MXPA05000874A - Proteina de fusion igg fc/vih-hp 120/c3d. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere, en general, a un inmunogeno y, en particular, a un inmunogeno para inducir anticuerpos que neutralicen un amplio espectro de aislados primarios de virus de inmunodeficiencia humana (VIH). La invencion tambien se refiere a un metodo para inducir anticuerpos anti-VIH utilizando el mismo.

Description

PROTEÍNA DE FUSIÓN IgG Fc/VIE-gpl20/C3d CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere, en general, a un inmunogeno, y, en particular, a un inmunógeno para inducir anticuerpos que neutralicen un amplio espectro de aislados primarios de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) . La invención también se refiere a un método para inducir anticuerpos anti-virus de inmunodeficiencia humana, utilizando este inmunógeno. ANTECEDENTES Debido a que la epidemia del VIH continúa extendiéndose por todo el mundo, sigue siendo urgente la necesidad de una vacuna efectiva contra el VIH. Un obstáculo clave para el desarrollo de la vacuna contra el VIH es la variabilidad extraordinaria del VIH, y la rapidez y el grado de mutación del VIH (Wain-Hobson en The Evolutionary Biology of Retroviruses, SSB Morse Ed. Raven Press, NY, páginas 185-209 (1994) ) . Myers, orber y colaboradores, han analizado las secuencias del VIH en todo el mundo, y dividieron aislados del VIH en grupos o conjuntos, y proporcionaron una base para evaluar la relación evolutiva de los aislados individuales del VIH unos con otros (Myers y colaboradores (Eds . ) , Human Retroviruses and AIDS (1995) , Publicado por el Theoretical Biology and Biophysics Group, T-10, ail Stop 710, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM 87545) . También, Korber y colaboradores han analizado recientemente el grado de variación en las regiones de proteína del VIH que contienen epítopes de CTL y auxiliares T, y la variación de secuencia documentada en muchos epítopes de CTL y auxiliares T entre aislados del VIH (Korber y colaboradores (Eds.), HIV Molecular Immunology Datábase (1995) , Publicado por el Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM 87545) . Recientemente, Hahn y colaboradores reportaron un nuevo nivel de complejidad de variación del VIH, mediante la demostración de la frecuente recombinación del VIH entre los conjuntos (Robinson y colaboradores, J. Mol. Evol . 40: 245-259 (1995)) . Estos autores sugieren que tantos como el 10 por ciento de los aislados del VIH son mosaicos de recombinación, sugiriendo que las vacunas basadas solamente en un conjunto de VIH no protegerán a los sujetos inmunizados de los aislados de VIH en mosaico (Robinson y colaboradores, J. Mol. Evol. 40: 245-259 (1995)). La presente invención se refiere a un inmunógeno adecuado para utilizarse en una vacuna de VIH. El inmunógeno induce anticuerpos neutralizantes de amplia reacción cruzada en seres humanos, y neutraliza un amplio espectro de aislados primarios del VIH.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un inmunógeno para inducir anticuerpos que neutralizan un amplio espectro de aislados primarios del VIH. La invención también se refiere a un método para inducir anticuerpos anti-VIH utilizando este inmunógeno. Los objetos y ventajas de la presente invención quedarán claros a partir de la siguiente descripción. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Representación esquemática del constructo de C3d-89.6 gpl20-hlg. Figura 2. Representación esquemática del constructo de C3d-89.6 gpl20-Ig. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un inmunógeno que induce anticuerpos neutralizantes ampliamente reactivos que son necesarios para una vacuna efectiva contra el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) . El inmunógeno de la invención comprende cuando menos una proteina de fusión que comprende cuando menos 3 componentes: i) un componente de IgG Fe, ii) un componente de envoltura de VIH (VIH) , y iii) un componente de C3d. De una manera conveniente, el componente de IgG Fe está presente en la proteína de fusión N-terminal para el componente de envoltura del VIH, el cual es N-terminal · para el componente C3d. Sin embargo, los componentes pueden estar presentes virtualmente en cualquier orden. En adición, también puede haber secuencias interventoras (por ejemplo, enlazadoras) presentes. La invención se refiere además a una secuencia de ácido nucleico que codifica esta proteína de fusión. El componente de IgG Fe (convenientemente, IgG Fe humana) de la proteina de fusión de la invención, proporciona a la proteína de fusión una vida media más larga en el suero/ plasma/fluido extracelular. El componente de C3d (convenientemente, C3d humana) dirige la proteína de fusión hacia las células presentadoras de antígeno del sistema inmune que expresa CD21 (el receptor de C3d) , y de esta manera promueve la presentación del antígeno (ver Ahearn y colaboradores, Adv. Immunol . 46: 183 (1989), Cooper y colaboradores, Ann. Rev. Immunol. 6: 85 (1988), Dempsey y colaboradores, Science 271: 348 (1996), Ross y colaboradores, AIDS Res. Hum. Retroviruses 17: 829 (2001)). El componente de envoltura de VIH es, convenientemente, gpl20 de VIH-1; sin embargo, también se pueden utilizar gpl40, gpl60, gp41 de VIH-1, y porciones más pequeñas de gpl20 y gp41. El componente de VIH puede incluir un epítope de auxiliar-T, y puede comprender residuos del dominio C4 de VIH gpl20 (por ejemplo, aproximadamente 16 residuos contiguos del dominio C4 (por ejemplo, aproximadamente los residuos 421 a 436) (ver también las secuencias del dominio C4 en la Publicación Internacional Número 03/039470) ) . El componente de VIH puede incluir residuos del dominio V3 de gpl20 que se seleccionen, por ejemplo, de tal manera que se incluya un epítope de anticuerpo neutralizante de células B. De una forma conveniente, se utilizan cuando menos 23 residuos contiguos del dominio V3 , por ejemplo, cuando menos los residuos 297 a 322 del dominio V3 de VIH gpl20. Los residuos V3 se pueden seleccionar de tal manera que sean representativos de motivos estructurales de orden más alto presentes en una población, cuyos motivos medien las funciones de V3 en el curso de la interacción del VIH mediado por envoltura con las células huéspedes. La Base de Datos de Retrovirus Humano y SIDA de Los Alamos National Laboratories (ver, por ejemplo, Human Retroviruses and AIDS, 2000, Publicado por el Theoretical Biology and Biophysics GT-10, Mail StopK710, LANL, Los Alamos, NM) actualmente contiene más de 14,000 secuencias de envoltura de VIH V3. Los ejemplos de las secuencias de V3 adecuadas para utilizarse en la invención incluyen, pero no se limitan a, las descritas en la Publicación Internacional Número WO 03/039470 y las enlistadas en seguida: Secuencia (s) de V3 RPNNNTRRNIHIGLGRRFYAT RPNNNTRRSVRIGPGGAMFRTG RPIKIERKRIPLGLGKAFYTTK RPSVNNTRRSIHMGLGRAFYTTG RPNRHTGKSIRMGLGLRAWHTTR RRNIHIGLGRRF RRSVRIGPGGAM RKSIRIGPGRAV RRRISIGPGRAF RKSIHIGPGRAF RKSIHIAPGRAF RPNNNTRKGIHIGPGRTFFATG RPNNNTRKSINIGPGRAFYTTG RPNNNTRKSIQIGPGRAFYTTG RPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTG RPNNNTRKSIHIGPGRAFYATE RPNNNTRKRMTLGPGKVFYTTG RPGNNTRGSIHLHPGRKFYYSR Secuencia en Consenso de V3 Nombre de Sec.Total Secuencia Base Datos Secuencia de Aminoácidos 1.481 945 SVEINCTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRCAHCNISRA 52.19C 952 SVEINCTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYATERIIGDIRCAHCMISRT 52.19AT SVEINCTRP NTR SIHIGPGRAFYATETTRIIGDIRCAHCNISRT 162.7 11 SVEINCTRPGNNTRGSIHLHPGRKFYYSRGIIGDIREAHCAINIP 170.6 7 SVEINCTRPNNNTRRSVRIGPGGAMFRTGDIIGDIRCAHCNLSRT 34.29 39 SIEINCTRP NTRKSIQIGPGRAFYTTGEIIGDIRCAHCNLSRA 74.17 94 SVEINCTRPÍMWTR RMTLGPGKVFYTTGEIIGDIRKAHCNISRA 396.2 2 SVAINCTRR N TRRNIHIGLGRRFYATEIIGDTKKADCNISRA 23.38 25 S EINCTR IKIER RIPLGLGKAFYTTKQVGDIKCAHC 32.15 36 PVEINCTRP N TRSIHIAPGRAFYTTGQIIGDIRRAHCNISRT 57.2 21 TWINCTRPNRHTGKSIRMGLGRAWHTTREIIGDIRKAYCTLNGT 36.29 46 SVNINCTRPNNNTRKGIHIGPGRTFFATGDIIGDIRQAHCNLSRT BAL V3 CTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRIQAHC La proteína de fusión se puede utilizar por s£ misma como un inmunógeno, o la proteína de fusión puede estar presente como un complejo en el que se haya "activado" el componente de envoltura de VIH, para exponer las conformaciones intermedias de epítopes de neutralización conservados que normalmente sólo se exponen de una forma transitoria o menos bien sobre la superficie del virión del VIH. La forma disparada "congelada" de la envoltura de VIH pone a disposición epítopes específicos para presentarse ante los linfocitos B. El resultado de esta presentación de epítopes, es la producción de anticuerpos que neutralizan ampliamente el VIH. El concepto de una envoltura disparada es consistente con las observaciones de que el péptido de la región gp41 HR-2, DP178, puede capturar una conformación desenrollada de gp41 (Furata y colaboradores, Nature Struct . Biol. 5: 276 (1998)), y con el reporte de que las células infectadas por VIH fijadas con formalina, pueden generar anticuerpos ampliamente neutralizantes (LaCasse y colaboradores, Science 283: 357 (1997)). Recientemente, se enlazó un anticuerpo monoclonal contra la región de espiral enrollada, a un determinante conformacional de gp41 en las regiones HR1 y HR2 de la estructura de gp41 de la espiral enrollada, pero no neutraliza el VIH (Jiang y colaboradores, J. Virol . 10213 (1998)). Sin embargo, este último estudio probó que la región de espiral enrollada está disponible para que el anticuerpo se enlace si se genera el anticuerpo correcto . Los sitios de neutralización conservados sobre la envoltura de VIH pueden estar sobre dos regiones : pueden estar sobre gp41, y pueden estar sobre gpl20. Se puede esperar que las regiones y conformaciones de gp41 que están expuestas durante el "disparo" ("activación") de gpl40 (ó gpl60) se conserven, debido a que: i) se conservan las secuencias de aminoácidos de la región de espiral enrollada, y ii) se conserva la función del complejo de envoltura fusogénica y es esencial para la patogenicidad del virus. Esta conservación es clave para la producción de anticuerpos anti-VIH ampliamente neutralizantes. En una modalidad, la proteína de fusión de la invención tiene las características de una envoltura ligada con el receptor (CD4) , con la región de enlace de CCR5 expuesta, pero a diferencia de las proteínas ligadas con CD4 que tienen el sitio de enlace de CD4 bloqueado, esta protexna de fusión tiene el sitio de enlace de CD4 expuesto (abierto) . Más aún, en esta modalidad, la proteína de fusión puede estar desprovista del CD4 del huésped, lo cual evita la producción de anticuerpos anti-CD4 potencialmente dañinos al administrarse a un huésped. El componente de envoltura gp!20 de la proteína de fusión de la invención se puede ligar con un ligando que se enlace a un sitio sobre gp!20 reconocido por un anticuerpo monoclonal (mab) A32. (Wyatt y colaboradores, J. Virol . 69: 5723 (1995), Boots y colaboradores, AIDS Res. Hum. Retro. 13: 1549 (1997), Moore y colaboradores, J. Virol. 68: 8350 (1994) ) . Se ha demostrado que un anticuerpo monoclonal A32 imita al CD4, y cuando se enlaza con gpl20, incrementa (expone) el sitio de enlace de CCR5 (Wyatt y colaboradores, J. Virol. 69: 5723 (1995)). El ligamiento de gpl20 con este ligando también incrementa el sitio de enlace de CD4 y no bloquea el enlace de CD4 con gpl20. De una manera conveniente, estos ligandos también incrementan el sitio de enlace de HR-2 de gp41 que se puede enlazar al gp!20 disociado, al gpl40 no disociado, y al gp41 disociado, exponiendo de esta manera adicionalmente los sitios de enlace de HR-2 sobre estas proteínas - cada una de las cuales es un objetivo potencial para los anticuerpos neutralizantes anti-VIH, cuando se expresan como proteínas de fusión IgFc/gpl20/C3d. En un aspecto específico de esta modalidad, el componente gpl20, gpl40, ó gpl60 de HIV-1 de la proteína de fusión de la invención, se liga ya sea con un mab A32 intacto, un fragmento Fab2 de un mab A32, o un fragmento Fab de un mab ?32, con el resultado de que el sitio de enlace de CD4, el sitio de enlace de CCR5 , y el sitio de enlace de HR-2 sobre gp!20, gpl40, ó gpl60, se exponen/se incrementan. El inmunógeno puede comprender un mab A32 (o fragmento del mismo) enlazado al componente gpl20 de la proteína de fusión, o puede comprender un mab A32 (o fragmento del mismo) enlazado y reticulado con un reticulante, tal como formaldehído al 0.3 por ciento, o un reticulante heterobifuncional , tal como DTSSP (Pierce Chemical Company) , con el componente gpl20 de la proteína de fusión. Un mab A32 (o fragmento del mismo) enlazado al componente gpl40 ó gpl20 de la proteína de fusión, resulta en el incremento (la exposición) de los sitios de enlace de HR-2 en gpl20 y gp!40. El enlace de un mab ?32 (o fragmento del mismo) a los componentes gpl20 ó gpl40, también resulta en el incremento del sitio de enlace de CD4 y del sitio de enlace de CCR5. Como con los complejos que comprenden proteínas de fusión que contienen gpl20, se pueden utilizar los complejos que comprendan proteínas de fusión que contengan gpl40 y un mab A32 (o fragmento del mismo) como un inmunógeno no reticulado o reticulado con el reticulante, tal como formaldehído al 0.3 por ciento o DTSSP. En una modalidad, la invención se refiere a un inmunógeno que comprende una proteína de fusión cuyo componente gpl40 está enlazado y reticulado con un fragmento Fab de un mab A32, opcionalmente enlazado y reticulado con una proteína de enlace de HR-2. La proteína de fusión de la invención disparada con un ligando que se enlace al sitio de enlace del mab A32 sobre gp!20, se puede administrar en combinación con cuando menos una segunda proteína de fusión que comprenda un segundo componente gp!20 (ó gpl40) de VIH-l, disparado por un ligando que se enlace a un sitio distinto del sitio de enlace del mab A32, tal como el sitio de enlace de CCR5 reconocido por el mab 17b. El mab 17b ( wong y colaboradores, Nature 393: 648 (1998) disponible en el AIDS Reference Repository, NIAID, NIH) aumenta el enlace de sCD4 con gpl20. Esta segunda proteína de fusión, por ejemplo, puede comprender un componente gpl20 de VIH-1 ligado ya sea con el mab 17b entero, un fragmento Fab2 del mab 17b, o un fragmento Fab del mab 17b. Se apreciará que se pueden utilizar otros ligandos de CCR5, incluyendo otros anticuerpos (o fragmentos de los mismos) , que den como resultado que se exponga el sitio de enlace de CD4, en lugar del mab 17b. Esta proteína de fusión adicional puede comprender un componente gpl20 con el mab 17b, o fragmento del mismo (u otro ligando de CCR5, como se indica anteriormente) enlazado al mismo, o puede comprender un componente gpl20 con el mab 17b, o fragmento del mismo (u otro ligando de CCR5, como se indica anteriormente) enlazado y reticulado con un agente tal como formaldehído al 0.3 por ciento o un reticulante heterobifuncional , tal como DTSSP (Pierce Chemical Company) . (Esta segunda proteína de fusión, que comprende un componente gpl20 de VIH-1 ligado ya sea con el mab 17b entero, un fragmento Fab2 del mab 17b, o un fragmento Fab del mab 17b (u otro ligando de CCR5) , se puede utilizar también por sí mismo como un inmunógeno) . Se pueden agregar péptidos HR-2 solubles, tales como T649Q26L y DP178, a los complejos anteriormente descritos, para estabilizar los epítopes sobre los componentes gpl20 ó gpl40 de las proteínas de fusión, y se pueden administrar ya sea reticulados o no reticulados con el complejo de inmunógeno. Se ha hecho una serie de anticuerpos monoclonales (mabs) que neutralizan muchos aislados primarios del VIH, incluyendo, en adición al mab 17b descrito anteriormente, el mab IgGlbl2 que se enlaza al sitio de enlace de CD4 sobre gpl20 (Roben y colaboradores, J. Virol . 68: 482 (1994), Mo y colaboradores, J. Virol. 71: 6869 (1997)), el mab 2G12 que se enlaza a un determinante de conformación sobre gpl20 (Trkola y colaboradores, J. Virol. 70: 1100 (1996)), y el mab 2F5 que se enlaza a una región proximal de membrana de gp41 (Muster y colaboradores, J. Virol. 68: 4031 (1994)). Se puede utilizar una mezcla de proteínas de fusión que comprendan componentes de envoltura disparados, con el fin de optimizar la inducción de anticuerpos que neutralicen un amplio espectro de aislados primarios del VIH. Estas proteínas de fusión, cuando se administran a un primate, por ejemplo, ya sea sistémicamente o bien en un sitio mucoso, inducen anticuerpos neutralizantes ampliamente reactivos para los aislados primarios del VIH. Como se indicó anteriormente, se pueden emplear diferentes planteamientos para "congelar" los epítopes fusogénicos de acuerdo con la invención. Por ejemplo, la "congelación" se puede efectuar mediante la adición de péptidos HR-2 solubles, tales como los péptidos DP-178 ó T-649Q26L, que representan porciones de la región de espiral enrollada, y que, cuando se agregan a la envoltura disparada por CD4 , dan como resultado la prevención de la fusión (Rimsky y colaboradores, J. Virol. 72: 986-993 (1998)). El péptido HR-2 se puede enlazar (o reticular mediante DTSSP (Pierce Co . ) , ó formaldehido) al componente gp!40 de la proteína de fusión de la invención, y el complejo se puede utilizar como un inmunógeno. La "congelación" también se puede efectuar mediante la adición de formaldehído o paraformaldehido del 0.1 por ciento al 3 por ciento, ambos agentes reticulantes de proteínas, al complejo para estabilizarlo (LaCasse y colaboradores, Science 283: 357-362 (1999)). Además, la "congelación" de los intermediarios de fusión de gpl20 se puede efectuar mediante la adición de agentes heterobifuncionales , tales como DSP (ditiobis- [succimidil-proprionato] ) (Pierce Co., Rockford, ILL. , Número 22585ZZ) , o el DTSSP soluble en agua (Pierce Co . ) que utiliza dos ésteres de NHS que son reactivos con grupos amino para reticular y estabilizar el complejo gpl60 de CD4, CCR5, ó CXCR . Existen diferencias inherentes en los aislados del VIH entre los conjuntos de VIH y entre los aislados de VIH de pacientes, en localizaciones geográficas variables. Se pueden hacer proteínas de fusión disparadas para el desarrollo de la vacuna de VIH, con componentes de envoltura de VIH a partir de una variedad de conjuntos de VIH, y a partir de una variedad de localizaciones. Las proteínas de fusión disparadas que comprenden anticuerpos o fragmentos de los mismos que incrementan el sitio de enlace de CCR5, el sitio de enlace de CD4, o ambos, o los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, que son inducibles por CD4 , se pueden producir mediante co-expresión de una manera dicistrónica en un plásmido, tanto de la proteína de fusión como, por ejemplo, la cadena pesada y ligera de la región Fab del anticuerpo, con el objeto de producir una protelna recombinante que tenga las propiedades de los complejos anteriormente descritos. La(s) proteína (s) de fusión de la invención se puede (n) formular con un vehículo y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable (tal como alum) empleando técnicas bien conocidas en este campo. Las vías de administración adecuadas del presente inmunógeno incluyen la sistémica (por ejemplo, intramuscular o subcutánea) . Se pueden emplear vías alternativas cuando se busca una respuesta inmune en un sistema mucoso inmune (por ejemplo, intranasal) . De una manera alternativa, se puede administrar un constructo que codifique la proteína de fusión bajo condiciones tales que se exprese la secuencia de codificación y se produzca la proteína de fusión. Ciertos aspectos de la invención se describen con mayor detalle en el Ejemplo no limitante que sigue. (Ver también la Publicación Internacional Número WO 02/024149 ó la Solicitud Número 09/960,717, presentada el 24 de septiembre de 2001, y la Solicitud Número 10/431,596, presentada el 8 de mayo de 2003, y la Solicitud Provisional Número 60/471,327, presentada el 19 de mayo de 2003, las cuales se incorporan a la presente como referencia) . EJEMPLO 1 Se inmunizaron conejillos de indias con una proteína de fusión IgG-89.6gpl20-C3d. La proteína se administró en Adyuvante de Freund Completo (CFA) y luego en Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) . En la Tabla 1 se muestran las titulaciones del anticuerpo neutralizante resultante (NAb) . (SHIV-89.6P es el virus contra el cual se dirigieron los anticuerpos neutralizantes) . Inmunización de Conejillos de Indias con la Proteína IgG-89.6gpl20-C3d Los animales se inmunizaron con 50 microgramos de proteína en CFA, y luego en IFA. Titulación de NAb con: Fecha de Número de Animal Sangrado Inoculaciones SHIV-89.6 SHIV-89.6P GP356 03-26-01 Pre <10 <20 04-27-01 2x 44 <20 05-18-01 3x 157 95/114 06-07-01 4x 781 110/90 GP357 03-26-01 Pre <10 <20 04-27-01 2x 19 23 05-18-01 3x 49 <20 06-07-01 4x 41 <20 GP358 03-26-01 Pre <10 <20 04-27-01 2x 35 30 05-18-01 3X 73 20 06-07-01 4X 61 62 * Las titulaciones de anticuerpo neutralizante (NAb) son el reciproco de la dilución en suero en la que se protegió al 50 por ciento de las células de la aniquilación inducida por el virus, como se midió mediante recuperación de rojo neutro.

Con el fin de generar el constructo c3d-gpl20 89.6 Ig (Figura 1) , se han tomado los siguientes pasos empleando técnicas moleculares convencionales (Figura 2) : 1) Con el fin de facilitar la clonación, a partir del complemento C3 se derivaron y sintetizaron, un iniciador 5' (Nhel-c3d-3064/Fl, CCG TGC TAG CCC ACC TCA TTG TGA CCC CCT CG) con la enzima de restricción Nhel, y un iniciador 3' (BamHl-c3d-3946/Rl : CTA TTG GAT CCC GGC GGC TGG GCA GTT GGA GGG ACA C) con el sitio de enzima de restricción BamHI . 2) Se generó un fragmento de ADN que contenía la secuencia de codificación c3d mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el plásmido pC3d (de David Montifiori) , que contiene el ADNc de C3 entero como una plantilla, y los iniciadores Nhel-c3d-3064/F1 y BamHl-c3d-3946/R1. 3) El producto de la PCR se digirió con Nhel y BamHI, y se ligó con el plásmido CD-19-Rg que contenía una secuencia secracional de CD5. 4) Entonces se cortó el fragmento de ADN c3d junto con la secuencia de señal secracional de CD5 a partir del plásmido resultante, con Xhol y BamI , y se clonó en los sitios Xhol-BamHI en el plásmido CDM8 que contenia el gen Ig humano . 5) Con el fin de clonar el 89.6 gpl20, se derivaron y sintetizaron, un iniciador 5' (Bam89.6/F1 : CTA TTG GAT CCA GCA ??? GAA AAA ACG TGG GTC ACA ATC) y un iniciador 3' (Bam89.6gpl20Rl : CTC TGG ATC CCG TCT TTT TTC TCT TTG CAC TGT TCT TCT C) con sitios de enzimas de restricción BamHI, a partir de VIH 89.6 env. 6) Se generó el ADN de gpl20 de envoltura VIH 89.6 (de Bob Dome) mediante la PCR, utilizando el plásmido 89.6gpl20 como una plantilla, y los iniciadores Bam89.6/Fl y Bam89.6gpl20Rl . 7) Luego se digirió el producto de la reacción en cadena de la polimerasa del gpl20 de envoltura VIH 89.6 con BamHI, y se ligó con el ADN del plásmido CDM8-c3d digerido con BamHI. Se identificaron los clones con la orientación correcta del gen gpl20 de envoltura VIH 89.6 mediante secuenciación .

Todos los documentos citados anteriormente se incorporan en su totalidad a la presente como referencia. Un experto en la materia apreciará, a partir de una lectura de esta divulgación, que se pueden hacer diferentes cambios en la forma y el detalle, sin apartarse del verdadero alcance de la invención.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión, la cual comprende: i) un componente IgG Fe, ii) un componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana, y iii) un componente C3d.

2. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el componente IgG Fe está presente en esta proteína de fusión N-terminal para el componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana.

3. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana está presente en esta proteína de fusión N-terminal para el componente C3d.

4. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el componente IgG Fe está presente en esta proteína de fusión N-terminal para el componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana, y el componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana está presente en la proteína de fusión N-terminal para el componente C3d.

5. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque esta proteína comprende además cuando menos una secuencia interventora entre cuando menos dos de estos componentes .

6. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el componente IgG Fe es un componente IgG Fe humano.

7. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el componente C3d es un C3d humano.

8. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el componente C3d dirige a la proteína de fusión hacia las células que presenten antígeno que expresen CD21, y de esta manera promueve la presentación del antígeno.

9. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana es gpl20, gp!40, gpl60, gp41 de VIH-l, o la porción inmunogénica de gp!20 ó gp41.

10. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana comprende residuos del dominio V3 de gpl20, e incluye un epítope de anticuerpo neutralizante de células B.

11. Una composición inmunogénica, la cual comprende cuando menos una de las proteínas de fusión de conformidad con la reivindicación 1.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque esta composición comprende además un vehículo.

13. Un complejo que comprende a la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana de esta proteína de fusión, está activado, de tal manera que se exponen las conformaciones intermedias de los epítopes de neutralización conservados de este componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana .

14. Un complejo que comprende a la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana se enlaza a un ligando que incrementa cuando menos uno de un sitio de enlace de CD4 y un sitio de enlace de CCR5 de dicho componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana.

15. El complejo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ligando es un anticuerpo, o un fragmento Fal¾ ó Fab del mismo.

16. El complejo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ligando se enlaza a un sitio de enlace de CCR5 del componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana, e incrementa un sitio de enlace de CD4 de dicho componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana.

17. El complejo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porgue el ligando incrementa un sitio de enlace de CCR5 y uno de CD4 sobre el componente de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana.

18. Un método para inducir una respuesta inmune en un mamífero, el cual comprende administrar a ese mamífero una cantidad de la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1, suficiente para efectuar dicha inducción.

19. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1.

20. Un vector de expresión, el cual comprende al ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19, operativamente enlazado a un promotor.