ES2944087T3

ES2944087T3 - Composiciones que contienen fosfatasa alcalina y/o péptido natriurético, y métodos de uso de las mismas

Info

Publication number: ES2944087T3
Application number: ES18201378T
Authority: ES
Inventors: Philippe Crine; Florent Elefteriou
Original assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc; Vanderbilt University
Current assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc; Vanderbilt University
Priority date: 2011-10-19
Filing date: 2012-10-18
Publication date: 2023-06-19
Anticipated expiration: 2032-10-18
Also published as: WO2013059491A1; WO2013058833A1; WO2013058833A8; HK1201446A1; ES2714406T3; JP6118807B2; EP2768526A4; CA2852874A1; EP2768526A1; JP2015502336A; EP3488861A1; EP3488861B1; EP2768526B1; KR20140084201A; SG11201401605QA

Abstract

La presente invención proporciona métodos, composiciones y kits para el tratamiento de síndromes neurocutáneos, como la neurofibromatosis tipo I; trastornos asociados con la sobreactivación de FGFR3, como la acondroplasia; trastornos de huesos o cartílagos; o trastornos del músculo liso vascular; o para el alargamiento del hueso. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona polipéptidos que tienen un péptido de fosfatasa alcalina fusionado con un dominio Fc de una inmunoglobulina o un péptido natriurético fusionado con un dominio Fc de una inmunoglobulina. Dichos polipéptidos se pueden administrar a sujetos, por ejemplo, por vía subcutánea, para tratar un síndrome neurocutáneo, un trastorno asociado con la sobreactivación de FGFR3, un trastorno óseo o del cartílago, o un trastorno del músculo liso vascular, o para alargar el hueso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que contienen fosfatasa alcalina y/o péptido natriurético, y métodos de uso de las mismas

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En general, esta invención se refiere al tratamiento de diversas enfermedades usando fosfatasa alcalina y/o péptido natriurético.

Numerosas enfermedades y afecciones involucran funciones esqueléticas, estructura, o crecimiento del hueso o cartílago anormales. Para algunas enfermedades, se conoce la etiología de estas manifestaciones esqueléticas, tal como en la hipofosfatasia (HPP) y la acondroplasia (ACH), pero las opciones de tratamiento son limitadas. En otras enfermedades, se desconoce la etiología. Por ejemplo, la neurofibromatosis tipo I (NF1 o enfermedad de Von Recklinghausen) es un trastorno genético autosómico dominante que tiene una incidencia de aproximadamente 1 de cada 3500 nacidos vivos. La NF1 codifica la neurofibromina, un miembro de la familia de proteínas activadoras de GTPasa (GAP) que se sabe que suprime la Ras cinasa. La neurofibromina es un supresor específico de p21 -RAS, y las mutaciones en el gen NF1 causan la activación no suprimida de RAS que conduce a un crecimiento y diferenciación celular anormal. Por consiguiente, las características clínicas de NF1 incluyen diversas transformaciones oncogénicas, tales como neurofibromas neurocutáneos y tumores de la vía óptica, y otras manifestaciones no cancerosas, tales como defectos cognitivos y anomalías esqueléticas. Algunas de las manifestaciones esqueléticas de NF1 tienen una alta morbilidad (por ejemplo, la escoliosis distrófica, el arqueamiento de huesos largos, y la pseudoartrosis) y opciones de tratamiento insatisfactorias, que se han complicado por el hecho de que la etiología de estas manifestaciones no está clara.

Muchas enfermedades esqueléticas surgen de la pérdida de la función de una o más proteínas. Por ejemplo, la hipofosfatasia (HPP) es una enfermedad rara y hereditaria causada por una o más mutaciones de pérdida de función en el gen ALPL, que codifica la fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNALP; también conocida como ALP de tipo hepática/ósea/renal ALP). La deficiencia de fosfatasa alcalina en osteoblastos y condrocitos deteriora la mineralización esquelética, lo que lleva a síntomas de diferente gravedad, desde raquitismo u osteomalacia hasta una ausencia casi completa de mineralización ósea in útero. Sin embargo, la terapia de reemplazo enzimático con fosfatasa alcalina no modificada (por ejemplo, infusión de fosfatasa alcalina nativa) ha sido en gran parte en vano.

En otro ejemplo, la acondroplasia (ACH) es la forma más común de enanismo de extremidades cortas en seres humanos, afecta a más de 250.000 individuos en todo el mundo, y es causada por mutaciones en el gen que codifica el receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR3), que causa una ganancia de función de FGFR3. La gravedad del fenotipo clínico está relacionada con la capacidad de la mutación para sobreactivar las rutas de señalización de FGFR3 en los condrocitos, tal como la ruta de MAP-cinasa. Esta ruta se puede inhibir activando el receptor del péptido natriurético B (NPR-B), que produce el segundo mensajero cGMP, y cGMP, a su vez, inhibe la ruta de MAP-cinasa dentro de la célula. En el entorno celular, las formas inmaduras y maduras del péptido natriurético de tipo C (CNP), tal como el CNP53 y el CNP22, se unen a NPR-B e inducen la producción de cGMP de una manera similar y dependiente de la dosis. Por lo tanto, se ha considerado el uso del CNP o un análogo de CNP que podría activar la ruta de señalización de NPR-B para el tratamiento de la displasia esquelética. Sin embargo, un inconveniente importante del uso terapéutico del CNP es su vida media extremadamente corta.

Siris ES y Canfield RE: "Paget's disease of bone", Trends in Endocrinology and Metabolism, Elsevier Science Publishing, Nueva York, NY, US, vol. 2, n.° 6, 1 de noviembre 1991 (1991 -11 -01), páginas 207-212, XP026453979, ISSN: 1043-2760 se refieren a los síntomas que acompañan a la enfermedad de Paget, tales como los niveles de fosfatasa alcalina sérica y de hidroxiprolina urinaria total típicamente elevados.

El documento WO 2009/067639 A2 describe el uso de variantes del péptido natriurético de tipo C (CNP) para el tratamiento de trastornos relacionados con los huesos, tales como displasias esqueléticas y acondroplasia.

El documento WO 02/074234 A2 describe el uso de composiciones farmacéuticas, que comprenden al menos un péptido natriurético, para el tratamiento de displasias esqueléticas, especialmente acondroplasia.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de desarrollar moléculas terapéuticas y métodos para tratar enfermedades que tengan manifestaciones esqueléticas, tales como la neurofibromatosis. Además, se necesitan más moléculas terapéuticas que tengan una vida media apreciable y/u otras propiedades farmacocinéticas y terapéuticas favorables, y estas moléculas se pueden usar para tratar una variedad de trastornos que se beneficiarían de su modo de acción subyacente, tales como la neurofibromatosis, la hipofosfatasia, y la acondroplasia.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

De manera sorprendente, se ha descubierto que la neurofibromatosis, un síndrome neurocutáneo que produce tumores en el sistema nervioso, da como resultado manifestaciones óseas que surgen de la acumulación de pirofosfato inorgánico (PPⁱ). Como las proteínas de fusión fosfatasa alcalina-Fc (ya sea con o sin un resto dirigido al hueso) pueden reducir acumulación de PPⁱ, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que incluye un dominio de fosfatasa alcalina soluble (sALP) (es decir, un polipéptido de sALP) como se especifica en las reivindicaciones, para uso en un método para tratar una o más manifestaciones óseas de un síndrome neurocutáneo en un sujeto. Además, las manifestaciones óseas en la neurofibromatosis también pueden surgir de la sobreactivación de la ruta de la MAP-cinasa, y podría usarse un péptido natriurético (NP) o un análogo de NP para inhibir esta ruta. Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso que comprende además un polipéptido que incluye un dominio de NP (por ejemplo, un CNP) (es decir, un polipéptido de NP).

Además, la presente invención incluye una combinación de un polipéptido de sALP y un polipéptido de NP para uso como se especifica en las reivindicaciones, en la que estos polipéptidos pueden administrarse por separado o juntos. Esta combinación sería particularmente útil en enfermedades que se beneficiarían de niveles elevados de ALP (por ejemplo, trastornos asociados con niveles elevados de PPi, tal como la neurofibromatosis, o trastornos asociados con la deficiencia de ALP, tal como la hipofosfatasia) y/o enfermedades que se beneficiarían de la inactivación de una ruta de señalización que involucra a FGFR3 (por ejemplo, trastornos asociados con la sobreactivación de la ruta de MAP-cinasa, tal como la neurofibromatosis o la acondroplasia, o trastornos asociados con la sobreactivación de FGFR3, tal como la acondroplasia o la craneosinostosis o el cáncer) y/o enfermedades que se beneficiarían de niveles elevados de NP (por ejemplo, trastornos asociados con la deficiencia de CNP, tal como la displasia esquelética, o trastornos del músculo liso vascular). Los polipéptidos para uso en la invención también pueden proporcionarse en kits, ya sea por separado o juntos.

En un primer aspecto, la invención presenta una composición farmacéutica que incluye: (a) (i) un polipéptido que incluye la estructura A-sALP-B, en la que sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina, A está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y B está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, en el que la secuencia de aminoácidos de dicha sALP comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1205, (ii) un polipéptido que comprende la estructura C-sALP-D-Fc-E o la estructura C-Fc-D-sALP-E; y C está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, D está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, en la que, opcionalmente, D es dos restos de aminoácidos y/o leucina-lisina, y E está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; o (iii) un polipéptido que comprende la estructura C-sALP-D-Fc-G-Iⁿ-H o la estructura C-Fc-D-sALP-G-Iⁿ-H; y C está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, D está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, G está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, H está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, e I es un ácido aspártico o un ácido glutámico, y n = 10 a 16; y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable; para uso en un método de tratamiento de una o más manifestaciones óseas de un síndrome neurocutáneo en un sujeto. En algunas realizaciones, el síndrome en el sujeto se trata de este modo.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la sALP incluye o consiste en restos de aminoácidos 23 508 de SEQ ID NO: 1215, restos de aminoácidos 18-498 de SEQ ID NO: 1216, restos de aminoácidos 23-508 de SEQ ID NO: 1218, o restos de aminoácidos 18-498 de SEQ ID NO: 1219, o la secuencia de aminoácidos de la sALP incluye o consiste en restos de aminoácidos 23-512 de SEQ ID NO: 1215, restos de aminoácidos 18-502 de SEQ ID NO: 1216, restos de aminoácidos 23-512 de SEQ ID NO: 1218, o restos de aminoácidos 18-502 de SEQ ID NO: 1219. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la sALP incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1205. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la sALP incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1205.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la sALP incluye o consiste en los restos de aminoácidos 1 497, 1-498, 1-499, 1-500, 1-501, 1-502, 1-503, 1-504, 1-505, 1-506, 1-507, 1-508, 1-509, 1-510, 1-511, 1-512, 23-497, 23-498, 23-499, 23-500, 23-501,23-502, 23-503, 23-504, 23-505, 23-506, 23-507, 23-508, 23-509, 23-510, 23-511, o 23-512 de SEQ ID NO: 1218, en la que X es cualquier aminoácido pero no es un aminoácido correspondiente a una mutación patógena en esa posición de la TNALP humana, por ejemplo no es un aminoácido correspondiente a una mutación patógena proporcionada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la sALP incluye o consiste en los restos de aminoácidos 18-497, 18-498, 18-499, 18-500, 18-501, 18-502, 18-503, 18-504, 18 505, 18-506, 18-507, 18-508, 18-509, 18-510, 18-511, o 18-512 de SEQ ID NO: 1219, en la que X es cualquier aminoácido pero no es un aminoácido correspondiente a una mutación patógena en esa posición de la TNALP humana, por ejemplo no es un aminoácido correspondiente a una mutación patógena proporcionada en la Tabla 1.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la sALP incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NOs: 1218 o 1219, en la que X es cualquier aminoácido pero no es un aminoácido correspondiente a una mutación patógena en esa posición de la TNALP humana, por ejemplo no es un aminoácido correspondiente a una mutación patógena proporcionada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la sALP incluye o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con los restos de aminoácidos 23-508 de SEQ ID NO: 1215, restos de aminoácidos 18-498 de SEQ ID NO: 1216, restos de aminoácidos 23-508 de SEQ ID NO: 1218, o restos de aminoácidos 18-498 de SEQ ID NO: 1219, o la secuencia de aminoácidos de la sALP consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con los restos de aminoácidos 23-512 de SEQ ID NO: 1215, restos de aminoácidos 18-502 de SEQ ID NO: 1216, restos de aminoácidos 23-512 de SEQ ID NO: 1218, o restos de aminoácidos 18-502 de SEQ ID NO: 1219, en la que X en SEQ ID NO: 1218 o 1219 es cualquier aminoácido pero no es un aminoácido correspondiente a una mutación patógena en esa posición de la TNALP humana, por ejemplo no es un aminoácido correspondiente a una mutación patógena proporcionada en la Tabla 1.

En algunas realizaciones, A y/o B están ausentes.

En algunas realizaciones, A y/o B incluye una región de fragmento cristalizable (Fc). En algunas realizaciones, la Fc incluye un dominio Ch², un dominio Ch3, y una región bisagra, o la Fc es un dominio constante de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en lgG-1, lgG-2, lgG-3, e lgG-4, por ejemplo lgG-1. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la Fc incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 401. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la Fc incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 401.

En algunas realizaciones, A y/o B incluye lⁿ, en Ias que I representa un ácido aspártico o un ácido glutámico, y n = 10 a 16, por ejemplo n es 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16. En algunas realizaciones, la lⁿes E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo E¹⁰o D¹⁰.

En algunas realizaciones, A y/o B incluyen un resto dirigido al hueso, por ejemplo que incluye 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16 restos ácidos consecutivos, por ejemplo ácido aspártico o ácido glutámico. En algunas realizaciones, el resto dirigido al hueso incluye o consiste en E⁶, E⁷, E^s, E^g, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D⁶, D⁷, D^s, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo E⁶, E¹⁰, D⁶, o D¹⁰. En algunas realizaciones, el polipéptido no incluye una región de ácido poliaspártico o ácido poliglutámico más larga de tres restos consecutivos de ácido aspártico o ácido glutámico, 0 el polipéptido no incluye una región de ácido poliaspártico o ácido poliglutámico más larga de dos restos consecutivos de ácido aspártico o ácido glutámico.

En algunas realizaciones, el polipéptido no incluye un resto dirigido al hueso.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye la estructura C-sALP-D-Fc-E o la estructura C-Fc-D-sALP-E, en las que C está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, D está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y E está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido.

En algunas realizaciones, C y/o E están ausentes. En algunas realizaciones, D es dos restos de aminoácidos, por ejemplo leucina-lisina o ácido aspártico-isoleucina. En algunas realizaciones, D es cualquier enlazador descrito aquí, por ejemplo la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 301 -391.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye la estructura C-sALP-D-Fc-G-lⁿ-H o la estructura C-Fc-D-sALP-G-lⁿ-H, en las que C está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, D está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, G está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, H está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, I representa un ácido aspártico o un ácido glutámico, y n = 10 a 16, por ejemplo n es 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16. En algunas realizaciones, la lⁿes E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo E¹⁰o D¹⁰.

En algunas realizaciones, C y/o H están ausentes. En algunas realizaciones, G es dos restos de aminoácidos, por ejemplo leucina-lisina o ácido aspártico-isoleucina, por ejemplo ácido aspártico-isoleucina. En algunas realizaciones, 1 es un ácido aspártico o un ácido glutámico, y n = 10 a 16, por ejemplo n es 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16, por ejemplo I es ácido aspártico y n = 10. En algunas realizaciones, D es dos restos de aminoácidos, por ejemplo leucina-lisina o ácido aspártico-isoleucina, por ejemplo leucina-lisina. En algunas realizaciones, D o G es cualquier enlazador descrito aquí, por ejemplo la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 301 -391.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NOs: 1201, 1204, 1220, o 1221, por ejemplo SEQ ID NO: 1204. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1201, 1204, 1220, o 1221, por ejemplo SEQ ID NO: 1204. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1204.

En un segundo aspecto, la invención presenta una composición farmacéutica que incluye: (a) (i) un polipéptido que incluye la estructura V-NP-W; y en la que NP es un péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (NPR-B), V está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y W está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido,en la que dicho NP comprende la estructura:

[extensión N-terminal]-[segmento corto]-[dominio de anillo]-[extensión C-terminal], y en la que dicho dominio de anillo se selecciona del grupo de restos de aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126 y en la que el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, Ser, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, o Asp, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y dicho segmento corto y dicho dominio de anillo comprenden juntos la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 13-30, 119-122, 126 o 156-161; o (ii) un polipéptido que comprende la estructura X-Fc-Y-NP-Z o la estructura X-NP-Y-Fc-Z, en las que NP es un péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (NPR-B), y cada uno de X, Y y Z está, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable; para uso en un método de tratamiento de una o más manifestaciones óseas de un síndrome neurocutáneo en un sujeto. En algunas realizaciones, el síndrome en el sujeto se trata de este modo.

En algunas realizaciones, el dominio de anillo incluye restos de aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 17 de la SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, o Ser, por ejemplo Phe o Leu, por ejemplo Phe, por ejemplo Leu. En algunas realizaciones, el dominio de anillo incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el segmento corto y el dominio de anillo incluyen juntos la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 4, 13-30, 119-122, 126, o 156 161, por ejemplo SEQ ID NO: 4 o 13-30. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del segmento corto incluye o consiste en los restos de aminoácidos 1-5, 2-5, 3-5, 4-5, o 5, por ejemplo consiste en los restos de aminoácidos 1-5, de SEQ ID NO: 4; restos de aminoácidos 1-10 de SEQ ID NO: 17; restos de aminoácidos 1-5 de SEQ ID NO: 19; restos de aminoácidos 1-3 de SEQ ID NO: 20; restos de aminoácidos 1-5 de SEQ ID NO: 21; o restos de aminoácidos 1-6 de SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del segmento corto y el dominio de anillo juntos

incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del segmento corto y el dominio de anillo juntos incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 119-122, 126, o 156-161 (por ejemplo, en las que X en SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, o Asp, por ejemplo Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, o Ser, por ejemplo Phe o Leu, por ejemplo Phe, por ejemplo Leu).

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la extensión N-terminal incluye restos de aminoácidos 1 31 o 17-31 de SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la extensión N-terminal incluye restos de aminoácidos 17-31 de SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la extensión N-terminal incluye KGANKK (SEQ ID NO: 314) o KGANQK (SEQ ID NO: 315). En algunas realizaciones, la extensión N-terminal, segmento corto, y dominio de anillo juntos incluyen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la extensión C-terminal incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 o 118, o incluye restos de aminoácidos 23-37 seleccionados de una cualquiera de SEQ ID NOs: 101-116. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del NP consiste en SEQ ID NOs: 4 u 11, o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 31-94, o un fragmento de las mismas que incluye al menos un dominio de anillo, o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 13-29, 100-116, 119-125, 127-233, o 1001-1155.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP puede incluir los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 puede ser Phe.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP puede incluir los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 puede ser Leu.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP puede incluir los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 puede ser Ile.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP puede incluir los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 puede ser Thr.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP puede incluir los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 puede ser Glu.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP puede incluir los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 puede ser Arg.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP puede incluir los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 puede ser Tyr.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP puede incluir los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 puede ser Cys.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP puede incluir los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 puede ser Pro.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP puede incluir los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 puede ser Asp.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP puede incluir los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 puede ser Ala.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP puede incluir los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 puede ser Ser.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP puede incluir los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 puede ser Val.

En algunas realizaciones, V y/o W están ausentes.

En algunas realizaciones, V y/o W incluyen una región de fragmento cristalizable (Fc). En algunas realizaciones, la Fc incluye un dominio Ch², un dominio Ch3, y una región bisagra, o la Fc es un dominio constante de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en lgG-1, lgG-2, lgG-3, e lgG-4, por ejemplo lgG-1. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la Fc incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 401. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la Fc incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 401.

En algunas realizaciones, V y/o W incluyen una región rica en glicina.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de V o W consiste en una o más glicinas y en una o más serinas. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de V o W incluye [(Gly)^m(Ser)]ⁿ(Gly)^po (Gly)^p[(Ser)(Gly)^m]ⁿ, en la que cada uno de m, n, y p está, independientemente, entre 0 y 20. En algunas realizaciones, m está entre 1 y 6; n está entre 1 y 10; y p está entre 0 y 4, por ejemplo m es 4 y n es 1-6. En algunas realizaciones, las combinaciones de m, n, y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2, o la secuencia de aminoácidos de V o W incluye la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 301 -391.

En algunas realizaciones, V y/o W no incluyen un resto dirigido al hueso.

En algunas realizaciones, V y/o W incluyen un resto dirigido al hueso, por ejemplo que incluye 6, 7,8,9,10,11, 12, 13, 14, 15, o 16 restos ácidos consecutivos, por ejemplo ácido aspártico o ácido glutámico. En algunas realizaciones, el resto dirigido al hueso incluye o consiste en E⁶, E⁷, E^s, E^g, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D⁶, D⁷, D^s, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo E⁶, E¹⁰, D⁶, o D¹⁰.

En algunas realizaciones, V y/o W incluyen una secuencia de escisión de catepsina (por ejemplo, catepsina K). En algunas realizaciones, la secuencia de escisión de catepsina es HGPQG (SEQ ID NO: 374) o HKLRG (SEQ ID NO:

375).

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye la estructura V-NP-W, en la que NP es un péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (NPR-B), cada uno de V y W está, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y el NP incluye la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 17-29, 31-40, 42-94, 101-116, 119-122, 128-161, o 163-233, o V o W incluye la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 304-313, 322-333, o 337-391.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye la estructura V-NP o NP-W, en las que NP es un péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (NPR-B), y cada uno de V y W incluye, independientemente, la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 304-313, 322-333, o 337-391.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye la estructura X-Fc-Y-NP-Z o la estructura X-NP-Y-Fc-Z, en las que NP es el péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (NPR-B) (por ejemplo, cualquier NP descrito aquí), y cada uno de X, Y y Z está, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido. En algunas realizaciones, Y incluye una región rica en glicina. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de Y consiste en una o más glicinas y en una o más serinas. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de Y incluye [(Gly)^m(Ser)]ⁿ(Gly)^po (Gly)^p[(Ser)(Gly)^m]ⁿ, en la que cada uno de m, n, y p está, independientemente, entre 0 y 20. En algunas realizaciones, m está entre 1 y 6; n está entre 1 y 10; y p está entre 0 y 4, por ejemplo m es 4 y n es 1-6. En algunas realizaciones, las combinaciones de m, n, y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2, o la secuencia de aminoácidos de Y incluye la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 301-389. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de Y consiste en (Gly)^m(Ser)]ⁿ(Gly)^po (Gly)^p[(Ser)(Gly)^m]ⁿ, en la que las combinaciones de m, n, y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2, o la secuencia de aminoácidos de Y consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 301 -389. En algunas realizaciones, X está ausente, Z está ausente, o tanto X como Z están ausentes. En algunas realizaciones, X, Y, o Z incluye un resto dirigido al hueso, por ejemplo que incluye 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16 restos ácidos consecutivos, por ejemplo ácido aspártico o ácido glutámico. En algunas realizaciones, el resto dirigido al hueso incluye o consiste en E⁶, E⁷, E⁸, E⁹, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D⁶, D⁷, D⁸, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo E⁶, E¹⁰, D⁶, o D¹⁰.

En algunas realizaciones, X, Y, o Z incluye una secuencia de escisión de catepsina (por ejemplo, catepsina K). En algunas realizaciones, la secuencia de escisión de catepsina incluye o consiste en HGPQg (SEQ ID NO: 374) o HKLRG (SEQ ID NO: 375).

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 501-608, por ejemplo SEQ ID NOs: 502, 504, 506, 512, 514, 516,

530, 560, 562, 564, 572, 574, 576, 584, 586, 588, 596, 598, 600, o 608, por ejemplo SEQ ID NOs: 504, 512, 530, 554,

572, o 578, por ejemplo SEQ ID NO: 512. En algunas realizaciones, el aminoácido del polipéptido incluye un resto dirigido al hueso, por ejemplo E⁶, E⁷, E^s, E⁹, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D⁶, D⁷, D^s, o D¹⁶, por ejemplo E⁶, E¹⁰, D⁶, o D¹⁰.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NOs: 504,

512, 530, 554, 572, o 578, por ejemplo SEQ ID NOs: 504, 512, 530, o 572, por ejemplo SEQ ID NO: 512. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 504, 512, 530, 554, 572, o 578, por ejemplo SEQ ID NOs: 504, 512, 530, o 572, por ejemplo SEQ ID NO: 512. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 504, 512, 530, o 572, por ejemplo SEQ ID NO: 512.

En algunas realizaciones, el segundo polipéptido incluye la estructura X-Fc-Y-NP-Z o la estructura X-NP-Y-Fc-Z, en las que NP es un péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (NPR-B), y en las que:

(i) NP incluye los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, en la que el aminoácido en la posición 17 no es Met; y cada uno de X, Y y Z está, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido;

o (ii) cada uno de X y Z está, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; y la secuencia de aminoácidos de Y incluye [(Gly)⁴(Ser)]ⁿ(Gly)^po (Gly)^p[(Ser)(Gly)⁴]ⁿ, en la que n está entre 1 y 10 y p está entre 0 y 4, o en la que las combinaciones de m, n, y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2, o en las que la secuencia de aminoácidos de Y incluye la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de

SEQ ID NOs: 304-313, 322-333, o 337-391.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye la estructura X-Fc-Y-NP-Z.

En algunas realizaciones, (i) NP incluye los aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126, en la que el aminoácido en la posición 17 no es Met; y cada uno de X, Y y Z está, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 17 de la SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, o Ser. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, o Asp, por ejemplo Phe o Leu, por ejemplo Phe, por ejemplo Leu. En algunas realizaciones, el NP incluye la estructura: [extensión N-terminal]-[segmento corto]-[dominio de anillo]-[extensión C-terminal], en la que dicho dominio de anillo incluye la secuencia de aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO:

126, en la que el aminoácido en la posición 17 no es Met, y cada uno de dicha extensión N-terminal, segmento corto, y extensión C-terminal está, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de dicho NP incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 119-125 o 156-220, en las que la posición 17 con respecto a SEQ

ID NO: 126 no es Met, o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 221-233.

En algunas realizaciones, (ii) cada uno de X y Z está, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; y la secuencia de aminoácidos de Y comprende [(Gly)⁴(Ser)]ⁿ(Gly)^po (Gly)^p[(Ser)(Gly)⁴]ⁿ, en la que n está entre 1 y 10 y p está entre 0 y 4, o en la que la secuencia de aminoácidos de Y comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 304-313, 322-333, o 337-391. En algunas realizaciones, el NP incluye la estructura: [extensión N-terminal]-[segmento corto]-[dominio de anillo]-[extensión C-terminal], en la que el dominio de anillo incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, aminoácidos 11 -27 de

SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 95, y cada uno de la extensión N-terminal, el segmento corto, y la extensión C-terminal está, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido. En algunas realizaciones, el dominio de anillo incluye aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 17 de la SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, o Ser. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 17 de la SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, o Asp, por ejemplo Phe o Leu, por ejemplo Phe, por ejemplo Leu. En algunas realizaciones, el dominio de anillo incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el segmento corto y el dominio de anillo incluyen juntos la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 4 o 13-30. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del segmento corto y el dominio de anillo juntos consisten en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del segmento corto y el dominio de anillo juntos consisten en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 119-122, 126, o 156-161 (por ejemplo, en las que X en SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, o Asp, por ejemplo Phe o Leu, por ejemplo Phe, por ejemplo Leu). En algunas realizaciones, la extensión N-terminal, segmento corto, y dominio de anillo juntos incluyen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del NP consiste en SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos

del NP consiste en SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del NP consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 31-94, o un fragmento de la misma que incluye al menos un dominio de anillo. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del NP incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 13-29, 100-116, 119-125, 127-233, o 1001-1155.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del segmento corto consiste en aminoácidos 1-5 de SEQ ID

NO: 4. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del segmento corto consiste en aminoácidos 1-5, 2-5,

3-5, 4-5, o 5 de SEQ ID NO: 4, aminoácidos 1-10 de SEQ ID NO: 17, aminoácidos 1-5 de SEQ ID NO: 19, aminoácidos

1-3 de SEQ ID NO: 20, aminoácidos 1-5 de SEQ ID NO: 21, o aminoácidos 1-6 de SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la extensión N-terminal incluye aminoácidos 1 -31 de SEQ ID NO: 11.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la extensión N-terminal incluye aminoácidos 17-31 de SEQ

ID NO: 11. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la extensión N-terminal incluye KGANKK (SEQ

ID NO: 314) o KGANQK (SEQ ID NO: 315). En algunas realizaciones, la extensión C-terminal incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 117, o aminoácidos 23-37 seleccionados de una cualquiera de SEQ ID NOs: 101-116.

En algunas realizaciones, el NP es selectivo para NPR-B sobre NPR-A, en el que la relación EC^{50(n p r -a )}/EC^{50(n p r -b )}para el NP, según lo determinado en un ensayo farmacocinético in vivo, es al menos 30.

En algunas realizaciones, la Fc incluye un dominio C^{h 2}, un dominio C^{h 3}, y una región bisagra. En algunas realizaciones, la Fc es un dominio constante de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en lgG-1, lgG-2, lgG-3, lgG-3 e lgG-4. En algunas realizaciones, la Fc incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 401. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina es lgG-1. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la Fc incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con

SEQ ID NO: 401, o incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 401.

En algunas realizaciones, Y incluye una región rica en glicina, o la secuencia de aminoácidos de Y consiste en una o más glicinas y en una o más serinas. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de Y puede incluir [(Gly)^m(Ser)]ⁿ(Gly)^po (Gly)^p[(Ser)(Gly)^m]ⁿ, en la que cada uno de m, n, y p está, independientemente, entre 0 y 20. En algunas realizaciones, m es 0-20 (por ejemplo, m es 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-11,3-12, 3-14, 3-15, 3-16, 3-17, 3-18, 3-19, 3-20, 4-6, 4-7, 4

8, 4-9, 4-10, 4-11,4-12, 4-14, 4-15, 4-16, 4-17, 4-18, 4-19, 4-20, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 5-11,5-12, 5-14, 5-15, 5-16,

5-17, 5-18, 5-19, 5-20, 6-7, 6-8, 6-9, 6-10, 6-11,6-12, 6-14, 6-15, 6-16, 6-17, 6-18, 6-19, 6-20, 7-8, 7-9, 7-10, 7-11,7

12, 7-14, 7-15, 7-16, 7-17, 7-18, 7-19, 7-20, 8-9, 8-10, 8-11,8-12, 8-14, 8-15, 8-16, 8-17, 8-18, 8-19, 8-20, 9-10, 9-11,

9-12, 9-14, 9-15, 9-16, 9-17, 9-18, 9-19, 9-20, 10-11, 10-12, 10-14, 10-15, 10-16, 10-17, 10-18, 10-19, o 10-20). En algunas realizaciones, m es 4 y n es 1-6. En algunas realizaciones, las combinaciones de m, n, y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2, o la secuencia de aminoácidos de Y incluye la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 304-313, 322-333, o 337-391. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de

Y consiste en (Gly)^m(Ser)]ⁿ(Gly)^po (Gly)^p[(Ser)(Gly)^m]ⁿ, en la que las combinaciones de m, n, y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2, o la secuencia de aminoácidos de Y consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 304-313, 322-333, o 337-391.

En algunas realizaciones, X está ausente, Z está ausente, o tanto X como Z están ausentes.

En algunas realizaciones, X, Y, o Z incluye un resto dirigido al hueso, por ejemplo que incluye 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, o 16 restos ácidos consecutivos, por ejemplo ácido aspártico o ácido glutámico. En algunas realizaciones, el resto dirigido al hueso incluye o consiste en E⁶, E⁷, E^s, E^g, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D⁶, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo E⁶, E¹⁰, D⁶, o D¹⁰.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ

ID NOs: 501-608, por ejemplo SEQ ID NOs: 502, 504, 506, 512, 514, 516, 530, 560, 562, 564, 572, 574, 576, 584,

586, 588, 596, 598, 600, o 608. En algunas realizaciones, el polipéptido incluye un resto dirigido al hueso, por ejemplo

E⁶, E⁷, E⁸, E⁹, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D⁶, D⁷, D⁸, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D ¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo E⁶, E¹⁰, D⁶, o D¹⁰.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 504.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 512.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 530.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 554.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 572.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 578.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 560.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 566.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 538 (por ejemplo, en la que X en SEQ ID NO: 538 puede ser cualquier aminoácido, por ejemplo Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg,

Tyr, Cys, Pro, Asp, Gly, Ala, Ser, Val, Trp, Asn, Gln, His, o Lys, por ejemplo Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, o Asp, por ejemplo Phe o Leu, por ejemplo Phe, por ejemplo Leu).

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye la estructura V-NP.

En algunas realizaciones, cualquiera de los NP o polipéptidos descritos aquí se pueden usar en combinación con el método (por ejemplo, los NP o polipéptidos descritos en cualquiera de los aspectos descritos aquí). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de V o W incluye [(Gly)^m(Ser)]ⁿ(Gly)^po (Gly)^p[(Ser)(Gly)^m]ⁿ, en la que cada uno de m, n, y p está, independientemente, entre 0 y 20. En algunas realizaciones, m es 4 y n es 1-6. En algunas realizaciones, V está ausente, W está ausente, o V y W están ambos ausentes. En algunas realizaciones, V y/o W

incluyen un resto dirigido al hueso, por ejemplo E⁶, E⁷, E^s, E⁹, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D⁶, D⁷, D^s, D⁹, D¹⁰, D¹¹,

D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo E⁶, E¹⁰, D⁶, o D¹⁰. En algunas realizaciones, V y/o W incluy escisión de catepsina (por ejemplo, catepsina K), por ejemplo HGPQG (SEQ ID NO: 374) o HKLRG (SEQ ID NO: 375).

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos aquí, el polipéptido de la invención, por ejemplo el polipéptido de sALP y/o el polipéptido de NP, está en forma dimérica. En algunas realizaciones, el polipéptido está glicosilado o pegilado.

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos aquí, la composición farmacéutica se administra en una dosis entre alrededor de 0,2 mg/kg y alrededor de 20 mg/kg del polipéptido de la invención, por ejemplo el polipéptido de sALP y/o el polipéptido de NP, por ejemplo el polipéptido de sALP. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto en una dosis entre alrededor de 0,2 mg/kg y alrededor de 20 mg/kg una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces al día. La dosis puede estar entre, por ejemplo, alrededor de 0,5 mg/kg y alrededor de 10 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 1 mg/kg y alrededor de 5 mg/kg, una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces al día. En algunas realizaciones, la dosis es alrededor de 1 mg/kg, alrededor de 2 mg/kg, o alrededor de 3 mg/kg una vez, dos veces, o tres veces al día. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto en una dosis entre alrededor de 0,2 mg/kg y alrededor de 20 mg/kg una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces por semana. La dosis puede estar entre, por ejemplo, alrededor de 0,5 mg/kg y alrededor de 10 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 1 mg/kg y alrededor de 5 mg/kg, una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces por semana.

En algunas realizaciones, la dosis es alrededor de 1 mg/kg, alrededor de 2 mg/kg, o alrededor de 3 mg/kg una vez, dos veces, o tres veces por semana.

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos aquí, la composición farmacéutica se administra en una dosis entre alrededor de 0,5 mg/kg y alrededor de 500 mg/kg del polipéptido de la invención, por ejemplo el polipéptido de sALP y/o el polipéptido de NP, por ejemplo el polipéptido de NP. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto en una dosis entre alrededor de 0,5 mg/kg y alrededor de 500 mg/kg una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces al día. La dosis puede estar entre, por ejemplo, alrededor de 5 mg/kg y alrededor de 200 mg/kg, por ejemplo alrededor de 10 mg/kg y alrededor de 100 mg/kg, una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces al día. En algunas realizaciones, la dosis es alrededor de 10 mg/kg o alrededor de 100 mg/kg dos veces al día. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto en una dosis entre alrededor de 0,5 mg/kg y alrededor de 500 mg/kg una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces por semana. La dosis puede estar entre, por ejemplo, alrededor de 5 mg/kg y alrededor de 200 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 10 mg/kg y alrededor de 100 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 20 mg/kg y alrededor de 40 mg/kg una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces por semana. En algunas realizaciones, la dosis es alrededor de 10 mg/kg, alrededor de 30 mg/kg, o alrededor de 100 mg/kg una vez, dos veces, o tres veces por semana.

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos aquí, la composición farmacéutica se administra en una dosis entre alrededor de 10 pg/kg y alrededor de 1.000 pg/kg del polipéptido de la invención, por ejemplo el polipéptido de sALP y/o el polipéptido de NP, por ejemplo el polipéptido de NP. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto en una dosis de entre alrededor de 10 pg/kg y alrededor de 1.000 pg/kg una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces por semana. La dosis puede estar entre, por ejemplo, alrededor de 20 pg/kg y alrededor de 800 pg/kg, por ejemplo, alrededor de 30 pg/kg y alrededor de 600 pg/kg, por ejemplo, alrededor de 50 pg/kg y alrededor de 500 pg/kg, por ejemplo, alrededor de 100 pg/kg y alrededor de 400 pg/kg, por ejemplo, alrededor de 200 pg/kg y alrededor de 300 pg/kg, una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces por semana.

En algunas realizaciones, la dosis es alrededor de 30 pg/kg, alrededor de 100 pg/kg, alrededor de 300 pg/kg, o alrededor de 500 pg/kg, una vez, dos veces, o tres veces por semana.

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos descritos aquí, la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra una vez, dos veces, o tres veces por semana.

En una realización, la invención presenta una composición que incluye un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en la que a) el primer polipéptido incluye la estructura A-sALP-B, en la que i) sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina, ii) A está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y iii) B está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, en la que la secuencia de aminoácidos de dicha sALP comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1205; y b) el segundo polipéptido incluye la estructura V-NP-W, en la que i) NP es un péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (NPR-B), ii) V está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y iii) W está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y en la que dicho NP comprende la estructura:

[extensión N-terminal]-[segmento corto]-[dominio de anillo]-[extensión C-terminal], y en la que dicho dominio de anillo se selecciona del grupo de restos de aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126 y en la que el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, Ser, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, o Asp, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y dicho segmento corto y dicho dominio de anillo comprenden juntos la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 13-30, 119-122, 126, o 156-161, y un excipiente farmacéuticamente aceptable para uso en un método para tratar una o más manifestaciones óseas de un síndrome neurocutáneo en un sujeto.

En algunas realizaciones, el primer polipéptido es cualquier polipéptido de sALP como se describe para el primer aspecto. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1201, 1204, 1220, o 1221, por ejemplo SEQ ID NO: 1204. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1204.

En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido de NP descrito aquí, por ejemplo como se describe para el segundo aspecto. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NOs: 504, 512, 530, 554, 572, o 578, por ejemplo SEQ ID NO: 512. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 512.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1204 o 1221, y la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 504, 512, 530, o 572.

En algunas realizaciones, el primer polipéptido y/o el segundo polipéptido están en forma dimérica. En algunas realizaciones, el primer polipéptido y/o el segundo polipéptido están glicosilados o pegilados.

La composición es una composición farmacéutica que incluye un excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo disolución salina. En algunas realizaciones, la composición está liofilizada.

En algunas realizaciones, el primer polipéptido está presente en una dosis entre alrededor de 0,2 mg/kg y alrededor de 20 mg/kg, y el segundo polipéptido está presente en una dosis entre alrededor de 0,5 mg/kg y alrededor de 500 mg/kg. En algunas realizaciones, el primer polipéptido está presente en una dosis entre alrededor de 0,2 mg/kg y alrededor de 20 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 0,5 mg/kg y alrededor de 10 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 1 mg/kg y alrededor de 5 mg/kg, para una administración de una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, o cuatro veces a la semana, por ejemplo, alrededor de 1 mg/kg, alrededor de 2 mg/kg, o alrededor de 3 mg/kg para una administración de una vez al día, dos veces al día, cuatro veces al día, una vez a la semana, dos veces a la semana, o tres veces a la semana; y el segundo polipéptido está presente en una dosis entre alrededor de 0,5 mg/kg y alrededor de 500 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 5 mg/kg y alrededor de 200 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 10 mg/kg y alrededor de 100 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 20 mg/kg y alrededor de 40 mg/kg, para una administración de una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, o cuatro veces a la semana, por ejemplo, alrededor de 10 mg/kg, alrededor de 30 mg/kg, o alrededor de 100 mg/kg, para una administración de una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, una vez a la semana, dos veces a la semana, o tres veces a la semana.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1204, y la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 512.

La presente descripción presenta además un método para tratar una enfermedad o una afección en un sujeto, incluyendo el método la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que a) el primer polipéptido incluye la estructura A-sALP-B, en la que i) sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina, ii) A está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y iii) B está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; y b) el segundo polipéptido incluye la estructura V-NP-W, en la que i) NP es un péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (NPR-B), ii) V está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y iii) W está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; y la enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en un síndrome neurocutáneo, un trastorno asociado con la sobreactivación de FGFR3, un trastorno óseo o de cartílago, un trastorno del músculo liso vascular, y una afección por elongación del hueso. En algunas descripciones, la enfermedad o afección en el sujeto se trata de este modo.

En algunas realizaciones, el primer polipéptido es cualquier polipéptido descrito aquí que incluye sALP, por ejemplo cualquier polipéptido de sALP descrito aquí, por ejemplo como se describe para el primer aspecto En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1201, 1204, 1220, o 1221, por ejemplo SEQ ID NO: 1204. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1204.

En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido descrito aquí que incluye NP, por ejemplo cualquier polipéptido de NP descrito aquí, por ejemplo como se describe para el segundo aspecto. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NOs: 504, 512, 530, 554, 572, o 578, por ejemplo SEQ ID NO: 512. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 512.

En algunas realizaciones, el primer polipéptido y el segundo polipéptido se administran dentro de diez días, cinco días, o veinticuatro horas el uno del otro, por ejemplo dentro de diez, nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, o dos días el uno del otro, o dentro de veinticuatro, doce, once, diez, nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos, o una hora el uno del otro.

En algunas realizaciones, el primer polipéptido y el segundo polipéptido se administran simultáneamente. En algunas realizaciones, el primer polipéptido y el segundo polipéptido se formulan juntos en una composición, o cada uno por separado en una composición. En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo disolución salina. En algunas realizaciones, la composición está liofilizada. En algunas realizaciones, la composición es cualquier composición, por ejemplo una composición farmacéutica, descrita aquí, por ejemplo como se describe para el primer, segundo aspecto.

Se describe adicionalmente aquí un kit que incluye: a) un primer polipéptido que incluye la estructura A-sALP-B, en la que i) sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina, ii) A está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y iii) B está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; y b) instrucciones para administrar el primer polipéptido a un paciente diagnosticado o con riesgo de desarrollar un síndrome neurocutáneo. En algunas realizaciones, el primer polipéptido es cualquier polipéptido descrito aquí que incluye sALP, por ejemplo cualquier polipéptido de sALP descrito aquí, por ejemplo como se ha descrito en cualquiera de los aspectos anteriores.

Se describe además aquí que el kit incluye además (c) un segundo polipéptido que incluye la estructura V-NP-W, en la que i) NP es un péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (NPR-B), ii) V está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y iii) W está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido descrito aquí que incluye NP, por ejemplo cualquier polipéptido de NP descrito aquí, por ejemplo como se ha descrito en cualquiera de los aspectos anteriores.

Se describe además aquí un kit que incluye: a) un polipéptido que incluye la estructura V-NP-W, en la que i) NP es un péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (NPR-B), ii) V está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y iii) W está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; y b) instrucciones para administrar el polipéptido a un paciente diagnosticado o con riesgo de desarrollar un síndrome neurocutáneo. Se describe además aquí que el polipéptido es cualquier polipéptido descrito aquí que incluye NP, por ejemplo cualquier polipéptido de NP descrito aquí, por ejemplo como se ha descrito en cualquiera de los aspectos anteriores.

Se describe además aquí un kit que incluye: a) un primer polipéptido que incluye la estructura A-sALP-B, en la que i) sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina, ii) A está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y iii) B está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; y b) un segundo polipéptido que incluye la estructura V-NP-W, en la que i) NP es un péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (NPR-B), ii) V está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y iii) W está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido. En algunas realizaciones, el primer polipéptido es cualquier polipéptido descrito aquí que incluye sALP, por ejemplo cualquier polipéptido de sALP descrito aquí, por ejemplo como se describe en cualquiera de los aspectos anteriores; y el segundo polipéptido es cualquier polipéptido descrito aquí que incluye NP, por ejemplo, cualquier polipéptido de NP descrito aquí, por ejemplo como se describe en cualquiera de los aspectos anteriores. En algunas realizaciones, el primer polipéptido y el segundo polipéptido se formulan juntos. En algunas realizaciones, el primer polipéptido y el segundo polipéptido se formulan por separado y en una cantidad de dosis individual.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos de la sALP incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NOs: 1202, 1205, 1218, o 1219.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos de la sALP incluye o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con los restos de aminoácidos 23-508 de SEQ ID NO: 1215, restos de aminoácidos 18-498 de SEQ ID NO: 1216, restos de aminoácidos 23-508 de SEQ ID NO: 1218, restos de aminoácidos 18-498 de SEQ ID NO: 1219, restos de aminoácidos 23-512 de SEQ ID NO: 1215, restos de aminoácidos 18-502 de SEQ ID NO: 1216, restos de aminoácidos 23-512 de SEQ ID NO: 1218, o restos de aminoácidos 18-502 de SEQ ID NO: 1219, en la que X en SEQ ID NO: 1218 o 1219 es cualquier aminoácido pero no es un aminoácido correspondiente a una mutación patógena en esa posición de la TNALP humana, por ejemplo no es un aminoácido correspondiente a una mutación patógena proporcionada en la Tabla 1, o comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1205.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP incluye o consiste en restos de aminoácidos 6-22 de s Eq ID NO: 126, y el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, Ser, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, o Asp, por ejemplo Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, o Ser, por ejemplo Phe, Leu, Arg, Tyr, por ejemplo Phe o Leu, por ejemplo Phe, por ejemplo Leu.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos del NP comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 13-29, 100-116, 119-125, 127-233, o 1001 -1155.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, el NP es selectivo para NPR-B sobre NPR-A, en el que la relación EC50(^npr-^a)/EC50(^npr-^b) para el NP, según lo determinado en un ensayo farmacocinético in vivo, es al menos 30, por ejemplo al menos 35, 40, 35, 50, 55, o 60.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la Fc incluye un dominio C^h2, un dominio C^h3, y una región bisagra, o en el que la Fc es un dominio constante de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en lgG-1, lgG-2, lgG-3, e lgG-4, por ejemplo lgG-1. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la Fc incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 401. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la Fc incluye o consiste en SEQ ID NO: 401.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos de D o Y incluye una región rica en glicina, o la secuencia de aminoácidos de D o Y consiste en una o más glicinas y en una o más serinas. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de D o Y puede incluir o consistir en [(Gly)^m(Ser)]ⁿ(Gly)^por (Gly)^p[(Ser)(Gly)^m]ⁿ, en la que cada uno de m, n, y p está, independientemente, entre 0 y 20. En algunas realizaciones, m está entre 1 y 6; n está entre 1 y 10; y p está entre 0 y 4, por ejemplo m es 4 y n es 1-6. En algunas realizaciones, las combinaciones de m, n y p se seleccionan de entre una sola fila de la Tabla 2 o la secuencia de aminoácidos de D o Y incluye o consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 301 -391.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la secuencia de aminoácidos de D, G, o Y es opcionalmente dos restos de aminoácidos (por ejemplo, leucina-lisina o ácido aspártico-isoleucina). En algunas realizaciones de un polipéptido de sALP, tanto C como E pueden estar ausentes, y D puede estar ausente o puede ser una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido. Por ejemplo, el polipéptido puede consistir en la estructura sALP-D-Fc o la estructura Fc-D-sALP, en la que D puede ser cualquier enlazador descrito aquí, u opcionalmente puede consistir en dos restos de aminoácidos, por ejemplo leucina-lisina. Por ejemplo, el polipéptido puede consistir en la estructura sALP-D-Fc. De manera opcional, la secuencia de aminoácidos de sALP es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1205, la secuencia de aminoácidos de D es leucina-lisina, y/o la secuencia de aminoácidos de Fc es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 401. En otras realizaciones de un polipéptido de sALP, C puede estar ausente, y tanto D como E pueden estar ausentes o pueden ser una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido. Por ejemplo, el polipéptido puede incluir la estructura sALP-D-Fc-E o la estructura Fc-D-sALP-E. En otras realizaciones de un polipéptido de sALP, C puede estar ausente, y D, G, y H pueden estar ausentes o pueden ser una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido. Por ejemplo, el polipéptido puede incluir la estructura sALP-D-Fc-G-Iⁿ-H. En algunas realizaciones de un polipéptido de NP, tanto X como Z pueden estar ausentes, e Y puede estar ausente o puede ser una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido. Por ejemplo, el polipéptido puede consistir en la estructura NP-Y-Fc o la estructura Fc-Y-NP, en la que Y puede ser cualquier enlazador descrito aquí, o puede consistir opcionalmente en dos restos de aminoácidos, por ejemplo leucina-lisina. Por ejemplo, el polipéptido puede consistir en la estructura NP-Y-Fc.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, uno o más de A, B, C, D, E, G, H, V, W, X, Y, o Z están ausentes. En algunas realizaciones, A está ausente, B está ausente, o tanto A como B están ausentes. En algunas realizaciones, C está ausente, E está ausente, o tanto C como E están ausentes. En algunas realizaciones, C está ausente, H está ausente, o tanto C como H están ausentes. En algunas realizaciones, X está ausente, Z está ausente, o tanto X como Z están ausentes.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, el polipéptido de la invención, por ejemplo el polipéptido de sALP y/o el polipéptido de NP, pueden incluir un resto dirigido al hueso, por ejemplo que incluye 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14,15, o 16 restos ácidos consecutivos, por ejemplo ácido aspártico o ácido glutámico, por ejemplo E⁶, E⁷, E^s, E^g, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, Ü⁶, D⁷, D^s, D^g, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo E⁶, E¹⁰, Ü⁶, o D¹⁰. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, uno o más de A, B, C, D, E, V, W, X, Y, o Z incluye un resto dirigido al hueso, por ejemplo que incluye 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16 restos ácidos consecutivos, por ejemplo ácido aspártico o ácido glutámico, por ejemplo E⁶, E⁷, E^s, E^g, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D⁶, D⁷, D^s, D^g, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶, por ejemplo E⁶, E¹⁰, D⁶, o D¹⁰.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, el polipéptido de la invención no incluye opcionalmente un resto dirigido al hueso (por ejemplo, una región de ácido poliaspártico o ácido poliglutámico más larga que dos restos de ácido aspártico o ácido glutámico consecutivos).

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, el polipéptido de la invención puede incluir una secuencia de escisión de catepsina (por ejemplo, catepsina K), por ejemplo, HGPQG (SEQ ID NO: 374) o HKLRG (SEQ ID NO: 375). En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, A, B, C, D, E, G, H, V, W, X, Y, o Z incluyen una secuencia de escisión de catepsina (por ejemplo, catepsina K).

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido de la invención puede incluir un polipéptido que tiene una degradación reducida (por ejemplo, en alrededor de 20 %, alrededor de 25 %, alrededor de 30 %, alrededor de 35 %, alrededor de 40 %, alrededor de 45 %, alrededor de 50 %, alrededor de 55 %, alrededor de 60 %, alrededor de 65 %, alrededor de 70 %, alrededor de 75 %, alrededor de 80 %, alrededor de 85 %, alrededor de 90 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de 99 %, o alrededor de 100 % (por ejemplo, mediante endopeptidasa neutra (NEP), enzima degradante de insulina (IDE), o cualquier otra enzima que escinde un péptido natriurético in vivo), en comparación con un control (por ejemplo, CNP22, CNP53, o cualquier polipéptido descrito aquí, tal como un péptido descrito en la publicación de solicitud internacional n.° WO2010/135541 o la publicación de solicitud de U. S. n.° 2010-0331256).

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido de la invención puede haber aumentado la eficacia (por ejemplo, en alrededor de 20 %, alrededor de 25 %, alrededor de 30 %, alrededor de 35 %, alrededor de 40 %, alrededor de 45 %, alrededor de 50 %, alrededor de 55 %, alrededor de 60 %, alrededor de 65 %, alrededor de 70 %, alrededor de 75 %, alrededor de 80 %, alrededor de 85 %, alrededor de 90 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de un 99 %, alrededor de un 100 %, o más) y/o haber reducido los efectos secundarios dependientes de la dosis (por ejemplo, en alrededor de 20 %, alrededor de 25 %, alrededor de 30 %, alrededor de 35 %, alrededor de 40 %, alrededor de 45 %, alrededor de 50 %, alrededor de 55 %, alrededor de 60 %, alrededor de 65 %, alrededor de 70 %, alrededor de 75 %, alrededor de 80 %, alrededor de 85 %, alrededor de 90 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de 99 %, o alrededor de 100 %) (por ejemplo, efectos hemodinámicos adversos reducidos, tal como la disminución reducida de la tensión arterial), en comparación con un control (por ejemplo, cualquier polipéptido descrito aquí, tal como un péptido descrito en la publicación de solicitud internacional n.° WO2010/135541 o la publicación de solicitud de U. S. n.22010-0331256).

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, el polipéptido de la invención (por ejemplo, un polipéptido de sALP o un polipéptido de NP) está glicosilado o pegilado. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye un dímero de uno o más de los polipéptidos de la invención. En algunas realizaciones, el excipiente farmacéuticamente aceptable incluye disolución salina. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está liofilizada. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea, intravenosa, oral, nasal, intramuscular, sublingual, intratecal, o intradérmica, por ejemplo por vía subcutánea.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto en una dosis entre alrededor de 0,5 mg/kg y alrededor de 500 mg/kg una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces al día. La dosis puede estar entre, por ejemplo, alrededor de 5 mg/kg y alrededor de 200 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 10 mg/kg y alrededor de 100 mg/kg, una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces al día. En algunas realizaciones, la dosis es alrededor de 10 mg/kg o alrededor de 100 mg/kg dos veces al día.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto en una dosis entre alrededor de 0,5 mg/kg y alrededor de 500 mg/kg, una vez o dos veces por semana. La dosis puede estar entre, por ejemplo, alrededor de 5 mg/kg y alrededor de 200 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 10 mg/kg y alrededor de 100 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 20 mg/kg y alrededor de 40 mg/kg, una vez o dos veces por semana. En algunas realizaciones, la dosis es alrededor de 10 mg/kg, alrededor de 30 mg/kg, o alrededor de 100 mg/kg, una vez o dos veces por semana.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto en una dosis entre alrededor de 10 pg/kg y alrededor de 1.000 pg/kg, una vez o dos veces por semana. La dosis puede estar entre, por ejemplo, alrededor de 20 pg/kg a alrededor de 800 pg/kg, por ejemplo, alrededor de 30 pg/kg a alrededor de 600 pg/kg, por ejemplo, alrededor de 50 pg/kg a alrededor de 500 pg/kg, por ejemplo, alrededor de 100 pg/kg a alrededor de 400 pg/kg, por ejemplo, alrededor de 200 pg/kg a alrededor de 300 pg/kg, una vez o dos veces por semana. En algunas realizaciones, la dosis es alrededor de 30 pg/kg, alrededor de 100 pg/kg, alrededor de 300 pg/kg, o alrededor de 500 pg/kg, una vez o dos veces por semana.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la composición farmacéutica se administra al sujeto en una dosis entre alrededor de 0,1 mg/kg y alrededor de 500 mg/kg de uno o más de los polipéptidos de la invención en un régimen de dosificación de una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces al día. La dosis puede estar entre, por ejemplo, alrededor de 1 mg/kg y alrededor de 200 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 2 mg/kg y alrededor de 100 mg/kg, o alrededor de 10 mg/kg y alrededor de 100 mg/kg de uno o más de los polipéptidos de la invención en un régimen de dosificación de una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces al día. En algunas realizaciones, la dosis es alrededor de 10 mg/kg o alrededor de 100 mg/kg de uno o más de los polipéptidos de la invención en un régimen de dosificación de dos veces al día. Por ejemplo, los métodos de la invención pueden incluir opcionalmente administrar una composición farmacéutica que incluye los polipéptidos de la invención (por ejemplo, un polipéptido de sALP y/o un polipéptido de NP) al sujeto en una dosis de alrededor de 0,5 mg/kg/día a alrededor de 10 mg/kg/día (por ejemplo, alrededor de 2 mg/kg/día a alrededor de 3 mg/kg/día).

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la composición farmacéutica se administra al sujeto entre una y catorce veces a la semana, o se administra al menos una vez al día durante al menos un mes. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto una vez a la semana durante al menos un mes. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra una vez, dos veces, tres veces, o cuatro veces a la semana, por ejemplo tres veces a la semana.

Cualquiera de las composiciones farmacéuticas de la invención puede formularse opcionalmente para tratar una enfermedad o afección (por ejemplo, cualquiera descrita aquí) en un sujeto.

Cualquiera de la composición farmacéutica de la invención que presenta un ácido nucleico aislado puede incluir opcionalmente un vector de expresión recombinante (por ejemplo, un vector lentiviral) que incluye el ácido nucleico aislado. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye alrededor de de 0,1 mg a alrededor de 10 mg del ácido nucleico aislado.

En cualquier realización descrita aquí, el polipéptido puede estar aislado o no.

En cualquier realización descrita aquí, el sujeto puede ser humano.

En cualquiera de los aspectos descritos aquí, la combinación de dos o más polipéptidos de la invención (por ejemplo, cualquier polipéptido de sALP y/o cualquier polipéptido de NP descrito aquí) o dos o más composiciones de la invención proporciona un efecto sinérgico. En realizaciones particulares, el efecto sinérgico es un efecto terapéutico que se observa para la combinación de dos o más polipéptidos de la invención, en la que uno o más de los polipéptidos de la invención están presentes en una dosis que normalmente no es terapéutica; o un efecto terapéutico que da como resultado una disminución inesperada en uno o más eventos adversos (por ejemplo, efectos hemodinámicos, tal como una disminución de la tensión arterial, tal como la tensión arterial sistólica, la tensión arterial diastólica, o la tensión arterial media, que da como resultado efectos hipotensivos adversos); o un efecto terapéutico que da como resultado efectos secundarios dependientes de la dosis reducidos, en comparación con el nivel de efectos secundarios dependientes de la dosis observados para un solo polipéptido de la invención a una dosis terapéutica.

En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones para uso en un método para tratar una o más manifestaciones óseas de un síndrome neurocutáneo en un sujeto descritas aquí, la enfermedad es el síndrome neurocutáneo (por ejemplo, neurofibromatosis (por ejemplo, el tipo clásico de von Recklinghausen (tipo I), ya sea con tumores estromales gastrointestinales (es decir, como en la neurofibromatosis intestinal (tipo 3B)) o sin dichos tumores; un tipo de neuroma acústico (tipo II); un tipo mixto que combina las características de los tipos I y II con características predominantes, tales como los neuromas acústicos bilaterales, los meningiomas de la fosa posterior y de las cervicales superiores, y los neurofibromas espinales/paraespinales (tipo III, tipo Riccardi o tipo 3A); un tipo atípico que se distingue por la falta de nodulos de Lisch del iris que son característicos del tipo I (tipo VI); neurofibromatosis segmentaria, que es una variante de tipo I que tiene lesiones que afectan a un área específica del cuerpo, tal como un solo segmento del cuerpo o un área que cruza la línea media (tipo V); un tipo que tiene sólo los síntomas de manchas café con leche sin otras manifestaciones de neurofibromatosis (tipo VI); neurofibromatosis espinal familiar, que es causada por una mutación en el gen NF1 de la neurofibromina y se considera una variante distinguible de tipo I; otras variantes de tipo I, tal como el síndrome de neurofibromatosis-feocromocitoma-carcinoide duodenal; neurofibromatosis con manifestaciones del síndrome de Noonan, tales como estatura baja, ptosis, hipoplasia del tercio medio facial, cuello palmeado, discapacidades de aprendizaje, y debilidad muscular; y schwannomatosis, en la que cualquiera de estos trastornos puede incluir o excluir una o más manifestaciones óseas); esclerosis tuberosa; enfermedad de Sturge-Weber; ataxia telangiectasia; enfermedad de von Hippel-Lindau; incontinentia pigmenti; síndromes del nevo epidérmico, tal como el nevo sebáceo lineal de Jadassohn; síndrome de carcinoma nevoide de células básales; hipomelanosis de Ito; melanosis neurocutánea; síndrome de Klippel-Ternaunay; y síndrome de Waardenburg, incluyendo los tipos I, II, III y IV). El síndrome neurocutáneo tiene una o más manifestaciones óseas. En algunas realizaciones, el síndrome neurocutáneo es una neurofibromatosis tipo I. En algunas realizaciones, la enfermedad es cualquier síndrome neurocutáneo con señalización de RAS y/o ERK sobreactivada (por ejemplo, síndrome de Noonan, síndrome de Costello, síndrome de Noonan con múltiples lentigos/síndrome LEOPARD, neurofibromatosis tipo 1, fibromatosis gingival hereditaria tipo 1, NF 1-síndrome de Noonan, síndrome de malformación capilar-malformación AV, síndrome de Legius, trastorno similar al síndrome de Noonan con cabello anágeno suelto, trastorno similar al síndrome de Noonan con leucemia mielomonocítica juvenil (JMML), síndrome cardio-facio-cutáneo, o síndrome linfoproliferativo autoinmune, en la que cualquiera de estos trastornos puede incluir o excluir una o más manifestaciones óseas). En algunas realizaciones, el trastorno asociado con la sobreactivación de FGFR3 es un trastorno óseo o de cartílago, por ejemplo una displasia esquelética, tal como cualquiera de los descritos aquí, por ejemplo acondroplasia o craneosinostosis. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno óseo o de cartílago, por ejemplo una displasia esquelética, tal como cualquiera de las descritas aquí. En algunas realizaciones, el trastorno óseo o de cartílago es una displasia esquelética, por ejemplo acondroplasia, acondroplasia homocigota, acondroplasia heterocigota, acondrogénesis, acrodisostosis, displasia acromesomélica, atelosteogénesis, displasia camptomélica, condrodisplasia punctata, tipo rizomélico de condrodisplasia punctata, disostosis cleidocraneal, fémur corto congénito, craneosinostosis (por ejemplo, síndrome de Muenke, síndrome de Crouzon, síndrome de Apert, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Pfeiffer, o síndrome de Crouzonodermoesquelético), dactilia, braquidactilia, camptodactilia, polidactilia, sindactilia, displasia diastrófica, enanismo, displasia disegmental, encondromatosis, fibrocondrogénesis, displasia fibrosa, exostosis múltiple hereditaria, hipocondroplasia, hipofosfatasia, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Jaffe-Lichtenstein, displasia de Kniest, síndrome de Kniest, displasia mesomélica tipo Langer, síndrome de Marfan, síndrome de McCune-Albright, micromelia, displasia metafisaria, displasia metafisaria de tipo Jansen, displasia metatrófica,

síndrome de Morquio, displasia mesomélica de tipo Nievergelt, neurofibromatosis (por ejemplo, tipo 1, por ejemplo con manifestaciones óseas; tipo 2; schwannomatosis; o cualquiera de las descritas aquí), osteoartritis, osteocondrodisplasia, osteogénesis imperfecta, tipo letal perinatal de osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoiquilosis , disostosis periférica, síndrome de Reinhardt, síndrome de Roberts, síndrome de Robinow, síndromes de costillas cortas y polidactilia, talla baja, displasia espondiloepifisaria congénita, displasia espondiloepimetafisaria, o displasia tanatofórica. En algunas realizaciones, el trastorno óseo o de cartílago es opcionalmente hipofosfatasia (por ejemplo, HPP infantil, HPP de la infancia, HPP perinatal, HPP adulta, u odontohipofosfatasia). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra en una cantidad que es terapéuticamente eficaz para tratar un fenotipo de acondroplasia seleccionado del grupo que consiste en retraso del crecimiento, deformidades del cráneo, y defectos ortodónticos. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra en una cantidad que es terapéuticamente eficaz para tratar un fenotipo de acondroplasia seleccionado del grupo que consiste en compresión del cordón cervical, estenosis espinal, hidrocefalia, pérdida de audición debido a otitis crónica, enfermedad cardiovascular, enfermedad neurológica, y obesidad.

En cualquier composición para uso en un método de tratamiento descrito aquí, se trata así el síndrome neurocutáneo en el sujeto.

En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos aquí, uno o más polipéptidos de la invención o una o más composiciones de la invención se administran opcionalmente en una cantidad que es terapéuticamente eficaz para tratar un fenotipo de HPP seleccionado del grupo que consiste en convulsiones relacionadas con HPP, pérdida prematura de dientes deciduos, mineralización incompleta de los huesos, niveles elevados de pirofosfato inorgánico (PPⁱ) en sangre y/u orina, niveles elevados de fosfoetanolamina (PEA) en sangre y/u orina, niveles elevados de piridoxal 5’-fosfato (PLP) en sangre y/u orina, aumento inadecuado de peso, raquitismo, dolor óseo, deposición de cristales de dihidrato de pirofosfato de calcio, aplasia, hipoplasia, y displasia del cemento dental. En algunas realizaciones, la mineralización incompleta del hueso es una mineralización incompleta del hueso femoral, una mineralización incompleta del hueso tibial, una mineralización incompleta del hueso metatarsiano, o una mineralización incompleta del hueso de la costilla.

Definiciones

Tal como se emplea aquí, el término “alrededor de” significa ± 10 % del valor mencionado.

Por “área bajo la curva” o “AUC”, en el contexto de un ensayo farmacocinético in vivo, se entiende el área bajo la curva de concentración de suero frente al tiempo tras la administración en un animal.

Por “trastorno óseo o de cartílago”, se entiende cualquier trastorno, enfermedad, u otra anomalía que afecte la función, la estructura, o el crecimiento del hueso o el cartílago.

Por “resto dirigido al hueso”, se entiende una secuencia de aminoácidos de entre 6 y 20 restos de aminoácidos de longitud que tiene una afinidad suficiente con la matriz ósea de modo que el resto dirigido al hueso, tomado solo, tenga una afinidad de unión in vivo con la matriz ósea que es al menos 10^-6M o mejor (por ejemplo, 10^-7M, 10^-8M, 10 ^-9M, o mejor).

Por “secuencia de escisión de catepsina”, se entiende una secuencia de aminoácidos que tiene un sitio que puede escindirse por la catepsina con una constante de velocidad k^cat/K^Mde al menos 10³M^-1s^-1(por ejemplo, 10⁴M^-1s^-1, 10⁵M^-1s^-1, 10⁶M^'V ¹, 10⁷M^'V ¹, o 10⁸M^'V ¹) a 30°C o más (por ejemplo, 37°C). En realizaciones particulares, la secuencia de escisión de catepsina es específica para la catepsina K. Las secuencias de escisión de catepsina ejemplares son P2-P1-P1’, en las que la escisión por la enzima se produciría en el enlace peptídico P1-P1’; P2 está compuesto preferentemente por Pro, Leu, Ile, pero también podría ser Val, Norleucina, Met, o Ala; P1 es preferentemente Arg, Lys, Gln, pero también podría ser Met, Norleucina, Leu, Ile, o Thr; y P1’ puede ser cualquier aminoácido, pero es preferentemente Gly. En Choe et al., J. Biol. Chem. 281 (18):12824-832, 2006, se proporcionan secuencias de escisión de catepsina adicionales

Por “CNP22” se entiende el CNP22 humano (SEQ ID NO: 4), a menos que se indique expresamente un significado diferente.

Por “CNP53”, se entiende el CNP53 humano (SEQ ID NO: 11), a menos que se indique expresamente un significado diferente.

Por afección para el alargamiento del hueso, se entiende cualquier trastorno, enfermedad, u otra anormalía que se beneficiaría del alargamiento de uno o más segmentos del hueso. Después de la administración de cualquier polipéptido descrito aquí, el alargamiento de uno o más segmentos de hueso puede aumentar en más de alrededor de 1 %, alrededor de 2 %, alrededor de 5 %, alrededor de 10 %, alrededor de 15 %, alrededor de 20 %, alrededor de 25 %, alrededor de 30%, alrededor de 35%, alrededor de 40%, alrededor de 45%, alrededor de 50%, alrededor de 55%, alrededor de 60%, alrededor de 65%, alrededor de 70%, alrededor de 75%, alrededor de 80%, alrededor de 85%, alrededor de 90%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, alrededor de 99%, o alrededor de 100%, o más.

Por “trastorno asociado con la sobreactivación de FGFR3”, se entiende cualquier trastorno, enfermedad, u otra anomalía causada por, o asociada con, la sobreactivación de FGFR3, por ejemplo que derive de una mutación de ganancia de función de FGFR3.

Por “eficacia” se entiende el valor E^maxde un compuesto en un ensayo de dosis-respuesta.

Por “Fc” se entiende una región de fragmento cristalizable de una inmunoglobulina, por ejemplo lgG-1, lgG-2, lgG-3, lgG-3 o lgG-4, incluyendo los dominios C^h2y C^h3 de la cadena pesada de inmunoglobulina. Fc también puede incluir cualquier porción de la región bisagra que se une a las regiones Fab y Fc. La Fc puede ser de cualquier mamífero, incluido el ser humano, y puede modificarse postraduccionalmente (por ejemplo, mediante glicosilación). En un ejemplo no limitativo, Fc puede ser la región de fragmento cristalizable de lgG-1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 401.

Por “fragmento” se entiende una porción de un polipéptido o molécula de ácido nucleico que contiene, preferiblemente, al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más de la longitud total de la molécula de ácido nucleico o polipéptido de referencia. Un fragmento puede contener, por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, o más nucleótidos, hasta la longitud total del molécula de ácido nucleico, o 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 400, 500, 600, 700, o más restos de aminoácidos, hasta la longitud total del polipéptido. Los fragmentos de sALP ejemplares tienen restos de aminoácidos 18-498, 18-499, 18-500, 18-501, 18-502, 18-503, 18-504, 18-505, 18-506, 18-507, 18 508, 18-509, 18-510, 18-511, o 18-512 de una secuencia de consenso para ALP (por ejemplo, SEQ ID NOs: 1215, 1216, 1218, o 1219), y pueden incluir porciones N-terminal y/o C-terminal adicionales. Los fragmentos de NP ejemplares tienen al menos un dominio de anillo de consenso, por ejemplo de SEQ ID NOs: 6, 30, o 95, y pueden incluir porciones N-terminal y/o C-terminal adicionales.

Por “homólogo” se entiende un polipéptido o molécula de ácido nucleico que muestra al menos 50 % de identidad con una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico de referencia. Dicha secuencia es generalmente al menos, por ejemplo, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a nivel de aminoácido o ácido nucleico a una secuencia de referencia. En general, para los polipéptidos, la longitud de las secuencias de comparación puede ser al menos de cinco restos de aminoácidos, por ejemplo 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, o más restos de aminoácidos, hasta la longitud total del polipéptido. Para los ácidos nucleicos, la longitud de las secuencias de comparación puede ser generalmente de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, o más nucleótidos, hasta la longitud total de la molécula de ácido nucleico. Se entiende que a los efectos de determinar la identidad de secuencia cuando se compara una secuencia de ADN con una secuencia de ARN, un nucleótido de timina es equivalente a un nucleótido de uracilo.

Tal como se emplea aquí, cuando se hace referencia a una secuencia polipeptídica o de ácido nucleico que tiene “al menos X % de identidad de secuencia” con una secuencia de referencia, se entiende que al menos X por ciento de los restos de aminoácidos o nucleótidos en el polipéptido o ácido nucleico son idénticos a los de la secuencia de referencia cuando las secuencias están alineadas de manera óptima. Un alineamiento óptimo de secuencias se puede determinar de diversas maneras que están dentro de la pericia en la técnica, por ejemplo el algoritmo de alineamiento de Smith Waterman (Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195-7, 1981) y BLA^sT (Herramienta básica de búsqueda de alineación local; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990). Se puede acceder a estos y otros algoritmos de alineamiento usando un software informático disponible públicamente, tal como “Best Fit” (Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489, 1981) como se incorpora en GeneMatcher PlusTM (Schwarz y Dayhof, Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff, M.O., Ed pp 353-358, 1979), BLAST, BLAST-2, BLAST-P, BlAs T-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL, o Megalign (DNASTAR). Además, los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualesquiera algoritmos necesarios para lograr un alineamiento óptimo en la longitud de las secuencias que se comparan.

Por “hibridar” se entiende emparejar para formar una molécula de doble cadena entre polinucleótidos complementarios o porciones de los mismos, en diversas condiciones de rigurosidad. (Véase, por ejemplo, Wahl, G. M. y S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507.) Por ejemplo, la concentración de sal de alta rigurosidad generalmente será menor que alrededor de 750 mM de NaCI y 75 mM de citrato trisódico, menor que alrededor de 500 mM de NaCI y 50 mM de citrato trisódico, o menor que alrededor de 250 mM de NaCI y 25 mM de citrato trisódico. Puede obtenerse una hibridación de baja rigurosidad en ausencia de disolvente orgánico, por ejemplo formamida, mientras que puede obtenerse una hibridación de alta rigurosidad en presencia de al menos alrededor de 35 % de formamida o al menos alrededor de 50 % de formamida. Las condiciones de temperatura de alta rigurosidad normalmente incluirán temperaturas de al menos alrededor de 30°C, 37°C o 42°C. Las variaciones de parámetros adicionales, tales como el tiempo de hibridación, la concentración de detergente, por ejemplo dodecilsulfato sódico (SDS), y la inclusión o exclusión de ADN portador, son bien conocidas por los expertos en la técnica. Se logran diversos niveles de rigurosidad combinando estas diversas condiciones según sea necesario. En una realización, la hibridación ocurrirá a 30°C en 750 mM de NaCI, 75 mM de citrato trisódico, y SDS al 1 %. En una realización alternativa, la hibridación ocurrirá a 37°C en 500 mM de NaCI, 50 mM de citrato trisódico, SDS al 1 %, formamida al 35 %, y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado (ssADN). En una realización alternativa, la hibridación ocurrirá a 42°C en 250 mM de NaCI, 25 mM de citrato trisódico, SDS al 1 %, formamida al 50%, y 200 pg/ml de ssADN. Las variaciones útiles en estas condiciones serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.

Para la mayoría de las aplicaciones, las etapas de lavado que siguen a la hibridación también variarán en cuanto a la rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad de lavado se pueden definir por la concentración de sal y por la temperatura. Como se ha indicado anteriormente, la rigurosidad de lavado se puede aumentar al disminuir la concentración de sal o al aumentar la temperatura. Por ejemplo, las concentraciones de sal de alta rigurosidad para las etapas de lavado pueden ser, por ejemplo, menores que alrededor de 30 mM de NaCI y 3 mM de citrato trisódico, o menores que alrededor de 15 mM de NaCI y 1,5 mM de citrato trisódico. Las condiciones de temperatura de alta rigurosidad para las etapas de lavado generalmente incluirán una temperatura de, por ejemplo, al menos alrededor de 25°C, 42°C o 68°C. En una realización, las etapas de lavado ocurrirán a 25°C en 30 mM de NaCI, 3 mM de citrato trisódico, y SDS al 0,1 %. En una realización alternativa, las etapas de lavado ocurrirán a 42°C en 15 mM de NaCI, 1,5 mM de citrato trisódico, y SDS al 0,1 %. En una realización alternativa adicional, las etapas de lavado ocurrirán a 68°C en 15 mM de NaCI, 1,5 mM de citrato trisódico, y SDS al 0,1 %. Las variaciones adicionales en estas condiciones serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Las técnicas de hibridación son bien conocidas por los expertos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Benton y Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein y Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961,1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nueva York, 2001); Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nueva York); y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.

Por “aislado” o “purificado” se entiende separado de otros componentes que lo acompañan de forma natural. Típicamente, un compuesto (por ejemplo, polipéptido, ácido nucleico, o molécula pequeña), factor, célula, u otro componente se considera aislado cuando está al menos, por ejemplo, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o incluso 99 % en peso, libre de proteínas, anticuerpos, moléculas orgánicas naturales, y otros componentes con los que está naturalmente asociado. En algunos casos, el componente es al menos 75 %, 90 %, o incluso 99 %, en peso, puro. Un componente aislado se puede obtener por síntesis química, separación del factor a partir de fuentes naturales, o producción del componente en una célula hospedante recombinante que no produce el componente de forma natural. Las proteínas y las moléculas pequeñas pueden ser purificadas por un experto en la técnica usando técnicas estándar tales como las descritas por Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 2000). El componente es preferentemente al menos, por ejemplo, 2, 5 o 10 veces tan puro como el material de partida, según se mide usando, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatografía en columna, densidad óptica, análisis de HPLC, o análisis Western (Ausubel et al., más arriba). Los procedimientos ejemplares de purificación son la cromatografía en columna, la inmunoprecipitación, y la purificación por inmunoafinidad de perlas magnéticas.

Por “péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (abreviado “NP”) se entiende un péptido natriurético como se describe aquí, por ejemplo CNP22 humano (SEQ ID NO: 4), o una variante del mismo, que es capaz de agonizar NPR-B, por ejemplo ⁿP^r-B humano, con al menos 0,000001,0,000005, 0,00001,0,00005, 0,0001,0,0005, 0,001,0,005, 0,01,0,05, 0,1,0,5, 0,9, o 1 veces la potencia, y al menos 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 95 %, o incluso 100 % veces la eficacia de CNP²²según se mide en un ensayo de activación de NPR-B estándar, por ejemplo un ensayo de membrana o un ensayo de células completas, como se describe aquí. Las variantes de NP pueden incluir una o más sustituciones, adiciones o supresiones con respecto a CNP22, y tienen la capacidad de agonizar NPR-B. Un NP como se describe aquí puede incluir cualquier otra secuencia o resto, unida covalentemente o no covalentemente, siempre y cuando el NP tenga la capacidad de agonizar NPR-B.

Por “síndrome neurocutáneo” se entiende un trastorno neurológico con una o más manifestaciones cutáneas, tales como lesiones en la piel y/o el ojo. Dichos síndromes pueden estar acompañados opcionalmente por tumores benignos o malignos en múltiples sitios del cuerpo.

Por “polipéptido de NP” se entiende cualquier secuencia que incluya una secuencia de NP, como se define aquí. Los polipéptidos NP ejemplares incluyen aquellos que tienen la estructura V-NP-W, en la que cada uno de V y W está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido (por ejemplo, cualquier polipéptido de fusión de NP descrito aquí).

Por “molécula de ácido nucleico” se entiende una molécula, por ejemplo ARN o ADN, que tiene una secuencia de dos o más nucleótidos enlazados de forma covalente, de origen natural o modificada. La molécula de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, monocatenaria o bicatenaria, y puede incluir nucleótidos modificados o no modificados, o mezclas o combinaciones de los mismos. También están incluidas diversas sales, sales mixtas, y formas de ácido libres.

Los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína” se usan indistintamente, y se refieren a cualquier cadena de dos o más restos de aminoácidos naturales o no naturales, independientemente de la modificación postraduccional (por ejemplo, glicosilación o fosforilación), que constituyen todo o parte de un polipéptido o péptido de origen natural o no natural, como se describe aquí.

Tal como se emplea aquí, un aminoácido natural es un a-aminoácido natural que tiene la configuración L, tales como los que normalmente se producen en los polipéptidos naturales. El aminoácido no natural se refiere a un aminoácido que normalmente no aparece en los polipéptidos, por ejemplo un epímero de un a-aminoácido natural que tiene la configuración L, es decir, un aminoácido que tiene la configuración D no natural; o una mezcla isomérica (D, L) del mismo; o un homólogo de dicho aminoácido, por ejemplo un p-aminoácido, un aminoácido a,a-disustituido, o un aaminoácido en el que la cadena lateral del aminoácido ha sido acortada por uno o dos grupos de metileno o alargada hasta 10 átomos de carbono, tal como un ácido a-amino-alcanoico con 5 hasta, e incluyendo, 10 átomos de carbono en una cadena lineal, un aromático no sustituido o sustituido (a-arilo o a-aril-alquilo inferior), por ejemplo una fenilalanina sustituida o fenilglicina.

Por “vehículo farmacéuticamente aceptable” o “excipiente farmacéuticamente aceptable” se entiende un vehículo o excipiente que es fisiológicamente aceptable para el paciente tratado, al tiempo que retiene las propiedades terapéuticas del compuesto con el que se administra. Una sustancia portadora farmacéuticamente aceptable ejemplar es una disolución salina fisiológica. Los expertos en la técnica conocen otros vehículos fisiológicamente aceptables y sus formulaciones, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, (20a edición), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.

Por “composición farmacéutica” se entiende una composición que contiene un polipéptido o molécula de ácido nucleico como se describe aquí formulado con un excipiente farmacéuticamente aceptable, y fabricada o vendida con la aprobación de una agencia reguladora gubernamental como parte de un régimen terapéutico para el tratamiento o prevención de una enfermedad o evento en un sujeto. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse, por ejemplo, para administración subcutánea, administración intravenosa (por ejemplo, como una disolución estéril libre de émbolos particulados y en un sistema disolvente adecuado para uso intravenoso), para administración oral (por ejemplo, un comprimido, cápsula, comprimido oblongo, cápsula de gel, o jarabe), o cualquier otra formulación descrita aquí, por ejemplo en forma de dosis unitaria.

Por “potencia” se entiende el recíproco del valor de EC⁵⁰de un compuesto en un ensayo de dosis-respuesta. Al comparar la potencia entre un compuesto y un control, o entre un ensayo y un ensayo de control, una disminución de potencia indica un valor de EC⁵⁰aumentado, y un aumento de potencia indica un valor de EC⁵⁰disminuido, en comparación con el valor de EC⁵⁰para el control o el ensayo de control.

Por “degradación reducida” se entiende tener un porcentaje menor de péptido degradado después de la exposición a una enzima durante al menos 5,10,15, 20, 25, 30, 60,120,180, o 240 minutos, o más, o cualquier intervalo entre cualquiera de estos dos valores, en comparación con un porcentaje de control degradado, tal como CNP22, CNP53, o cualquier polipéptido descrito aquí, tal como un péptido descrito en la publicación de solicitud internacional n.° WO2010/135541 o la publicación de solicitud de U. S. n.° 2010-0331256. El porcentaje de péptido degradado puede ser menor que alrededor de 20 %, alrededor de 25 %, alrededor de 30 %, alrededor de 35 %, alrededor de 40 %, alrededor de 45 %, alrededor de 50 %, alrededor de 55 %, alrededor de 60 %, alrededor de 65 %, alrededor de 70%, alrededor de 75 %, alrededor de 80 %, alrededor de 85 %, alrededor de 90 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de 99 %, o alrededor de 100 %, en el que el porcentaje de péptido degradado puede determinarse midiendo el porcentaje de péptido degradado directa o indirectamente midiendo el porcentaje de péptido restante después de la exposición a una enzima (por ejemplo endopeptidasa neutra, enzima que degrada la insulina, y cualquier otra enzima que escinde un péptido natriurético in vivo) y restando este porcentaje de péptido restante del 100 %. El porcentaje de péptido degradado o péptido restante se puede medir mediante cualquier procedimiento útil, tal como cromatografía de liquidos (por ejemplo, cromatografía de liquidos de alta resolución (HPLC)), espectrometría de masas (MS), o técnicas analíticas combinadas (por ejemplo, LC-MS).

Por “efecto secundario reducido dependiente de la dosis” se entiende una disminución de uno o más efectos adversos en función de la dosis de un compuesto, en comparación con un control (por ejemplo, cualquier polipéptido descrito aquí, tal como un péptido descrito en la publicación de solicitud internacional n.° WO2010/135541 o la publicación de solicitud de U. S. n.° 2010-0331256). La disminución de uno o más efectos adversos puede ser de alrededor de 20 %, alrededor de 25 %, alrededor de 30 %, alrededor de 35 %, alrededor de 40 %, alrededor de 45 %, alrededor de 50 %, alrededor de 55 %, alrededor de 60 %, alrededor de 65 % , alrededor de 70 %, alrededor de 75 %, alrededor de 80 %, alrededor de 85 %, alrededor de 90 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de 99 %, o alrededor de 100 %, según lo determine cualquier ensayo útil para detectar el efecto adverso.

Los efectos adversos ejemplares incluyen efectos hemodinámicos, tal como una disminución de la tensión arterial, tal como la tensión arterial sistólica, la tensión arterial diastólica, o la tensión arterial media, que produce efectos hipotensivos adversos, y los ensayos para detectar tales efectos hemodinámicos incluyen un esfigmomanómetro o un transductor de presión implantado.

Los términos “sALP”, “fosfatasa alcalina soluble”, y “dominio extracelular de una fosfatasa alcalina” se usan indistintamente, y significan una fosfatasa alcalina no unida a la membrana o un dominio, un fragmento biológicamente activo, o una variante biológicamente activa de la misma. Las sALP incluyen, por ejemplo, una fosfatasa alcalina que carece de una secuencia señal de GPI C-terminal, por ejemplo un polipéptido que incluye o consiste en los restos de aminoácidos 18-502 de TNALP humana (SEQ ID NO: 1208). Las sALP incluyen además, por ejemplo, formas solubles no unidas a la membrana de ortólogos de mamíferos de TNALP humana (por ejemplo, polipéptidos que incluyen o consisten en los restos de aminoácidos 16-502 o 18-502 de SEQ ID NO: 1206, restos de aminoácidos 18-502 de SEQ

ID NO: 1207, restos de aminoácidos 18-502 de SEQ ID NO: 1209, restos de aminoácidos 18-502 de SEQ ID NO: 1210, o restos de aminoácidos 1-480 de SEQ ID NO: 1211), formas solubles no unidas a la membrana de IALP, GALP y PLALP humanas (por ejemplo, polipéptidos que incluyen o consisten en los restos de aminoácidos 20-503 de SEQ ID NO: 1212, restos de aminoácidos 20-503 de SEQ ID NO: 1213, o restos de aminoácidos 23-506 de SEQ ID NO: 1214), y variantes adicionales y análogos de los mismos que retienen la actividad de fosfatasa alcalina, por ejemplo, la capacidad de hidrolizar PPⁱ.

Por “polipéptido de sALP” se entiende cualquier secuencia que incluya una secuencia de sALP, como se define aquí.

Los polipéptidos de sALP ejemplares incluyen aquellos que tienen la estructura A-sALP-B, en la que cada uno de A y

B está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido (por ejemplo, cualquier polipéptido de fusión de sALP descrito aquí).

Por “selectivo para NPR-B sobre NPR-A” se entiende que tiene una relación EC50(npr-a)/EC50(npr-b) que es al menos 1,25, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1,100, 1,200, 1,250, 1,300, 1,400, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, o mayor, o cualquier intervalo entre cualquiera de estos dos valores, en un ensayo in vivo o in vitro de respuesta frente a la dosis, por ejemplo midiendo la producción de cGMP, como se describe aquí. Alternativamente, o además, la expresión “selectivo para NPR-B sobre NPR-A” significa tener una relación AUC(npr-b)/AUC(npr-a) que es al menos

1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,75, 1,8, 1,9, 2, 225, 2,5, 2,75, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 20, 25, 30, 35,

40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1,100, 1,200, 1,250, 1,300, 1,400, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, o mayor, o cualquier intervalo entre cualquiera de estos dos valores, como se describe aquí.

Por “péptido señal” o “secuencia señal” se entiende una secuencia de aminoácidos que dirige un polipéptido a la membrana celular de modo que el polipéptido se segrega. De manera alternativa, la secuencia señal puede dirigir el polipéptido a un compartimento u orgánulo intracelular, tal como el aparato de Golgi. Una secuencia señal puede identificarse por homología o actividad biológica, con una secuencia peptídica con la función conocida de dirigir un polipéptido a una región particular de la célula. Un experto en la técnica puede identificar una secuencia señal mediante el uso de software fácilmente disponible (por ejemplo, el paquete de software de análisis de secuencia del Genetics Computer Group, Centro de biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705, programas BLAST, o PILEUP/PRETTYBOX). Una secuencia señal puede ser aquella que sea, por ejemplo, sustancialmente idéntica a los restos de aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 501, o a los restos de aminoácidos 1-17 de SEQ ID NO: 1201.

Por “displasia esquelética” se entiende un trastorno óseo o de cartílago caracterizado por baja estatura o enanismo.

Por “sujeto” se entiende un mamífero, que incluye, pero no se limita a, un mamífero humano o no humano, tal como un bovino, equino, canino, ovino, o felino.

Por efecto “sinérgico” se entiende un efecto terapéutico observado después de la administración de dos o más agentes que es mayor que la suma de los efectos terapéuticos observados después de la administración de cada agente individual. En un ejemplo de sinergia, se observa un efecto terapéutico para la combinación de dos o más agentes, en la que uno o más de los agentes está presente en una dosis que normalmente no es terapéutica. En otro ejemplo de sinergia, la combinación de dos o más agentes da como resultado una disminución inesperada en uno o más eventos adversos (es decir, un nivel o número de eventos adversos que es menor que la suma de los eventos adversos observados después de la administración de los agentes individuales). En otro ejemplo, la combinación de dos o más agentes a una dosis terapéutica da como resultado efectos secundarios reducidos dependientes de la dosis, en comparación con el nivel de efectos secundarios dependientes de la dosis observados para un agente único a una dosis terapéutica.

Por “cantidad terapéuticamente eficaz” se entiende una cantidad de un polipéptido o molécula de ácido nucleico descrito aquí que es suficiente para tratar, prevenir, retrasar, suprimir, o detener sustancialmente cualquier síntoma de un síndrome neurocutáneo, un trastorno asociado con la sobreactivación de FGFR3, un trastorno óseo o de cartílago (por ejemplo, acondroplasia), o un trastorno del músculo liso vascular, o que es suficiente para alargar sustancialmente el hueso. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición descrita aquí puede depender de la gravedad del trastorno que se está tratando y la afección, el peso y el estado general del sujeto, y puede determinarse por un experto en la técnica teniendo en cuenta dichos factores. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición descrita aquí puede administrarse a un sujeto en una dosis única o en múltiples dosis administradas durante un periodo de tiempo.

Por “tratando”, “tratar” o “tratamiento” se entiende la gestión médica de un paciente con la intención de curar, mejorar, estabilizar, reducir la probabilidad de, o prevenir un síndrome neurocutáneo, un trastorno asociado con la sobreactivación de FGFR3, un trastorno óseo o de cartílago (por ejemplo, acondroplasia), o un trastorno del músculo liso vascular, o la gestión de un sujeto sano con la intención de alargar el hueso, por ejemplo administrando una composición farmacéutica. Este término incluye el tratamiento activo, es decir, el tratamiento dirigido específicamente a la mejora o asociado con la cura de una enfermedad, afección patológica, trastorno, o evento, y también incluye un tratamiento causal, es decir, un tratamiento dirigido eliminar la causa de la enfermedad asociada, afección patológica, trastorno, o evento. Además, este término incluye el tratamiento paliativo, es decir, el tratamiento diseñado para aliviar los síntomas en lugar de curar la enfermedad, afección patológica, trastorno, o evento; el tratamiento sintomático, es decir, el tratamiento dirigido a los síntomas constitucionales de la enfermedad asociada, afección patológica, trastorno, o evento; el tratamiento preventivo, es decir, el tratamiento dirigido a minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de la enfermedad asociada, afección patológica, trastorno, o evento, por ejemplo en un paciente que, aunque no está enfermo, es susceptible, o de otro modo corre el riesgo, de una enfermedad particular, afección patológica, trastorno, o evento; y el tratamiento de apoyo, es decir, el tratamiento empleado para complementar otra terapia específica dirigida a mejorar la enfermedad asociada, afección patológica, trastorno, o evento.

Por “trastorno del músculo liso vascular” se entiende cualquier trastorno, enfermedad u otra anomalía que afecta la función, estructura o crecimiento del músculo liso vascular.

Por “vector” se entiende una molécula de ADN, generalmente derivada de un plásmido o bacteriófago, en la que se pueden insertar o clonar fragmentos de ADN. Un vector recombinante contendrá uno o más sitios de restricción únicos, y puede ser capaz de replicación autónoma en un organismo vehículo u hospedante definido, de modo que la secuencia clonada sea reproducible. Un vector contiene un promotor enlazado operativamente a un gen o región codificante de manera que, tras la transfección en una célula receptora, se expresa un ARN.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

En las figuras que muestran un alineamiento de secuencia múltiple, "*" representa la identidad; ":" representa una sustitución conservada; y "." representa una sustitución semiconservada.

La Fig. 1A es un gráfico que muestra niveles de pirofosfato (PPⁱ) en osteoblastos de ratones de tipo salvaje (izquierda) y ratones NF1^col2-/-(derecha).

La Fig. 1B es un gráfico que muestra los niveles de expresión del ARNm del gen de anquilosis progresiva (Ank) en osteoblastos de ratones de tipo salvaje (marcados como “WT”) y

ratones NF1^col2-/-(marcados como “KO”). Los osteoblastos se trataron con un vehículo, un inhibidor de la MEK1/MEK2 cinasa U0126 (1,4-diamino-2,3-diciano-1,4-bis(2-aminofeniltio) butadieno), o una proteína morfogenética ósea 2 (BMP2).

La Fig. 2 es un esquema que muestra un modelo de trabajo hipotético no limitativo para la mineralización defectuosa de la matriz ósea en ratones NF1^col2-/-.

La Fig. 3A muestra el efecto de la proteína morfogenética ósea 2 humana recombinante (rhBMP2) en osteoblastos de ratones de tipo salvaje (marcados “WT”) y ratones NF1^col2-/-. Las placas celulares se muestran con tinción histológica para fosfatasa alcalina (ALP) sola o en combinación con rojo de alizarina S (ALP/Alizarina), y para el número de células, con violeta cristal.

La Fig. 3B muestra el efecto de un polipéptido de fusión de sALP (sTNALP-FcD¹⁰, SEQ ID NO: 1204) en células estromales de médula ósea de ratones de tipo salvaje (marcados como “WT”) y ratones NF1^col2-/-. Las células se trataron entonces durante 8 días con dosis crecientes de sTNALP-FcDio. Las placas celulares se muestran con tinción histológica para el rojo de alizarina S para determinar la presencia de deposición calcificada (parte superior), y se cuantificó la intensidad relativa de la tinción con rojo de alizarina S (parte inferior).

La Fig. 3C muestra el efecto de un polipéptido de fusión de sALP (sTNALP-FcD¹⁰, SEQ ID NO: 1204) en células estromales de médula ósea (BMSC) de ratones de tipo salvaje (marcados como “WT”) y ratones NF1 ^col2-/-. Las BMSC se incubaron en cultivo, y se indujo la diferenciación durante 14 días usando vitamina C y beta-glicerofosfato. Las células se trataron entonces con 0,5 pg/ml de sTNALP-FcD¹⁰, y se tiñeron con rojo de alizarina para evaluar el nivel de mineralización, con rojo picrosirio para demostrar la presencia de matriz extracelular, o con violeta cristal para teñir las células.

La Fig. 3D muestra el efecto de un polipéptido de fusión de sALP (sTNALP-FcD¹⁰, SEQ ID NO: 1204) en células estromales de médula ósea (BMSC) de ratones con gen NF1 flanqueado. Las BMSC se incubaron en cultivo, y se indujo la diferenciación durante 14 días usando vitamina C y beta-glicerofosfato. Las células se trataron durante 8 días con un adenovirus que codifica GFP (“Ad-GFP”, como control) o un adenovirus que codifica la recombinasa CRE (“Ad-Cre”), ya sea con vehículo o con 0,5 pg/ml de sTNALP-FcD¹⁰. Las células se tiñeron entonces con rojo de alizarina para evaluar el nivel de mineralización (primera y segunda columnas), o con rojo picrosirio para demostrar la presencia de matriz extracelular (tercera y cuarta columnas).

La Fig. 3E muestra el efecto in vivo de un polipéptido de fusión de sALP (sTNALP-FcD¹⁰, SEQ ID NO: 1204) en ratones de tipo salvaje (marcados como “WT”) y ratones NF1^col2-/-. Los ratones NF1^col2-/-se trataron desde el día 1 hasta el día 18 con 8,2 mg/kg de sTNALP-FcD¹⁰, y se compararon con ratones no tratados o WT. Los ratones se sacrificaron el día 19, y las vértebras se analizaron con imágenes de micro-CT para medir el volumen del hueso con respecto al volumen total (BV/TV). El tratamiento de los ratones con sTNALP-FcD¹⁰incrementó el déficit de densidad mineral ósea en ratones NF1coI2-/- en comparación con el vehículo (* p < 0,5).

La Fig. 4A muestra la expresión del gen NPR-B en ratones NF1^coi2-/-. Se cultivaron células estromales de médula ósea durante 3 semanas en condiciones osteogénicas (con acetato de ascorbato), y se lisaron. La RT-PCR se realizó usando cebadores de NPR-B y GAPDH de gen constitutivo.

La Fig. 4B muestra el efecto de un polipéptido de fusión de NP (NC2-KGANKK, SEQ ID NO: 512) en condrocitos de ratones de tipo salvaje (marcados como “WT”) y ratones NF1^coi2-/-. El análisis de transferencia Western proporciona niveles de ERK y ERK fosforilado (p-ERK) para condrocitos de ratones de tipo salvaje o de ratones NF1^coi2-/-. Se cultivaron condrocitos primarios extraídos de las costillas de ratones NF1^coi2-/-neonatos o ratones WT, y después se trataron durante 30 minutos con concentraciones crecientes de NC2-KGANKK. A continuación, las células se lisaron, y se realizó una transferencia Western en lisados usando anticuerpos específicos anti-ERK o anti-fosfo-ERK.

La Fig.4C muestra el efecto in vivo de un polipéptido de fusión de NP (NC2B, SEQ ID NO: 504) en la longitud naso-anal en ratones de tipo salvaje (marcados como “WT”) y ratones NF1^coi2-/-. Los ratones NF1^coi2-/-se trataron desde el día 1 hasta el día 18 con 100 o 300 mg/kg de NC2B, y se compararon con ratones tratados con vehículo o WT. Los ratones se midieron para determinar su longitud naso-anal en el día 19.

La Fig.4D muestra el efecto in vivo de un polipéptido de fusión de NP (NC2B, SEQ ID NO: 504) en la longitud de la tibia en ratones de tipo salvaje (marcados como “WT”) y ratones NF1^coi2-/-. Los ratones NF1^coi2-/-se trataron desde el día 1 hasta el día 18 con 100 o 300 mg/kg de NC2B, y se compararon con ratones tratados con vehículo o WT. Los ratones se midieron para determinar la longitud de la tibia en el día 19.

La Fig. 4E muestra el efecto in vivo de un polipéptido de fusión de NP (NC2B, SEQ ID NO: 504) en placas de crecimiento en ratones de tipo salvaje (marcados como “WT”) y ratones NF1^col2-/-. Los ratones NF1^col2-/-se trataron desde el día 1 hasta el día 18 con 300 mg/kg de NC2B, y se compararon con ratones tratados con vehículo o WT. En el día 19, las tibias se usaron para analizar placas de crecimiento proximal en histología, y para medir el tamaño de las zonas de condrocitos.

La Fig. 5A es un diagrama esquemático de la estructura de la fosfatasa alcalina no específica de tejido humana (hsTNALP) como se describe aquí, que incluye un polipéptido que tiene un ectodominio de TNALP, una secuencia de señalización N-terminal, y una secuencia señal de GPI (parte superior); una hsTNALP-FcDio que tiene un ectodominio de TNALP, una secuencia de señalización N-terminal, una secuencia de IgG¹-Fc, y un resto D¹⁰dirigido al hueso (centro); y una hsTNALP-FcD¹⁰sin una secuencia señal que tiene un ectodominio de TNALP, una secuencia de IgG¹-Fc, y un resto Dio dirigido al hueso (parte inferior).

La Fig. 5B muestra la secuencia de aminoácidos de hsTNALP-FcD¹⁰(SEQ ID NO: 1201), que incluye la secuencia señal N-terminal (los primeros 17 restos de aminoácidos, subrayados y en cursiva; la posición 2, una valina, difiere del resto de tipo salvaje en esa posición, isoleucina); y la secuencia de aminoácidos de hsTNALP-FcDio segregada (SEQ ID NO: 1204), que carece de la secuencia señal N-terminal. Los restos de aminoácidos de la porción hsTNALP de los polipéptidos, que corresponden a los restos de aminoácidos 18 502 de hsTNALP (SEQ ID NO: 1205), están en cursiva. La secuencia señal en SEQ ID NO: 1201 está en cursiva y subrayada. Las porciones de Fc de los polipéptidos (SEQ ID NO: 401) están subrayadas. Se muestra en negrita un enlazador dipeptídico leucina-lisina (LK) entre las porciones hsTNALP y Fc, y un enlazador dipeptídico ácido aspártico-isoleucina (DI) entre la hsTNALP y el resto dirigido al hueso.

La Fig. 5C muestra la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión de sALP que carecen de un resto dirigido al hueso: hsTNALP-Fc (SEQ ID NO: 1220) y hsTNALP-FcD¹⁰segregada (SEQ ID NO: 1221), que carece de la secuencia señal N-terminal. Los restos de aminoácidos de la porción hsTNALP de los polipéptidos, que corresponden a los restos de aminoácidos 18-502 de hsTNALP (SEQ ID NO: 1205), están en cursiva. La secuencia señal en SEQ ID NO: 1201 está en cursiva y subrayada. Las porciones de Fc de los polipéptidos (SEQ ID NO: 401) están subrayadas. Se muestra en negrita un enlace dipeptídico leucinalisina (LK) entre las porciones hsTNALP y Fc.

La Fig. 5D muestra una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 1217) que codifica el polipéptido de hsTNALP-Fc representado en la Fig. 5B.

La Fig. 6 muestra secuencias de aminoácidos para la fosfatasa alcalina no específica de tejido soluble humana (hsTNALP), incluida la secuencia de hsTNALP que tiene la secuencia señal N-terminal (restos de aminoácidos 1-502) (SEQ ID NO: 1202) y la secuencia de hsTNALP segregada que carece de la secuencia señal (restos de aminoácidos 18-502) (SEQ ID NO: 1205). La secuencia señal está subrayada.

La Fig. 7 es una lista de la secuencia de aminoácidos de una Fc ejemplar de lgG-1 humana (SEQ ID NO: 401).

La Fig. 8 muestra un alineamiento de secuencia múltiple de CLUSTAL™ W (1.82) de ortólogos de fosfatasa alcalina no específica de tejido de mamífero (TNALP). Los ortólogos de TNALP de mamífero incluyen TNALP de vaca (“P09487|PPBT_BOVINO” ; n.° de acceso P09487; SEQ ID NO: 1206); TNALP de gato (“Q29486|PPBT_FELCA” ; n.2 de acceso Q29486; SEQ ID NO: 1207); TNALP humana (“P05186|PPBT_HUMANO”; n.2 de acceso P05186; SEQ ID NO: 1208); TNALP de ratón (“P09242|PPBT_RATÓN”; n.2 de acceso P09242; SEQ ID NO: 1209); TNALP de rata (“P08289|PPBT_RATA”; n.° de acceso P08289; SEQ ID NO: 1210), y una secuencia parcial de TNALP de perro (“Q9N0V0|Q9N0V0_CANFA” ; n.° de acceso Q9N0V0; SEQ ID NO: 1211). Una secuencia de consenso deriva de este alineamiento (“Consenso” ; SEQ ID NO: 1216), en la que X denota posiciones degeneradas, y puede ser cualquier aminoácido.

La Fig. 9 muestra un alineamiento de secuencia múltiple de CLUSTAL^™(2.0.5) de ortólogos de fosfatasa alcalina no específica de tejido de mamífero (TNALP) e isozimas de fosfatasa alcalina humana (ALP). Los ortólogos de TNALP de mamífero incluyen aquellos que se muestran en la Fig. 8, incluyendo TNALP de rata (“TNALPrn”, SEQ ID NO: 1210), TNALP de ratón (“TNALPmm”, SEQ ID NO: 1209), TNALP humana (“TNALPhs”, SEQ ID NO: 1208), una secuencia parcial de TNALP de perro (“TNALPcf, SEQ ID NO: 1211), TNALP de gato (“TNALPfc”, SEQ ID NO: 1207), y TNALP de vaca (“TNALPbt”, SEQ ID NO: 1206). Las isoenzimas de ALP humana incluyen una ALP gastrointestinal humana (“GALPhs”; n.° de acceso P10696; SEQ ID NO: 1213), una ALP placentaria humana (“PLALPhs” ; n.° de acceso 05187; SEQ ID NO: 1214), y una ALP intestinal humana (“lALPhs”; n.° de acceso P09923; SEQ ID NO: 1212). Una secuencia de consenso deriva de este alineamiento (“Consenso”; SEQ ID NO: 1215), en la que X denota posiciones degeneradas, y puede ser cualquier aminoácido.

La Fig. 10 es una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 1218) para ortólogos de fosfatasa alcalina no específica de tejido de mamífero (TNALP) e isozimas de fosfatasa alcalina humana (ALP), excluyendo mutaciones patógenas, en la que X puede ser cualquier aminoácido, pero no un aminoácido correspondiente a una o más mutaciones patógenas proporcionadas en la Tabla 1.

La Fig. 11 es una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 1219) para ortólogos de fosfatasa alcalina no específica de tejido de mamífero (TNALP), excluyendo mutaciones patógenas, en la que X puede ser cualquier aminoácido, pero no un aminoácido correspondiente a una o más mutaciones patógenas proporcionadas en la Tabla 1.

La Fig. 12 es un alineamiento de secuencia múltiple de ANP humano (SEQ ID NO: 1), urodilatina humana (SEQ ID NO: 2), BNP humano (SEQ ID NO: 3), CNP22 humano (SEQ ID NO: 4), y DNP (SEQ ID NO: 5). El dominio de anillo de 17 aminoácidos para cada péptido natriurético se muestra en negrita y encerrado en un recuadro. A continuación, se muestra una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 6), en la que cada X representa cualquier aminoácido, u opcionalmente representa cualquier aminoácido en la posición correspondiente en una de SEQ ID NOs: 1-5.

La Fig. 13 es un alineamiento de CNP53 humano (SEQ ID NO: 11), CNP22 humano, y CNP humano (sólo en el dominio de anillo) (SEQ ID NO: 12).

La Fig. 14 es un alineamiento de secuencia múltiple de diversos homólogos de CNP22. El dominio de anillo de 17 aminoácidos para cada NP se muestra en negrita y encerrado en un recuadro. A continuación, se muestra una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 30), en la que cada X dentro del dominio de anillo representa cualquier aminoácido, u opcionalmente representa cualquier aminoácido en la posición correspondiente en una de SEQ ID NOs: 4 y 13-29. Cada X fuera del dominio de anillo representa cualquier aminoácido o puede estar ausente, u opcionalmente representa cualquier aminoácido en la posición correspondiente en una de SEQ ID NOs: 4 y 13-29.

Las Figs. 15A-15G son un alineamiento de secuencia múltiple de diversos homólogos de CNP, incluyendo en algunos casos las secuencias previas y posteriores N-terminales. El dominio de anillo de 17 aminoácidos para cada NP se muestra en negrita y encerrado en un recuadro. A continuación, se muestra una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 95), en la que cada X representa cualquier aminoácido, u opcionalmente representa cualquier aminoácido en la posición correspondiente en una de SEQ ID NOs: 31-94.

La Fig. 16 es un diagrama esquemático de la estructura de un péptido natriurético como se describe aquí, que incluye una extensión N-terminal opcional, un segmento corto opcional, un dominio de anillo requerido, y una extensión C-terminal opcional.

Las Figs. 17A-17E son diagramas esquemáticos de constructos de Fc-NP o NP-Fc ejemplares. La Fig. 17A representa un dímero Fc-NP. La Fig. 17B representa un dimero NP-Fc. La Fig. 17C representa un híbrido de monómero-dímero Fc:Fc-NP. La Fig. 17D representa un híbrido de monómero-dímero NP-Fc:Fc. La Fig. 17E representa un dímero híbrido NP-Fc:Fc-NP.

La Fig. 18A es una lista de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión inmadura NC2 Streptag (“NC2st”) (SEQ ID NO: 501), junto con una tabla que proporciona un sumario de las regiones proteicas. La secuencia señal N-terminal, que se escinde durante la traducción, está subrayada. Diversas secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio de Fc se muestra en negrita. El dominio de CNP se muestra en gris resaltado. La Fig. 18B es una lista de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de NC2st (SEQ ID NO: 502) sin la secuencia señal. La Fig. 18C es una lista de la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 801) que codifica la proteína de fusión de NC2st.

La Fig. 19A es una lista de la secuencia de aminoácidos de NC2B, tanto con la secuencia señal (SEQ ID NO: 503) como sin la secuencia señal (SEQ ID NO: 504), y la secuencia de aminoácidos de D10-NC2 que tiene una etiqueta Dio, tanto con la secuencia señal (SEQ ID NO: 607) como sin la secuencia señal (SEQ ID NO: 608).

La Fig. 19B es una lista de una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 802) que codifica NC2B.

La Fig. 20A es una lista de secuencias de aminoácidos para NC2B-22, NC2B-28, y NC2B-34, tanto con la secuencia señal (SEQ ID NOs: 505, 507, y 509, respectivamente) como sin la secuencia señal (SEQ ID NOs: 506, 508, y 510 respectivamente). Las secuencias señal están subrayadas. El dominio de Fc se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio de CNP se muestra en gris resaltado. La Fig. 20B es una lista de una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 803) que codifica NC2B-22. La Fig. 20C es una lista de una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 804) que codifica NC2B-28. La Fig. 20D es una lista de una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 805) que codifica NC2B-34.

La Fig. 21 es una lista de secuencias de aminoácidos para NC2-KGANKK y NC2-KGANQK tanto con la secuencia señal (SEQ ID NOs: 511 y 513, respectivamente) como sin la secuencia señal (SEQ ID NOs: 512 y 514, respectivamente). Las secuencias señal están subrayadas. El dominio de Fc se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio de CNP se muestra en gris resaltado.

La Fig. 22 es una lista de secuencias de aminoácidos para NC2-CNP53mut2, tanto con la secuencia señal (SEQ ID NO: 515) como sin la secuencia señal (SEQ ID NOs: 516). La secuencia señal está subrayada. El dominio de Fc se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio de CNP se muestra en gris resaltado.

La Fig. 23 es una lista de secuencias de aminoácidos para Fc-CNP53-A (también denominada Fc-CNP53wt) y Fc-CNP53-AAA (también denominada Fc-CNP53mut), tanto con la secuencia señal (SEQ ID NOs: 517 y 519, respectivamente) como sin la secuencia señal (SEQ ID NOs: 518 y 520, respectivamente). Las secuencias señal están subrayadas. El dominio de Fc se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio de CNP se muestra en gris resaltado.

La Fig. 24 es un alineamiento de secuencia múltiple de diversos NP y homólogos, incluyendo CDNP. La región dentro del recuadro es la región más conservada de la cola de DNP entre los péptidos de unión a NPRA. Las secuencias de numerosas variantes de CDNP se muestran en la mitad inferior de la figura, y también se muestra una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 118) para la cola C-terminal de DNP. Cada X en la secuencia de consenso representa cualquier aminoácido, u opcionalmente representa cualquier aminoácido en la posición correspondiente en una de SEQ ID NOs: 100-116.

La Fig. 25A es una lista de secuencias de aminoácidos para CNP-enlazador16AA-Fc-His10 (NC1) (SEQ ID NO: 521); CNP-enlazador6AA-Fc-His 10 (NC3) (SEQ ID NO: 522), CNP-enlazador6AA-Fc (SEQ ID NO: 523), CDNP-Fc (SEQ ID NO: 524), CDNP-A17saa-Fc (SEQ ID NO: 525), y CDNP-A17sra-Fc (SEQ ID NO: 526). El dominio de CNP se muestra en gris resaltado. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio de Fc se muestra en negrita. La Fig. 25B es una lista de la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 806) de NC1.

La Fig. 26 es una lista de diversos mutantes de punto (SEQ ID NO: 119-125), teniendo cada uno una mutación en la posición 17 de CNP22, junto con una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 126). X representa cualquier aminoácido, u opcionalmente representa cualquier aminoácido en la posición correspondiente en una de SEQ ID NOs: 119-125.

La Fig. 27 es una lista de secuencias de aminoácidos para varias variantes de CNP (SEQ ID NO: 4 y 127 150). El dominio de anillo de 17 aminoácidos para cada variante se muestra en negrita. La región del enlazador se muestra en cursiva.

Las Figs. 28A-28E son una lista de secuencias de aminoácidos para variantes de CNP adicionales (SEQ ID NO: 1001-1155).

La Fig. 29 es una lista de secuencias de aminoácidos para CNP22 (SEQ ID NO: 4), CNP-L17 (SEQ ID NO: 120), CNP-F17 (SEQ ID NO: 119), CNP-T17 (SEQ ID NO: 122), D6-enlazador14AA-CNP [C3] (SEQ ID NO: 147), CNP-enlazador14AA-D6 [C4] (SEQ ID NO: 148), CNP-Nterm2 [C5] (SEQ ID NO: 150), CDNP-S3A4A5R6 [C13] (SEQ ID NO: 115), CDNP29-S3A4A5R6 [C14] (SEQ ID NO: 151), C1(E6) [BC1] (SEQ ID NO: 129), C2(E6) [BC2] (SEQ ID NO: 130), C3 (E6) [BC3] (SEQ ID NO: 131), C4(E6) [BC4] (SEQ ID NO: 132), C5(E6) [BC5] (SEQ ID NO: 133), C6(E6) [BC6] (SEQ ID NO: 134), C7(E6) [BC7] (SEQ ID NO: 135), C8(E6) [BC8] (SEQ ID NO: 136), C9(E6) [BC9] (SEQ ID NO: 137), C10(E6) [BC10] (SEQ ID NO: 138), C11 (E6) [BC11] (SEQ ID NO: 139), PGCNP37(E6) (SEQ ID NO: 128), KA1 (SEQ ID NO:152), KA1(E6) (SEQ ID NO:153), KB1 (SEQ ID ⁿO:154), y KB1(E6) (SEQ ID NO: 155). El dominio de anillo de 17 aminoácidos para cada variante se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. Las secuencias de escisión de catepsina se muestran de forma subrayada.

La Fig. 30 es una lista de secuencias de aminoácidos para variantes de CNP que tienen una mutación puntual en la posición 17 con respecto a CNP22 (SEQ ID NOs: 126, 119-122, y 156-172). Para las SEQ ID NOs: 126 y 162, X puede ser cualquier aminoácido, incluyendo, pero sin limitarse a, F, L, I, T, E, R, Y, C, P, o D. El dominio de anillo de 17 aminoácidos para cada variante se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva.

Las Figs. 31A-31B son una lista de secuencias de aminoácidos para variantes de CNP adicionales que tienen una mutación puntual en la posición 17 con respecto a CNP22 (SEQ ID NOs: 173-220). X puede ser cualquier aminoácido, incluyendo, pero sin limitarse a, F, L, I, T, E, R, Y, C, P, o D. El dominio de anillo de 17 aminoácidos para cada variante se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. Las secuencias de escisión de catepsina se muestran de forma subrayada.

La Fig. 32 es una lista de secuencias de aminoácidos para variantes de CNP que tienen una mutación puntual en la posición 17 con respecto a CNP22, en las que la metionina en la posición 17 se ha sustituido por una leucina (SEQ ID NOs: 221-233). El dominio de anillo de 17 aminoácidos para cada variante se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. Las secuencias de escisión de catepsina se muestran de forma subrayada.

Las Figs. 33A-33E son listas de secuencias de aminoácidos para constructos que tienen una mutación puntual en la posición 17 con respecto a CNP22 (SEQ ID NOs: 527-552). X puede ser cualquier aminoácido, incluyendo, pero sin limitarse a, F, L, I, T, E, R, Y, C, P, o D. Las secuencias señal están subrayadas. El dominio de Fc se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio de CNP se muestra en gris resaltado.

Las Figs. 34A-34J son listas de secuencias de aminoácidos para variantes de NC2 (SEQ ID NOs: 511-516 y 553-606) con o sin la secuencia señal, y con o sin un resto Dio dirigido al hueso en el N-terminal. Las secuencias señal están subrayadas. El dominio de Fc se muestra en negrita. Las secuencias de enlazadores se muestran en cursiva. El dominio de CNP se muestra en gris resaltado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención presenta polipéptidos de fosfatasa alcalina soluble (sALP), por ejemplo fusionados con un dominio de Fc de una inmunoglobulina, un ácido nucleico que los codifica, y sus usos para tratar una o más manifestaciones óseas de síndromes neurocutáneos (por ejemplo, neurofibromatosis, por ejemplo tipo 1). La presente invención también presenta polipéptidos natriuréticos (NP), por ejemplo fusionados con un dominio de Fc de una inmunoglobulina, un ácido nucleico que los codifica, y sus usos para tratar una o más manifestaciones óseas de síndromes neurocutáneos (por ejemplo, neurofibromatosis, por ejemplo tipo 1). La presente invención también presenta una combinación de tales polipéptidos de sALP con tales polipéptidos de NP, como se describe aquí, y usos de esta combinación para tratar una o más manifestaciones óseas de síndromes neurocutáneos. A continuación, se proporcionan detalles adicionales de la invención.

Fosfatasa alcalina

Las fosfatasas alcalinas abarcan un grupo de enzimas que comparten la propiedad de poder escindir el fosfato en una variedad de contextos (por ejemplo, hidrólisis de pirofosfato, PPⁱ). Se conocen cuatro isozimas de fosfatasa alcalina (ALP) de mamífero: fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNALP; descrita más adelante), fosfatasa alcalina placentaria (PLALP) (por ejemplo, n.° de acceso P05187, Np_112603 y NP_001623), fosfatasa alcalina de células germinales (GALP) (por ejemplo, n.° de acceso P10696), y fosfatasa alcalina intestinal (IALP) (por ejemplo, n.° de acceso P09923 y NP_001622). Estas isoenzimas poseen estructuras tridimensionales muy similares. Cada uno de sus sitios catalíticos contiene cuatro dominios de unión a metal que se unen a iones metálicos necesarios para la actividad enzimática, incluidos dos iones de zinc y un ion de magnesio. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de monoésteres de ácido fosfórico, y también catalizan una reacción de transfosforilación en presencia de altas concentraciones de aceptores de fosfato. Se ha demostrado que PLALP es fisiológicamente activa con respecto a la fosfoetanolamina (PEA), el pirofosfato inorgánico (PPⁱ) y el piridoxal 5'-fosfato (PLP), siendo los tres conocidos como sustratos naturales para la TNALP (Whyte, 1995). En la Fig. 9 se muestra un alineamiento entre estas isozimas. Fosfatasas alcalinas adicionales se describen, por ejemplo, en el documento WO 2008/138131 y en la publicación de EE. UU. n.22006/0014687.

Las fosfatasas no específicas de tejido son una familia de proteínas, codificadas por un solo gen, que difieren entre sí por la modificación postraduccional. Las TNALP están presentes predominantemente en el hígado, los riñones, y los huesos, pero pueden aparecer en todo el cuerpo. Las TNALP conocidas en mamíferos incluyen, por ejemplo, TNALP humana (n.2 de acceso NP_000469, AAI10910, AAH90861, AAH66116, AAH21289 y AAI26166); TNALP de mono (n.2 de acceso XP 01109717); TNALP de rata (n.° de acceso NP_037191); TNALP de perro (n.° de acceso AAF64516); TNALP de cerdo (n.° de acceso AAN64273), ratón (n.° de acceso NP_031457), TNALP de vaca (n.° de acceso NP_789828, NP_776412, AAM 8209 y AAC33858) y TNALP de gato (n.2 de acceso NP_001036028), además de otros ejemplos proporcionados aquí.

Fosfatasa alcalina soluble

Las fosfatasas alcalinas solubles (sALP) para uso en la invención incluyen, por ejemplo, formas solubles (por ejemplo, extracelulares o no unidas a membrana) de cualquiera de las fosfatasas alcalinas descritas aquí. La fosfatasa alcalina soluble para uso en la invención puede ser, por ejemplo, una forma soluble de TNALP humana. Una representación esquemática de los dominios de TNALP humana (hTNALP) se muestra en la Fig. 5A (parte superior). TNALP es una proteína unida a membrana anclada a través de una unión glicolipídica a su C-terminal (Swiss-Prot, P05186). Este anclaje de glicolípido (GPI) se añade postraduccionalmente después de la eliminación de un extremo C-terminal hidrófobo que actúa tanto como un anclaje de membrana temporal como una señal para la adición del GPI. Este anclaje de GPI está enterrado en la membrana celular, y las porciones restantes de la proteína son extracelulares. La TNALP, incluida hTNALP, puede manipularse para reemplazar el primer aminoácido de la secuencia C-terminal hidrófoba (una alanina) por un codón de parada. La hTNALP manipulada formada de esta manera contiene todos los restos de aminoácidos de la forma anclada nativa de TNALP, pero carece del anclaje de membrana GPI. Una hTNALP que es soluble se denomina aquí “hsTNALP”. Un experto en la técnica apreciará que la posición del anclaje de membrana GPI variará en diferentes fosfatasas alcalinas, y puede incluir, por ejemplo, los últimos 10, 12, 14, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 45, 50, o más restos de aminoácidos en el extremo C del polipéptido. Por ejemplo, el anclaje de membrana GPI de la hTNALP (SEQ ID NO: 1208) son los restos de aminoácidos 503-524. La secuencia de aminoácidos de esta hsTNALP (con una variación en la posición 2 de la secuencia señal), según se fusiona con Fc, se muestra en la Fig. 5B. La secuencia de un ácido nucleico que codifica este polipéptido de fusión hsTNALP-Fc se muestra en la Fig. 5D (SEQ ID NO: 1217).

Además del anclaje de GPI C-terminal, la TNALP también tiene una secuencia de péptido señal N-terminal. El péptido señal N-terminal está inicialmente presente en la proteína cuando se sintetiza, pero se escinde después de la translocación en el RE. Por lo tanto, el péptido señal N-terminal está ausente de la forma segregada de TNALP. Las sALP para uso en la invención incluyen tanto formas segregadas (es decir, que carecen de la señal N-terminal) como no segregadas (es decir, que tienen la señal N-terminal) de las mismas. Un experto en la técnica apreciará que la posición del péptido señal N-terminal variará en diferentes fosfatasas alcalinas, y puede incluir, por ejemplo, los primeros 5, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 27, 30, o más restos de aminoácidos en el extremo N del polipéptido. Por ejemplo, el péptido señal N-terminal de la hTNALP de SEQ ID NO: 1208 son sus primeros 17 restos de aminoácidos, como se muestra en la Fig. 6. Por lo tanto, una forma soluble segregada de esta hTNALP son los restos de aminoácidos 18-502 de SEQ ID NO: 1208 (SEQ ID NO: 1205), como se muestra en la Fig. 6. La secuencia de aminoácidos de esta hsTNALP segregada, según se fusiona con Fc, se muestra en la Fig. 5B. Las sALP para uso en la invención incluyen tanto formas segregadas como no segregadas de las mismas. Un experto en la técnica puede predecir la posición de un sitio de escisión de secuencia señal, por ejemplo mediante un algoritmo informático apropiado tal como el descrito en Bendtsen et al. (J. Mol. Biol. 340(4):783-795, 2004) y disponible en la Web en http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/.

Las sALP para uso en la invención también incluyen, por ejemplo, secuencias polipeptídicas que satisfacen una secuencia de consenso derivada del dominio extracelular de ALP de isozimas de ALP humanas y de ortólogos de TNALP de mamífero (humano, ratón, rata, vaca, gato, y perro) (SEQ ID NO: 1215, como se muestra en la Fig. 9), o un consenso derivado del dominio extracelular de ALP de solo ortólogos de TNALP de mamífero (humano, ratón, rata, vaca, gato y perro) (SEQ ID NO: 1216, como se muestra en la Fig. 8). En algunas realizaciones, la sALP incluye los restos de aminoácidos 18-498, 18-499, 18-500, 18-501, 18-502, 18-503, 18-504, 18-505, 18-506, 18-507, 18-508, 18 509, 18-510, 18-511, o 18-512 de SEQ ID N^o: 1216. En algunas realizaciones, la sALP incluye los restos de aminoácidos 23-498, 23-499, 23-500, 23-501, 23-502, 23-503, 23-504, 23-505, 23-506, 23-507, 23-508, 23-509, 23 510, 23-511, o 23-512 de SEQ ID NO: 1215.

Las sALP para uso en la invención también incluyen aquellas que satisfacen secuencias de consenso similares derivadas de diversas combinaciones de estos ortólogos de TNALP o isozimas de ALP humanas. Dichas secuencias de consenso se dan, por ejemplo, en el documento WO 2008/138131.

Además, se ha demostrado que las hsTNALP recombinantes que retienen los restos de aminoácidos originales 1 a 501 (18 a 501 cuando se segregan) (Oda et al., J. Biochem. 126: 694-699, 1999), los restos de aminoácidos 1 a 502 (18 a 502 cuando se segregan) (documento WO 2008/138131), los restos de aminoácidos 1 a 504 (18 a 504 cuando se segregan) (patente de EE. UU. n.° 6.905.689), y los restos de aminoácidos 1 a 505 (18-505 cuando se segregan) (publicación de patente de EE. UU. n.° 2007/0081984), son enzimáticamente activas. Esto indica que ciertos restos de aminoácidos pueden truncarse desde el extremo C-terminal del polipéptido de hsTNALP soluble sin afectar su actividad enzimática. Esto también indica que ciertos restos de aminoácidos del anclaje de membrana GPI, cuando están presentes, no afectan significativamente la solubilidad del polipéptido. Por lo tanto, las sALP para uso en la invención también incluyen aquellas en las que, por ejemplo, hasta cinco (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, o cinco) restos de aminoácidos están truncados en su extremo C-terminal, y aquellas en las que están presentes, por ejemplo, hasta cinco (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o cinco) restos de aminoácidos del anclaje de membrana GPI. Por ejemplo, las sALP no segregadas para uso en la invención incluyen aquellas que contienen los restos de aminoácidos 1-497, 1-498, 1-499, 1-500, 1-501, 1-502, 1-503, 1-504, 1-505, 1-

506, o 1-507 de SEQ ID NO: 1208, así como variantes de los mismos en las que el aminoácido en la posición 2 es una valina, y las sALP no segregadas para uso en la invención incluyen aquellas que contienen los restos de aminoácidos 18-497, 18-498, 18-499, 18-500, 18-501, 18-502, 18-503, 18-504, 18-505, 18-506, o 18-507 de SEQ ID NO: 1208.

Un experto en la técnica apreciará que muchas mutaciones en la secuencia de aminoácidos de una enzima no interrumpirán significativamente la función catalítica de la enzima. En algunos casos, cierta mutación puede incluso beneficiar la función catalítica de la enzima en el contexto de la terapia para cualquier trastorno o afección descrito aquí (por ejemplo, un síndrome neurocutáneo o un trastorno óseo o del cartílago). Por lo tanto, las sALP para uso en la invención incluyen no sólo la secuencia de tipo salvaje de las fosfatasas alcalinas descritas anteriormente, sino también incluyen cualquier polipéptido que tenga al menos 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más) de identidad de secuencia con estas fosfatasas alcalinas. Sin embargo, se sabe que mutaciones específicas en TNALP tienden a causar HPP. Dichas mutaciones patógenas están preferiblemente ausentes en las sALP para uso en la invención. Por lo tanto, las sALP para uso en la invención incluyen aquellas que tienen una secuencia de aminoácidos que incluye una secuencia de consenso para múltiples ortólogos de TNALP de mamífero e isoenzimas de ALP humanas que carecen de mutaciones patógenas (SEQ ID NO: 1218, como se muestra en la Fig. 10), o que incluye una secuencia de consenso para múltiples ortólogos de TNALP de mamífero que carecen de mutaciones patógenas (SEQ ID NO: 1219, como se muestra en la Fig. 11). Las sALP ejemplares para uso en la invención incluyen aquellas que contienen los residuos de aminoácidos 1-497, 1-498, 1-499, 1-500, 1-501, 1-502, 1-503, 1-504, 1-505, 1-506, 1-507, 1-508, 1 509, 1-510, 1-511, 1-512, 23-497, 23-498, 23-499, 23-500, 23-501, 23-502, 23-503, 23-504, 23-505, 23-506, 23-507, 23-508, 23-509, 23-510, 23-511, o 23-512 de SEQ ID ⁿO: 1218, y las sALP segregadas para uso en la invención incluyen aquellas que contienen los restos de aminoácidos 18-497, 18-498, 18-499, 18-500, 18-501, 18-502, 18-503, 18-504, 18-505, 18-506, 18-507, 18-508, 18-509, 18-510, 18-511, o 18-512 de SEQ ID NO: 1219. En estas secuencias de consenso (SEQ ID NO: 1218 y 1219), X es cualquier aminoácido, pero no es un aminoácido correspondiente a una mutación patógena en esa posición de TNALP humana. Los ejemplos de tales mutaciones patógenas se enumeran a continuación y se proporcionan en la Tabla 1.

En algunas realizaciones, los polipéptidos de sALP para uso en la invención no incluyen ninguna de las mutaciones proporcionadas en la Tabla 1. En particular, los polipéptidos de sALP para uso en la invención, mediante la numeración de la secuencia de consenso de SEQ ID NO: 1218 (Fig. 10), el aminoácido en la posición 22 no es un resto de fenilalanina; el aminoácido en la posición 33 (posición 11 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de cisteína; el aminoácido en la posición 38 (posición 16 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el aminoácido en la posición 42 (posición 20 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de prolina; el aminoácido en la posición 45 (posición 23 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 56 (posición 34 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina o de valina; el resto de aminoácido en la posición 67 (posición 45 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina, un resto de isoleucina o de valina; el resto de aminoácido en la posición 68 (posición 46 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 73 (posición 51 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 76 (posición 54 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de cisteína, de serina, de prolina o de histidina; el resto de aminoácido en la posición 77 (posición 55 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 80 (posición 58 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 81 (posición 59 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de asparagina; el resto de aminoácido en la posición 105 (posición 83 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 113 (posición 89 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 116 (posición 94 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 117 (posición 95 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 119 (posición 97 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de glicina; el resto de aminoácido en la posición 121 (posición 99 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina o de treonina; el resto de aminoácido en la posición 125 (posición 103 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina; el resto de aminoácido en la posición 128 (posición 106 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 133 (posición 111 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 134 (posición 112 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina; el resto de aminoácido en la posición 137 (posición 115 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina o de valina; el resto de aminoácido en la posición 139 (posición 117 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de histidina o de asparagina; el resto de aminoácido en la posición 141 (posición 119 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de histidina; el resto de aminoácido en la posición 153 (posición 131 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de alanina o de isoleucina; el resto de aminoácido en la posición 167 (posición 145 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina o de valina; el resto de aminoácido en la posición 172 (posición 150 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 175 (posición 153 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 176 (posición 154 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de tirosina o de arginina; el resto de aminoácido en la posición 181 (posición 159 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 182 (posición 160 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 184 (posición 162 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 186 (posición 164 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 189 (posición 167 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de triptófano; el resto de aminoácido en la posición 194 (posición 172 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de glutamato; el resto de aminoácido en la posición 196 (posición 174 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina o de glicina; el resto de aminoácido en la posición 197 (posición 175 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 198 (posición 176 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de alanina; el resto de aminoácido en la posición 206 (posición 184 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de tirosina; el resto de aminoácido en la posición 208 (posición 186 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de glutamato; el resto de aminoácido en la posición 207 (posición 190 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de prolina; el resto de aminoácido en la posición 216 (posición 194 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 217 (posición 195 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de fenilalanina; el resto de aminoácido en la posición 223 (posición 201 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 225 (posición 203 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina o de alanina; el resto de aminoácido en la posición 226 (posición 204 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 228 (posición 206 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de triptófano o de glutamina; el resto de aminoácido en la posición 229 (posición 207 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de glutamato; el resto de aminoácido en la posición 231 (posición 209 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 240 (posición 218 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de glicina; el resto de aminoácido en la posición 251 (posición 229 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 254 (posición 232 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 269 (posición 247 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina; el resto de aminoácido en la posición 277 (posición 255 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de cisteína, de leucina o de histidina; el resto de aminoácido en la posición 280 (posición 258 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de prolina; el resto de aminoácido en la posición 295 (posición 273 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de fenilalanina; el resto de aminoácido en la posición 297 (posición 275 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina; el resto de aminoácido en la posición 298 (posición 276 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 300 (posición 278 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de tirosina o de alanina; el resto de aminoácido en la posición 301 (posición 279 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina, de treonina or de isoleucina; el resto de aminoácido en la posición 303 (posición 281 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de aspirato; el resto de aminoácido en la posición 304 (posición 282 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina; el resto de aminoácido en la posición 305 (posición 283 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de prolina; el resto de aminoácido en la posición 312 (posición 290 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 313 (posición 291 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina o de leucina; el resto de aminoácido en la posición 317 (posición 295 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina; el resto de aminoácido en la posición 332 (posición 310 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina; el resto de aminoácido en la posición 333 (posición 311 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de cisteína, de glicina o de leucina; el resto de aminoácido en la posición 334 (posición 312 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 340 (posición 318 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 345 (posición 323 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina o de glutamato; el resto de aminoácido en la posición 354 (posición 332 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 360 (posición 338 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 361 (posición 339 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina o de isoleucina; el resto de aminoácido en la posición 377 (posición 355 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 380 (posición 358 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 383 (posición 361 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 384 (posición 362 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 387 (posición 365 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina; el resto de aminoácido en la posición 388 (posición 366 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 395 (posición 373 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 397 (posición 375 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de cisteína o de histidina; el resto de aminoácido en la posición 398 (posición 376 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de alanina; el resto de aminoácido en la posición 401 (posición 379 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 405 (posición 383 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina o de valina; el resto de aminoácido en la posición 406 (posición 384 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 412 (posición 390 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de glicina; el resto de aminoácido en la posición 416 (posición 394 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 417 (posición 395 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de alanina; el resto de aminoácido en la posición 420 (posición 398 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 423 (posición 401 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 426 (posición 404 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 429 (posición 407 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de alanina; el resto de aminoácido en la posición 430 (posición 408 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 432 (posición 410 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de cisteína o de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 434 (posición 412 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de prolina; el resto de aminoácido en la posición 435 (posición 413 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina; el resto de aminoácido en la posición 442 (posición 420 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de histidina; el resto de aminoácido en la posición 451 (posición 429 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de prolina; el resto de aminoácido en la posición 456 (posición 434 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de histidina o de cisteína; el resto de aminoácido en la posición 458 (posición 436 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina; el resto de aminoácido en la posición 460 (posición 438 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina; el resto de aminoácido en la posición 461 (posición 439 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina o de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 462 (posición 440 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de triptófano o de arginina; el resto de aminoácido en la posición 465 (posición 443 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina o de leucina; el resto de aminoácido en la posición 472 (posición 450 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 473 (posición 451 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 474 (posición 452 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 479 (posición 457 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 482 (posición 460 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina o de glicina; el resto de aminoácido en la posición 484 (posición 462 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 495 (posición 473 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 496 (posición 474 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de fenilalanina; y el resto de aminoácido en la posición 497 (posición 475 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina.

También más específicamente, cuando se usa una sTNALP en las sALP dirigidas al hueso de la presente invención, usando la numeración de la secuencia de la TNALP humana, el aminoácido en la posición 17 no es un resto de fenilalanina; el aminoácido en la posición 28 (posición 11 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de cisteína; el aminoácido en la posición 33 (posición 16 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el aminoácido en la posición 37 (posición 20 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de prolina; el aminoácido en la posición 40 (posición 23 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 51 (posición 34 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina o de valina; el resto de aminoácido en la posición 62 (posición 45 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina, de isoleucina o de valina; el resto de aminoácido en la posición 63 (posición 46 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 68 (posición 51 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 71 (posición 54 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de cisteína, de serina, de prolina o de histidina; el resto de aminoácido en la posición 72 (posición 55 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 75 (posición 58 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 76 (posición 59 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de asparagina; el resto de aminoácido en la posición 100 (posición 83 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 108 (posición 89 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 111 (posición 94 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 112 (posición 95 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 114 (posición 97 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de glicina; el resto de aminoácido en la posición 116 (posición 99 en la secuencia sin péptido señal) no es resto de serina o de treonina; el resto de aminoácido en la posición 120 (posición 103 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina; el resto de aminoácido en la posición 123 (posición 106 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 128 (posición 111 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 129 (posición 112 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina; el resto de aminoácido en la posición 132 (posición 115 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina o de valina; el resto de aminoácido en la posición 134 (posición 117 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de histidina o de asparagina; el resto de aminoácido en la posición 136 (posición 119 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de histidina; el resto de aminoácido en la posición 148 (posición 131 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de alanina o de isoleucina; el resto de aminoácido en la posición 162 (posición 145 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina o de valina; el resto de aminoácido en la posición 167 (posición 150 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 170 (posición 153 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 171 (posición 154 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de tirosina o de arginina; el resto de aminoácido en la posición 176 (posición 159 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 177 (posición 160 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 179 (posición 162 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 181 (posición 164 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 184 (posición 167 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de triptófano; el resto de aminoácido en la posición 189 (posición 172 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de glutamato; el resto de aminoácido en la posición 191 (posición 174 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina o de glicina; el resto de aminoácido en la posición 192 (posición 175 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 193 (posición 176 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de alanina; el resto de aminoácido en la posición 201 (posición 184 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de tirosina; el resto de aminoácido en la posición 203 (posición 186 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de glutamato; el resto de aminoácido en la posición 207 (posición 190 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de prolina; el resto de aminoácido en la posición 211 (posición 194 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 212 (posición 195 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de fenilalanina; el resto de aminoácido en la posición 218 (posición 201 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 220 (posición 203 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina o de alanina; el resto de aminoácido en la posición 221 (posición 204 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 223 (posición 206 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de triptófano o de glutamina; el resto de aminoácido en la posición 224 (posición 207 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de glutamato; el resto de aminoácido en la posición 226 (posición 209 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 235 (posición 218 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de glicina; el resto de aminoácido en la posición 246 (posición 229 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 249 (posición 232 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 264 (posición 247 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina; el resto de aminoácido en la posición 272 (posición 255 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de cisteína, de leucina o de histidina; el resto de aminoácido en la posición 275 (posición 258 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de prolina; el resto de aminoácido en la posición 289 (posición 272 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de fenilalanina; el resto de aminoácido en la posición 291 (posición 274 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina; el resto de aminoácido en la posición 292 (posición 275 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 294 (posición 277 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de tirosina o de alanina; el resto de aminoácido en la posición 295 (posición 278 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina, de treonina o de isoleucina; el resto de aminoácido en la posición 297 (posición 280 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de aspirato; el resto de aminoácido en la posición 298 (posición 281 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina; el resto de aminoácido en la posición 299 (posición 282 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de prolina; el resto de aminoácido en la posición 306 (posición 289 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 307 (posición 290 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina o de leucina; el resto de aminoácido en la posición 311 (posición 294 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina; el resto de aminoácido en la posición 326 (posición 309 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina; el resto de aminoácido en la posición 327 (posición 310 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de cisteína, de glicina o de leucina; el resto de aminoácido en la posición 328 (posición 311 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 334 (posición 317 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 339 (posición 322 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina o de glutamato; el resto de aminoácido en la posición 348 (posición 331 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 354 (posición 337 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 355 (posición 338 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina o de isoleucina; el resto de aminoácido en la posición 371 (posición 354 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 374 (posición 357 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 377 (posición 360 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 378 (posición 361 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de valina; el resto de aminoácido en la posición 381 (posición 364 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina; el resto de aminoácido en la posición 382 (posición 365 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 389 (posición 372 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 391 (posición 374 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de cisteína o de histidina; el resto de aminoácido en la posición 392 (posición 375 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de alanina; el resto de aminoácido en la posición 395 (posición 378 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 399 (posición 382 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina o de valina; el resto de aminoácido en la posición 400 (posición 383 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 406 (posición 389 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de glicina; el resto de aminoácido en la posición 410 (posición 393 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 411 (posición 394 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de alanina; el resto de aminoácido en la posición 414 (posición 397 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 417 (posición 400 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 420 (posición 403 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 423 (posición 406 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de alanina; el resto de aminoácido en la posición 424 (posición 407 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina; el resto de aminoácido en la posición 426 (posición 409 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de cisteína o de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 428 (posición 411 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de prolina; el resto de aminoácido en la posición 429 (posición 412 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina; el resto de aminoácido en la posición 436 (posición 419 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de histidina; el resto de aminoácido en la posición 445 (posición 428 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de prolina; el resto de aminoácido en la posición 450 (posición 433 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de histidina o de cisteína; el resto de aminoácido en la posición 452 (posición 435 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina; el resto de aminoácido en la posición 454 (posición 437 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina; el resto de aminoácido en la posición 455 (posición 438 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina o de ácido aspártico; el resto de aminoácido en la posición 456 (posición 439 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de triptófano o de arginina; el resto de aminoácido en la posición 459 (posición 442 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de metionina o de leucina; el resto de aminoácido en la posición 466 (posición 449 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 467 (posición 450 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 468 (posición 451 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de treonina; el resto de aminoácido en la posición 473 (posición 456 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 476 (posición 459 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de lisina o de glicina; el resto de aminoácido en la posición 478 (posición 461 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de leucina; el resto de aminoácido en la posición 489 (posición 472 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de serina; el resto de aminoácido en la posición 490 (posición 473 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de fenilalanina; y el resto de aminoácido en la posición 491 (posición 474 en la secuencia sin péptido señal) no es un resto de arginina. En otras realizaciones especificas, una o más X se definen como cualquiera de los restos de aminoácidos encontrados en esa posición en las secuencias del alineamiento, o un resto que constituye una sustitución conservada o semiconservada de cualquiera de estos restos de aminoácidos. En otras realizaciones específicas, las X se definen como cualquiera de los restos de aminoácidos encontrados en esa posición en las secuencias del alineamiento. Por ejemplo, el resto de aminoácido en la posición 51 (posición 34 en la secuencia sin péptido señal) es un resto de alanina o de valina; el resto de aminoácido en la posición 177 (posición 160 en la secuencia sin péptido señal) es un resto de alanina o de serina; el resto de aminoácido en la posición 212 (posición 195 en la secuencia sin péptido señal) es un resto de isoleucina o de valina; el resto de aminoácido en la posición 291 (posición 274 en la secuencia sin péptido señal) es un resto de ácido glutámico o de ácido aspártico; y el resto de aminoácido en la posición 374 (posición 357 en la secuencia sin péptido señal) es un resto de valina o de isoleucina.

Una sALP puede estar opcionalmente glicosilada en cualquiera de uno o más restos de aminoácidos apropiados.

Además, una sALP puede tener al menos 50 % (por ejemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más) identidad de secuencia con cualquiera de las sALP descritas aquí.

Una sALP puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más adiciones, supresiones, o sustituciones con respecto a cualquiera de las sALP descritas aquí.

NP

Cualquier péptido natriurético o variante del mismo que sea un agonista del receptor del péptido natriurético B (“NPR-B”), por ejemplo NPR-B humano, se puede usar en cualquiera de los métodos y composiciones descritos aquí.

Los péptidos natriuréticos como se describen aquí son péptidos que son capaces de agonizar NPR-B. Los péptidos natriuréticos incluyen el péptido natriurético auricular (ANP), el péptido natriurético cerebral (BNP), y el péptido natriurético de tipo C (CNP). Estos péptidos se unen a tres tipos de receptores que señalizan intracelularmente para modular las funciones fisiológicas. ANP y BNP se unen preferentemente al receptor peptídico natriurético A (NPR-A) (también conocido como guanilil ciclasa A (GC-A)), y CNP se une preferentemente al receptor del péptido natriurético B (NPR-B) (también conocido como guanilil ciclasa B (GC-B)). Los tres péptidos tienen afinidad similar por el receptor del péptido natriurético C (NPR-C), que tiene funciones de señalización y de eliminación del péptido. La eliminación de los péptidos natriuréticos también se produce a través de la acción de la endopeptidasa neutra unida a la membrana (NEP). La unión del péptido a NPR-A o NPR-B activa el dominio intracelular de guanilil ciclasa de estos receptores, lo que produce el segundo mensajero cGMP. cGMP activa o inhibe múltiples rutas de señalización dentro de la célula.

Los péptidos natriuréticos, incluyendo CNP, que agoniza principalmente NPR-B, y ANP y BNP, que agonizan principalmente NPR-A, tienen funciones importantes en múltiples procesos biológicos. Los alineamientos de secuencia múltiples de diversos miembros de la familia NP y las secuencias de consenso se muestran en las Figs. 12-14 y 15A-15G.

Un efecto derivado clave de CNP22 y CNP53, y las variantes de los mismos como se describe aquí, en la agonización de NPR-B, es la osificación endocondral. Por lo tanto, los NP descritos aquí son útiles, por ejemplo, para tratar una amplia gama de trastornos asociados con la sobreactivación de FGFR3, y trastornos del músculo liso vascular.

Los NP incluyen la estructura esquemática mostrada en la Fig. 16, en la que se requiere el dominio de anillo y cada uno de la extensión N-terminal, el segmento corto, y la extensión C-terminal es opcional. El dominio de anillo tiene una longitud de 17 restos de aminoácidos, con restos de cisteína en cada extremo del dominio de anillo (posiciones 1 y 17) que forman un enlace de disulfuro. En algunas realizaciones, el dominio de anillo tiene una secuencia de aminoácidos que cae dentro de una de las secuencias de consenso mostradas en las Figs. 12, 14, o 15A-15G (SEQ ID NO: 6, restos de aminoácidos 11-27 de SEQ ID NO: 30, o SEQ ID NO: 95, respectivamente). Cualquiera de los dominios de anillo mostrados en las Figs. 12-14 y 15A-15G pueden usarse en un NP como se describe aquí.

El segmento corto es un segmento inmediatamente N-terminal al dominio de anillo que tiene entre 0 y 10 restos de aminoácidos (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 restos de aminoácidos) de longitud. Los segmentos cortos ejemplares se muestran inmediatamente N-terminales a la región del recuadro en la Fig. 12 o la Fig. 14, por ejemplo los restos 1-5 de SEQ ID NO: 4, o los 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 restos de aminoácidos inmediatamente N-terminales al dominio de anillo conservado en cualquiera de las especies mostradas en las Figs. 14 y 15A-15G. En algunas realizaciones, el segmento corto consiste en la porción de 5 aminoácidos inmediatamente N-terminal al dominio de anillo conservado en cualquiera de las especies mostradas en las Figs. 12, 14, o 15A-15G. En algunas realizaciones, el segmento corto confiere mayor selectividad por NPR-B con respecto a NPR-A.

La extensión N-terminal es una región inmediatamente N-terminal al segmento corto (si el segmento corto está presente) o al dominio de anillo (si el segmento corto no está presente), y puede tener cualquier longitud, por ejemplo 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, o incluso más restos de aminoácidos. Esta región está ausente en CNP22, pero está presente en CNP53 (restos 1-31 de SEQ ID NO: 11). Extensiones N-terminales ejemplares son los 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, o más restos inmediatamente N-terminales al segmento corto, por ejemplo de 5 restos de aminoácidos (si está presente un segmento corto), o inmediatamente N-terminales al dominio de anillo (si no está presente un segmento corto), de cualquiera de las especies mostradas en las Figs. 15A-15G. En algunas realizaciones, la extensión N-terminal proporciona mayor selectividad por NPR-B con respecto a NPR-A.

La extensión C-terminal es una región inmediatamente C-terminal al dominio de anillo, y puede tener cualquier longitud, por ejemplo 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, o incluso más restos de aminoácidos. Esta región está ausente en CNP22 y CNP53, pero está presente en el péptido híbrido CDNP (SEQ ID NO: 100, Fig. 24). Las variantes adicionales de CDNP incluyen aquellas que tienen una o más mutaciones que proporcionan una degradación reducida de NEP, tales como las proporcionadas en la Fig. 24: CDNP-N1 (SEQ ID NO: 101), CDNP-G1 (SEQ ID NO: 102), CDNP-H1 (SEQ ID NO: 103), y CDNP-K1 (SEQ ID NO: 104).

Las extensiones C-terminal ejemplares se muestran inmediatamente C-terminales a la región del recuadro en la Fig. 12, por ejemplo los restos de aminoácidos 24-28 de SEQ ID NO: 1, restos de aminoácidos 28-32 de SEQ ID NO: 2, restos de aminoácidos 27-32 de SEQ ID NO: 3, o restos de aminoácidos 24-38 de SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, la cola C-terminal incluye, o consiste en, la cola C-terminal de DNP (SEQ ID NO: 117), o una variante de la misma que tenga una o más mutaciones de adición, supresión, o sustitución (por ejemplo, SEQ ID NO: 118). Por ejemplo, una cola C-terminal de un NP puede incluir cualquiera de las mutaciones de la cola C-terminal de DNP mostradas en la Fig. 24. En particular, los restos 1,3, 4, 5, 6, y/o 7 de la cola C-terminal de DNP (SEQ ID NO: 117) se pueden mutar, por ejemplo, como en cualquiera de las mutaciones mostradas en la Fig. 24. En algunas realizaciones, la extensión C-terminal confiere mayor selectividad por NPR-B con respecto a NPR-A.

Un NP puede estar opcionalmente glicosilado en cualquiera de uno o más restos de aminoácidos apropiados.

Además, un NP puede tener al menos 50 % (por ejemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más) de identidad de secuencia con cualquiera de los NP descritos aquí, o con uno o más del dominio de anillo, el segmento corto, la extensión C-terminal, o la extensión N-terminal.

Un NP puede tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más adiciones, supresiones, o sustituciones con respecto a cualquiera de los NP descritos aquí, o a uno o más del dominio de anillo, el segmento corto, la extensión C-terminal, o la extensión N-terminal.

En un ejemplo, el NP puede tener una o más mutaciones que son menos sensibles a la oxidación sin reducir sustancialmente la potencia o la eficacia. Por ejemplo, el resto 17 de CNP22 es una de las posiciones menos bien conservadas en CNP22, con homólogos de origen natural que tienen (sin limitación) Phe, Leu, Ile, Thr, Val, o Ser en esta posición (véase, por ejemplo, la Fig. 14). Las variantes de CNP22 ejemplares incluyen CNP-F17 (SEQ ID NO: 119); CNP-L17 (SEQ ID NO: 120); CNP-I17 (SEQ ID NO: 121); CNP-T17 (SEQ ID NO: 122); CNP-V17 (SEQ ID NO: 123); CNP-A17 (SEQ ID NO: 124); CNP-S17 (SEQ ID NO: 125); CNP-E17 (SEQ ID NO: 156); CNP-R17 (SEQ ID NO: 157); y CNP-Y17 (SEQ ID NO: 158), en las que la secuencia de consenso se muestra en ^sE^qID NO: 126 (en la que X puede ser cualquier aminoácido, incluyendo, sin limitación, Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, Asp, Val, Ala, o Ser) (Fig. 26). Las variantes ejemplares adicionales de CNP22 incluyen aquellas que tienen una mutación puntual en la posición 17, como se muestra en la Fig. 30 (SEQ ID NOs: 126, 119-122, o 156-172), en las que X en SEQ ID NOs: 126 o 162 puede ser cualquier aminoácido, por ejemplo F, L, I, T, E, R, Y, C, P, o D.

En otro ejemplo, el NP puede tener una o más mutaciones que proporcionan mayor resistencia a una o más enzimas que escinden CNP in vivo (por ejemplo, endopeptidasa neutra (NEP) y/o enzima de degradación de insulina (IDE)). Las moléculas ejemplares se muestran en la Fig. 27 (SEQ ID NO: 127-150), Figs. 28A-28E (SEQ ID NOs: 1001-1155), y Fig. 29 (SEQ ID NOs: 4, 115, 119, 120, 122, 128-139, 147, 148, y 150-155).

Un NP como se describe aquí puede incluir cualquier otra secuencia o resto, unida covalente o no covalentemente, siempre que el NP tenga la capacidad de agonizar NPR-B.

En algunas realizaciones, un NP como se describe aquí puede tener no más de 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 70, 80, 90, 100, 110, o 120 restos de aminoácidos de longitud. Además, en algunas realizaciones, un NP como se describe aquí puede tener no más de 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8, o 10.0 kilodaltons (kDa) en peso molecular.

Las NP que son adecuados para uso en las composiciones y los métodos descritos aquí incluyen los descritos, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. núms. 5.352.770; 5.434.133; 6.020.168; 6.034.231; 6.407.211; 6.743.425; 6.818.619; 7.276.481; 7.384.917; y 7.754.852; las Publicaciones de Solicitudes de EE. UU. núms. 2007-0197434; 2008-0181903; 2008-0312142; 2009-0170756; 2010-0055150; y 2010-0297021; las Publicaciones de Solicitudes Internacionales núms. WO 94/20534; WO 02/047871; WO 2004/047871; WO 2005/098490; WO 2008/154226; y WO 2009/067639; Publicación de Solicitud Europea núms. EP 0497368 y EP 0466174; Furuya et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 183: 964-969 (1992); Takano et al., Zool. Sci., 11: 451-454 (1994); Plater et al., Toxicon., 36(6): 847-857 (1998); e Inoue et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 100(17): 10079-10084 (2003), incluidas todas las fórmulas, estructuras, y secuencias de péptidos natriuréticos y variantes de los mismos. En realizaciones alternativas, los NP a los que se hace referencia en el presente párrafo se excluyen de las composiciones y métodos descritos aquí.

En algunas realizaciones, cualquiera de los NP descritos aquí puede usarse en las composiciones descritas aquí sin fusión con un dominio de Fc o con un enlazador, o de manera alternativa, puede fusionarse con cualquiera de los enlazadores descritos aquí, pero no con un dominio de Fc. Dichos NP se pueden usar para tratar un síndrome neurocutáneo, un trastorno asociado con la sobreactivación de FGFR3, por ejemplo acondroplasia, un trastorno óseo o de cartílago, un trastorno del músculo liso vascular, o una afección por elongación de hueso, como se describe aquí.

En otras realizaciones, cualquiera de los NP descritos o citados aquí puede incluir una mutación puntual en la posición 17 con respecto a CNP22. El CNP22 de tipo salvaje tiene una metionina en la posición 17 con respecto a CNP22, que puede ser oxidada in vivo y/o que puede proporcionar un péptido que es degradable por una proteasa. Como se describe aquí, las mutaciones puntuales en la posición 17 con respecto a CNP22 podrían proporcionar polipéptidos que tienen una degradación reducida, al tiempo que mantienen la potencia. Ejemplos de restos de aminoácidos en la posición 17 con respecto a CNP22 son Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, Asp, Gly, Ala, Ser, Val, Trp, Asn, Gln, His, o Lys, por ejemplo Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, o Asp, por ejemplo Phe o Leu, por ejemplo Phe, por ejemplo Leu. Por ejemplo, el aminoácido en la posición 17 con respecto a CNP22 podría ser Phe, Leu, Ile, Thr, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, y Asp, por ejemplo Phe o Leu, por ejemplo Phe, por ejemplo Leu. En otro ejemplo, el aminoácido en la posición 17 con respecto a CNP22 podría ser Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, o Ser. Como alternativa, los restos de aminoácidos ejemplares en la posición 17 con respecto a CNP22 son Gly, Ala, Ser, Val, Trp, Asn, Gln, His, o Lys.

Además, incluidas en las composiciones y métodos descritos aquí están las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los NP y polipéptidos de fusión descritos aquí, así como moléculas de ácido nucleico que se hibridan en condiciones de alta rigurosidad con al menos una porción, por ejemplo con un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o incluso un 100 %, de una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de los NP o polipéptidos de fusión descritos aquí.

Fragmentos de región de fragmento cristalizable (Fc)

Los polipéptidos de fusión para uso en la invención pueden incluir un dominio N-terminal o C-terminal, tal como Fc, una región de fragmento cristalizable de una inmunoglobulina. Por ejemplo, un polipéptido de sALP y/o un polipéptido de NP para uso en la invención puede ser un polipéptido de fusión que incluye una Fc. Una molécula de inmunoglobulina tiene una estructura que es bien conocida en la técnica. Incluye dos cadenas ligeras (~23 kD cada una) y dos cadenas pesadas (-50-70 kD cada una) unidas por enlaces de disulfuro intercatenarios. Las inmunoglobulinas se escinden con facilidad proteolíticamente (por ejemplo, mediante escisión con papaína) en Fab (que contiene la cadena ligera y los dominios VH y CH1 de la cadena pesada) y Fc (que contiene los dominios C^h2y CH³de la cadena pesada, junto con las secuencias adyacentes). La escisión se produce típicamente en una región bisagra flexible que se une a las regiones Fab y Fc. Por ejemplo, la papaína escinde la región bisagra inmediatamente antes de los enlaces de disulfuro que unen las dos cadenas pesadas.

Los fragmentos Fc útiles como se describen aquí incluyen el fragmento Fc de cualquier molécula de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD, o IgE, y sus diversas subclases (por ejemplo, lgG-1, lgG-2, lgG-3, lgG-4, lgA-1, lgA-2), tomada de cualquier mamífero (por ejemplo, ser humano). Los fragmentos Fc para uso en la invención pueden incluir, por ejemplo, los dominios C^h2y C^h3 de la cadena pesada, así como cualquier porción de la región bisagra. Además, la región Fc puede estar opcionalmente glicosilada en cualquiera de uno o más restos de aminoácidos apropiados, por ejemplo diversos restos de aminoácidos conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, el fragmento Fc es de lgG-1 humana. En realizaciones particulares, el fragmento Fc del polipéptido de fusión tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 401, o tiene al menos un 50 % (por ejemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 401 (Fig. 7).

En algunas realizaciones, las regiones Fc manipuladas, por ejemplo de forma no natural, pueden utilizarse en las composiciones para uso de la invención, por ejemplo como se describe en la Publicación de Solicitud Internacional n.° W02005/007809.

Un fragmento Fc como se describe aquí puede tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, o más adiciones, supresiones, o sustituciones con respecto a cualquiera de los fragmentos Fc descritos aquí.

Enlazadores

Las proteínas de fusión descritas aquí pueden incluir una región enlazadora peptídica entre el fragmento Fc y la sALP, o entre el fragmento Fc y el NP. Además, se puede incluir una región enlazadora peptídica entre el fragmento Fc y el resto dirigido al hueso opcional. La región enlazadora puede ser de cualquier secuencia y longitud que permita que la sALP o el NP permanezcan biológicamente activos, por ejemplo sin impedimento estérico. Las longitudes del enlazador ejemplares están entre 1 y 200 restos de aminoácidos, por ejemplo, 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31 -35, 36-40, 41 -45, 46-50, 51-55, 56-60, 61 -65, 66-70, 71 -75, 76-80, 81 -85, 86-90, 91 -95, 96-100, 101-110, 111 -120, 121-130, 131-140, 141-150, 151-160, 161-170, 171-180, 181-190, o 191-200 restos de aminoácidos. Longitudes del enlazador ejemplares adicionales son 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o 200 restos de aminoácidos. Las longitudes del enlazador ejemplares adicionales son 14-18, 20-24, 26-30, 32-36, 38-42, y 44-48 restos de aminoácidos.

En algunas realizaciones, los enlazadores incluyen o consisten en porciones flexibles, por ejemplo regiones sin una estructura secundaria o terciaria fija significativa. Los enlazadores flexibles ejemplares son enlazadores ricos en glicina, por ejemplo que contienen al menos 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o incluso 100 % restos de glicina. Los enlazadores también pueden contener, por ejemplo, restos de serina. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos de los enlazadores consiste sólo en los restos de glicina y serina.

En algunos casos, la secuencia de aminoácidos de la secuencia enlazadora incluye o consiste en una secuencia según la fórmula [(Gly)^m(Ser)]ⁿ(Gly)^p, en la que cada uno de m, n y p es, i ndependientemente, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20. En algunas realizaciones, m = 1,2, 3, 4, 5, o 6; n = 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; y p = 0, 1,2, 3, o 4. De manera alternativa, la secuencia enlazadora incluye o consiste en una secuencia según la fórmula (Gly)^p[(Ser)(Gly)^m]n, en la que cada uno de m, n y p es, independientemente, 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20. En algunas realizaciones, m = 1, 2, 3, 4, 5, o 6; n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; y p = 0, 1, 2, 3, o 4.

En la Tabla 2 se enumeran combinaciones ejemplares de valores m, n y p para cualquiera de las dos fórmulas anteriores.

Tabla 2.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del enlazador (por ejemplo, entre la Fc y la sALP, o entre la Fc y el NP, o entre la Fc y el resto dirigido al hueso opcional) incluye o consiste en una secuencia en la Tabla 3. Tabla 3.

En algunas realizaciones, el enlazador puede incluir o consistir en un enlazador [(Gly)^m(Ser)]ⁿ(Gly)^po (Gly)^p[(Ser)(Gly)^m]ⁿcomo se describe anteriormente, seguido de una de SEQ ID NOs: 314-321, por ejemplo una de SEQ ID NOs: 314, 315, o 321.

En otras realizaciones de polipéptidos que incluyen una sALP, el enlazador puede incluir o consistir en todo o un fragmento de una sALP. Por ejemplo, la porción de 17 aminoácidos de TNALP humana, que es una secuencia señal N-terminal, u homólogos o variantes o fragmentos de la misma (por ejemplo, restos 1-17 de SEQ ID NOs: 1202 o 1208), pueden usarse como un enlazador. Los homólogos de esta región de 17 aminoácidos pueden identificarse, por ejemplo, consultando un alineamiento de secuencias tal como el de la Fig. 8 (restos 1-17 de SEQ ID NO: 1216, en la que X puede ser cualquier aminoácido) o en la Fig. 11 (restos 1-17 de SEQ ID NO: 1219, en la que X puede ser cualquier aminoácido, pero no una mutación patógena proporcionada en la Tabla 1). En otro ejemplo, la porción de anclaje de GPI C-terminal de TNALP humana, u homólogos o variantes o fragmentos de la misma (por ejemplo, restos 503-524 de SEQ ID NO: 1208), pueden usarse como enlazador. Los homólogos de esta región C-terminal se pueden identificar, por ejemplo, consultando un alineamiento de secuencia tal como el de la Fig. 8 (restos 503-524 de SEQ ID NO: 1216, en la que X puede ser cualquier aminoácido) o en la Fig. 11 (restos 503-524 de SEQ ID NO: 1219, en la que X puede ser cualquier aminoácido, pero no una mutación patógena proporcionada en la Tabla 1).

En otras realizaciones de polipéptidos que incluyen un NP, el enlazador puede incluir o consistir en la totalidad o un fragmento de un NP. Por ejemplo, la porción de 31 aminoácidos de CNP53 humano, que es N-terminal para CNP22, o sus homólogos o variantes (por ejemplo, restos 4-34 de SEQ ID NO: 320), pueden usarse como enlazador. Los homólogos de esta región de 31 aminoácidos pueden identificarse, por ejemplo, consultando un alineamiento de secuencias como el de las Figs. 15A-15G, e identificando las regiones correspondientes a los restos de 31 aminoácidos N-terminales de CNP53 humano. También se pueden identificar otros enlazadores adecuados, por ejemplo escogiendo cualquier porción de un NP, excluyendo opcionalmente un dominio de anillo, como se muestra en las Figs.

15A-15G, o en cualquier otro NP o región de un NP que no se muestra en las Figs. 15A-15G. Por ejemplo, la extensión C-terminal de DNP (SEQ ID NO: 117), o fragmentos o variantes de la misma, pueden usarse como enlazadores.

Un enlazador puede estar opcionalmente glicosilado en cualquiera de uno o más restos de aminoácidos apropiados.

Además, un enlazador puede tener al menos 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más) de identidad de secuencia con cualquiera de los enlazadores descritos aquí. Además, un enlazador puede tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más adiciones, supresiones, o sustituciones con respecto a cualquiera de los enlazadores descritos aquí.

Un enlazador como se describe aquí puede incluir cualquier otra secuencia o resto, unida covalente o no covalentemente.

En algunas realizaciones, el enlazador está ausente, lo que significa que el fragmento Fc y la sALP se fusionan directamente, o que el fragmento Fc y el NP se fusionan directamente, sin restos intermedios.

Debe observarse que ciertas proteínas de fusión Fc-sALP o sALP-Fc pueden verse, según la presente descripción, ya sea como 1) que no tienen enlazador, o como 2) que tienen un enlazador que corresponde a una porción de la sALP. Por ejemplo, la Fc fusionada directamente con hsTNALP (1-502) puede verse, por ejemplo, como que no tiene enlazador, en la que el NP es hsTNALP (1 -502), o como que tiene un enlazador de 17 aminoácidos, en la que el NP es hsTNALP (18-502).

Además, debe observarse que ciertas proteínas de fusión Fc-NP o NP-Fc pueden verse, según la presente descripción, ya sea como 1) que no tienen enlazador, o como 2) que tienen un enlazador que corresponde a una porción del NP. Por ejemplo, la Fc fusionada directamente con CNP53 puede verse, por ejemplo, como que no tiene enlazador, en la que el NP es CNP53, o como que tiene un enlazador de 31 aminoácidos, en la que el NP es CNP22.

Polipéptidos de sALP

Cualquiera de las sALP y enlazadores descritos aquí pueden combinarse en un polipéptido de sALP, por ejemplo un polipéptido de sALP de A-sALP-B, en el que cada uno de A y B está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido. Cuando están presentes, A y/o B pueden ser cualquier enlazador descrito aquí (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de s Eq ID NOs: 301-391). En algunas realizaciones, A está ausente, B está ausente, o tanto A como B están ausentes.

Los polipéptidos de sALP para uso en la invención pueden incluir opcionalmente una región Fc para proporcionar un polipéptido de fusión de sALP, como se describe aquí.

El polipéptido de sALP puede incluir opcionalmente un resto dirigido al hueso (por ejemplo, cualquiera descrito aquí). En algunas realizaciones, se puede incluir un enlazador, por ejemplo un enlazador flexible, entre el resto dirigido al hueso y la sALP. Por ejemplo, la Fig. 5B proporciona polipéptidos que tienen tanto un resto dirigido al hueso como un enlazador (que se muestra en negrita) entre la región Fc y el resto dirigido al hueso. En algunas realizaciones, el enlazador es una secuencia dipeptídica (por ejemplo, leucina-lisina o ácido aspártico-isoleucina) o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 301 -391.

El polipéptido de sALP puede incluir cualesquiera ALP, mutaciones, secuencia señal N-terminal, secuencia de GPI C-terminal, y/o enlazadores, o fragmentos de los mismos, descritos aquí. Por ejemplo, las regiones en cursiva en las Figs. 5B-5C, y las secuencias proporcionadas en las Figs. 6 u 8-11, pueden usarse con respecto cualquiera de las sALP descritas aquí (por ejemplo, SEQ ID NOs: 1201, 1202, 1204-1216, 1218, y 1219).

Polipéptidos de fusión de sALP

Cualquiera de las sALP, enlazadores, y regiones Fc descritos aquí pueden combinarse en un polipéptido de fusión, por ejemplo un polipéptido de fusión recombinante, que incluye la estructura C-sALP-D-Fc-E, C-Fc-D-sALP-E, C-sALP-D-Fc-G-Iⁿ-H, o C-Fc-D-sALP-G-Iⁿ-H, en la que cada uno de C, D (la región enlazadora), E, G (región enlazadora), y H está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; I representa un ácido aspártico o un ácido glutámico; y n = 10 a 16. D y G pueden estar ausentes o pueden incluir opcionalmente cualquier enlazador descrito aquí (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 301-391).

Los polipéptidos para uso en la invención incluyen opcionalmente uno o más restos de aminoácidos adicionales 1) en el extremo N del polipéptido, 2) entre las regiones sALP y Fc del polipéptido, y 3) en el extremo C del polipéptido. Por lo tanto, la invención incluye, por ejemplo, polipéptidos de la forma C-sALP-D-Fc-E o la estructura C-Fc-D-sALP-E, en la que C es uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más) restos de aminoácidos adicionales en el extremo N del polipéptido, D es uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más) restos de aminoácidos adicionales (es decir, un enlazador) entre las regiones sALP y Fc del polipéptido, y E es uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más) restos de aminoácidos adicionales en el extremo C del polipéptido. En un ejemplo particular, D es el dipéptido leucina-lisina. De manera alternativa, cualquier combinación de C, D, y E puede estar presente o ausente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, tanto C como E están ausentes, y D está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido. Por ejemplo, el polipéptido puede consistir en la estructura sALP-D-Fc o la estructura Fc-D-sALP. En algunas realizaciones de polipéptidos que consisten en la estructura sALP-D-Fc o Fc-D-sALP, D puede consistir en dos restos de aminoácidos, por ejemplo leucina-lisina. Por ejemplo, el polipéptido puede consistir en la estructura sALP-D-Fc. De manera opcional, la secuencia de aminoácidos de sALP es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1205, la secuencia de aminoácidos de D es leucina-lisina, y/o la secuencia de aminoácidos de Fc es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 401. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1204. En algunas realizaciones, el polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 % 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más) de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1204 o 1221.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye un resto dirigido al hueso, por ejemplo que tiene una serie de restos consecutivos de Asp o Glu, por ejemplo, E⁶, E⁷, E^s, E⁹, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D⁶, D⁷, D^s, D⁹, D¹⁰, D¹¹, D¹², D¹³, D¹⁴, D¹⁵, o D¹⁶. El resto dirigido al hueso, si está presente, puede colocarse en cualquier lugar del polipéptido de fusión, por ejemplo en o cerca del extremo N-terminal o C-terminal, y/o en la región enlazadora. Por ejemplo, uno cualquiera de C, D y/o E puede incluir un resto dirigido al hueso. En algunas realizaciones, el resto dirigido al hueso está en el extremo C-terminal. Por ejemplo, el polipéptido puede comprender o consistir en la estructura C-sALP-D-Fc-G-Iⁿ-H o la estructura C-Fc-D-sALP-G-Iⁿ-H, en la que cada uno de C, D (la región enlazadora), G (región enlazadora) y H está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, I representa un ácido aspártico o un ácido glutámico, y n = 10 a 16. En algunas realizaciones, tanto C como H están ausentes, y D y G pueden estar ausentes o pueden incluir opcionalmente cualquier enlazador descrito aquí (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 301-391). Por ejemplo, el polipéptido puede comprender o consistir en la estructura sALP-D-Fc-G-Iⁿo la estructura Fc-D-sALP-G-Iⁿ.

Un polipéptido de fusión como se describe aquí puede tener al menos 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más) de identidad de secuencia con cualquiera de los polipéptidos de fusión descritos aquí, por ejemplo SEQ ID NOs: 1201, 1204, 1220, o 1221. Además, un polipéptido de fusión como se describe aquí puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, o más adiciones, supresiones, o sustituciones con respecto a cualquiera de los polipéptidos de fusión descritos aquí. Además, en algunas realizaciones, un polipéptido de fusión como se describe aquí puede ser codificado por una molécula de ácido nucleico que se híbrida en condiciones de alta rigurosidad con al menos una porción, por ejemplo con el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o incluso 100 %, de una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos, por ejemplo los polipéptidos de fusión, descritos aquí.

En algunas realizaciones, pueden introducirse restos de aminoácidos adicionales en el polipéptido según la estrategia de clonación usada para producir los polipéptidos de fusión. En algunas realizaciones, los restos de aminoácidos adicionales no proporcionan una señal de anclaje de GPI adicional para mantener el polipéptido en una forma soluble. Además, en algunas realizaciones, cualquiera de dichos restos de aminoácidos adicionales, cuando se incorporan en el polipéptido para uso en la invención, no proporcionan un sitio de escisión para las endoproteasas de la célula hospedante. La probabilidad de que una secuencia diseñada sea escindida por las endoproteasas de la célula hospedante puede predecirse como se describe, por ejemplo, por Ikezawa (Biol. Pharm. Bull. 25:409-417, 2002).

En ciertas realizaciones, los polipéptidos para uso en la invención se asocian en dímeros o tetrámeros. Por ejemplo, dos monómeros de sALP-Fc pueden unirse covalentemente a través de dos enlaces disulfuro ubicados en las regiones bisagra de los fragmentos Fc.

Polipéptidos de NP

Cualquiera de los NP y enlazadores descritos aquí pueden combinarse en un polipéptido de NP, por ejemplo un polipéptido de NP de V-NP-W, en el que cada uno de V y W está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido.

Los polipéptidos de NP para uso en la invención pueden incluir opcionalmente una región Fc para proporcionar un polipéptido de fusión de NP, como se describe aquí.

El polipéptido de NP puede incluir opcionalmente un resto dirigido al hueso. En algunas realizaciones, se puede incluir un enlazador, por ejemplo un enlazador flexible, entre el resto dirigido al hueso y el NP. Por ejemplo, la Fig. 27 proporciona polipéptidos que tienen un enlazador, o tanto un resto dirigido al hueso como un enlazador (SEQ ID NOs: 128-150); las Figs. 31A-31B proporcionan polipéptidos que tienen un enlazador, o tanto un resto dirigido al hueso como un enlazador, en las que X en cualquiera de SEQ ID NOs: 173-220 puede ser cualquier aminoácido, por ejemplo, F, L, I, T, E, R, Y, C, P o D; y la Fig. 32 proporciona secuencias de aminoácidos para variantes particulares, en las que X en SEQ ID NOs: 186-198 es una leucina para proporcionar las secuencias en SEQ ID NOs: 221-233.

El polipéptido de NP puede incluir cualesquiera NP, extensiones N-terminales, extensiones C-terminales, y/o enlazadores descritos aquí. Por ejemplo, las regiones en cursiva en las Figs. 30, 31A-31B, y 32 pueden usarse con respecto a cualquiera de los NP descritos aquí (véanse, por ejemplo, SEQ ID NOs: 511-516 y 553-558).

Polipéptidos de fusión de NP

Cualquiera de los NP, enlazadores, y regiones Fc descritos aquí se pueden combinar en un polipéptido de fusión, por ejemplo un polipéptido de fusión recombinante, que incluye la estructura X-Fc-Y-NP-Z o la estructura X-NP-Y-Fc-Z, en la que cada uno de X, Y (la región enlazadora) y Z está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido.

Las Figs. 17A-17E representan varias estructuras esquemáticas posibles de polipéptidos de fusión como se describe aquí. Los homodímeros de Fc-NP o NP-Fc pueden formarse, por ejemplo, debido a los enlaces disulfuro formados por

Fc (Figs. 17A y 17B, respectivamente). Alternativamente, son posibles híbridos de monómero-dímero en los que un polipéptido de fusión de NP-Fc o Fc-NP se une a un dominio de Fc libre (Figs. 17C y 17D, respectivamente). Además, un monómero NP-Fc puede unirse a un monómero Fc-NP, como se muestra en la Fig. 17E. Estas configuraciones no pretenden ser exhaustivas, sino meramente ejemplares.

Los polipéptidos de fusión ejemplares que tienen un dominio NP N-terminal y un dominio de Fc C-terminal incluyen los mostrados en la Fig. 25A, e incluyen CNP-enlazador16AA-Fc-His¹⁰(NC1) (SEQ ID NO: 521); CNP-enlazador6AA-Fc-His¹⁰(NC3) (SEQ ID NO: 522); CNP-enlazador6AA-Fc (SEQ ID NO: 523); CDNP-Fc (SEQ ID NO: 524), que no tiene enlazador entre los restos de CDNP y Fc; CDNP-A17saa-Fc (SEQ ID NO: 525), que tiene una mutación a alanina en la posición 17 de la región de CNP22, y mutaciones S3, A4, y A5 en la región de la cola de DNP; y CDNP-A17sra-Fc (SEQ ID NO: 526), que tiene una mutación a alanina en la posición 17 de la región de CNP22, y mutaciones S3 y

A5 en la región de la cola de DNP. La Fig. 25B es una lista de la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 806) de NC1.

El dominio NP en el polipéptido de fusión puede ser cualquier NP descrito aquí. Por ejemplo, cualquiera de las moléculas mostradas en las Figs. 30, 31A-31B, y 32, con o sin el resto dirigido al hueso, puede fusionarse con un dominio de Fc, y opcionalmente puede incluir una región enlazadora entre Fc y NP, como se describe aquí. Por ejemplo, una variante de CNP con mutación M17X puede fusionarse con un dominio de Fc, por ejemplo como se muestra en las Figs. 33A-33E, en las que X puede ser cualquier aminoácido, por ejemplo F, L, I, T, E, R, Y, C, P, D, G, A, S, V, W,

N, Q, H, o K, por ejemplo F, L, I, T, E, R, Y, C, P, o D, por ejemplo F o L. En algunas realizaciones, la secuencia es

SEQ ID NO: 530, y X es cualquier aminoácido descrito aquí, por ejemplo F, L, I, T, E, R, Y, C, P, D, G, A, S, V, W, N,

Q, H, o K, por ejemplo, F, L, I, T, E, R, Y, C, P, o D, por ejemplo F o L.

En la estructura X-Fc-Y-NP-Z o la estructura X-NP-Y-Fc-Z, X puede incluir uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más) restos de aminoácidos adicionales en el extremo N del polipéptido, y Z puede incluir independientemente uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,

12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más) restos de aminoácidos adicionales en el extremo C del polipéptido.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye un resto dirigido al hueso, por ejemplo que tiene una serie de restos consecutivos de Asp o Glu, por ejemplo E⁶, E⁷, Es, E^g, E¹⁰, E¹¹, E¹², E¹³, E¹⁴, E¹⁵, E¹⁶, D⁶, D⁷, D¹⁴, D¹⁵, o Die. El resto dirigido al hueso, si está presente, puede colocarse en cualquier lugar del polipéptido de fusión, por ejemplo en o cerca del extremo N-terminal o C-terminal, y/o en la región enlazadora. Por ejemplo, uno cualquiera de X, Y y/o Z puede incluir un resto dirigido al hueso.

En algunos casos, se introducen uno o más restos de aminoácidos en el polipéptido de fusión, por ejemplo dentro de

X, Y, o Z, como resultado de la estrategia de clonación usada. En algunas realizaciones, cualquiera de tales restos de aminoácidos adicionales, cuando se incorporan en el polipéptido para uso en la invención, no proporcionan un sitio de escisión para las endoproteasas de la célula hospedante. La probabilidad de que una secuencia diseñada sea escindida por las endoproteasas de la célula hospedante puede predecirse como se describe, por ejemplo, por Ikezawa (Biol. Pharm. Bull. 25:409-417, 2002).

En ciertas realizaciones, los polipéptidos de fusión para uso en la invención se asocian en dímeros, por ejemplo a través de dos enlaces disulfuro ubicados en las regiones bisagra de los fragmentos Fc.

En algunas realizaciones, los polipéptidos de fusión para uso en la invención tienen al menos, por ejemplo, 1, 1,5, 2,

2,5, 3, 3,5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12.5, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400,

450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 7.500, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 40.000, o 50.000 veces la vida media de CNP22 in vivo.

Cualquier proteína de fusión de NP puede expresarse con una secuencia señal N-terminal para facilitar la secreción, por ejemplo los restos de aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 501, o cualquier otra secuencia señal conocida en la técnica. Dichas secuencias se escinden generalmente de forma co-traduccional, dando como resultado la secreción de la versión madura de la proteína.

Un polipéptido de fusión como se describe aquí puede tener al menos 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más) de identidad de secuencia con cualquiera de los polipéptidos de fusión descritos aquí, por ejemplo SEQ ID NOs: 501-608. Además, un polipéptido de fusión como se describe aquí puede tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, o más adiciones, supresiones, o sustituciones con respecto a cualquiera de los polipéptidos de fusión descritos aquí. Además, en algunas realizaciones, un polipéptido de fusión como se describe aquí puede ser codificado por una molécula de ácido nucleico que se híbrida en condiciones de alta rigurosidad con al menos una porción, por ejemplo con el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o incluso 100 %, de una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos, por ejemplo los polipéptidos de fusión, descritos aquí.

Las proteínas de fusión incluyen aquellas que tienen una o más modificaciones que se escinden durante la expresión. Por ejemplo, una proteína de fusión de Fc-CNP se diseñó como se muestra en las Figs. 18A y 18B. Esta proteína, denominada “Streptag NC2” o “NC2st”, tiene una secuencia señal N-terminal de 25 aminoácidos que se escinde durante la expresión. La proteína madura tiene la siguiente estructura de dominio, desde el extremo N hasta el extremo C: secuencia Strep-tag II (para facilitar la purificación) flanqueada por secuencias cortas de enlazador; secuencia de escisión de la proteasa TEV, seguida de un enlazador corto; dominio de Fc de la lgG-1 humana; enlazador rico en glicina de 16 aminoácidos; y CNP22. Esta proteína se puede producir sintetizando químicamente la secuencia codificante (Fig. 18C, SEQ ID NO: 801), e insertando la secuencia codificante en un plásmido de clonación pequeño usando técnicas estándar conocidas en la técnica.

Las proteínas de fusión pueden variar en varios aspectos. Por ejemplo, NC2st se puede variar eliminando la secuencia que es N-terminal para el dominio de Fc (que da como resultado, por ejemplo, NC2B, como se muestra en las Figs.19A-19B), añadiendo un resto dirigido al hueso (que da como resultado, por ejemplo, D10-NC2, como se muestra en la Fig. 19A), y/ o alterando la longitud del enlazador entre Fc y CNP22 (por ejemplo, NC2B-22 (también denominado NC2-22), NC2B-28 (también denominado NC2-28), y NC2B-34 (también denominado NC2-34), como se muestra en las Figs. 20A-20D). Otras variantes ejemplares de NC2st se muestran en la Fig. 21 (NC2-KGANKK y NC2-KGANQK) y la Fig. 22 (NC2-CNP53mut2).

NC2B puede variar en varios aspectos, incluyendo el hecho de tener una mutación puntual, por ejemplo en la posición 17 con respecto a CNP22, tener un resto dirigido al hueso, y/o tener regiones enlazadoras modificadas o alteradas. Las proteínas de fusión ejemplares incluyen cualesquiera secuencias que tengan una región enlazadora modificada o alterada (por ejemplo, SEQ ID NOs: 511-516, como se muestra en la Fig. 34A), en comparación con NC2B (como se muestra en las Figs. 16A-16B); cualesquiera secuencias que tengan un resto dirigido al hueso, por ejemplo un resto D¹⁰(por ejemplo, SEQ ID NOs: 553-558, como se muestra en la Fig. 34B); cualesquiera extensiones N-terminales, extensiones C-terminales, y/o enlazadores para cualquiera de los NP descritos aquí (por ejemplo, las regiones en cursiva en SEQ ID NOs: 511-516 y 553-558, como se muestra en las Figs. 30, 31A-31B y 32); cualesquiera secuencias que tengan una sustitución de fenilalanina (Phe, F) en la posición 17 con respecto a CNP22 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 559-564, como se muestra en la Fig. 34C), incluyendo aquellas secuencias que tienen una modificación adicional de un resto dirigido al hueso D¹⁰en el extremo N (por ejemplo, SEQ ID NOs: 565-570, como se muestra en la Fig. 34D); cualesquiera secuencias que tengan una sustitución de leucina (Leu, L) en la posición 17 con respecto a CNP22 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 571-576, como se muestra en la Fig. 34E), incluyendo aquellas secuencias que tienen una modificación adicional de un resto dirigido al hueso D¹⁰en el extremo N (por ejemplo, SEQ ID NOs: 577-582, como se muestra en la Fig. 34F); cualesquiera secuencias que tengan una sustitución de arginina (Arg, R) en la posición 17 con respecto a CNP22 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 583-588, como se muestra en la Fig. 34G), incluyendo aquellas secuencias que tienen una modificación adicional de un resto dirigido al hueso D¹⁰en el extremo N (por ejemplo, SEQ ID NOs: 589-594, como se muestra en la Fig. 34H); y cualesquiera secuencias que tengan una sustitución de tirosina (Tyr, Y) en la posición 17 con respecto a CNP22 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 595-600, como se muestra en la Fig. 34I), incluyendo aquellas secuencias que tienen una modificación adicional de un resto dirigido al hueso D¹⁰en el extremo N (por ejemplo, SEQ ID NOs: 601-606, como se muestra en la Fig. 34J).

Los constructos adicionales incluyen proteínas de fusión en las que un dominio de Fc N-terminal se fusiona con una variante de CNP53 con una región enlazadora corta Gly3. Una forma alternativa de analizar estos polipéptidos de fusión es que la región enlazadora es Gly3 seguida de los restos de aminoácidos 1-31 de CNP53 (o variantes del mismo); visto de esta manera, la región enlazadora conecta el dominio de Fc con CNP22, y tiene una longitud de 34 restos de aminoácidos. Para Fc-CNP53-A (también denominada “Fc-CNP53wt”) (SEQ ID NOs: 517 (con secuencia señal) y 518 (sin secuencia señal); Fig. 23), la posición 48 de CNP53, correspondiente a la posición 17 de CNP22, se mutó a alanina. Fc-CNP53-AAA (también denominada “Fc-CNP53mut”) (SEQ ID NOs: 519 (con secuencia señal) y 520 (sin secuencia señal); Fig. 23) tiene la misma secuencia que Fc-CNP53-A, con la excepción de que los restos 30 y 31 de CNP53, los dos restos inmediatamente anteriores a CNP22, se mutan a alanina para reducir la probabilidad de escisión proteolítica. En algunos casos, la modificación de la región enlazadora de una fusión Fc-CNP22 para incluir los primeros 31 restos de aminoácidos de CNP53 podría dar como resultado constructos que tengan una potencia y una eficacia aún mayores que NC2st en ensayos de membrana y de células completas in vitro.

Características adicionales del polipéptido

Los polipéptidos para uso en la invención también incluyen cualquier polipéptido que tenga una o más modificaciones postraduccionales, tales como glicosilación (por ejemplo, manosilación y otras formas de glicosilación descritas aquí), acetilación, amidación, bloqueo, formilación, hidroxilación con ácido gamma-carboxiglutámico, metilación, ubiquitinación, fosforilación, modificación con ácido pirrolidona carboxílico, y sulfatación. También se pueden hacer modificaciones artificiales, por ejemplo pegilación.

Producción de ácidos nucleicos y polipéptidos

Los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos para uso en la invención pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Típicamente, un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión deseada se genera usando métodos de clonación molecular, y generalmente se coloca dentro de un vector, tal como un plásmido o virus. El vector se usa para transformar el ácido nucleico en una célula hospedante apropiada para la expresión de la proteína de fusión. Se describen métodos representativos, por ejemplo, en Maniatis et al. (Cold Springs Harbor Laboratory, 1989). Se pueden usar muchos tipos de células como células hospedantes apropiadas, aunque son preferibles las células de mamífero debido a que pueden conferir modificaciones postraduccionales apropiadas. Por ejemplo, se han usado como hospedante células de riñón embrionario humano 293 (HEK293) para expresar las proteínas de fusión de la presente invención, como se describe con más detalle en los Ejemplos a continuación.

Los polipéptidos para uso en la invención se pueden producir en cualquier condición adecuada para efectuar la expresión del polipéptido en la célula hospedante. Dichas condiciones incluyen la selección apropiada de un medio preparado con componentes tales como un amortiguador, bicarbonato y/o HEPES, iones como cloruro, fosfato, calcio, sodio, potasio, magnesio, hierro, fuentes de carbono como azúcares simples, aminoácidos, potencialmente lípidos, nucleótidos, vitaminas y factores de crecimiento como insulina; medios habituales comercialmente disponibles como alfa-MEM, DMEM, Ham's-F12, e IMDM suplementados con 2-4 mM de L-glutamina y suero fetal bovino al 5 %; medios habituales libres de proteínas animales comercialmente disponibles como Hyclone™ SFM4CHO, Sigma CHO DHFR-, Cambrex POWER^™CHO CD suplementados con 2-4 mM de L-glutamina. Estos medios se preparan de forma deseable sin timidina, hipoxantina y L-glicina, para mantener una presión selectiva, permitiendo una expresión estable del producto proteico.

En los Ejemplos se dan los detalles adicionales de la producción de los polipéptidos y ácidos nucleicos.

Aplicaciones terapéuticas

Los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico descritos aquí pueden tener una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas, por ejemplo en los campos de los síndromes neurocutáneos (por ejemplo, neurofibromatosis) o trastornos asociados con la sobreactivación de FGFR3 (por ejemplo, trastornos óseos y de cartílago, por ejemplo acondroplasia, o cánceres, por ejemplo mieloma múltiple), o trastornos óseos o de cartílago (por ejemplo, que no están asociados con la sobreactivación de FGFR3), o trastornos del músculo liso vascular. Además, los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico descritos aquí pueden usarse para cualquier afección o trastorno que se beneficiaría de la elongación del hueso.

Síndromes neurocutáneos

Los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico descritos aquí se pueden usar para tratar cualquier trastorno, enfermedad, u otra anomalía asociada con niveles elevados en sangre y/u orina de pirofosfato inorgánico (PPⁱ), y/o con la sobreactivación de MAP cinasa, tales como los síndromes neurocutáneos. En realizaciones particulares, el polipéptido y moléculas de ácido nucleico se usan para tratar un síndrome neurocutáneo con una manifestación ósea. Los síndromes neurocutáneos ejemplares incluyen neurofibromatosis (por ejemplo, cualquier tipo descrito aquí, tal como tipo I o tipo II); trastorno similar al síndrome de Noonan con cabello anágeno suelto; trastorno similar al síndrome de Noonan con leucemia mielomonocítica juvenil (JMML); esclerosis tuberosa; enfermedad de Sturge-Weber; ataxia telangiectasia; enfermedad de von Hippel-Lindau; incontinencia pigmentaria; síndromes del nevo epidérmico, tal como el nevo sebáceo lineal de Jadassohn; síndrome del carcinoma nevoide de células básales; hipomelanosis de Ito; melanosis neurocutánea; síndrome de Klippel-Ternaunay; y el síndrome de Waardenburg, incluidos los tipos I, II, III, y IV.

Neurofibromatosis

La neurofibromatosis es un síndrome neurocutáneo autosómico dominante caracterizado por un crecimiento o proliferación anormal del tejido nervioso, así como por la producción de tumores (o neurofibromas) o pigmentación anormal (por ejemplo, manchas café con leche). En particular, la neurofibromatosis puede ir acompañada de manifestaciones óseas (por ejemplo, manifestaciones derivadas de la hipofosfatasia), tales como estatura baja, escoliosis, osteomalacia, displasia fibrosa ósea (por ejemplo, una o más lesiones en los extremos de o dentro de uno o más huesos, tal como el fémur, la tibia, o el peroné), pseudoartrosis (por ejemplo, pseudoartrosis tibial), y/o displasia esquelética (por ejemplo, displasia tibial, displasia orbital, y/o displasia del ala del esfenoides).

La neurofibromatosis, o cualquiera de sus manifestaciones o fenotipos, puede tratarse usando las composiciones y métodos descritos aquí. Los ejemplos de tales trastornos, manifestaciones, y fenotipos incluyen el tipo clásico de von Recklinghausen (tipo I), ya sea con tumores del estroma gastrointestinal (es decir, como en la neurofibromatosis intestinal (tipo 3B)) o sin tales tumores; un tipo de neuroma acústico (tipo II); un tipo mixto que combina las características de los tipos I y II con características predominantes, tales como neuromas acústicos bilaterales, meningiomas de la fosa posterior y de las cervicales superiores, y neurofibromas espinales/paraespinales (tipo III, tipo Riccardi o tipo 3A); un tipo atípico que se distingue por la falta de nódulos de Lisch del iris que son característicos del tipo I (tipo VI); neurofibromatosis segmentaria, que es una variante del tipo I que tiene lesiones que afectan un área específica del cuerpo, tal como un solo segmento del cuerpo o un área que cruza la línea media (tipo V); un tipo que tiene sólo los síntomas de manchas café con leche sin otras manifestaciones de neurofibromatosis (tipo VI); neurofibromatosis espinal familiar, que es causada por una mutación en el gen NF 1 de la neurofibromina y se considera una variante distinguible del tipo I; otras variantes del tipo I, tal como síndrome de neurofibromatosisfeocromocitoma-carcinoide duodenal; neurofibromatosis con manifestaciones del síndrome de Noonan, tal como baja estatura, ptosis, hipoplasia del tercio medio facial, cuello palmeado, problemas de aprendizaje, y debilidad muscular; y schwannomatosis, en los que cualquiera de estos trastornos puede incluir o excluir una o más manifestaciones óseas.

Trastornos asociados con la sobreactivación de RAS y/o ERK

Cualquier trastorno, enfermedad, u otra anomalía causada por, o asociada con, la sobreactivación de RAS y/o ERK puede tratarse usando las composiciones y métodos descritos aquí. Estos trastornos, enfermedades, y otras anomalías incluyen el síndrome de Noonan, el síndrome de Costello, el síndrome de Noonan con múltiples lentigos/síndrome LEOPARD, neurofibromatosis tipo 1, NF 1-síndrome de Noonan, fibromatosis gingival hereditaria tipo 1, síndrome de malformación capilar- malformación AV, síndrome de Legius, trastorno similar al síndrome de Noonan con cabello anágeno suelto, trastorno similar al síndrome de Noonan con leucemia mielomonocítica juvenil (JMML), síndrome cardio-facio-cutáneo, o síndrome linfoproliferativo autoinmune, en los que cualquiera de estos trastornos puede incluir o excluir una o más manifestaciones óseas.

Trastornos asociados con la sobreactivación de FGFR3

Cualquier trastorno, enfermedad, u otra anomalía causada por, o asociada con, la sobreactivación de FGFR3, por ejemplo derivada de una mutación de ganancia de función de FGFR3, puede tratarse usando las composiciones y métodos descritos aquí. Estos trastornos, enfermedades, y otras anomalías incluyen trastornos y cánceres de huesos o cartílagos, cada uno de los cuales se describe con más detalle a continuación.

Trastornos óseos o de cartílago asociados con la sobreactivación de FGFR3

Cualquier trastorno, enfermedad, u otra anomalía, por ejemplo displasia esquelética, que afecta a la función, estructura, o crecimiento del hueso o cartílago, puede tratarse usando las composiciones y métodos descritos aquí. En particular, el trastorno puede ser una displasia esquelética asociada con la sobreactivación de FGFR3, tal como acondroplasia, incluyendo acondroplasia severa con retraso en el desarrollo y acantosis; síndrome de Muenke (craneosinostosis coronal de Muenke); síndrome crouzonodermoesquelético; hipocondroplasia; displasia tanatofórica tipo I; y displasia tanatofórica tipo II. Las composiciones para uso de la invención también se pueden usar para tratar trastornos óseos o de cartílago no asociados con la sobreactivación de FGFR3, y estos trastornos se describen con más detalle a continuación.

Cánceres

Cualquier cáncer que sea causado por, o se asocie con, la sobreactivación de FGFR3, puede tratarse usando las composiciones y métodos descritos aquí. Estos cánceres incluyen, por ejemplo, mieloma múltiple, síndromes mieloproliferativos, leucemia (por ejemplo, leucemia de células plasmáticas), linfomas, glioblastoma, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, y cáncer de mama.

Trastornos óseos y de cartílago

Los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico descritos aquí se pueden usar para tratar cualquier trastorno, enfermedad, fenotipo, u otra anomalía que afecte la función, estructura, o crecimiento del hueso o cartílago. Estos trastornos óseos o de cartílago pueden estar asociados, pero no necesariamente tienen que estarlo, con la sobreactivación de FGFR3.

Los trastornos óseos y de cartílago ejemplares incluyen displasia esquelética y cualesquiera otros trastornos, enfermedades, fenotipos, u otras anomalías relacionadas con el hueso o el cartílago, incluida la acondroplasia (por ejemplo, acondroplasia homocigótica o heterocigótica), acondrogénesis, acrodisostosis, displasia acromesomélica, atelosteogénesis, dolor óseo, depósito de cristales de pirofosfato cálcico dihidratado (CPPD), displasia camptomélica, condrodisplasia punctata (por ejemplo, tipo rizomélica de condrodisplasia punctata), disostosis cleidocraneal, fémur corto congénito, craneosinostosis (por ejemplo, síndrome de Muenke, síndrome de Crouzon, síndrome de Apert, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Pfeiffer, o síndrome crouzonodermoesquelético), dactilia (por ejemplo, braquidactilia, camptodactilia, polidactilia, o sindactilia), displasia diastrófica, trastornos dentales (por ejemplo, disminución de la mineralización de los dientes y pérdida prematura de dientes deciduos, tal como a través de aplasia, hipoplasia o displasia del cemento dental), enanismo, displasia disegmentaria, encondromatosis, fibrocondrogénesis, displasia fibrosa, exostosis múltiple hereditaria, hipocondroplasia, hipofosfatasia (HPP) (por ejemplo, HPP infantil, HPP de la niñez, HPP perinatal, HPP del adulto, u odontohipofosfosfatasia), convulsiones relacionadas con HPP, raquitismo hipofosfatémico, mineralización ósea incompleta, síndrome de Jaffe-Lichtenstein, displasia de Kniest, síndrome de Kniest, displasia mesomélica de tipo Langer, síndrome de Marfan, síndrome de McCune-Albright, micromelia, displasia metafisaria (por ejemplo, displasia metafisaria de tipo Jansen), displasia metatrófica, síndrome de Morquio, displasia mesomélica de tipo Nievergelt, neurofibromatosis (por ejemplo, tipo 1, por ejemplo con manifestaciones óseas o sin manifestaciones óseas; tipo 2; o schwannomatosis), osteoartritis, osteocondrodisplasia, osteogénesis imperfecta (por ejemplo, tipo letal perinatal de osteogénesis imperfecta), osteomalacia, osteopetrosis, osteopoiquilosis, osteoporosis, disostosis periférica, síndrome de Reinhardt, síndrome de Roberts, síndrome de Robinow, síndrome de costillas cortas y polidactilia, estatura baja, displasia congénita espondiloepifisaria, displasia espondiloepimetafisaria, o displasia tanatofórica. Los trastornos óseos o de cartílago también incluyen aquellos que pueden ser diagnosticados, por ejemplo, por niveles elevados en sangre y/u orina de uno o más marcadores clínicos relacionados con la hipofosfatasia (por ejemplo, niveles elevados de pirofosfato inorgánico (PPⁱ), fosfoetanolamina (PEA) y/o piridoxal 5'-fosfato (PLP), retraso del crecimiento con una disminución de la longitud de huesos largos (tales como el fémur, la tibia, el húmero, el radio, el cúbito), una disminución de la densidad media del hueso total, o una disminución de la mineralización ósea en huesos tales como el fémur, la tibia, las costillas y metatarsos, y la falange. Sin limitarse tanto, el tratamiento de los trastornos óseos o de cartílago se puede observar mediante uno o más de los siguientes: un aumento de la longitud de huesos largos, un aumento de la mineralización en el hueso y/o los dientes, una corrección del arqueamiento de las piernas, una reducción del dolor óseo, y una reducción de la deposición de cristales de CPPD en las articulaciones.

Displasia esquelética

Las displasias esqueléticas son trastornos óseos o de cartílago caracterizados por baja estatura o enanismo. Las displasias esqueléticas son típicamente congénitas, y pueden incluir numerosas anomalías además de la baja estatura, por ejemplo extremidades y tronco cortos; piernas arqueadas; marcha de pato; malformaciones del cráneo, por ejemplo una cabeza grande, cráneo en forma de hoja de trébol, craneosinostosis (fusión prematura de los huesos en el cráneo), o huesos suturales (conexiones anormales similares a hilos entre los huesos en el cráneo); anomalías de las manos y los pies, por ejemplo polidactilia (dedos adicionales), pulgares del “autostopista”, y uñas de manos y pies anormales; o anomalías en el pecho, por ejemplo tórax en forma de pera o tórax estrecho. También pueden presentarse anomalías no esqueléticas en personas con displasia esquelética, por ejemplo anomalías de los ojos, boca y oídos, tales como cataratas congénitas, miopía, paladar hendido, o sordera; malformaciones cerebrales, tales como hidrocefalia, porencefalia, hidranencefalia, o agenesia del cuerpo calloso; defectos cardíacos, tales como defecto del tabique auricular, conducto arterioso persistente, o transposición de los grandes vasos; retrasos del desarrollo; o retraso mental. Las displasias esqueléticas asociadas con la sobreactivación de FGFR3 incluyen acondroplasia.

Las displasias esqueléticas incluyen acondroplasia (por ejemplo, acondroplasia homocigótica o heterocigótica), acondrogénesis, acrodisostosis, displasia acromesomélica, atelosteogénesis, displasia camptomélica, condrodisplasia punctata (por ejemplo, tipo rizomélico de condrodisplasia punctata), disostosis cleidocraneal, fémur corto congénito, craneosinostosis (por ejemplo, síndrome de Muenke, síndrome de Crouzon, síndrome de Apert, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Pfeiffer, o síndrome crouzonodermoesquelético), dactilia (por ejemplo, braquidactilia, camptodactilia, polidactilia o sindactilia), displasia diastrófica, enanismo, displasia disegmentaria, encondromatosis, fibrocondrogénesis, displasia fibrosa, exostosis múltiple hereditaria, hipocondroplasia, hipofosfatasia (HPP) (por ejemplo, HPP infantil, HPP de la niñez, HPP perinatal, HPP del adulto, u odontohipofosfatasia), raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Jaffe-Lichtenstein, displasia de Kniest, síndrome de Kniest, displasia mesomélica de tipo Langer, síndrome de Marfan, síndrome de McCune-Albright, micromelia, displasia metafisaria (por ejemplo, displasia metafisaria de tipo Jansen), displasia metatrófica, síndrome de Morquio, displasia mesomélica de tipo Nievergelt, neurofibromatosis (por ejemplo, tipo 1, por ejemplo con manifestaciones óseas o sin manifestaciones óseas; tipo 2; o schwannomatosis), osteoartritis, osteocondrodisplasia, osteogénesis imperfecta (por ejemplo, tipo letal perinatal de osteogénesis imperfecta), osteopetrosis, osteopoiquilosis, disostosis periférica, síndrome de Reinhardt, síndrome de Roberts, síndrome de Robinow, síndromes de costillas cortas y polidactilia, baja estatura, displasia espondiloepifisaria congénita, displasia espondiloepimetafisaria, o displasia tanatofórica.

En particular, algunas formas de craneosinostosis son el resultado de mutaciones en uno de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, uno o más de FGFR1, FGFR2, o FGFR3) que causan la activación de la ruta de MAPK. Este es el caso de síndromes de Muenke (craneosinostosis coronal de Muenke), de Crouzon, de Apert, de Jackson-Weiss, de Pfeiffer, y crouzonodermoesquelético, por ejemplo. Existe evidencia genética y bioquímica en la bibliografía científica de que los agentes que pueden prevenir la activación de la MAP-cinasa (ERK 1/2) pueden prevenir la craneosinostosis en modelos animales. En particular, el uso de un inhibidor de MEK1/2 (por ejemplo, U0126), que previene la activación de ERK 1/2, puede prevenir la craneosinostosis en un modelo animal de síndrome de Apert (Shukla et al., Nat. Genet. 39:1145, 2007). Por consiguiente, los compuestos de la presente invención, que pueden prevenir la activación de la ruta de la MAP-cinasa, podrían usarse para tratar estas formas de craneosinostosis.

Acondroplasia

La acondroplasia es una displasia esquelética autosómica dominante que es la causa más común de enanismo en los seres humanos. Su incidencia es aproximadamente 1 de cada 20.000 nacidos vivos. Las manifestaciones esqueléticas incluyen retraso del crecimiento (con una altura promedio de adulto de 123-131 cm (4 pies 1/2 pulgadas - 4 pies 31/2 pulgadas)), deformidades del cráneo, y defectos ortodónticos. Las manifestaciones extraesqueléticas incluyen compresión del cordón cervical (con riesgo de muerte, por ejemplo por apnea central o convulsiones); estenosis espinal (por ejemplo, dolor en las piernas y lumbalgia); hidrocefalia (por ejemplo, que requiere cirugía de derivación cerebral); pérdida de audición por otitis crónica; enfermedad cardiovascular; enfermedad neurológica; mayor frecuencia de accidentes; y obesidad.

Los bebés a menudo se diagnostican al nacer. Mientras que la forma homocigótica suele ser letal, las personas diagnosticadas con la forma heterocigótica tienen una esperanza de vida, en promedio, de 15 años menos que la población normal.

La acondroplasia heterocigótica u homocigótica, o cualquiera de sus manifestaciones o fenotipos, pueden tratarse usando las composiciones y métodos descritos aquí. El tratamiento de cualquiera de las formas puede iniciarse lo antes posible en la vida del paciente, por ejemplo poco después del nacimiento o incluso in utero; esto es particularmente importante para el tratamiento de la forma homocigótica, que suele ser mucho más grave y a menudo es letal si no se trata.

Hipofosfatasia (HPP)

La HPP es un trastorno de mineralización de la matriz que se clasifica históricamente según la edad en el momento del diagnóstico, e incluye (en orden desde la más grave a la menos grave) formas perinatal, infantil, de la niñez, adulta, y odontohipofosfatasia. La forma más grave, la HPP perinatal (letal), se manifiesta como una ausencia casi completa de mineralización ósea in utero, y puede causar la muerte fetal. Algunos neonatos con HPP perinatal pueden sobrevivir durante varios días, pero sufren un aumento del compromiso respiratorio debido a la enfermedad hipoplásica y raquítica del tórax. En la HPP infantil, diagnosticada antes de los 6 meses de edad, el desarrollo postnatal parece normal hasta la aparición de una alimentación deficiente, aumento de peso inadecuado, y aparición de raquitismo. La HPP infantil tiene características radiológicas específicas que muestran un deterioro en la mineralización del esqueleto, a veces con desmineralización esquelética progresiva que conduce a fracturas de costillas y deformidad del tórax. La HPP de la niñez tiene una expresión clínica muy variable. Un síntoma de la HPP infantil es la pérdida prematura de dientes deciduos como resultado de aplasia, hipoplasia o displasia del cemento dental que conecta la raíz del diente con el ligamento periodontal. Otro síntoma de la HPP infantil es el raquitismo, que causa baja estatura y deformidades esqueléticas, tales como piernas arqueadas y muñecas, rodillas y tobillos agrandados como resultado de la metáfisis ensanchada. La HPP del adulto generalmente se presenta durante la mediana edad, pero con frecuencia está precedida por un historial de raquitismo y/o pérdida temprana de dientes, acompañada de buena salud durante la adolescencia y la vida adulta joven. En la HPP del adulto, son frecuentes las fracturas recurrentes del metatarsiano por estrés, y la deposición de dihidrato de pirofosfato de calcio puede causar ataques de artritis y artropatía por pirofosfato. Finalmente, la odontohipofosfatasia se diagnostica cuando la única anomalía clínica es la enfermedad dental, y los estudios radiológicos e incluso las biopsias óseas no revelan signos de raquitismo ni osteomalacia.

Las formas clínicas más graves de HPP generalmente se heredan como rasgos autosómicos recesivos, mostrando los padres de estos pacientes niveles de la actividad de AP en suero inferiores al normal. Para las formas más leves de HPP, es decir, HPP adulta y odontohipofosfatasia, también se ha documentado un patrón de herencia autosómico dominante.

En el esqueleto sano, TNALP es una ectoenzima presente en la superficie de la membrana plasmática de osteoblastos y condrocitos, y en las membranas de sus vesículas de matriz desprendidas (MV), en las que la enzima está particularmente enriquecida. La deposición de hidroxiapatita durante la mineralización ósea normalmente se inicia dentro de la luz de estas MV. La microscopía electrónica ha demostrado que las MV deficientes en TNALP de pacientes con HPP gravemente afectados y ratones Akp2-/- (un modelo de ratón carente de TNALP, véase más abajo) contienen cristales de hidroxiapatita, pero la propagación de cristales extravesiculares parece retardada. Este defecto se atribuye a la acumulación extracelular de PPi, un potente inhibidor de la calcificación, debido a una deficiencia de la actividad de TNALP.

A concentraciones fisiológicas (0,01-0,1 mM), PPi tiene la capacidad de estimular la mineralización. Esto se ha demostrado en fémures de pollos cultivados en órganos, y en las MV de rata aisladas. Sin embargo, a concentraciones por encima de 1 mM, PPi inhibe la formación de minerales de fosfato de calcio mediante el recubrimiento de cristales de hidroxiapatita, evitando así el crecimiento de cristales minerales y la autonucleación proliferativa. Por lo tanto, PPi tiene un doble papel fisiológico: funciona como un promotor de la mineralización a bajas concentraciones, además de como un inhibidor de la mineralización a altas concentraciones. Se ha demostrado que TNALP hidroliza el inhibidor de mineralización PP¡ para facilitar la precipitación y el crecimiento de minerales. Estudios recientes que usan los ratones Akp2-/- han indicado que la función principal de TNALP in vivo es restringir el tamaño del conjunto de PPi extracelular, para permitir una adecuada mineralización esquelética.

La gravedad de la hipofosfatasia depende de la naturaleza de la mutación de TNALP. Se ha descubierto que las mutaciones con cambio de sentido en una variedad de posiciones en TNALP, incluyendo la vecindad del sitio activo de la enzima, la interfaz homodímera, el dominio de corona, el brazo amino-terminal, y el sitio de unión de calcio, afectan su actividad catalítica. Además, también se ha demostrado que las mutaciones de sentido erróneo, sin sentido, de cambio de marco, y del sitio de ayuste conducen a proteínas mutantes aberrantes o a defectos de tráfico intracelular que conducen a una actividad inferior a la normal en la superficie celular. La multitud de mutaciones que causan HPP, y el hecho de que la heterocigosidad compuesta es una aparición común en la HPP, explica la expresividad variable y la penetrancia incompleta que se observa a menudo en esta enfermedad.

El progreso en la forma humana de HPP se ha beneficiado enormemente de la existencia de los ratones carentes de TNALP (Akp2'1'), un modelo animal de HPP. Los ratones A kp 2 - feno

con un esqueleto normalmente mineralizado, pero desarrollan raquitismo radiográficamente aparente a alrededor de los 6 días de edad, y mueren entre los días 12-16, sufriendo hipomineralización esquelética severa y episodios de apnea y convulsiones epilépticas atribuibles a perturbaciones en el metabolismo de PLP (vitamina B6).

Tanto PPi como PLP son sustratos naturales confirmados de TNALP, y se ha demostrado que algunas mutaciones del sitio activo de TNALP tienen diferentes efectos sobre la capacidad de la enzima para metabolizar PPi y PLP. Las anomalías en el metabolismo de PLP explican las convulsiones epilépticas observadas en ratones Akp2-/-, mientras que las anomalías en el metabolismo de PPi explican el fenotipo esquelético en este modelo de ratón de HPP.

En la presente invención, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se administran opcionalmente en una cantidad que es terapéuticamente eficaz para tratar un fenotipo de HPP seleccionado del grupo que consiste en convulsiones relacionadas con HPP, pérdida prematura de dientes deciduos, mineralización ósea incompleta, niveles elevados de PPi en sangre y/u orina, niveles elevados de PEA en sangre y/u orina, niveles elevados de PLP en sangre y/u orina, aumento inadecuado de peso, raquitismo, dolor óseo, deposición de cristales de dihidrato de pirofosfato de calcio, aplasia, hipoplasia, y displasia del cemento dental. En algunas realizaciones, la mineralización incompleta del hueso es una mineralización incompleta del hueso femoral, una mineralización incompleta del hueso tibial, una mineralización incompleta del hueso metatarsiano, o una mineralización incompleta del hueso de la costilla.

Trastornos del músculo liso vascular

Los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico descritos aquí se pueden usar para tratar cualquier trastorno, enfermedad, u otra anomalía que afecte la función, estructura, o crecimiento del músculo liso vascular. Por ejemplo, los péptidos natriuréticos modulan la homeostasis del agua y la sales en el cuerpo, y de esta manera actúan como reguladores de la tensión arterial. Los péptidos que pertenecen a esta familia tienen secuencias de aminoácidos variables, y son segregados a través de diferentes mecanismos por diversos tejidos del cuerpo. Por ejemplo, las células musculares liberan ANP en las cámaras superiores (aurículas) del corazón (miocitos auriculares), y este actúa como un vasodilatador; el BNP es segregado por las cámaras inferiores (ventrículos) del corazón en respuesta al estrés cardíaco; y el CNP ejerce un efecto natrurético y natriurético, y regula el tono vascular, inhibe la migración y la proliferación de las células del músculo liso vascular. Por consiguiente, los polipéptidos y composiciones para uso de la invención se pueden usar para tratar trastornos del músculo liso vascular. Los trastornos del músculo liso vascular ejemplares son hipertensión, restenosis, arteriosclerosis, insuficiencia cardíaca descompensada aguda, insuficiencia cardíaca congestiva, edema cardíaco, nefredema, edema hepático, insuficiencia renal aguda, e insuficiencia renal crónica.

Condiciones para la elongación de hueso

Cualquier afección, trastorno, enfermedad, u otra anomalía que se beneficiaría de la elongación del hueso puede tratarse usando las composiciones y métodos descritos aquí. Estas afecciones, trastornos, enfermedades, y otras anomalías incluyen, sin limitación, un crecimiento óseo insuficiente o defectuoso derivado de fracturas, fallo o insuficiencia renal, mala alimentación, deficiencia de vitaminas, o deficiencia de hormonas. Los sujetos sanos, por ejemplo aquellos sin afecciones, trastornos, enfermedades, u otras anomalías relacionadas con el hueso o el cartílago, también pueden tratarse usando las composiciones y métodos descritos aquí, por ejemplo con fines cosméticos.

Las displasias esqueléticas también se asocian con segmentos más cortos de huesos largos. Las displasias esqueléticas ejemplares incluyen aquellas asociadas con rizomelia (o acortamiento en un segmento proximal de una extremidad, por ejemplo en el húmero o fémur), tales como acondroplasia, atelosteogénesis, fémur corto congénito, displasia diastrófica, hipocondroplasia, tipo Jansen de displasia metafisaria, tipo rizomélico de condrodisplasia punctata, displasia espondiloepifisaria congénita, y displasia tanatofórica; mesomelia (o acortamiento en un segmento medio de una extremidad, por ejemplo en el radio, cúbito, tibia, o peroné), tal como los tipos de Langer y Nievergelt de displasias mesomélicas, síndrome de Robinow y síndrome de Reinhardt; acromelia (o acortamiento en un segmento distal de una extremidad, por ejemplo en metacarpianos o falanges), tales como acrodisostosis, y disostosis periférica; acromesomelia (o acortamiento en los segmentos medio y distal de las extremidades, por ejemplo en los antebrazos y las manos), tales como displasia acromesomélica; micromelia (o acortamiento de toda la extremidad), tales como acondrogénesis, fibrocondrogénesis, displasia disegmentaria, displasia de Kniest, y síndrome de Roberts; o tronco corto, tal como enfermedad de Dyggve-Melchior-Clausen, síndrome de Kniest, displasia metatrófica, síndrome de Morquio, displasia espondiloepimetafisaria, y displasia espondiloepifisaria congénita.

Terapia de combinación

Las combinaciones de los polipéptidos para uso de la invención (por ejemplo, una combinación de un polipéptido de sALP y un polipéptido de NP, tal como una combinación de una proteína de fusión de sALP y una proteína de fusión de NP) son útiles para el tratamiento de cualquier enfermedad o afección descrita aquí. La terapia se puede realizar sola o en combinación con otra terapia (por ejemplo, cirugía, radioterapia, inmunoterapia, o terapia génica). Además, una persona que tenga un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad descrita aquí (por ejemplo, alguien que esté genéticamente predispuesto o alguien que haya tenido previamente un síndrome neurocutáneo) puede recibir tratamiento profiláctico para inhibir o retrasar la formación de la enfermedad. La duración de la terapia de combinación depende del tipo de enfermedad o trastorno que se esté tratando, la edad y el estado del paciente, la etapa y el tipo de enfermedad del paciente, y la forma en que el paciente responde al tratamiento. La terapia puede administrarse en ciclos de inicio y parada que incluyen períodos de descanso para que el cuerpo del paciente tenga la oportunidad de recuperarse de cualquier posible efecto secundario imprevisto.

La administración de una combinación de los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, una combinación de un polipéptido de sALP y un polipéptido de NP) permite la administración de dosis menores de cada polipéptido, proporcionando una eficacia similar y una menor toxicidad en comparación con la administración de cualquiera de los dos polipéptidos individualmente. De manera alternativa, dichas combinaciones dan como resultado una eficacia mejorada en el tratamiento de una enfermedad descrita aquí (por ejemplo, un síndrome neurocutáneo, tal como neurofibromatosis) con eventos adversos similares o reducidos con respecto al agente individual, a dosis moderadas o altas.

Formulación

La formulación dependerá de la vía de administración, así como de otras metas terapéuticas. Los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico descritos aquí se pueden administrar por cualquier vía conocida en la técnica, por ejemplo subcutánea (por ejemplo, mediante inyección subcutánea), por vía intravenosa, oral, nasal, intramuscular, sublingual, intratecal, o intradérmica. A modo de ejemplo, las composiciones farmacéuticas para uso de la invención pueden estar en forma de líquido, disolución, suspensión, píldora, cápsula, comprimido, cápsula de gel, polvo, gel, pomada, crema, nebulizaciones, pulverización, vapor atomizado, aerosol, o fitosoma.

En algunas realizaciones de la invención, las composiciones para uso de la invención pueden administrarse por vía subcutánea. La administración subcutánea es ventajosa porque es relativamente no invasiva y ofrece perfiles farmacocinéticos deseables. Los expertos en la técnica conocen los volúmenes adecuados, y típicamente son 5 ml o menores (por ejemplo, 4 ml, 3,5 ml, 3 ml, 2,7 ml, 2,5 ml, 2,3 ml, 2,2 ml, 2,1 ml, 2,0 ml, 1,9 ml, 1,8 ml, 1,7 ml, 1,5 ml, 1,3 ml, 1,0 ml, 0,7 ml, 0,5 ml, 0,3 ml, 0,1 ml, 0,05 ml, 0,01 ml, o menores). Típicamente, las composiciones para uso de la invención se pueden formular a una concentración entre 1 mg/ml y 500 mg/ml (por ejemplo, entre 10 mg/ml y 300 mg/ml, 20 mg/ml y 120 mg/ml, 40 mg/ml y 200 mg/ml, 30 mg/ml y 150 mg/ml, 40 mg/ml y 100 mg/ml, 50 mg/ml y 80 mg/ml, o 60 mg/ml y 70 mg/ml) para la administración subcutánea.

Para la administración oral, los comprimidos o cápsulas se pueden preparar por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes, cargas, lubricantes, disgregantes, o agentes humectantes. Los comprimidos se pueden recubrir mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, disoluciones, jarabes, o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su constitución con disolución salina u otro vehículo líquido adecuado antes de su uso. Las composiciones para uso de la invención para administración oral también pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos, conservantes, sales amortiguadoras, agentes aromatizantes, colorantes, y edulcorantes, según sea apropiado. Las preparaciones para administración oral también se pueden formular adecuadamente para obtener una liberación controlada de los ingredientes activos.

Los recubrimientos entéricos se pueden usar además en comprimidos de la presente invención para resistir el contacto prolongado con el fluido gástrico fuertemente ácido, pero se disuelven en el entorno intestinal ligeramente ácido o neutro. Sin estar así limitados, el ftalato de acetato de celulosa, Eudragit™ y el ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP) se pueden usar en recubrimientos entéricos de composiciones farmacéuticas de la presente invención. Las concentraciones de ftalato de acetato de celulosa generalmente usadas son 0,5-9,0 % del peso del núcleo. La adición de plastificantes mejora la resistencia al agua de este material de recubrimiento, y las formulaciones que usan tales plastificantes son más eficaces que cuando el ftalato de acetato de celulosa se usa solo. El ftalato de acetato de celulosa es compatible con muchos plastificantes, incluyendo monoglicérido acetilado; glicolato de butil ftalilbutilo; tartrato de dibutilo; ftalato de dietilo; ftalato de dimetilo; glicolato de etil ftaliletilo; glicerina; propilenglicol; triacetina; citrato de triacetina; y tripropionina. También se usa en combinación con otros agentes de recubrimiento tales como etilcelulosa, en preparaciones de liberación controlada de fármacos.

Los compuestos para uso en la invención se pueden administrar en combinación con disolventes, suspensiones o emulsiones farmacéuticamente aceptables, estériles, acuosos o no acuosos. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal, aceite de pescado, y ésteres orgánicos inyectables. Los portadores acuosos incluyen agua, disoluciones de hidroalcohólicas, emulsiones o suspensiones, incluyendo disolución salina y vehículos parenterales médicos amortiguados que incluyen disolución de cloruro de sodio, disolución de dextrosa de Ringer, disolución de dextrosa más cloruro de sodio, disolución de Ringer que contiene lactosa, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos pueden incluir regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse en un sistema de liberación controlada. En algunas realizaciones, se pueden usar materiales poliméricos que incluyen ácido poliláctico, poliortoésteres, copolímeros de bloques anfipáticos reticulados e hidrogeles, ácido polihidroxibutírico y polihidropiranos (véanse también Smolen y Ball, Controlled Drug Bioavailability, Drug product design and performance, 1984, John Wiley & Sons; Ranade y Hollinger, Drug Delivery Systems, pharmacology and toxicology series, 2003, 2a edición, CRC Press). En otra realización, se puede usar una bomba (Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574).

Las composiciones para uso de la invención se podrían formular en forma de un polvo liofilizado usando disoluciones de excipientes apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes.

Además, las células pueden aislarse de un individuo que tiene un síndrome neurocutáneo, un trastorno asociado con la sobreactivación de FGFR3, por ejemplo acondroplasia, un trastorno óseo o de cartílago, o un trastorno del músculo liso vascular, o de un individuo que se beneficiaría de la elongación ósea; transformarse con un ácido nucleico descrito aquí; e introducirse en el individuo afectado (por ejemplo, inyección subcutánea o intravenosa). De manera alternativa, el ácido nucleico puede administrarse directamente al individuo afectado, por ejemplo mediante inyección. El ácido nucleico también puede administrarse a través de un vehículo tal como un liposoma, que puede diseñarse para dirigirlo contra un tipo de célula específico, y que puede manipularse para administrarse a través de diferentes vías.

Los polipéptidos o composiciones de la presente invención también se pueden usar en combinación con al menos otro ingrediente activo para corregir, por ejemplo, un fenotipo de acondroplasia, neurofibromatosis, HPP, o cualquier otro trastorno o afección descrito aquí.

Para la terapia de combinación, dos o más de los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, un polipéptido de sALP y un polipéptido de NP) se formulan en una variedad de formas que son conocidas en la técnica. Por ejemplo, el primer y segundo polipéptidos se pueden formular juntos o por separado. En algunas realizaciones, el primer y segundo polipéptidos se formulan juntos para la administración simultánea o casi simultánea de los polipéptidos. Dichas composiciones coformuladas pueden incluir el polipéptido de sALP y el polipéptido de NP formulados juntos en la misma píldora, cápsula, líquido, etc.

La administración de cada compuesto en formulaciones de liberación controlada es útil cuando el polipéptido de sALP o el polipéptido de NP tiene (i) un índice terapéutico estrecho (por ejemplo, la diferencia entre la concentración plasmática que conduce a efectos secundarios dañinos o reacciones tóxicas y la concentración plasmática que conduce a un efecto terapéutico es pequeña; en general, el índice terapéutico, TI, se define como la relación entre la dosis letal media (LD⁵⁰) y la dosis eficaz media (ED⁵⁰)); (ii) una ventana de absorción estrecha en el tracto gastrointestinal; (iii) una vida biológica media corta, tal como por degradación in vivo por NEP y/o IDE; o (iv) el perfil farmacocinético de cada componente debe modificarse para maximizar la exposición del neoplasma a una cantidad de cada agente, en conjunto, que es terapéuticamente eficaz. Por consiguiente, se puede usar una formulación de liberación sostenida para evitar la dosificación frecuente que puede requerirse para mantener los niveles plasmáticos de ambos agentes a un nivel terapéutico.

Se pueden seguir muchas estrategias para obtener una liberación controlada en la que la tasa de liberación supere la tasa de metabolismo del polipéptido terapéutico. Por ejemplo, la liberación controlada se puede obtener mediante la selección apropiada de los parámetros de formulación y los ingredientes (por ejemplo, composiciones y recubrimientos de liberación controlada apropiados). Los ejemplos incluyen composiciones de comprimidos o cápsulas de unidades individuales o múltiples, disoluciones oleosas, suspensiones, emulsiones, microcápsulas, microesferas, nanopartículas, parches, y liposomas. El mecanismo de liberación de control puede ser tal que el compuesto del polipéptido de sALP se libere primero, seguido del polipéptido de NP, o viceversa. El mecanismo de liberación también puede controlarse de modo que los dos polipéptidos se liberen a intervalos periódicos, la liberación podría ser simultánea o una liberación retardada de uno, cuando se prefiere la liberación de un fármaco particular sobre el otro.

Las formulaciones de liberación controlada pueden incluir un polímero degradable o no degradable, hidrogel, organogel, u otro constructo físico que modifique la bioabsorción, la vida media o la biodegradación del agente. La formulación de liberación controlada puede ser un material que se pinta o se aplica de otro modo en el sitio afectado, ya sea interna o externamente. En un ejemplo, los hidrogeles, tales como los descritos en la patente de EE. UU. n.° 5.626.863, pueden usarse en formulaciones de liberación controlada de composiciones para uso de la invención. Estos polímeros biodegradables se pueden adaptar para degradarse a una tasa deseada y con una cinética deseada seleccionando los monómeros apropiados, el método de preparación y el peso molecular. Las diferencias en la cristalinidad del monómero pueden alterar la tasa de degradación polimérica. Debido a la naturaleza relativamente hidrófoba de la mayoría de los polímeros, la pérdida de masa real puede comenzar con los fragmentos oligoméricos que son lo suficientemente pequeños para ser solubles en agua; por lo tanto, incluso el peso molecular inicial puede influir en la tasa de degradación.

Los polipéptidos formulados individualmente o por separado se pueden empaquetar juntos en forma de kit. Los ejemplos no limitativos incluyen kits que contienen, por ejemplo, dos píldoras, una píldora y un polvo, un supositorio y un líquido en un vial, dos cremas tópicas, entre otros. El kit puede incluir componentes opcionales que ayudan en la administración de la dosis unitaria a los pacientes, tales como viales para reconstituir formas en polvo, jeringas para inyección o administración subcutánea, sistemas de administración IV personalizados, inhaladores, entre otros. Además, el kit de dosis unitaria puede contener instrucciones para la preparación y administración de las composiciones. El kit puede fabricarse como una dosis unitaria de uso único para un sujeto, usos múltiples para un sujeto particular (a una dosis constante, o en la que los polipéptidos individuales pueden variar en potencia a medida que avanza la terapia); o el kit puede contener dosis múltiples adecuadas para la administración a múltiples sujetos (“envase a granel”). Los componentes del kit se pueden envasar en cajas de cartón, envases tipo blíster, botellas, tubos, y similares.

Terapia génica

Los polipéptidos descritos aquí también podrían administrarse ventajosamente a través de terapia génica, en la que un ácido nucleico exógeno que codifica las proteínas se administra a tejidos de interés y se expresan in vivo. Los métodos de terapia génica se discuten, por ejemplo, en Verme et al. (Nature 389:239-242, 1997), Yamamoto et al. (Molecular Therapy 17:S67-S68, 2009), y Yamamoto et al., (J. Bone Miner. Res. 26:135-142, 2011). Se pueden usar sistemas de vectores tanto virales como no virales. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cromosomas artificiales (por ejemplo, cromosomas artificiales de bacterias, de mamíferos, o de levaduras), vectores de virus o fagos provistos de un origen de replicación, y opcionalmente, un promotor para la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido viral, y opcionalmente, un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina o kanamicina en el caso de un plásmido bacteriano, o un gen de resistencia para un vector fúngico. Los vectores se pueden usar in vitro, por ejemplo para la producción de ADN, ARN, o el polipéptido viral, o se pueden usar para transfectar o transformar una célula hospedante, por ejemplo una célula hospedante de mamífero, por ejemplo para la producción del polipéptido viral codificado por el vector. Los vectores también se pueden adaptar para ser usados in vivo, por ejemplo en un método de vacunación o terapia génica.

Los ejemplos de vectores virales adecuados incluyen retrovirales, lentivirales, adenovirales, virales adenoasociados, virus herpéticos, incluyendo el virus del herpes simple, el virus alfa, el virus de la viruela, tal como la viruela del canario y sistemas basados en el virus de la vacuna. Las técnicas de transferencia génica que usan estos virus son conocidas en la técnica. Los vectores de retrovirus, por ejemplo, se pueden usar para integrar de manera estable los ácidos nucleicos en el genoma hospedante. Los vectores de adenovirus defectuosos en la replicación, en cambio, siguen siendo episomales, y por lo tanto permiten la expresión transitoria. Pueden emplearse vectores capaces de impulsar la expresión en células de insectos (por ejemplo, vectores de baculovirus), en células humanas, levaduras, o bacterias, para producir cantidades del

polipéptido o polipéptidos virales codificados por los ácidos nucleicos de la descripción, por ejemplo para uso en vacunas de subunidades o en inmunoensayos. Los métodos de terapia génica útiles incluyen los descritos en el documento WO 06/060641, en la patente de EE. UU. n.° 7.179.903 y el documento WO 01/36620, que usan un vector de adenovirus para dirigir un ácido nucleico de interés a los hepatocitos como células productoras de proteínas.

En un ejemplo adicional, como un vector vivo, se puede usar un vector de adenovirus de simio deficiente en la replicación. Estos virus contienen una supresión de E1, y pueden crecer en líneas celulares que se transforman con un gen E1. Ejemplos de estos vectores de adenovirus de simios de replicación deficiente se describen en la patente de EE. UU. n.° 6.083.716 y en el documento WO 03/046124. Estos vectores pueden manipularse para insertar un ácido nucleico de la descripción, de tal manera que se pueda expresar el o los polipéptidos virales codificados.

Los promotores y otras señales reguladoras de la expresión se pueden seleccionar para que sean compatibles con la célula hospedante para la cual se diseña la expresión. Por ejemplo, los promotores de mamíferos incluyen el promotor de metalotioneína, que puede inducirse en respuesta a metales pesados tal como el cadmio, y el promotor de la pactina. También se pueden usar promotores virales, tales como el promotor del antígeno T grande SV40, el promotor temprano inmediato (1E) del citomegalovirus humano (CMV), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous, el promotor de adenovirus, o un promotor del VPH, en particular la región reguladora ascendente (URR) del VPH. Todos estos promotores, así como promotores adicionales, están bien descritos en la técnica.

Las moléculas de ácido nucleico descritas aquí también pueden administrarse usando sistemas no virales. Por ejemplo, estos sistemas de administración incluyen encapsulamiento en microesferas, poli(lactida-co- glicolida), nanopartículas, y sistemas basados en liposomas. Los sistemas no virales también incluyen técnicas que facilitan el suministro de polinucleótidos “desnudos” (tales como la electroporación, el suministro por “biolística”, y otras diversas técnicas usadas para la introducción de polinucleótidos).

El polinucleótido introducido puede mantenerse de forma estable o transitoria en la célula hospedante. El mantenimiento estable generalmente requiere que el polinucleótido introducido contenga un origen de replicación compatible con la célula hospedante o se integre en un replicón de la célula hospedante, tal como un replicón extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o un cromosoma nuclear o mitocondrial.

Dosis

Se puede administrar a un sujeto cualquier cantidad de un polipéptido para uso en la invención, o una composición farmacéutica para uso de la invención. Las dosis dependerán de muchos factores, incluyendo el modo de administración y la edad del sujeto. Típicamente, la cantidad de la composición para uso de la invención contenida en una sola dosis será una cantidad que sea eficaz para tratar una o más manifestaciones óseas de un síndrome neurocutáneo, sin inducir una toxicidad significativa. Por ejemplo, los polipéptidos descritos aquí se pueden administrar a sujetos en dosis individuales que oscilan, por ejemplo, de 0,01 mg/kg a 500 mg/kg (por ejemplo, de 0,05 mg/kg a 500 mg/kg, de 0,2 mg/kg a 20 mg/kg, de 5 mg/kg a 500 mg/kg, de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg, de 10 mg/kg a 100 mg/kg, de 0,1 mg/kg a 50 mg/kg, 0,5 mg/kg a 25 mg/kg, 1,0 mg/kg a 10 mg/kg, 1,5 mg/kg a 5 mg/kg, o 2,0 mg/kg a 3,0 mg/kg) o de 1 pg/kg a 1,000 pg/kg (por ejemplo, de 5 pg/kg a 1,000 pg/kg, de 1 pg/kg a 750 pg/kg, de 5 pg/kg a 750 pg/kg, de 10 pg/kg a 750 pg/kg, de 1 pg/kg a 500 pg/kg, de 5 pg/kg a 500 pg/kg, de 10 pg/kg a 500 pg/kg, de 1 pg/kg a 100 pg/kg, de 5 pg/kg a 100 pg/kg, de 10 pg/kg a 100 pg/kg, de 1 pg/kg a 50 pg/kg, de 5 pg/kg a 50 pg/kg, o de 10 pg/kg a 50 pg/kg). Las dosis ejemplares incluyen, por ejemplo, 0,01,0,05, 0,1,0,5, 1,2, 2,5, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250, o 500 mg/kg; o 1,2, 2,5, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 900, o 1.000 pg/kg. Para todas las dosis o intervalos mencionados aquí, la expresión “alrededor de” se puede usar para modificar estas dosis en ± 10 % de los valores enumerados o los puntos finales del intervalo.

Las dosis también pueden ajustarse cuando se administran dos o más polipéptidos o composiciones para uso de las invenciones. Las dosis ejemplares incluyen un polipéptido de sALP (por ejemplo, una proteína de fusión de sALP) presente en una dosis entre alrededor de 0,2 mg/kg y alrededor de 20 mg/kg, y un polipéptido de NP (por ejemplo, una proteína de fusión de NP) presente en una dosis de alrededor de 0,5 mg/kg a alrededor de 500 mg/kg. En realizaciones particulares, la dosis de cada polipéptido o composición individual es menor que la dosis terapéutica de un único polipéptido o única composición cuando se administran individualmente.

Las dosis se pueden administrar, por ejemplo, cada hora, cada dos horas, diariamente, cada dos días, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana, cinco veces a la semana, seis veces a la semana, semanalmente, quincenalmente, mensualmente, bimensualmente, o anualmente. De manera alternativamente, se pueden administrar dosis, por ejemplo, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, 10 veces, 11 veces, o 12 veces al día. En realizaciones particulares, el régimen de dosificación es una vez por semana. La duración del régimen de dosificación puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 días, semanas o meses, o incluso para el resto de la vida del sujeto. La cantidad, la frecuencia, y la duración de la dosis serán adaptadas por el médico de acuerdo con factores convencionales tales como la magnitud de la enfermedad y los diferentes parámetros del sujeto.

Los ácidos nucleicos de la descripción se pueden administrar a un paciente, según las formulaciones descritas aquí, en dosis adecuadas para la terapia génica. La cantidad de los ácidos nucleicos administrados dependerá de una serie de factores conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen: la longitud y la naturaleza del ácido nucleico, el vector (por ejemplo, viral o no viral) usado, la actividad del polipéptido codificado, la presencia de excipientes, la vía y el procedimiento de administración, y el estado general y físico del sujeto. Se describen dosis y vías de administración ejemplares, por ejemplo, en Melman et al. (Isr. Med. Assoc. J. 9:143-146, 2007; que describe la inyección intrapeneana de 0,5 mg a 7,5 mg de ADNc humano en un plásmido para tratar la disfunción eréctil), Powell et al. (Circulation 118:58-65, 2008; que describe la inyección intramuscular de 0,4 mg a 4,0 mg de un plásmido de factor de crecimiento de hepatocitos para tratar la isquemia crítica de las extremidades, Waddill et al. (AJR Am. J. Roentgenol. 169:63-67, 1997; que describe la inyección intratumoral guiada por TC de 0,01 mg a 0,25 mg de ADN plasmídico que codifica un antígeno de MHC para tratar el melanoma), Kastrup et al. (J. Am. Coll. Cardiol. 45:982-988, 2005; que describe la inyección intramiocárdica de 0,5 mg de un plásmido de VEGF para tratar la angina de pecho grave), y Romero et al. (Hum. Gene. Ther. 15:1065-1076, 2004; que describe la inyección intramuscular de 0,2 mg a 0,6 mg de un plásmido para tratar la distrofia muscular de Duchenne/Becker).

En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos de la descripción se pueden administrar al sujeto en una dosis en el intervalo de, por ejemplo, 0,01 mg a 100 mg (por ejemplo, de 0,05 mg a 50 mg, de 0,1 mg a 10 mg, de 0,3 mg a 3 mg, o alrededor de 1 mg) de ácido nucleico. El volumen total en el que se puede administrar el ácido nucleico dependerá de su concentración, y puede variar, por ejemplo, de 1 pl a 10 ml (por ejemplo de 10 pl a 1 ml, 50 pl a 500 pl, 70 pl a 200 pl, 90 pl a 150 pl, o 100 pl a 120 pl).

Los ácidos nucleicos se pueden administrar, por ejemplo, cada hora, cada dos horas, diariamente, cada dos días, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana, cinco veces a la semana, seis veces a la semana, semanalmente, quincenalmente, mensualmente, bimensualmente, o anualmente. Alternativamente, los ácidos nucleicos se pueden administrar, por ejemplo, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, 10 veces, 11 veces, o 12 veces al día. La duración del régimen de dosificación puede ser, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 días, semanas, o meses, o incluso para el resto de la vida del sujeto.

Esto es una guía, ya que la dosis real debe ser seleccionada cuidadosamente y titulada por un médico o nutricionista tratante basándose en los factores clínicos exclusivos para cada sujeto. La dosis periódica óptima se determinará por los procedimientos conocidos en la técnica, y se verá afectada por factores tales como la edad del sujeto, como se indicó anteriormente, y otros factores clínicamente pertinentes. Además, los sujetos pueden estar tomando medicamentos para otras enfermedades o afecciones. Los otros medicamentos pueden continuarse durante el tiempo en que se administra un polipéptido o ácido nucleico al sujeto, pero en tales casos es recomendable comenzar con dosis bajas para determinar si se experimentan efectos secundarios adversos.

E J E M P L O S

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de ilustrar la invención.

E je m p lo 1. C a ra c te r iza c ió n d e o s te o b la s to s en ra to n e s q u e ca re c e n d e NF1

Para determinar el efecto de NF1 sobre la mineralización de la matriz ósea, se desarrollaron y caracterizaron ratones que carecían de NF1 en células osteocondroprogenitoras. Estos ratones mostraron defectos de displasia esquelética similares a los pacientes con neurofibromatosis tipo I, en los que estos defectos incluían escoliosis progresiva y cifosis, arqueamiento tibial, y anomalías en la formación del cráneo y de la pared torácica anterior. En particular, los osteoblastos NF1col2-/- segregaron niveles elevados de (PPi) en comparación con los osteoblastos de ratones de tipo salvaje (Fig. 1A). Las células estromales adherentes de médula ósea (BMSC) extraídas de ratones adultos NF1col2-/- y cultivadas in vitro en un medio osteogénico forman menos nodulos positivos a la fosfatasa alcalina (AP) y menos nodulos mineralizados (positivos para rojo de alizarina) en comparación con BMSC extraídas de ratones de tipo salvaje, que traen consigo un aumento de la cantidad de PPi liberado en el medio durante 24 horas. La acumulación de PPi previene la correcta mineralización de la matriz ósea, y probablemente contribuye, al menos en parte, a los defectos observados en los ratones NF1col2-/-. Por lo tanto, los compuestos que reducen la acumulación de PPi, tales como sALP o un análogo de sALP, podrían ser útiles para tratar NF1.

Además, los osteoblastos NF1col2-/- expresaron niveles elevados de ARNm para el gen de la anquilosis progresiva (Ank) en comparación con los osteoblastos de ratones de tipo salvaje (Fig. 1B). El tratamiento con un inhibidor de la MEK1/MEK2 cinasa de especificidad dual (U0126) proporcionó niveles reducidos de expresión de ARNm de Ank en osteoblastos NF1col2-/- en comparación con el vehículo, y estos niveles observados fueron similares a los de los osteoblastos de tipo salvaje (Fig. 1B, segunda y tercera barras). Por lo tanto, los compuestos que inhiben una ruta de cinasa, tal como NP o un análogo de NP, podrían ser útiles para tratar NF1.

En conjunto, estos datos sugieren que un polipéptido de sALP solo, un polipéptido de NP solo, o la combinación de un polipéptido de sALP y un polipéptido de NP, podrían ser útiles para tratar cualquier síndrome neurocutáneo con manifestaciones óseas, tal como neurofibromatosis, o cualquier otro trastorno descrito aquí.

E je m p lo 2. T e ra p ia d e c o m b in a c ió n p ara el tra ta m ie n to d e la n e u ro fib ro m a to s is

La Fig. 2 proporciona un modelo de trabajo hipotético para la mineralización defectuosa de la matriz ósea en ratones NF1 col²-/-, que puede incluir múltiples desequilibrios (por ejemplo, aumento de PPi, o la sobreactivación de una o más cinasas, tal como Ras o ERK) que contribuyen a la enfermedad. Sin querer limitarse por la teoría, la acumulación de PPi podría minimizarse usando cualquiera de las composiciones y métodos descritos aquí, incluyendo una fosfatasa alcalina soluble (sALP) o un análogo de sALP (véase, por ejemplo, el polipéptido de SEQ ID NO: 1204). Además, la sobreactivación de una o más cinasas podría controlarse usando cualquiera de las composiciones y método descritos aquí, incluyendo un NP o análogo de NP. Tal como se describe aquí, se sabe que la producción intracelular de cGMP resultante de la activación de NPR-B inhibe la ruta de la MAP-cinasa. Por lo tanto, un NP o análogo de NP, que podría activar la ruta de señalización de NPR-B, se puede usar para el tratamiento de síndromes neurocutáneos, tal como la neurofibromatosis. Por consiguiente, la combinación de una sALP o análogo de sALP (por ejemplo, un polipéptido de sALP) con un NP o análogo de NP (por ejemplo, un polipéptido de NP) podría ser particularmente útil para tratar tales enfermedades.

E je m p lo 3. E fec to s in vitro e in vivo d e s T N A L P -F c D 10 s o b re el fe n o tip o N F 1col2-/"

Para evaluar el efecto de los polipéptidos de sALP en el fenotipo NF1, cultivos de osteoblastos de ratones NF1coi2'/' se trataron con proteína morfogenética ósea 2 (BMP2) o con el polipéptido de fusión de sALP de sTNALP-FcD¹⁰(SEQ ID NO: 1204).

Los osteoblastos tanto de tipo salvaje como NF1col2-/- se trataron con concentraciones crecientes de BMP2 humano recombinante (rhBMP2, Fig. 3A). En los osteoblastos NF1col2-/-, rhBMP2 rescató el defecto de diferenciación, como se evidencia por una mayor presencia de fosfatasa alcalina al aumentar la dosis de rhBMP2 (Fig. 3A, segunda fila). Sin embargo, no se observó una mayor mineralización, como lo demuestra la falta de deposición de calcio (como lo indica la falta de tinción con rojo de alizarina S) (Fig. 3A, cuarta fila).

En cambio, el tratamiento con sTNALP-FcD¹⁰rescató el defecto de mineralización que está presente en los osteoblastos NF1col2-/- (Fig. 3B). Las dosis crecientes de sTNALP-FcD¹⁰proporcionaron una mayor deposición de calcio de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3B, parte inferior, y Fig. 3C).

Además, la supresión dirigida in vitrodel gen NF1 en las BMSC produjo una reducción significativa de la mineralización, que se rescata al menos parcialmente mediante el tratamiento con 0,5 pg/ml de sTNALP-FcD¹⁰(Fig. 3D).

También se realizaron experimentos in vivo con sTNALP-FcD¹⁰. Los ratones NF1col2-/- se trataron desde el día 1 hasta el día 18 con 8,2 mg/kg de sTNALP-FcD¹⁰. El tratamiento de los ratones con sTNALP-FcD¹⁰incrementó el déficit de densidad mineral ósea en ratones NF1col2-/- en comparación con el vehículo (* p < 0,5), según lo determinado por la relación entre el volumen óseo mineralizado (BV) y el volumen óseo total (TV) (Fig. 3E).

Por consiguiente, cualquier polipéptido de sALP descrito aquí, ya sea solo o en combinación con cualquier polipéptido de NP descrito aquí, podría ser particularmente útil para tratar la neurofibromatosis o cualquier síndrome neurocutáneo con manifestaciones óseas.

E je m p lo 4. E fec to s in vitro e in vivo d e N C 2 -K G A N K K en el fe n o tip o N F 1 col2-/-Para evaluar el efecto de los polipéptidos de NP en el fenotipo NF1, se evaluaron los niveles de expresión del gen NPR-B en ratones NF1col2-/- (Fig. 4A). El NPR-B se expresó en las BMSC en todas las etapas de diferenciación, en las que la falta de expresión de NF1 no afectó la expresión de NPR-B.

Se realizaron experimentos adicionales en los que se trataron cultivos de condrocitos de ratones NF1col2-/- con el polipéptido de fusión NP de NC2-KGANKK (SEQ ID NO: 512). Los condrocitos primarios de costilla de ratones P0 se obtuvieron de ratones de tipo salvaje y ratones NF1col2-/-, y se trataron durante 30 minutos con concentraciones crecientes de NC2-KGANKK. Sin ningún tratamiento, se observaron niveles elevados de ERK fosforilada (p-ERK) en los condrocitos NF1col2-/-, en comparación con los niveles en los condrocitos de tipo salvaje (Fig. 4B). Después del tratamiento con NC2-KGANKK, se observaron niveles reducidos de p-ERK en los condrocitos NF1col2-/-. Estos resultados apoyan el uso de polipéptidos de NP, tal como NC2-KGANKK, para inhibir la sobreactivación de una o más cinasas, tal como ERK.

También se llevaron a cabo experimentos in vivo. Los ratones NF1col2-/- se trataron con NC2B (SEQ ID NO: 504). El tratamiento rescató al menos parcialmente el defecto de longitud corporal en ratones NF1col2-/- (Fig. 4C), el defecto de crecimiento óseo en ratones NF1col2-/- (Fig. 4D), y los defectos de la zona de condrocitos proliferativos e hipertróficos en ratones NF1col2-/- (Fig. 4E).

Por consiguiente, cualquier polipéptido de NP descrito aquí, ya sea solo o en combinación con un polipéptido de sALP descrito aquí, podría ser particularmente útil para tratar trastornos asociados con la sobreactivación de una o más cinasas, tales como neurofibromatosis o cualquier síndrome neurocutáneo con manifestaciones óseas.

R e fe re n c ia s

Aquí se hace referencia a los siguientes documentos.

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O tras re a liza c io n e s

Aunque la invención se ha descrito con respecto a realizaciones específicas, debe entenderse que la invención, tal como se reivindica, no debe limitarse indebidamente a dichas realizaciones específicas. De hecho, diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son evidentes para los expertos en la técnica están destinadas a estar dentro del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones.

Claims

R E IV IN D IC A C IO N E S

1. Una composición farmacéutica, que comprende:

(a)

(i) un polipéptido que comprende la estructura A-sALP-B,

en la que sALP es el dominio extracelular de una fosfatasa alcalina,

A está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y

B está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido,

en la que la secuencia de aminoácidos de dicha sALP comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1205;

(ii) un polipéptido que comprende la estructura C-sALP-D-Fc-E o la estructura C-Fc-D-sALP-E; y

C está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido,

D está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido,

en la que, opcionalmente, D es dos restos de aminoácidos y/o leucina-lisina, y

E está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; o

(iii) un polipéptido que comprende la estructura C-sALP-D-Fc-G-ln-H o la estructura C-Fc-D-sALP-G-ln-H, en las que: C está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido,

D está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido,

G está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido,

H está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, e

I es un ácido aspártico o un ácido glutámico, y n = 10 a 16; y

(b) un excipiente farmacéuticamente aceptable;

para uso en un método de tratamiento de una o más manifestaciones óseas de un síndrome neurocutáneo en un sujeto.

2. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1, en la que:

(a) A y/o B están ausentes,

(b) A o B comprende una región cristalizable de fragmento (Fc); en la que opcionalmente,

(i) dicha Fc comprende un dominio Ch², un dominio Ch3, y una región bisagra;

(ii) dicha Fc es un dominio constante de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en lgG-1, lgG-2, lgG-3, e lgG-4; y/o

(iii) dicha Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85 %, 95 %, 99 %, o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 401; o

(c) A o B comprende In, en la que I es un ácido aspártico o un ácido glutámico y n = 10 a 16.

3. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1, en la que el polipéptido comprende la estructura C-sALP-D-Fc-G-In-H o la estructura C-Fc-D-sALP-G-In-H, en las que:

(a) C y/o H están ausentes;

(b) G es dos restos de aminoácidos, en las que opcionalmente G es ácido aspártico-isoleucina;

(c) I es ácido aspártico y n = 10; y/o

(d) D es dos aminoácidos, en las que, opcionalmente, D es leucina-lisina.

4. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 3, en la que:

(a) C y H están ausentes

(b) G es ácido aspártico-isoleucina

(c) I es ácido aspártico y n = 10; y

(d) D es leucina-lisina.

5. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en la que:

(a) dicho polipéptido está en forma dimérica;

(b) dicho polipéptido está glicosilado o pegilado;

(c) dicha composición farmacéutica se formula para la administración a una dosis de alrededor de 0,2 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg de dicho polipéptido;

(d) dicha composición farmacéutica se formula para la administración a una dosis de alrededor de 0,5 mg/kg a alrededor de 500 mg/kg de dicho polipéptido;

(e) dicha composición farmacéutica se formula para la administración a una dosis de alrededor de 10 pg/kg a alrededor de 1.000 pg/kg de dicho polipéptido;

(f) dicha composición farmacéutica se formula para administración subcutánea;

(g) dicha composición farmacéutica se formula para administración una, dos, o tres veces por semana;

(h) dicho sujeto es un ser humano; y/o

(i) dicho síndrome neurocutáneo es la neurofibromatosis tipo I.

6. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que dicha composición comprende además un segundo polipéptido, en la que dicho segundo polipéptido comprende: (a) un polipéptido que comprende la estructura V-NP-W; y

en la que NP es un péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (NPR-B),

V está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y W está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y

en la que dicho NP comprende la estructura: [extensión N-terminal]-[segmento corto]-[dominio de anillo]-[extensión C-terminal], y en la que dicho dominio de anillo se selecciona del grupo de restos de aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126 y en la que el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, Ser, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, o Asp, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y dicho segmento corto y dicho dominio de anillo comprenden juntos la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 13-30, 119-122, 126, o 156 161; o

(b) un polipéptido comprende la estructura X-Fc-Y-NP-Z o la estructura X-NP-Y-Fc-Z,

NP es un péptido natriurético que es un agonista del receptor del péptido natriurético B (NPR-B), y

cada uno de X, Y, y Z está, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido.

7. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 6, en la que:

(a) dicho primer polipéptido y dicho segundo polipéptido se formulan para la administración dentro de diez días, cinco días, o veinticuatro horas uno del otro;

(b) dicho primer polipéptido y dicho segundo polipéptido se formulan para administración subcutánea;

(c) dicho primer polipéptido y dicho segundo polipéptido se formulan juntos en una composición, o cada uno por separado en una composición;

(d) dicha composición está liofilizada;

(e) la secuencia de aminoácidos de dicho primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1204, y en la que la secuencia de aminoácidos de dicho segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 504, 512, 530, o 572;

(f) dicho primer polipéptido se formula para la administración a una dosis de alrededor de 0,2 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg, y dicho segundo polipéptido se formula para la administración a una dosis de alrededor de 0,5 mg/kg a alrededor de 500 mg/kg;

(g) dicho primer polipéptido se formula para la administración a una dosis de alrededor de 0,2 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg, y dicho segundo polipéptido se formula para la administración a una dosis de alrededor de 10 pg/kg a alrededor de 1.000 pg/kg;

(h) dicho primer polipéptido y dicho segundo polipéptido se formulan para administración una vez, dos veces, o tres veces por semana.

8. Una composición farmacéutica, que comprende:

(a)

(i) un polipéptido que comprende la estructura V-NP-W; y

V está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, y

W está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido, en la que dicho NP comprende la estructura: [extensión N-terminal]-[segmento corto]-[dominio de anillo]-[extensión C-terminal], y en la que dicho dominio de anillo se selecciona del grupo de restos de aminoácidos 6-22 de SEQ ID NO: 126 y en la que el aminoácido en la posición 17 de SEQ ID NO: 126 es Phe, Leu, Ile, Thr, Val, Ala, Ser, Glu, Arg, Tyr, Cys, Pro, o Asp, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y dicho segmento corto y dicho dominio de anillo comprenden juntos la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 13-30, 119-122, 126, o 156-161; o

(ii) un polipéptido que comprende la estructura X-Fc-Y-NP-Z o la estructura X-NP-Y-Fc-Z,

cada uno de X, Y y Z está, independientemente, ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; y

(b) un excipiente farmacéuticamente aceptable;

9. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 8, en la que:

(a) dicho segmento corto y dicho dominio de anillo juntos comprenden la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 13-30, 119-122, 126, o 156-161;

(b) la secuencia de aminoácidos de dicho segmento corto consiste en restos de aminoácidos 1-5, 2-5, 3-5, 4-5, o 5 de SEq ID NO: 4, restos de aminoácidos 1-10 de SEQ ID NO: 17, restos de aminoácidos 1-5 de s Eq iD NO: 19, restos de aminoácidos 1-3 de SEQ ID NO: 20, restos de aminoácidos 1-5 de SEQ ID NO: 21 o restos de aminoácidos 1-6 de SEQ ID NO: 29;

(c) la secuencia de aminoácidos de dicha extensión N-terminal comprende restos de aminoácidos 1-31 o 17-31 de SEQ ID NO: 11;

(d) la secuencia de aminoácidos de dicha extensión N-terminal comprende KGANKK (SEQ ID NO: 314) o KGANQK (SEQ ID NO: 315);

(e) la extensión N-terminal, segmento corto, y dominio de anillo juntos incluyen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11;

(f) dicha extensión C-terminal comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 117 o 118, o comprende restos de aminoácidos 23-37 seleccionados de una cualquiera de SEQ ID NOs: 101-116;

(g) la secuencia de aminoácidos de dicho NP consiste en SEQ ID NOs: 4 u 11, o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 31-94, o un fragmento de las mismas que comprende al menos un dominio de anillo, o la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 13-29, 100-116, 119-125, 127-233, o 1001-1155; (h) V y/o W están ausentes, comprenden un resto dirigido al hueso, no comprenden un resto dirigido al hueso, comprenden una región Fc, o comprenden una región rica en glicina, en la que, opcionalmente, la región rica en glicina consiste en uno o más restos de glicina y uno o más restos de serina.

10. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 9, en la que:

(a) dicha Fc comprende un dominio Ch², un dominio Ch3, y una región bisagra, o en la que dicha Fc es un dominio constante de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en lgG-1, lgG-2, lgG-3, e lgG-4;

(b) la secuencia de aminoácidos de dicha Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85 %, 95 %, 99 %, o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 401;

(c) la secuencia de aminoácidos de V o W comprende [(Gly)m(Ser)]n(Gly)p o (Gly)p[(Ser)(Gly)m]n, y en la que cada uno de m, n, y p está, independientemente, entre 0 y 20, en la que, opcionalmente, m está entre 1 y 6; n está entre 1 y 10; y p está entre 0 y 4; y/o en la que las combinaciones de m, n, y p se seleccionan de una sola fila de la Tabla 2, o en la que la secuencia de aminoácidos de V o W comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 301-391; y/o

(d) dicho resto dirigido al hueso comprende seis o diez restos ácidos consecutivos, en el que, opcionalmente, dichos restos ácidos son ácido aspártico o ácido glutámico; en el que preferiblemente, dicho resto dirigido al hueso comprende E6, E¹⁰, D6, o D¹⁰.

11. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 10, en la que dicha NP comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 17-29, 31 -40, 42-94, 101-116, 119-122, 128-161, or 163-233, dicho V o W comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 304-313, 322-333, o 337-391; la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 501 -608; o el polipéptido comprende la estructura V-NP o NP-W.

12. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 10 u 11, en la que:

(a) Y comprende una región rica en glicina, en la que, opcionalmente, la secuencia de aminoácidos de Y consiste en una o más glicinas y una o más serinas, y/o comprende [(Gly)m(Ser)]n(Gly)p o (Gly)p[(Ser)(Gly)m]n, y en la que cada uno de m, n, y p está, independientemente, entre 0 y 20;

(b) X está ausente, Z está ausente, o tanto X como Z están ausentes;

(c) X, Y o Z comprende un resto dirigido al hueso, en el que, opcionalmente, dicho resto dirigido al hueso:

(i) comprende seis o diez restos ácidos consecutivos, en el que, opcionalmente, dichos restos ácidos son ácido aspártico o ácido glutámico; o

(ii) comprende E6, E¹⁰, D6, o D¹⁰; o

(d) X, Y o Z comprenden una secuencia de escisión de catepsina, en la que, opcionalmente, dicha secuencia de escisión de catepsina comprende una secuencia de escisión de catepsina K.

13. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que una o más manifestaciones óseas se c a ra c te r iza n p or una o más displasias esqueléticas, tales como una displasia esquelética de huesos largos; en las que, opcionalmente, el hueso largo es un fémur, una tibia, un húmero, un radio, o un cúbito.

14. La composición farmacéutica para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la que el sujeto tiene una pseudoartrosis.

15. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -14, en la que el sujeto tiene síndrome de Noonan, síndrome de Costello, síndrome de Noonan con múltiples lentigos/síndrome LEOPARD, neurofibromatosis tipo 1, fibromatosis gingival hereditaria tipo 1, síndrome NFI-Noonan, síndrome de malformación capilar-malformación AV, síndrome de Legius, trastorno similar al síndrome de Noonan con cabello anágeno suelto, trastorno similar al síndrome de Noonan con leucemia mielomonocítica juvenil (JMML), síndrome cardio-facio-cutáneo, síndrome linfoproliferativo autoinmune, acondroplasia, craneosinostosis, acondroplasia, acondroplasia homocigota, acondroplasia heterocigota, acondrogénesis, acrodisostosis, displasia acromesomélica, atelosteogénesis, displasia camptomélica, condrodisplasia punctata, tipo rizomélico de condrodisplasia punctata, disostosis cleidocraneal, fémur corto congénito, craneosinostosis, síndrome de Muenke, síndrome de Crouzon, síndrome de Apert, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Pfeiffer, síndrome crouzonodermoesquelético, dactilia, braquidactilia, camptodactilia, polidactilia, sindactilia, displasia diastrófica, enanismo, displasia disegmentaria, encondromatosis, fibrocondrogénesis, displasia fibrosa, exostosis múltiple hereditaria, hipocondroplasia, hipofosfatasia, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Jaffe-Lichtenstein, displasia de Kniest, síndrome de Kniest, displasia mesomélica de tipo Langer, síndrome de Marfan, síndrome de McCune-Albright, micromelia, displasia metafisaria, displasia metafisaria de tipo Jansen, displasia metatrófica, síndrome de Morquio, displasia mesomélica de tipo Nievergelt, neurofibromatosis tipo 1, neurofibromatosis tipo 2, schwannomatosis, osteoartritis, osteocondrodisplasia, osteogénesis imperfecta, tipo letal perinatal de osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoiquilosis, disostosis periférica, síndrome de Reinhardt, síndrome de Roberts, síndrome de Robinow, síndromes de polidactilia de costillas cortas, baja estatura, displasia espondiloepifisaria congénita, displasia espondiloepimetafisaria, o displasia tanatofórica.