplo 40. Células MARV-GFP Huh-7
[0285] Se sembraron células Huh-7 en placas de 96 pocillos. Se diluyeron de ocho a diez concentraciones de compuesto en incrementos de dilución en serie de 3 veces en medio y se transfirieron 100 pl/pocillo de cada dilución por triplicado a placas de 96 pocillos que contenían monocapas Huh-7 preestablecidas. Las placas se transfirieron a contención BSL-4 y la dilución apropiada del stock de virus MARVGFP, previamente determinada por valoración y preparada en medios de cultivo celular, se añadió a las placas de prueba que contenían células y compuestos diluidos en serie. Cada placa incluía tres pocillos de células infectadas no tratadas y tres pocillos de células no infectadas que servían como 0% y 100% de control de inhibición del virus, respectivamente. Después de la infección, las placas de prueba se incubaron durante 3 a 4 días en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, se midió la replicación del virus en un lector de placas por fluorescencia directa para medir la expresión de GFP del virus informador. El porcentaje de inhibición se calculó para cada concentración probada en relación con los controles de inhibición de 0% y 100% y el valor de CE50 para cada compuesto se determinó por regresión no lineal como la concentración efectiva del compuesto que inhibió la replicación del virus en un 50%.
Ejemplo 41. Ébola Huh-7 (ARN)
[0286] Se sembraron células Huh-7 en placas de 96 pocillos. Se diluyeron de ocho a diez concentraciones de compuesto en incrementos de dilución en serie de 3 veces en medio y se transfirieron 100 pl/pocillo de cada dilución por triplicado a placas que contenían monocapas de células Huh-7 preestablecidas. Las placas se transfirieron a contención BSL-4 y la dilución apropiada del stock de virus EBOV, previamente determinado por valoración y preparada en medios de cultivo celular, se añadió a las placas de prueba que contenían células y compuestos diluidos en serie. Cada placa incluía tres pocillos de células infectadas no tratadas y tres pocillos de células no infectadas que servían como 0% y 100% de control de inhibición del virus, respectivamente. Después de la infección, las placas de prueba se incubaron durante 3 a 4 días en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, se eliminaron los medios de las células infectadas y se usó una porción para cuantificar el ARN viral mediante la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR). El porcentaje de inhibición se calculó para cada concentración probada en relación con los controles de inhibición de 0% y 100% y el valor de CE50 para cada compuesto se determinó por regresión no lineal como la concentración efectiva del compuesto que inhibió la replicación del virus en un 50%.
Ejemplo 42. Ébola Huh-7 (rendimiento)
[0287] Se sembraron células Huh-7 en placas de 96 pocillos. Se diluyeron de ocho a diez concentraciones de compuesto en incrementos de dilución en serie de 3 veces en medio y se transfirieron 100 pl/pocillo de cada dilución por triplicado a placas que contenían monocapas de células Huh-7 preestablecidas. Las placas se transfirieron a contención BSL-4 y la dilución apropiada del stock de virus EBOV, previamente determinada por valoración y preparada en medios de cultivo celular, se añadió a las placas de prueba que contenían células y compuestos diluidos en serie. Cada placa incluía tres pocillos de células infectadas no tratadas y tres pocillos de células no infectadas que servían como 0% y 100% de control de inhibición del virus, respectivamente. Después de la infección, las placas de prueba se incubaron durante 3 a 4 días en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, los medios de las células infectadas se eliminaron y diluyeron en diluciones en serie de 10 veces. La cantidad de virus infeccioso se midió usando los medios diluidos para infectar monocapas de células frescas para determinar la dosis infecciosa del cultivo de tejidos que causó 50% de efectos citopáticos (TCID50) usando el reactivo Cell TiterGlo (Promega, Madison, WI). El porcentaje de inhibición se calculó para cada concentración probada en relación con los controles de inhibición de 0% y 100% y el valor de CE50 para cada compuesto se determinó por regresión no lineal como la concentración efectiva del compuesto que inhibió la replicación del virus en un 50%.
Ejemplo 43. Células Ébola HeLa
[0288] La actividad antiviral de los compuestos seleccionados se midió frente a la cepa Zaire del Ébolavirus (EBOV) realizada en contención de nivel 4 de bioseguridad (BSL-4) en el Instituto de Investigación Médica del Ejército de EE.UU. para Enfermedades de Infecciones (USAMRIID). Se sembraron células Hela en placas de 384 pocillos a 5000 células/pocillo. La actividad antiviral de cada compuesto se midió por cuadruplicado. Se agregaron de ocho a diez concentraciones de compuesto directamente a los cultivos celulares usando el dispensador digita1 HP300 en incrementos de dilución en serie de 3 veces 2 h antes de la infección. Las placas se transfirieron a contención BSL-4 y la dilución apropiada del stock de virus, previamente determinada por valoración y preparada en medios de cultivo celular, se añadió a las placas de prueba que contenían células y compuestos diluidos en serie. Cada placa incluía tres pocillos de células infectadas no tratadas y tres pocillos de células no infectadas que servían como 0% y 100% de control de inhibición del virus, respectivamente. Después de la infección, las placas de prueba se incubaron durante 2 días en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, las células se fijaron en solución de formalina y se midió la replicación del virus cuantificando los niveles de glucoproteína Ébola después de la inmunotinción y la obtención de imágenes de alto contenido utilizando el instrumento de microscopía confocal Perkin Elmer Opera. El porcentaje de inhibición se calculó para cada concentración probada en relación con los controles de inhibición de 0% y 100% y el valor de CE50 para cada compuesto se determinó por regresión no lineal como la concentración efectiva del compuesto que inhibió la replicación del virus en un 50%.
Ejemplo 44. Cultivos de macrófagos de Ébola
[0289] La actividad antiviral de los compuestos seleccionados se midió frente a la cepa Zaire del virus del Ébola (EBOV) realizada en contención de nivel 4 de bioseguridad (BSL-4) en el Instituto de Investigación Médica del Ejército de EE.UU. para Enfermedades de Infecciones (USAMRIID). Los cultivos de macrófagos se aislaron de PBMC humanas frescas y se diferenciaron en presencia de 5 ng/ml de GM-CSF y 50 mM de B-mercaptoetanol. Los medios se cambiaron cada 2 días y las células que se adhirieron a la placa de cultivo de tejidos después de 7 días se eliminaron con EDTA 0,5 M en 1x PBS, se concentraron por centrifugación a 200 x g durante 10 minutos y se sembraron en en placas de ensayo de 384 pocillos a 40,000 células/pocillo. La actividad antiviral de cada compuesto se midió por cuadruplicado. Se agregaron de ocho a diez concentraciones de compuesto directamente a los cultivos celulares usando el dispensador digital HP300 en incrementos de dilución en serie de 3 veces 2 h antes de la infección. Las placas se transfirieron a contención BSL-4 y la dilución apropiada del stock de virus, previamente determinada por valoración y preparada en medios de cultivo celular, se añadió a las placas de prueba que contenían células y compuestos diluidos en serie. Cada placa incluía tres pocillos de células infectadas no tratadas y tres pocillos de células no infectadas que servían como 0% y 100% de control de inhibición del virus, respectivamente. Después de la infección, las placas de prueba se incubaron durante 2 días en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, las células se fijaron en solución de formalina y se midió la replicación del virus cuantificando los niveles de glucoproteína Ébola después de la inmunotinción y la obtención de imágenes de alto contenido utilizando el instrumento de microscopía confocal Perkin Elmer Opera. El porcentaje de inhibición se calculó para cada concentración probada en relación con los controles de inhibición de 0% y 100% y el valor de CE50 para cada compuesto se determinó por regresión no lineal como la concentración efectiva del compuesto que inhibió la replicación del virus en un 50%.
Ejemplo 45. Células Nipah-GFP HMVEC-TERT
[0290] Se sembraron células HMVEC-TERT en placas de 96 pocillos. Se diluyeron de ocho a diez concentraciones de compuesto en incrementos de dilución en serie de 3 veces en medio y se transfirieron 100 pl/pocillo de cada dilución por triplicado a placas de 96 pocillos que contenían monocapas HMVEC-TERT preestablecidas. Las placas se transfirieron a contención BSL-4 y la dilución apropiada del stock de virus NiV-GFP, previamente determinado por titulación y preparado en medios de cultivo celular, se añadió a las placas de prueba que contenían células y compuestos diluidos en serie. Cada placa incluía tres pocillos de células infectadas no tratadas y tres pocillos de células no infectadas que servían como 0% y 100% de control de inhibición del virus, respectivamente. Después de la infección, las placas de prueba se incubaron durante 3 a 4 días en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, la replicación del virus se midió en un lector de placas Envision por fluorescencia directa para medir la expresión de GFP del virus informador. El porcentaje de inhibición se calculó para cada concentración probada en relación con los controles de inhibición de 0% y 100% y el valor de CE50 para cada compuesto se determinó por regresión no lineal como la concentración efectiva del compuesto que inhibió la replicación del virus en un 50%.
Ejemplo 46. NiV-Luc HMVEC-TERT
[0291] Se sembraron células HMVEC-TERT en placas de 96 pocillos. Se diluyeron entre ocho y diez concentraciones de compuesto en incrementos de dilución en serie de 3 veces en medio y se transfirieron 100 pl/pocillo de cada dilución por triplicado a placas que contenían monocapas de células preestablecidas. Las placas se transfirieron a contención BSL-4 y la dilución apropiada del stock de virus NivLuc, previamente determinado por valoración y preparada en medios de cultivo celular, se añadió a las placas de prueba que contenían células y compuestos diluidos en serie. Cada placa incluía tres pocillos de células infectadas no tratadas y tres pocillos de células no infectadas que servían como 0% y 100% de control de inhibición del virus, respectivamente. Después de la infección, las placas de prueba se incubaron durante 3 a 4 días en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, se midió la replicación del virus en un lector de placas Envision después de la posterior adición de sustrato de luciferasa. El porcentaje de inhibición se calculó para cada concentración probada en relación con los controles de inhibición de 0% y 100% y el valor de CE50 para cada compuesto se determinó por regresión no lineal como la concentración efectiva del compuesto que inhibió la replicación del virus en un 50%.
Ejemplo 47. NiV Hela (rendimiento)
[0292] Las células HeLa se sembraron en placas de 96 pocillos. Se diluyeron de ocho a diez concentraciones de compuesto en incrementos de dilución en serie de 3 veces en medio y se transfirieron 100 pl/pocillo de cada dilución por triplicado a placas que contenían monocapas de células Hela preestablecidas. Las placas se transfirieron a contención BSL-4 y la dilución apropiada del stock de virus Niv, previamente determinado por valoración y preparada en medios de cultivo celular, se añadió a las placas de prueba que contenían células y compuestos diluidos en serie. Cada placa incluía tres pocillos de células infectadas no tratadas y tres pocillos de células no infectadas que servían como 0% y 100% de control de inhibición del virus, respectivamente. Después de la infección, las placas de prueba se incubaron durante 4 días en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, los medios de las células infectadas se eliminaron y diluyeron en diluciones en serie de 10 veces. La cantidad de virus infeccioso se midió usando los medios diluidos para infectar monocapas de células frescas para determinar la dosis infecciosa del cultivo de tejidos que causó 50% de efectos citopáticos (TCID50) usando el reactivo Cell TiterGlo (Promega, Madison, WI). El porcentaje de inhibición se calculó para cada concentración probada en relación con los controles de inhibición de 0% y 100% y el valor de CE50 para cada compuesto se determinó por regresión no lineal como la concentración efectiva del compuesto que inhibió la replicación del virus en un 50%.
Ejemplo 48. Niv Hela (ARN)
[0293] Se sembraron células Huh-7 en placas de 96 pocillos. Se diluyeron de ocho a diez concentraciones de compuesto en incrementos de dilución en serie de 3 veces en medio y se transfirieron 100 pl/pocillo de cada dilución por triplicado a placas que contenían monocapas de células hela. Las placas se transfirieron a contención BSL-4 y la dilución apropiada del stock de virus Niv, previamente determinado por valoración y preparada en medios de cultivo celular, se añadió a las placas de prueba que contenían células y compuestos diluidos en serie. Cada placa incluía tres pocillos de células infectadas no tratadas y tres pocillos de células no infectadas que servían como 0% y 100% de control de inhibición del virus, respectivamente. Después de la infección, las placas de prueba se incubaron durante 3 a 4 días en una incubadora de cultivo de tejidos. Después de la incubación, se eliminaron los medios de las células infectadas y se usó una porción para cuantificar el ARN viral mediante la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR). El porcentaje de inhibición se calculó para cada concentración probada en relación con los controles de inhibición de 0% y 100% y el valor de CE50 para cada compuesto se determinó por regresión no lineal como la concentración efectiva del compuesto que inhibió la replicación del virus en un 50%.
Tabla 2: Ensayos antivirales del virus del Ébola y Marburg
Figure imgf000056_0001
Tabla 2-a: Ensayos antivirales del virus del Ébola y Marburg
Figure imgf000057_0002
Tabla 3: Ensayos antivirales del virus Nipah y Hendra
Figure imgf000057_0001
[0294] La invención se ha descrito con referencia a diversas realizaciones y técnicas específicas y preferidas. Sin embargo, un experto en la materia comprenderá que se pueden hacer muchas variaciones y modificaciones, en la medida en que están cubiertas por las reivindicaciones, mientras permanecen dentro del alcance de la invención.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000058_0001
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000060_0001
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
2. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y al menos otro agente terapéutico.
4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, en la que el al menos otro agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en ribavirina, palivizumab, motavizumab, RSV-IGIV (RespiGam®), MEDI-557, A-60444, MDT-637, BMS-433771, amiodarona, dronedarona, verapamilo, plasma convaleciente del ébola (ECP), TKM-100201, BCX4430 ((2S, 3S, 4R, 5R)-2-(4-amino-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-7-ilo)-5-(hidroximetilo)pirrolidina-3,4-diol), favipiravir (también conocido como T-705 o Avigan), monofosfato T-705, difosfato T-705, trifosfato T-705, FGI-106 (1-N,7-N-bis[3-(dimetilamino)propilo]-3,9-dimetilquinolino[8,7-h]quinolona-1,7-diamina), Jk -05, TKM-Ébola, ZMapp, rNAPc2, VRC-EBOADC076-00-VP, OS-2966, MVA-BN filo, brincidofovir, vacuna contra ébola basada en vector 5 de adenovirus Vaxart, Ad26-ZEBOV, vacuna FiloVax, GOVX-E301, GOVX-E302, inhibidores de la entrada del virus del ébola (inhibidores NPC1) y rVSV-EBOV, y sus mezclas.
5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en la que el al menos otro agente terapéutico es ZMapp.
6. El compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en un método de tratamiento de una infección por el virus Filoviridae en un ser humano.
7. El compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en un método de tratamiento de una infección por ébolavirus en un ser humano.
8. El compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en un método de tratamiento de una infección por el virus de Marburg en una persona.
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