ES2564389T3 - Polipéptidos Fc monocatenarios - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido Fc monocatenario, en donde la secuencia desde el extremo amino al extremo carboxilo es: un primer dominio CH2 unido por su extremo carboxilo al extremo amino de un primer dominio CH3, y dicho primer dominio CH3 está unido por su extremo carboxilo a través de un conector de longitud aminoacídica que comprende repeticiones de una secuencia seleccionada de GS, GSGGS, GGGGS y GGGS al extremo amino del segundo dominio CH2 que está unido por su extremo carboxilo al extremo amino del segundo dominio CH3, en donde los dominios Fc, en dicho polipéptido Fc monocatenario, consisten en dos dominios CH2 y dos dominios CH3, caracterizado por formar dichos dominios CH2 y CH3 un dominio Fc funcional dentro de la cadena polipeptídica, en la que un primer dominio CH2 está dimerizado con un segundo dominio CH2 y un primer dominio CH3 está dimerizado con un segundo dominio CH3 dentro de la cadena polipeptídica, y unido al extremo amino de un primer dominio CH2, de dicho polipéptido Fc monocatenario, está una molécula biológicamente activa seleccionada del grupo que consiste en: ácidos nucleicos, glúcidos, proteínas receptoras, avímeros, adnectinas, anticalinas, filómeros, aptámeros, agentes hemostáticos, citocinas y factores de crecimiento, interleucinas, interferones, factor-α de la necrosis tumoral, factor-ß de la necrosis tumoral y factores estimulantes de colonias.

Description

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también incluye los fragmentos idóneos de tales receptores, un ejemplo de lo cual incluye el dominio extracelular de un receptor. En un ejemplo, el receptor es el receptor gp130 humano o un fragmento de fijación a citocina del mismo, tal como el dominio 1, 2 y/o 3. En un ejemplo, la molécula biológicamente activa comprende el dominio 1 del receptor gp130 o un fragmento del mismo. En un ejemplo, la molécula biológicamente activa comprende los aminoácidos 1 a 125 de la SEQ ID n.º 91. En un ejemplo, la molécula biológicamente activa comprende el dominio 2 y el dominio 3 del receptor gp130. En un ejemplo, la molécula biológicamente activa comprende el dominio 1, el dominio 2 y el dominio 3 del receptor gp130. También se apreciará que el término «receptor», tal y como se utiliza en la presente memoria, incluye las formas modificadas de los receptores que se producen de forma natural, entre ellos, por ejemplo, sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. En un ejemplo, un receptor que comprende dos cadenas se pueden producir como una única cadena y unirse a un polipéptido Fc monocatenario de la presente invención. En un ejemplo, el receptor puede comprender todo o parte de los dominios extracelulares de las cadenas α y β del receptor de los linfocitos T (TCR, por su nombre en inglés). Preferiblemente, estos dominios extracelulares α y β están unidos en una única cadena mediante un conector idóneo que a su vez está unido a un polipéptido Fc monocatenario de la presente invención.
Preferiblemente, la proteína de fijación monovalente es un fragmento de anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo idóneos incluyen, pero sin limitarse a ellos, scFv, Fab, Fab', VHH, Fv, Vκ, VH, Vλ, fragmentos de fijación a epítopo de cualquiera de los anteriores. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo idóneos incluyen los descritos en Adair y Lawson, 2005. «Therapeutic antibodies» Drug Design Reviews -Online 2(3): 209-217, y las solicitudes de patente internacional WO 2005003169, WO 2005003170 y WO 2005003171.
Un fragmento de anticuerpo para ser usado en la presente descripción puede proceder de cualquier clase (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD o IgA) o subclase de molécula de inmunoglobulina, y puede proceder de cualquier especie, entre las que se incluyen, por ejemplo, ratón, rata, tiburón, conejo, cerdo, hámster, camello, llama, cabra o humano.
En una realización, el fragmento de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo monoclonal, humanizado y/o quimérico.
Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo que tiene una o varias regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por su nombre en inglés) de una especie no humana y una región flanqueante de una molécula de inmunoglobulina de humano que facultativamente comprende uno o varios restos donantes de la especie no humana (véase, por ejemplo, patente de los EE. UU. US 5.585.089).
Se han creado por ingeniería genética anticuerpos quiméricos para que los genes de cadena ligera y pesada estén compuestos de segmentos génicos de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Preferiblemente, las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera son de humano y las regiones variables proceden de otras especies.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como la técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256: 495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de linfocitos B de humano (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4: 72) y la técnica de hibridoma-EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, págs. 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).
También se pueden obtener anticuerpos mediante cualquier otro método idóneo, tales como los descritos en Babcook, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93 (15), 7843-7848, y las solicitudes de patente internacional WO 92/02551, WO 2004/051268 y WO 2004/10637.
Un fragmento de anticuerpo para ser usado en la presente descripción se puede obtener de cualquier anticuerpo entero, en especial de un anticuerpo monoclonal entero, mediante el uso de cualquier técnica idónea de escisión y/o digestión enzimática, por ejemplo, mediante el tratamiento con pepsina. Como alternativa, los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar mediante el uso de técnicas de ADN recombinante que implican la manipulación y la reexpresión de ADN que codifica regiones constantes y/o variables de anticuerpo. Se pueden utilizar técnicas convencionales de la biología molecular para modificar, añadir o suprimir aminoácidos o dominios según se vea necesario. Cualquier alteración de las regiones variables o constantes todavía está incluida en los términos región 'variable' y 'constante' según se utilizan en la presente memoria.
Los métodos para crear y fabricar anticuerpos y fragmentos de anticuerpo se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Boss et al., patente de los EE. UU. US 4.816.397; Cabilly et al., patente de los EE. UU. US 6.331.415; Shrader et al., solicitud de patente internacional WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341, 544; Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; Bird et al., 1988, Science, 242, 423; Queen et al., patente de los EE. UU. US 5.585.089; Adair, solicitud de patente internacional WO 91/09967; Mountain y Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10, 1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181).
Los fragmentos de anticuerpo para ser usados en la presente descripción pueden poseer una región bisagra nativa o modificada que comprende una o varias cisteínas. La región bisagra nativa es la región bisagra asociada normalmente al dominio CH1 de la molécula de anticuerpo. Una región bisagra modificada es cualquier bisagra que difiere en longitud y/o composición de la región bisagra nativa. Tales bisagras pueden incluir regiones bisagra de
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otras especies, tales como regiones bisagra de humano, ratón, rata, conejo, tiburón, cerdo, hámster, camello, llama
o cabra. Otras regiones bisagra modificadas pueden comprender una región bisagra completa procedente de un anticuerpo de una clase o subclase diferente a la del dominio CH1. Así pues, por ejemplo, un dominio CH1 de clase γ1 podría estar conectado a una región bisagra de clase γ4. Como alternativa, la región bisagra modificada puede comprender parte de una bisagra natural o una unidad de repetición en la que cada unidad de la repetición procede de una región bisagra natural. En una alternativa más, se puede alterar la región bisagra natural al convertir una o varias cisteínas u otros restos en restos neutros, tales como serina o alanina, o al convertir los restos colocados idóneamente en restos de cisteína. Mediante tales medios, se puede incrementar o disminuir el número de restos de cisteína de la región bisagra. Otras regiones bisagra modificadas pueden ser totalmente sintéticas o se pueden diseñar para que posean propiedades deseadas, tales como longitud, composición de cisteínas y flexibilidad.
Ya se han descrito numerosas regiones bisagra modificadas, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. US 5.677.425, y en las solicitudes de patente internacional WO 9915549, WO 9825971 y WO 200500317. En un ejemplo, la proteína para ser usada en la presente invención es un fragmento Fab' con una región bisagra nativa o modificada.
En un ejemplo, se pueden manipular genéticamente una o varias cisteínas en los fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, para crear una o varias cisteínas expuestas en la superficie (patente de los EE. UU. US 5.219.996). Así pues, mediante el uso de técnicas de ingeniería idóneas, el número de cisteínas de un fragmento de anticuerpo se puede modificar para proporcionar un número específico de sitios, por ejemplo, para la adhesión de moléculas efectoras.
En una realización, el polipéptido Fc monocatenario comprende además un fragmento de anticuerpo.
En una realización, el fragmento de anticuerpo es un polipéptido Fv monocatenario. En una realización, el polipéptido Fc monocatenario de la presente invención comprende además un polipéptido Fv monocatenario. En una realización, el extremo carboxilo del dominio VH del sc-Fv está fusionado genéticamente al extremo amino del primer dominio CH2, facultativamente mediante uno de los conectores descritos más arriba en la presente memoria. En una realización, el extremo carboxilo del dominio VH del sc-Fv está fusionado genéticamente al extremo amino del primer dominio CH2, facultativamente mediante uno de los conectores descritos más arriba en la presente memoria.
En una realización, la molécula biológicamente activa es un Fab o Fab' (véase, por ejemplo, la figura 1). En una realización, el polipéptido Fc monocatenario de la presente invención comprende además un fragmento Fab o Fab' de anticuerpo. En una realización, el extremo carboxilo de la cadena VH-CH1 del Fab o Fab' está genéticamente fusionado al extremo amino de un polipéptido Fc monocatenario de la presente invención. En esta realización, la cadena VL-CL del Fab o Fab' está unida a la cadena VH-CH1 mediante un enlace disulfuro, preferiblemente el enlace disulfuro intercatenario nativo. En una realización, el extremo carboxilo de la cadena VL-CL del Fab o Fab' está genéticamente fusionado al extremo amino de un polipéptido Fc monocatenario de la presente invención. En esta realización, la cadena VH-CH1 del Fab o Fab' está unida a la VL-CL mediante un enlace disulfuro, preferiblemente el enlace disulfuro intercatenario nativo.
El polipéptido Fc monocatenario puede llevar unidas una o varias moléculas efectoras. Las moléculas efectoras se pueden unir mediante cualquier método idóneo, por ejemplo, mediante conjugación química o fusión genética.
La terminología «molécula efectora», según se utiliza en la presente memoria, incluye, por ejemplo, antineoplásicos, fármacos, toxinas (tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano o vegetal y fragmentos de las mismas, p. ej. ricina y fragmentos de la misma), proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, polímeros sintéticos o de origen natural, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, p. ej. ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionúclidos, concretamente yodo radiactivo, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores, tales como compuestos fluorescentes o compuestos que se pueden detectar por RMN o espectroscopia ESR. Se apreciará que una molécula efectora puede comprender una única molécula efectora o dos o varias de dichas moléculas unidas de tal modo que forman un único grupo funcional que puede unirse a una proteína mediante el procedimiento de la presente invención.
Los agentes antineoplásicos concretos incluyen agentes citotóxicos o citostáticos, por ejemplo alquilantes, tales como clormetinas (p. ej. clorambucilo, melfalán, mecloretamina, ciclosfosfamida, o mostaza de uracilo) y derivados de los mismos, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, busulfano, o cisplatino; antimetabolitos, tales como metotrexato, fluorouracilo, floxuridina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, ácido fluoroacético, o ácido fluorocítrico, antibióticos, tales como bleomicinas (p. ej. sulfato de bleomicina), doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicinas (p. ej. mitomicina C), actinomicinas (p. ej. dactinomicina), plicamina, caliqueamicina y derivados de los mismos, o esperamicina y derivados de la misma; inhibidores mitóticos, tales como etopósido, vincristina o vinblastina, y derivados de los mismos; alcaloides tales como elipticina; polioles tales como taxicina I o taxicina II; hormonas, tales como andrógenos (p. ej. dromostanolona o testolactona), progestinas (p. ej. acetato de megestrol o acetato de medroxiprogesterona), estrógenos (p. ej. difosfato de dimetilestilbestrol, fosfato de poliestradiol o fosfato de estramustina) o antiestrógenos (p. ej. tamoxifeno); antraquinonas, tales como mitoxantrona, ureas, tales como hidroxiurea; hidrazinas, tales como procarbazina; o imidazoles, tales como dacarbazina.
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Los metales quelados incluyen quelatos de metales di-o tripositivos que tienen un número de coordinación de 2 a 8 inclusive. Los ejemplos concretos de tales metales incluyen tecnecio (Tc), renio (Re), cobalto (Co), cobre (Cu), oro (Au), plata (Ag), plomo (Pb), bismuto (Bi), indio (In), galio (Ga), itrio (Y), terbio (Tb), gadolinio (Gd), y escandio (Sc). En general, el metal es preferiblemente un radionúclido. Los radionúclidos concretos incluyen 99mTc, 186Re, 188Re,58CO, 60Co, 67Cu, 195Au, 199Au, 110Ag, 203Pb, 206Bi, 207Bi, 111In, 67Ga, 68Ga, 88Y, 90Y, 160Tb, 153Gd y 47Sc.
El metal quelado puede ser, por ejemplo, uno de los tipos anteriores de metales quelados con cualquier agente quelante polidentado idóneo, por ejemplo poliaminas acíclicas o cíclicas, poliéteres, (p. ej. éteres corona y derivados de los mismos); poliamidas; porfirinas; y derivados carbocíclicos.
En general, el tipo de quelante dependerá del metal en uso. Un grupo particularmente útil de quelantes en los productos conjugados de acuerdo con la invención, sin embargo, son las poliaminas acíclicas y cíclicas, en especial los ácidos poliaminocarboxílicos, por ejemplo ácido dietilentriaminopentaacético y los derivados del mismo, y las aminas macrocíclicas, p. ej. derivados cíclicos triazoicos y tetraazoicos (por ejemplo. tal y como está descrito en la Memoria de Patente Internacional Núm.WO 92/22583); y las poliamidas, en especial desferrioxamina y los derivados de la misma.
Otras moléculas efectoras incluyen otras proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, aunque sin limitación, enzimas proteolíticas, hidrolasas, liasas, isomerasas, transferasas. Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, aunque sin limitación, inmunoglobulinas, albúmina, toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de la difteria, una proteína tal como la insulina, factor de necrosis tumoral, interferón α, interferón β, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador de plasminógeno de tejido, un agente trombótico o un antiangiogénico, p. ej., angioestatina o endoestatina, o un modificador de la respuesta biológica, tal como una linfocina, interleucina 1 (IL-1), interleucina 2 (IL-2), interleucina 6 (IL-6), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otros factores de crecimiento.
Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles, por ejemplo, para el diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diferentes enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, núclidos radioactivos, metales emisores de positrones (para uso en la tomografía de emisión de positrones), e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase en general la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.741.900 para los iones metálicos que se pueden conjugar con anticuerpos para su uso como agentes de diagnóstico. Las enzimas idóneas incluyen la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la β-galactosidasa, o la acetilcolinesterasa; los grupos prostéticos idóneos incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes idóneos incluyen umbeliferona, fluoresceína, rojo rodamina, verde rodamina, ficoeritrina B, ficoeritrina R, aloficosianina, rojo Texas, azul Pacific, azul Marina, verde Oregon y Alexa Fluor series 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 y 750; los materiales luminiscentes idóneos incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes idóneos incluyen luciferasa, luciferina y ecuorina; y los núclidos radiactivos idóneos incluyen 125I, 131I, 111In y 99Tc.
Los polímeros naturales o sintéticos para su uso como moléculas efectoras incluyen, por ejemplo, polímeros de polialquileno, polialquenileno, o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada facultativamente sustituidos, o polisacáridos ramificados o sin ramificar, p. ej. un homo-o heteropolisacáridos, tales como lactosa, amilosa, dextrano, almidón o glucógeno. Los sustituyentes facultativos concretos que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados más arriba incluyen uno o varios grupos hidroxi, metilo o metoxi. Los ejemplos concretos de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol), poli(propilenglicol), poli(alcohol vinílico) de cadena lineal
o ramificada facultativamente sustituidos o derivados de los mismos, en especial poli(etilenglicol) facultativamente sustituido, tal como metoxipoli(etilenglicol) o los derivados del mismo.
Se pretende que «derivados», tal y como se utiliza en la presente memoria, incluya los derivados reactivos, por ejemplo, grupos reactivos selectivos de tiol tales como un ácido o éster α-halocarboxílico, p. ej. yodoacetamida, una imida, p. ej. maleimida, una vinilsulfona o disulfuro maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar unido al polímero directamente o a través de un segmento conector. Se apreciará que el resto de dicho grupo en algunos casos formará parte del producto, como grupo de unión entre la proteína y el polímero.
Se apreciará que uno o varios dominios o moléculas biológicamente activas diferentes se pueden fusionar genéticamente, o si no conjugar, al extremo carboxilo del polipéptido monocatenario.
En una realización, el polipéptido Fc monocatenario comprende además un dominio transmembranario fusionado al extremo carboxilo del polipéptido Fc monocatenario. El dominio transmembranario permite que los polipéptidos Fc monocatenarios se expresen en la superficie de una célula. De acuerdo con esto, los dominios transmembranarios adecuados se pueden utilizar en función del tipo de célula de interés. Se han descrito numerosos dominios transmembranarios diferentes, véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente internacional WO 97/23613, WO 99/00494, WO 99/57268, WO 00/63374 y WO 00/63373. Otros ejemplos de dominios transmembranarios idóneos incluyen los dominios transmembranarios naturales con los cuales se expresan las inmunoglobulinas sobre la superficie de los linfocitos B, véanse por ejemplo las secuencias dadas en las SEQ ID n.os 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83 y 86. En una realización, los dominios transmembranarios están unidos al extremo carboxilo del polipéptido Fc
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La presente descripción también da a conocer un procedimiento para la producción de un polipéptido Fc monocatenario que comprende una célula hospedadora que contiene un vector, tal y como está descrito más arriba en la presente memoria, en las condiciones idóneas que conducen a la expresión de la proteína a partir del ADN que codifica el Fc monocatenario, y al aislamiento del polipéptido Fc monocatenario.
El polipéptido Fc monocatenario puede comprender solo una única cadena y, cuando se expresa sola o como una fusión genética con la molécula biológicamente activa, sólo se necesita utilizar una única secuencia que codifica un polipéptido para transfectar las células hospedadoras, por ejemplo, scFvscFc. Para la producción de polipéptidos Fc monocatenarios que comprenden una molécula biológicamente activa que comprende dos o más cadenas, la línea celular se puede transfectar con dos o más vectores, en donde un primer vector codifica el polipéptido Fc monocatenario fusionado a una primera cadena de la molécula biológicamente activa (p. ej., VH-CH1), y un segundo vector codifica una segunda cadena de la molécula biológicamente activa (p. ej., VL-CL). Como alternativa, se puede utilizar un único vector, en donde el vector incluye la secuencia que codifica ambas cadenas de la molécula biológicamente activa, en donde una de las cadenas está fusionada al polipéptido Fc monocatenario.
Una vez producido, el polipéptido Fc monocatenario se puede purificar cuando sea necesario mediante cualquier método idóneo conocido en la técnica, que incluye, por ejemplo, técnicas de cromatografía tales como el intercambio iónico, exclusión por tamaños, cromatografía de interacción hidrófoba o de proteína A.
El tamaño del polipéptido Fc monocatenario se puede confirmar mediante los métodos convencionales conocidos en la técnica, tales como la cromatografía de exclusión por tamaños y el SDS-PAGE no reductor. Tales técnicas se pueden utilizar para confirmar que el scFc no se ha dimerizado. Si se detectan dímeros, entonces los polipéptidos Fc monocatenarios monoméricos se pueden purificar para separarlos de las especies diméricas mediante las técnicas de cromatografía convencionales, tal y como está descrito más arriba.
La funcionalidad de los polipéptidos Fc monocatenarios se puede determinar mediante el uso de cualquier método idóneo conocido en la técnica según las funciones efectoras necesarias, que incluye los métodos dados a conocer en los ejemplos. Los ensayos idóneos incluyen ensayos de fijación del receptor de Fc, ensayos de fijación al complemento, ensayos de coestimulación, ensayos de muerte celular, ensayos de citotoxicidad y ensayos citostáticos. Además, se puede medir la semivida mediante los métodos farmacocinéticos idóneos conocidos en la técnica.
Además, cuando la molécula biológicamente activa se fija a una proteína de la superficie y envía selectivamente el polipéptido Fc monocatenario hacia esta proteína expresada de la superficie, también se pueden utilizar otros ensayos funcionales, tales como los ensayos de muerte celular (p. ej., ensayos de citotoxicidad mediados por el complemento). De acuerdo con esto, un experto en la técnica puede establecer con facilidad los ensayos funcionales idóneos con los que determinar si se consigue la función deseada.
Los polipéptidos Fc monocatenarios descritos en la presente memoria son útiles para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades. De acuerdo con esto, la presente descripción también da a conocer una composición farmacéutica o diagnóstica que comprende un polipéptido Fc monocatenario de la presente invención en combinación con uno o varios de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptables. De acuerdo con esto, se da a conocer el uso de un polipéptido Fc monocatenario tal y como se describe en la presente memoria para la fabricación de un medicamento. Habitualmente, la composición se suministrará como parte de una composición farmacéutica esterilizada que normalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
La presente descripción también da a conocer un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico o de reactivos para investigación que comprende añadir y mezclar el polipéptido Fc monocatenario con uno o varios excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
El polipéptido Fc monocatenario puede ser el único ingrediente activo de la composición farmacéutica o diagnóstica,
o puede venir acompañado con otros ingredientes activos, que incluyen, por ejemplo, otros ingredientes de anticuerpo o no anticuerpo, entre ellos, por ejemplo, antiinflamatorios y quimioterápicos.
Las composiciones farmacéuticas comprenden preferiblemente una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido Fc monocatenario.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, aliviar o impedir una enfermedad o afección deseada, o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier polipéptido Fc monocatenario, la cantidad terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos de animales, habitualmente de roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo de animal también se puede usar para determinar el margen de concentraciones apropiado y la vía de administración apropiada. A continuación, dicha información puede usarse para determinar las dosis y vías que tengan éxito para administración en los humanos.
La cantidad terapéuticamente eficaz para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de enfermedad, de la salud general del sujeto, de la edad, del peso y del sexo del sujeto, de la dieta, del momento y frecuencia de
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administración, de las politerapias farmacológicas, de la sensibilidad a las reacciones, y de la tolerancia/respuesta al tratamiento. Dicha cantidad puede determinarse mediante experimentación convencional y se encuentra dentro del criterio del médico. De forma general, una cantidad terapéuticamente eficaz estará entre 0,01 mg/kg y 50 mg/kg, preferiblemente entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg. Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse por comodidad en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis.
Las composiciones pueden administrarse por separado a un paciente o pueden administrarse en combinación (p. ej., de forma simultánea, secuencial o por separado) con otros agentes, fármacos u hormonas.
La dosis a la que se administra el polipéptido Fc monocatenario de la presente invención depende de la naturaleza de la afección a tratar, del grado de inflamación presente y de si la molécula de anticuerpo está siendo usada de forma preventiva o para tratar una afección existente.
La frecuencia de dosis dependerá de la semivida del polipéptido Fc monocatenario y de la duración de su efecto. Si el polipéptido Fc monocatenario tiene una semivida corta (p. ej., de 2 a 10 horas), podría ser necesario suministrar una o varias dosis al día. Como alternativa, si el polipéptido Fc monocatenario tiene una semivida larga (p. ej., de 2 a 15 días), podría ser necesario administrar tan solo una dosis una vez al día, una vez a la semana o incluso una vez cada 1 o 2 meses.
El vehículo farmacéuticamente aceptable no debería inducir por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición y no debería ser tóxico. Los vehículos idóneos pueden ser macromoléculas grandes, de metabolización lenta, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas víricas inactivas.
Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos minerales, tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables de composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, en dichas composiciones pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como humectantes o emulsionantes o sustancias tamponantes de pH. Dichos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, soluciones viscosas y suspensiones, para ingestión por parte del paciente.
Las formas preferidas para administración incluyen formas idóneas para la administración parenteral, p. ej., mediante inyección o infusión, por ejemplo mediante inyección en embolada o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede adoptar la forma de una suspensión, una solución o una emulsión en un vehículo oleaginoso o acuoso, y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el polipéptido Fc monocatenario puede encontrarse en forma seca, para su reconstitución antes de ser usado con un líquido estéril apropiado.
Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales. Sin embargo, es preferible que las composiciones se adapten para la administración a sujetos humanos.
Las composiciones farmacéuticas de esta descripción pueden administrarse por una serie de vías que incluyen, aunque sin limitación, las vías oral, pulmonar, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase la solicitud de patente internacional WO 98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. También se pueden usar hipoaerosoles y nebulizadores para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como inyectables, como soluciones líquidas o como suspensiones. También se pueden preparar formas sólidas idóneas para disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección.
La administración directa de las composiciones generalmente se realizará mediante inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se administrará al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en una lesión. El tratamiento con dosis puede corresponder a una pauta de dosis única o a una pauta de dosis múltiples.
Se apreciará que el ingrediente activo de la composición será un polipéptido Fc monocatenario. Como tal, será susceptible de degradación en el tubo digestivo. Por tanto, si la composición se va a administrar por una vía que use el tubo digestivo, la composición necesitará contener agentes que protejan el polipéptido Fc monocatenario de la degradación, pero que liberen el polipéptido Fc monocatenario una vez que se ha absorbido en el tubo digestivo.
Se puede encontrar una explicación exhaustiva de los vehículos farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Company, N. J. 1991).
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formato como el mostrado en la figura 1(c)
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formato como el mostrado en la figura 2(b)
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5 Ejemplo 1:
Se diseñaron tres polipéptidos Fc monocatenarios murinos que comprenden una molécula biológicamente activa en el extremo amino, en el que la molécula biológicamente activa era un fragmento Fab de anticuerpo. Las regiones variables del fragmento Fab procedían del anticuerpo murino, Mox46, que se fija al antígeno proteico de la superficie celular. Los dominios Fc procedían de la IgG2a murina y las tres versiones diferentes de estos dominios se muestran
10 a continuación. Las secuencias conectoras están subrayadas. Las secuencias bisagra están en cursiva y, cuando forman parte de la secuencia conectora, están en cursiva y subrayadas.
Versión 1: SEQ ID n.º 88 (formato como el ilustrado en la figura 2b). Las cisteínas de la bisagra entre CH1 y CH2 se han substituido por serinas.
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15 Versión 2: SEQ ID n.º 89 (formato como el ilustrado en la figura 2a).
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Las dos versiones 1 y 3 de Fc monocatenario se encontró que se fijaban tanto a CD64 como a CD32.
Ejemplo 4: Ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento con células recombinantes NSO
Las versiones 1 y 3 de Fc monocatenario se analizaron por su capacidad para provocar la citotoxicidad mediada por el complemento en las células a las que se fijaron.
Una línea NS0 recombinante que expresa el antígeno relevante en su superficie (5 × 106 células por mililitro de medio) se mezcló con 50 µl/ml de complemento de gazapo (Serotec C12CA). Antes de ser usado, el complemento se reconstruyó con 2 ml de agua destilada enfriada en hielo de calidad para cultivo de tejidos. Se utilizó en menos una hora desde la reconstitución y se mantuvo en hielo hasta su uso. Los agentes analizados estaban a una concentración de 2 µg/ml y se sembraron en una placa de 96 pocillos (Costar) en volúmenes de 100 µl por duplicado. Se le añadió por pocillo 100 µl de la mezcla de células/complemento y la placa se incubó a 37 ºC durante 4 horas. La citotoxicidad se valoró mediante la captación de la tinción vital, yoduro de propidio (PI) mediante FACS. Se preparó una solución de reserva de PI a 20 mg/ml (Molecular Probes P-1304MP) en agua destilada y a continuación se diluyó en RPMI 1640 para dar una concentración final en el pocillo de 3 µg/ml. Las células se incubaron durante 10 min a TA en la oscuridad, antes de analizarlas mediante citometría de flujo.
La figura 5a (con complemento) y la figura 5b (sin complemento) muestran que ambas versiones 1 y 3 de los polipéptidos Fc monocatenarios (1.1 y 3.1) inducen la citotoxicidad dependiente del complemento.
Ejemplo 5: Ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento con linfocitos T activados
(i) Las versiones 1, 2 y 3 de Fc monocatenario se analizaron por su capacidad para provocar la citotoxicidad mediada por el complemento en los linfocitos T activados que expresan el antígeno fijado mediante el anticuerpo MOX46 de su superficie. Los métodos utilizados fueron los que están descritos en el ejemplo 4, excepto que se utilizaron los linfocitos T activados primarios en vez de las células NS0 y se produjeron como se describe en el ejemplo 2.
El porcentaje de lisis específica se calculó como sigue:
% de células positivas con PI en la condición experimental – % de fondo de células positivas con PI
% máximo de células positivas con PI (tampón de lisis) – % de fondo de células positivas con PI
Se encontró que las tres versiones de los polipéptidos Fc monocatenarios inducen la citotoxicidad dependiente del complemento (figura 5c).
(ii) Otro polipéptido Fc monocatenario (versión 3) que comprende un fragmento Fab de anticuerpo procedente del anticuerpo murino, 495, que se fija a un antígeno proteico diferente de la superficie celular se produjo como formato de IgG1 y de IgG2a mediante el uso de las regiones Fc murinas. Se analizó la capacidad de estas proteínas scFc para provocar la citotoxicidad mediada por el complemento de los linfocitos T activados que expresan el antígeno fijado mediante el anticuerpo 495 en su superficie. Los métodos utilizados fueron tal y como se describen en el ejemplo 4, excepto que se utilizaron los linfocitos T activados primarios que se produjeron tal y como se describe en el ejemplo 2.
La figura 5d ilustra con claridad que, como se esperaba, sólo el formato de IgG2a del Fc monocatenario y el formato de IgG2b del anticuerpo completo 495 eran capaces de inducir la citotoxicidad dependiente del complemento. Los formatos de IgG1 no consiguieron inducir la citotoxicidad dependiente del complemento.
Ejemplo 6: Fusión receptor-scFc
El dominio 1 del receptor gp130 de humano se clonó como una proteína de fusión de Fc (γ1 de ratón) monocatenaria mediante el formato de Fc monocatenario ilustrado en la figura 1a. La secuencia de la proteína de fusión se muestra a continuación.
Proteína de fusión del dominio 1 de gp130 con scFV (SEQ ID n.º 91)
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La secuencia en negrita representa el dominio 1 del receptor gp130 (aminoácidos 1 a 125 de la SEQ ID n.º 91). La secuencia del conector está subrayada. Las secuencias bisagra están en cursiva y, cuando forman parte del
5 conector, están en cursiva y subrayadas. La secuencia «SSA» entre el extremo carboxilo del dominio 1 de gp130 y la primera secuencia bisagra son los aminoácidos necesarios para introducir el sitio de restricción de XhoI necesario con fines de clonación.
Las construcciones se expresaron transitoriamente en un sistema de células de mamífero (CHO L761) utilizando un vector pVAX y la secuencia señal de ratón B72.3. Se preparó un análisis de inmunotransferencia utilizando la 10 proteína scFc resultante y la transferencia se hibridó con una sonda de Fc antirratón con HRP (Jackson 115-035071) y también con el policlonal anti-gp130 biotinilado (R&D BAF228), revelado con una estrep-HRP. Se detectó una proteína que correspondía al tamaño predicho de la proteína de fusión del dominio 1 de gp130 en el análisis de inmunotransferencia. Los intentos anteriores para expresar el dominio 1 de gp130 por sí solo o uniéndole una etiqueta de His no han tenido éxito. La fusión del dominio 1 de gp130 al polipéptido Fc monocatenario permitió
15 expresar el dominio 1 de gp130.

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