ES2714406T3

ES2714406T3 - Composiciones que comprenden fosfatasa alcalina y / o péptido natriurético y procedimientos de uso de las mismas

Info

Publication number: ES2714406T3
Application number: ES12842640T
Authority: ES
Inventors: Philippe Crine; Florent Elefteriou
Original assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc; Vanderbilt University
Current assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc; Vanderbilt University
Priority date: 2011-10-19
Filing date: 2012-10-18
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2032-10-18
Also published as: WO2013058833A1; JP2015502336A; EP3488861B1; EP2768526A4; HK1201446A1; JP6118807B2; EP2768526A1; WO2013058833A8; EP3488861A1; SG11201401605QA; KR20140084201A; ES2944087T3; CA2852874A1; EP2768526B1; WO2013059491A1

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende: (a) un polipéptido que comprende la estructura A-sALP-B; y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina, A está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y B es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido o está ausente, para su uso en un procedimiento para tratar la neurofibromatosis en un sujeto.

Description

DESCRIPCION

Composiciones que comprenden fosfatasa alcalina y / o peptido natriuretico y procedimientos de uso de las mismas ANTECEDENTES DE LA INVENCION

En general, esta invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido que comprende un dominio extracelular de una fosfatasa alcalina para su uso en un procedimiento para tratar la neurofibromatosis. Numerosas enfermedades y afecciones involucran funciones esqueleticas anormales, estructura o crecimiento del hueso o cartflago. Para algunas enfermedades, se conoce la etiologfa de estas manifestaciones esqueleticas, como en la hipofosfatasia (HPP) y la acondroplasia (ACH), pero las opciones de tratamiento son limitadas. En otras enfermedades, se desconoce la etiologfa. Por ejemplo, la neurofibromatosis tipo I (NF1 o enfermedad de Von Recklinghausen) es un trastorno genetico autosomico dominante que tiene una incidencia de aproximadamente 1 de cada 3500 nacidos vivos. La NF1 codifica la neurofibromina, un miembro de la familia de protefnas activadoras de GTPasa (GAP) que se sabe que suprime la cinasa Ras. La neurofibromina es un supresor especffico de p21-RAS, y las mutaciones en el gen NF1 causan la activacion no suprimida de RAS que conduce a un crecimiento y diferenciacion celular anormal. Por consiguiente, las caracterfsticas clfnicas de NF1 incluyen varias transformaciones oncogenicas, como neurofibromas neurocutaneos y tumores de la via optica, y otras manifestaciones no cancerosas, como defectos cognitivos y anomalfas esqueleticas. Algunas de las manifestaciones esqueleticas de NF1 tienen una alta morbilidad (por ejemplo, la escoliosis distrofica, el arqueamiento de huesos largos y la pseudoartrosis) y opciones de tratamiento insatisfactorias, que se han complicado por el hecho de que la etiologfa de estas manifestaciones no esta clara. Muchas enfermedades esqueleticas surgen de la perdida de la funcion de una o mas protefnas. Por ejemplo, la hipofosfatasia (HPP) es una enfermedad rara y hereditaria causada por una o mas mutaciones de perdida de funcion en el gen ALPL, que codifica la fosfatasa alcalina no especffica de tejido (TNALP; tambien conocida como hfgado / hueso / rinon tipo ALP). La deficiencia de fosfatasa alcalina en osteoblastos y condrocitos deteriora la mineralizacion esqueletica, lo que lleva a sfntomas de diferente gravedad, desde raquitismo u osteomalacia hasta una ausencia casi completa de mineralizacion osea en el utero. Sin embargo, la terapia de reemplazo enzimatico con fosfatasa alcalina no modificada (por ejemplo, infusion de fosfatasa alcalina nativa) ha sido en gran parte en vano.

En otro ejemplo, la acondroplasia (ACH) es la forma mas comun de enanismo de extremidades cortas en seres humanos, afecta a mas de 250.000 individuos en todo el mundo y es causada por mutaciones en el gen que codifica el receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR3), que causa una ganancia de funcion FGFR3. La gravedad del fenotipo clfnico esta relacionada con la capacidad de la mutacion para sobreactivar las vfas de senalizacion de FGFR3 en los condrocitos, como la via MAP-quinasa. Esta via se puede inhibir activando el receptor peptfdico natriuretico B (NPR-B), que produce el segundo mensajero cGMP, y cGMP, a su vez, inhibe la via MAP-quinasa dentro de la celula. En el entorno celular, las formas inmaduras y maduras del peptido natriuretico de tipo C (CNP), como el CNP53 y el CNP22, se enlazan a NPR-B e inducen la produccion de cGMP de una manera similar y dependiente de la dosis. Por lo tanto, se ha considerado el uso del CNP o un analogo de CNP que podrfa activar la via de senalizacion de NPR-B para el tratamiento de la displasia esqueletica. Sin embargo, un inconveniente importante del uso terapeutico del CNP es su vida media extremadamente corta.

Por lo tanto, existe la necesidad en la tecnica de desarrollar moleculas terapeuticas y procedimientos para tratar enfermedades que tengan manifestaciones esqueleticas, tales como la neurofibromatosis. Ademas, se necesitan mas moleculas terapeuticas que tengan una vida media apreciable y / u otras propiedades farmacocineticas y terapeuticas favorables, y estas moleculas se pueden utilizar para tratar una variedad de trastornos que se beneficiarfan de su modo de accion subyacente, como la neurofibromatosis, la hipofosfatasia y la acondroplasia.

RESUMEN DE LA INVENCION

De manera sorprendente, se ha descubierto que la neurofibromatosis, un sfndrome neurocutaneo que produce tumores en el sistema nervioso, da lugar a manifestaciones oseas que surgen de la acumulacion de pirofosfato inorganico (PPi). Como las protefnas de fusion de fosfatasa alcalina-Fc (ya sea con o sin una fraccion dirigida al hueso) pueden reducir la acumulacion de PPi, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido que incluye un dominio de fosfatasa alcalina soluble (sALP) (es decir, un polipeptido de sALP), asf como composiciones y usos de los mismos. La presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende:

(a) un polipeptido que comprende la estructura A-sALP-B; y

(b) un excipiente farmaceuticamente aceptable,

donde

sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina,

A esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y

B es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente,

para su uso en un procedimiento para tratar la neurofibromatosis en un sujeto.

Ademas, las manifestaciones oseas en la neurofibromatosis tambien pueden surgir de la sobreactivacion de la via de la MAP-quinasa, y podrfa utilizarse un peptido natriuretico (NP) o un analogo de NP para inhibir esta via. Por consiguiente, la presente solicitud describe un polipeptido que incluye un dominio de NP (por ejemplo, un CNP) (es decir, un polipeptido de NP) y composiciones y usos de los mismos.

Ademas, la presente invencion incluye una composicion farmaceutica para el uso de la invencion que comprende combinaciones de un polipeptido de sALP y un polipeptido de NP, donde estos polipeptidos se pueden administrar por separado o juntos. En particular, la presente invencion se relaciona con una composicion farmaceutica para el uso de la invencion, donde dicha composicion comprende ademas un segundo polipeptido que comprende la estructura V-NP-W, donde la secuencia de aminoacidos de dicho segundo polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 572, 501-571 y 573-608, preferentemente la secuencia de aminoacidos del segundo polipeptido comprende la SEQ ID NO: 572. Esta combinacion serfa particularmente util en enfermedades que se beneficiarfan de niveles elevados de ALP (por ejemplo, trastornos asociados con niveles elevados de PPi, como la neurofibromatosis o trastornos asociados con la deficiencia de ALP, como la hipofosfatasia) y / o enfermedades que se beneficiarfan de la inactivacion de una via de senalizacion que involucra FGFR3 (por ejemplo, trastornos asociados con la sobreactivacion de la via MAP-quinasa, como la neurofibromatosis o la acondroplasia o trastornos asociados con la sobreactivacion de FGFR3, como la acondroplasia o la craneosinostosis o el cancer) y / o enfermedades que se beneficiarfan de niveles elevados de NP (por ejemplo, trastornos asociados con la deficiencia de CNP, como la displasia esqueletica o trastornos del musculo liso vascular). Los polipeptidos en las composiciones farmaceuticas para el uso de la invencion tambien pueden proporcionarse en kits, ya sea por separado o juntos.

Se describe un procedimiento para tratar un sfndrome neurocutaneo en un sujeto, incluyendo el procedimiento la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que incluye: (a) un polipeptido que incluye la estructura A-sALP-B; y (b) un excipiente farmaceuticamente aceptable, donde sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina, A esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y B esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. En algunas realizaciones, el sfndrome en el sujeto se trata de este modo.

La presente invencion se refiere en un primer aspecto a una composicion farmaceutica que comprende:

(a) un polipeptido que comprende la estructura A-sALP-B; y

(b) un excipiente farmaceuticamente aceptable,

donde

sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina,

A esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y

B es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente,

para su uso en un procedimiento para tratar la neurofibromatosis en un sujeto.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la sALP incluye o consiste en residuos de aminoacidos 23 508 de SEQ ID NO: 1215, residuos de aminoacidos 18-498 de SEQ ID NO: 1216, residuos de aminoacidos 23-508 de SEQ ID NO: 1218 o residuos de aminoacidos 18-498 de SEQ ID NO: 1219 o la secuencia de aminoacidos de la sALP incluye o consiste en residuos de aminoacidos 23-512 de SEQ ID NO: 1215, residuos de aminoacidos 18-502 de SEQ ID NO: 1216, residuos de aminoacidos 23-512 de SEQ ID NO: 1218 o residuos de aminoacidos 18-502 de SEQ ID NO: 1219. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la sALP incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1205. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la sALP incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID

NO: 1205.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la sALP incluye o consiste en los residuos de aminoacidos

1-497, 1-498, 1-499, 1-500, 1-501, 1-502, 1-503, 1-504, 1-505, 1-506, 1-507, 1-508, 1-509, 1-510, 1-511, 1-512, 23

497, 23-498, 23-499, 23-500, 23-501, 23-502, 23-503, 23-504, 23-505, 23-506, 23-507, 23-508, 23-509, 23-510, 23

511 o 23-512 de la SEQ ID NO: 1218, donde X es cualquier aminoacido pero no es un aminoacido correspondiente a una mutacion patogena en esa posicion de la TNALP humana, por ejemplo, no es un aminoacido correspondiente a una mutacion patogena proporcionada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la sALP incluye o consiste en los residuos de aminoacidos 18-497, 18-498, 18-499, 18-500, 18-501, 18-502, 18-503, 18

504, 18-505, 18-506, 18-507, 18-508, 18-509, 18-510, 18-511 o 18-512 de la SEQ ID NO: 1219, donde X es cualquier aminoacido pero no es un aminoacido correspondiente a una mutacion patogena en esa posicion de la TNALP humana, por ejemplo, no es un aminoacido correspondiente a una mutacion patogena proporcionada en la Tabla 1.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la sALP incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1218 o 1219, donde X es cualquier aminoacido, pero no es un aminoacido correspondiente a una mutacion patogena en esa posicion de la TNALP humana, por ejemplo, no es un aminoacido correspondiente a una mutacion patogena proporcionada en la

Tabla 1. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la sALP incluye o consiste en una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con los residuos de aminoacidos 23-508 de la SEQ ID NO: 1215, residuos de aminoacidos 18-498 de SEQ ID NO: 1216, residuos de aminoacidos 23-508 de SEQ ID NO: 1218 o residuos de aminoacidos 18-498 de SEQ ID NO: 1219 o la secuencia de aminoacidos de la sALP consiste en una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99

% de identidad de secuencia con los residuos de aminoacidos 23-512 de la SEQ ID NO: 1215, residuos de aminoacidos

18-502 de SEQ ID NO: 1216, residuos de aminoacidos 23-512 de SEQ ID NO: 1218 o residuos de aminoacidos 18

502 de SEQ ID NO: 1219, donde X en la SEQ ID NO: 1218 o 1219 es cualquier aminoacido pero no es un aminoacido correspondiente a una mutacion patogena en esa posicion de la TNALP humana, por ejemplo, no es un aminoacido correspondiente a una mutacion patogena proporcionada en la Tabla 1.

En algunas realizaciones, A y / o B estan ausentes.

En algunas realizaciones, A y / o B incluye una region de fragmento cristalizable (Fc). En algunas realizaciones, la Fc incluye un dominio Ch², un dominio Ch3 y una region bisagra o la Fc es un dominio constante de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4, por ejemplo, IgG-1. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la Fc incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95

% o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 401. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la Fc incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 401.

En algunas realizaciones, A y / o B incluye In, donde I representa un acido aspartico o un acido glutamico y n = 10 a

16, por ejemplo, n es 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. En algunas realizaciones, la In es E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D¹⁰,

D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵o D¹⁶, por ejemplo, E¹⁰o D¹⁰.

En algunas realizaciones, A y / o B incluye una fraccion dirigida al hueso, por ejemplo, que incluye 6, 7, 8, 9, 10, 11,

12, 13, 14, 15 o 16 residuos acidos consecutivos, por ejemplo, acido aspartico o acido glutamico. En algunas realizaciones, la fraccion dirigida al hueso incluye o consiste en E6, E⁷, Es, Eg, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, D8, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo, E6, E¹⁰, D6, o D¹⁰. En algunas realizaciones, el polipeptido no incluye una region de acido poliaspartico o acido poliglutamico superior a tres residuos consecutivos de acido aspartico o acido glutamico o el polipeptido no incluye una region de acido poliaspartico o acido poliglutamico superior a dos residuos consecutivos de acido aspartico o acido glutamico.

En algunas realizaciones, el polipeptido no incluye una fraccion dirigida al hueso.

En algunas realizaciones, el polipeptido incluye la estructura C-sALP-D-Fc-E o la estructura C-Fc-D-sALP-E, donde C esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, D esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido y E esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido.

En algunas realizaciones, C y / o E estan ausentes. En algunas realizaciones, D es dos residuos de aminoacidos, por ejemplo, leucina-lisina o acido aspartico-isoleucina. En algunas realizaciones, D es cualquier enlazador descrito en el presente documento, por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 301-391.

En algunas realizaciones, el polipeptido incluye la estructura C-sALP-D-Fc-G-In-H o la estructura C-Fc-D-sALP-G-In-H, donde C esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, D esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, G esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, H esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, I representa un acido aspartico o un acido glutamico y n = 10 a 16, por ejemplo, n es 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. En algunas realizaciones, la In es E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵o D¹⁶, por ejemplo, E¹⁰o D¹⁰.

En algunas realizaciones, C y / o H estan ausentes. En algunas realizaciones, G es dos residuos de aminoacidos, por ejemplo, leucina-lisina o acido aspartico-isoleucina, por ejemplo, acido aspartico-isoleucina. En algunas realizaciones, I es un acido aspartico o un acido glutamico y n = 10 a 16, por ejemplo, n es 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16, por ejemplo, I es acido aspartico y n = 10. En algunas realizaciones, D es dos residuos de aminoacidos, por ejemplo, leucina-lisina o acido aspartico-isoleucina, por ejemplo, leucina-lisina. En algunas realizaciones, D o G es cualquier enlazador descrito en el presente documento, por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 301 391.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del polipeptido incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1201, 1204, 1220 o 1221, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1204. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1201, 1204, 1220 o 1221, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1204. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del polipeptido consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1204.

Se describe un procedimiento para tratar un sfndrome neurocutaneo en un sujeto, incluyendo el procedimiento la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que incluye: (a) un polipeptido que incluye la estructura V-NP-W; y (b) un excipiente farmaceuticamente aceptable, donde Np es un peptido natriuretico que es un agonista del receptor B del peptido natriuretico (NPR-B), V esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido y W esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. Se describe que el sfndrome en el sujeto se trata de este modo.

En una realizacion preferida de la composicion farmaceutica para el uso de la invencion, la composicion farmaceutica comprende ademas un segundo polipeptido que comprende la estructura V-NP-W, donde la secuencia de aminoacidos de dicho segundo polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 572, 501 571 y 573-608, preferentemente la secuencia de aminoacidos del segundo polipeptido comprende la SEQ ID NO: 572. En otra realizacion preferida de la composicion farmaceutica para el uso de la invencion, la composicion farmaceutica comprende ademas un segundo polipeptido que comprende la estructura V-NP-W, donde:

(a) NP es un peptido natriuretico que es un agonista del receptor B del peptido natriuretico (NPR-B);

(b) V es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente; y

(c) W es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente,

donde dicho NP de dicho segundo polipeptido comprende la estructura:

[extension N-terminal]- [segmento corto]- [dominio de anillo]- [extension C-terminal], donde:

(i) dicho dominio de anillo comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6, residuos de aminoacidos 11-27 de SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 95, y cada uno de dicha extension N-terminal, segmento corto y extension C-terminal esta, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido; o

(ii) dicho dominio de anillo comprende residuos de aminoacidos 6-22 de SEQ ID NO: 126; o

(iii) dicho dominio de anillo comprende residuos de aminoacidos 6-22 de SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 se sustituye por Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, Ser, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro o Asp; o (iv) la secuencia de aminoacidos de dicha extension N-terminal comprende KGANKK (SEQ ID NO: 314), KGANQK (SEQ ID NO: 315) o residuos de aminoacidos 1-31 o 17-31 de SEQ iD NO: 11; o

(v) dicha extension C-terminal comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 117 o 118 o residuos de aminoacidos 23-37 seleccionados de entre cualquiera de las SEQ ID NO: 101-116; o

(vi) la secuencia de aminoacidos de dicho NP consiste en las SEQ ID NO: 4 u 11 o la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 31-94 o un fragmento del mismo que comprende al menos un dominio de anillo o la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 13-29, 100-116, 119-125, 127-233 o 1001-1155.

En algunas realizaciones, el NP incluye la estructura: [extension N-terminal]-[segmento corto]-[dominio de anillo]-[extension C-terminal], donde el dominio de anillo incluye la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6, residuos de aminoacidos 11-27 de SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 95, y cada uno de la extension N-terminal, segmento corto y extension C-terminal esta, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. En algunas realizaciones, el dominio de anillo incluye residuos de aminoacidos 6-22 de SEQ ID NO: 126. En algunas realizaciones, el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, Asp, Gly, Ala, Ser, Val, Trp, Asn, Gln, His o Lys, por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, Ser, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro o Asp, por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala o Ser, por ejemplo, Phe o Leu, por ejemplo, Phe, por ejemplo, Leu. En algunas realizaciones, el dominio de anillo incluye la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el segmento corto y el dominio de anillo juntos incluyen la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 4, 13-30, 119-122, 126 o 156-161, por ejemplo, la SEQ ID NO: 4 o 13-30. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del segmento corto incluye o consiste en los residuos de aminoacidos 1-5, 2-5, 3-5, 4-5 o 5, por ejemplo, consiste en los residuos de aminoacidos 1-5, de SEQ ID NO: 4; residuos de aminoacidos 1-10 de la SEQ ID NO: 17; residuos de aminoacidos 1-5 de la SEQ ID NO: 19; residuos de aminoacidos 1-3 de la SEQ ID NO: 20; residuos de aminoacidos 1-5 de la SEQ ID NO: 21; o residuos de aminoacidos 1-6 de la SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del segmento corto y el dominio de anillo juntos incluyen o consisten en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del segmento corto y el dominio de anillo juntos incluyen o consisten en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 119-122, 126 o 156-161 (por ejemplo, donde X en la SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, Asp, Gly, Ala, Ser, Val, Trp, Asn, Gln, His o Lys, por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro o Asp, por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala o Ser, por ejemplo, Phe o Leu, por ejemplo, Phe, por ejemplo, Leu). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la extension N-terminal incluye residuos de aminoacidos 1 31 o 17-31 de la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la extension N-terminal incluye residuos de aminoacidos 17-31 de la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la extension N-terminal incluye KGANKK (SEQ ID NO: 314) o KGANQK (SEQ ID NO: 315). En algunas realizaciones, la extension N-terminal, segmento corto y dominio de anillo juntos incluyen la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la extension C-terminal incluye la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 117 o 118 o incluye residuos de aminoacidos 23-37 seleccionados de entre cualquiera de las SEQ ID NO: 101 116. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del NP consiste en las SEQ ID NO: 4 u 11 o la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 31-94 o un fragmento de la misma que incluye al menos un dominio de anillo o la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 13-29, 100-116, 119-125, 127-233 o 1001 1155.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Phe. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Leu. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Ile. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Thr. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Glu. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Arg. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Tyr. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Cys.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Pro. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Asp. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Gly. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Ala. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Ser. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Val. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Trp. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Asn. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Gln. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser His. En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP puede incluir los aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 puede ser Lys. En algunas realizaciones, V y / o W estan ausentes.

En algunas realizaciones, V y / o W incluye una region de fragmento cristalizable (Fc). En algunas realizaciones, la Fc incluye un dominio C^h2, un dominio C^h3 y una region bisagra o la Fc es un dominio constante de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4, por ejemplo, IgG-1. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la Fc incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 401. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la Fc incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 401.

En algunas realizaciones, V y / o W incluye una region rica en glicina.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de V o W consiste en una o mas glicinas y en una o mas serinas. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de V o W incluye [(Gly)m(Ser)]n(Gly)p o (Gly)p[(Ser)(Gly)m]n, donde cada uno de m, n y p esta, independientemente, entre 0 y 20. En algunas realizaciones, m esta entre 1 y 6; n esta entre 1 y 10; y p esta entre 0 y 4, por ejemplo, m es 4 y n es 1-6. En algunas realizaciones, las combinaciones de m, n y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2 o la secuencia de aminoacidos de V o W incluye la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 301-391.

En algunas realizaciones, V y / o W no incluye una fraccion dirigida al hueso.

En algunas realizaciones, V y / o W incluye una fraccion dirigida al hueso, por ejemplo, que incluye 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 residuos acidos consecutivos, por ejemplo, acido aspartico o acido glutamico. En algunas realizaciones, la fraccion dirigida al hueso incluye o consiste en E6, E⁷, E8, Eg, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D6, D⁷, D8, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo, E6, E¹⁰, D6, o D¹⁰.

En algunas realizaciones, V y / o W incluye una secuencia de escision de catepsina (por ejemplo, catepsina K). En algunas realizaciones, la secuencia de escision de catepsina es HGPQG (SEQ ID NO: 374) o HKLRG (SEQ ID NO:

375).

En algunas realizaciones, el polipeptido incluye la estructura V-NP-W, donde NP es un peptido natriuretico que es un agonista del receptor B del peptido natriuretico (NPR-B), cada uno de V y W esta, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y el NP incluye la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 17-29, 31-40, 42-94, 101-116, 119-122, 128-161 o 163-233 o V o W incluye la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 304-313, 322-333 o 337-391.

En algunas realizaciones, el polipeptido incluye la estructura V-NP o NP-W, donde NP es un peptido natriuretico que es un agonista del receptor B del peptido natriuretico (NPR-B), y cada uno de V y W incluye, independientemente, la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 304-313, 322-333 o 337-391.

En algunas realizaciones, el polipeptido incluye la estructura X-Fc-Y-NP-Z o la estructura X-NP-Y-Fc-Z, donde NP es el peptido natriuretico que es un agonista del receptor B del peptido natriuretico (NPR-B) (por ejemplo, cualquier NP descrito en el presente documento), y cada uno de X, Y y Z esta, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. En algunas realizaciones, Y incluye una region rica en glicina. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de Y consiste en una o mas glicinas y en una o mas serinas. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de Y incluye [(Gly)m(Ser)]n(Gly)p o (Gly)p[(Ser)(Gly)m]n, donde cada uno de m, n y p esta, independientemente, entre 0 y 20. En algunas realizaciones, m esta entre 1 y 6; n esta entre 1 y 10; y p esta entre 0 y 4, por ejemplo, m es 4 y n es 1-6. En algunas realizaciones, las combinaciones de m, n y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2 o la secuencia de aminoacidos de Y incluye la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 301-389. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de Y consiste en [(Gly)m(Ser)]n(Gly)por (Gly)p[(Ser)(Gly)m]n, donde las combinaciones de m, n y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2 o la secuencia de aminoacidos de Y consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ

ID NO: 301-389. En algunas realizaciones, X esta ausente, Z esta ausente o tanto X como Z estan ausentes. En algunas realizaciones, X, Y o Z incluye una fraccion dirigida al hueso, por ejemplo, que incluye 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15 o 16 residuos acidos consecutivos, por ejemplo, acido aspartico o acido glutamico. En algunas realizaciones, la fraccion dirigida al hueso incluye o consiste en E6, E⁷, E8, Eg, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D6, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo, E6, E¹⁰, D6, o D¹⁰.

En algunas realizaciones, X, Y o Z incluye una secuencia de escision de catepsina (por ejemplo, catepsina K). En algunas realizaciones, la secuencia de escision de catepsina incluye o consiste en HGPQ^g(SEQ ID NO: 374) o HKLRG (SEQ ID NO: 375).

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del segundo polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 501-608, por ejemplo, las S^eQ ID ⁿO: 502, 504, 506, 512, 514, 516,

530, 560, 562, 564, 572, 574, 576, 584, 586, 588, 596, 598, 600 o 608, por ejemplo, las SEQ ID NO: 504, 512, 530,

554, 572 o 578, por ejemplo, la SEQ ID NO: 512. En algunas realizaciones, el aminoacido del polipeptido incluye una fraccion dirigida al hueso, por ejemplo, E6, E⁷, Es, E⁹, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D¹⁴, D¹⁵o D¹⁶, por ejemplo, E6, E¹⁰, D6 o D¹⁰.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del polipeptido incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 504,

512, 530, 554, 572 o 578, por ejemplo, las SEQ ID NO: 504, 512, 530 o 572, por ejemplo, la SEQ ID NO: 512. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 504, 512, 530, 554, 572 o 578, por ejemplo, las SEQ ID NO: 504, 512, 530 o 572, por ejemplo, la SEQ ID NO: 512. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del segundo polipeptido consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 504, 512, 530 o 572, por ejemplo, la SEQ ID NO: 512.

En algunas realizaciones, el segundo polipeptido incluye la estructura X-Fc-Y-NP-Z o la estructura X-NP-Y-Fc-Z, donde

NP es un peptido natriuretico que es un agonista del receptor B del peptido natriuretico (NPR- B), y donde: (i) NP incluye los aminoacidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, donde el aminoacido en la posicion 17 no es Met; y cada uno de X,

Y y Z esta, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido; o (ii) cada uno de X y Z esta, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido; y la secuencia de aminoacidos de Y incluye [(Gly)4(Ser)]n(Gly)p o (Gly)p[(Ser)(Gly)4]n, donde n esta entre 1 y 10 y p esta entre 0 y 4 o donde las combinaciones de m, n y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2 o donde la secuencia de aminoacidos de Y incluye la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 304-313, 322

333 o 337-391.

En algunas realizaciones, el segundo polipeptido incluye la estructura X-Fc-Y-NP-Z.

En algunas realizaciones, (i) NP incluye los aminoacidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, donde el aminoacido en la posicion 17 no es Met; y cada uno de X, Y y Z esta, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. En algunas realizaciones, el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala o Ser. En algunas realizaciones, el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, Asp, Gly, Ala, Ser, Val, Trp, Asn, Gln, His o Lys, por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro o Asp, por ejemplo, Phe o Leu, por ejemplo, Phe, por ejemplo, Leu. En algunas realizaciones, el NP incluye la estructura: [extension N-terminal]-[segmento corto]-[dominio de anillo]-[extension C-terminal], donde dicho dominio de anillo incluye la secuencia de aminoacidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, donde el aminoacido en la posicion 17 no es Met y cada uno de dicha extension N-terminal, segmento corto y extension C-terminal esta, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de dicho NP incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 119-125 o 156-220, donde la posicion 17 relativa a la SEQ ID NO: 126 no es Met o la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 221-233.

En algunas realizaciones, (ii) cada uno de X y Z esta, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido; y la secuencia de aminoacidos de Y comprende [(Gly)4(Ser)]n(Gly)por (Gly)p[(Ser)(Gly)4]n, donde n esta entre 1 y 10 y p esta entre 0 y 4 o donde la secuencia de aminoacidos de Y comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 304-313, 322-333 o 337-391. En algunas realizaciones, el NP incluye la estructura: [extension N-terminal]-[segmento corto]-[dominio de anillo]-[extension C-terminal], donde el dominio de anillo incluye la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: ⁶, aminoacidos 11-27 de SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 95, y cada uno de la extension N-terminal, segmento corto y extension C-terminal esta, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. En algunas realizaciones, el dominio de anillo incluye aminoacidos 6-22 de SEQ ID NO: 126. En algunas realizaciones, el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala o Ser. En algunas realizaciones, el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, Asp, Gly, Ala, Ser, Val, Trp, Asn, Gln, His o Lys, por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro o Asp, por ejemplo, Phe o Leu, por ejemplo, Phe, por ejemplo, Leu. En algunas realizaciones, el dominio de anillo incluye la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el segmento corto y el dominio de anillo juntos incluyen la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 o 13-30. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del segmento corto y el dominio de anillo juntos consisten en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del segmento corto y el dominio de anillo juntos consisten en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 119-122, ¹²⁶o 156-161 (por ejemplo, donde X en la SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, Asp, Gly, Ala, Ser, Val, Trp, Asn, Gln, His o Lys, por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro o Asp, por ejemplo, Phe o Leu, por ejemplo, Phe, por ejemplo, Leu). En algunas realizaciones, la extension N-terminal, segmento corto y dominio de anillo juntos incluyen la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del NP consiste en la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del NP consiste en la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del NP consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 31 94 o un fragmento de la misma que incluye al menos un dominio de anillo. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del NP incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 13-29, 100 116, 119-125, 127-233 o 1001-1155.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del segmento corto consiste en aminoacidos 1-5 de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del segmento corto consiste en aminoacidos 1-5, 2-5, 3-5, 4-5 o 5 de SEQ ID NO: 4, aminoacidos 1-10 de SEQ ID NO: 17, aminoacidos 1-5 de SEQ ID NO: 19, aminoacidos 1-3 de SEQ ID NO: 20, aminoacidos 1-5 de SEQ ID NO: 21 o aminoacidos 1-6 de SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la extension N-terminal incluye aminoacidos 1-31 de SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la extension N-terminal incluye aminoacidos 17-31 de SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la extension N-terminal incluye KGANKK (SEQ ID NO: 314) o KGANQK (SEQ ID NO: 315). En algunas realizaciones, la extension C-terminal incluye la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 117 o aminoacidos 23-37 seleccionados de entre cualquiera de las SEQ ID NO: 101-116.

En algunas realizaciones, el NP es selectivo para NPR-B sobre NPR-A, donde la relacion EC50(^npr-^a) /EC50(^npr-^b) para el NP, de acuerdo con lo determinado en un ensayo farmacocinetico in vivo, es al menos 30.

En algunas realizaciones, la Fc incluye un dominio C^h2, un dominio C^h3y una region bisagra. En algunas realizaciones, la Fc es un dominio constante de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-3 e IgG-4. En algunas realizaciones, la Fc incluye la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 401. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina es IgG-1. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la Fc incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 401 o incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 401.

En algunas realizaciones, Y incluye una region rica en glicina o la secuencia de aminoacidos de Y consiste en una o mas glicinas y en una o mas serinas. Por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de Y puede incluir [(Gly)m(Ser)]n(Gly)p o (Gly)p[(Ser)(Gly)m]n, donde cada uno de m, n y p esta, independientemente, entre 0 y 20. En algunas realizaciones, m es 0-20 (por ejemplo, m es 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-11, 3-12, 3-14, 3-15, 3-16, 3-17, 3-18, 3-19, 3-20, 4-6, 4-7, 4 8, 4-9, 4-10, 4-11, 4-12, 4-14, 4-15, 4-16, 4-17, 4-18, 4-19, 4-20, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 5-11, 5-12, 5-14, 5-15, 5-16, 5-17, 5-18, 5-19, 5-20, 6-7, 6-8, 6-9, 6-10, 6-11, 6-12, 6-14, 6-15, 6-16, 6-17, 6-18, 6-19, 6-20, 7-8, 7-9, 7-10, 7-11, 7 12, 7-14, 7-15, 7-16, 7-17, 7-18, 7-19, 7-20, 8-9, 8-10, 8-11, 8-12, 8-14, 8-15, 8-16, 8-17, 8-18, 8-19, 8-20, 9-10,9-11, 9-12, 9-14, 9-15, 9-16, 9-17, 9-18, 9-19, 9-20, 10-11, 10-12, 10-14, 10-15, 10-16, 10-17, 10-18, 10-19 o 10-20). En algunas realizaciones, m es 4 y n es 1-6. En algunas realizaciones, las combinaciones de m, n y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2 o la secuencia de aminoacidos de Y incluye la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 304-313, 322-333 o 337-391. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de Y consiste en [(Gly)m(Ser)]n(Gly)por (Gly)p[(Ser)(Gly)m]n, donde las combinaciones de m, n y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2 o la secuencia de aminoacidos de Y consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 304-313, 322-333 o 337-391.

En algunas realizaciones, X esta ausente, Z esta ausente o tanto X como Z estan ausentes.

En algunas realizaciones, X, Y o Z incluye una fraccion dirigida al hueso, por ejemplo, que incluye 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 residuos acidos consecutivos, por ejemplo, acido aspartico o acido glutamico. En algunas realizaciones, la fraccion dirigida al hueso incluye o consiste en E6, E⁷, Es, Eg, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D6, D⁷, D8, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo, E6, E¹⁰, D6, o D¹⁰.

En algunas realizaciones, el polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ

ID NO: 501-608, por ejemplo, las SEQ ID NO: 502, 504, 506, 512, 514, 516,530, 560, 562, 564, 572, 574, 576, 584, 586, 588, 596, 598, 600 o 608. En algunas realizaciones, el polipeptido incluye una fraccion dirigida al hueso, por ejemplo, E6, E⁷, E8, E⁹, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D6, D⁷, D8, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵o D¹⁶, por ejemplo, E6, E¹⁰, D6 o D¹⁰.

En algunas realizaciones, el polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 504.

En algunas realizaciones, el polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 512. En algunas realizaciones, el polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 530. En algunas realizaciones, el polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 554. En algunas realizaciones, el polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 572. En algunas realizaciones, el polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 578. En algunas realizaciones, el polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 560. En algunas realizaciones, el polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 566. En algunas realizaciones, el polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 538 (por ejemplo, donde X en la SEQ ID NO: 538 puede ser cualquier aminoacido, por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, Asp, Gly, Ala, Ser, Val, Trp, Asn, Gln, His o Lys, por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro o Asp, por ejemplo, Phe o Leu, por ejemplo, Phe, por ejemplo, Leu).

En algunas realizaciones, el polipeptido incluye la estructura V-NP.

Se describe que cualquiera de los NP o polipeptidos descritos en el presente documento se pueden utilizar en combinacion con el procedimiento (por ejemplo, los NP o polipeptidos descritos en cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de V o W incluye [(Gly)m(Ser)]n(Gly)p o (Gly)p[(Ser)(Gly)m]n, donde cada uno de m, n y p esta, independientemente, entre 0 y 20. En algunas realizaciones, m es 4 y n es 1-6. En algunas realizaciones, V esta ausente, W esta ausente o V y W estan ambas ausentes. En algunas realizaciones, V y / o W incluye una fraccion dirigida al hueso, por ejemplo, E6, E⁷, Es, E⁹, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D6, D⁷, Ds, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵o D¹⁶, por ejemplo, E6, E¹⁰, D6 o D¹⁰. En algunas realizaciones, V y / o W incluye una secuencia de escision de catepsina (por ejemplo, catepsina K), por ejemplo, HGPQG (SEQ ID NO: 374) o HKLRG (SEQ ID NO: 375).

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, el polipeptido en la composicion farmaceutica para el uso de la invencion, por ejemplo, el polipeptido de sALP y / o el polipeptido de NP, esta en forma dimerica. En algunas realizaciones, el polipeptido esta glicosilado o pegilado.

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la composicion farmaceutica se administra en una dosis de entre aproximadamente 0,2 mg / kg y aproximadamente 20 mg / kg del polipeptido de la composicion farmaceutica para el uso de la invencion, por ejemplo, el polipeptido de sALP y / o el polipeptido de NP, por ejemplo, el polipeptido de sALP. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra al sujeto en una dosis de entre aproximadamente 0,2 mg / kg y aproximadamente 20 mg / kg una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces al dfa. La dosis puede estar entre, por ejemplo, aproximadamente 0,5 mg / kg y aproximadamente 10 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 1 mg / kg y aproximadamente 5 mg / kg, una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces al dfa. En algunas realizaciones, la dosis es de aproximadamente 1 mg / kg, aproximadamente 2 mg / kg o aproximadamente 3 mg / kg una vez, dos veces o tres veces al dfa. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra al sujeto en una dosis de entre aproximadamente 0,2 mg / kg y aproximadamente 20 mg / kg una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces por semana. La dosis puede estar entre, por ejemplo, aproximadamente 0,5 mg / kg y aproximadamente 10 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 1 mg / kg y aproximadamente 5 mg / kg, una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces por semana. En algunas realizaciones, la dosis es de aproximadamente 1 mg / kg, aproximadamente 2 mg / kg o aproximadamente 3 mg / kg una vez, dos veces o tres veces por semana.

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la composicion farmaceutica se administra en una dosis de entre aproximadamente 0,5 mg / kg y aproximadamente 500 mg / kg del polipeptido de la composicion farmaceutica para el uso de la invencion, por ejemplo, el polipeptido de sALP y / o el polipeptido de NP, por ejemplo, el polipeptido de NP. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra al sujeto en una dosis de entre aproximadamente 0,5 mg / kg y aproximadamente 500 mg / kg una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces al dfa. La dosis puede estar entre, por ejemplo, aproximadamente 5 mg / kg y aproximadamente 200 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 10 mg / kg y aproximadamente 100 mg / kg, una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces al dfa. En algunas realizaciones, la dosis es de aproximadamente 10 mg / kg o aproximadamente 100 mg / kg dos veces al dfa. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra al sujeto en una dosis de entre aproximadamente 0,5 mg / kg y aproximadamente 500 mg / kg una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces por semana. La dosis puede estar entre, por ejemplo, aproximadamente 5 mg / kg y aproximadamente 200 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 10 mg / kg y aproximadamente 100 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 20 mg / kg y aproximadamente 40 mg / kg una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces por semana. En algunas realizaciones, la dosis es de aproximadamente 10 mg / kg, aproximadamente 30 mg / kg o aproximadamente 100 mg / kg una vez, dos veces o tres veces por semana.

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la composicion farmaceutica se administra en una dosis de entre aproximadamente 10 pg / kg y aproximadamente 1000 pg / kg del polipeptido de la composicion farmaceutica para el uso de la invencion, por ejemplo, el polipeptido de sALP y / o el polipeptido de NP, por ejemplo, el polipeptido de NP. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra al sujeto en una dosis de entre aproximadamente 10 pg / kg y aproximadamente 1000 pg / kg una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces por semana. La dosis puede estar entre, por ejemplo, aproximadamente 20 pg / kg y aproximadamente 800 pg / kg, por ejemplo, aproximadamente 30 pg / kg y aproximadamente 600 pg / kg, por ejemplo, aproximadamente 50 pg / kg y aproximadamente 500 pg / kg, por ejemplo, aproximadamente 100 pg / kg y aproximadamente 400 pg / kg, por ejemplo, aproximadamente 200 pg / kg y aproximadamente 300 pg / kg, una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces por semana. En algunas realizaciones, la dosis es de aproximadamente 30 pg / kg, aproximadamente 100 pg / kg, aproximadamente 300 pg / kg o aproximadamente 500 pg / kg, una vez, dos veces o tres veces por semana.

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la composicion farmaceutica se administra por via subcutanea. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra una vez, dos veces o tres veces por semana.

Se describe una composicion que incluye un primer polipeptido y un segundo polipeptido, donde a) el primer polipeptido incluye la estructura A-sALP-B, donde i) sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina, ii) A esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y iii) B esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido; y b) el segundo polipeptido incluye la estructura V-NP-W, donde i) NP es un peptido natriuretico que es un agonista del receptor B del peptido natriuretico (NPR-B), ii) V esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y iii) W esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido.

En una realizacion preferida, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende: (a) un polipeptido que comprende la estructura A-sALP-B; y

(b) un excipiente farmaceuticamente aceptable,

donde

sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina,

A esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y

B es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente,

para su uso en un procedimiento para tratar la neurofibromatosis en un sujeto,

donde dicha composicion comprende ademas un segundo polipeptido que comprende la estructura V-NP-W, donde la secuencia de aminoacidos de dicho segundo polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 572, 501-571 y 573-608, preferentemente la secuencia de aminoacidos del segundo polipeptido comprende la SEQ ID NO: 572.

En algunas realizaciones, el primer polipeptido es cualquier polipeptido de sALP descrito en el presente documento, por ejemplo, como se describe para el primer aspecto. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del primer polipeptido incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 120l, 1204, 1220 o 1221, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1204. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del primer polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1204.

En algunas realizaciones, el segundo polipeptido es cualquier polipeptido de NP descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del polipeptido incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 504, 512, 530, 554, 572 o 578, por ejemplo, la SEQ ID NO: 512. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del segundo polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 512.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del primer polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1204 o 1221 y la secuencia de aminoacidos del segundo polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 504, 512, 530 o 572.

En algunas realizaciones, el primer polipeptido y / o el segundo polipeptido estan en forma dimerica. En algunas realizaciones, el primer polipeptido y / o el segundo polipeptido estan glicosilados o pegilados.

En algunas realizaciones, la composicion es una composicion farmaceutica que incluye un excipiente farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, salino. En algunas realizaciones, la composicion esta liofilizada.

En algunas realizaciones, el primer polipeptido esta presente en una dosis de entre aproximadamente 0,2 mg / kg y aproximadamente 20 mg / kg y el segundo polipeptido esta presente en una dosis de entre aproximadamente 0,5 mg / kg y aproximadamente 500 mg / kg. En algunas realizaciones, el primer polipeptido esta presente en una dosis de entre aproximadamente 0,2 mg / kg y aproximadamente 20 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 0,5 mg / kg y aproximadamente 10 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 1 mg / kg y aproximadamente 5 mg / kg, para una administracion de una vez al dfa, dos veces al dfa, tres veces al dfa, cuatro veces al dfa, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana o cuatro veces a la semana, por ejemplo, aproximadamente 1 mg / kg, aproximadamente 2 mg / kg o aproximadamente 3 mg / kg para una administracion de una vez al dfa, dos veces al dfa, cuatro veces al dfa, una vez a la semana, dos veces a la semana o tres veces a la semana; y el segundo polipeptido esta presente en una dosis entre aproximadamente 0,5 mg / kg y aproximadamente 500 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 5 mg / kg y aproximadamente 200 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 10 mg / kg y aproximadamente 100 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 20 mg / kg y aproximadamente 40 mg / kg, para una administracion de una vez al dfa, dos veces al dfa, tres veces al dfa, cuatro veces al dfa, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana o cuatro veces a la semana, por ejemplo, aproximadamente 10 mg / kg, aproximadamente 30 mg / kg o aproximadamente 100 mg / kg, para una administracion de una vez al dfa, dos veces al dfa, tres veces al dfa, una vez a la semana, dos veces a la semana o tres veces a la semana.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del primer polipeptido incluye la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1204 y la secuencia de aminoacidos del segundo polipeptido incluye la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 512.

Se describe un procedimiento para tratar una enfermedad o una afeccion en un sujeto, incluyendo el procedimiento la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de un primer polipeptido y un segundo polipeptido, donde a) el primer polipeptido incluye la estructura A-sALP-B, donde i) sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina, ii) A esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y iii) B esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido; y b) el segundo polipeptido incluye la estructura V-NP-W, donde i) NP es un peptido natriuretico que es un agonista del receptor B del peptido natriuretico (NPR-B) , ii) V esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y iii) W esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido; y la enfermedad o la afeccion se seleccionan del grupo que consiste en un sfndrome neurocutaneo, un trastorno asociado con la sobreactivacion de FGFR3, un trastorno oseo o de cartflago, un trastorno del musculo liso vascular y una afeccion por elongacion del hueso. En algunas descripciones, la enfermedad o la afeccion en el sujeto se trata de este modo.

(b) un excipiente farmaceuticamente aceptable,

donde

sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina,

A esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y

B es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente,

para su uso en un procedimiento para tratar la neurofibromatosis en un sujeto, donde dicha composicion comprende ademas un segundo polipeptido que comprende la estructura V-NP-W, donde la secuencia de aminoacidos de dicho segundo polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 572, 501-571 y 573 608, preferentemente la secuencia de aminoacidos del segundo polipeptido comprende la SEQ ID NO: 572.

En algunas realizaciones, el primer polipeptido es cualquier polipeptido descrito en el presente documento que incluye sALP, por ejemplo, cualquier polipeptido de sALP descrito en el presente documento, por ejemplo, como descrito anteriormente. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del primer polipeptido incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 1201, 1204, 1220 o 1221, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1204. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del primer polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1204.

En algunas realizaciones, el segundo polipeptido es cualquier polipeptido descrito en el presente documento que incluye NP, por ejemplo, cualquier polipeptido de NP descrito en el presente documento, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del polipeptido incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 504, 512, 530, 554, 572 o 578, por ejemplo, la SEQ ID NO: 512. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del segundo polipeptido incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 512.

En algunas realizaciones, el primer polipeptido y el segundo polipeptido se administran dentro de diez dfas, cinco dfas o veinticuatro horas el uno del otro, por ejemplo, dentro de diez, nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres o dos dfas el uno del otro o dentro de veinticuatro, doce, once, diez, nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una hora(s) el uno del otro.

En algunas realizaciones, el primer polipeptido y el segundo polipeptido se administran simultaneamente. En algunas realizaciones, el primer polipeptido y el segundo polipeptido se formulan juntos en una composicion o cada uno por separado en una composicion. En algunas realizaciones, la composicion es una composicion farmaceutica que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, salino. En algunas realizaciones, la composicion esta liofilizada. En algunas realizaciones, la composicion es cualquier composicion, por ejemplo, una composicion farmaceutica, descrita en el presente documento.

Se describe un kit que incluye: a) un primer polipeptido que incluye la estructura A-sALP-B, donde i) sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina, ii) A esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido y iii) B esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido; y b) instrucciones para administrar el primer polipeptido a un paciente diagnosticado o con riesgo de desarrollar un sfndrome neurocutaneo. En algunas realizaciones, el primer polipeptido es cualquier polipeptido descrito en el presente documento que incluye sALP, por ejemplo, cualquier polipeptido de sALP descrito en el presente documento, por ejemplo, como se ha descrito en cualquiera de los aspectos anteriores.

En alguna realizacion de la presente invencion, el kit incluye ademas (c) un segundo polipeptido que incluye la estructura V-NP-W, donde i) NP es un peptido natriuretico que es un agonista del receptor B del peptido natriuretico (NPR-B), ii) V esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y iii) W esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. En algunas realizaciones, el segundo polipeptido es cualquier polipeptido descrito en el presente documento que incluye NP, por ejemplo, cualquier polipeptido de NP descrito en el presente documento, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente.

Se describe un kit que incluye: a) un polipeptido que incluye la estructura V-NP-W, donde i) NP es un peptido natriuretico que es un agonista del receptor B del peptido natriuretico (NPR-B), ii) V esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y iii) W esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido; y b) instrucciones para administrar el polipeptido a un paciente diagnosticado o con riesgo de desarrollar un sfndrome neurocutaneo. En alguna descripcion, el polipeptido es cualquier polipeptido descrito en el presente documento que incluye NP, por ejemplo, cualquier polipeptido de NP descrito en el presente documento, por ejemplo, como se ha descrito en cualquiera de los aspectos anteriores.

La invencion presenta un kit que incluye: a) un primer polipeptido que incluye la estructura A-sALP-B, donde i) sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina, ii) A esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y iii) B esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido; y b) un segundo polipeptido que incluye la estructura V-NP-W, donde i) NP es un peptido natriuretico que es un agonista del receptor B del peptido natriuretico (NPR-B), ii) V esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y iii) W esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. En algunas realizaciones, el primer polipeptido es cualquier polipeptido descrito en el presente documento que incluye sALP, por ejemplo, cualquier polipeptido de sALP descrito en el presente documento, por ejemplo, como se describe en cualquiera de los aspectos anteriores; y el segundo polipeptido es cualquier polipeptido descrito en este documento que incluye NP, por ejemplo, cualquier polipeptido de N^pdescrito en este documento, por ejemplo, como se describe en cualquiera de los aspectos anteriores. En algunas realizaciones, el primer polipeptido y el segundo polipeptido se formulan juntos. En algunas realizaciones, el primer polipeptido y el segundo polipeptido se formulan por separado y en una cantidad de dosis individual.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos de la sALP incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1202, 1205, 1218 o 1219.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos de la sALP incluye o consiste en una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con los residuos de aminoacidos 23-508 de la SEQ ID NO: 1215, residuos de aminoacidos 18-498 de SEQ ID NO: 1216, residuos de aminoacidos 23-508 de SEQ ID NO: 1218, residuos de aminoacidos 18-498 de SEQ ID NO: 1219, residuos de aminoacidos 23-512 de SEQ ID NO: 1215, residuos de aminoacidos 18-502 de SEQ ID NO: 1216, residuos de aminoacidos 23-512 de SEQ ID NO: 1218 o residuos de aminoacidos 18-502 de SEQ ID NO: 1219, donde X en la SEQ ID NO: 1218 o 1219 es cualquier aminoacido pero no es un aminoacido correspondiente a una mutacion patogena en esa posicion de la TNALP humana, por ejemplo, no es un aminoacido correspondiente a una mutacion patogena proporcionada en la Tabla 1.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP incluye o consiste en residuos de aminoacidos 6-22 de la SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, Asp, Gly, Ala, Ser, Val, Trp, Asn, Gln, His o Lys, por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, Ser, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro o Asp, por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala o Ser, por ejemplo, Phe, Leu, Arg, Tyr, por ejemplo, Phe o Leu, por ejemplo, Phe, por ejemplo, Leu.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos del NP comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 13-29, 100-116, 119-125, 127-233 o 1001 1155.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, el NP es selectivo para NPR-B sobre NPR-A, donde la relacion EC50(npr-a) /EC50(npr-b) para el NP, de acuerdo con lo determinado en un ensayo farmacocinetico in vivo, es al menos 30, por ejemplo, al menos 35, 40, 35, 50, 55 o 60.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la Fc incluye un dominio Ch², un dominio Ch3 y una region bisagra o donde la Fc es un dominio constante de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4, por ejemplo, IgG-1. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la Fc incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 401. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la Fc incluye o consiste en la SEQ ID NO: 401.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos de D o Y incluye una region rica en glicina o la secuencia de aminoacidos de D o Y consiste en una o mas glicinas y en una o mas serinas. Por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de D o Y puede incluir o consistir en [(Gly)m(Ser)]n(Gly)p o (Gly)p[(Ser)(Gly)m]n, donde cada uno de m, n y p esta, independientemente, entre 0 y 20. En algunas realizaciones, m esta entre 1 y 6; n esta entre 1 y 10; y p esta entre 0 y 4, por ejemplo, m es 4 y n es 1-6. En algunas realizaciones, las combinaciones de m, n y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2 o la secuencia de aminoacidos de D o Y incluye o consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 301-391.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la secuencia de aminoacidos de D, G o Y es opcionalmente dos residuos de aminoacidos (por ejemplo, leucina-lisina o acido aspartico-isoleucina). En algunas realizaciones de un polipeptido de sALP, tanto C como E pueden estar ausentes, y D puede estar ausente o puede ser una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. Por ejemplo, el polipeptido puede consistir en la estructura sALP-D-Fc o la estructura Fc-D-sALP, donde D puede ser cualquier enlazador descrito en el presente documento u opcionalmente puede consistir en dos residuos de aminoacidos, por ejemplo, leucina-lisina. Por ejemplo, el polipeptido puede consistir en la estructura sALP-D-Fc. De manera opcional, la secuencia de aminoacidos de sALP es la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1205, la secuencia de aminoacidos de D es leucina-lisina y / o la secuencia de aminoacidos de Fc es la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 401. En otras realizaciones de un polipeptido de sALP, C puede estar ausente y tanto D como E pueden estar ausentes o pueden ser una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. Por ejemplo, el polipeptido puede incluir la estructura sALP-D-Fc-E o la estructura Fc-D-sALP-E. En otras realizaciones de un polipeptido de sALP, C puede estar ausente, y D, G y H pueden estar ausentes o pueden ser una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. Por ejemplo, el polipeptido puede incluir la estructura sALP-D-Fc-G-In-H. En algunas realizaciones de un polipeptido NP, tanto X como Z pueden estar ausentes, e Y puede estar ausente o puede ser una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. Por ejemplo, el polipeptido puede consistir en la estructura NP-Y-Fc o la estructura Fc-Y-NP, donde Y puede ser cualquier enlazador descrito en el presente documento u opcionalmente puede consistir en dos residuos de aminoacidos, por ejemplo, leucina-lisina. Por ejemplo, el polipeptido puede consistir en la estructura NP-Y-Fc.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, uno o mas de A, B, C, D, E, G, H, V, W, X, Y o Z estan ausentes. En algunas realizaciones, A esta ausente, B esta ausente o tanto A como B estan ausentes. En algunas realizaciones, C esta ausente, E esta ausente o tanto C como E estan ausentes. En algunas realizaciones, C esta ausente, H esta ausente o tanto C como H estan ausentes. En algunas realizaciones, X esta ausente, Z esta ausente o tanto X como Z estan ausentes.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, el polipeptido de la invencion, por ejemplo, el polipeptido sALP y / o el polipeptido NP, pueden incluir una fraccion dirigida al hueso, por ejemplo, incluyendo 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 residuos acidos consecutivos, por ejemplo, acido aspartico o acido glutamico, por ejemplo, E6, E⁷, E8, E⁹, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D6, D⁷, D8, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵o D¹⁶, por ejemplo, E6, E¹⁰, D6 o D¹⁰. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, uno o mas de A, B, C, D, E, V, W, X, Y o Z incluye una fraccion dirigida al hueso, por ejemplo, incluyendo 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 residuos acidos consecutivos, por ejemplo, acido aspartico o acido glutamico, por ejemplo, E6, E⁷, E8, E⁹, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D6, D⁷, D8, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵o D¹⁶, por ejemplo, E6, E¹⁰, D6 o D¹⁰.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, el polipeptido de la invencion no incluye opcionalmente una fraccion dirigida al hueso (por ejemplo, una region de acido poliaspartico o acido poliglutamico mayor que dos residuos de acido aspartico o acido glutamico consecutivos).

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, el polipeptido de la invencion puede incluir una secuencia de escision de catepsina (por ejemplo, catepsina K), por ejemplo, HGPQG (SEQ ID NO: 374) o HKLRG (SEQ ID NO: 375). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, A, B, C, D, E, G, H, V, W, X, Y o Z incluye una secuencia de escision de catepsina (por ejemplo, catepsina K).

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, el polipeptido de la invencion puede incluir un polipeptido que tiene una degradacion reducida (por ejemplo, en aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % , aproximadamente un 99 % o aproximadamente un 100 %) (por ejemplo, por endopeptidasa neutra (NEP), enzima degradante de insulina (IDE) o cualquier otra enzima que escinde un peptido natriuretico in vivo), en comparacion con un control (por ejemplo, CNP22, CNP53 o cualquier polipeptido descrito en el presente documento, tal como un peptido descrito en la publicacion de solicitud internacional N.°WO2010/135541ola publicacion de solicitud de EE. UU. N.° 2010-0331256).

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, el polipeptido de la invencion puede haber aumentado la eficacia (por ejemplo, en aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 %, aproximadamente un 100 % o mas) y / o haber reducido los efectos secundarios dependientes de la dosis (por ejemplo, en aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 % o aproximadamente un 100 %) (por ejemplo, efectos hemodinamicos adversos reducidos, como la disminucion reducida de la presion arterial), en comparacion con un control (por ejemplo, cualquier polipeptido descrito en el presente documento, como un peptido descrito en la publicacion de solicitud internacional N. °WO2010/135541ola publicacion de solicitud de EE. UU. N.° 2010-0331256).

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, el polipeptido de la invencion (por ejemplo, un polipeptido de sALP o un polipeptido de NP) esta glicosilado o pegilado. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica incluye un dfmero de uno o mas de los polipeptidos de la invencion. En algunas realizaciones, el excipiente farmaceuticamente aceptable incluye solucion salina. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica esta liofilizada. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra por via subcutanea, intravenosa, oral, nasal, intramuscular, sublingual, intratecal o intradermica, por ejemplo, por via subcutanea.

En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra al sujeto en una dosis de entre aproximadamente O, 5 mg / kg y aproximadamente 500 mg / kg una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces al dfa. La dosis puede estar entre, por ejemplo, aproximadamente 5 mg / kg y aproximadamente 200 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 10 mg / kg y aproximadamente 100 mg / kg, una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces al dfa. En algunas realizaciones, la dosis es de aproximadamente 10 mg / kg o aproximadamente 100 mg / kg dos veces al dfa.

En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra al sujeto en una dosis de entre aproximadamente 0,5 mg / kg y aproximadamente 500 mg / kg una vez o dos veces por semana. La dosis puede estar entre, por ejemplo, aproximadamente 5 mg / kg y aproximadamente 200 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 10 mg / kg y aproximadamente 100 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 20 mg / kg y aproximadamente 40 mg / kg, una vez o dos veces por semana. En algunas realizaciones, la dosis es de aproximadamente 10 mg / kg, aproximadamente 30 mg / kg o aproximadamente 100 mg / kg, una vez o dos veces por semana.

En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra al sujeto en una dosis de entre aproximadamente 10 pg / kg y aproximadamente 1000 pg / kg una vez o dos veces por semana. La dosis puede estar entre, por ejemplo, aproximadamente 20 pg / kg y aproximadamente 800 pg / kg, por ejemplo, aproximadamente 30 pg / kg y aproximadamente 600 pg / kg, por ejemplo, aproximadamente 50 pg / kg y aproximadamente 500 pg / kg, por ejemplo, aproximadamente 100 pg / kg y aproximadamente 400 pg / kg, por ejemplo, aproximadamente 200 pg / kg y aproximadamente 300 pg / kg una vez o dos veces por semana. En algunas realizaciones, la dosis es de aproximadamente 30 pg / kg, aproximadamente 100 pg / kg, aproximadamente 300 pg / kg o aproximadamente 500 pg / kg una vez o dos veces por semana.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la composicion farmaceutica se administra al sujeto en una dosis entre aproximadamente 0,1 mg / kg y aproximadamente 500 mg / kg de uno o mas de los polipeptidos de la invencion en un regimen de dosis de una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces al dfa. La dosis puede ser entre, por ejemplo, aproximadamente 1 mg / kg y aproximadamente 200 mg / kg, por ejemplo, aproximadamente 2 mg / kg y aproximadamente 100 mg / kg o aproximadamente 10 mg / kg y aproximadamente 100 mg / kg de uno o mas de los polipeptidos de la invencion en un regimen de dosis de una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces al dfa. En algunas realizaciones, la dosis es de aproximadamente 10 mg / kg o aproximadamente 100 mg / kg de uno o mas de los polipeptidos de la invencion en un regimen de dosis de dos veces al dfa. Por ejemplo, los usos de la invencion pueden incluir opcionalmente administrar una composicion farmaceutica que incluye los polipeptidos de la invencion (por ejemplo, un polipeptido de sALP y / o un polipeptido de NP) al sujeto en una dosis de aproximadamente 0,5 mg / kg / dfa a aproximadamente 10 mg / kg / dfa (por ejemplo, aproximadamente 2 mg / kg / dfa a aproximadamente 3 mg / kg / dfa).

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la composicion farmaceutica se administra al sujeto entre una y catorce veces a la semana o se administra al menos una vez al dfa durante al menos un mes. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra al sujeto una vez a la semana durante al menos un mes. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra una vez, dos veces, tres veces o cuatro veces a la semana, por ejemplo, tres veces a la semana.

Cualquiera de las composiciones farmaceuticas de la invencion puede formularse opcionalmente para tratar una enfermedad o afeccion (por ejemplo, cualquiera descrita en el presente documento) en un sujeto.

Cualquiera de la composicion farmaceutica de la invencion que presenta un acido nucleico aislado puede incluir opcionalmente un vector de expresion recombinante (por ejemplo, un vector lentiviral) que incluye el acido nucleico aislado. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica incluye aproximadamente de 0,1 mg a aproximadamente 10 mg del acido nucleico aislado.

En cualquier realizacion descrita en el presente documento, el polipeptido puede o no estar aislado.

En cualquier realizacion descrita en el presente documento, el sujeto puede ser humano.

En cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento, la combinacion de dos o mas polipeptidos de la invencion (por ejemplo, cualquier polipeptido de sALP y / o cualquier polipeptido de NP descrito en el presente documento) o dos o mas composiciones de la invencion proporciona un efecto sinergico. En realizaciones particulares, el efecto sinergico es un efecto terapeutico que se observa para la combinacion de dos o mas polipeptidos de la invencion, donde uno o mas de los polipeptidos de la invencion estan presentes en una dosis que normalmente no es terapeutica; o un efecto terapeutico que resulta en una disminucion inesperada en uno o mas eventos adversos (por ejemplo, efectos hemodinamicos, como una disminucion de la presion arterial, como la presion arterial sistolica, la presion arterial diastolica o la presion arterial media, que resulta en efectos hipotensivos adversos); o un efecto terapeutico que da como resultado efectos secundarios dependientes de la dosis reducidos, en comparacion con el nivel de efectos secundarios dependientes de la dosis observados para un solo polipeptido de la invencion a una dosis terapeutica.

En alguna descripcion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la enfermedad es el sfndrome neurocutaneo (por ejemplo, neurofibromatosis (por ejemplo, el tipo clasico de von Recklinghausen (tipo I), ya sea con tumores estromales gastrointestinales (es decir, como en la neurofibromatosis intestinal (tipo 3B)) o sin dichos tumores; un tipo de neuroma acustico (tipo II); un tipo mixto que combina las caracterfsticas de los tipos I y II con caracterfsticas predominantes, como los neuromas acusticos bilaterales, la fosa posterior y los meningiomas cervicales superiores y los neurofibromas espinales / paraespinales (tipo III, tipo Riccardi o tipo 3A); un tipo atfpico que se distingue por la falta de nodulos Lisch del iris que son caracterfsticos del tipo I (tipo VI); neurofibromatosis segmentaria, que es una variante del tipo I que tiene lesiones que afectan a un area especffica del cuerpo, como un solo segmento del cuerpo o un area que cruza la lfnea media (tipo V); un tipo que tiene solo los sfntomas de manchas cafe con leche sin otras manifestaciones de neurofibromatosis (tipo VI); neurofibromatosis espinal familiar, que es causada por una mutacion en el gen NF1 de la neurofibromina y se considera una variante distinguible de tipo I; otras variantes de tipo I, como el sfndrome carcinoide de neurofibromatosis-feocromocitoma-duodenal; neurofibromatosis con manifestaciones del sfndrome de Noonan, como estatura baja, ptosis, hipoplasia de cara media, cuello reticulado, discapacidades de aprendizaje y debilidad muscular; y schwannomatosis, donde cualquiera de estos trastornos puede incluir o excluir una o mas manifestaciones oseas); esclerosis tuberosa; enfermedad de Sturge-Weber; ataxia telangiectasia; enfermedad de von Hippel-Lindau; incontinentia pigmenti; sfndromes del nevo epidermico, como el nevo sebaceo lineal de Jadassohn; sfndrome de carcinoma nevoide de celulas basales; hipomelanosis de Ito; melanosis neurocutanea; sfndrome de Klippel-Ternaunay; y sfndrome de Waardenburg, incluyendo los tipos I, II, III y IV). En alguna descripcion, el sfndrome neurocutaneo tiene una o mas manifestaciones oseas. En alguna descripcion, el sfndrome neurocutaneo es una neurofibromatosis tipo I. En alguna descripcion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la enfermedad es cualquier sfndrome (por ejemplo, un sfndrome neurocutaneo) con senalizacion RAS y / o ERK sobreactivada (por ejemplo, sfndrome de Noonan, sfndrome de Costello, sfndrome de Noonan con lentiginosis multiple / sfndrome LEOPARD, neurofibromatosis tipo 1, fibromatosis gingival hereditaria tipo 1, sfndrome de NF1-Noonan, sfndrome de malformacion capilar-malformacion AV, sfndrome de Legius, trastorno similar al sfndrome de Noonan con cabello anageno suelto, trastorno similar al sfndrome de Noonan con leucemia mielomonocftica juvenil (JMML), sfndrome cardio-facio-cutaneo o sfndrome linfoproliferativo autoinmune, donde cualquiera de estos trastornos puede incluir o excluir una o mas manifestaciones oseas). En alguna descripcion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el trastorno asociado con la sobreactivacion de FGFR3 es un trastorno oseo o de cartflago, por ejemplo, una displasia esqueletica, tal como cualquiera de los descritos en el presente documento, por ejemplo, acondroplasia o craneosinostosis. En alguna descripcion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el trastorno es un trastorno oseo o de cartflago, por ejemplo, una displasia esqueletica, tal como cualquiera de los descritos en el presente documento. En alguna descripcion, el trastorno oseo o de cartflago es una displasia esqueletica, por ejemplo, acondroplasia, acondroplasia homocigotica, acondroplasia heterocigotica, acondrogenesis, acrodisostosis, displasia acromesomelica, atelosteogenesis, displasia campomelica, condrodisplasia punctata, condrodisplasia punctata del tipo rizomelico, disostosis cleidocraneal, femur corto congenito, craneosinostosis (por ejemplo, el sfndrome de Muenke, el sfndrome de Crouzon, el sfndrome de Apert, el sfndrome de Jackson-Weiss, el sfndrome de Pfeiffer o el sfndrome dermoesqueletico de Crouzon), dactilia, braquidactilia, campodactilia, polidactilia, sindactilia, displasia diastrofica, enanismo, displasia disegmentaria, encondromatosis, fibrocondrogenesis, displasia fibrosa, exostosis multiple hereditaria, hipocondroplasia, hipofosfatasia, raquitismo hipofosfatemico, sfndrome de Jaffe-Lichtenstein, displasia de Kniest, sfndrome de Kniest, displasia mesomelica tipo Langer, sfndrome de Marfan, sfndrome de McCune-Albright, micromelia, displasia metafisaria, displasia metafisaria de tipo Jansen, displasia metatrofica, sfndrome de Morquio, displasia mesomelica de tipo Nievergelt, neurofibromatosis (por ejemplo, tipo 1, por ejemplo, con manifestaciones oseas o sin manifestaciones oseas; tipo 2; schwannomatosis; o cualquiera de las descritas en el presente documento), osteoartritis, osteocondrodisplasia, osteogenesis imperfecta, tipo perinatal letal de osteogenesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoikilosis, disostosis periferica, sfndrome de Reinhardt, sfndrome de Roberts, sfndrome de Robinow, sfndromes de costillas cortas con polidactilia, baja estatura, displasia espondiloepifisaria congenita o displasia tanatoforica. En alguna descripcion, el trastorno oseo o de cartflago es opcionalmente hipofosfatasia (por ejemplo, HPP infantil, HPP de la infancia, HPP perinatal, HPP adulta u odontohipofosfatasia). En alguna descripcion, la composicion farmaceutica se administra en una cantidad que es terapeuticamente eficaz para tratar un fenotipo de acondroplasia seleccionado del grupo que consiste en retraso del crecimiento, deformidades del craneo y defectos ortodonticos. En alguna descripcion, la composicion farmaceutica se administra en una cantidad que es terapeuticamente eficaz para tratar un fenotipo de acondroplasia seleccionado del grupo que consiste en compresion del cordon cervical, estenosis espinal, hidrocefalia, perdida de audicion debido a otitis cronica, enfermedad cardiovascular, enfermedad neurologica y obesidad. En algunas descripciones de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el trastorno asociado con la sobreactivacion de FGFR3 es cancer, por ejemplo, mieloma multiple, sfndrome mieloproliferativo, leucemia, leucemia de celulas plasmaticas, linfoma, glioblastoma, cancer de prostata, cancer de vejiga o cancer de mama. En alguna descripcion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el trastorno del musculo liso vascular es hipertension, restenosis, arteriosclerosis, insuficiencia cardfaca descompensada aguda, insuficiencia cardfaca congestiva, edema cardfaco, nefredema, edema hepatico, insuficiencia renal aguda o insuficiencia renal cronica. En alguna descripcion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la condicion para el alargamiento del hueso es insuficiente o perjudica el crecimiento oseo que surge de fracturas, insuficiencia o fallo renal, mala alimentacion, deficiencia de vitaminas, deficiencia de hormonas o cualquier displasia esqueletica descrita en el presente documento.

En cualquier procedimiento descrito en el presente documento, se trata de este modo el smdrome neurocutaneo, el trastorno asociado con la sobreactivacion de FGFR3, el trastorno oseo o de cartflago, el trastorno del musculo liso vascular o la afeccion por elongacion de hueso en el sujeto.

En alguna descripcion de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, uno o mas polipeptidos de la invencion o una o mas composiciones de la invencion se administran opcionalmente en una cantidad que es terapeuticamente eficaz para tratar un fenotipo de HPP seleccionado del grupo que consiste en convulsiones relacionadas con HPP, perdida prematura de dientes deciduos, mineralizacion incompleta de los huesos, niveles elevados de pirofosfato inorganico (PPi) en sangre y / u orina, niveles elevados de fosfoetanolamina (PEA) en sangre y / u orina, niveles elevados de piridoxal 5'-fosfato (PLP) en sangre y / u orina, aumento inadecuado de peso, raquitismo, dolor oseo, deposicion de cristales de dihidrato de pirofosfato de calcio, aplasia, hipoplasia y displasia del cemento dental. En algunas realizaciones, la mineralizacion incompleta del hueso es una mineralizacion incompleta del hueso femoral, una mineralizacion incompleta del hueso tibial, una mineralizacion incompleta del hueso metatarsiano o una mineralizacion incompleta del hueso de la costilla.

La composicion farmaceutica para el uso de la presente invencion es para su uso en un procedimiento para tratar la neurofibromatosis en un sujeto. En una realizacion preferida, la neurofibromatosis es la neurofibromatosis tipo 1. Definiciones

Tal como se emplea en el presente documento, el termino “aproximadamente” significa ± 10 % del valor mencionado. Por “area bajo la curva” o “AUC” en el contexto de un ensayo farmacocinetico in vivo se entiende el area bajo la curva de concentracion de suero en funcion del tiempo despues de la administracion en un animal.

Por “trastorno oseo o de cartHago” se entiende cualquier trastorno, enfermedad u otra anomalfa que afecte la funcion, la estructura o el crecimiento del hueso o el cartflago.

Por “fraccion dirigida al hueso” se entiende una secuencia de aminoacidos de entre 6 y 20 residuos de aminoacidos de longitud que tiene una afinidad suficiente con la matriz osea de modo que la fraccion dirigida al hueso, tomada sola, tenga una afinidad de enlace in vivo con la matriz osea que es al menos 10-6M o mejor (por ejemplo, 10-7M, 10-8M, 10 9M o mejor).

Por “secuencia de escision de catepsina” se entiende una secuencia de aminoacidos que tiene un sitio que puede escindirse por la catepsina con una constante de relacion kcat/KMde al menos 103M-1s-1 (por ejemplo, 104M-1s-1, 105M-1s-1, 106M-1S-1, 107M-1s-1 o 108M-1s-1) a 30 °C o mas (por ejemplo, 37 °C). En realizaciones particulares, la secuencia de escision de catepsina es espedfica para la catepsina K. Las secuencias de escision de catepsina ejemplares son P2-P1-P1', donde la escision por la enzima se producina en el enlace peptfdico P1-P1'; P2 esta compuesto preferentemente por Pro, Leu, Ile, pero tambien podna ser Val, Norleucina, Met o Ala; P1 es preferentemente Arg, Lys, Gln, pero tambien podna ser Met, Norleucina, Leu, Ile o Thr; y P1 ' puede ser cualquier aminoacido, pero es preferentemente Gly. Secuencias de escision de catepsina adicionales se proporcionan enChoe y col., J. Biol. Chem.

281(18):12824-832, 2006.

Por “CNP22” se entiende el CNP22 humano (SEQ ID NO: 4), a menos que se indique expresamente un significado diferente.

Por “CNP53” se entiende el CNP53 humano (SEQ ID NO: 11), a menos que se indique expresamente un significado diferente.

Por “afeccion de elongacion del hueso” se entiende cualquier trastorno, enfermedad u otra anomalfa que resultana del alargamiento de uno o mas segmentos de hueso. Despues de la administracion de cualquier polipeptido descrito en el presente documento, el alargamiento de uno o mas segmentos de hueso se puede aumentar en mas de aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 % , aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % o mas.

Por “trastorno asociado con la sobreactivacion de FGFR3” se entiende cualquier trastorno, enfermedad u otra anomalfa causada por, o asociada con, la sobreactivacion de FGFR3, por ejemplo, que se derive de una mutacion de ganancia de funcion de FGFR3.

Por “eficacia” se entiende el valor Emax de un compuesto en un ensayo de dosis-respuesta.

Por “Fc” se entiende una region de fragmento cristalizable de una inmunoglobulina, por ejemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-3 o IgG-4, incluyendo los dominios Ch²y Ch3 de la cadena pesada de inmunoglobulina. Fc tambien puede incluir cualquier porcion de la region bisagra que se une a las regiones Fab y Fc. La Fc puede ser de cualquier mamffero, incluido el humano, y puede modificarse postraduccionalmente (por ejemplo, mediante glicosilacion). En un ejemplo, Fc puede ser la region de fragmento cristalizable de la IgG-1 humana que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 401.

Por “fragmento” se entiende una porcion de un polipeptido o molecula de acido nucleico que contiene, preferentemente, al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas de la longitud total de la molecula de acido nucleico de referencia o polipeptido. Un fragmento puede contener, por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100 o mas nucleotidos, hasta la longitud total de la molecula de acido nucleico o 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 400, 500, 600, 700 o mas residuos de aminoacidos, hasta la longitud total del polipeptido. Los fragmentos de sALP ejemplares tienen residuos de aminoacidos 18-498, 18-499, 18-500, 18-501, 18-502, 18-503, 18 504, 18-505, 18-506, 18-507, 18-508 , 18-509, 18-510, 18-511 o 18-512 de una secuencia de consenso para ALP (por ejemplo, SEQ ID NO: 1215, 1216, 1218 o 1219), y puede incluir porciones N-terminal y / o C-terminal adicionales. Los fragmentos de NP ejemplares tienen al menos un dominio de anillo de consenso, por ejemplo, de SEQ ID NO: 6, 30 o 95, y pueden incluir porciones N-terminal y / o C-terminal adicionales.

Por “homologo” se entiende un polipeptido o molecula de acido nucleico que muestra al menos un 50 % de identidad con una secuencia de aminoacidos de referencia o una secuencia de acido nucleico. Dicha secuencia es generalmente al menos, por ejemplo, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica en el nivel de aminoacido o acido nucleico a una secuencia de referencia. En general, para los polipeptidos, la longitud de las secuencias de comparacion puede ser al menos de cinco residuos de aminoacidos, por ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700 o mas residuos de aminoacidos, hasta la longitud total del polipeptido. Para los acidos nucleicos, la longitud de las secuencias de comparacion generalmente puede ser de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500. 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100 o mas nucleotidos, hasta la longitud total de la molecula de acido nucleico. Se entiende que a los efectos de determinar la identidad de secuencia cuando se compara una secuencia de ADN con una secuencia de ARN, un nucleotido de timina es equivalente a un nucleotido de uracilo.

Tal como se emplea en el presente documento, cuando se hace referencia a una secuencia de polipeptido o acido nucleico que tiene “al menos X % de identidad de secuencia” con una secuencia de referencia, se entiende que al menos el X por ciento de los residuos de aminoacidos o nucleotidos en el polipeptido o acido nucleico son identicos a los de la secuencia de referencia cuando las secuencias estan alineadas de manera optima. Un alineamiento optimo de secuencias se puede determinar de varias maneras que estan dentro de la capacidad de la tecnica, por ejemplo, el algoritmo de alineamiento de Smith Waterman (Smith y col., J. Mol. Biol. 147:195-7, 1981) y BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul y col., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990). Se puede acceder a estos y otros algoritmos de alineamiento utilizando un software informatico disponible como “Best Fit” (Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489, 1981) incorporado en GeneMatcher PlusTM (Schwarz y Dayhof, Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff, M.O., Ed pp 353-358, 1979), BLAST, BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL o Megalign (DNA^sT^aR). Ademas, los expertos en la tecnica pueden determinar los parametros apropiados para medir el alineamiento, incluidos los algoritmos necesarios para lograr un alineamiento optimo en la longitud de las secuencias que se comparan.

Por “hibridar” se entiende que se empareja para formar una molecula de doble cadena entre polinucleotidos complementarios o porciones de los mismos, en diversas condiciones de rigurosidad. (Vease, por ejemplo, Wahl, G.

M. y S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507.) Por ejemplo, la concentracion de sal de alta rigurosidad generalmente sera inferior a aproximadamente 750 mM de NaCl y 75 mM de citrato trisodico, inferior a aproximadamente 500 mM de NaCl y 50 mM de citrato trisodico o inferior a aproximadamente 250 mM de NaCl y 25 mM de citrato de trisodio. Puede obtenerse una hibridacion de baja rigurosidad en ausencia de solvente organico, por ejemplo, formamida, mientras que puede obtenerse una hibridacion de alta rigurosidad en presencia de al menos aproximadamente el 35 % de formamida o al menos aproximadamente el 50 % de formamida. Las condiciones de temperatura de alta rigurosidad normalmente incluiran temperaturas de al menos aproximadamente 30 °C, 37 °C o 42 °C. Variantes de parametros adicionales, tales como el tiempo de hibridacion, la concentracion de detergente, por ejemplo, dodecilsulfato sodico (SDS), y la inclusion o exclusion de ADN portador, son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Se logran varios niveles de rigurosidad combinando estas diversas condiciones segun sea necesario. En una realizacion, la hibridacion ocurrira a 30 °C en 750 mM de NaCl, 75 mM de citrato trisodico y SDS al 1 %. En una realizacion alternativa, la hibridacion ocurrira a 37 °C en 500 mM de NaCl, 50 mM de citrato trisodico, SDS al 1 %, formamida al 35 % y 100 pg / ml de ADN de esperma de salmon desnaturalizado (ssADN). En una realizacion alternativa, la hibridacion ocurrira a 42°C en 250 mM de NaCl, 25 mM de citrato trisodico, SDS al 1 %, formamida al 50% y 200 pg / ml de ssADN. Las variaciones utiles en estas condiciones seran facilmente evidentes para los expertos en la materia.

Para la mayorfa de las aplicaciones, las etapas de lavado que siguen a la hibridacion tambien variaran en cuanto a la rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad de lavado se pueden definir por la concentracion de sal y por la temperatura. Como se ha indicado anteriormente, la rigurosidad de lavado se puede aumentar al disminuir la concentracion de sal o al aumentar la temperatura. Por ejemplo, las concentraciones de sal de alta rigurosidad para las etapas de lavado pueden ser inferiores a aproximadamente 30 mM de NaCl y 3 mM de citrato trisodico o inferiores a aproximadamente 15 mM de NaCl y 1,5 mM de citrato trisodico. Las condiciones de temperatura de alta rigurosidad para las etapas de lavado generalmente incluiran una temperatura de, por ejemplo, al menos aproximadamente 25 °C, 42 °C o 68 °C. En una realizacion, las etapas de lavado ocurriran a 25 °C en 30 mM de NaCl, 3 mM de citrato trisodico y SDS al 0,1 %. En una realizacion alternativa, las etapas de lavado ocurriran a 42 °C en 15 mM de NaCl, 1,5 mM de citrato trisodico y SDS al 0,1 %. En una realizacion alternativa adicional, las etapas de lavado ocurriran a 68 °C en 15 mM de NaCl, 1,5 mM de citrato trisodico y SDS al 0,1 %. Las variaciones adicionales en estas condiciones seran facilmente evidentes para los expertos en la materia. Los expertos en la tecnica conocen bien las tecnicas de hibridacion y se describen, por ejemplo, en Benton y Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein y Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., Ee . UU. 72:3961, 1975); Ausubel y col. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nueva York, 2001); Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nueva York); y Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.

Por “aislado” o “purificado” se entiende separado de otros componentes complementarios de manera natural. Tfpicamente, un compuesto (por ejemplo, polipeptido, acido nucleico o molecula pequena), factor, celula u otro componente se considera aislado cuando esta al menos, por ejemplo, en un 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o incluso 99 % en peso, libre de protefnas, anticuerpos, moleculas organicas naturales y otros componentes con los que esta naturalmente asociado. En algunos casos, el componente es puro al menos en un 75 %, 90 % o incluso en un 99 % en peso. Un componente aislado se puede obtener por sfntesis qufmica, separacion del factor de fuentes naturales o produccion del componente en una celula huesped recombinante que no produce el componente de forma natural. Las protefnas y las moleculas pequenas pueden ser purificadas por un experto en la tecnica utilizando tecnicas estandar tales como las descritas por Ausubel y col. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 2000). El componente es preferentemente al menos, por ejemplo, 2, 5 o 10 veces tan puro como el material de partida, segun se mide utilizando, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatograffa en columna, densidad optica, analisis de HPLC o analisis de Western (Ausubel y col., supra). Los procedimientos ejemplares de purificacion son la cromatograffa en columna, la inmunoprecipitacion y la purificacion por inmunoafinidad de perlas magneticas.

Por “peptido natriuretico que es un agonista del receptor B del peptido natriuretico (abreviado “NP”) se entiende un peptido natriuretico como se describe en el presente documento, por ejemplo, CNP22 humano (SEQ ID NO: 4), o una variante del mismo, que es capaz de agonizar NPR-B, por ejemplo, NPR-B humano, con al menos 0,000001,0,000005, 0,00001, 0,00005, 0,0001, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 0,9 o 1 veces la potencia, y al menos 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 95 % o incluso 100 % la eficacia de CNP22 segun se mide en un ensayo de activacion de NPR-B estandar, por ejemplo, un ensayo de membrana o un ensayo de celulas completas, como se describe en el presente documento. Las variantes de NP pueden incluir una o mas sustituciones, adiciones o supresiones en relacion con CNP22 y tienen la capacidad de agonizar NPR-B. Un NP como se describe en el presente documento puede incluir cualquier otra secuencia o fraccion, unida covalentemente o no covalentemente, siempre y cuando el NP tenga la capacidad de agonizar NPR-B.

Por “sfndrome neurocutaneo” se entiende un trastorno neurologico con una o mas manifestaciones cutaneas, como lesiones en la piel y / o el ojo. Dichos sfndromes pueden estar acompanados opcionalmente por tumores benignos o malignos en multiples sitios del cuerpo.

Por “polipeptido NP” se entiende cualquier secuencia que incluya una secuencia NP, como se define en el presente documento. Los polipeptidos NP ejemplares incluyen aquellos que tienen la estructura V-NP-W, donde cada uno de V y W esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido (por ejemplo, cualquier polipeptido de fusion NP descrito en el presente documento).

Por “molecula de acido nucleico” se entiende una molecula, por ejemplo, ARN o ADN, que tiene una secuencia de dos o mas nucleotidos unidos de forma covalente, de origen natural o modificado. La molecula de acido nucleico puede ser, por ejemplo, monocatenaria o bicatenaria, y puede incluir nucleotidos modificados o no modificados o mezclas o combinaciones de los mismos. Tambien estan incluidas diversas sales, sales mixtas y formas libres de acido.

Los terminos “peptido”, “polipeptido” y “proteina” se usan indistintamente y se refieren a cualquier cadena de dos o mas residuos de aminoacidos naturales o no naturales, independientemente de la modificacion postraduccional (por ejemplo, glicosilacion o fosforilacion), que constituyen todo o parte de un polipeptido o peptido de origen natural o no natural, como se describe en el presente documento.

Tal como se emplea en el presente documento, un aminoacido natural es un aminoacido a natural que tiene la configuracion L, como los que normalmente se producen en los polipeptidos naturales. El aminoacido no natural se refiere a un aminoacido que normalmente no aparece en los polipeptidos, por ejemplo, un epfmero de un aminoacido a natural que tiene la configuracion L, es decir, un aminoacido que tiene la configuracion D no natural; o una mezcla isomerica (D, L) de los mismos; o un homologo de dicho aminoacido, por ejemplo, un aminoacido p, un aminoacido a, a-disustituido o un aminoacido a donde la cadena lateral del aminoacido ha sido acortada por uno o dos grupos de metileno o alargada hasta 10 atomos de carbono, como un acido a-amino-alcanoico con hasta 5 e incluyendo 10 atomos de carbono en una cadena lineal, un aromatico no sustituido o sustituido (a-arilo o a-aril-alquilo inferior), por ejemplo, una fenilalanina sustituida o fenilglicina.

Por “portador farmaceuticamente aceptable” o “excipiente farmaceuticamente aceptable” se entiende un portador o excipiente que es fisiologicamente aceptable para el paciente tratado mientras retiene las propiedades terapeuticas del compuesto con el que se administra. Una sustancia portadora farmaceuticamente aceptable ejemplar es una solucion salina fisiologica. Los expertos en la tecnica conocen otros portadores fisiologicamente aceptables y sus formulaciones y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.

Por “composicion farmaceutica” se entiende una composicion que contiene un polipeptido o molecula de acido nucleico como se describe en el presente documento formulado con un excipiente farmaceuticamente aceptable, y fabricada o vendida con la aprobacion de una agencia reguladora gubernamental como parte de un regimen terapeutico para el tratamiento o prevencion de una enfermedad o evento en un sujeto. Las composiciones farmaceuticas pueden formularse, por ejemplo, para administracion subcutanea, administracion intravenosa (por ejemplo, como una solucion esteril libre de embolos particulados y en un sistema solvente adecuado para uso intravenoso), para administracion oral (por ejemplo, una tableta, capsula, comprimido, capsula de gel o jarabe), o cualquier otra formulacion descrita en el presente documento, por ejemplo, en forma de dosis unitaria.

Por “potencia” se entiende el recfproco del valor EC⁵⁰de un compuesto en un ensayo de dosis-respuesta. Al comparar la potencia entre un compuesto y un control o entre un ensayo y un ensayo de control, la potencia disminuida indica un valor de EC⁵⁰aumentado, y la potencia incrementada indica un valor de EC⁵⁰disminuido, en comparacion con el valor de EC⁵⁰para el control o el ensayo de control.

Por “degradacion reducida” se entiende tener un porcentaje menor de peptido degradado despues de la exposicion a una enzima durante al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 60, 120, 180 o 240 minutos o mas o cualquier rango entre cualquiera de estos dos valores, en comparacion con un porcentaje de control degradado, como CNP22, CNP53 o cualquier polipeptido descrito en el presente documento, como un peptido descrito en la publicacion de solicitud internacional N.°Wo2010/135541ola publicacion de solicitud de EE. UU. N.° 2010-0331256. El porcentaje de peptido degradado puede ser inferior en aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 %, donde el porcentaje de peptido degradado puede determinarse midiendo el porcentaje de peptido degradado directa o indirectamente midiendo el porcentaje de peptido remanente despues de la exposicion a una enzima (por ejemplo, endopeptidasa neutra, enzima que degrada la insulina y cualquier otra enzima que escinde un peptido natriuretico in vivo) y restando este porcentaje del peptido restante del 100 %. El porcentaje de peptido degradado o peptido restante se puede medir mediante cualquier procedimiento util, como cromatograffa lfquida (por ejemplo, cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC)), espectrometrfa de masas (MS) o tecnicas analfticas combinadas (por ejemplo, LC-MS).

Por “efecto secundario dependiente de la dosis reducida” se entiende una disminucion de uno o mas efectos adversos en funcion de la dosis de un compuesto, en comparacion con un control (por ejemplo, cualquier polipeptido descrito en el presente documento, como un peptido descrito en la publicacion de solicitud internacional N.° WO20l0/135541ola publicacion de solicitud de EE. UU. N.° 2010-0331256). La disminucion de uno o mas efectos adversos puede ser de aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 % , aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 %, segun lo determinado por cualquier ensayo util para detectar el efecto adverso. Los efectos adversos ejemplares incluyen efectos hemodinamicos, como una disminucion de la presion arterial, como la presion arterial sistolica, la presion arterial diastolica o la presion arterial media, que produce efectos hipotensivos adversos, y los ensayos para detectar dichos efectos hemodinamicos incluyen un esfigmomanometro o un transductor de presion implantado.

Los terminos “sALP”, “fosfatasa alcalina soluble” y “dominio extracelular de una fosfatasa alcalina” se usan indistintamente y significan una fosfatasa alcalina no unida a la membrana o un dominio, un fragmento biologicamente activo o una variante biologicamente activa de los mismos. Las sALP incluyen, por ejemplo, una fosfatasa alcalina que carece de una secuencia de senal GPI de C-terminal, por ejemplo, un polipeptido que incluye o consiste en los residuos de aminoacidos 18-502 de TNALP humano (SEQ ID NO: 1208). Las sALP incluyen ademas, por ejemplo, formas solubles no unidas a la membrana de ortologos de mamfferos de TNALP humano (por ejemplo, polipeptidos que incluyen o consisten en los residuos de aminoacidos 16-502 o 18-502 de SEQ ID NO: 1206, residuos de aminoacidos 18-502 de SEQ ID NO: 1207, residuos de aminoacidos 18-502 de SEQ ID NO: 1209, residuos de aminoacidos 18-502 de SEQ ID NO: 1210 o residuos de aminoacidos 1-480 de SEQ ID NO: 1211), formas solubles no unidas a la membrana de IALP, GALP y PLALP humanos (por ejemplo, polipeptidos que incluyen o consisten en los residuos de aminoacidos 20-503 de SEQ ID NO: 1212, residuos de aminoacidos 20-503 de SEQ ID NO: 1213 o residuos de aminoacidos 23 506 de SEQ ID NO: 1214), y variantes adicionales y analogas de los mismos que retienen la actividad de la fosfatasa alcalina, por ejemplo, la capacidad de hidrolizar PPi.

Por “polipeptido de sALP” se entiende cualquier secuencia que incluya una secuencia de sALP, como se define en el presente documento. Los polipeptidos de sALP ejemplares incluyen aquellos que tienen la estructura A-sALP-B, donde cada uno de A y B esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido (por ejemplo, cualquier polipeptido de fusion de sALP descrito en el presente documento).

Por “selectivo para NPR-B sobre NPR-A” se entiende que tiene una relacion EC50(^npr-^a)/EC50(^npr-^b) que es al menos 1,25, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1100, 1200, 1250, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 10.000 o mas o cualquier rango entre cualquiera de estos dos valores, en un ensayo de dosis-respuesta in vivo o in vitro, por ejemplo , midiendo la produccion de cGMP, como se describe en el presente documento. De manera alternativa o adicional, el termino “selectivo para NPR-B sobre NPR-A” significa tener una relacion AUC(npr-b)/AUC(npr-a) que es al menos 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,75, 1,8, 1,9, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1250, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 10.000 o mas o cualquier rango entre cualquiera de estos dos valores, como se describe en el presente documento.

Por “peptido de senal” o “secuencia de senal” se entiende una secuencia de aminoacidos que dirige un polipeptido a la membrana celular de modo que el polipeptido se secreta. De manera alternativa, la secuencia de senal puede dirigir el polipeptido a un compartimento u organulo intracelular, tal como el aparato de Golgi. Una secuencia de senal puede identificarse por homologfa o actividad biologica, con una secuencia peptfdica con la funcion conocida de dirigir un polipeptido a una region particular de la celula. Un experto en la tecnica puede identificar una secuencia de senal mediante el uso de software facilmente disponible (por ejemplo, el paquete de software de analisis de secuencia del Genetics Computer Group, Centro de biotecnologfa de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705, programas BLAST o PILEUP / PRETTYBOX). Una secuencia de senal puede ser una que sea, por ejemplo, sustancialmente identica a los residuos de aminoacidos 1-25 de la SEQ ID NO: 501 o a los residuos de aminoacidos 1-17 de SEQ ID NO: 1201.

Por “displasia esqueletica” se entiende un trastorno oseo o de cartflago caracterizado por baja estatura o enanismo. Por “sujeto” se entiende un mamffero, que incluye un mamffero humano o no humano, tal como un bovino, equino, canino, ovino o felino.

Por “efecto sinergico” se entiende un efecto terapeutico observado despues de la administracion de dos o mas agentes que es mayor que la suma de los efectos terapeuticos observados despues de la administracion de cada agente individual. En un ejemplo de sinergia, se observa un efecto terapeutico para la combinacion de dos o mas agentes, donde uno o mas de los agentes esta presente en una dosis que normalmente no es terapeutica. En otro ejemplo de sinergia, la combinacion de dos o mas agentes resulta en una disminucion inesperada en uno o mas eventos adversos (es decir, un nivel o numero de eventos adversos que es menor que la suma de los eventos adversos observados despues de la administracion de los agentes individuales). En otro ejemplo, la combinacion de dos o mas agentes a una dosis terapeutica da como resultado efectos secundarios dependientes de la dosis reducida, en comparacion con el nivel de efectos secundarios dependientes de la dosis observados para un agente unico a una dosis terapeutica. Por “cantidad terapeuticamente eficaz” se entiende una cantidad de un polipeptido o molecula de acido nucleico descrito en el presente documento que es suficiente para tratar, prevenir, retrasar, suprimir o detener sustancialmente cualquier sfntoma de un sfndrome neurocutaneo, un trastorno asociado con la sobreactivacion de FGFR3, un trastorno oseo o de cartflago (por ejemplo, acondroplasia) o un trastorno del musculo liso vascular o que es suficiente para alargar sustancialmente el hueso. Una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion descrita en el presente documento puede depender de la gravedad del trastorno que se esta tratando y la condicion, el peso y el estado general del sujeto y puede determinarse por un experto en la materia teniendo en cuenta dichos factores. Una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion descrita en el presente documento puede administrarse a un sujeto en una dosis unica o en dosis multiples administradas durante un periodo de tiempo.

Por “tratando”, “tratar” o “tratamiento” se entiende la gestion medica de un paciente con la intencion de curar, mejorar, estabilizar, reducir la probabilidad de o prevenir un sfndrome neurocutaneo, un trastorno asociado con la sobreactivacion de FGFR3, un trastorno oseo o de cartflago (por ejemplo, acondroplasia) o un trastorno del musculo liso vascular o la gestion de un sujeto sano con la intencion de alargar el hueso, por ejemplo, administrando una composicion farmaceutica. Este termino incluye el tratamiento activo, es decir, el tratamiento dirigido especfficamente hacia la mejora o asociado con la cura de una enfermedad, afeccion patologica, trastorno o evento, y tambien incluye un tratamiento causal, es decir, un tratamiento dirigido hacia la eliminacion de la causa de la enfermedad asociada, afeccion patologica, trastorno o evento. Ademas, este termino incluye el tratamiento paliativo, es decir, el tratamiento disenado para aliviar los sfntomas en lugar de curar la enfermedad, afeccion patologica, trastorno o evento; el tratamiento sintomatico, es decir, el tratamiento dirigido hacia los sfntomas constitucionales de la enfermedad asociada, afeccion patologica, trastorno o evento; el tratamiento preventivo, es decir, el tratamiento dirigido a minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de la enfermedad, afeccion patologica, trastorno o evento asociado, por ejemplo, en un paciente que aunque no esta enfermo, es susceptible o, de lo contrario, corre el riesgo de una enfermedad particular, afeccion patologica, trastorno o evento; y el tratamiento de apoyo, es decir, el tratamiento empleado para complementar otra terapia especffica dirigida a la mejora de la enfermedad asociada, afeccion patologica, trastorno o evento.

Por “trastorno del musculo liso vascular” se entiende cualquier trastorno, enfermedad u otra anomalfa que afecta la funcion, la estructura o el crecimiento del musculo liso vascular.

Por “vector” se entiende una molecula de ADN, generalmente derivada de un plasmido o bacteriofago, en la que se pueden insertar o clonar fragmentos de ADN. Un vector recombinante contendra uno o mas sitios de restriccion unicos, y puede ser capaz de replicacion autonoma en un organismo vehfculo o huesped definido, de modo que la secuencia clonada sea reproducible. Un vector contiene un promotor enlazado operativamente a un gen o region codificante de manera que, tras la transfeccion en una celula receptora, se expresa un ARN.

Otras caracterfsticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la descripcion detallada y las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

En las figuras que muestran un alineamiento de secuencia multiple, “*” representa la identidad; “:” representa una sustitucion conservada; y “.” representa una sustitucion semiconservada.

La Fig. 1A es un grafico que muestra niveles de pirofosfato (PPi) en osteoblastos de ratones de tipo salvaje (izquierda) y ratones NF1coi2'/_ (derecha).

La Fig. 1B es un grafico que muestra los niveles de expresion del ARNm del gen de anquilosis progresiva (Ank) en osteoblastos de ratones de tipo salvaje (etiquetados como “WT”) y ratones NF1coi2'/_ (etiquetados como “KO”). Los osteoblastos se trataron con un vehfculo, un inhibidor de la cinasa MEK1/MEK2 U0126 (1,4-diamino-2,3-diciano-1,4-bis(2-aminofeniltio) butadieno) o una protefna morfogenetica osea 2 (BMP2).

La Fig. 2 es un esquema que muestra un modelo de trabajo hipotetico para la mineralizacion defectuosa de la matriz osea en ratones NF¹coi²'/_.

La Fig. 3A muestra el efecto de la protefna morfogenetica osea humana recombinante 2 (rhBMP2) en osteoblastos de ratones de tipo salvaje (etiquetados “WT”) y ratones NF1coi2'/_. Las placas celulares se muestran con tincion histologica para la fosfatasa alcalina (ALP) sola o en combinacion con rojo de alizarina S (ALP / Alizarina) y para el numero de celulas con violeta cristal.

La Fig. 3B muestra el efecto de un polipeptido de fusion de sALP (sTNALP-FcD¹⁰, SEQ ID NO: 1204) en celulas estromales de medula osea de ratones de tipo salvaje (etiquetados como “WT”) y ratones NF1coi2'/'. Las celulas se trataron posteriormente durante 8 dfas con dosis crecientes de sTNALP-FcDm Las placas celulares se muestran con tincion histologica para el rojo de alizarina S para determinar la presencia de deposicion calcificada (parte superior), y se cuantifico la intensidad relativa de la tincion con rojo de alizarina S (parte inferior).

La Fig. 3C muestra el efecto de un polipeptido de fusion de sALP (sTNALP-FcD¹⁰, SEQ ID NO: 1204) en celulas estromales de medula osea (BMSC) de ratones de tipo salvaje (etiquetados como “WT”) y ratones NF1coi2'/'. Las BMSC se incubaron en cultivo y se indujo la diferenciacion durante 14 dfas utilizando vitamina C y beta-glicerofosfato. Luego, las celulas se trataron con 0,5 pg / ml de sTNALP-FcD¹⁰y se tineron con rojo de alizarina para evaluar el nivel de mineralizacion, con rojo picrosirius para demostrar la presencia de matriz extracelular o con violeta cristal para tenir las celulas.

La Fig. 3D muestra el efecto de un polipeptido de fusion de sALP (sTNALP-FcD¹⁰, SEQ ID NO: 1204) en celulas estromales de medula osea (BMSC) de ratones con gen NF1 floxado. Las BMSC se incubaron en cultivo y se indujo la diferenciacion durante 14 dfas utilizando vitamina C y beta-glicerofosfato. Las celulas se trataron durante 8 dfas con un adenovirus que codifica GFP (“Ad-GFP”, como control) o un adenovirus que codifica para la recombinasa CRE (“Ad-Cre”) ya sea con vehfculo o con 0,5 pg / ml de sTNALP-FcDm Las celulas se tineron luego con rojo de alizarina para evaluar el nivel de mineralizacion (primera y segunda columnas) o con rojo de picrosirius para demostrar la presencia de matriz extracelular (tercera y cuarta columnas).

La Fig. 3E muestra el efecto in vivo de un polipeptido de fusion de sALP (sTNALP-FcDm SEQ ID NO: 1204) en ratones de tipo salvaje (etiquetados como “WT”) y ratones NF1coi2'/'. Los ratones NF1coi2'/' se trataron desde el dfa 1 hasta el dfa 18 con 8,2 mg / kg de sTNALP-FcD¹⁰y se compararon con ratones no tratados o WT. Los ratones se sacrificaron el dfa 19 y las vertebras se analizaron con imagenes de micro-CT para medir el volumen del hueso sobre el volumen total (BV / TV). El tratamiento de los ratones con sTNALP-FcD¹⁰incremento el deficit de densidad mineral osea en ratones NF1coi2'/' en comparacion con el vehfculo (* p < 0,5).

La Fig. 4A muestra la expresion del gen NPR-B en ratones NF1coi2'/_. Se cultivaron celulas estromales de medula osea durante 3 semanas en condiciones osteogenicas (con acetato de ascorbato) y se lisaron. La RT-PCR se realizo utilizando NPR-B e iniciadores GAPDH de gen constitutivo.

La Fig. 4B muestra el efecto de un polipeptido de fusion de NP (NC2-KGANKK, SEQ ID NO: 512) en condrocitos de ratones de tipo salvaje (etiquetados como “WT”) y ratones NF1coi2'/'. El analisis de transferencia Western proporciona niveles de ERK y ERK fosforilado (p-ERK) para condrocitos de ratones de tipo salvaje o de ratones NF1coi2'/'. Se cultivaron condrocitos primarios extrafdos de las costillas de ratones recien nacidos NF1coi2'/' o WT y luego se trataron durante 30 minutos con concentraciones crecientes de NC2-KGANKK. A continuacion, las celulas se lisaron y se realizo una transferencia Western en lisados usando anticuerpos especfficos anti-ERK o anti-fosfo-ERK.

La Fig. 4C muestra el efecto in vivo de un polipeptido de fusion de Np (NC2B, SEQ ID NO: 504) en la longitud nasoanal en ratones de tipo salvaje (etiquetados como “WT”) y ratones NF1coi2'/'. Los ratones NF1coi2'/' se trataron desde el dfa 1 hasta el dfa 18 con 100 o 300 mg / kg de NC2B y se compararon con ratones tratados con vehfculo o WT. Los ratones se midieron para determinar su longitud naso-anal en el dfa 19.

La Fig. 4D muestra el efecto in vivo de un polipeptido de fusion de NP (NC2B, SEQ ID NO: 504) en la longitud de la tibia en ratones de tipo salvaje (etiquetados como “WT”) y ratones NF1coi2'/'. Los ratones NF1coi2'/' se trataron desde el dfa 1 hasta el dfa 18 con 100 o 300 mg / kg de NC2B y se compararon con ratones tratados con vehfculo o WT. Los ratones se midieron para determinar la longitud de la tibia en el dfa 19.

La Fig. 4E muestra el efecto in vivo de un polipeptido de fusion de NP (NC2B, SEQ ID NO: 504) en placas de crecimiento en ratones de tipo salvaje (etiquetados como “WT”) y ratones NF1col2-/-. Los ratones NF1col2-/- se trataron desde el dfa 1 hasta el dfa 18 con 300 mg / kg de NC2B y se compararon con ratones tratados con vehfculo o WT. En el dfa 19, se utilizaron tibias para analizar placas de crecimiento proximal en histologfa y para medir el tamano de las zonas de condrocitos.

La Fig. 5A es un diagrama esquematico de la estructura de la fosfatasa alcalina no especffica de tejido humano (hsTNALP) como se describe en el presente documento, que incluye un polipeptido que tiene un ectodominio de TNALP, una secuencia de senalizacion N-terminal y una secuencia de senal GPI (parte superior); una hsTNALP-FcDio que tiene un ectodominio de TNALP, una secuencia de senalizacion N-terminal, una secuencia IgGi-Fc y una fraccion dirigida al hueso Dio (centro); y una hsTNALP-FcDio sin una secuencia de senal que tiene un ectodominio de TNALP, una secuencia de IgG¹-Fc, y una fraccion dirigida al hueso D¹⁰(parte inferior).

La Fig. 5B muestra la secuencia de aminoacidos de hsTNALP-FcD¹⁰(SEQ ID NO: 1201), que incluye la secuencia de senal N-terminal (los primeros 17 residuos de aminoacidos, subrayados y en cursiva; la posicion 2, una valina, difiere del residuo de tipo salvaje en esa posicion, isoleucina); y la secuencia de aminoacidos de hsTNALP-FcD¹⁰secretada (SEQ ID NO: 1204), que carece de la secuencia de senal N-terminal. Los residuos de aminoacidos de la porcion hsTNALP de los polipeptidos, que corresponden a los residuos de aminoacidos 18-502 de hsTNALP (SEQ ID NO: 1205), estan en cursiva. La secuencia de senal en la SEQ ID NO: 1201 esta en cursiva y subrayada. Las porciones de Fc de los polipeptidos (SEQ ID NO: 401) estan subrayadas. Se muestra en negrita un enlazador dipeptido leucinalisina (LK) entre las porciones hsTNALP y Fc y un enlazador dipeptido acido aspartico-isoleucina (DI) entre la hsTNALP y la fraccion dirigida al hueso.

La Fig. 5C muestra la secuencia de aminoacidos de las protefnas de fusion sALP que carecen de una fraccion dirigida al hueso: hsTNALP-Fc (SEQ ID NO: 1220) y hsTNALP-FcD¹⁰secretada (SEQ ID NO: 1221), que carece de la secuencia de senal N-terminal. Los residuos de aminoacidos de la porcion hsTNALP de los polipeptidos, que corresponden a los residuos de aminoacidos 18-502 de hsTNALP (SEQ ID NO: 1205), estan en cursiva. La secuencia de senal en la SEQ ID NO: 1201 esta en cursiva y subrayada. Las porciones de Fc de los polipeptidos (SEQ ID NO: 401) estan subrayadas. Se muestra en negrita un enlace dipeptido leucina-lisina (LK) entre las porciones hsTNALP y Fc.

La Fig. 5D muestra una secuencia de acido nucleico (SEQ ID NO: 1217) que codifica el polipeptido de hsTNALP-Fc representado en la Fig. 5B.

La Fig. 6 muestra secuencias de aminoacidos para la fosfatasa alcalina no especffica del tejido soluble humano (hsTNALP), incluida la secuencia de hsTNALP que tiene la secuencia de senal N-terminal (residuos de aminoacidos 1-502) (SEQ ID NO: 1202) y la secuencia de hsTNALP secretada que carece de la secuencia de senal (residuos de aminoacidos 18-502) (SEQ ID NO: 1205). La secuencia de senal esta subrayada.

La Fig. 7 es una lista de la secuencia de aminoacidos de una Fc ejemplar de IgG-1 humana (SEQ ID NO: 401).

La Fig. 8 muestra un alineamiento de secuencia multiple CLUSTAl ™ W (1.82) de ortologos de fosfatasa alcalina no especffica de tejido de mamffero (TNALP). Los ortologos de TNALP de mamfferos incluyen TNALP de vaca (“P09487|PPBT_BOVINO”; accesion N.° P09487; SEQ ID NO: 1206); TNALP de gato (“Q294861PPBT_FELCA”; accesion N.° Q29486; SEQ ID NO: 1207); TNALP humano (“P05186|PPBT_HUMANO”; accesion N.° P05186; SEQ ID NO: 1208); TNALP de raton (“P09242|PPBT_RATON”; accesion N.° P09242; SEQ ID NO: 1209); TNALP de rata (“P08289|PPBT_RATA”; accesion N.° P08289; SEQ ID NO: 1210), y una secuencia parcial de TNALP de perro (“Q9N0v 0|Q9N0V0_CANFA”; accesion N.° Q9N0V0; SEQ ID NO: 1211). Una secuencia de consenso se deriva de este alineamiento (“Consenso”; SEQ ID NO: 1216), donde X denota posiciones degeneradas y puede ser cualquier aminoacido.

La Fig. 9 muestra un alineamiento de secuencia multiple de CLUSTAL™ (2.0.5) de ortologos de fosfatasa alcalina no especffica de tejido de mamffero (TNALP) e isozimas de fosfatasa alcalina humana (ALP). Los ortologos de TNALP de mamfferos incluyen aquellas que se muestran en la Fig. 8, incluyendo TNALP de rata (“TNALPrn”, SEQ ID NO: 1210), TNALP de raton (“TNALPmm”, SEQ ID NO: 1209), TNALP humana (“TNALPhs”, SEQ ID NO: 1208), una secuencia parcial de TNALP de perro (“TNALPcf”, SEQ ID NO: 1211), TNALP de gato (“TNALPfc”, SEQ ID NO: 1207), y TNALP de vaca (“TNALPbt”, SEQ ID NO: 1206). Las isoenzimas de ALP humanas incluyen una ALP gastrointestinal humana (“GALPhs”; accesion N.° P10696; SEQ ID NO: 1213), una ALP placentaria humana (“PLALPhs”; accesion N.° 05187; SEQ ID NO: 1214), y una ALP intestinal humana (“IALPhs”; accesion N.° P09923; SEQ ID NO: 1212). Una secuencia de consenso se deriva de este alineamiento (“Consenso”; SEQ ID NO: 1215), donde X denota posiciones degeneradas y puede ser cualquier aminoacido.

La Fig. 10 es una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 1218) para ortologos de fosfatasa alcalina no especffica de tejido de mamffero (TNALP) e isozimas de fosfatasa alcalina humana (ALP) excluyendo mutaciones patogenas, donde X puede ser cualquier aminoacido, pero no un aminoacido correspondiente a una o mas mutaciones patogenas proporcionadas en la Tabla 1.

La Fig. 11 es una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 1219) para ortologos de fosfatasa alcalina no especffica de tejido de mamffero (TNALP) excluyendo mutaciones patogenas, donde X puede ser cualquier aminoacido, pero no un aminoacido correspondiente a una o mas mutaciones patogenas proporcionadas en la Tabla 1.

La Fig. 12 es un alineamiento de secuencia multiple de ANP humano (SEQ ID NO: 1), urodilatina humana (SEQ ID NO: 2), BNP humano (SEQ ID NO: 3), CNP22 humano (SEQ ID NO: 4), y DNP (SEQ ID NO: 5). El dominio de anillo de 17 aminoacidos para cada peptido natriuretico se muestra en negrita y encerrado en un recuadro. A continuacion, se muestra una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 6), donde cada X representa cualquier aminoacido o de manera opcional, representa cualquier aminoacido en la posicion correspondiente en una de las SEQ ID NO: 1-5.

La Fig. 13 es un alineamiento de CNP53 humano (SEQ ID NO: 11), CNP22 humano y CNP humano (solo en el dominio de anillo) (SEQ ID NO: 12).

La Fig. 14 es un alineamiento de secuencia multiple de varios homologos de CNP22. El dominio de anillo de 17 aminoacidos para cada NP se muestra en negrita y encerrado en un recuadro. A continuacion, se muestra una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 30), donde cada X dentro del dominio de anillo representa cualquier aminoacido o de manera opcional, representa cualquier aminoacido en la posicion correspondiente en una de las SEQ ID NO: 4 y 13-29. Cada X fuera del dominio de anillo representa cualquier aminoacido o puede estar ausente, o de manera opcional, representa cualquier aminoacido en la posicion correspondiente en una de las SEQ ID NO: 4 y 13-29. Las Figs. 15A-15G son un alineamiento de secuencias multiples de varios homologos de CNP, incluyendo en algunos casos las secuencias previas y posteriores de N-terminal. El dominio de anillo de 17 aminoacidos para cada NP se muestra en negrita y encerrado en un recuadro. A continuacion, se muestra una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 95), donde cada X representa cualquier aminoacido o de manera opcional, representa cualquier aminoacido en la posicion correspondiente en una de las SEQ ID NO: 31-94.

La Fig. 16 es un diagrama esquematico de la estructura de un peptido natriuretico como se describe en el presente documento, que incluye una extension N-terminal opcional, un segmento corto opcional, un dominio de anillo requerido y una extension C-terminal opcional.

Las Figs. 17A-17E son diagramas esquematicos de constructos de Fc-NP o NP-Fc ejemplares. La Fig. 17A representa un dfmero Fc-NP. La Fig. 17B representa un dfmero NP-Fc. La Fig. 17C representa un hfbrido monomero-dfmero Fc: Fc-NP. La Fig. 17D representa un hfbrido monomero-dfmero NP-Fc: Fc. La Fig. 17E representa un dfmero hfbrido NP-Fc: Fc-NP.

La Fig. 18A es un listado de la secuencia de aminoacidos de la protefna de fusion inmadura NC2 Streptag (“NC2st”) (SEQ ID NO: 501), junto con una tabla que proporciona un resumen de las regiones de protefnas. La secuencia de senal N-terminal, que se escinde durante la traduccion, esta subrayada. Varias secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio Fc se muestra en negrita. El dominio CNP se muestra en gris resaltado. La Fig. 18B es un listado de la secuencia de aminoacidos de la protefna de fusion NC2st (SEQ ID NO: 502) sin la secuencia de senal. La Fig. 18C es una lista de la secuencia de acido nucleico (SEQ ID NO: 801) que codifica la protefna de fusion NC2st.

La Fig. 19A es una lista de la secuencia de aminoacidos de NC2B, tanto con la secuencia de senal (SEQ ID NO: 503) como sin la secuencia de senal (SEQ ID NO: 504), y la secuencia de aminoacidos D10-NC2 que tiene una etiqueta D10, tanto con la secuencia de senal (SEQ ID NO: 607) como sin la secuencia de senal (SEQ ID NO: 608).

La Fig. 19B es una lista de una secuencia de acido nucleico (SEQ ID NO: 802) que codifica NC2B.

La Fig. 20A es una lista de secuencias de aminoacidos para NC2B-22, NC2B-28 y NC2B-34, tanto con la secuencia de senal (SEQ ID NO: 505, 507 y 509, respectivamente) como sin la secuencia de senal (SEQ ID NO: 506, 508, y 510 respectivamente). Las secuencias de senal estan subrayadas. El dominio Fc se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio CNP se muestra en gris resaltado. La Fig. 20B es una lista de una secuencia de acido nucleico (SEQ ID NO: 803) que codifica NC2B-22. La Fig. 20C es una lista de una secuencia de acido nucleico (SEQ ID NO: 804) que codifica NC2B-28. La Fig. 20D es una lista de una secuencia de acido nucleico (SEQ ID NO: 805) que codifica NC2B-34.

La Fig. 21 es una lista de secuencias de aminoacidos para NC2-KGANKK y NC2-KGANQK tanto con la secuencia de senal (SEQ ID NO: 511 y 513, respectivamente) como sin la secuencia de senal (SEQ ID NO: 512 y 514, respectivamente). Las secuencias de senal estan subrayadas. El dominio Fc se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio CNP se muestra en gris resaltado.

La Fig. 22 es una lista de secuencias de aminoacidos para NC2-CNP53mut2 tanto con la secuencia de senal (SEQ ID NO: 515) como sin la secuencia de senal (SEQ ID NO: 516). La secuencia de senal estan subrayadas. El dominio Fc se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio CNP se muestra en gris resaltado.

La Fig. 23 es una lista de secuencias de aminoacidos para Fc-CNP53-A (tambien denominada Fc-CNP53wt) y Fc-CNP53-AAA (tambien denominada Fc-CNP53mut), tanto con la secuencia de senal (SEQ ID NO: 517 y 519, respectivamente) como sin la secuencia de senal (SEQ ID NO: 518 y 520, respectivamente). Las secuencias de senal estan subrayadas. El dominio Fc se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio CNP se muestra en gris resaltado.

La Fig. 24 es un alineamiento de secuencia multiple de varios NP y homologos, que incluyen CDNP. La region dentro del recuadro es la region mas conservada de la cola de DNP entre los peptidos de enlace NPRA. Las secuencias de numerosas variantes de CDNP se muestran en la mitad inferior de la figura, y tambien se muestra una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 118) para la cola C-terminal de DNP. Cada X en la secuencia de consenso representa cualquier aminoacido o de manera opcional, representa cualquier aminoacido en la posicion correspondiente en una de las SEQ ID NO: 100-116.

La Fig. 25A es una lista de secuencias de aminoacidos para CNP-16AAenlazador-Fc-His10 (NC1) (SEQ ID NO: 521), CNP-6AAenlzador-Fc-His10 (NC3) (SEQ ID NO: 522), CNP-6AAenlzador-Fc (SEQ ID NO: 523), CDNP-Fc (SEQ ID NO: 524), CDNP-A17saa-Fc (SEQ ID NO: 525), y CDNP-A17sra-Fc (SEQ ID NO: 526). El dominio CNP se muestra en gris resaltado. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio Fc se muestra en negrita. La Fig. 25B es una lista de la secuencia de acido nucleico (SEQ ID NO: 806) de NC1.

La Fig. 26 es una lista de varios mutantes puntuales (SEQ ID NO: 119-125) cada uno con una mutacion en la posicion 17 de CNP22, junto con una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 126). X representa cualquier aminoacido o de manera opcional, representa cualquier aminoacido en la posicion correspondiente en una de las SEQ ID NO: 119-125. La Fig. 27 es una lista de secuencias de aminoacidos para varias variantes de CNP (SEQ ID NO: 4 y 127-150). El dominio de anillo de 17 aminoacidos para cada variante se muestra en negrita. La region del enlazador se muestra en cursiva.

Las Figs. 28A-28E son una lista de secuencias de aminoacidos para variantes de CNP adicionales (SEQ ID NO: 1001 1155).

La Fig. 29 es una lista de secuencias de aminoacidos para CNP22 (SEQ ID NO: 4), CNP-L17 (SEQ ID NO: 120), CNP-F17 (SEQ ID NO: 119), CNP-T17 (SEQ ID NO: 122), D6-14AAenlzador-CNP [C3] (SEQ ID NO: 147), CNP-14AAenlzador-D6 [C4] (SEQ ID NO: 148), CNP-Nterm2 [C5] (SEQ ID NO: 150), CDNP-S3A4A5R6 [C13] (SEQ ID NO: 115), CDNP29-S3A4A5R6 [C14] (SEQ ID NO: 151), C1(E6) [BC1] (SEQ ID NO: 129), C2(E6) [BC2] (SEQ ID NO: 130), C3 (E6) [BC3] (SEQ ID NO: 131), C4(E6) [BC4] (SEQ ID NO: 132), C5(E6) [BC5] (SEQ ID NO: 133), C6(E6) [BC6] (SEQ ID NO: 134), C7(E6) [BC7] (SEQ ID NO: 135), C8(E6) [BC8] (SEQ ID NO: 136), C9(E6) [BC9] (SEQ ID NO: 137), C10(E6) [BC10] (SEQ ID NO: 138), C11(E6) [BC11] (SEQ ID NO: 139), PGCNP37(E6) (SEQ ID NO: 128), KA1 (SEQ ID NO:152), KA1(E6) (SEQ ID NO:153), KB1 (SEQ ID NO:154), y KB1(E6) (SEQ ID NO: 155). El dominio de anillo de 17 aminoacidos para cada variante se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. Las secuencias de escision de catepsina se muestran de forma subrayada.

La Fig. 30 es una lista de secuencias de aminoacidos para variantes de CNP que tienen una mutacion puntual en la posicion 17 con respecto a CNP22 (SEQ ID NO: 126, 119-122 y 156-172). Para las SEQ ID NO: 126 y 162, X puede ser cualquier aminoacido, incluidos F, L, I, T, E, R, Y, C, P o D. El dominio de anillo de 17 aminoacidos para cada variante se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva.

Las Figs. 31A-31B son una lista de secuencias de aminoacidos para variantes de CNP adicionales que tienen una mutacion puntual en la posicion 17 con respecto a CNP22 (SEQ ID NO: 173-220). X puede ser cualquier aminoacido, incluidos F, L, I, T, E, R, Y, C, P o D. El dominio de anillo de 17 aminoacidos para cada variante se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. Las secuencias de escision de catepsina se muestran de forma subrayada.

La Fig. 32 es una lista de secuencias de aminoacidos para variantes de CNP que tienen una mutacion puntual en la posicion 17 con respecto a CNP22, donde la metionina en la posicion 17 se ha sustituido con una leucina (SEQ ID NO: 221-233). El dominio de anillo de 17 aminoacidos para cada variante se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. Las secuencias de escision de catepsina se muestran de forma subrayada. Las Figs. 33A-33E son listas de secuencias de aminoacidos para constructos que tienen una mutacion puntual en la posicion 17 con respecto a CNP22 (SEQ ID NO: 527-552). X puede ser cualquier aminoacido, incluidos F, L, I, T, E, R, Y, C, P o D. Las secuencias de senal estan subrayadas. El dominio Fc se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio CNP se muestra en gris resaltado.

Las Figs. 34A-34J son listas de secuencias de aminoacidos para variantes de NC2 (SEQ ID NO: 511-516 y 553-606) con o sin la secuencia de senal y con o sin una fraccion dirigida al hueso D¹⁰en el N-terminal. Las secuencias de senal estan subrayadas. El dominio Fc se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio CNP se muestra en gris resaltado.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La presente invencion presenta composiciones farmaceuticas que comprenden polipeptidos de fosfatasa alcalina soluble (sALP), por ejemplo, fusionados con un dominio Fc de una inmunoglobulina, codificada por acido nucleico, para su uso en el tratamiento de la neurofibromatosis, por ejemplo, de tipo 1. Se describen polipeptidos de fosfatasa alcalina soluble (sALP), por ejemplo, fusionados con un dominio Fc de una inmunoglobulina, codificada por acido nucleico, y su uso para tratar trastornos asociados con la sobreactivacion de FGFR3, trastornos oseos o de cartflago (por ejemplo, hipofosfatasia o acondroplasia), trastornos del musculo liso vascular, asf como para alargar el hueso). Se describen polipeptidos natriureticos (NP), por ejemplo, fusionados con un dominio Fc de una inmunoglobulina, codificada por acido nucleico y sus usos para tratar cualquier enfermedad o afeccion descrita en el presente documento (por ejemplo, sfndromes neurocutaneos (por ejemplo, neurofibromatosis, por ejemplo, de tipo 1), trastornos asociados con la sobreactivacion de FGFR3, trastornos oseos o de cartflago (por ejemplo, hipofosfatasia o acondroplasia), trastornos del musculo liso vascular, asf como para alargar el hueso). La presente invencion tambien presenta una composicion farmaceutica que comprende una combinacion de dichos polipeptidos sALP con dichos polipeptidos NP, como se describe en el presente documento, para su uso en el tratamiento de la neurofibromatosis. Se describe una combinacion de dichos polipeptidos SALP con dichos polipeptidos NP, como se describe en el presente documento, y su uso para tratar cualquier enfermedad o afeccion descrita en el presente documento (por ejemplo, sfndromes neurocutaneos, trastornos asociados con la sobreactivacion de FGFR3, trastornos oseos o de cartflago (por ejemplo, hipofosfatasia o acondroplasia), trastornos del musculo liso vascular, asf como para alargar el hueso). A continuacion, se proporcionan detalles adicionales de la invencion.

Fosfatasa alcalina

Las fosfatasas alcalinas abarcan un grupo de enzimas que comparten la propiedad de poder escindir el fosfato en una variedad de contextos (por ejemplo, hidrolisis de pirofosfato, PPi). Se conocen cuatro isozimas de fosfatasa alcalina (ALP) de mamfferos: la fosfatasa alcalina no especffica de tejido (TNALP; descrita mas adelante), la fosfatasa alcalina placentaria (PLALP) (por ejemplo, accesion N.° P05187, n P_112603 y NP001623), la fosfatasa alcalina de celulas germinales (GALP) (por ejemplo, accesion N.° P10696) y la fosfatasa alcalina intestinal (IALP) (por ejemplo, accesion N.° P09923 y NP_001622). Estas isoenzimas poseen estructuras tridimensionales muy similares. Cada uno de sus sitios catalfticos contiene cuatro dominios de enlace metalico que se unen a los iones metalicos necesarios para la actividad enzimatica, incluidos dos iones de zinc y un ion de magnesio. Estas enzimas catalizan la hidrolisis de monoesteres de acido fosforico y tambien catalizan una reaccion de transfosforilacion en presencia de altas concentraciones de aceptores de fosfato. Se ha demostrado que la PLALP es fisiologicamente activa con respecto a la fosfoetanolamina (PEA), el pirofosfato inorganico (PPi) y el 5'-fosfato piridoxal (PLP), siendo los tres conocidos como sustratos naturales para la TNALP (Whyte, 1995). En la Fig. 9 se muestra un alineamiento entre estas isozimas. Se describen fosfatasas alcalinas adicionales, por ejemplo, en el documento WO 2008/138131y en la publicacion de EE. UU. N.° 2006/0014687.

Las fosfatasas no especfficas de tejido son una familia de protefnas, codificadas por un solo gen, que difieren entre si por la modificacion postraduccional. Las TNALP estan presentes predominantemente en el hfgado, los rinones y los huesos, pero pueden ocurrir en todo el cuerpo. Las TNALP conocidas en mamfferos incluyen, por ejemplo, TNALP humana (accesion N.° NP_000469, AAI10910, AAH90861, AAH66116, AAH21289 y AAI26166); TNALP rhesus (accesion N.° XP _01109717); TNALP de rata (accesion N.° NP_037191); TNALP de perro (accesion N.° AAF64516); TNALP de cerdo (accesion N.° AAN64273), raton (accesion N.° n P_031457), TnALP de vaca (accesion N.° NP_789828, NP_776412, AAM 8209 y AAC33858) y TNALP de gato (accesion N.° NP_001036028), ademas de otros ejemplos proporcionados en el presente documento.

Fosfatasa alcalina soluble

Las fosfatasas alcalinas solubles (sALP) para su uso en la invencion incluyen, por ejemplo, formas solubles (por ejemplo, extracelulares o no unidas a membrana) de cualquiera de las fosfatasas alcalinas descritas en el presente documento. La fosfatasa alcalina soluble para su uso en la invencion puede ser, por ejemplo, una forma soluble de TNALP humana. Una representacion esquematica de los dominios de TNALP humana (hTNALP) se muestra en la Fig. 5A (parte superior). TNALP es una protefna unida a membrana anclada a traves de una union de glicolfpido a su C-terminal (Swiss-Prot, P05186). Este anclaje de glicolfpido (GPI) se agrega postraduccionalmente despues de la eliminacion de un extremo C-terminal hidrofobico que actua tanto como anclaje de membrana temporal como una senal para el agregado de GPI. Este anclaje GPI esta enterrado en la membrana celular, y las porciones restantes de la protefna son extracelulares. La TNALP, incluida la hTNALP, puede disenarse para reemplazar el primer aminoacido de la secuencia C-terminal hidrofoba (una alanina) con un codon de parada. La hTNALP formada de esta manera contiene todos los residuos de aminoacidos de la forma nativa anclada de TNALP, pero carece del anclaje de membrana GPI. Una hTNALP que es soluble en el presente documento se denomina “hsTNALP”. Un experto en la materia apreciara que la posicion del anclaje de membrana GPI variara en diferentes fosfatasas alcalinas y puede incluir, por ejemplo, los ultimos 10, 12, 14, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24. 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 45, 50 o mas residuos de aminoacidos en el extremo C del polipeptido. Por ejemplo, el anclaje de membrana GPI de la hTNALP (SEQ ID NO: 1208) son los residuos de aminoacidos 503-524. La secuencia de aminoacidos de esta hsTNALP (con una variacion en la posicion 2 de la secuencia de senal), fusionada con Fc, se muestra en la Fig. 5B. La secuencia de un acido nucleico que codifica este polipeptido de fusion hsTNALP-Fc se muestra en la Fig. 5D (SEQ ID NO: 1217).

Ademas del anclaje de GPI de C-terminal, la TNALP tambien tiene una secuencia de peptido de senal N-terminal. El peptido de senal N-terminal esta inicialmente presente en la protefna cuando se sintetiza, pero se escinde despues de la translocacion en el ER. Por lo tanto, el peptido de senal N-terminal esta ausente de la forma secretada de TNALP. Las sALP para el uso en la invencion incluyen tanto formas secretadas (es decir, que carecen de la senal N-terminal) como no secretadas (es decir, que tienen la senal N-terminal) de las mismas. Un experto en la materia apreciara que la posicion del peptido de senal N-terminal variara en diferentes fosfatasas alcalinas y puede incluir, por ejemplo, los primeros 5, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30 o mas residuos de aminoacidos en el extremo N del polipeptido. Por ejemplo, el peptido de senal N-terminal de la hTNALP de SEQ ID NO: 1208 son sus primeros 17 residuos de aminoacidos, como se muestra en la Fig. 6. Por lo tanto, una forma soluble secretada de esta hTNALP son los residuos de aminoacidos 18-502 de la SEQ ID NO: 1208 (SEQ ID NO: 1205), como se muestra en la Fig. 6. La secuencia de aminoacidos de esta hsTNALP secretada, como se fusiona con Fc, se muestra en la Fig. 5B. Las sALP para su uso en la invencion incluyen tanto formas secretadas como no secretadas de las mismas. Un experto en la materia puede predecir la posicion de un sitio de escision de secuencia de senal, por ejemplo, mediante un algoritmo informatico apropiado tal como el descrito en Bendtsen y col. (J. Mol. Biol. 340(4):783-795, 2004) y disponible en la web en http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/.

Las sALP para su uso en la invencion tambien incluyen, por ejemplo, secuencias polipeptfdicas que satisfacen una secuencia de consenso derivada del dominio extracelular de ALP de isozimas de ALP humanas y de ortologos de TNALP de mamfferos (humano, raton, rata, vaca, gato y perro) (SEQ ID NO: 1215, como se muestra en la Fig. 9) o un consenso derivado del dominio extracelular de ALP de solo ortologos de TNALP de mamfferos (humano, raton, rata, vaca, gato y perro) (SEQ ID NO: 1216, como se muestra en la Fig. 8). En algunas realizaciones, la sALP incluye los residuos de aminoacidos 18-498, 18-499, 18-500, 18-501, 18-502, 18-503, 18-504, 18-505, 18-506, 18-507, 18-508, 18-509, 18-510, 18-511 o 18-512 de la SEQ ID NO: 1216. En algunas realizaciones, la sALP incluye los residuos de aminoacidos 23-498, 23-499, 23-500, 23-501, 23-502, 23-503, 23-504, 23-505, 23-506, 23-507, 23-508, 23-509, 23 510, 23-511 o 23-512 de la SEQ ID NO: 1215.

Las sALP para su uso en la invencion tambien incluyen aquellas que satisfacen secuencias de consenso similares derivadas de diversas combinaciones de estos ortologos de TNALP o isozimas de ALP humanas. Dichas secuencias de consenso se dan, por ejemplo, en el documento WO 2008/138131.

Ademas, se ha demostrado que las hsTNALP recombinantes que retienen los residuos de aminoacidos originales 1 a 501 (18 a 501 cuando se secretan) (Oda y col., J. Biochem. 126: 694-699, 1999), los residuos de aminoacidos 1 a 502 (18 a 502 cuando se secretan) (documento WO 2008/138131), los residuos de aminoacidos 1 a 504 (18 a 504 cuando se secretan) (patente de EE. UU. N.° 6,905,689), y los residuos de aminoacidos 1 a 505 (18-505 cuando se secretan) (publicacion de patente de EE. UU. N.° 2007/0081984), son enzimaticamente activas. Esto indica que ciertos residuos de aminoacidos pueden truncarse desde el extremo C-terminal del polipeptido hsTNALP soluble sin afectar su actividad enzimatica. Esto tambien indica que ciertos residuos de aminoacidos del anclaje de membrana GPI, cuando estan presentes, no afectan significativamente la solubilidad del polipeptido. Por lo tanto, las sALP para su uso en la invencion tambien incluyen aquellas donde, por ejemplo, hasta cinco (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoacidos se truncan en su extremo C-terminal, y aquellas donde, por ejemplo, hasta cinco (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o cinco) residuos de aminoacidos del anclaje de membrana GPI estan presentes. Por ejemplo, las sALP no secretadas para su uso en la invencion incluyen aquellas que contienen los residuos de aminoacidos 1 497, 1-498, 1-499, 1-500, 1-501, 1-502, 1-503, 1-504, 1-505, 1-506 o 1-507 de la SEQ ID NO: 1208, asf como variantes de los mismos donde el aminoacido en la posicion 2 es una valina, y las sALP no secretadas para su uso en la invencion incluyen aquellas que contienen los residuos de aminoacidos 18-497, 18-498, 18-499, 18-500, 18-501, 18 502, 18-503, 18-504, 18-505, 18-506 o 18-507 de la SEQ ID NO: 1208.

Un experto en la tecnica apreciara que muchas mutaciones en la secuencia de aminoacidos de una enzima no interrumpiran significativamente la funcion catalftica de la enzima. En algunos casos, cierta mutacion puede incluso beneficiar la funcion catalftica de la enzima en el contexto de la terapia para cualquier trastorno o afeccion descrito en el presente documento (por ejemplo, un sfndrome neurocutaneo o un trastorno del hueso o del cartflago). Por lo tanto, las sALP para su uso en la invencion incluyen no solo la secuencia de tipo salvaje de las fosfatasas alcalinas descritas anteriormente, sino que tambien incluyen cualquier polipeptido que tenga al menos 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o mas) de identidad de secuencia con estas fosfatasas alcalinas. Sin embargo, se sabe que las mutaciones especfficas en TNALP tienden a causar HPP. Dichas mutaciones patogenas estan preferentemente ausentes en las sALP para su uso en la invencion. Por lo tanto, las sALP para su uso en la invencion incluyen aquellas que tienen una secuencia de aminoacidos que incluye una secuencia de consenso para multiples ortologos de TNALP de mamfferos e isoenzimas de ALP humanas que carecen de mutaciones patogenas (SEQ ID NO: 1218, como se muestra en la Fig. 10) o que incluye una secuencia de consenso para multiples ortologos de TNALP de mamfferos que carecen de mutaciones patogenas (SEQ ID NO: 1219, como se muestra en la Fig. 11). Las sALP ejemplares para su uso en la invencion incluyen aquellas que contienen los residuos de aminoacidos 1-497, 1-498, 1-499, 1-500, 1-501, 1-502, 1 503, 1-504, 1-505, 1-506, 1-507, 1-508, 1-509, 1-510, 1-511, 1-512, 23-497, 23-498, 23-499, 23-500, 23-501, 23-502, 23-503, 23-504, 23-505, 23-506, 23-507, 23-508, 23-509, 23-510, 23-511 o 23-512 de la SEQ ID NO: 1218, y las sALP secretadas para su uso en la invencion incluyen aquellas que contienen los residuos de aminoacidos 18-497, 18-498, 18-499, 18-500, 18-501, 18-502, 18-503, 18-504, 18- 505, 18-506, 18-507, 18-508, 18-509, 18-510, 18-511 o 18-512 de la SEQ ID NO: 1219. En estas secuencias de consenso (SEQ ID NO: 1218 y 1219), X es cualquier aminoacido, pero no es un aminoacido correspondiente a una mutacion patogena en esa posicion de la TNALP humana. Los ejemplos de dichas mutaciones patogenas se enumeran a continuacion y se proporcionan en la Tabla 1.

En algunas realizaciones, los polipeptidos de sALP para su uso en la invencion no incluyen ninguna de las mutaciones proporcionadas en la Tabla 1. En particular, los polipeptidos de sALP para su uso en la invencion, mediante la numeracion de la secuencia de consenso de SEQ ID NO: 1218 (Fig. 10), el aminoacido en la posicion 22 no es un residuo de fenilalanina; el aminoacido en la posicion 33 (posicion 11 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de cistefna; el aminoacido en la posicion 38 (posicion 16 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el aminoacido en la posicion 42 (posicion 20 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de prolina; el aminoacido en la posicion 45 (posicion 23 en la secuencia sin peptido senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 56 (posicion 34 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina o valina; el residuo de aminoacido en la posicion 67 (posicion 45 en la secuencia sin peptido de senal) no es una leucina, una isoleucina o un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 68 (posicion 46 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 73 (posicion 51 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 76 (posicion 54 en la secuencia sin peptido de senal) no es una cistefna, una serina, una prolina o un residuo de histidina; el residuo de aminoacido en la posicion 77 (posicion 55 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 80 (posicion 58 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 81 (posicion 59 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de asparagina; el residuo de aminoacido en la posicion 105 (posicion 83 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 113 (posicion 89 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 116 (posicion 94 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 117 (posicion 95 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 119 (posicion 97 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de glicina; el residuo de aminoacido en la posicion 121 (posicion 99 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina o treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 125 (posicion 103 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 128 (posicion 106 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 133 (posicion 111 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 134 (posicion 112 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 137 (posicion 115 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina o valina; el residuo de aminoacido en la posicion 139 (posicion 117 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de histidina o asparagina; el residuo de aminoacido en la posicion 141 (posicion 119 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de histidina; el residuo de aminoacido en la posicion 153 (posicion 131 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de alanina o isoleucina; el residuo de aminoacido en la posicion 167 (posicion 145 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina o valina; el residuo de aminoacido en la posicion 172 (posicion 150 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 175 (posicion 153 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 176 (posicion 154 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de tirosina o arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 181 (posicion 159 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 182 (posicion 160 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 184 (posicion 162 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 186 (posicion 164 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 189 (posicion 167 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de triptofano; el residuo de aminoacido en la posicion 194 (posicion 172 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de glutamato; el residuo de aminoacido en la posicion 196 (posicion 174 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina o glicina; el residuo de aminoacido en la posicion 197 (posicion 175 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 198 (posicion 176 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de alanina; el residuo de aminoacido en la posicion 206 (posicion 184 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de tirosina; el residuo de aminoacido en la posicion 208 (posicion 186 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de glutamato; el residuo de aminoacido en la posicion 207 (posicion 190 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de prolina; el residuo de aminoacido en la posicion 216 (posicion 194 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 217 (posicion 195 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de fenilalanina; el residuo de aminoacido en la posicion 223 (posicion 201 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 225 (posicion 203 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina o alanina; el residuo de aminoacido en la posicion 226 (posicion 204 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 228 (posicion 206 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de triptofano o glutamina; el residuo de aminoacido en la posicion 229 (posicion 207 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de glutamato; el residuo de aminoacido en la posicion 231 (posicion 209 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 240 (posicion 218 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de glicina; el residuo de aminoacido en la posicion 251 (posicion 229 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 254 (posicion 232 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 269 (posicion 247 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 277 (posicion 255 en la secuencia sin peptido de senal) no es una cistefna, una leucina o un residuo de histidina; el residuo de aminoacido en la posicion 280 (posicion 258 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de prolina; el residuo de aminoacido en la posicion 295 (posicion 273 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de fenilalanina; el residuo de aminoacido en la posicion 297 (posicion 275 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina; el residuo de aminoacido en la posicion 298 (posicion 276 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 300 (posicion 278 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de tirosina o alanina; el residuo de aminoacido en la posicion 301 (posicion 279 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina, treonina o isoleucina; el residuo de aminoacido en la posicion 303 (posicion 281 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de aspirado; el residuo de aminoacido en la posicion 304 (posicion 282 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina; el residuo de aminoacido en la posicion 305 (posicion 283 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de prolina; el residuo de aminoacido en la posicion 312 (posicion 290 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 313 (posicion 291 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina o leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 317 (posicion 295 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina; el residuo de aminoacido en la posicion 332 (posicion 310 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 333 (posicion 311 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de cistefna, glicina o leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 334 (posicion 312 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 340 (posicion 318 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 345 (posicion 323 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina o glutamato; el residuo de aminoacido en la posicion 354 (posicion 332 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 360 (posicion 338 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 361 (posicion 339 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina o isoleucina; el residuo de aminoacido en la posicion 377 (posicion 355 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 380 (posicion 358 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 383 (posicion 361 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 384 (posicion 362 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 387 (posicion 365 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 388 (posicion 366 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 395 (posicion 373 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 397 (posicion 375 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de cistefna o histidina; el residuo de aminoacido en la posicion 398 (posicion 376 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de alanina; el residuo de aminoacido en la posicion 401 (posicion 379 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 405 (posicion 383 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina o valina; el residuo de aminoacido en la posicion 406 (posicion 384 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 412 (posicion 390 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de glicina; el residuo de aminoacido en la posicion 416 (posicion 394 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 417 (posicion 395 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de alanina; el residuo de aminoacido en la posicion 420 (posicion 398 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 423 (posicion 401 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 426 (posicion 404 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 429 (posicion 407 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de alanina; el residuo de aminoacido en la posicion 430 (posicion 408 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 432 (posicion 410 en la secuencia sin peptido de senal) no es una cistefna o un residuo de acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 434 (posicion 412 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de prolina; el residuo de aminoacido en la posicion 435 (posicion 413 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina; el residuo de aminoacido en la posicion 442 (posicion 420 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de histidina; el residuo de aminoacido en la posicion 451 (posicion 429 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de prolina; el residuo de aminoacido en la posicion 456 (posicion 434 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de histidina o cistefna; el residuo de aminoacido en la posicion 458 (posicion 436 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina; el residuo de aminoacido en la posicion ^{4 6 0}(posicion 438 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 461 (posicion 439 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina o acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 462 (posicion 440 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de triptofano o arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 465 (posicion 443 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina o leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 472 (posicion 450 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 473 (posicion 451 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 474 (posicion 452 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 479 (posicion 457 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 482 (posicion 460 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina o glicina; el residuo de aminoacido en la posicion 484 (posicion 462 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 495 (posicion 473 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 496 (posicion 474 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de fenilalanina; y el residuo de aminoacido en la posicion 497 (posicion 475 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina.

Tambien mas especfficamente, cuando se usa una sTNALP en las sALP dirigidas al hueso para su uso en la presente invencion, mediante la numeracion de la secuencia de TNALP humana, el aminoacido en la posicion 17 no es un residuo de fenilalanina; el aminoacido en la posicion 28 (posicion 11 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de cistefna; el aminoacido en la posicion 33 (posicion 16 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el aminoacido en la posicion 37 (posicion 20 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de prolina; el aminoacido en la posicion 40 (posicion 23 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 51 (posicion 34 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina o valina; el residuo de aminoacido en la posicion 62 (posicion 45 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina, isoleucina o valina; el residuo de aminoacido en la posicion 63 (posicion 46 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 68 (posicion 51 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 71 (posicion 54 en la secuencia sin peptido de senal) no es una cistefna, una serina, una prolina o un residuo de histidina; el residuo de aminoacido en la posicion 72 (posicion 55 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 75 (posicion 58 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 76 (posicion 59 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de asparagina; el residuo de aminoacido en la posicion 100 (posicion 83 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 108 (posicion 89 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 111 (posicion 94 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 112 (posicion 95 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 114 (posicion 97 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de glicina; el residuo de aminoacido en la posicion 116 (posicion 99 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina o treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 120 (posicion 103 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 123 (posicion 106 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 128 (posicion 111 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 129 (posicion 112 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 132 (posicion 115 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina o valina; el residuo de aminoacido en la posicion 134 (posicion 117 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de histidina o asparagina; el residuo de aminoacido en la posicion 136 (posicion 119 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de histidina; el residuo de aminoacido en la posicion 148 (posicion 131 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de alanina o isoleucina; el residuo de aminoacido en la posicion 162 (posicion 145 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina o valina; el residuo de aminoacido en la posicion 167 (posicion 150 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 170 (posicion 153 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 171 (posicion 154 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de tirosina o arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 176 (posicion 159 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 177 (posicion 160 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 179 (posicion 162 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 181 (posicion 164 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 184 (posicion 167 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de triptofano; el residuo de aminoacido en la posicion 189 (posicion 172 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de glutamato; el residuo de aminoacido en la posicion 191 (posicion 174 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina o glicina; el residuo de aminoacido en la posicion 192 (posicion 175 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 193 (posicion 176 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de alanina; el residuo de aminoacido en la posicion 201 (posicion 184 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de tirosina; el residuo de aminoacido en la posicion 203 (posicion 186 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de glutamato; el residuo de aminoacido en la posicion 207 (posicion 190 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de prolina; el residuo de aminoacido en la posicion 211 (posicion 194 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 212 (posicion 195 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de fenilalanina; el residuo de aminoacido en la posicion 218 (posicion 201 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 220 (posicion 203 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina o alanina; el residuo de aminoacido en la posicion 221 (posicion 204 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 223 (posicion 206 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de triptofano o glutamina; el residuo de aminoacido en la posicion 224 (posicion 207 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de glutamato; el residuo de aminoacido en la posicion 226 (posicion 209 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 235 (posicion 218 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de glicina; el residuo de aminoacido en la posicion 246 (posicion 229 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 249 (posicion 232 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 264 (posicion 247 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 272 (posicion 255 en la secuencia sin peptido de senal) no es una cistefna, una leucina o un residuo de histidina; el residuo de aminoacido en la posicion 275 (posicion 258 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de prolina; el residuo de aminoacido en la posicion 289 (posicion 272 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de fenilalanina; el residuo de aminoacido en la posicion 291 (posicion 274 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina; el residuo de aminoacido en la posicion 292 (posicion 275 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 294 (posicion 277 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de tirosina o alanina; el residuo de aminoacido en la posicion 295 (posicion 278 en la secuencia sin peptido de senal) no es una valina, una treonina o un residuo de isoleucina; el residuo de aminoacido en la posicion 297 (posicion 280 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de aspirado; el residuo de aminoacido en la posicion 298 (posicion 281 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina; el residuo de aminoacido en la posicion 299 (posicion 282 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de prolina; el residuo de aminoacido en la posicion 306 (posicion 289 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 307 (posicion 290 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina o leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 311 (posicion 294 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina; el residuo de aminoacido en la posicion 326 (posicion 309 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 327 (posicion 310 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de cistefna, glicina o leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 328 (posicion 311 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 334 (posicion 317 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 339 (posicion 322 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina o glutamato; el residuo de aminoacido en la posicion 348 (posicion 331 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 354 (posicion 337 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 355 (posicion 338 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina o isoleucina; el residuo de aminoacido en la posicion 371 (posicion 354 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 374 (posicion 357 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 377 (posicion 360 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 378 (posicion 361 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de valina; el residuo de aminoacido en la posicion 381 (posicion 364 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 382 (posicion 365 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 389 (posicion 372 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 391 (posicion 374 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de cistefna o histidina; el residuo de aminoacido en la posicion 392 (posicion 375 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de alanina; el residuo de aminoacido en la posicion 395 (posicion 378 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 399 (posicion 382 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina o valina; el residuo de aminoacido en la posicion 400 (posicion 383 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 406 (posicion 389 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de glicina; el residuo de aminoacido en la posicion 410 (posicion 393 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 411 (posicion 394 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de alanina; el residuo de aminoacido en la posicion 414 (posicion 397 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 417 (posicion 400 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 420 (posicion 403 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 423 (posicion 406 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de alanina; el residuo de aminoacido en la posicion 424 (posicion 407 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina; el residuo de aminoacido en la posicion 426 (posicion 409 en la secuencia sin peptido de senal) no es una cistefna o un residuo de acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 428 (posicion 411 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de prolina; el residuo de aminoacido en la posicion 429 (posicion 412 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina; el residuo de aminoacido en la posicion 436 (posicion 419 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de histidina; el residuo de aminoacido en la posicion 445 (posicion 428 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de prolina; el residuo de aminoacido en la posicion 450 (posicion 433 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de histidina o cistefna; el residuo de aminoacido en la posicion 452 (posicion 435 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina; el residuo de aminoacido en la posicion 454 (posicion 437 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 455 (posicion 438 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina o acido aspartico; el residuo de aminoacido en la posicion 456 (posicion 439 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de triptofano o arginina; el residuo de aminoacido en la posicion 459 (posicion 442 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de metionina o leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 466 (posicion 449 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 467 (posicion 450 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 468 (posicion 451 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de treonina; el residuo de aminoacido en la posicion 473 (posicion 456 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 476 (posicion 459 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de lisina o glicina; el residuo de aminoacido en la posicion 478 (posicion 461 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de leucina; el residuo de aminoacido en la posicion 489 (posicion 472 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de serina; el residuo de aminoacido en la posicion 490 (posicion 473 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de fenilalanina; y el residuo de aminoacido en la posicion 491 (posicion 474 en la secuencia sin peptido de senal) no es un residuo de arginina. En otras realizaciones especfficas, una o mas X se definen como cualquiera de los residuos de aminoacidos encontrados en esa posicion en las secuencias del alineamiento o un residuo que constituye una sustitucion conservada o semiconservada de cualquiera de estos residuos de aminoacidos. En otras realizaciones especfficas, las X se definen como cualquiera de los residuos de aminoacidos encontrados en esa posicion en las secuencias del alineamiento. Por ejemplo, el residuo de aminoacido en la posicion 51 (posicion 34 en la secuencia sin peptido de senal) es un residuo de alanina o valina; el residuo de aminoacido en la posicion 177 (posicion 160 en la secuencia sin peptido de senal) es un residuo de alanina o serina; el residuo de aminoacido en la posicion 212 (posicion 195 en la secuencia sin peptido de senal) es un residuo de isoleucina o valina; el residuo de aminoacido en la posicion 291 (posicion 274 en la secuencia sin peptido de senal) es un acido glutamico o un residuo de acido aspartico; y el residuo de aminoacido en la posicion 374 (posicion 357 en la secuencia sin peptido de senal) es un residuo de valina o isoleucina.

Una sALP puede estar opcionalmente glicosilada en cualquiera de uno o mas residuos de aminoacidos apropiados.

Ademas, una sALP puede tener al menos 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) de identidad de secuencia con cualquiera de las sALP descritas en el presente documento.

Una sALP puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas adiciones, supresiones o sustituciones relativas a cualquiera de las sALP descritas en el presente documento.

NP

Cualquier peptido natriuretico o variante del mismo que sea un agonista del receptor B del peptido natriuretico (“NPR-B”), por ejemplo, NPR-B humano, se puede utilizar en cualquiera de los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento.

Los peptidos natriureticos como se describen en el presente documento son peptidos capaces de agonizar NPR-B. Los peptidos natriureticos incluyen el peptido natriuretico auricular (ANP), el peptido natriuretico cerebral (BNP) y el peptido natriuretico de tipo C (CNP). Estos peptidos se unen a tres tipos de receptores que senalizan intracelularmente para modular las funciones fisiologicas. ANP y BNP se unen preferentemente al receptor peptfdico natriuretico A (NPR-A) (tambien conocido como guanilil ciclasa A (GC-A)), y el CNP se une preferentemente al receptor B del peptido natriuretico (NPR-B) (tambien conocido como guanilil ciclasa B (GC-B)). Los tres peptidos tienen afinidad similar por el receptor peptfdico natriuretico C (NPR-C), que tiene funciones de senalizacion y de eliminacion del peptido. La eliminacion de los peptidos natriureticos tambien se produce a traves de la accion de la endopeptidasa neutra unida a la membrana (NEP). La union del peptido a NPR-A o NPR-B activa el dominio intracelular de guanilil ciclasa de estos receptores, lo que produce el segundo mensajero cGMP. cGMP activa o inhibe multiples vfas de senalizacion dentro de la celula.

Los peptidos natriureticos, incluido el CNP, que agoniza principalmente NPR-B, y ANP y BNP, que agonizan principalmente NPR-A, tienen funciones importantes en multiples procesos biologicos. Los alineamientos de secuencias multiples de varios miembros de la familia NP y las secuencias de consenso se muestran en las Figs. 12 14 y 15A-15G.

Un efecto descendente clave de CNP22 y CNP53, y las variantes de los mismos como se describe en el presente documento, en la agonizacion de NPR-B es la osificacion endocondrala. Por lo tanto, los NP descritos en el presente documento son utiles, por ejemplo, para tratar una amplia gama de trastornos asociados con la sobreactivacion de FGFR3 y trastornos del musculo liso vascular.

Los NP incluyen la estructura esquematica mostrada en la Fig. 16, donde se requiere el dominio de anillo y cada uno de la extension N-terminal, segmento corto y la extension C-terminal es opcional. El dominio de anillo tiene una longitud de 17 residuos de aminoacidos, con residuos de cistefna en cada extremo del dominio de anillo (posiciones 1 y 17) que forman un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, el dominio de anillo tiene una secuencia de aminoacidos que cae dentro de una de las secuencias de consenso mostradas en las Figs. 12, 14 o 15A-15G (SEQ ID NO: 6, residuos de aminoacidos 11-27 de SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 95, respectivamente). Cualquiera de los dominios de anillo mostrados en las Figs. 12-14 y 15A-15G pueden usarse en un NP como se describe en el presente documento.

El segmento corto es un segmento inmediatamente N-terminal al dominio de anillo que esta entre 0 y 10 residuos de aminoacidos (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de aminoacidos) de longitud. Los segmentos cortos ejemplares se muestran inmediatamente en el extremo N-terminal a la region del recuadro en la Fig. 12 o la Fig. 14, por ejemplo, los residuos 1-5 de la SEQ ID NO: 4 o los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de aminoacidos inmediatamente N-terminales al dominio de anillo conservado en cualquiera de las especies mostradas en las Figs. 14 y 15A-15G. En algunas realizaciones, el segmento corto consiste en la porcion de 5 aminoacidos inmediatamente N-terminal al dominio de anillo conservado en cualquiera de las especies mostradas en las Figs. 12, 14 o 15A-15G. En algunas realizaciones, el segmento corto confiere mayor selectividad para NPR-B en relacion con NPR-A.

La extension N-terminal es una region inmediatamente N-terminal al segmento corto (si el segmento corto esta presente) o el dominio de anillo (si el segmento corto no esta presente) y puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o incluso mas residuos de aminoacidos. Esta region esta ausente en CNP22, pero esta presente en CNP53 (residuos 1-31 de la SEQ ID NO: 11). Las extensiones N-terminales ejemplares son los 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250 o mas residuos inmediatamente N-terminales al segmento corto, por ejemplo, de 5 residuos de aminoacidos (si esta presente un segmento corto) o inmediatamente N-terminal al dominio de anillo (si no esta presente un segmento corto), de cualquiera de las especies mostradas en las Figs. 15A-15G. En algunas realizaciones, la extension N-terminal proporciona mayor selectividad para NPR-B en relacion con NPR-A.

La extension C-terminal es una region inmediatamente C-terminal al dominio de anillo y puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o incluso mas residuos de aminoacidos. Esta region esta ausente en CNP22 y CNP53, pero esta presente en el peptido hfbrido CDNP (SEQ ID NO: 100, Fig. 24). Las variantes adicionales de CDNP incluyen aquellos que tienen una o mas mutaciones que proporcionan una degradacion reducida de la NEP, como las proporcionadas en la Fig. 24: CDNP-N1 (SEQ ID NO: 101), CDNP-G1 (SEQ ID NO: 102), CDNP-H1 (SEQ ID NO: 103) y CDNP-K1 (SEQ ID NO: 104).

Las extensiones C-terminal ejemplares se muestran inmediatamente en el extremo C-terminal a la region del recuadro en la Fig. 12, por ejemplo, los residuos 24-28 de la SEQ ID NO: 1, residuos de aminoacidos 28-32 de SEQ ID NO: 2, residuos de aminoacidos 27-32 de SEQ ID NO: 3 o residuos de aminoacidos 24-38 de SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, la cola C-terminal incluye, o consiste en, la cola C-terminal de DNP (SEQ ID NO: 117) o una variante del mismo que tenga una o mas mutaciones de adicion, supresion o sustitucion (por ejemplo, la SEQ ID NO: 118). Por ejemplo, una cola C-terminal de un NP puede incluir cualquiera de las mutaciones de cola C-terminal de DNP mostradas en la Fig. 24. En particular, los residuos 1, 3, 4, 5, 6 y / o 7 de la cola C-terminal de DNP (SEQ ID NO: 117) se pueden mutar, por ejemplo, como en cualquiera de las mutaciones mostradas en la Fig. 24. En algunas realizaciones, la extension C-terminal confiere mayor selectividad para NPR-B en relacion con NPR-A.

Un NP puede estar opcionalmente glicosilado en cualquiera de uno o mas residuos de aminoacidos apropiados. Ademas, un NP puede tener al menos un 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) identidad de secuencia con cualquiera de los NP descritos en el presente documento o con uno o mas del dominio de anillo, el segmento corto, la extension C-terminal o la extension N-terminal.

Un NP puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas adiciones, supresiones o sustituciones relativas a cualquiera de los NP descritos en el presente documento, o a uno o mas del dominio de anillo, el segmento corto, la extension C-terminal o la extension N-terminal.

En un ejemplo, el NP puede tener una o mas mutaciones que son menos sensibles a la oxidacion sin reducir sustancialmente la potencia o la eficacia. Por ejemplo, el residuo 17 de CNP22 es una de las posiciones menos conservadas en CNP22, con homologos de origen natural que tienen Phe, Leu, Ile, Thr, Val o Ser en esta posicion (vease, por ejemplo, la Fig. 14). Las variantes ejemplares de CNP22 incluyen CNP-F17 (SEQ ID NO: 119); CNP-L17 (SEQ ID NO: 120); CNP-I17 (SEQ ID NO: 121); CNP-T17 (SEQ ID NO: 122); CNP-V17 (SEQ ID NO: 123); CNP-A17 (SEQ ID NO: 124); CNP-S17 (SEQ ID NO: 125); CNP-E17 (SEQ ID NO: 156); CNP-R17 (SEQ ID NO: 157); y CNP-Y17 (SEQ ID NO: 158), donde la secuencia de consenso se muestra en la SEQ ID NO: 126 (donde X puede ser cualquier aminoacido, incluidos Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, Asp, Val, Ala o Ser) (Fig. 26). Las variantes ejemplares adicionales de CNP22 incluyen aquellas que tienen una mutacion puntual en la posicion 17, como se muestra en la Fig. 30 (SEQ ID NO: 126, 119-122 o 156-172), donde X en las SEQ ID NO: 126 o 162 puede ser cualquier aminoacido, por ejemplo, F, L, I, T, E, R, Y, C, P o D.

En otro ejemplo, el NP puede tener una o mas mutaciones que proporcionan mayor resistencia a una o mas enzimas que escinden CNP in vivo (por ejemplo, endopeptidasa neutra (NEP) y / o enzima de degradacion de insulina (IDE)). Las moleculas ejemplares se muestran en la Fig. 27 (SEQ ID NO: 127-150), Figs. 28A-28E (SEQ ID NO: 1001-1155) y Fig. 29 (SEQ ID NO: 4, 115, 119, 120, 122, 128-139, 147, 148 y 150-155).

Un NP como se describe en el presente documento puede incluir cualquier otra secuencia o fraccion, unida covalentemente o no covalentemente, siempre que el NP tenga la capacidad de agonizar NPR-B.

En algunas realizaciones, un NP como se describe en el presente documento puede ser de no mas de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 residuos de aminoacidos de longitud. Ademas, en algunas realizaciones, un NP como se describe en el presente documento puede ser de no mas de 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8 o 10,0 Kilodalton (kDa) en peso molecular.

Los NP que son adecuados para su uso en las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.° 5.352.770;5.434.133;6.020.168;6.034.231;6.407.211;6.743.425;6.818.619;7.276.481;7.384.917; y7.754.852;la publicacion de solicitud de EE. UU. N.° 2007-0197434;2008-0181903;2008-0312142;2009-0170756;2010-0055150; y2010-0297021; la publicacion de solicitud internacional N.°WO 94/20534;WO 02/047871;WO 2004/047871;WO 2005/098490;WO 2008/154226; y WO 2009/067639; la publicacion de solicitud europea N.° EP 0497368yEP 0466174;Furuya y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 183: 964-969 (1992); Takano y col., Zool. Sci., 11: 451-454 (1994); Plater y col., Toxicon., 36(6): 847-857 (1998); yInoue y col., Proc. Nat. Acad. Sci., 100(17): 10079-10084 (2003). En realizaciones alternativas, los NP a los que se hace referencia en el presente parrafo se excluyen de las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones, cualquiera de los NP descritos en el presente documento puede usarse en las composiciones descritas en el presente documento sin fusion con un dominio Fc o con un enlazador o, de manera alternativa, puede fusionarse con cualquiera de los enlazadores descritos en el presente documento, pero no con un dominio Fc. Dichos NP se pueden usar para tratar un sfndrome neurocutaneo, un trastorno asociado con la sobreactivacion de FGFR3, por ejemplo, acondroplasia, un trastorno oseo o de cartflago, un trastorno del musculo liso vascular o una afeccion por elongacion del hueso, como se describe en el presente documento.

En otras realizaciones, cualquiera de los NP descritos en el presente documento puede incluir una mutacion puntual en la posicion 17 con respecto a CNP22. El CNP22 de tipo salvaje tiene una metionina en la posicion 17 en relacion con CNP22, que puede ser oxidado in vivo y / o que puede proporcionar un peptido que es degradable por una proteasa. Como se describe en el presente documento, las mutaciones puntuales en la posicion 17 en relacion con CNP22 podrfan proporcionar polipeptidos que tienen una degradacion reducida, mientras se mantiene la potencia. Los residuos de aminoacidos ejemplares en la posicion 17 en relacion con CNP22 son Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, Asp, Gly, Ala, Ser, Val, Trp, Asn, Gln, His o Lys, por ejemplo, Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro o Asp, por ejemplo, Phe o Leu, por ejemplo, Phe, por ejemplo, Leu. Por ejemplo, el aminoacido en la posicion 17 en relacion con CNP22 podrfa ser Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro y Asp, por ejemplo, Phe o Leu, por ejemplo, Phe, por ejemplo, Leu. En otro ejemplo, el aminoacido en la posicion 17 en relacion con CNP22 podrfa ser Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala o Ser. De manera alternativa, los residuos de aminoacidos ejemplares en la posicion 17 en relacion con CNP22 son Gly, Ala, Ser, Val, Trp, Asn, Gln, His o Lys.

Ademas, se describe como estando incluidas en las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento moleculas de acido nucleico que codifican cualquiera de los NP y polipeptidos de fusion descritos en el presente documento, asf como moleculas de acido nucleico que se hibridan en condiciones de alta rigurosidad en al menos una porcion, por ejemplo, un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso un 100 %, de una molecula de acido nucleico que codifica cualquiera de los NP o polipeptidos de fusion descritos en el presente documento.

Fragmentos de region de fragmento cristalizable (Fc)

Los polipeptidos de fusion para su uso en la invencion pueden incluir un dominio N-terminal o C-terminal tal como Fc, una region de fragmento cristalizable de una inmunoglobulina. Por ejemplo, un polipeptido de sALP y / o un polipeptido de NP para su uso en la invencion puede ser un polipeptido de fusion que incluye una Fc. Una molecula de inmunoglobulina tiene una estructura que es bien conocida en la tecnica. Incluye dos cadenas ligeras (~23 kD cada una) y dos cadenas pesadas (-50-70 kD cada una) unidas por enlaces disulfuro intercatenarios. Las inmunoglobulinas se escinden con facilidad proteolfticamente (por ejemplo, mediante escision de papafna) en Fab (que contiene la cadena ligera y los dominios VH y CH1 de la cadena pesada) y Fc (que contiene los dominios Ch²y Ch3 de la cadena pesada, junto con las secuencias adyacentes). La escision se produce tfpicamente en una region bisagra flexible que se une a las regiones Fab y Fc. Por ejemplo, la papafna escinde la region bisagra inmediatamente antes de que los enlaces disulfuro se unan a las dos cadenas pesadas.

Los fragmentos Fc utiles como se describen en el presente documento incluyen el fragmento Fc de cualquier molecula de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, y sus diversas subclases (por ejemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1, IgA-2), tomada de cualquier mamffero (por ejemplo, humano). Los fragmentos Fc para su uso en la invencion pueden incluir, por ejemplo, los dominios C^h2y C^h3 de la cadena pesada, asf como cualquier porcion de la region bisagra. Ademas, la region Fc puede estar opcionalmente glicosilada en cualquiera de uno o mas residuos de aminoacidos apropiados, por ejemplo, varios residuos de aminoacidos conocidos por los expertos en la tecnica. En algunas realizaciones, el fragmento Fc es de IgG-1 humana. En realizaciones particulares, el fragmento Fc del polipeptido de fusion tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 401 o tiene al menos 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 401 (Fig. 7).

En algunas realizaciones, las regiones Fc creadas, por ejemplo, de forma no natural, pueden utilizarse en las composiciones para el uso de la invencion, por ejemplo, como se describe en la publicacion de solicitud internacional N.° W02005/007809.

Un fragmento Fc como se describe en el presente documento puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o mas adiciones, supresiones o sustituciones relativas a cualquiera de los fragmentos Fc descritos en el presente documento.

Enlazadores

Las protefnas de fusion descritas en el presente documento pueden incluir una region enlazadora peptfdica entre el fragmento Fc y la sALP o entre el fragmento Fc y el NP. Ademas, se puede incluir una region enlazadora peptfdica entre el fragmento Fc y la fraccion dirigida al hueso opcional. La region enlazadora puede ser de cualquier secuencia y longitud que permita que la sALP o el NP permanezcan biologicamente activos, por ejemplo, sin impedimento esterico. Las longitudes de enlazador ejemplares estan entre 1 y 200 residuos de aminoacidos, por ejemplo, 1-5, 6 10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, 76-80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-110, 111- 120, 121-130, 131-140, 141-150, 151-160, 161-170, 171-180, 181-190 o 191-200 residuos de aminoacidos. Las longitudes de enlazador ejemplares adicionales son 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, ^{4 5}, 46, 47, 48,49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, ^{6 6}, 67, ^{6 8}, 69, 70, 71, 72, 73 , 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, ^{8 6}, 87, ^{8 8}, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 , 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 residuos de aminoacidos. Las longitudes de enlazador ejemplares adicionales son 14-18, 20-24, 26-30, 32-36, 38-42 y 44-48 residuos de aminoacidos.

En algunas realizaciones, los enlazadores incluyen o consisten en porciones flexibles, por ejemplo, regiones sin una estructura secundaria o terciaria fija significativa. Los enlazadores flexibles ejemplares son enlazadores ricos en glicina, por ejemplo, que contienen al menos 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o incluso 100 % de residuos de glicina. Los enlazadores tambien pueden contener, por ejemplo, residuos de serina. En algunos casos, la secuencia de aminoacidos de los enlazadores consiste solo en los residuos de glicina y serina.

En algunos casos, la secuencia de aminoacidos de la secuencia enlazadora incluye o consiste en una secuencia de acuerdo con la formula [(Gly)m(Ser)]n(Gly)p, donde cada uno de m, n y p es, independientemente, 0, 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. En algunas realizaciones, m = 1, 2, 3, 4, 5 o ⁶; n = 1,2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9 o 10; y p = 0, 1, 2, 3 o 4. De manera alternativa, la secuencia enlazadora incluye o consiste en una secuencia de acuerdo con la formula (Gly)p[(Ser)(Gly)m]n, donde cada uno de m, n y p es, independientemente, 0, 1,2, 3,4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. En algunas realizaciones, m = 1, 2, 3, 4, 5 o ⁶; n = 1,2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9 o 10; y p = 0, 1, 2, 3 o 4.

En la T abla 2, se enumeran combinaciones ejemplares de los valores de m, n y p para cualquiera de las dos formulas anteriores.

Tabla 2.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del enlazador (por ejemplo, entre la Fc y la sALP o entre la Fc y el NP o entre la Fc y la fraccion dirigida al hueso opcional) incluye o consiste en una secuencia en la Tabla 3.

Tabla 3.

En algunas realizaciones, el enlazador puede incluir o consistir en un enlazador [(Gly)m(Ser)]n(Gly)por (Gly)p[(Ser)(Gly)m]n como se ha descrito anteriormente, seguido de una de las SEQ ID NO: 314-321, por ejemplo, una de las SEQ ID NO: 314, 315 o 321.

En otras realizaciones de polipeptidos que incluyen una sALP, el enlazador puede incluir o consistir en todo o en un fragmento de una sALP. Por ejemplo, la porcion de 17 aminoacidos de TNALP humana que es una secuencia de senal N-terminal u homologos o variantes o fragmentos de los mismos (por ejemplo, los residuos 1-17 de las SEQ ID NO: 1202 o 1208), se puede utilizar como enlazador. Los homologos de esta region de 17 aminoacidos se pueden identificar, por ejemplo, consultando un alineamiento de secuencia como la Fig. 8 (residuos 1-17 de la SEQ ID NO: 1216, donde X puede ser cualquier aminoacido) o en la Fig. 11 (residuos 1-17 de la SEQ ID NO: 1219, donde X puede ser cualquier aminoacido, pero no una mutacion patogena proporcionada en la Tabla 1). En otro ejemplo, la porcion de anclaje GPI C-terminal de TNALP humana u homologos o variantes o fragmentos de los mismos (por ejemplo, los residuos 503-524 de la SEQ ID NO: 1208) se puede utilizar como enlazador. Los homologos de esta region C-terminal se pueden identificar, por ejemplo, consultando un alineamiento de secuencia como la Fig. 8 (residuos 503-524 de la SEQ ID NO: 1216, donde X puede ser cualquier aminoacido) o en la Fig. 11 (residuos 503-524 de la SEQ ID NO: 1219, donde X puede ser cualquier aminoacido, pero no una mutacion patogena proporcionada en la Tabla 1).

En otras realizaciones de polipeptidos que incluyen un NP, el enlazador puede incluir o consistir en todo o en un fragmento de un NP. Por ejemplo, la porcion de 31 aminoacidos de CNP53 humano que es N-terminal al CNP22 u homologos o variantes de los mismos (por ejemplo, los residuos 4-34 de la SEQ ID NO: 320) se puede utilizar como enlazador. Los homologos de esta region de 31 aminoacidos se pueden identificar, por ejemplo, consultando un alineamiento de secuencia como en las Figs. 15A-15G e identificando las regiones correspondientes a los 31 residuos de aminoacidos N-terminales de CNP53 humano. Tambien se pueden identificar otros enlazadores adecuados, por ejemplo, seleccionando cualquier porcion de un NP, excluyendo de manera opcional un dominio de anillo, como se muestra en las Figs. 15A-15G o en cualquier otro NP o region de un NP que no se muestra en las Figs. 15A-15G. Por ejemplo, la extension C-terminal de DNP (SEQ ID NO: 117) o fragmentos o variantes de los mismos, pueden usarse como enlazadores.

Un enlazador puede estar opcionalmente glicosilado en cualquiera de uno o mas residuos de aminoacidos apropiados. Ademas, un enlazador puede tener al menos 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) de identidad de secuencia con cualquiera de los enlazadores descritos en el presente documento. Ademas, un enlazador puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas adiciones, supresiones o sustituciones relativas a cualquiera de los enlazadores descritos en el presente documento.

Un enlazador como se describe en el presente documento puede incluir cualquier otra secuencia o fraccion, unida covalentemente o no covalentemente.

En algunas realizaciones, el enlazador esta ausente, lo que significa que el fragmento Fc y la sALP se fusionan directamente o que el fragmento Fc y el NP se fusionan directamente, sin residuos intermedios.

Debe observarse que ciertas protefnas de fusion Fc-sALP o sALP-Fc pueden verse, de acuerdo con la presente descripcion, ya sea como 1) que no tiene enlazador, o como 2) que tiene un enlazador que corresponde a una porcion de la sALP. Por ejemplo, la Fc fusionada directamente con hsTNALP (1-502) puede verse, por ejemplo, como si no tuviera un enlazador, donde el NP es hsTNALP (1-502) o como si tuviera un enlazador de 17 aminoacidos, donde el NP es hsTNALP (18-502).

Ademas, debe observarse que ciertas protefnas de fusion Fc-NP o NP-Fc pueden verse, de acuerdo con la presente descripcion, ya sea como 1) que no tiene enlazador, o como 2) que tiene un enlazador que corresponde a una porcion del NP. Por ejemplo, la Fc fusionada directamente con CNP53 puede verse, por ejemplo, como si no tuviera un enlazador, donde el NP es CNP53, o como si tuviera un enlazador de 31 aminoacidos, donde el NP es CNP22. Polipeptidos de sALP

Cualquiera de las sALP y enlazadores descritos en el presente documento pueden combinarse en un polipeptido de sALP, por ejemplo, un polipeptido de sALP de A-sALP-B, donde cada uno de A y B esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. Cuando estan presentes, A y / o B pueden ser cualquier enlazador descrito en el presente documento (por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 301-391). En algunas realizaciones, A esta ausente, B esta ausente o tanto A como B estan ausentes.

Los polipeptidos de sALP para su uso en la invencion pueden incluir opcionalmente una region Fc para proporcionar un polipeptido de fusion sALP, como se describe en el presente documento.

El polipeptido de sALP puede incluir opcionalmente una fraccion dirigida al hueso (por ejemplo, cualquiera descrita en el presente documento). En algunas realizaciones, se puede incluir un enlazador, por ejemplo, un enlazador flexible, entre la fraccion dirigida al hueso y la sALP. Por ejemplo, la Fig. 5B proporciona polipeptidos que tienen tanto una fraccion dirigida al hueso como un enlazador (que se muestra en negrita) entre la region Fc y la fraccion dirigida al hueso. En algunas realizaciones, el enlazador es una secuencia dipeptfdica (por ejemplo, leucina-lisina o acido aspartico-isoleucina) o la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 301-391.

El polipeptido de sALP puede incluir cualquier ALP, mutaciones, secuencia de senal N-terminal, secuencia de GPI C-terminal y / o enlazadores o fragmentos de los mismos, descritos en el presente documento. Por ejemplo, las regiones en cursiva en las Figs. 5B-5C y las secuencias proporcionadas en las Figs. 6 u 8-11 se pueden usar como para cualquiera de las sALP descritas en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO: 1201, 1202, 1204-1216, 1218 y 1219).

Polipeptidos de fusion de sALP

Cualquiera de las sALP, enlazadores y regiones Fc descritos en el presente documento pueden combinarse en un polipeptido de fusion, por ejemplo, un polipeptido de fusion recombinante, que incluye la estructura C-sALP-D-Fc-E, C-Fc-D-sALP-E, C-sALP-D-Fc-G-In-H o C-Fc-D-sALP-G-In-H, donde cada una de C, D (la region enlazadora), E, G (region enlazadora), y H esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido; I representa un acido aspartico o un acido glutamico; y n = 10 a 16. D y G pueden estar ausentes o pueden incluir opcionalmente cualquier enlazador descrito en el presente documento (por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 301-391).

Los polipeptidos para su uso en la invencion incluyen opcionalmente uno o mas residuos de aminoacidos adicionales 1) en el extremo N del polipeptido, 2) entre las regiones sALP y Fc del polipeptido, y 3) en el extremo C del polipeptido. Por lo tanto, la invencion incluye, por ejemplo, composiciones farmaceuticas para el uso que comprenden polipeptidos de la forma C-sALP-D-Fc-E o la estructura C-Fc-D-sALP-E, donde C es uno o mas (por ejemplo, 2,3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas) residuos de aminoacidos adicionales en el extremo N del polipeptido, D es uno o mas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas) residuos de aminoacidos adicionales (es decir, un enlazador) entre las regiones sALP y Fc del polipeptido, y E es uno o mas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas) residuos de aminoacidos adicionales en el extremo C-terminal del polipeptido. En un ejemplo particular, D es el dipeptido leucina-lisina. De manera alternativa, cualquier combinacion de C, D y E puede estar presente o ausente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, tanto C como E estan ausentes, y D esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido. Por ejemplo, el polipeptido puede consistir en la estructura sALP-D-Fc o la estructura Fc-D-sALP. En algunas realizaciones de polipeptidos que consisten en la estructura sALP-D-Fc o Fc-D-sALP, D puede consistir en dos residuos de aminoacidos, por ejemplo, leucina-lisina. Por ejemplo, el polipeptido puede consistir en la estructura sALP-D-Fc. De manera opcional, la secuencia de aminoacidos de sALP es la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1205, la secuencia de aminoacidos de D es leucina-lisina y / o la secuencia de aminoacidos de Fc es la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 401. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del polipeptido consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1204. En algunas realizaciones, el polipeptido incluye una secuencia de aminoacidos de al menos 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 % ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) de identidad de secuencia con una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1204 o 1221.

En algunas realizaciones, el polipeptido incluye una fraccion dirigida al hueso, por ejemplo, que tiene una serie de residuos consecutivos de Asp o Glu, por ejemplo, E6, E⁷, Es, Eg, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D6, D⁷, Ds, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵o D¹⁶. La fraccion dirigida al hueso, si esta presente, puede colocarse en cualquier lugar del polipeptido de fusion, por ejemplo, en o cerca del extremo N-terminal o C-terminal, y / o en la region enlazadora. Por ejemplo, cualquiera de C, D y / o E puede incluir una fraccion dirigida al hueso. En algunas realizaciones, la fraccion dirigida al hueso esta en el extremo C-terminal. Por ejemplo, el polipeptido puede comprender o consistir en la estructura C-sALP-D-Fc-G-In-H o la estructura C-Fc-D-sALP-G-In-H, donde cada una de C, D (la region enlazadora), G (region enlazadora) y H esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, I representa un acido aspartico o un acido glutamico, y n = 10 a 16. En algunas realizaciones, tanto C como H estan ausentes y D y G pueden estar ausentes o pueden incluir opcionalmente cualquier enlazador descrito en el presente documento (por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 301-391). Por ejemplo, el polipeptido puede comprender o consistir en la estructura sALP-D-Fc-G-In o la estructura Fc-D-sALP-G-In.

Un polipeptido de fusion como se describe en el presente documento puede tener al menos 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, ⁸⁶%, 87 %, ⁸⁸%, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) de identidad de secuencia con cualquiera de los polipeptidos de fusion descritos en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 1201, 1204, 1220 o 1221. Ademas, un polipeptido de fusion como se describe en el presente documento puede tener 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o mas adiciones, supresiones o sustituciones relativas a cualquiera de los polipeptidos de fusion descritos en el presente documento. Ademas, en algunas realizaciones, un polipeptido de fusion como se describe en el presente documento puede codificarse por una molecula de acido nucleico que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad a al menos una porcion, por ejemplo, al 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, ^{6 0}%, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso al 100 %, de una molecula de acido nucleico que codifica cualquiera de los polipeptidos, por ejemplo, los polipeptidos de fusion, descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones, pueden introducirse residuos de aminoacidos adicionales en el polipeptido de acuerdo con la estrategia de clonacion utilizada para producir los polipeptidos de fusion. En algunas realizaciones, los residuos de aminoacidos adicionales no proporcionan una senal de anclaje GPI adicional para mantener el polipeptido en una forma soluble. Ademas, en algunas realizaciones, cualquiera de dichos residuos de aminoacidos adicionales, cuando se incorporan en el polipeptido para su uso en la invencion, no proporcionan un sitio de escision para las endoproteasas de la celula huesped. La probabilidad de que una secuencia disenada sea escindida por las endoproteasas de la celula huesped puede predecirse como se describe, por ejemplo, por Lkezawa (Biol. Pharm. Bull.

25:409-417, 2002).

En ciertas realizaciones, los polipeptidos para su uso en la invencion estan asociados en dfmeros o tetrameros. Por ejemplo, dos monomeros de sALP-Fc pueden unirse covalentemente a traves de dos enlaces disulfuro ubicados en las regiones bisagra de los fragmentos Fc.

Polipeptidos de NP

Cualquiera de los NP y enlazadores descritos en el presente documento pueden combinarse en un polipeptido de NP, por ejemplo, un polipeptido de NP de V-NP-W, donde cada uno de V y W esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido.

Los polipeptidos de NP para su uso en la invencion pueden incluir opcionalmente una region Fc para proporcionar un polipeptido de fusion NP, como se describe en el presente documento.

El polipeptido de NP puede incluir opcionalmente una fraccion dirigida al hueso. En algunas realizaciones, se puede incluir un enlazador, por ejemplo, un enlazador flexible, entre la fraccion dirigida al hueso y el NP. Por ejemplo, la Fig. 27 proporciona polipeptidos que tienen un enlazador o tanto una fraccion dirigida al hueso como un enlazador (SEQ ID NO: 128-150); las Figs. 31A-31B proporcionan polipeptidos que tienen un enlazador o tanto una fraccion dirigida al hueso como un enlazador, donde X en cualquiera de las SEQ ID NO: 173-220 puede ser cualquier aminoacido, por ejemplo, F, L, I, T, E, R, Y, C, P o D; y la Fig. 32 proporciona secuencias de aminoacidos para variantes particulares, donde X en las SEQ ID NO: 186-198 es una leucina para proporcionar las secuencias en las SEQ ID NO: 221-233. El polipeptido de NP puede incluir cualquier NP, extensiones N-terminales, extensiones C-terminales y / o enlazadores descritos en el presente documento. Por ejemplo, las regiones en cursiva en las Figs. 30, 31A-31B y 32 se pueden usar como para cualquiera de los NP descritos en el presente documento (vease, por ejemplo, la ^sE^qID NO: 511 516 y 553-558).

Polipeptidos de fusion de NP

Cualquiera de los NP, enlazadores y regiones Fc descritos en el presente documento se pueden combinar en un polipeptido de fusion, por ejemplo, un polipeptido de fusion recombinante, que incluye la estructura X-Fc-Y-NP-Z o la estructura X-NP-Y-Fc -Z, donde cada uno de X, Y (la region enlazadora) y Z esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido.

Las Figs. 17A-17E representan varias estructuras esquematicas posibles de polipeptidos de fusion como se describe en el presente documento. Los homodfmeros Fc-NP o NP-Fc pueden formarse, por ejemplo, debido a los enlaces disulfuro formados por Fc (Figs. 17A y 17B, respectivamente). De manera alternativa, son posibles hfbridos monomerodfmeros en los que un polipeptido de fusion NP-Fc o Fc-NP se une a un dominio Fc libre (Figs. 17C y 17D, respectivamente). Ademas, un monomero NP-Fc puede unirse a un monomero Fc-NP, como se muestra en la Fig. 17E. Estas configuraciones no pretenden ser exhaustivas, sino meramente ejemplares.

Los polipeptidos de fusion ejemplares que tienen un dominio NP N-terminal y un dominio Fc C-terminal incluyen los mostrados en la Fig. 25A e incluyen el CNP-16AAenlzador-Fc-His10(NC1) (SEQ ID NO: 521); CNP-6AAenlzador-Fc-His10(NC3) (SEQ ID NO: 522); CNP-6AAenlazador-Fc (SEQ ID NO: 523); CDNP-Fc (SEQ ID NO: 524), que no tiene enlazador entre el CDNP y las fracciones Fc; CDNP-A17saa-Fc (SEQ ID NO: 525), que tiene una mutacion a alanina en la posicion 17 de la region del CNP22 y mutaciones S3, A4 y A5 en la region de la cola del DNP; y CDNP-A17sra-Fc (SEQ ID NO: 526), que tiene una mutacion a alanina en la posicion 17 de la region del CNP22 y mutaciones S3 y A5 en la region de la cola del DNP. La Fig. 25B es una lista de la secuencia de acido nucleico (SEQ ID NO: 806) de NC1.

El dominio NP en el polipeptido de fusion puede ser cualquier NP descrito en el presente documento. Por ejemplo, cualquiera de las moleculas mostradas en las Figs. 30, 31A-31B y 32, con o sin la fraccion dirigida al hueso, puede fusionarse con un dominio Fc y opcionalmente puede incluir una region enlazadora entre Fc y NP, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una variante de CNP con mutacion M17X puede fusionarse con un dominio Fc, por ejemplo, como se muestra en las Figs. 33A-33E, donde X puede ser cualquier aminoacido, por ejemplo, F, L, I, T, E, R, Y, C, P, D, G, A, S, V, W, N, Q, H o K, por ejemplo, F, L, I, T, E, R, Y, C, P o D, por ejemplo, F o L. En algunas realizaciones, la secuencia es la SEQ ID NO: 530 y X es cualquier aminoacido descrito en el presente documento, por ejemplo, F, L, I, T, E, R, Y, C, P, D, G, A, S, V, W, N, Q, H o K, por ejemplo, F, L, I, T, E, R, Y, C, P o D, por ejemplo, F o L.

En la estructura X-Fc-Y-NP-Z o la estructura X-NP-Y-Fc-Z, X puede incluir uno o mas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas) residuos de aminoacidos adicionales en el extremo N del polipeptido, y Z puede incluir independientemente uno o mas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25,30, 35, 40, 45, 50 o mas) residuos de aminoacidos adicionales en el extremo C del polipeptido.

En algunas realizaciones, el polipeptido incluye una fraccion dirigida al hueso, por ejemplo, que tiene una serie de residuos consecutivos de Asp o Glu, por ejemplo, E6, E⁷, E8, E⁹, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D6, D⁷, D8, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵o D¹⁶. La fraccion dirigida al hueso, si esta presente, puede colocarse en cualquier lugar del polipeptido de fusion, por ejemplo, en o cerca del extremo N-terminal o C-terminal, y / o en la region enlazadora. Por ejemplo, cualquiera de X, Y y / o Z puede incluir una fraccion dirigida al hueso.

En algunos casos, se introducen uno o mas residuos de aminoacidos en el polipeptido de fusion, por ejemplo, dentro de X, Y o Z, como resultado de la estrategia de clonacion utilizada. En algunas realizaciones, cualquiera de dichos residuos de aminoacidos adicionales, cuando se incorporan en el polipeptido para su uso en la invencion, no proporcionan un sitio de escision para las endoproteasas de la celula huesped. La probabilidad de que una secuencia disenada sea escindida por las endoproteasas de la celula huesped puede predecirse como se describe, por ejemplo, por Lkezawa (Biol. Pharm. Bull. 25:409-417, 2002).

En ciertas realizaciones, los polipeptidos de fusion para su uso en la invencion estan asociados en dfmeros, por ejemplo, a traves de dos enlaces disulfuro localizados en las regiones bisagra de los fragmentos Fc.

En algunas realizaciones, los polipeptidos de fusion para su uso en la invencion tienen al menos, por ejemplo, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 40.000 o 50.000 veces la vida media de CNP22 in vivo.

Cualquier protefna de fusion de NP puede expresarse con una secuencia de senal N-terminal para facilitar la secrecion, por ejemplo, los residuos de aminoacidos 1-25 de la SEQ ID NO: 501 o cualquier otra secuencia de senal conocida en la tecnica. Dichas secuencias generalmente se escinden co-traduccionalmente, dando como resultado la secrecion de la version madura de la protefna.

Un polipeptido de fusion como se describe en el presente documento puede tener al menos 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) de identidad de secuencia con cualquiera de los polipeptidos de fusion descritos en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 501-608. Ademas, un polipeptido de fusion como se describe en el presente documento puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o mas adiciones, supresiones o sustituciones relativas a cualquiera de los polipeptidos de fusion descritos en el presente documento. Ademas, en algunas realizaciones, un polipeptido de fusion como se describe en el presente documento puede codificarse por una molecula de acido nucleico que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad a al menos una porcion, por ejemplo, al 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso al 100 %, de una molecula de acido nucleico que codifica cualquiera de los polipeptidos, por ejemplo, los polipeptidos de fusion, descritos en el presente documento.

Las protefnas de fusion incluyen aquellas que tienen una o mas modificaciones que se escinden durante la expresion. Por ejemplo, una protefna de fusion Fc-CNP se diseno como se muestra en las Figs. 18A y 18B. Esta protefna, denominada “Streptag NC2” o “NC2st”, tiene una secuencia de senal N-terminal de 25 aminoacidos que se escinde durante la expresion. La protefna madura tiene la siguiente estructura de dominio, desde el extremo N al extremo C: secuencia strep-tag II (para facilitar la purificacion) flanqueada por secuencias cortas de enlazador; secuencia de escision de la proteasa TEV, seguida de un enlazador corto; dominio Fc de la IgG-1 humana; enlazador rico en glicina de 16 aminoacidos; y CNP22. Esta protefna se puede producir sintetizando qufmicamente la secuencia de codificacion (Fig. 18C, SEQ ID NO: 801) e insertando la secuencia de codificacion en un plasmido de clonacion pequeno utilizando tecnicas estandar conocidas en la tecnica.

Las protefnas de fusion pueden variar en varios aspectos. Por ejemplo, NC2st puede variarse eliminando la secuencia que es N-terminal al dominio Fc (que resulta, por ejemplo, en NC2B, como se muestra en las Figs. 19A-19B), agregando una fraccion dirigida al hueso (que resulta, por ejemplo, en D10-NC2, como se muestra en la Fig. 19A), y / o alterando la longitud del enlazador entre Fc y CNP22 (por ejemplo, NC2B-22 (tambien denominado NC2-22), NC2B-28 (tambien denominado NC2-28), y NC2B-34 (tambien denominado NC2-34), como se muestra en las Figs. 20A-20D). Otras variantes ejemplares de NC2st se muestran en la Fig. 21 (NC2-KgAn KK y NC2-KGANQK) y en la Fig. 22 (NC2-CNP53mut2).

NC2B puede variar en varios aspectos, incluyendo el hecho de tener una mutacion puntual, por ejemplo, en la posicion 17 en relacion con CNP22, tener una fraccion dirigida al hueso, y / o tener regiones enlazadoras modificadas o alteradas. Las protefnas de fusion ejemplares incluyen cualquier secuencia que tenga una region enlazadora modificada o alterada (por ejemplo, las SEQ ID NO: 511-516, como se muestra en la Fig. 34A), en comparacion con NC2B (como se muestra en las Figs. 16A-16B); cualquier secuencia que tenga una fraccion dirigida al hueso, por ejemplo, una fraccion D¹⁰(por ejemplo, las SEQ ID NO: 553-558, como se muestra en la Fig. 34B); cualquier extension N-terminal, extension C-terminal y / o enlazadores para cualquiera de los NP descritos en el presente documento (por ejemplo, las regiones en cursiva en las SEQ ID NO: 511-516 y 553-558, como se muestra en las Figs. 30, 31A-31B, y 32); cualquier secuencia que tenga una sustitucion de fenilalanina (Phe, F) en la posicion 17 en relacion con CNP22 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 559-564, como se muestra en la Fig. 34C), incluidas las secuencias que tienen una modificacion adicional de una fraccion dirigida al hueso D¹⁰en el extremo N (por ejemplo, las SEQ ID NO: 565-570, como se muestra en la Fig. 34D); cualquier secuencia que tenga una sustitucion de leucina (Leu, L) en la posicion 17 en relacion con CNP22 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 571-576, como se muestra en la Fig. 34E), incluidas las secuencias que tienen una modificacion adicional de una fraccion dirigida al hueso D¹⁰en el extremo N (por ejemplo, las SEQ ID NO: 577-582, como se muestra en la Fig. 34F); cualquier secuencia que tenga una sustitucion de arginina (Arg, R) en la posicion 17 en relacion con CNP22 (por ejemplo, SEQ ID NO: 583-588, como se muestra en la Fig. 34G), incluidas las secuencias que tienen una modificacion adicional de una fraccion dirigida al hueso D¹⁰en el extremo N (por ejemplo, las SEQ ID NO: 589-594, como se muestra en la Fig. 34H); y cualquier secuencia que tenga una sustitucion de tirosina (Tyr, Y) en la posicion 17 en relacion con CNP22 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 595-600, como se muestra en la Fig. 34I), incluidas las secuencias que tienen una modificacion adicional de una fraccion dirigida al hueso D¹⁰en el extremo N (por ejemplo, las SEQ ID NO: 601-606, como se muestra en la Fig. 34J).

Los constructos adicionales incluyen protefnas de fusion en las que un dominio Fc N-terminal se fusiona con una variante de CNP53 con una region enlazadora corta Gly3. Una forma alternativa de analizar estos polipeptidos de fusion es que la region enlazadora es Gly3 seguida de los residuos de aminoacidos 1-31 de CNP53 (o variantes de los mismos); visto de esta manera, la region enlazadora conecta el dominio Fc al CNP22 y tiene una longitud de 34 residuos de aminoacidos. Para Fc-CNP53-A (tambien denominado “Fc-CNP53wt”) (SEQ ID NO: 517 (con secuencia de senal) y 518 (sin secuencia de senal); Fig. 23), la posicion 48 de CNP53, correspondiente a la posicion 17 de CNP22, se muto a alanina. F^c-CNP53-^aA^a(tambien denominado “Fc-CNP53mut”)(SEQ ID NO: 519 (con secuencia de senal) y 520 (sin secuencia de senal); Fig. 23) tiene la misma secuencia que Fc-CNP53-A con la excepcion de que los residuos 30 y 31 de CNP53, los dos residuos inmediatamente anteriores a CNP22, se mutan a alanina para reducir la probabilidad de escision proteolftica. En algunos casos, la modificacion de la region enlazadora de una fusion Fc-CNP22 para incluir los primeros 31 residuos de aminoacidos de CNP53 podrfa dar como resultado que los constructos tengan una potencia y una eficacia aun mayores que NC2st en ensayos de membrana y celulas completas in vitro.

Caracterfsticas adicionales del polipeptido

Los polipeptidos para su uso en la invencion tambien incluyen cualquier polipeptido que tenga una o mas modificaciones postraduccionales tales como glicosilacion (por ejemplo, manosilacion y otras formas de glicosilacion descritas en el presente documento), acetilacion, amidacion, bloqueo, formilacion, hidroxilacido de acido gammacarboxiglutamico, metilacion, ubiquitinacion, fosforilacion, modificacion de acido pirrolidona carboxflico y sulfatacion. Tambien se pueden hacer modificaciones artificiales, por ejemplo, pegilacion.

Produccion de acidos nucleicos y polipeptidos

Los acidos nucleicos y polipeptidos descritos para el uso de la invencion pueden producirse mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Tfpicamente, un acido nucleico que codifica la protefna de fusion deseada se genera utilizando procedimientos de clonacion molecular, y generalmente se coloca dentro de un vector, como un plasmido o virus. El vector se usa para transformar el acido nucleico en una celula huesped apropiada para la expresion de la protefna de fusion. Se describen procedimientos representativos, por ejemplo, en Maniatis y col. (Cold Springs Harbor Laboratory, 1989). Se pueden utilizar muchos tipos de celulas como celulas huesped apropiadas, aunque son preferibles las celulas de mamfferos porque pueden conferir modificaciones postraduccionales apropiadas. Por ejemplo, se han utilizado celulas de rinon embrionario humano 293 (HEK293) como huesped para expresar las protefnas de fusion para su uso en la presente invencion, como se describe con mas detalle en los ejemplos a continuacion.

Los polipeptidos para el uso en la invencion se pueden producir en cualquier condicion adecuada para efectuar la expresion del polipeptido en la celula huesped. Dichas condiciones incluyen la seleccion apropiada de un medio preparado con componentes tales como un tampon, bicarbonato y / o HEPES, cloruro similar a iones, fosfato, calcio, sodio, potasio, magnesio, hierro, fuentes de carbono como azucares simples, aminoacidos, potencialmente Ifpidos, nucleotidos, vitaminas y factores de crecimiento como la insulina; medios regulares disponibles comercialmente como alfa-MEM, DMEM, Ham's-F12 e IMDM complementados con de 2-4 mM de L-glutamina y suero bovino fetal al 5 %; medios libres de protefnas animales disponibles en el mercado como Hyclone™ SFM4CHO, Sigma CHO DHFR-, Cambrex POWER™ CHO CD complementados con 2-4 mM de L-glutamina. Estos medios se preparan de forma deseable sin timidina, hipoxantina y L-glicina para mantener una presion selectiva, permitiendo una expresion estable de protefna-producto.

En los ejemplos se dan los detalles adicionales de la produccion de los polipeptidos para su uso en la invencion y los acidos nucleicos descritos.

Aplicaciones terapeuticas

Los polipeptidos y las moleculas de acido nucleico descritos aquf pueden tener una amplia variedad de aplicaciones terapeuticas, por ejemplo, en los campos de los sfndromes neurocutaneos (por ejemplo, neurofibromatosis) o trastornos asociados con la sobreactivacion de FGFR3 (por ejemplo, trastornos del hueso y del cartflago, por ejemplo, acondroplasia o canceres por ejemplo, mieloma multiple) o trastornos oseos o de cartflago (por ejemplo, que no esten asociados con la sobreactivacion de FGFR3) o trastornos del musculo liso vascular. Ademas, los polipeptidos y las moleculas de acido nucleico descritos en el presente documento pueden usarse para cualquier afeccion o trastorno que resultana en la elongacion del hueso.

Sfndromes neurocutaneos

Los polipeptidos y las moleculas de acido nucleico descritos en el presente documento se pueden usar para tratar cualquier trastorno, enfermedad u otra anomalfa asociada con niveles elevados de sangre y / u orina de pirofosfato inorganico (PPi) y / o sobreactivacion de quinasa MAP, como los sfndromes neurocutaneos. Se describe que el polipeptido y las moleculas de acido nucleico se utilizan para tratar un sfndrome neurocutaneo con o sin una manifestacion osea. Los sfndromes neurocutaneos ejemplares incluyen neurofibromatosis (por ejemplo, cualquier tipo descrito en el presente documento, tal como tipo I o tipo II); trastorno similar al sfndrome de Noonan con cabello anageno suelto; trastorno similar al sfndrome de Noonan con leucemia mielomonocftica juvenil (JMML); esclerosis tuberosa; enfermedad de Sturge-Weber; ataxia telangiectasia; enfermedad de von Hippel-Lindau; incontinencia pigmentaria; sfndromes del nevo epidermico, como el nevo sebaceo lineal de Jadassohn; sfndrome del carcinoma nevoide de celulas basales; hipomelanosis de Ito; melanosis neurocutanea; sfndrome de Klippel-Ternaunay; y el sfndrome de Waardenburg, incluidos los tipos I, II, III y IV. Las composiciones farmaceuticas para el uso de la presente invencion son para su uso en un procedimiento para tratar la neurofibromatosis.

Neurofibromatosis

La neurofibromatosis es un sfndrome neurocutaneo autosomico dominante caracterizado por un crecimiento o proliferacion anormal del tejido nervioso, asf como por la produccion de tumores (o neurofibromas) o pigmentacion anormal (por ejemplo, manchas cafes con leche). En particular, la neurofibromatosis puede ir acompanada de manifestaciones oseas (por ejemplo, manifestaciones derivadas de la hipofosfatasia), como estatura baja, escoliosis, osteomalacia, displasia fibrosa osea (por ejemplo, una o mas lesiones en los extremos de o dentro de uno o mas huesos, como el femur, la tibia o el perone), pseudoartrosis (por ejemplo, pseudoartrosis tibial) y / o displasia esqueletica (por ejemplo, displasia tibial, displasia orbital y / o displasia del ala del esfenoides).

La neurofibromatosis o cualquiera de sus manifestaciones o fenotipos, puede tratarse utilizando las composiciones para el uso de la invencion y los procedimientos descritos en el presente documento. Los ejemplos de dichos trastornos, manifestaciones y fenotipos incluyen el tipo clasico de von Recklinghausen (tipo I), ya sea con tumores estromales gastrointestinales (es decir, como en la neurofibromatosis intestinal (tipo 3B)) o sin dichos tumores; un tipo de neuroma acustico (tipo II); un tipo mixto que combina las caracterfsticas de los tipos I y II con caracterfsticas predominantes, como los neuromas acusticos bilaterales, la fosa posterior y los meningiomas cervicales superiores, y los neurofibromas espinales / paraespinales (tipo III, tipo Riccardi o tipo 3A); un tipo atfpico que se distingue por la falta de nodulos Lisch del iris que son caracterfsticos del tipo I (tipo VI); neurofibromatosis segmentaria, que es una variante del tipo I que tiene lesiones que afectan a un area especffica del cuerpo, como un solo segmento del cuerpo o un area que cruza la lfnea media (tipo V); un tipo que tiene solo los sfntomas de manchas cafe con leche sin otras manifestaciones de neurofibromatosis (tipo VI); neurofibromatosis espinal familiar, que es causada por una mutacion en el gen NF1 de la neurofibromina y se considera una variante distinguible de tipo I; otras variantes de tipo I, como el sfndrome carcinoide de neurofibromatosis-feocromocitoma-duodenal; neurofibromatosis con manifestaciones del sfndrome de Noonan, como estatura baja, ptosis, hipoplasia de cara media, cuello reticulado, discapacidades de aprendizaje y debilidad muscular; y schwannomatosis, donde cualquiera de estos trastornos puede incluir o excluir una o mas manifestaciones oseas.

Trastornos asociados con la sobreactivacion de RAS y / o ERK

Se describe que cualquier trastorno, enfermedad u otra anomalfa causada por, o asociada con, la sobreactivacion de RAS y / o ERK puede tratarse utilizando las composiciones y los procedimientos descritos en el presente documento. Estos trastornos, enfermedades y otras anomalfas incluyen el sfndrome de Noonan, el sfndrome de Costello, el sfndrome de Noonan con lentiginosis multiple / sfndrome de LEOPARD, neurofibromatosis tipo 1, sfndrome de Noonan NF-1, fibromatosis gingival hereditaria tipo 1, sfndrome de malformacion capilar-malformacion AV, sfndrome de Legius, trastorno similar al sfndrome de Noonan con cabello anageno suelto, trastorno similar al sfndrome de Noonan con leucemia mielomonocftica juvenil (JMML), sfndrome cardio-facio-cutaneo o sfndrome linfoproliferativo autoinmune, donde cualquiera de estos trastornos puede incluir o excluir una o mas manifestaciones oseas.

Trastornos asociados con la sobreactivacion de FGFR3

Se describe que cualquier trastorno, enfermedad u otra anomalfa causada por, o asociada con, la sobreactivacion de FGFR3, por ejemplo, derivada de una mutacion de ganancia de funcion de FGFR3, puede tratarse utilizando las composiciones y los procedimientos descritos en el presente documento. Estos trastornos, enfermedades y otras anomalfas incluyen trastornos y canceres de huesos o cartflagos, cada uno de los cuales se describe con mas detalle a continuacion.

Trastornos oseos o de cartilago asociados con la sobreactivacion de FGFR3

Se describe que cualquier trastorno, enfermedad u otra anomalfa, por ejemplo, displasia esqueletica, que afecta a la funcion, estructura o crecimiento del hueso o cartilago, puede tratarse utilizando las composiciones y los procedimientos descritos en el presente documento. En particular, el trastorno puede ser una displasia esqueletica que se asocia con la sobreactivacion de FGFR3, como la acondroplasia, incluida la acondroplasia severa con retraso en el desarrollo y la acantosis; el sfndrome de Muenke (craneosinostosis coronal de Muenke); el sfndrome dermoesqueletico de Crouzon; la hipocondroplasia; la displasia tanatoforica tipo I; y la displasia tanatoforica tipo II. Se describe que las composiciones y los procedimientos tambien se pueden utilizar para tratar trastornos oseos o de cartilago no asociados con la sobreactivacion de FGFR3, y estos trastornos se describen con mas detalle a continuacion.

Canceres

Se describe que cualquier cancer que sea causado por, o se asocie con, la sobreactivacion de FGFR3, puede tratarse utilizando las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento. Estos canceres incluyen, por ejemplo, mieloma multiple, sfndromes mieloproliferativos, leucemia (por ejemplo, leucemia de celulas plasmaticas), linfomas, glioblastoma, cancer de prostata, cancer de vejiga y cancer de mama.

Trastornos oseos y de cartilago

Se describe que los polipeptidos y las moleculas de acido nucleico descritos en el presente documento se pueden utilizar para tratar cualquier trastorno, enfermedad, fenotipo u otra anomalfa que afecte la funcion, estructura o crecimiento del hueso o cartilago. Estos trastornos oseos o de cartilago pueden estar, pero no necesariamente tienen que estar, asociados con la sobreactivacion de FGFR3.

Los trastornos oseos y de cartilago ejemplares incluyen displasia esqueletica y cualquier otro trastorno, enfermedad, fenotipo u otras anomalfas relacionadas con el hueso o el cartilago, incluida la acondroplasia (por ejemplo, acondroplasia homocigotica o heterocigotica), acondrogenesis, acrodisostosis, displasia acromesomelica, atelosteogenesis, dolor oseo, deposito de cristales de pirofosfato dihidrato de calcio (CPPD), displasia campomelica, condrodisplasia punctata (por ejemplo, tipo rizomelico de condrodisplasia punctata), disostosis cleidocraneal, femur corto congenito, craneosintosis (por ejemplo, sfndrome de Muenke, sfndrome de Crouzon, sfndrome de Apert, sfndrome de Jackson-Weiss, sfndrome de Pfeiffer o sfndrome dermoesqueletico de Crouzon), dactilia (por ejemplo, braquidactilia, campodactilia, polidactilia o sindactilia), displasia diastrofica, trastornos dentales (por ejemplo, disminucion de la mineralizacion de los dientes y perdida prematura de dientes deciduos, como a traves de la aplasia, la hipoplasia o la displasia del cemento dental), enanismo, displasia disegmentaria, encondromatosis, fibrocondrogenesis, displasia fibrosa, exostosis multiple hereditaria, hipocondroplasia, hipofosfatasia (HPP) (por ejemplo, HPP infantil, HPP de la infancia, HPP perinatal, HPP adulta o odontohipofosfosfatasia), convulsiones relacionados con HPP, raquitismo hipofosfatemico, mineralizacion osea incompleta, sfndrome de Jaffe-Lichtenstein, displasia de Kniest, sfndrome de Kniest, displasia mesomelica de tipo Langer, sfndrome de Marfan, sfndrome de McCune-Albright, micromelia, displasia metafisaria (por ejemplo, displasia metafisaria de tipo Jansen), displasia metatrofica, smdrome de Morquio, displasia mesomelica tipo Nievergelt, neurofibromatosis (por ejemplo, tipo 1, por ejemplo, con manifestaciones oseas o sin manifestaciones oseas; tipo 2; o schwannomatosis), osteoartritis, osteocondrodisplasia, osteogenesis imperfecta (por ejemplo, tipo perinatal letal de osteogenesis imperfecta), osteomalacia, osteopetrosis, osteopoiquilosis, osteoporosis, disostosis periferica, smdrome de Reinhardt, smdrome de Roberts, smdromes de polidactilia de costillas cortas, estatura baja, displasia espondiloepifisaria congenita, displasia espondiloepimetafisaria o displasia tanatoforica. Los trastornos oseos o de cartflago tambien incluyen aquellos que pueden ser diagnosticados, por ejemplo, por niveles elevados en sangre y / u orina de uno o mas marcadores clmicos relacionados con la hipofosfatasia (por ejemplo, niveles elevados de pirofosfato inorganico (PPi), fosfoetanolamina (PEA) y / o piridoxal 5'-fosfato (PLP), retraso del crecimiento con una disminucion de la longitud del hueso largo (como el femur, la tibia, el humero, el radio, el cubito), una disminucion de la densidad media del hueso total o una disminucion de la mineralizacion osea en huesos como el femur, la tibia, las costillas y el metatarso y la falange. El tratamiento de los trastornos oseos o de cartflago se puede observar mediante uno o mas de los siguientes: un aumento de la longitud del hueso largo, un aumento de la mineralizacion en el hueso y / o los dientes, una correccion del arqueamiento de las piernas, una reduccion del dolor oseo y una reduccion de la deposicion de cristales de CPPD en las articulaciones.

Displasia esqueletica

Las displasias esqueleticas son trastornos oseos o de cartflago caracterizados por baja estatura o enanismo. Las displasias esqueleticas son tfpicamente congenitas y pueden incluir numerosas anomalfas ademas de la baja estatura, por ejemplo, extremidades y tronco cortos; piernas arqueadas; marcha de pato; malformaciones del craneo, por ejemplo, una cabeza grande, craneo en forma de hoja de trebol, craneosinostosis (fusion prematura de los huesos en el craneo) o huesos suturales (conexiones anormales como hilos entre los huesos en el craneo); anomalfas de las manos y los pies, por ejemplo, polidactilia (dedos adicionales), pulgares del “autostopista” y unas de manos y pies anormales; o anomalfas en el pecho, por ejemplo, torax en forma de pera o torax estrecho. Tambien pueden presentarse anomalfas no esqueleticas en personas con displasia esqueletica, por ejemplo, anomalfas de los ojos, boca y ofdos, como cataratas congenitas, miopfa, paladar hendido o sordera; malformaciones cerebrales, como hidrocefalia, porencefalia, hidranencefalia o agenesia del cuerpo calloso; defectos cardfacos, como defecto del tabique auricular, conducto arterioso persistente o transposicion de los grandes vasos; retrasos del desarrollo; o retraso mental. Las displasias esqueleticas asociadas con la sobreactivacion de FGFR3 incluyen acondroplasia.

Las displasias esqueleticas incluyen acondroplasia (por ejemplo, acondroplasia homocigotica o heterocigotica), acondrogenesis, acrodisostosis, displasia acromesomelica, atelosteogenesis, displasia campomelica, condrodisplasia punctata (por ejemplo, condrodisplasia punctata de tipo rizomelico), disostosis cleidocraneal, femur corto congenito, craneosinostosis (por ejemplo, el smdrome de Muenke, el smdrome de Crouzon, el smdrome de Apert, el smdrome de Jackson-Weiss, el smdrome de Pfeiffer o el smdrome dermoesqueletico de Crouzon), dactilia (por ejemplo, braquidactilia, campodactilia, polidactilia o sindactilia), displasia diastrofica, enanismo, displasia disegmentaria, encondromatosis, fibrocondrogenesis, displasia fibrosa, exostosis multiple hereditaria, hipocondroplasia, hipofosfatasia (HPP) (por ejemplo, HPP infantil, HPP de la infancia, HPP perinatal, HPP adulta u odontohipofosfatasia), raquitismo hipofosfatemico, smdrome de Jaffe-Lichtenstein, displasia de Kniest, smdrome de Kniest, displasia mesomelica tipo Langer, smdrome de Marfan, smdrome de McCune-Albright, micromelia, displasia metafisaria (por ejemplo, displasia metafisaria de tipo Jansen), displasia metatrofica, smdrome de Morquio, displasia mesomelica de tipo Nievergelt, neurofibromatosis (por ejemplo, tipo 1, por ejemplo, con manifestaciones oseas o sin manifestaciones oseas; tipo 2; o schwannomatosis); osteoartritis, osteocondrodisplasia, osteogenesis imperfecta (por ejemplo, tipo perinatal letal de osteogenesis imperfecta), osteopetrosis, osteopoiquilosis, disostosis periferica, smdrome de Reinhardt, smdrome de Roberts, smdrome de Robinow, smdromes de costillas cortas con polidactilia, baja estatura, displasia espondiloepifisaria congenita o displasia tanatoforica.

En particular, algunas formas de craneosinostosis son el resultado de mutaciones en uno de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, uno o mas de FGFR1, FGFR2 o FGFR3) que causan la activacion de la via MAPK. Este es el caso de Muenke (craneosinostosis coronal de Muenke), Crouzon, Apert, Jackson-Weiss, Pfeiffer y smdromes dermoesqueleticos de Crouzon, por ejemplo. Existe evidencia genetica y bioquímica en la literatura cientffica de que los agentes que pueden prevenir la activacion de la MAP-quinasa (ERK 1/2) pueden prevenir la craneosinostosis en modelos animales. En particular, el uso de un inhibidor de MEK1 / 2 (por ejemplo, U0126), que previene la activacion de ERK1 / 2 puede prevenir la craneosinostosis en un modelo animal de smdrome de Apert (Shukla y col., Nat. Genet. 39:1145, 2007). Por consiguiente, se describe que los compuestos descritos en el presente documento, que pueden prevenir la activacion de la via de la MAP-quinasa, podnan utilizarse para tratar estas formas de craneosinostosis.

Acondroplasia

La acondroplasia es una displasia esqueletica autosomica dominante que es la causa mas comun de enanismo en los seres humanos. Su incidencia es de aproximadamente 1 de cada 20.000 nacidos vivos. Las manifestaciones esqueleticas incluyen retraso del crecimiento (con una altura promedio de adultos de 123-131 cm (4 pies A pulgadas - 4 pies 3A pulgadas)), deformidades del craneo y defectos ortodonticos. Las manifestaciones extraesqueleticas incluyen compresion del cordon cervical (con riesgo de muerte, por ejemplo, por apnea central o convulsiones); estenosis espinal (por ejemplo, dolor en la pierna y en la parte inferior de la espalda); hidrocefalia (por ejemplo, que requiere cirugfa de derivacion cerebral); perdida de audicion por otitis cronica; enfermedad cardiovascular; enfermedad neurologica; mayor frecuencia de accidentes; y obesidad.

Los bebes a menudo se diagnostican al nacer. Mientras que la forma homocigotica suele ser letal, las personas diagnosticadas con la forma heterocigotica tienen una esperanza de vida, como promedio, de 15 anos menos que la poblacion normal.

La acondroplasia heterocigotica u homocigotica o cualquiera de sus manifestaciones o fenotipos, pueden tratarse utilizando las composiciones y los procedimientos descritos en el presente documento. El tratamiento de cualquiera de las formas puede iniciarse lo antes posible en la vida del paciente, por ejemplo, poco despues del nacimiento o incluso en el utero; esto es particularmente importante para el tratamiento de la forma homocigotica, que suele ser mucho mas grave y, a menudo, letal si no se trata.

Hipofosfatasia (HPP)

La HPP es un trastorno de mineralizacion de matriz que se clasifica historicamente segun la edad en el momento del diagnostico e incluye (en orden de la mas grave a la menos grave) formas perinatales, infantil, de infancia, adulta y odontohipofosfatasia. La forma mas grave, la HPP perinatal (letal), se manifiesta como una ausencia casi completa de mineralizacion osea en el utero y puede causar la muerte fetal. Algunos neonatos con HPP perinatal pueden sobrevivir durante varios dfas, pero sufren un aumento del compromiso respiratorio debido a la enfermedad hipoplasica y raquftica del torax. En la HPP infantil, diagnosticada antes de los 6 meses de edad, el desarrollo postnatal parece normal hasta la aparicion de una alimentacion deficiente, un aumento de peso inadecuado y la aparicion de raquitismo. La HPP de la infancia tiene caracterfsticas radiologicas especfficas que muestran un deterioro en la mineralizacion del esqueleto, a veces con desmineralizacion esqueletica progresiva que conduce a fracturas de costillas y deformidad del torax. La HPP de la infancia tiene una expresion clfnica muy variable. Un sfntoma de la HPP de la infancia es la perdida prematura de dientes deciduos como resultado de la aplasia, hipoplasia o displasia del cemento dental que conecta la rafz del diente con el ligamento periodontal. Otro sfntoma de la HPP de la infancia es el raquitismo, que causa baja estatura y deformidades esqueleticas como las piernas arqueadas y las munecas, rodillas y tobillos agrandados como resultado de la metafisis ensanchada. La HPP adulta generalmente se presenta durante la mediana edad, pero con frecuencia esta precedida por un historial de raquitismo y / o perdida temprana de dientes, acompanada de buena salud durante la adolescencia y la vida adulta joven. En la HPP adulta, son frecuentes las fracturas recurrentes del metatarsiano por estres, y la deposicion de dihidrato de pirofosfato de calcio puede causar ataques de artritis y artropatfa de pirofosfato. Finalmente, la odontohipofosfatasia se diagnostica cuando la unica anomalfa clfnica es la enfermedad dental, y los estudios radiologicos e incluso las biopsias oseas no revelan signos de raquitismo ni osteomalacia.

Las formas clfnicas mas graves de HPP generalmente se heredan como rasgos autosomicos recesivos, y los padres de estos pacientes muestran niveles subnormales de actividad AP en suero. Para las formas mas leves de HPP, es decir, HPP adulta y odontohipofosfatasia, tambien se ha documentado un patron de herencia autosomico dominante. En el esqueleto sano, la TNALP es una ectoenzima presente en la superficie de la membrana plasmatica de los osteoblastos y condrocitos, y en las membranas de sus vesfculas de matriz de cambio (MV), donde la enzima esta particularmente enriquecida. La deposicion de hidroxiapatita durante la mineralizacion osea normalmente se inicia dentro del lumen de estas MV. La microscopfa electronica ha demostrado que las MV deficientes en TNALP de pacientes con HPP gravemente afectados y ratones Akp2'/_ (un modelo de raton nulo en TNALP, vease mas abajo) contienen cristales de hidroxiapatita, pero la propagacion de cristales extravesiculares parece retardada. Este defecto se atribuye a la acumulacion extracelular de PPi, un potente inhibidor de la calcificacion, debido a una deficiencia de la actividad de TNALP.

En concentraciones fisiologicas (0,01-0,1 mM), PPi tiene la capacidad de estimular la mineralizacion. Esto se ha demostrado en femures de pollos cultivados en organos y en MV de rata aislada. Sin embargo, a concentraciones superiores a 1 mM, el PPi inhibe la formacion de minerales de fosfato de calcio mediante el recubrimiento de cristales de hidroxiapatita, lo que evita el crecimiento de cristales minerales y la autonucleacion proliferativa. Por lo tanto, el PPi tiene un doble papel fisiologico: funciona como un promotor de la mineralizacion en bajas concentraciones, ademas de como un inhibidor de la mineralizacion en altas concentraciones. Se ha demostrado que la TNALP hidroliza el inhibidor de mineralizacion PPi para facilitar la precipitacion y el crecimiento de los minerales. Estudios recientes que utilizan los ratones Akp2-/- han indicado que la funcion principal de la TNALP in vivo es restringir el tamano del conjunto de PPi extracelular para permitir una adecuada mineralizacion esqueletica.

La gravedad de la hipofosfatasia depende de la naturaleza de la mutacion de TNALP. Se ha descubierto que las mutaciones con cambio de sentido en una variedad de posiciones en la TNALP, incluyendo la vecindad del sitio activo de la enzima, la interfaz homodfmera, el dominio de corona, el brazo amino-terminal y el sitio de enlace de calcio, afectan su actividad catalftica. Ademas, se ha demostrado que las mutaciones con cambio de sentido, sin sentido, con desplazamiento del marco de lectura y de sitio de empalme conducen a protefnas mutantes aberrantes o defectos de trafico intracelular que conducen a una actividad subnormal en la superficie celular. La multitud de mutaciones que causan HPP, y el hecho de que la heterocigosidad compuesta es una ocurrencia comun en la HPP, explica la expresividad variable y la penetrancia incompleta que se observa a menudo en esta enfermedad.

El progreso en la forma humana de HPP se ha beneficiado enormemente de la existencia de los ratones con cero TNALP (Akp2rl~), un modelo animal de HPP. Los ratones Akp2~'~son una feno

infantil: nacen con un esqueleto normalmente mineralizado, pero desarrollan raquitismo radiograficamente aparente a los 6 dfas de edad, y mueren entre los dfas 12 y 16 sufriendo hipomineralizacion esqueletica severa y episodios de apnea y convulsiones epilepticas atribuibles a perturbaciones metabolicas en PLP (vitamina B6).

Tanto PPi como PLP son sustratos naturales confirmados de TNALP, y se ha demostrado que algunas mutaciones del sitio activo de TNALP tienen diferentes efectos sobre la capacidad de la enzima para metabolizar PPi y PLP. Las anomalfas en el metabolismo del PLP explican las convulsiones epilepticas observadas en ratones Akp2-/-, mientras que las anomalfas en el metabolismo de PPi explican el fenotipo esqueletico en este modelo de raton de HPP. En cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento se administran opcionalmente en una cantidad que es terapeuticamente eficaz para tratar un fenotipo de HPP seleccionado del grupo que consiste en convulsiones relacionados con HPP, perdida prematura de dientes deciduos, mineralizacion osea incompleta, niveles elevados de PPi en sangre y / u orina, niveles elevados de PEA en sangre y / u orina, niveles elevados de PLP en sangre y / u orina, aumento inadecuado de peso, raquitismo, dolor oseo, deposicion de cristales de dihidrato de pirofosfato de calcio, aplasia, hipoplasia y displasia del cemento dental. En alguna descripcion, la mineralizacion incompleta del hueso es una mineralizacion incompleta del hueso femoral, una mineralizacion incompleta del hueso tibial, una mineralizacion incompleta del hueso metatarsiano o una mineralizacion incompleta del hueso de la costilla.

Trastornos del musculo liso vascular

Los polipeptidos y las moleculas de acido nucleico descritos en el presente documento se pueden utilizar para tratar cualquier trastorno, enfermedad u otra anomalfa que afecte la funcion, estructura o crecimiento del musculo liso vascular. Por ejemplo, los peptidos natriureticos modulan la homeostasis del agua y la sal en el cuerpo y de esta manera actuan como reguladores de la presion arterial. Los peptidos que pertenecen a esta familia tienen secuencias de aminoacidos variables y se secretan a traves de diferentes mecanismos por diversos tejidos del cuerpo. Por ejemplo, las celulas musculares liberan ANP en las camaras superiores (auriculas) del corazon (miocitos auriculares) y este actua como un vasodilatador; el BNP es secretado por las camaras inferiores (ventrfculos) del corazon en respuesta al estres cardfaco; y el CNP ejerce un efecto natruretico y natriuretico y regula el tono vascular, inhibe la migracion y la proliferacion de las celulas del musculo liso vascular. Por consiguiente, los polipeptidos y composiciones de la invencion pueden utilizarse para tratar trastornos del musculo liso vascular. Los trastornos del musculo liso vascular ejemplares son la hipertension, la restenosis, la arteriosclerosis, la insuficiencia cardfaca descompensada aguda, la insuficiencia cardfaca congestiva, el edema cardfaco, el nefredema, el edema hepatico, la insuficiencia renal aguda y la insuficiencia renal cronica.

Condiciones para la elongacion de hueso

Cualquier afeccion, trastorno, enfermedad u otra anomalfa que se beneficiarfa de la elongacion del hueso puede tratarse utilizando las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento. Estas afecciones, trastornos, enfermedades y otras anomalfas incluyen un crecimiento oseo insuficiente o deficiente derivado de fracturas, fallo o insuficiencia renal, mala alimentacion, deficiencia de vitaminas o deficiencia de hormonas. Los sujetos sanos, por ejemplo, aquellos sin condiciones, trastornos, enfermedades u otras anomalfas relacionadas con el hueso o el cartflago, tambien pueden tratarse utilizando las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento, por ejemplo, con fines cosmeticos.

Las displasias esqueleticas tambien se asocian con segmentos mas cortos de huesos largos. Las displasias esqueleticas ejemplares incluyen aquellas asociadas con la rizomelia (o acortamiento en un segmento proximal de una extremidad, por ejemplo, en el humero o femur), como acondroplasia, atelosteogenesis, femur corto congenito, displasia diastrofica, hipocondroplasia, displasia metafisaria de tipo Jansen, condrodisplasia punctata de tipo rizomelica, displasia espondiloepifisaria congenita y displasia tanatoforica; mesomelia (o acortamiento en un segmento medio de una extremidad, por ejemplo, en el radio, cubito, tibia o perone), como los tipos de displasias mesomelicas de Langer y Nievergelt, sfndrome de Robinow y sfndrome de Reinhardt; acromelia (o acortamiento en un segmento distal de una extremidad, por ejemplo, en los metacarpianos o falanges), como la acrodisostosis y la disostosis periferica; acromesomelia (o acortamiento en los segmentos medio y distal de las extremidades, por ejemplo, en los antebrazos y las manos), como la displasia acromesomelica; micromelia (o acortamiento de toda la extremidad), como acondrogenesis, fibrocondrogenesis, displasia disegmentaria, displasia de Kniest y sfndrome de Roberts; o de tronco corto, como la enfermedad de Dyggve-Melchior-Clausen, el sfndrome de Kniest, la displasia metatrofica, el sfndrome de Morquio, la displasia espondiloepimetafisaria y la displasia espondiloepifisaria congenita.

Terapia de combination

Se describe que las combinaciones de los polipeptidos para el uso de la invencion (por ejemplo, una combinacion de un polipeptido de sALP y un polipeptido de NP, tal como una combinacion de una protefna de fusion sALP y una protefna de fusion NP) son utiles para el tratamiento de cualquier enfermedad o afeccion descrita en el presente documento. La terapia se puede realizar sola o en combinacion con otra terapia (por ejemplo, cirugfa, radioterapia, inmunoterapia o terapia genica). Ademas, una persona que tenga un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad descrita en el presente documento (por ejemplo, alguien que este geneticamente predispuesto o alguien que haya tenido previamente un sfndrome neurocutaneo) puede recibir tratamiento profilactico para inhibir o retrasar la formacion de la enfermedad. La duracion de la terapia de combinacion depende del tipo de enfermedad o trastorno que se este tratando, la edad y el estado del paciente, la etapa y el tipo de enfermedad del paciente y la forma en que el paciente responde al tratamiento. La terapia puede administrarse en ciclos de encendido y apagado que incluyen perfodos de descanso para que el cuerpo del paciente tenga la oportunidad de recuperarse de cualquier posible efecto secundario imprevisto.

La administracion de una combinacion de los polipeptidos para el uso en la presente invencion (por ejemplo, una combinacion de un polipeptido de sALP y un polipeptido de NP) permite la administracion de dosis inferiores de cada polipeptido, proporcionando una eficacia similar y una toxicidad inferior en comparacion con la administracion de cualquiera de los dos polipeptidos individualmente. De manera alternativa, dichas combinaciones dan como resultado una eficacia mejorada en el tratamiento de una enfermedad descrita en el presente documento (por ejemplo, un sfndrome neurocutaneo, como la neurofibromatosis) con eventos adversos similares o reducidos sobre el agente individual, a dosis moderadas o altas.

Formulation

La formulacion dependera de la via de administracion, asf como de otros objetivos terapeuticos. Los polipeptidos y las moleculas de acido nucleico descritos en el presente documento pueden administrarse por cualquier via conocida en la tecnica, por ejemplo, subcutanea (por ejemplo, mediante inyeccion subcutanea), por via intravenosa, oral, nasal, intramuscular, sublingual, intratecal o intradermica. A modo de ejemplo, las composiciones farmaceuticas para el uso de la invencion pueden estar en forma de lfquido, solucion, suspension, pfldora, capsula, tableta, capsula de gel, polvo, gel, pomada, crema, nebulosas, neblina, vapor atomizado, aerosol o fitosoma.

En algunas realizaciones de la invencion, las composiciones para el uso de la invencion pueden administrarse por via subcutanea. La administracion subcutanea es ventajosa porque es relativamente no invasiva y ofrece perfiles farmacocineticos deseables. Los expertos en la tecnica conocen los volumenes adecuados, y tfpicamente son de 5 ml o inferiores (por ejemplo, 4 ml, 3,5 ml, 3 ml, 2,7 ml, 2,5 ml, 2,3 ml, 2,2 ml, 2,1 ml, 2,0 ml, 1,9 ml, 1,8 ml, 1,7 ml, 1,5 ml, 1,3 ml, 1,0 ml, 0,7 ml, 0,5 ml, 0,3 ml, 0,1 ml, 0,05 ml, 0,01 ml o inferiores). Tfpicamente, las composiciones para el uso de la invencion se pueden formular a una concentracion entre 1 mg / ml y 500 mg / ml (por ejemplo, entre 10 mg / ml y 300 mg / ml, 20 mg / ml y 120 mg / ml, 40 mg / ml y 200 mg / ml, 30 mg / ml y 150 mg / ml, 40 mg / ml y 100 mg / ml, 50 mg / ml y 80 mg / ml o 60 mg / ml y 70 mg / ml) para la administracion subcutanea.

Para la administracion oral, los comprimidos o capsulas se pueden preparar por medios convencionales con excipientes farmaceuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes, aditivos, lubricantes, desintegrantes o agentes humectantes. Los comprimidos se pueden recubrir mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica. Las preparaciones lfquidas para administracion oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su constitucion con solucion salina u otro vehfculo lfquido adecuado antes de su uso. Las composiciones para el uso de la invencion para administracion oral tambien pueden contener excipientes farmaceuticamente aceptables tales como agentes de suspension, agentes emulsionantes, vehfculos no acuosos, conservantes, sales tampon, agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes, segun sea apropiado. Las preparaciones para administracion oral tambien pueden formularse adecuadamente para obtener una liberacion controlada de los ingredientes activos. Los recubrimientos entericos se pueden utilizar ademas en tabletas para el uso de la presente invencion para resistir el contacto prolongado con el fluido gastrico fuertemente acido, pero se disuelven en el ambiente intestinal ligeramente acido o neutro. El ftalato de acetato de celulosa, Eudragit™ y el ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP) se pueden utilizar en recubrimientos entericos de composiciones farmaceuticas para el uso de la presente invencion. Las concentraciones de ftalato de acetato de celulosa generalmente utilizadas son 0,5 al 9,0 % del peso del nucleo. La adicion de plastificantes mejora la resistencia al agua de este material de recubrimiento, y las formulaciones que usan dichos plastificantes son mas efectivas que cuando el acetato de celulosa se usa solo. El ftalato de acetato de celulosa es compatible con muchos plastificantes, incluido el monoglicerido acetilado; el glicolato de butilo ftalilbutilo; el tartrato de dibutilo; el ftalato de dietilo; el ftalato de dimetilo; el glicolato de etil ftaliletilo; la glicerina; el propilenglicol; la triacetina; el citrato de triacetina; y la tripropionina. Tambien se usa en combinacion con otros agentes de recubrimiento como la etilcelulosa, en preparaciones de liberacion controlada de medicamentos.

Los compuestos para el uso en la invencion se pueden administrar en combinacion con disolventes, suspensiones o emulsiones farmaceuticamente aceptables, esteriles, acuosos o no acuosos. Ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol, el polietilenglicol, el aceite vegetal, el aceite de pescado y los esteres organicos inyectables. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones de agua-alcohol, emulsiones o suspensiones que incluyen solucion salina y vehfculos parenterales medicos tamponados que incluyen solucion de cloruro de sodio, solucion de dextrosa de Ringer, solucion de dextrosa mas cloruro de sodio, solucion de Ringer que contiene lactosa o aceites fijos. Los vehfculos intravenosos pueden incluir regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares.

En algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas para el uso de la presente invencion pueden administrarse en un sistema de liberacion controlada. En algunas realizaciones, se pueden utilizar materiales polimericos que incluyen acido polilactico, poliortoesteres, copolfmeros de bloques anfipaticos entrecruzados e hidrogeles, acido polihidroxibutfrico y polihidropiranos (vease tambien Smolen y Ball, Controlled Drug Bioavailability, Drug product design and performance, 1984, John Wiley & Sons; Ranade y Hollinger, Drug Delivery Systems, pharmacology and toxicology series, 2003, 2nd edition, CRC Press). En otra realizacion, se puede utilizar una bomba (Saudek y col., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574).

Las composiciones para el uso de la invencion se podrfan formular en forma de un polvo liofilizado utilizando soluciones de excipientes apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes.

Ademas, pueden aislarse celulas de un individuo que tiene un sfndrome neurocutaneo, un trastorno asociado con la sobreactivacion de FGFR3, por ejemplo, acondroplasia, un trastorno oseo o de cartflago o un trastorno del musculo liso vascular o de un individuo que se beneficiarfa de la elongacion osea; transformarse con un acido nucleico descrito en el presente documento; e introducirse en el individuo afectado (por ejemplo, inyeccion subcutanea o intravenosa). De manera alternativa, el acido nucleico puede administrarse directamente al individuo afectado, por ejemplo, mediante inyeccion. El acido nucleico tambien puede administrarse a traves de un vehfculo como un liposoma, que puede disenarse para destinarse a un tipo de celula especffico y disenarse para administrarse a traves de diferentes vfas.

Los polipeptidos o composiciones para el uso de la presente invencion tambien se pueden utilizar en combinacion con al menos otro ingrediente activo para corregir, por ejemplo, un fenotipo de acondroplasia, neurofibromatosis, HPP o cualquier otro trastorno o afeccion descrito en el presente documento.

Para la terapia de combinacion, dos o mas de los polipeptidos para el uso de la presente invencion (por ejemplo, un polipeptido de sALP y un polipeptido de NP) se formulan en una variedad de formas que se conocen en la tecnica. Por ejemplo, el primer y segundo polipeptidos pueden formularse juntos o por separado. En algunas realizaciones, el primer y segundo polipeptidos se formulan juntos para la administracion simultanea o casi simultanea de los polipeptidos. Dichas composiciones coformuladas pueden incluir el polipeptido de sALP y el polipeptido de NP formulados juntos en la misma pfldora, capsula, lfquido, etc.

La administracion de cada compuesto en formulaciones de liberacion controlada es util cuando el polipeptido de sALP o el polipeptido de NP tiene (i) un mdice terapeutico estrecho (por ejemplo, la diferencia entre la concentracion plasmatica que conduce a efectos secundarios daninos o reacciones toxicas y la concentracion plasmatica que conduce al efecto terapeutico es pequeno; en general, el mdice terapeutico, TI, se define como la relacion entre la dosis letal media (LD⁵⁰) y la dosis efectiva media (ED⁵⁰)); (ii) una ventana de absorcion estrecha en el tracto gastrointestinal; (iii) una vida biologica media corta, como la degradacion en vivo por NEP y / o IDE; o (iv) el perfil farmacocinetico de cada componente debe modificarse para maximizar la exposicion del neoplasma a una cantidad de cada agente, en conjunto, que sea terapeuticamente eficaz. Por consiguiente, se puede utilizar una formulacion de liberacion sostenida para evitar la dosificacion frecuente que puede requerirse para mantener los niveles plasmaticos de ambos agentes a un nivel terapeutico.

Se pueden seguir muchas estrategias para obtener una liberacion controlada en la que el mdice de liberacion sea mayor que el mdice de metabolismo del polipeptido terapeutico. Por ejemplo, la liberacion controlada se puede obtener mediante la seleccion apropiada de los parametros de formulacion y los ingredientes (por ejemplo, composiciones y recubrimientos de liberacion controlada apropiados). Los ejemplos incluyen composiciones de comprimidos o capsulas de unidades individuales o multiples, soluciones de aceite, suspensiones, emulsiones, microcapsulas, microesferas, nanopartmulas, parches y liposomas. El mecanismo de liberacion de control puede ser tal que el compuesto del polipeptido de sALP se libere primero, seguido del polipeptido de NP o viceversa. El mecanismo de liberacion tambien puede controlarse de modo que los dos polipeptidos se liberen a intervalos periodicos, la liberacion podna ser simultanea o una liberacion retardada de uno, cuando se prefiere la liberacion de un medicamento en particular, sobre el otro.

Las formulaciones de liberacion controlada pueden incluir un polfmero degradable o no degradable, hidrogel, organogel u otro constructo ffsico que modifique la bioabsorcion, la vida media o la biodegradacion del agente. La formulacion de liberacion controlada puede ser un material que se pinta o de lo contrario, se aplica en el sitio afectado, ya sea interna o externamente. En un ejemplo, los hidrogeles, como los descritos en la patente de EE. UU. N.° 5.626.863pueden utilizarse en formulaciones de liberacion controlada de composiciones para el uso de la invencion. Estos polfmeros biodegradables se pueden adaptar para degradarse a una velocidad deseada y con una cinetica deseada seleccionando los monomeros apropiados, el procedimiento de preparacion y el peso molecular. Las diferencias en la cristalinidad del monomero pueden alterar la velocidad de degradacion del polfmero. Debido a la naturaleza relativamente hidrofoba de la mayona de los polfmeros, la perdida de masa real puede comenzar con los fragmentos oligomericos que son lo suficientemente pequenos como para ser solubles en agua; por lo tanto, incluso el peso molecular inicial puede influir en el mdice de degradacion.

Los polipeptidos formulados individualmente o por separado se pueden empaquetar juntos en forma de kit. Los ejemplos incluyen kits que contienen, por ejemplo, dos pfldoras, una pfldora y un polvo, un supositorio y un lfquido en un frasco, dos cremas topicas, entre otros. El kit puede incluir componentes opcionales que ayudan en la administracion de la dosis unitaria a los pacientes, como viales para reconstituir formas en polvo, jeringas para inyeccion o administracion subcutanea, sistemas de administracion IV personalizados, inhaladores, entre otros. Ademas, el kit de dosis unitaria puede contener instrucciones para la preparacion y administracion de las composiciones. El kit puede fabricarse como una dosis unitaria de uso unico para un sujeto, usos multiples para un sujeto particular (a una dosis constante o en la que los polipeptidos individuales pueden variar en potencia a medida que avanza la terapia); o el kit puede contener dosis multiples adecuadas para la administracion a multiples sujetos (“envase a granel”). Los componentes del kit se pueden envasar en cajas de carton, envases tipo blister, botellas, tubos y similares.

Terapia genica

Los polipeptidos descritos en el presente documento tambien podnan administrarse ventajosamente a traves de terapia genica, donde un acido nucleico exogeno que codifica las protemas se administra a tejidos de interes y se expresan in vivo. Se describen los procedimientos de terapia genica, por ejemplo, en Verme y col. (Nature 389:239 242, 1997), Yamamoto y col. (Molecular Therapy 17: S67-S68, 2009), y Yamamoto y col., (J. Bone Miner. Res. 26:135 142, 2011). Se pueden utilizar sistemas de vectores tanto virales como no virales. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plasmidos, cromosomas artificiales (por ejemplo, cromosomas artificiales de bacterias, mairnferos o levaduras), vectores de virus o fagos provistos de un origen de replicacion y, opcionalmente, un promotor para la expresion del acido nucleico que codifica el polipeptido viral y opcionalmente, un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o mas genes marcadores seleccionables, por ejemplo, un gen de resistencia a la ampicilina o kanamicina en el caso de un plasmido bacteriano o un gen de resistencia para un vector fungico. Los vectores se pueden utilizar in vitro, por ejemplo, para la produccion de ADN, ARN o el polipeptido viral, o se pueden utilizar para transfectar o transformar una celula huesped, por ejemplo, una celula huesped de mai^ero, por ejemplo, para la produccion del polipeptido viral codificado por el vector. Los vectores tambien pueden adaptarse para ser utilizados in vivo, por ejemplo, en un procedimiento de vacunacion o terapia genica.

Los ejemplos de vectores virales adecuados incluyen retrovirales, lentivirales, adenovirales, virales adenoasociados, virus herpeticos, incluyendo el virus del herpes simple, el virus alfa, el virus de la viruela, tal como la viruela del canario y sistemas basados en el virus de la vaccinia. Las tecnicas de transferencia genica que utilizan estos virus son conocidas en la tecnica. Los vectores de retrovirus, por ejemplo, pueden utilizarse para integrar de manera estable los acidos nucleicos en el genoma huesped. Los vectores de adenovirus defectuosos en la replicacion, en cambio, siguen siendo episomales y, por lo tanto, permiten la expresion transitoria. Pueden emplearse vectores capaces de dirigir la expresion en celulas de insectos (por ejemplo, vectores de baculovirus), en celulas humanas, levaduras o bacterias para producir cantidades del (de los) polipeptido (s) viral(es) codificado(s) por los acidos nucleicos, por ejemplo, para su uso en vacunas subunitarias o en inmunoensayos. Los procedimientos de terapia genica utiles incluyen los descritos en el documento WO 06/060641, patente de EE. UU. N.° 7.179.903y el documento WO 01/36620, que utilizan un vector de adenovirus para destinar un acido nucleico de interes a los hepatocitos como celulas productoras de protefnas.

En un ejemplo adicional, un vector de adenovirus de simio de replicacion deficiente se puede utilizar como un vector vivo. Estos virus contienen una supresion de E1 y pueden crecer en lfneas celulares que se transforman con un gen E1. Ejemplos de estos vectores de adenovirus de simios de replicacion deficiente se describen en la patente de EE. UU. N.° 6.083.716y el documento WO 03/046124. Estos vectores pueden manipularse para insertar un acido nucleico, de tal manera que se pueda expresar el o los polipeptidos virales codificados.

Los promotores y otras senales reguladoras de expresion pueden seleccionarse para que sean compatibles con la celula huesped para la cual se disena la expresion. Por ejemplo, los promotores de mamfferos incluyen el promotor de metalotionefna, que puede inducirse en respuesta a metales pesados como el cadmio, y el promotor de la p-actina. Tambien pueden utilizarse los promotores virales, como el promotor del antfgeno T grande SV40, el promotor temprano inmediato (1E) del citomegalovirus humano (CMV), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous, el promotor de adenovirus o un promotor del VPH, en particular la region reguladora ascendente del VPH (URR, por sus siglas en ingles). Todos estos promotores, asf como promotores adicionales, estan bien descritos en la tecnica.

Las moleculas de acido nucleico descritas en el presente documento tambien pueden administrarse usando sistemas no virales. Por ejemplo, estos sistemas de administracion incluyen encapsulacion de microesferas, poli(lactida-coglicolida), nanopartfculas y sistemas a base de liposomas. Los sistemas no virales tambien incluyen tecnicas que facilitan el suministro de polinucleotidos “desnudos” (como la electroporacion, el suministro por “biolfstica” y varias otras tecnicas utilizadas para la introduccion de polinucleotidos).

El polinucleotido introducido puede mantenerse de forma estable o transitoria en la celula huesped. El mantenimiento estable generalmente requiere que el polinucleotido introducido contenga un origen de replicacion compatible con la celula huesped o se integre en un replicon de la celula huesped como un replicon extracromosomico (por ejemplo, un plasmido) o un cromosoma nuclear o mitocondrial.

Dosis

Cualquier cantidad de un polipeptido o una composicion farmaceutica para el uso de la invencion puede administrarse a un sujeto. Las dosis dependeran de muchos factores, incluido el modo de administracion y la edad del sujeto. Tfpicamente, la cantidad de la composicion para el uso de la invencion contenida dentro de una dosis unica sera una cantidad que sea efectiva para tratar un sfndrome neurocutaneo, un trastorno asociado con la sobreactivacion de FGFR3, un trastorno oseo o de cartflago o un trastorno del musculo liso vascular o para alargar el hueso, sin inducir una toxicidad significativa. Por ejemplo, los polipeptidos descritos en el presente documento pueden administrarse a sujetos en dosis individuales que varfan, por ejemplo, de 0,01 mg / kg a 500 mg / kg (por ejemplo, de 0,05 mg / kg a 500 mg / kg, de 0,2 mg / kg a 20 mg / kg, de 5 mg / kg a 500 mg / kg, de 0,1 mg / kg a 100 mg / kg, de 10 mg / kg a 100 mg / kg, de 0,1 mg / kg a 50 mg / kg, de 0,5 mg / kg a 25 mg / kg, de 1,0 mg / kg a 10 mg / kg, de 1,5 mg / kg a 5 mg / kg o de 2,0 mg / kg a 3,0 mg / kg) o de 1 pg / kg a 1000 pg / kg (por ejemplo, de 5 pg / kg a 1000 pg / kg, de 1 pg / kg a 750 pg / kg, de 5 pg / kg a 750 pg / kg, de 10 pg / kg a 750 pg / kg, de 1 pg / kg a 500 pg / kg, de 5 pg / kg a 500 pg / kg, de 10 pg / kg a 500 pg / kg, de 1 pg / kg a 100 pg / kg, de 5 pg / kg a 100 pg / kg, de 10 pg / kg a 100 pg / kg, de 1 pg / kg a 50 pg / kg, de 5 pg / kg a 50 pg / kg o de 10 pg / kg a 50 pg / kg). Las dosis ejemplares incluyen, por ejemplo, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250 o 500 mg / kg; o 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 900 o 1000 pg / kg. Para todas las dosis o rangos mencionados en el presente documento, el termino “aproximadamente” se puede utilizar para modificar estas dosis en ± 10 % de los valores o los parametros del rango mencionados anteriormente.

Las dosis tambien pueden ajustarse cuando se administran dos o mas polipeptidos o composiciones para el uso de las invenciones. Las dosis ejemplares incluyen un polipeptido de sALP (por ejemplo, una protefna de fusion de sALP) presente en una dosis entre aproximadamente 0,2 mg / kg y aproximadamente 20 mg / kg y un polipeptido de NP (por ejemplo, una protefna de fusion NP) presente en una dosis de aproximadamente 0,5 mg / kg a aproximadamente 500 mg / kg. En realizaciones particulares, la dosis de cada polipeptido o composicion individual es menor que la dosis terapeutica de un unico polipeptido o composicion unica cuando se administran individualmente.

Las dosis se pueden administrar, por ejemplo, cada una hora, cada dos horas, diariamente, cada dos dfas, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana, cinco veces a la semana, seis veces a la semana, semanal, quincenal, mensual, bimensual o anualmente. De manera alternativamente, se pueden administrar dosis, por ejemplo, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, 10 veces, l1 veces o 12 veces al dfa. En realizaciones particulares, el regimen de dosificacion es una vez por semana. La duracion del regimen de dosificacion puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 dfa(s), semana(s) o mes(es) o incluso para la vida restante del sujeto. La cantidad, la frecuencia y la duracion de la dosis seran adaptadas por el medico de acuerdo con factores convencionales tales como la magnitud de la enfermedad y los diferentes parametros del sujeto.

Los acidos nucleicos pueden administrarse de acuerdo con las formulaciones descritas en el presente documento a un paciente en dosis adecuadas para la terapia genica. La cantidad de acidos nucleicos administrados dependera de una serie de factores conocidos por los expertos en la tecnica, entre los que se incluyen: la longitud y la naturaleza del acido nucleico, el vector (por ejemplo, viral o no viral) utilizado, la actividad del polipeptido codificado, la presencia de excipientes, la via y el procedimiento de administracion, y el estado general y ffsico del sujeto. Se describen dosis y vfas de administracion ejemplares, por ejemplo, en Melman y col. (Isr. Med. Assoc. J. 9:143-146, 2007; que describen la inyeccion intrapenil de 0,5 mg a 7,5 mg de un ADNc humano en un plasmido para tratar la disfuncion erectil), Powell y col. (Circulation 118:58-65, 2008; que describe la inyeccion intramuscular de 0,4 mg a 4,0 mg de un plasmido del factor de crecimiento de hepatocitos para tratar la isquemia crftica de las extremidades, Waddill y col. (AJR Am. J. Roentgenol. 169:63-67, 1997; que describe la inyeccion intratumoral guiada por TAC de 0,01 mg a 0,25 mg de ADN plasmfdico que codifica un antfgeno MHC para tratar el melanoma), Kastrup y col. (J. Am. Coll. Cardiol. 45:982-988, 2005; que describe la inyeccion intramiocardica de 0,5 mg de un plasmido de VEGF para tratar la angina de pecho severa), y Romero y col. (Hum. Gene. Ther. 15:1065-1076, 2004; que describe la inyeccion intramuscular de 0,2 mg a 0,6 mg de un plasmido para tratar la distrofia muscular de Duchenne / Becker).

En ciertas realizaciones, los acidos nucleicos pueden administrarse al sujeto en una dosis en el rango de, por ejemplo, 0,01 mg a 100 mg (por ejemplo, de 0,05 mg a 50 mg, de 0,1 mg a 10 mg, de 0,3 mg a 3 mg o aproximadamente 1 mg) de acido nucleico. El volumen total en el que se puede administrar el acido nucleico dependera de su concentracion y puede variar, por ejemplo, de 1 pL a 10 ml (por ejemplo, de 10 pL a 1 ml, de 50 pL a 500 pL, de 70 pL a 200 pL, de 90 pL a 150 pl o de 100 pL a 120 pl).

Los acidos nucleicos se pueden administrar, por ejemplo, cada una hora, cada dos horas, diariamente, cada dos dfas, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana, cinco veces a la semana, seis veces a la semana, semanal, quincenal, mensual, bimensual o anualmente. De manera alternativamente, los acidos nucleicos se pueden administrar, por ejemplo, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, 10 veces, 11 veces o 12 veces al dfa. La duracion del regimen de dosificacion puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 dfas, semanas o meses o incluso para la vida restante del sujeto.

Esto es una gufa, ya que la dosis real debe ser seleccionada cuidadosamente y titulada por un medico o nutricionista tratante basandose en los factores clfnicos exclusivos para cada sujeto. La dosis periodica optima sera determinada por los procedimientos conocidos en la tecnica y se vera afectada por factores tales como la edad del sujeto, como se indico anteriormente y otros factores clfnicamente pertinentes. Ademas, los sujetos pueden estar tomando medicamentos para otras enfermedades o afecciones. Los otros medicamentos pueden continuarse durante el tiempo en que se administra un polipeptido o acido nucleico al sujeto, pero en dichos casos es recomendable comenzar con dosis bajas para determinar si se experimentan efectos secundarios adversos.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de ilustrar la invencion.

Ejemplo 1. Caracterizacion de osteoblastos en ratones que carecen de NF1

Para determinar el efecto de NF1 en la mineralizacion de la matriz osea, se desarrollaron y caracterizaron ratones que carecen de NF1 en celulas osteocondroprogenitoras. Estos ratones mostraron defectos de displasia esqueletica similares a los pacientes con neurofibromatosis tipo I, donde estos defectos inclufan escoliosis progresiva y cifosis, arqueamiento tibial y anomalfas en el craneo y la formacion de la pared toracica anterior. En particular, los osteoblastos NF1 col²"/" secretaron niveles elevados de (PPi) en comparacion con los osteoblastos de ratones de tipo salvaje (Fig. 1A). Las celulas estromales adherentes a la medula osea (BMSC) extrafdas de ratones adultos NF1col2'/_ y cultivadas in vitro en un medio osteogenico forman menos nodulos positivos a la fosfatasa alcalina (AP) y mineralizados (rojo de alizarina positiva) en comparacion con BMSC extrafdas de ratones de tipo salvaje, que traen consigo un aumento de la cantidad de PPi liberado en el medio durante 24 horas. La acumulacion de PPi previene la correcta mineralizacion de la matriz osea y es probable que contribuya, al menos en parte, a los defectos observados en los ratones NF1col2'/' . Por lo tanto, los compuestos que reducen la acumulacion de PPi, como la sALP o un analogo de sALP, podrfan ser utiles para tratar NF1.

Ademas, los osteoblastos NF1col2'/' expresaron niveles elevados de ARNm para el gen de la anquilosis progresiva (Ank) en comparacion con los osteoblastos de ratones de tipo salvaje (Fig. 1B). El tratamiento con un inhibidor de la quinasa MEK1 / MEK2 de especificidad dual (U0126) proporciono niveles reducidos de expresion de ARNm de Ank en osteoblastos NF1col2'/' en comparacion con el vehfculo, y estos niveles observados fueron similares a los de los osteoblastos de tipo salvaje (Fig. 1B, segunda y tercera barra). Por lo tanto, los compuestos que inhiben una via de quinasa, tal como NP o un analogo de NP, podrfan ser utiles para tratar NF1.

En conjunto, estos datos sugieren que un polipeptido de sALP solo, un polipeptido de NP solo o la combinacion de un polipeptido de sALP y un polipeptido de NP podrfan ser utiles para tratar cualquier sfndrome neurocutaneo con manifestaciones oseas, como la neurofibromatosis o cualquier otro trastorno descrito en el presente documento.

E jem p lo 2. T e ra p ia d e c o m b in a c io n p ara el tra ta m ie n to d e la n e u ro fib ro m a to s is

La Fig. 2 proporciona un modelo de trabajo hipotetico para la mineralizacion defectuosa de la matriz osea en ratones NF1 col²/ , que puede incluir multiples desequilibrios (por ejemplo, aumento de PPi o la sobreactivacion de una o mas quinasas, como Ras o ERK) que contribuyen a la enfermedad. Sin querer limitarse por la teorfa, la acumulacion de PPi podrfa minimizarse utilizando cualquiera de las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento, incluida una fosfatasa alcalina soluble (sALP) o un analogo de sALP (vease, por ejemplo, el polipeptido de SEQ ID NO: 1204). Ademas, la sobreactivacion de una o mas quinasas podrfa controlarse utilizando cualquiera de las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento, incluyendo un NP o analogo de NP. Tal como se describe en el presente documento, se sabe que la produccion intracelular de cGMP resultante de la activacion de NPR-B inhibe la via de la MAP-quinasa. Por lo tanto, un NP o analogo de NP que podrfa activar la via de senalizacion de NPR-B puede utilizarse para el tratamiento de sfndromes neurocutaneos, como la neurofibromatosis. Por consiguiente, la combinacion de una sALP o analogo de sALP (por ejemplo, un polipeptido de sALP) con un NP o analogo de NP (por ejemplo, un polipeptido de NP) podrfa ser particularmente util para tratar dichas enfermedades.

^{E je m p lo 3. E fec to s} in vitro ^e in vivo ^{d e s T N A L P -F c D}10 ^{en fe n o tip o N F 1 col2-/"}

Para evaluar el efecto de los polipeptidos de sALP en el fenotipo NF1, los cultivos de osteoblastos de ratones NF1col2" /- se trataron con protefna morfogenetica osea 2 (BMP2) o con el polipeptido de fusion de sALP de sTNALP-FcD¹⁰(SEQ ID NO: 1204).

Los osteoblastos de tipo salvaje y NF1col2"/" se trataron con concentraciones crecientes de BMP2 humano recombinante (rhBMP2, Fig. 3A). En los osteoblastos NF1col2"/", rhBMP2 rescato el defecto de diferenciacion, como se evidencia por una mayor presencia de fosfatasa alcalina al aumentar la dosis de rhBMP2 (Fig. 3A, segunda fila). Sin embargo, no se observo una mayor mineralizacion, como lo demuestra la falta de deposicion de calcio (como lo indica la falta de tincion con rojo S de alizarina) (Fig. 3A, cuarta fila).

En cambio, el tratamiento con sTNALP-FcD¹⁰rescato el defecto de mineralizacion que esta presente en los osteoblastos NF1col2"/" (Fig. 3B). Las dosis crecientes de sTNALP-FcD¹⁰proporcionaron una mayor deposicion de calcio de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3B, parte inferior y Fig. 3C).

Ademas, la supresion dirigida in vitro del gen NF1 en las BMSC produjo una reduccion significativa de la mineralizacion, que se rescata al menos parcialmente mediante el tratamiento con 0,5 pg / ml de sTNALP-FcD¹⁰(Fig. 3D).

Tambien se realizaron experimentos in vivo con sTNALP-FcDio. Los ratones NF1coi2'/_ se trataron desde el dfa 1 hasta el dfa 18 con 8,2 mg / kg de sTNALP-FcDm El tratamiento de los ratones con sTNALP-FcD¹⁰incremento el deficit de densidad mineral osea en ratones NF1coi2'/_ en comparacion con el vehfculo (* p < 0,5), segun lo determinado por la relacion entre el volumen oseo mineralizado (BV) y el volumen oseo total (TV) (Fig. 3E).

Por consiguiente, cualquier polipeptido de sALP descrito en el presente documento, ya sea solo o en combinacion con cualquier polipeptido de NP descrito en el presente documento, podrfa ser particularmente util para tratar la neurofibromatosis o cualquier sfndrome neurocutaneo con manifestaciones oseas.

^{E je m p lo 4. E fec to s} in vitro ^e in vivo ^{d e N C 2 -K G A N K K en fe n o tip o d e N F 1 col2-/-}

Para evaluar el efecto de los polipeptidos de NP en el fenotipo NF1, se evaluaron los niveles de expresion del gen NPR-B en ratones NF1coi2'/_ (Fig. 4A). El NPR-B se expreso en BMSC en todas las etapas de diferenciacion, donde la falta de expresion de NF1 no afecto la expresion de NPR-B.

Se realizaron experimentos adicionales en los que se trataron cultivos de condrocitos de ratones NF1col2"/" con el polipeptido de fusion NP de NC2-KGANKK (SEQ ID NO: 512). Los condrocitos primarios de costilla de ratones P0 se obtuvieron de ratones de tipo salvaje y ratones NF1col2"/" y se trataron durante 30 minutos con concentraciones crecientes de NC2-KGANKK. Sin ningun tratamiento, se observaron niveles elevados de ERK fosforilada (p-ERK) en los condrocitos NF1col2'/', en comparacion con los niveles en los condrocitos de tipo salvaje (Fig. 4B). Despues del tratamiento con NC2-KGANKK, se observaron niveles reducidos de p-ERK en los condrocitos NF1col2'/'. Estos resultados apoyan el uso de polipeptidos de NP, como NC2-KGANKK, para inhibir la sobreactivacion de una o mas quinasas, como ERK.

Tambien se llevaron a cabo experimentos in vivo. Los ratones NF1coi2'/_ se trataron con NC2B (SEQ ID NO: 504). El tratamiento rescato al menos parcialmente el defecto de longitud corporal en ratones NF1coi2'/_ (Fig. 4C), el defecto de crecimiento oseo en ratones NF1coi2'/_ (Fig. 4D), y los defectos proliferativos e hipertroficos de la zona de condrocitos en ratones NF1coi2'/_ (Fig. 4E).

Por consiguiente, cualquier polipeptido de NP descrito en el presente documento, ya sea solo o en combinacion con un polipeptido de sALP descrito en el presente documento, podrfa ser particularmente util para tratar trastornos asociados con la sobreactivacion de una o mas quinasas, como la neurofibromatosis o cualquier sfndrome neurocutaneo con manifestaciones oseas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composicion farmaceutica que comprende:

(a) un polipeptido que comprende la estructura A-sALP-B; y

(b) un excipiente farmaceuticamente aceptable, donde

sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina,

A esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y

B es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente, para su uso en un procedimiento para tratar la neurofibromatosis en un sujeto.

2. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1204.

3. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde:

(a) dicha fosfatasa alcalina es una fosfatasa alcalina no especffica de tejido (TNALP), una fosfatasa alcalina placentaria (PLALP), una fosfatasa alcalina de celulas germinales (GALP) o una fosfatasa alcalina intestinal (IAL^p), donde preferentemente dicha fosfatasa alcalina es una TNALP; o

(b) la secuencia de aminoacidos de dicha sALP:

(i) comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 85 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1205, donde preferentemente la secuencia de aminoacidos de dicha sALP comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1205;

(ii) comprende residuos de aminoacidos 23-508 de SEQ ID NO: 1215, residuos de aminoacidos 18-498 de SEQ ID NO: 1216, residuos de aminoacidos 23-508 de SEQ ID NO: 1218 o residuos de aminoacidos 18-498 de SEQ ID NO: 1219; o

(iii) consiste en residuos de aminoacidos 23-512 de SEQ ID NO: 1215, residuos de aminoacidos 18-502 de SEQ ID ⁿO: 1216, residuos de aminoacidos 23-512 de SEQ ID NO: 1218 o residuos de aminoacidos 18-502 de SEQ ID NO: 1219.

4. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 3, donde A o B comprende una region de fragmento cristalizable (Fc), donde dicha Fc:

(a) comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 85 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 401, donde preferentemente dicha Fc comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 401; (b) es un dominio constante de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4; o

(c) comprende un dominio C^h2, un dominio C^h3 y una region bisagra.

5. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4, donde:

(a) dicho polipeptido comprende la estructura C-sALP-D-Fc-G-In-H o la estructura C-Fc-D-sALP-G-In-H, donde: C esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido,

D es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente,

G es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente,

H es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente, e

I representa un acido aspartico o un acido glutamico, y n = 10 a 16, donde preferentemente:

(i) G es dos residuos de aminoacidos, donde preferentemente G es acido aspartico-isoleucina;

(ii) I es acido aspartico y n = 10;

(iii) D es dos residuos de aminoacidos, donde preferentemente D es leucina-lisina; o

donde preferentemente la secuencia de aminoacidos de dicho polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1204 o 1201; o

(b) dicho polipeptido comprende la estructura sALP-Fc o la estructura Fc-sALP; o

(c) dicho polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1221 o 1220; o

(d) dicho polipeptido comprende una fraccion dirigida al hueso, donde preferentemente dicha fraccion dirigida al hueso comprende acidos asparticos o acidos glutamicos consecutivos.

6. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicha fosfatasa alcalina es fisiologicamente activa frente a la fosfoetanolamina (PEA), el pirofosfato inorganico (PPi) y / o el piridoxal 5'-fosfato (PLP).

7. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha composicion comprende ademas un segundo polipeptido que comprende la estructura V-NP-W, donde la secuencia de aminoacidos de dicho segundo polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 572, 501-571 y 573-608, preferentemente la secuencia de aminoacidos del segundo polipeptido comprende la SEQ ID NO: 572.

8. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha composicion comprende ademas un segundo polipeptido que comprende la estructura V-NP-W, donde:

(c) W es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente,

donde dicho NP de dicho segundo polipeptido comprende la estructura:

[extension N-terminal]-[segmento corto]-[dominio de anillo]-[extension C-terminal], donde:

(i) dicho dominio de anillo comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6, residuos de aminoacidos 11-27 de SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 95, y cada uno de dicha extension N-terminal, segmento corto y extension C-terminal esta, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido; o (ii) dicho dominio de anillo comprende residuos de aminoacidos 6-22 de SEQ ID NO: 126; o

(iii) dicho dominio de anillo comprende residuos de aminoacidos 6-22 de SEQ ID NO: 126 y el aminoacido en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 126 se sustituye por Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, Ser, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro o Asp; o

(iv) la secuencia de aminoacidos de dicha extension N-terminal comprende KGANKK (SEQ ID NO: 314), KGANQK (SEQ ID NO: 315) o residuos de aminoacidos 1-31 o 17-31 de SEQ ID NO: 11; o

9. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, donde V o W de dicho segundo polipeptido comprende:

(a) una region de fragmento cristalizable (Fc), donde dicha Fc en V o W:

(i) comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 85 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 401, donde preferentemente dicha Fc comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 401;

(ii) es un dominio constante de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4; o

(iii) comprende un dominio Ch², un dominio Ch3 y una region bisagra; o

(b) una region rica en glicina; o

(c) una fraccion dirigida al hueso; o

(d) una secuencia de escision de catepsina.

10. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8 o 9, donde dicho segundo polipeptido comprende la estructura X-Fc-Y-NP-Z o la estructura X-NP-Y-Fc-Z, donde:

(a) X esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido;

(b) Y es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente; y

(c) Z esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido.

11. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, donde Y comprende: (a) una region rica en glicina;

(b) [(Gly)m(Ser)]n(Gly)p o (Gly)p[(Ser)(Gly)m]n, donde cada uno de m, n y p esta, independientemente, entre 0 y 20; o (c) la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 301-391.

12. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde al menos uno de dicho primer polipeptido y dicho segundo polipeptido esta en forma dimerica, glicosilado o pegilado.

13. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicha neurofibromatosis es una neurofibromatosis de tipo I.

14. Un kit que comprende:

(a) un primer polipeptido que comprende la estructura A-sALP-B, donde

(i) la sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina,

(ii) A esta ausente o es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido, y

(iii) B es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente; y

(b) un segundo polipeptido que comprende la estructura V-NP-W, donde

(i) NP es un peptido natriuretico que es un agonista del receptor B del peptido natriuretico (NPR-B),

(ii) V es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente, y

(iii) W es una secuencia de aminoacidos de al menos un aminoacido o esta ausente.

15. El kit de la reivindicacion 14, donde:

(a) dicho primer polipeptido y dicho segundo polipeptido se formulan juntos, o por separado y en cantidades de dosificacion individuales; o

(b) dicho kit comprende ademas instrucciones para administrar el primer polipeptido a un paciente diagnosticado o en riesgo de desarrollar un sfndrome neurocutaneo, como la neurofibromatosis de tipo I.