ES2634096T3 - Un proceso para realizar un dispositivo de recolección y transferencia de muestras para biología molecular - Google Patents

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ES2634096T3 ES12703153.2T ES12703153T ES2634096T3 ES 2634096 T3 ES2634096 T3 ES 2634096T3 ES 12703153 T ES12703153 T ES 12703153T ES 2634096 T3 ES2634096 T3 ES 2634096T3
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Abstract

Un proceso para producir un hisopo flocado de recolección y de transferencia de muestras de ADN o ARN para biología molecular, comprendiendo el hisopo flocado como mínimo: un cuerpo de soporte (2), que tiene al menos una primera porción (2a) y una pluralidad de fibras (6) fijadas y dispuestas sobre la primera porción (2a) del cuerpo de soporte (2) por floculación, de modo que definan una porción flocada de recolección (3) destinada a recolectar una cantidad de la muestra para biología molecular sobre dicha porción de recolección (3), en donde las fibras (6) están dispuestas por floculación de manera ordenada y sustancialmente perpendicular al cuerpo de soporte (2); comprendiendo el proceso al menos una etapa de pretratamiento de la pluralidad de fibras (6) con un tensioactivo, y una etapa de secado de las fibras tras la etapa de pretratamiento de las fibras, realizándose la etapa de pretratamiento de la pluralidad de fibras (6) con un agente tensioactivo después de aplicar por floculación las fibras sobre el cuerpo de soporte (2) y/o antes de aplicar por floculación las fibras (6) sobre el cuerpo (2) y/o en donde el tensioactivo se añade a las fibras (6) durante la producción de las fibras (6).

Description

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DESCRIPCION
Un proceso para realizar un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular
La presente invencion se refiere a un proceso para realizar un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular.
La invencion se refiere tambien a un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, que se realice usando el proceso y a un metodo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular usando el dispositivo.
La invencion puede aplicarse, por ejemplo, a la recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, tales como ADN, ARN y celulas que contengan ADN y ARN. La invencion puede aplicarse adicionalmente a la recoleccion y transferencia de otros tipos de analitos o muestras biologicas o muestras de origen biologico. La tecnica anterior incluye diversos tipos de dispositivo de recoleccion y transferencia de analitos, tales como sustancias organicas o biologicas, por ejemplo, para someter posteriormente las mismas a examenes de laboratorio de tipo analltico o de diagnostico. La tecnica anterior describe especialmente el uso de dispositivos colectores convencionales, que comprenden un cuerpo de soporte alargado y una fibra alargada, generalmente de algodon, enrollada alrededor de un extremo del cuerpo, hasta definir una porcion de recoleccion destinada a absorber internamente las muestras a recolectar.
Estos dispositivos presentan diversos inconvenientes, entre los que se encuentra el hecho de que las muestras biologicas tienden a quedar retenidas dentro de la porcion de recoleccion, y por lo tanto son diflciles de extraer de la porcion de recoleccion cuando sea necesario. Por lo tanto, la cantidad de muestra que puede recuperarse de la muestra inicialmente disponible a menudo es muy limitada, lo que da lugar a numerosos inconvenientes. Como en algunos casos la cantidad real de sustancia recoleccion puede ser bastante limitada en primer lugar, es de fundamental importancia poder recolectar el mayor porcentaje posible de la sustancia inicialmente recoleccion. Para superar este inconveniente se han proporcionado dispositivos, conocidos convencionalmente como hisopos flocados, que comprenden un cuerpo de soporte alargado y una pluralidad de fibras flocadas en un extremo del cuerpo de soporte, de modo que definan una porcion de recoleccion para los analitos o muestras biologicas. La floculacion de las fibras sobre el cuerpo puede lograrse mediante floculacion en un campo magnetico, y pueden adherirse al cuerpo de soporte con un pegamento apropiado o incluso sin el uso de adhesivos. Las fibras pueden disponerse de manera ordenada y sustancialmente perpendiculares al cuerpo de soporte, de manera que definan una configuracion optima para la recoleccion, el transporte y la liberation selectiva de las muestras recolectadas. Este tipo de dispositivo se conoce, por ejemplo, a partir de la patente EP 1608268 B1, perteneciente a los presentes solicitantes. Gracias a la disposition ordenada de las fibras en paralelo al cuerpo de soporte, estos dispositivos pueden absorber cantidades de analitos o muestras que son al menos equivalentes a los dispositivos convencionales, como los descritos anteriormente, pero presentan la gran ventaja de que permiten la liberacion, de cantidades mucho mayores de analitos o muestras desde la porcion recoleccion, en el momento apropiado, pudiendo recuperarse facilmente hasta un 80 % o incluso mas de la muestra original. Los solicitantes han observado que, aunque los dispositivos flocados anteriormente descritos pueden usarse tambien ventajosamente para la recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, tales como ADN, ARN y celulas que contengan estas muestras, las cantidades de ADN y ARN liberadas por el dispositivo y que pueden utilizarse en la practica para realizar operaciones de biologla molecular, tales como polimerizacion o amplification, a veces son insatisfactorias o insuficientes, con las consecuentes dificultades en este caso a la hora de llevar a cabo los procesos sobre las muestras.
A partir del documento de patente US2007/0208274 se conoce adicionalmente un sistema de recoleccion de muestras, que incluye un vial y un baston de recoleccion con un mango alargado y una almohadilla absorbente. A partir del documento de patente WO2008/131033 se conoce adicionalmente un colector, destinado en particular a ensayos de abuso de drogas, que incluye un elemento colector que recibe una muestra de fluido corporal y que puede ser una almohadilla absorbente, tratada con un tensioactivo. A partir del documento de patente WO2009/136892 se conoce adicionalmente un sistema de micromatriz, que incluye una micromatriz formada sobre una superficie plana y una camara de incubation, formada alrededor de la micromatriz.
El objetivo principal de la presente invencion es resolver uno o mas de los problemas observados en la tecnica anterior. Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo y un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, que permitan extraer del dispositivo de recoleccion una mayor cantidad de muestras para biologla molecular, a utilizar en operaciones de biologla molecular, con respecto a los dispositivos conocidos. Un objetivo adicional de la presente invencion es proporcionar un metodo y un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, que permitan extraer del dispositivo de recoleccion el mayor porcentaje posible de ADN o ARN recolectado inicialmente por el dispositivo, de la mejor forma y en las mejores condiciones para todos los usos posteriores. Un objetivo adicional de la invencion es proporcionar un metodo y un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, que permita conservar eficazmente la integridad de las muestras de ADN o ARN recolectadas con el dispositivo. Un objetivo adicional de la presente invencion es proporcionar un metodo y un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para
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biologla molecular, que permitan reducir el numero de ciclos necesarios para realizar las reacciones de polimerizacion o las reacciones en cadena de la polimerasa, sobre las muestras de ADN o ARN liberadas por el dispositivo. Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo y un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, que sean sencillos y economicas de realizar. Estos objetivos y otros objetivos adicionales, que se deduciran de manera mas plena a partir de la siguiente descripcion, se consiguen sustancialmente mediante un metodo y un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, y mediante un proceso de realizacion de un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, de acuerdo con lo expuesto en una o mas de las reivindicaciones adjuntas, por si solas o combinadas, o en cualquier combination con uno o mas de los aspectos adicionales descritos mas adelante en el presente documento. En un aspecto adicional, la invencion se refiere ademas a un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de proceso adjuntas, o con los aspectos adicionales indicados en el presente documento, que comprende adicionalmente al menos una etapa de production del cuerpo de soporte del dispositivo, que tenga al menos la primera portion, y la etapa de aplicacion de la pluralidad de fibras sobre la primera portion, por floculacion.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere ademas a un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de proceso adjuntas, o con los aspectos adicionales indicados en el presente documento, en los que el tensioactivo sea cloruro cationico o de benzalconio (BAC, o cloruro de alquildimetilbencilamonio, o ADBAC), y en los que las fibras esten fabricadas con nailon. En un aspecto adicional, la invencion se refiere adicionalmente a un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, realizado con un proceso de realizacion de un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones adjuntas. En un aspecto adicional, la invencion se refiere ademas a un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de metodo adjuntas, o con los aspectos adicionales indicados en el presente documento, en los que una etapa de predisposition de la solution comprende etapas en las que se predispone una cantidad predeterminada de tensioactivos, preferentemente cationicos; se disuelve la cantidad predeterminada de tensioactivos en agua, con el fin de obtener la solucion, y/o una etapa en la que se forma la solucion de manera que sea sustancialmente homogenea. En un aspecto adicional, la invencion se refiere ademas a un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de metodo adjuntas, o a los aspectos adicionales indicados en el presente documento, que comprende ademas una etapa en la que se seca al menos la porcion de recoleccion que proporciona la muestra y/o que comprende adicionalmente etapas en las que se inserta la porcion de recoleccion en un recipiente hermetico, durante la etapa de secado o independientemente de la etapa de secado. En un aspecto adicional, la invencion se refiere ademas a un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de metodo adjuntas, o con los aspectos adicionales indicados en el presente documento, que comprende adicionalmente una etapa de liberation de al menos el 80 % de la muestra recoleccion desde la porcion de recoleccion, o al menos el 86 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 %, por ejemplo, por dilution en un medio llquido, suspension en un tampon o en una solucion tampon. En un aspecto preferido adicional de la misma, la invencion se refiere ademas al uso de un tensioactivo o un tensioactivo cationico para pretratar las fibras aplicadas, o a aplicar por floculacion, sobre un cuerpo de soporte de un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, con el fin de aumentar la cantidad de ADN o ARN que podra liberarse desde el dispositivo de recoleccion, y que podra utilizarse en operaciones de biologla molecular, con respecto a una cantidad que podra liberarse y utilizarse en operaciones de biologla molecular obtenida a partir de fibras del dispositivo que no se hayan tratado previamente. En un aspecto preferido adicional de la misma, la invencion se refiere ademas al uso de un tensioactivo cationico, en particular cloruro de benzalconio, para pretratar fibras de nailon aplicadas, o a aplicar por floculacion, sobre un cuerpo de soporte de un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, con el fin de aumentar el porcentaje de ADN o ARN que podra utilizarse en operaciones de biologla molecular, con respecto a la cantidad que podra liberarse desde el dispositivo de recoleccion y transferencia. En un aspecto adicional, la invencion se refiere ademas al uso de un tensioactivo cationico para producir fibras a aplicar por floculacion sobre un cuerpo de soporte de un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, en el que el tensioactivo cationico se anade a materiales con los que se realizan las fibras durante la produccion de las mismas. A continuation, se proporciona una descripcion detallada, a modo de ejemplo no limitativo, de una o mas realizaciones preferidas de la invencion, con ayuda de las figuras de los dibujos, en las que:
- la figura 1 es una vista lateral de un dispositivo de acuerdo con una realizacion del presente ejemplo;
- la figura 2 es una vista de un detalle del dispositivo de la figura 1, relativa a una porcion de recoleccion;
- la figura 3 es un recipiente de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
A continuacion, se ofrece una descripcion de un dispositivo 1 de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, de acuerdo con una o mas realizaciones de la invencion. En el presente texto, el termino "biologla molecular" pretende referirse a tecnicas que permitan la detection, analisis, manipulation, amplification (PCR) y copia (donation) de acidos nucleicos (ADN y ARN).
La expresion "ADN o ARN que puede/podra utilizarse para operaciones de biologla molecular" quiere decir que el ADN o ARN sera integral, no estara danado o sera inutilizable y que, en cualquier caso, estara en condiciones suficientemente buenas para la realizacion de diversas operaciones de biologla molecular, por ejemplo, reacciones de polimerizacion. Con referencia a las figuras adjuntas de los dibujos, 1 denota en su totalidad un dispositivo de
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recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular. El dispositivo 1 comprende un cuerpo de soporte 2, que puede tener una conformacion alargada y/o una conformacion sustancialmente de tipo barra. El cuerpo de soporte 2 puede tener cualquier seccion, incluyendo una que varle a lo largo de su extension longitudinal. El cuerpo de soporte esta provisto de una primera porcion 2a, por ejemplo, una porcion terminal, que defina una porcion de recoleccion 3 de muestras, una segunda porcion central 2b, sustancialmente en forma de varilla, y una tercera porcion terminal 2c, que un operario puede agarrar manualmente o que puede conectarse a un elemento 4 de agarre adicional, tal como una tapa 5 para tubos de ensayo o similares.
La porcion de recoleccion 3 de muestras puede estar conformada como un hisopo. La porcion de recoleccion 3 esta flocada, lo cual se logra mediante la floculacion de una pluralidad de fibras 6 sobre el primer extremo 2a del cuerpo. Las fibras 6 flocadas sobre el primer extremo pueden estar fabricadas con un material hidrofilo o no hidrofilo, pero la porcion de recoleccion 3 sera hidrofila, en cualquier caso, debido al efecto capilar gracias a las caracterlsticas de las fibras 6 y la distribution de las mismas sobre el cuerpo de soporte 2. Las fibras flocadas 6 estan preferentemente fabricadas con nailon. En otras palabras, la porcion de recoleccion 3 puede presentar una capa continua de fibras 6, fabricadas con un material sustancialmente adsorbente o no absorbente, para con la muestra, pero conformada con una pluralidad ordenada de intersticios capilares 9 en los que pueda retenerse por imbibition una cantidad predeterminada de la muestra, por ejemplo una muestra llquida, y desde los cuales pueda liberarse cuantitativamente la muestra en el momento apropiado, por ejemplo frotando la porcion de recoleccion 3 sobre una superficie de liberation especial. En la patente EP1.608.268, de los presentes solicitantes, se ilustra un ejemplo de este tipo de hisopo flocado. Como se describe en la patente mencionada anteriormente, la deposition por floculacion produce, en el extremo implicado del dispositivo 1 de recoleccion, una capa continua y homogenea de una pluralidad de fibras 6 que presentan una disposition ordenada, sustancialmente perpendiculares en cada punto de la primera porcion 2a del cuerpo de soporte 2, y cada una de las cuales es sustancialmente paralela a las fibras 6 adyacentes. Entre las fibras 6 esta definida una correspondiente pluralidad ordenada de intersticios capilares 9, y entre los mismos se recoge una cantidad predeterminada de la muestra a recolectar y retener, posiblemente por imbibicion debido al efecto capilar. La capa flocada puede liberar despues la muestra recoleccion, de manera efectiva, por ejemplo, al frotarla sobre una superficie especial o por dilution de la muestra en un diluyente apropiado. La porcion de recoleccion 3 flocada puede estar configurada y dimensionada de modo que recoja una cantidad apropiada de muestra, o para que recoja una cantidad de muestra comprendida entre 5 y 1000 microlitros, entre 10 microlitros y 500 microlitros, entre 50 y 200 microlitros, o entre 80 y 120 microlitros, por ejemplo. Las fibras 6 pueden estar dispuestas sobre el cuerpo de soporte 2 de manera sustancialmente ordenada, y de tal manera que formen una capa sustancialmente continua sobre la porcion de recoleccion 3 y/o que puedan disponerse sobre la porcion de recoleccion 3 de tal manera que definan una pluralidad de intersticios capilares 9, destinados a absorber la muestra llquida por action capilar. Las fibras 6 pueden presentar un recuento de hilos comprendido entre 1 y 10 Dtex, o preferentemente entre 1,7 y 3,3 Dtex, y/o las fibras 6 pueden presentar una longitud comprendida entre 0,6 y 3 mm. Las fibras 6 pueden disponerse por floculacion de las mismas sobre la porcion de recoleccion 3 del cuerpo de soporte 2, con una densidad superficial comprendida por ejemplo entre 50 y 500 fibras por mm2, o entre 100 y 200 fibras por mm2 de la superficie de la primera porcion 2a del cuerpo de soporte 2. La capa de fibras puede definir una capacidad de absorbancia de al menos 0,5 pl por mm2, o de al menos 0,6 pl por mm2, o de al menos 0,7 pl por mm2, o de al menos 0,75 pl por mm2 de la superficie del cuerpo de soporte 2, por ejemplo. Las fibras 6 pueden estar fabricadas con un material sustancialmente no hidrofilo o no adsorbente con respecto a la muestra, y/o con un material sustancialmente hidrofilo o adsorbente con respecto a la muestra, y/o con un material seleccionado entre: poliamida, nailon, rayon, poliester, fibra de carbono, alginato, fibra natural, o una mezcla de los materiales citados. Las fibras estan preferentemente fabricadas con nailon. El cuerpo de soporte 2 puede presentar una extension longitudinal comprendida entre 2 cm y 20 cm, o entre 3 cm y 18 cm, o entre 6 cm y 16 cm, y/o un espesor o un diametro de una seccion perpendicular al eje central de la misma que este comprendido entre 0,5 mm y 5 mm, o entre 1 mm y 3 mm, o entre 1,5 y 2,5 mm. La porcion de recoleccion 3 puede presentar una extension longitudinal comprendida entre 8 cm y 0,5 cm o entre 5 cm y 1 cm y/o un diametro o espesor, incluyendo las fibras 6, entre 10 mm y 1 mm o entre 8 mm y 2 mm o Entre 5 mm y 2,5 mm. La porcion de recoleccion 3 puede presentar cualquier forma adecuada para el tipo de muestra a recolectar, o adecuada para el asiento de recoleccion, por ejemplo, redondeada o con uno o mas bordes afilados. El cuerpo de soporte 2 puede estar provisto de una porcion central debilitada, destinada a facilitar la rotura selectiva del propio cuerpo por un punto intermedio entre el primer extremo y el segundo extremo, para facilitar por ejemplo la insertion de la porcion de recoleccion 3 en un recipiente 7 para su transporte. El dispositivo 1 de recoleccion puede comprender una pluralidad de cuerpos de soporte 2, cada uno provisto de una porcion de recoleccion 3 que tenga este conformada o tenga una forma diferente y especlficamente configurada para recolectar una muestra en un asiento especlfico, o para recolectar una cantidad especlfica de muestra. En la presente invention, las fibras 6 se tratan con un tensioactivo previamente a su uso para recolectar la muestra y, por ejemplo, durante la etapa de production del dispositivo 1. El tensioactivo puede ser cationico, anionico, no ionico, o anfotero. En la presente invencion, el tensioactivo es preferentemente cationico. En la invencion, el uso de un tensioactivo cationico, por ejemplo y en particular cloruro de benzalconio, permite alcanzar los objetivos anteriormente descritos de manera sorprendentemente y particularmente significativa. En la invencion, el uso de un tensioactivo cationico, por ejemplo y en particular cloruro de benzalconio, permite alcanzar los objetivos anteriormente descritos de manera sorprendentemente y particularmente significativa si se usa con fibras de nailon. En la invencion, el tensioactivo cationico es preferentemente cloruro de benzalconio (BAC, o cloruro de alquildimetilbencilamonio, o ADBAC). El tensioactivo cationico puede ser una sal que tenga una parte positiva, constituida por al menos una cadena de atomos de carbono con un grupo de amonio cuaternario, y/o puede ser una
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sal de amonio cuaternario o puede comprender una mezcla de sales de amonio. El tensioactivo cationico puede ser una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio, en la que el grupo alquilo varie de octilo (C8H17-) a octadecilo (C18H37-). En una realization alternativa, el tensioactivo cationico podria ser bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB, o bromuro de hexadeciltrimetilamonio). En realizaciones alternativas adicionales, el tensioactivo cationico puede ser, por ejemplo, cloruro de bencetonio, cloruro de cetalconio, bromuro de laurtrimonio, bromuro de miristrimetilamonio, cetrimida, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio o cloruro de estearalconio. El dispositivo 1 de recoleccion puede comprender adicionalmente un recipiente 7 para el transporte de la muestra, que tenga un asiento interno 10 de contention y una abertura 11 de acceso. El recipiente 7 puede ser un tubo de ensayo, para el transporte de muestras de material biologico o de origen biologico. El dispositivo 1 de recoleccion puede comprender adicionalmente una tapa 5 de cierre, que puede montarse de forma desmontable en la abertura de acceso para cerrar selectivamente el recipiente 7. El dispositivo 1 de recoleccion puede comprender adicionalmente al menos un elemento de secado o de deshumidificacion, por ejemplo, una bolsa que contenga gel de silicio, alojada en el recipiente 7 o en otra position util. El recipiente 7 y/o el tapon 5 de cierre y/o el cuerpo de soporte 2 pueden estar fabricadas con un material plastico, por ejemplo, poliestirol, o poliestireno o polipropileno, y/o con un material adecuado para su uso con la muestra especifica a recolectar, adecuado o en general para su uso con materiales biologicos o materiales de origen biologico. El recipiente 7 y/o el tapon 5 de cierre y/o el cuerpo de soporte 2 pueden esterilizarse. El dispositivo 1 de recoleccion puede comprender adicionalmente un embalaje sellado (no ilustrado en las figuras, dado que es de tipo conocido) en el que puedan alojarse el cuerpo de soporte 2 y/o el recipiente 7 y la tapa 5 de cierre, antes de su uso para recolectar una muestra. El cuerpo de soporte 2, el embalaje, el recipiente 7 y la tapa 5 pueden ser esteriles. La invention se refiere adicionalmente a un proceso de realizacion de un dispositivo 1 de recoleccion y transferencia de muestras para biologia molecular, del tipo descrito anteriormente. El proceso puede comprender, por ejemplo, las etapas siguientes, en si mismas de tipo conocido y por lo tanto no descritas con mayor detalle: realizar el cuerpo de soporte 2, por ejemplo por extrusion de un material plastico; aplicar un pegamento adecuado a la primera portion 2a del cuerpo 2; aplicar las fibras 6 a la primera portion 2a, por medio de floculacion en un campo electromagnetico; secar el pegamento en un horno apropiado, de tipo convencional, con el fin de polimerizar el pegamento al menos parcialmente. En la presente invencion, el proceso comprende adicionalmente la etapa de pretratamiento de la pluralidad de fibras 6 con un tensioactivo cationico, del tipo descrito anteriormente. El proceso puede comprender adicionalmente una etapa de secado de las fibras, por ejemplo, en un horno, al menos tras la etapa de pretratamiento de las fibras. La etapa de pretratamiento de la pluralidad de fibras 6 con un tensioactivo cationico puede llevarse a cabo tras la aplicacion de las fibras sobre el cuerpo de soporte 2, por floculacion, y puede hacerse sumergiendo directamente la porcion de recoleccion en una solution que contenga el tensioactivo cationico. Alternativamente, la etapa de pretratamiento de la pluralidad de fibras 6 con el agente tensioactivo cationico anteriormente mencionado puede llevarse a cabo antes de la aplicacion de las fibras 6 sobre el cuerpo, por floculacion, tratando asi las fibras 6 antes de la floculacion de las mismas. En una alternativa adicional, el agente tensioactivo cationico puede anadirse a las fibras 6 durante la production de las fibras 6, anadiendo una cantidad predeterminada de tensioactivo cationico a los materiales de tipo conocido con los que se fabriquen las fibras. El proceso puede comprender adicionalmente la etapa de predisposition de una solucion acuosa que comprenda en la solucion un porcentaje, un valor de concentration, o una cantidad del tensioactivo, preferentemente cationico, de un 0,1 % a un 15 % o de un 0,2 % a un 10 % o de un 0,5 % a un 5 % o de un 0,8 % a un 1,5 % o de un 0,4 % a un 1,2 % en volumen o en peso. Por ejemplo, una concentracion preferida es de entre 0,4 gramos de cloruro de benzalconio por cada 100 ml de solucion y 1,2 gramos por cada 100 ml de solucion. Puede aplicarse la misma concentracion preferida a otros tensioactivos cationicos. La etapa de predisposicion de la solucion puede comprender etapas de predisposicion de una cantidad predeterminada de tensioactivo cationico; de disolucion de la cantidad predeterminada de tensioactivo cationico en agua o en una solucion acuosa, con el fin de obtener la solucion, y/o la etapa de formation de una solucion sustancialmente homogenea. La etapa de tratamiento de la pluralidad de fibras 6 con un tensioactivo cationico puede llevarse a cabo por imbibition de las fibras en la solucion. La imbibicion de las fibras 6 en la solucion puede llevarse a cabo tras la aplicacion de las fibras sobre la porcion de recoleccion del cuerpo, por floculacion, o antes de la aplicacion de las fibras sobre la porcion de recoleccion del cuerpo por floculacion. La invencion se refiere adicionalmente a un metodo de recoleccion y transferencia de muestras para biologia molecular, por medio de un dispositivo 1 del tipo descrito anteriormente. El metodo comprende al menos la etapa de recoleccion de una muestra para biologia molecular en al menos una porcion de recoleccion 3 flocada del dispositivo 1 de recoleccion, en el que la pluralidad de fibras 6 estan previamente tratadas con un tensioactivo cationico del tipo descrito anteriormente. El metodo puede usarse para recolectar y transferir muestras de ADN o ARN, y/o celulas que comprendan muestras de ADN o ARN. El metodo puede comprender tambien la etapa de conservation de la muestra sobre la porcion de recoleccion 3, durante un periodo de tiempo predeterminado. El metodo puede comprender tambien la etapa de deshidratacion o secado de al menos la porcion de recoleccion 3, provista de la muestra recoleccion. La etapa de secado puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante secado en un horno de ventilation forzada, o mediante otro metodo de tipo conocido y que sea adecuado para el tratamiento de la muestra.
El metodo puede comprender adicionalmente etapas de insertion de la porcion de recoleccion 3 en un recipiente de vacio (de tipo conocido y por lo tanto no ilustrado en las figuras), y de generation de un vacio sustancial en el recipiente de vacio. La etapa de generacion de un vacio puede llevarse a cabo durante la etapa de secado, o en otro momento por separado de la etapa de secado. El metodo puede comprender adicionalmente una etapa de rehidratacion de la muestra contenida en la porcion de recoleccion 3, por ejemplo, con al menos una solucion hidratante, con el fin de obtener una cantidad predeterminada de muestra rehidratada en la porcion de recoleccion 3.
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El proceso puede comprender adicionalmente etapas de insercion de la porcion de recoleccion 3, que contiene la muestra, en un recipiente 7 tal como por ejemplo un tubo de ensayo, el cierre del recipiente 7 con una tapa 5 o cubierta de cierre, y la transferencia del recipiente 7 que comprende la porcion de recoleccion 3, y/o la etapa de predisposicion en el recipiente 7 de una cantidad predeterminada de una sustancia 8, destinada a licuar y/o a conservar la muestra, y/o una etapa en la que se bascule, sacuda o haga girar el recipiente 7 que comprende la porcion de recoleccion 3 con la muestra, a una velocidad predeterminada destinada a licuar la muestra. El metodo puede comprender adicionalmente una etapa de liberacion de la muestra para biologla molecular, desde la porcion de recoleccion, con el fin de permitir efectuar operaciones de biologla molecular en la muestra. El metodo puede comprender, en particular, una etapa de liberacion de al menos un 80 % de la cantidad de la muestra recoleccion para biologla molecular, o de al menos un 85 %, o de al menos un 90 %, por dilucion en un medio llquido o en un tampon de dilucion con el fin de permitir efectuar operaciones adicionales sobre la muestra. La liberacion puede facilitarse mediante operaciones de frotamiento convencionales. La invencion se refiere adicionalmente al uso de un tensioactivo cationico, del tipo indicado anteriormente, para pretratar las fibras 6 aplicadas, o a aplicar por floculacion, sobre un cuerpo de soporte 2 de un dispositivo de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular. En lo sucesivo se describiran los resultados de los ensayos efectuados mediante el tratamiento de un hisopo flocado, que tiene fibras de nailon flocadas, tratado con una solucion con una concentracion de aproximadamente 1 gramo de cloruro de benzalconio por cada 100 ml de llquido. Para simular la recoleccion de ADN en la escena de un crimen, se utilizaron 100 pl de agua desmineralizada esteril para rehumedecer manchas de saliva (que se hablan secado previamente sobre una superficie dura, para reproducir la recoleccion de ADN en la escena de un crimen), cada una de las cuales se recolecto con un hisopo individual. Se calcularon las concentraciones medias y los porcentajes del ADN recuperado. Se analizaron diferentes tipos de hisopos: hisopos de fibras de nailon flocados no recubiertos (sin tratar) e hisopos de fibras de nailon flocados recubiertos (tratados). Durante las pruebas, tambien se estudio la optimizacion de la preservacion del ADN en el hisopo en condiciones ambientales crlticas. En particular, el ensayo valoro la correcta conservacion de la muestra en el hisopo una vez recolectada, por ejemplo, de la escena de un crimen, hasta su llegada al laboratorio forense. Se realizaron dos ensayos:
1) Con el fin de verificar la capacidad de los hisopos flocados recubiertos para mantener el ADN recolectado en la escena del crimen, se inoculo saliva en los hisopos y se extrajo el ADN, y se cuantifico el PCR a tiempo real (porcentaje de recuperacion) en el minuto 1 y tras 1 semana, a temperatura ambiente.
La siguiente tabla muestra el porcentaje de recuperacion de ADN de los hisopos recubiertos, en diferentes momentos (en el minuto 1, despues de 24 horas, despues de 48 horas, y despues de 1 semana):
Hisopo recubierto: momento del ensayo
Concentracion de ADN (ng/ul) Porcentaje de recuperacion de ADN (%)
minuto 1
1,70 (ng/ul) 100
a las 24 horas
1,68 (ng/ul) 99
a las 48 horas
1,69 (ng/ul) 100
despues de 1 semana
1,67 (ng/ul) 98
2) Se efectuo otro ensayo para simular una recoleccion en la escena de un crimen en presencia de una gran cantidad de contaminantes ambientales, y para simular el transporte de un hisopo en condiciones crlticas de temperatura (por ejemplo, en verano o en zonas muy calientes), en las que las temperaturas cambian y el crecimiento excesivo de contaminantes podrla ser un problema real para la conservacion del ADN humano en el hisopo, mediante la inoculacion en cada hisopo de 100 pl de una mezcla de 0,5 McF de agentes contaminantes ambientales y saliva humana. Se extrajo el ADN de cada hisopo, y se cuantifico el PCR a tiempo real en el minuto 1, al cabo de 3 dlas a temperatura ambiente (TA) y a + 37 °C, al cabo de 5 dlas a temperatura ambiente y a + 37 °C. Los siguientes graficos representan la tendencia de la preservacion del ADN humano en los hisopos, a las 2 temperaturas diferentes de ensayo:
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En lo referente al numero de ciclos necesarios para el PCR a tiempo real los hisopos recubiertos requirieron, en las diferentes condiciones de ensayo, un numero de ciclos que fueron desde un minimo de aproximadamente 27,27 (en el minuto 1) hasta un maximo de aproximadamente 27,27 (despues de 5 dias a 37 °C), mientras que los hisopos no recubiertos requirieron un numero de ciclos que fueron desde un minimo de 27,38 (en el minuto 1) hasta un maximo de aproximadamente 33,33 (despues de 5 dias a 37 °C). El anterior ensayo demuestra que los hisopos recubiertos pueden conservar aproximadamente el 100 % del ADN recolectado incluso despues de 5 dias, no solo a temperatura ambiente (estado optimo) sino tambien con una temperatura de incubacion critica (+ 37 °C), sin la necesidad de secar el hisopo usando dispositivos de gel de silice, y pueden mejorar hasta 100 veces la sensibilidad del ensayo en comparacion con un hisopo no recubierto. La presente invencion proporciona una o mas de las siguientes ventajas. En primer lugar, y siendo las mas importante de todas, la invencion permite un proceso y un dispositivo realizado de acuerdo con el proceso, y un metodo para utilizar el dispositivo, que obvian los problemas observados en la tecnica anterior. La invencion permite adicionalmente extraer del dispositivo de recoleccion una cantidad relevante de muestras (en relacion con la cantidad recolectada) para biologia molecular, tal como ADN o ARN, y, en particular, permite conservar las muestras con mayor cuidado y en mejores condiciones integrales con respecto a la tecnica anterior; asi, se permite cualquier posible uso posterior en laboratorio. La invencion permite un aumento del porcentaje de ADN o ARN a utilizar en operaciones de biologia molecular que impliquen la recoleccion y la transferencia, con respecto a la tecnica anterior. Esto es posible gracias a la capacidad del tratamiento para conservar la integridad de las celulas humanas y para evitar la lisis de las mismas, manteniendo tambien consecuentemente la integridad de los acidos nucleicos. Ademas de lo anterior, la presente invencion tambien puede usarse ventajosamente para recolectar otras muestras biologicas o quimicas a analizar. La invencion permite adicionalmente recolectar, transferir, y preparar para su analisis y para operaciones adicionales, una gran cantidad de muestra biologica con respecto a los dispositivos conocidos. La invencion permite disponer de cantidades de ADN o ARN y utilizarlas para llevar a cabo operaciones de biologia molecular, siendo tales cantidades significativamente mayores con respecto a los dispositivos conocidos, pudiendo ser incluso hasta diez veces mayores. La invencion permite adicionalmente reducir el numero de ciclos requeridos para llevar a cabo reacciones de polimerizacion, o reacciones en cadena de la polimerasa, sobre muestras de ADN o ARN liberadas desde el dispositivo, ya que permite liberar desde el dispositivo de recoleccion una mayor cantidad de ADN o ARN disponible para estas operaciones. Finalmente, la invencion puede realizarse de manera sencilla y economica.

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    REIVINDICACIONES
    1. Un proceso para producir un hisopo flocado de recoleccion y de transferencia de muestras de ADN o ARN para biologla molecular, comprendiendo el hisopo flocado como mlnimo: un cuerpo de soporte (2), que tiene al menos una primera porcion (2a) y una pluralidad de fibras (6) fijadas y dispuestas sobre la primera porcion (2a) del cuerpo de soporte (2) por floculacion, de modo que definan una porcion flocada de recoleccion (3) destinada a recolectar una cantidad de la muestra para biologla molecular sobre dicha porcion de recoleccion (3), en donde las fibras (6) estan dispuestas por floculacion de manera ordenada y sustancialmente perpendicular al cuerpo de soporte (2); comprendiendo el proceso al menos una etapa de pretratamiento de la pluralidad de fibras (6) con un tensioactivo, y una etapa de secado de las fibras tras la etapa de pretratamiento de las fibras, realizandose la etapa de pretratamiento de la pluralidad de fibras (6) con un agente tensioactivo despues de aplicar por floculacion las fibras sobre el cuerpo de soporte (2) y/o antes de aplicar por floculacion las fibras (6) sobre el cuerpo (2) y/o en donde el tensioactivo se anade a las fibras (6) durante la produccion de las fibras (6).
  2. 2. El proceso segun la reivindicacion 1, en el que el tensioactivo es un tensioactivo cationico y/o es un compuesto de amonio cuaternario y/o es una sal que tiene una parte positiva, constituida al menos por una cadena de atomos de carbono que termina con un grupo de amonio cuaternario y/o en el que el cuerpo de soporte (2) tiene una conformacion alargada y/o una conformacion sustancialmente similar a una barra.
  3. 3. El proceso segun la reivindicacion 1, en el que el tensioactivo es cloruro de benzalconio (BAC, o cloruro de alquildimetilbencilamonio, o ADBAC).
  4. 4. El proceso segun la reivindicacion 1, en el que el tensioactivo es una sal de amonio cuaternario o comprende una mezcla de sales de amonio cuaternario; o en el que es una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio, en la que el grupo alquilo varla de octilo (C8H17-) a octadecilo (C18H37-).
  5. 5. El proceso segun la reivindicacion 1, en el que el tensioactivo se elige del grupo que comprende: cloruro de benzalconio, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB o bromuro de hexadeciltrimetilamonio), cloruro de bencetonio, cloruro de cetalconio, bromuro de laurtrimonio, bromuro de miristiltrimetilamonio, cetrimida, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio y cloruro de estearalconio.
  6. 6. El proceso segun la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente una etapa de predisposicion de una solucion
    acuosa que comprenda en la solucion un porcentaje, un valor de concentracion o una cantidad del tensioactivo de un 0,1 % a un 15 %, o de un 0,2 % a un 10 %, o de un 0,5 % a un 5 %, o de un 0,8 % a un 1,5 %, o de un 0,4 % a un
    1.2 % en volumen o en peso, y en el que la etapa de tratamiento de la pluralidad de fibras (6) con un tensioactivo se
    lleva a cabo por imbibicion de las fibras (6) en la solucion, en donde la imbibicion de las fibras (6) en la solucion se lleva a cabo mediante floculacion tras la aplicacion de las fibras (6) sobre la primera porcion (2a) del cuerpo (2).
  7. 7. El proceso segun la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente una etapa de predisposicion de una solucion
    acuosa que comprende en la solucion un porcentaje, un valor de concentracion o una cantidad del tensioactivo de un 0,1 % a un 15% o de un 0,2 % a un 10 % o de un 0,5 % a un 5 % o de un 0,8 % a un 1,5 % o de un 0,4 % a un
    1.2 % en volumen o en peso, y en el que la etapa de tratamiento de la pluralidad de fibras (6) con un tensioactivo se
    lleva a cabo por imbibicion de las fibras (6) en la solucion, en donde la imbibicion de las fibras (6) en la solucion se lleva a cabo mediante floculacion antes de la aplicacion de las fibras (6) sobre la primera porcion (2a) del cuerpo (2).
  8. 8. Un hisopo flocado (1) de recoleccion y transferencia de muestras de ADN o ARN para biologla molecular, que comprende al menos un cuerpo de soporte (2), que tiene al menos una primera porcion (2a) y una pluralidad de fibras (6) fijadas y dispuestas sobre la primera porcion (2a) del cuerpo de soporte (2) por floculacion, de modo que definan una porcion flocada de recoleccion (3) destinada a recolectar una cantidad de muestra para biologla molecular sobre dicha porcion de recoleccion (3), en donde las fibras (6) estan dispuestas por floculacion de manera ordenada y sustancialmente perpendicular al cuerpo de soporte (2); caracterizado por que la pluralidad de fibras (6) se tratan previamente con un tensioactivo y se secan tras la etapa de pretratamiento, durante las etapas del proceso de produccion del hisopo flocado (1) de recoleccion y transferencia de muestras para biologla molecular, en donde la porcion flocada de recoleccion (3) comprende el tensioactivo sobre la pluralidad de fibras (6), de manera que se aumente la cantidad de ADN o ARN a liberar por el hisopo flocado de recoleccion y a utilizar en las operaciones de biologla molecular.
  9. 9. El hisopo flocado (1) segun la reivindicacion 8, en el que el tensioactivo es cationico y/o es cloruro de benzalconio (BAC) y/o en el que el tensioactivo es cationico y es una sal que tiene una parte positiva, constituida al menos por una cadena de atomos de carbono que termina con un grupo de amonio cuaternario; y/o en el que el tensioactivo es una sal de amonio cuaternario, o en el que comprende una mezcla de sales de amonio cuaternario.
  10. 10. El hisopo flocado (1) segun la reivindicacion 8, en el que el tensioactivo es una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio, en el que el grupo alquilo varia de octilo (C8H17-) a octadecilo (C18H37-); y/o en el que el tensioactivo cationico es un compuesto de amonio cuaternario y/o se elige del grupo que comprende: cloruro de benzalconio, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB, o bromuro de hexadeciltrimetilamonio), cloruro de bencetonio,
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    cloruro de cetalconio, bromuro de laurtrimonio, bromuro de miristiltrimetilamonio, cetrimida, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio y cloruro de estearalconio.
  11. 11. El hisopo flocado (1) segun la reivindicacion 8, en el que la porcion flocada de recoleccion (3) esta configurada para recolectar una cantidad sustancialmente conocida de la muestra o para recolectar una cantidad comprendida entre 5 y 1000 microlitros o entre 10 microlitros y 500 microlitros o entre 50 y 200 microlitros o entre 80 y 120 microlitros de la muestra y/o para recolectar una cantidad de muestra de al menos 0,5 pl por mm2 o de al menos 0,6 pl por mm2 o de al menos 0,7 pl por mm2 o de al menos 0,75 pl por mm2.
  12. 12. El hisopo flocado (1) segun la reivindicacion 8, en el que las fibras (6) estan dispuestas sobre la primera porcion (2a) del cuerpo de soporte (2) de manera sustancialmente ordenada y de manera que formen una capa sustancialmente continua sobre la porcion de recoleccion (3) y/o las fibras (6) estan dispuestas sobre la parte de recoleccion (3) de tal manera que definan una pluralidad de intersticios capilares (9) destinados a absorber la muestra por accion capilar y/o en el que las fibras (6) presentan un recuento de hilos comprendido entre 1,7 y 3,3 Dtex y/o una longitud comprendida entre 0,6 y 3 mm y/o en la que el cuerpo de soporte (2) tiene una conformation alargada y/o una conformacion substancialmente similar a una barra.
  13. 13. El hisopo flocado (1) segun la reivindicacion 8, en el que las fibras (6) estan fabricadas con nailon o con un material seleccionado de: poliamida, rayon, poliester, fibra de carbono, alginato, fibra natural o una mezcla de dichos materiales y/o en el que la porcion de recoleccion (3) presenta una densidad superficial de las fibras (6) sobre la porcion de recoleccion (3) comprendida entre 50 y 500 fibras por mm2 o entre 100 y 200 fibras por mm2.
  14. 14. Un metodo para recolectar, conservar y transferir muestras de ADN o ARN para biologla molecular, por medio de un hisopo flocado (1) de acuerdo con la reivindicacion 8, comprendiendo el metodo al menos una etapa de recoleccion de una muestra para biologla molecular sobre al menos una porcion flocada de recoleccion (3) del hisopo flocado (1) de recoleccion que tiene un cuerpo de soporte (2), comprendiendo la porcion flocada de recoleccion (3) una primera porcion (2a) del cuerpo de soporte (2) y una pluralidad de fibras (6), fijadas y dispuestas sobre la primera porcion (2a) del cuerpo de soporte (2) por floculacion, siendo tratada previamente la pluralidad de fibras (6) con un tensioactivo o con un tensioactivo cationico y comprendiendo adicionalmente el metodo una etapa de conservation de la muestra en la porcion de recoleccion durante un periodo de tiempo.
  15. 15. El metodo segun la reivindicacion 14 para recolectar, conservar y transferir muestras de ADN o ARN y/o celulas que comprendan muestras de ADN o ARN y/o que comprende adicionalmente una etapa de liberation de la muestra para biologla molecular desde la porcion de recoleccion (3), con el fin de permitir llevar a cabo operaciones de biologla molecular en la muestra.
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