ES2333598T3

ES2333598T3 - Proteinas quimericas del factor de coagulacion fc para tratar la hemofilia.

Info

Publication number: ES2333598T3
Application number: ES04751357T
Authority: ES
Inventors: Daniel S. Rivera; Robert T. Peters; Alan J. Bitonti
Original assignee: Syntonix Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date: 2003-05-06
Filing date: 2004-05-06
Publication date: 2010-02-24
Anticipated expiration: 2024-05-06
Also published as: CA2522859C; DE602004022800D1; US20150044207A1; US8449884B2; EP2298347A1; ES2361036T3; WO2004101740A3; DK2298347T3; EP1624891A2; EP3002012A9; CY2016039I2; DE602004031390D1; EP3552627A1; AU2010201711A1; SI1624891T2; HK1153947A1; CY1111725T1; US20180237762A1; SI1624891T1; EP2077121B1

Abstract

Una proteína quimérica que comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, al menos un factor de coagulación seleccionado del grupo que consiste del factor VIII, factor VIIIa, factor V, factor Va, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII o factor de von Willebrand, y opcionalmente al menos un ligador.

Description

Proteínas quiméricas del factor de coagulación Fc para tratar la hemofilia.

Esta aplicación reivindica de prioridad a la United States Provisional Appln. No. 60/468,837, archivada en Mayo 6, 2003.

Campo de la invención

La invención se relaciona generalmente con el campo de terapéuticos para desórdenes hemostáticos. Más específicamente, la invención se relaciona con una proteína quimérica para el tratamiento de un trastorno hemostático.

Antecedentes de la invención

Los trastornos hemostáticos se caracterizan por sangrado no controlado, que resulta en la incapacidad o capacidad reducida para formar coágulos de fibrina. Los trastornos hemostáticos pueden resultar de un defecto genético o se pueden adquirir como un resultado de una condición médica no relacionada (por ejemplo, cáncer y quimioterapia relacionada, enfermedad autoinmune) (Kasper 2000, Hemophilia 6(Supp):13; Cohen et al. 1996, Bailiere's Clinical Hematology 9(2):331). Por lo general, los trastornos hemostáticos resultan de la deficiencia de un factor de coagulación de la sangre específico. Ejemplos clásicos de trastornos hemostáticos incluyen hemofilia A, que resulta de una deficiencia en el factor VIII; hemofilia B (enfermedad de Christmas), que resulta de una deficiencia en el factor IX; y la enfermedad de von Willebrand, que resulta en un defecto en el factor de von Willebrand. El factor de von Willebrand circula en asociación con el factor VIII y lo estabiliza. Media la adherencia de las plaquetas entre sí y con las paredes de vasos sanguíneos lesionadas. Otros, trastornos hemostáticos menos comunes incluyen deficiencia del factor XI (deficiencia de PTA), deficiencia del factor XII, así como deficiencias o anormalidades estructurales en fibrinógeno, protrombina, factor V, factor VII, factor X, o factor XIII (Kasper 2000, Hemophilia 6(Supp):13).

Los factores de coagulación actúan en concierto con otros, en una cascada de coagulación que finalmente resulta en la formación de un coágulo de fibrina (Figura 1). Estos factores pueden existir en un estado de reposo como una proenzima o zimógeno o en un estado enzimático activo cuando se estimula para formar un coágulo. La estimulación de estos factores, puede ocurrir por dos rutas distintas, la ruta intrínseca y la ruta extrínseca. La ruta intrínseca se refiere a aquellas reacciones que conducen a la formación de coágulos mediante el uso de factores presentes solo en el plasma. En contraste, la ruta extrínseca se refiere a aquellas reacciones que conducen a la formación de coágulos de la liberación de factor de tejido de enlace de membrana por la interrupción del endotelio del vaso.

El factor VII participa en ambas rutas que dividen el factor X en el factor Xa activado en relación con el factor tisular en la ruta extrínseca o que interactúa con el factor IXa en la ruta intrínseca. El factor VII actúa secuencia abajo e independientemente de los factores VIII y IX cuando actúa a través de la ruta extrínseca, evitando así la necesidad de estos factores de coagulación. Es, por lo tanto, un candidato terapéutico atractivo para tratar trastornos hemostáticos, especialmente Hemofilia A y B. (U.S. Patent No. 6,310,183; WO 01/58935).

El factor VII, es una proteína de plasma dependiente de la vitamina K, sintetizada en el hígado y segregada en la sangre como una glicoproteína de cadena sencilla con un peso molecular de 53 kDa (Broze et al. 1980, J. Biol. Chem. 255:1242). El zimógeno del factor VII se convierte en una forma activa (FVIIa) por división proteolítica en un sitio único, Arg152-Ile153, resultando en dos cadenas, pesada (254 aminoácidos) y ligera (154 aminoácidos) unidas por un enlace disulfuro sencillo (Hagen et al. 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83:2412). La forma activa del factor VII se une al factor tisular, el cual luego se convierte de factor X a factor Xa. El factor Xa se necesita para convertir la protrombina a trombina, que convierte el fibrinógeno a fibrina como una etapa final para formar un coágulo de fibrina.

El factor VII experimenta modificaciones pos-translacionales, incluyendo la carboxilación dependiente de la vitamina K, que resulta en diez residuos de ácido \gamma-carboxiglutámico en la región terminal-N de la molécula. Otras modificaciones pos-translacionales incluyen unión de la fracción de azúcar a dos sitios de glicosilación N-ligados que ocurren naturalmente en la posición 145 y 322, respectivamente, y en dos sitios de glicosilación O-ligados que ocurren naturalmente en la posición 52 y 60, respectivamente (WO 01/58935).

La terapia tradicional para trastornos hemostáticos denominada para reemplazo parenteral de diferentes factores de coagulación tales como factor VII, factor VIII o factor IX (ver, por ejemplo, U.S. Patent Nos. 6,310,183 y 4,784,950). El tratamiento con frecuencia implica tanto la administración de factores de coagulación para tratar episodios de sangrado agudos, así como la administración de factores de coagulación para impedir profilácticamente la ocurrencia de futuros episodios de sangrado. Se ha encontrado que la profilaxis reduce el riesgo del desarrollo de problemas de articulaciones y artritis asociados con episodios de sangrado frecuentes (Petrini 2001, Hemophilia 7:99; Fischer et al. 2002, Blood 99(7):2337).

Las terapias tradicionales, sin embargo, tienen muchos problemas asociados. En la actualidad, los factores de coagulación se deben administrar vía parenteral con el fin de lograr dosis efectivas debido a que hasta la fecha, los métodos no-invasivos no han tenido éxito en alcanzar niveles terapéuticos. Los problemas asociados con la administración parenteral incluyen oclusión, dolor e infección de sitio de inyección. El uso de un catéter en-línea aumenta el riesgo de todos estos eventos. Problemas específicos asociados con la administración parenteral de factores de coagulación en bebés y niños pequeños incluyen el acceso venoso central. Adicionalmente, la administración parenteral de factores de coagulación corre el riesgo de precipitar un episodio de sangrado. Estos problemas son particularmente relevantes cuando el paciente está experimentando la administración profiláctica regular de un factor de coagulación.

Los factores de coagulación, tales como factor IX y factor VIII deben darse con frecuencia y en grandes dosis, lo que da lugar al desarrollo de anticuerpos del inhibidor contra el factor de coagulación en un número significante de pacientes (ver, por ejemplo, Nilsson 1992, Transfusion Medicine Review 6(4):285; Cohen et al. 1996, Bailiere's Clinical Hematology 9(2):331).

Un aspecto de la invención proporciona un tratamiento seguro más efectivo para trastornos hemostáticos. Otro aspecto de la invención proporciona el aumento de la vida media del suero y el incremento de la biodisponibilidad de terapéuticos administrados a través de medios no-invasivos para el tratamiento de trastornos hemostáticos, reduciendo así el riesgo de que suceda un episodio de sangrado, infección y oclusión del sitio de inyección asociado con la administración parenteral. Otro aspecto de la invención proporciona la terapia para los trastornos hemostáticos con un riesgo reducido, en comparación con las terapias actuales, de desarrollo de anticuerpos del inhibidor contra el factor de coagulación. Incluso otro aspecto de la invención proporciona un tratamiento profiláctico de un trastorno hemostático.

Los aspectos de la invención proporcionan una proteína quimérica compuesta de al menos un factor de coagulación y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, en donde el factor de coagulación es capaz de promover la coagulación de la sangre y/o la formación del coágulo de fibrina.

Las proteínas quiméricas que comprenden una porción Fc de una inmunoglobulina se conocen (ver, por ejemplo, U. S. Patent Nos. 6,030,613, 6,086,875, 6,485,726, y PCT Application No. US/02/21335) y mientras que las proteínas quiméricas compuestas de factores de coagulación mutantes sin actividad de coagulación, y las inmunoglobulinas se han descrito previamente (WO01/02439 y WO 01/02240), las proteínas quiméricas que comprenden un factor de coagulación (i.e., que tiene la actividad de coagulación) y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina se han descrito solo para la tromboplastina (EP 0 464 533). El factor de coagulación según se define a continuación y se emplea aquí se refiere a cualquier molécula con actividad de coagulación tal como se define en este documento.

Resumen de la invención

La invención se relaciona con una proteína quimérica mejorada como se describe en las reivindicaciones 1 y 10 para tratar trastornos hemostáticos. La invención proporciona una proteína quimérica como se describe en las reivindicaciones 1 y 10, para tratar un trastorno hemostático que puede ser administrado vía parenteral o de manera no-invasiva (por ejemplo, vía una ruta pulmonar, nasal, u oral). La invención, de esta manera se relaciona con una proteína quimérica como se describe en las reivindicaciones 1 y 10, que comprende al menos un factor de coagulación y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina.

La invención se relaciona con un método para tratar un trastorno hemostático que comprende la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de una proteína quimérica que comprende al menos un factor de coagulación como se describe en las reivindicaciones 1 y 10 y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina.

La invención se relaciona con un método para hacer una proteína quimérica como se describe en las reivindicaciones 1 y 10, que comprende al menos un factor de coagulación y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina; dicho método que comprende la transfección de una célula con una construcción de ADN que comprende una primera secuencia de ADN que codifica al menos un factor de coagulación, ligada operativamente a una segunda secuencia de ADN que codifica al menos una porción de una inmunoglobulina.; el cultivo de dicha célula bajo condiciones, de tal manera que la proteína quimérica se exprese; y el aislamiento de dicha proteína quimérica a partir de dicha célula.

La invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica al menos un factor de coagulación como se describe en las reivindicaciones 1 y 10 y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina.

La invención se relaciona con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que codifica al menos un factor de coagulación como se describe en las reivindicaciones 1 y 10 y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1, es un diagrama que muestra la ruta extrínseca e intrínseca de la cascada de coagulación.

Figura 2, es un diagrama de las formas inactivas y activas del factor VIIa-Fc.

Figura 3A, es la secuencia de aminoácido de una proteína quimérica que comprende el factor VIIa y un fragmento Fc de una inmunoglobulina (SEQ ID NO:1).

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Figura 3B, es la secuencia de aminoácido de un fragmento Fc de una inmunoglobulina (SEQ ID NO:2).

Figura 3C, es la secuencia de ácido nucleico de un fragmento Fc de una inmunoglobulina (SEQ ID NO:3).

Figura 3D, es la secuencia de ácido nucleico de una proteína quimérica que comprende el factor VIIa y un fragmento Fc de una inmunoglobulina (SEQ ID NO:4).

Figura 4, es un diagrama de los resultados de un ensayo STA-CLOT demostrando que el factor VIIa-Fc tiene actividad significante de coagulación.

Figura 5, es un diagrama que muestra el factor VIIa-Fc unido a un receptor neonatal Fc humano soluble (shFcRn).

Figura 6, demuestra niveles en plasma durante el tiempo para el factor VIIa-Fc administrado vía oral en ratas neonatales.

Figura 7, compara la absorción oral en ratas neonatales de híbridos monómero/dímero del Factor VIIa-Fc que comprende dos cadenas de polipéptido, cada cadena que comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina y en donde el factor VII se une a solo una de las dos cadenas, contra los homodímeros compuestos de dos cadenas de polipéptido en donde ambas cadenas comprenden al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina y ambas cadenas también comprenden el factor VII.

Figura 8A, muestra los niveles en plasma en el tiempo del factor VIIa-Fc administrado vía intravenosa a minipigs, en donde el factor VIIa-Fc es un híbrido monómero/dímero, que comprende dos cadenas de polipéptido, cada cadena compuesta de al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina y en donde el factor VII se une a solo una de las dos cadenas.

Figura 8B, muestra la actividad de coagulación en el tiempo, del factor VIIa-Fc administrado vía intravenosa a minipigs en donde el factor VIIa-Fc es un híbrido monómero/dímero, que comprende dos cadenas de polipéptido, cada cadena compuesta de al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina y en donde el factor VII se une a solo una de las dos cadenas.

Figura 9A, es la secuencia de aminoácido del Factor IX-Fc de la proteína quimérica. Incluida en la secuencia está el péptido señal (subrayado) que se divide por la célula y el propéptido (negrilla) que se reconoce por la \gamma carboxilasa dependiente de la vitamina K que modifica el Factor IX para lograr una actividad total. La secuencia posteriormente se divide por PACE para producir el Factor IX-Fc.

Figura 9B, es la secuencia de ácido nucleico del Factor IX-Fc de la proteína quimérica. Incluido en la secuencia está el péptido señal (subrayado) y el propéptido (negrilla) que se reconoce por la \gamma carboxilasa dependiente de la vitamina K, que modifica el Factor IX para lograr la actividad total. La secuencia traducida posteriormente se divide por PACE para producir el Factor IX-Fc maduro.

Resumen de las secuencias

1

Descripción de las modalidades A. Definiciones

Etiqueta de afinidad, como se utiliza aquí, significa una molécula unida a una segunda molécula de interés, capaz de interactuar con un socio de enlace específico con el fin de aislar o identificar dicha segunda molécula de interés

Análogos de, o proteínas o péptidos o sustancialmente idénticos a las proteínas quiméricas de la invención, como se utiliza aquí, significa que una secuencia de aminoácido relevante de una proteína o un péptido es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, o 100% idénticos a una secuencia dada. A modo de ejemplo, dichas secuencias pueden ser variantes derivadas de varias especies, o se pueden derivar de la secuencia dada por truncamiento, deleción, sustitución o adición de aminoácido. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácido se determina por algoritmos de alineación estándar tales como, por ejemplo, Basic Local Alignment Tool (BLAST) descrita en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410, el algoritmo de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol., 48:444-453; el algoritmo de Meyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci., 4:11-17; o Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett., 174:247-250, etc. Tales algoritmos se incorporan en los programas BLASTN, BLASTP y "Secuencias 2 BLAST" (ver www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Cuando se utilizan este tipo de programas, los parámetros por defecto se pueden utilizar. Por ejemplo, para las secuencias de nucleótidos los siguientes ajustes se pueden utilizar para "Secuencias BLAST 2": programa BLASTN, recompensa para apareamiento 2, penalización para apareamiento erróneo -2, hueco abierto y penalizaciones de extensión de hueco 5 y 2 respectivamente, espacio x caída 50, esperado 10, tamaño de palabra 11, filtro ON. Para las secuencias de aminoácido, los siguientes ajustes se puede utilizar para "Secuencias BLAST 2": programa BLASTP, matriz BLOSUM62, hueco abierto y penalizaciones de extensión de hueco 11 y 1 respectivamente, gap x_dropoff 50, esperado 10, tamaño de palabra 3, filtro ON.

La biodisponibilidad, como se utiliza aquí, significa la extensión y velocidad en la cual una sustancia se absorbe en un sistema de vida o se hace disponible en el sitio de actividad fisiológica.

Una proteína quimérica, como se utiliza aquí, se refiere a cualquier proteína compuesta de una primera secuencia de aminoácido derivada de una primera fuente, unida, covalentemente o no-covalentemente, a una segunda secuencia de aminoácido derivada de una segunda fuente, en donde la primera y segunda fuente no son las mismas. Una primera fuente y una segunda fuente que no son las mismas pueden incluir dos entidades biológicas diferentes, o dos diferentes proteínas de la misma entidad biológica, o una entidad biológica y una entidad no-biológica. Una proteína quimérica puede incluir por ejemplo, una proteína derivada de al menos 2 diferentes fuentes biológicas. Una fuente biológica puede incluir cualquier ácido nucleico o secuencia de aminoácido producido no-sintéticamente (por ejemplo una secuencia genómica o de cADN, un plásmido o vector viral, un virión nativo o un mutante o análogo, como además se describe en este documento, de cualquiera de los anteriores). Una fuente sintética puede incluir una proteína o secuencia de ácido nucleico producida químicamente y no por un sistema biológico (por ejemplo síntesis de fase sólida de secuencias de aminoácido). Una proteína quimérica también puede incluir una proteína derivada de al menos 2 diferentes fuentes sintéticas o una proteína derivada de al menos una fuente biológica y al menos una fuente sintética.

El factor de coagulación, como se utiliza aquí, significa cualquier molécula, que ocurre naturalmente o se produce recombinantemente que previene o disminuye la duración de un episodio de sangrado en un sujeto con un trastorno hemostático como se describe en este documento.

Actividad de coagulación, como se utiliza aquí, significa la capacidad para participar en una cascada de reacciones bioquímicas que culmina en la formación de un coágulo de fibrina y/o reduce la severidad, duración o frecuencia de la hemorragia o episodio de sangrado.

Construcción de ADN, como se utiliza aquí, significa una molécula de ADN, o un clon de dicha molécula, ya sea de cadena sencilla o doble que se ha modificado a través de una intervención humana que contiene segmentos de ADN combinado de modo que en su conjunto no existe de otra manera la naturaleza. Las construcciones de ADN contienen la información necesaria para dirigir la expresión de los polipéptidos de interés. Las construcciones de ADN pueden incluir promotores, potenciadores y terminadores de la transcripción. Las construcciones de ADN que contienen la información necesaria para dirigir la secreción de un polipéptido también contendrán al menos una secuencia señal secretora.

Un fragmento, como se utiliza aquí, se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido de al menos 2 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, de al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, o de al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos o cualquier deleción o truncamiento de una proteína.

La hemostasis, como se utiliza aquí, significa la detención del sangrado o hemorragia; o la detención de flujo sanguíneo a través un vaso sanguíneo o parte del cuerpo.

Trastorno hemostático, como se utiliza aquí, significa una condición heredada genéticamente o adquirida, caracterizada por una tendencia a hemorragia, ya sea espontáneamente o como un resultado de trauma, debido a una capacidad deteriorada o incapacidad para formar un coágulo de fibrina.

Unida, como se utiliza aquí, se refiere a una primera secuencia de ácido nucleico covalentemente unida a una segunda secuencia de ácido nucleico. La primera secuencia de ácido nucleico se puede unir directamente o yuxtaponer a la segunda secuencia de ácido nucleico o alternativamente una secuencia que interviene puede unir covalentemente la primera secuencia con la segunda secuencia. Unida como se utiliza aquí también se puede referir a una primera secuencia de aminoácido covalentemente unida a una segunda secuencia de aminoácido. La primera secuencia de aminoácido se puede unir directamente o yuxtaponer a la segunda secuencia de aminoácido o alternativamente una secuencia que interviene puede unir covalentemente la primera secuencia de aminoácido a la segunda secuencia de aminoácido. Unida también se puede referir a una primera secuencia de aminoácido unida no-covalentemente a una segunda secuencia de aminoácido. Unida como se utiliza aquí también se puede referir a una primera secuencia de aminoácido covalentemente unida con una secuencia de ácido nucleico o una molécula orgánica o inorgánica pequeña.

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Unida operativamente, como se utiliza aquí, significa una primera secuencia de ácido nucleico unida a una segunda secuencia de ácido nucleico, de tal manera que ambas secuencias son capaces de ser expresadas como un polipéptido activo biológicamente.

Una molécula inorgánica pequeña, como se utiliza aquí, significa una molécula que no contiene átomos de carbono y que no es mayor de 50 kD.

Una molécula orgánica pequeña, como se utiliza aquí, significa una molécula que contienen al menos un átomo de carbono y que no es mayor de 50 kD.

Alta severidad, como se utiliza aquí, incluye condiciones fácilmente determinadas por el experto basándose en, por ejemplo, la longitud del ADN. Generalmente, tales condiciones se definen como condiciones de hibridación según se cita anteriormente, y con un lavado a aproximadamente 68ºC, 0.2X SSC, 0.1% de SDS. El experto reconocerá que la temperatura y la concentración de solución de lavado de sal se pueden ajustar según sea necesario de acuerdo con los factores tales como la longitud de la sonda.

Severidad moderada, como se utiliza aquí, incluyen condiciones que pueden ser fácilmente determinadas por aquellos de ordinaria habilidad en el oficio basándose en, por ejemplo, la longitud del ADN. Las condiciones básicas se publican por Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, pp. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), e incluyen el uso de una solución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, 0.5% SDS, EDTA 1.0 mM (pH 8.0), condiciones de hibridación de formamida 50%, 6X SSC a 42ºC (u otra solución de hibridación similar, tal como solución de Stark, en 50% de formamida a 42ºC), y condiciones de lavado de 60ºC, 0.5x SSC, 0.1% de SDS.

Polipéptido, como se utiliza aquí, se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto; de esta manera, los péptidos, oligopéptidos, y proteínas se incluyen dentro de la definición del polipéptido. Este término no excluye las modificaciones de pos-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación, pegilación, adición de una fracción lipídica, o la adición de cualquier molécula orgánica o inorgánica. Incluida dentro de la definición, están por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no-naturales) y polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en el oficio, tanto que ocurren naturalmente y que no-ocurren naturalmente.

Tratar, tratamiento, que trata, como se utiliza aquí, significa cualquiera de los siguientes: la reducción en severidad de un trastorno hemostático; la profilaxis de uno o más síntomas asociados con un trastorno hemostático, por ejemplo, un episodio de sangrado; la reducción en la duración de un curso de la enfermedad de un trastorno hemostático; la mejora de uno o más síntomas asociados con un trastorno hemostático; la reducción en duración de un episodio de sangrado asociado con un trastorno hemostático, la reducción en el título de un anticuerpo inhibidor contra un factor de coagulación, la provisión de efectos benéficos a un sujeto con un trastorno hemostático, sin necesidad de curar el trastorno hemostático.

B. Terapéuticos Mejorados para Desórdenes Hemostáticos

La invención se relaciona en general para mejorar los terapéuticos para trastornos hemostáticos. La invención, de esta manera, se relaciona con una proteína quimérica que comprende al menos un factor de coagulación, como se describe en este documento y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina.

Las proteínas quiméricas de la invención tienen estabilidad aumentada y otras propiedades mejoradas cuando en comparación con agentes terapéuticos conocidos que tienen actividad de coagulación. También pueden ser administradas vía parenteral o de manera no-invasiva. Por consiguiente, la invención proporciona los métodos mejorados para la administración de agentes terapéuticos que tienen actividad de coagulación. Mientras que los factores de coagulación actuales, generalmente se administran vía subcutánea, intramuscular o intravenosa, las proteínas quiméricas de la invención se pueden administrar empleando medios menos invasivos tales como administración oral, administración nasal, o administración pulmonar. En una modalidad específica, las proteínas quiméricas de la invención son útiles en el tratamiento profiláctico de trastornos hemostáticos.

La invención también se relaciona generalmente para mejorar métodos para fabricar factores de coagulación terapéuticos. La invención se relaciona con métodos recombinantes para producir factores de coagulación terapéuticos con expresión mejorada y rendimientos mejorados. La invención de esta manera se relaciona con métodos para hacer proteínas quiméricas que comprenden al menos un factor de coagulación y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, por transfección de una célula con una construcción de ADN, dicha construcción que comprende una secuencia de ADN que codifica al menos un factor de coagulación y una secuencia de ADN que codifica al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina; cultivo de dicha célula bajo condiciones de tal manera que la proteína quimérica se exprese por dicha célula; y aislamiento de dicha proteína quimérica.

C. Proteínas Quiméricas

La invención se relaciona generalmente con las proteínas quiméricas que comprenden al menos un factor de coagulación como se describe en este documento, al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, y opcionalmente un ligador. El factor de coagulación puede estar unido covalentemente, o no-covalentemente con la porción de una región constante de inmunoglobulina. La porción de una región constante de inmunoglobulina tendrá tanto un terminal N, o un amino, y un terminal C, o carboxi. En una modalidad, la proteína quimérica de la invención puede tener un factor de coagulación unido al terminal N de la porción de una región constante de inmunoglobulina.

La proteína quimérica, opcionalmente puede comprender al menos un ligador, de esta manera el factor de coagulación no se tiene que unir directamente a la porción de una región constante de inmunoglobulina. El ligador puede intervenir entre el factor de coagulación y la porción de una región constante de inmunoglobulina. El ligador puede estar unido al terminal N de la porción de una región constante de inmunoglobulina, o el terminal C de una porción de una región constante de inmunoglobulina. El ligador puede estar unido al terminal N del factor de coagulación.

La invención, de esta manera se relaciona con una proteína quimérica compuesta de al menos un factor de coagulación como se describe en este documento (X), opcionalmente, un ligador (L), y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (F). En una modalidad, la invención se relaciona con una proteína quimérica compuesta de la fórmula

X-L_{a}-F

en donde X se une a su terminal C con el terminal N de L, y L se une a su terminal C con el terminal N de F y en donde a es cualquier número entero o cero. Cuando a es cero X está directamente unida a su terminal C con el terminal N de F.

Por ejemplo, pero no como una limitación, a pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 o 20.

En una modalidad, la invención se relaciona con una proteína quimérica que comprende la secuencia de aminoácido de la Figura 3A (SEQ ID NO:1).

La proteína quimérica de la invención incluye monómeros, dímeros, así como multímeros de orden superior. En una modalidad, la proteína quimérica es un monómero que comprende un factor de coagulación y una porción de una región constante de inmunoglobulina. En otra modalidad, la proteína quimérica es un dímero que comprende dos factores de coagulación y dos porciones de una inmunoglobulina. En una modalidad, los dos factores de coagulación son los mismos. En una modalidad, los dos factores de coagulación son diferentes. En una modalidad, las dos porciones de una inmunoglobulina son las mismas. En una modalidad, las dos porciones de una inmunoglobulina son diferentes. En otra modalidad, la proteína quimérica es un híbrido monómero/dímero en donde la proteína quimérica tiene un aspecto dimérico en el cual está compuesta de al menos una porción de dos regiones constantes de polipéptidos de inmunoglobulina y un aspecto monomérico en el cual está compuesta de solo un factor de coagulación unido a una de las dos inmunoglobulinas. La invención de esta manera se relaciona con una proteína quimérica que comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde dicha primera cadena comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina unida a un factor de coagulación y dicha segunda cadena comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina sin un factor de coagulación unido a esta.

Dichas proteínas quiméricas, se pueden describir empleando las fórmulas expuestas en la Tabla 1, donde I, L, y F son como se describen anteriormente, y donde (') indica una molécula diferente de sin (') y en donde (:) indica un enlace no-peptídico

TABLA 1

2

El experto comprenderá que combinaciones adicionales son posibles incluyendo el uso de ligadores adicionales.

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1. Variantes de Proteína Quimérica

Los derivados y análogos de las proteínas quiméricas de la invención, los anticuerpos contra las proteínas quiméricas de la invención y los anticuerpos contra socios de enlace de las proteínas quiméricas de la invención todos se contemplan, y se pueden hacer alterando sus secuencias de aminoácido por sustituciones, adiciones, y/o deleciones/truncamientos o por introducción de modificaciones químicas que dan lugar a moléculas funcionalmente equivalentes. Se entenderá por alguien de ordinaria habilidad en el oficio, que ciertos aminoácidos en una secuencia de cualquier proteína pueden ser sustituidos por otros aminoácidos sin afectar negativamente la actividad de la proteína.

Varios cambios se pueden hacer en las secuencias de aminoácidos de las proteínas quiméricas de la invención o secuencias de ADN codificantes, por lo tanto sin apreciable pérdida de su actividad, función, o utilidad biológica. Los derivados, análogos, o mutantes resultantes de dichos cambios y el uso de dichos derivados están dentro del alcance de la presente invención. En una modalidad específica, el derivado es funcionalmente activo, i.e., capaz de mostrar una o más actividades asociados con las proteínas quiméricas de la invención, por ejemplo, formación de coágulos, activación de un factor de coagulación. La actividad se puede medir por ensayos conocidos en el oficio, por ejemplo, ensayo StaClot FVIIa-rTF (Johannessen et al. 2000, Blood Coagulation and Fibrinolysis 11:S159) tiempo de protrombina (ensayo PT) o un ensayo APTT para el factor IX.

Los sustituyentes para un aminoácido dentro de la secuencia pueden ser seleccionados de los otros miembros de la clase a la cual el aminoácido pertenece (ver Tabla 2). Adicionalmente, varios aminoácidos se sustituyen comúnmente con aminoácidos neutros, por ejemplo, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina (ver, por ejemplo, MacLennan et al. (1998) Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al. (1998) Adv. Biophys. 35:1-24).

TABLA 2

3

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2. Factores de Coagulación

Las proteínas quiméricas de esta invención incluyen al menos un factor de coagulación. El factor de coagulación puede incluir cualquiera de los factores enumerados abajo que tienen actividad de coagulación o activan una molécula con actividad de coagulación. El factor de coagulación puede estar compuesto de un polipéptido, una molécula pequeña orgánica, o una molécula inorgánica pequeña. El factor de coagulación puede ser un factor de coagulación mutado con tal de que mantenga al menos alguna actividad de coagulación. El factor de coagulación es el factor VIII, incluyendo el dominio B suprimido del factor VIII. El factor IX (U.S. Patent No. 4,994,371), factor XI, factor XII, fibrinógeno, protrombina, factor V, factor VII, factor X, o factor XIII. En una modalidad, el factor de coagulación es el factor VII o factor VIIa. En otra modalidad, el factor de coagulación es un factor VII o VIIa mutado (ver, por ejemplo, Persson, et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:13583; U.S. Patent application Serial No. 10/109498).

El factor de coagulación, como se define anteriormente puede ser un factor de coagulación humano o un factor de coagulación no-humano, por ejemplo, derivado de un primate no-humano, un cerdo, o cualquier mamífero. El factor de coagulación puede ser factor de coagulación quimérico, por ejemplo, el factor de coagulación puede comprender una porción de un factor de coagulación humano y una porción de un factor de coagulación de porcino, o cualquier factor de coagulación no-humano o una porción de un primer factor de coagulación no-humano y una porción de un segundo factor de coagulación no-humano.

El factor de coagulación puede ser un factor de coagulación activo. De manera alternativa, el factor de coagulación puede ser una forma inactiva de un factor de coagulación, por ejemplo, un zimógeno. El factor de coagulación inactivo puede experimentar activación posterior al estar unido a al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina. El factor de coagulación inactivo se puede activar posteriormente a la administración a un sujeto. De manera alternativa, el factor de coagulación inactivo se puede activar antes de la administración.

3. Inmunoglobulinas

Las proteínas quiméricas de esta invención incluyen al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas están compuestas de cuatro cadenas de proteínas que asocian covalentemente-dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena además se compone de una región variable y una región constante. Dependiendo del isotipo de la inmunoglobulina, la región de la cadena pesada constante se compone de 3 o 4 dominios de la región constante (por ejemplo, CH1, CH2, CH3, CH4). Algunos isotipos también pueden incluir una región bisagra.

La porción de una región constante de inmunoglobulina puede ser una porción de una región constante de inmunoglobulina obtenida de cualquier mamífero. La porción de una región constante de inmunoglobulina pueden incluir, pero no se limita a, una porción de una región constante de inmunoglobulina humana, una región constante de inmunoglobulina de primate no-humano, una región constante de inmunoglobulina de bovino, una región constante de inmunoglobulina de porcino, una región constante de inmunoglobulina murina, una región constante de inmunoglobulina de ovino o una región constante de inmunoglobulina de rata.

La porción de una región constante de inmunoglobulina puede incluir la región de la cadena pesada constante total, o un fragmento o su análogo. Una región de la cadena pesada constante puede comprender un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3, y/o una región bisagra. Una región de la cadena pesada constante puede comprender un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3, y/o un dominio CH4.

La inmunoglobulina, se puede producir por recombinación o sintéticamente. La inmunoglobulina se puede aislar de una biblioteca de cADN. La inmunoglobulina se puede aislar de una biblioteca de fago (ver McCafferty et al. 1990, Nature 348:552). La inmunoglobulina se puede obtener por transposiciones genéticas de secuencias conocidas (Mark et al. 1992, Bio/Technol. 10:779). La inmunoglobulina se puede aislar por recombinación in vivo (Waterhouse et al. 1993, Nucl. Acid Res. 21:2265). La inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina humanizada (Jones et al. 1986, Nature 332:323).

La porción de una región constante de inmunoglobulina puede incluir una porción de una IgG, una IgA, una IgM, una IgD, una IgE. En una modalidad, la inmunoglobulina es una IgG. En otra modalidad, la inmunoglobulina es IgG1. En incluso otra modalidad, la inmunoglobulina es la IgG2.

La porción de una región constante de inmunoglobulina puede incluir un fragmento Fc. Un fragmento Fc puede estar compuesto de los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina y la región bisagra de la inmunoglobulina. El fragmento Fc puede ser el fragmento Fc de una IgG1, una IgG2, una IgG3 o una IgG4. En una modalidad, la inmunoglobulina es un fragmento Fc de una IgG1. En una modalidad, la inmunoglobulina es un fragmento Fc de una IgG2. En otra modalidad, la porción de una región constante de inmunoglobulina se compone de la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:2 (Figura 3B) o un análogo de este. En otra modalidad, la inmunoglobulina se compone de una proteína, o fragmento de este, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3 (Figura 3C).

La porción de una región constante de inmunoglobulina puede incluir una variante Fc. La variante Fc se refiere a una molécula o secuencia que se modifica a partir de un Fc nativo pero incluso comprende un sitio de enlace para el receptor salvado, FcRn (WO 97/34631). Nativo se refiere a un Fc que no ha sido modificado por un humano. WO 96/32478 describe ejemplarmente las variantes Fc, así como la interacción con el receptor salvado. De esta manera, el término "variante Fc" comprende una molécula o secuencia que se humaniza a partir de un Fc nativo no-humano. Adicionalmente, un Fc nativo comprende sitios que pueden ser eliminados debido a que proporcionan características estructurales o actividad biológica que no se necesita para las moléculas de fusión de la presente invención. De esta manera, la variante Fc comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos nativos Fc que afectan o se involucran en (1) formación de enlace disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula huésped seleccionada (3) heterogeneidad terminal-N bajo expresión en una célula huésped seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con complemento, (6) enlace con un receptor Fc diferente de un receptor salvado, o (7) citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC).

En otra modalidad, la porción de una región constante de inmunoglobulina es un socio de enlace del Fc del receptor neonatal (FcRn). Un socio de enlace FcRn es cualquier molécula que puede ser específicamente unida por el receptor FcRn con transporte activo posterior por el receptor FcRn del socio de enlace FcRn. El receptor FcRn se ha aislado de diversas especies de mamífero incluyendo humanos. Las secuencias del FcRn humano, FcRn de rata, y FcRn de ratón se conocen (Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). El receptor FcRn une IgG (pero no otras clases de inmunoglobulina tales como IgA, IgM, IgD, y IgE) a pH relativamente bajo, de forma activa transporta la IgG vía transcelular en una dirección luminal a serosal, y a continuación libera la IgG, a un pH relativamente alto se encuentra en los fluidos intersticiales. Se expresa en tejido epitelial adulto (U.S. Patent Nos. 6,030,613 y 6,086,875) incluyendo epitelio pulmonar e intestinal (Israel et al. 1997, Immunology 92:69) epitelio tubular proximal renal (Kobayashi et al. 2002,
Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358) así como epitelio nasal, superficies vaginales, y superficies de árbol biliar.

Los socios de enlace FcRn de la presente invención abarcan cualquier molécula que puede ser específicamente unida por el receptor FcRn incluyendo toda la IgG, el fragmento Fc de IgG, y otros fragmentos que incluyen la región de enlace completa del receptor FcRn. La región de la porción Fc de IgG que une al receptor FcRn ha sido descrita basándose en cristalografía de rayos-X (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). La principal área de contacto del Fc con el FcRn está cerca a la unión de los dominios CH2 y CH3. Los contactos Fc-FcRn están todos dentro de una cadena pesada Ig sencilla. Los socios de enlace FcRn incluyen toda la IgG, el fragmento Fc de IgG, y otros fragmentos de IgG que incluyen la región de enlace completa de FcRn. Los sitios de contacto principal incluyen residuos de aminoácido 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, y 314 del dominio CH2 y los residuos de aminoácido 385-387, 428, y 433-436 del dominio CH3. Las referencias hechas a la numeración de aminoácidos de inmunoglobulinas o fragmentos de la inmunoglobulina, o regiones, todas se basan en Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda; MD.

La región de IgG del Fc, se puede modificar de acuerdo con procedimientos bien reconocidos tales como mutagénesis de sitio dirigido y similares para producir IgG modificada o fragmentos Fc o porciones de estos que serán unidos por FcRn. Tales modificaciones incluyen modificaciones distantes de los sitios de contacto de FcRn así como modificaciones dentro de los sitios de contacto que preservan o incluso potencian el enlace con el FcRn. Por ejemplo los siguientes residuos de aminoácido sencillos en IgG1 humana Fc (Fc\gamma1) puede ser sustituidos sin pérdida significante de afinidad de enlace del Fc para FcRn: P238A, S239A. K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301 A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, A330S, P331A, P331S, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A. Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391 F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A. S440A, S444A, y K447A, donde por ejemplo P238A representa la prolina de tipo salvaje sustituida por la alanina en la posición número 238. Además a la alanina otros aminoácidos pueden ser sustituidos para los aminoácidos del tipo salvaje en las posiciones especificadas anteriormente. Las mutaciones se pueden introducir por separado en Fc dando lugar a más de un centenar de los socios de enlace FcRn distintos del Fc nativo. Adicionalmente, las combinaciones de dos, tres, o más de estas mutaciones individuales se pueden introducir juntas, dando lugar a cientos más de los socios de enlace FcRn.

Ciertas de las mutaciones anteriores puede conferir nueva funcionalidad bajo el socio de enlace FcRn. Por ejemplo, una modalidad incorpora N297A, eliminando un sitio de N-glicosilación altamente conservado. El efecto de esta mutación es reducir la inmunogenicidad, por consiguiente mejorando la vida media de la circulación del socio de enlace FcRn, y para suministrar el socio de enlace FcRn incapaz de unir a Fc\gammaRI, Fc\gammaRIIA, Fc\gammaRIIB, y Fc\gammaRIIIA, sin comprometer la afinidad para FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Adicionalmente, al menos tres receptores gamma Fc humanos aparecen para reconocer un sitio de enlace en IgG dentro de la región bisagra inferior, generalmente los aminoácidos 234-237. Por consiguiente, otro ejemplo de nueva funcionalidad y potencial inmunogenicidad disminuida derivado a partir de mutaciones de esta región, como por ejemplo, reemplazando los aminoácidos 233-236 de IgG1 humana "ELLG" a la secuencia correspondiente a partir de IgG2 "PVA" (con una deleción de aminoácido). Se ha mostrado que Fc\gammaRI, Fc\gammaRII, y Fc\gammaRIII, que media varias funciones efector no se unirán a IgG1 cuando tales mutaciones han sido introducidas (Ward y Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al.1999, Eur. J. Immunol. 29:2613). Como un ejemplo más de nueva funcionalidad derivado a partir de las mutaciones descritas anteriormente la afinidad por FcRn se puede incrementar más allá que la de tipo salvaje en algunos casos. Esta mayor afinidad puede reflejar un incremento "on" de la velocidad, una disminución "off" de la velocidad o tanto un incremento "on" en la velocidad como una disminución "off" de la velocidad. Se considera que las mutaciones que imparten un incremento de la afinidad para FcRn incluyen T256A, T307A, E380A, y N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).

En una modalidad, el socio de enlace FcRn es un polipéptido incluyendo la secuencia PKNSSMISNTP y opcionalmente además incluyendo una secuencia seleccionada de HQSLGTQ, HQNLSDGK, HQNISDGK, o VISSHLGQ (U.S. Patent No. 5,739,277).

Dos receptores FcRn puede unir una molécula Fc sencilla. Los datos cristalográficos sugieren que cada molécula FcRn une un polipéptido sencillo del homodímero Fc. El enlace del socio de enlace FcRn, por ejemplo, un fragmento Fc de un IgG, con un factor de coagulación, de esta manera proporciona un medio o entrega del factor de coagulación vía oral o como un aerosol administrado vía nasal, una ruta ocular o vía una ruta pulmonar.

El experto comprenderá que las porciones de una región constante de inmunoglobulina para utilizar en la proteína quimérica de la invención pueden incluir mutantes o análogos de este, o pueden incluir regiones constantes de inmunoglobulina modificadas químicamente o fragmentos de estas (por ejemplo pegilación) (ver, por ejemplo, Aslam and Dent 1998, Bioconjugation: Protein Coupling Techniques For the Biomedical Sciences Macmilan Reference, London). En un ejemplo un muíante puede proporcionar un enlace mejorado de un socio de enlace FcRn para el FcRn. También, se contempla el uso en la proteína quimérica de la invención los péptidos miméticos de al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, un péptido mimético de un fragmento Fc o un péptido mimético de un socio de enlace FcRn. En una modalidad, el péptido mimético se identifica empleando la técnica phage display (Ver, por ejemplo, McCafferty et al. 1990, Nature 348:552, Kang et al. 1991, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:4363; EP 0 589 877 B1).

4. Ligadores Opcionales

La proteína quimérica de la invención opcionalmente puede comprender al menos una molécula ligador. En una modalidad, el ligador se compone de aminoácidos. El ligador puede comprender 1-5 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 10-50 aminoácidos, 50-100 aminoácidos, 100-200 aminoácidos. El ligador puede comprender la secuencia Gn. El ligador puede comprender la secuencia (GGS)_{n} (SEQ ID NO.: 5). En cada ejemplo, n pueden ser un número entero, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10. Ejemplos de ligadores incluyen, pero no se limitan a, GGG (SEQ ID NO.: 6), SGGSGGS(SEQ ID NO.: 7), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO.: 8), y GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO.: 9).

En una modalidad, el ligador no elimina la actividad de coagulación del factor de coagulación. Opcionalmente, el ligador incrementa la actividad de coagulación del factor de coagulación, por ejemplo, disminuyendo los efectos de impedimento amplio y haciendo el factor de coagulación más accesible a su sitio de enlace blanco, por ejemplo, otro factor en la cascada de coagulación.

D. Construcciones de Ácido Nucleico

La invención se relaciona con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas quiméricas de la invención, dicha secuencia de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica, por ejemplo al menos un factor de coagulación, ligada operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina. La secuencia de ácido nucleico también puede incluir secuencias o elementos adicionales conocidos en el oficio (por ejemplo promotores, potenciadores, secuencias poli A, secuencia señal). La secuencia de ácido nucleico, puede opcionalmente incluir una secuencia que codifica un ligador colocado entre la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un factor de coagulación y la porción de una inmunoglobulina. La secuencia de ácido nucleico puede opcionalmente incluir una secuencia ligador colocada antes o después de la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un factor de coagulación y la porción de una inmunoglobulina.

En una modalidad, la construcción de ácido nucleico se compone de ADN. En otra modalidad, la construcción de ácido nucleico se compone de ARN. La construcción de ácido nucleico puede ser un vector, por ejemplo, un vector viral o un plásmido. Ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a un vector de adenovirus, un vector de adenovirus asociados o un vector del virus de la leucemia de murina. Ejemplos de plásmidos incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, pUC y pGEX.

En una modalidad, la construcción de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico de Figura 3D (SEQ ID NO:4).

Debido a la degeneración conocida del código genético, en donde más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, una secuencia de ADN puede variar de la que se muestra en la SEQ ID NOS:3 o 4 y codificará un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NOS:2 o 1 respectivamente. Tales secuencias de ADN variantes pueden resultar de mutaciones silenciosas (por ejemplo que ocurren durante la amplificación de PCR), o puede ser el producto de mutagénesis deliberadas de una secuencia nativa. La invención de esta manera proporciona secuencias de ADN aisladas que codifican polipéptidos de la invención, seleccionados del: (a) ADN que comprende la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO:3 o 4; (b) ADN que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:1 o 2; (c) ADN capaz de hibridizar a un ADN de (a) o (b) bajo condiciones de severidad moderada y que codifica los polipéptidos de la invención; (d) ADN capaz de hibridizar a un ADN de (a) o (b) bajo condiciones de severidad alta y que codifica los polipéptidos de la invención, y (e) ADN que se degenera como un resultado del código genético con un ADN definido en (a), (b), (c), o (d) y que codifica los polipéptidos de la invención. Por supuesto, los polipéptidos codificados por tales secuencias de ADN se abarcan por la invención.

En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención también comprenden secuencias de nucleótidos que son al menos 80% idénticas a una secuencia nativa. También se contemplan las modalidades en las cuales una molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 90% idéntica, al menos 95% idéntica, al menos 98% idéntica, al menos 99% idéntica, o al menos 99.9% idéntica a una secuencia nativa. El porcentaje de identidad se puede determinar por inspección visual y cálculo matemático. De manera alternativa, el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido nucleico, se puede determinar comparando la información de la secuencia empleando el programa de ordenador GAP, versión 6.0 descrito por Devereux et al. 1984, Nucl. Acids Res. 12:387, y disponible de University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros preferidos por defecto para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (que contienen un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov and Burgess 1986, Nucl. Acids Res. 14:6745, como se describe por Schwartz and Dayhoff, eds., 1979, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358; (2) una penalización de 3.0 por cada hueco y una penalización adicional de 0.10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalización para los huecos terminales. También se pueden utilizar, otros programas utilizados por alguien de habilidad en el oficio de comparación de la secuencia.

E. Síntesis de Proteínas Quiméricas

Las proteínas quiméricas que comprenden al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina y un factor de coagulación se puede sintetizar empleando técnicas bien conocidas en el oficio. Por ejemplo las proteínas quiméricas de la invención se pueden sintetizar recombinantemente en células (ver, por ejemplo, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. and Ausubel et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).

Las secuencias de ADN que codifican las inmunoglobulinas, o fragmentos de estas, o factores de coagulación, o fragmentos de estas, se pueden clonar de una variedad de bibliotecas genómicas o de cADN, conocidas en el oficio. Las técnicas para el aislamiento de dichas secuencias de ADN empleando métodos basados en sonda son técnicas convencionales y son bien conocidas por aquellos de habilidad en el oficio. Las sondas para el aislamiento de tales secuencias de ADN se pueden basar en secuencias de ADN publicadas (ver, por ejemplo, Hieter et al. 1980, Cell 22: 197-207). El método de reacción de cadena de polimerasa (PCR) revelado por Mullis et al. (U.S. Patent No. 4,683,195) y Mullis (U.S. Patent No. 4,683,202) puede ser utilizado. La elección de biblioteca y selección de sondas para el aislamiento de tales secuencias de ADN está dentro del nivel de ordinaria habilidad en el oficio. De manera alternativa, las secuencias de ADN que codifican inmunoglobulinas, o fragmentos de estas, o factores de coagulación se pueden obtener de vectores conocidos en el oficio que contienen inmunoglobulinas, o fragmentos de estas, o factores de coagulación.

Para la producción recombinante, una secuencia de polinucleótido que codifica la proteína quimérica se inserta en un vehículo de expresión apropiado, i.e., un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada, o en el caso de un vector viral de ARN, los elementos necesarios para la replicación y traducción. El ácido nucleico que codifica la proteína quimérica se inserta en el vector en el marco de lectura apropiado.

En ciertas modalidades, el ácido nucleico también puede codificar para un factor de coagulación de propéptido que se modifica por la célula para producir la proteína quimérica madura de la invención. En una modalidad específica, el factor de coagulación de propéptido se reconoce por una \gamma carboxilasa dependiente de la vitamina K, que modifica el factor de coagulación de propéptido para lograr la actividad total (por ejemplo factor VII, factor IX, factor X, protrombina). Para producir la proteína quimérica madura de la invención, la secuencia del propéptido posteriormente se divide por una endoproteasa, por ejemplo, enzima convertidora de aminoácidos básicos en pares (PACE), o cualquier miembro de la familia PACE, tal como PCSK1-9, incluyendo versiones truncadas de este, o su levadura equivalente Kex2 de S. cerevisiae y versiones truncadas de Kex2 (ver, por ejemplo, U.S. Patent Nos. 5,077,204; 5,162,220; 5,234,830; 5,885,821; 6,329,176 (Kex2 1-675)).

El vehículo de expresión luego se transfecta en una célula diana apropiada que expresará la proteína, por ejemplo, una proteína quimérica. Las técnicas de transfección conocidas en el oficio incluyen, pero no se limitan a, precipitación de fosfato de calcio (Wigler et al. 1978, Cell 14:725) y electroporación (Neumann et al. 1982, EMBO, J. 1:841). Una variedad de sistemas de vector expresión-huésped, se puede utilizar para expresar las proteínas quiméricas, como se describe en este documento en las células eucariotas. En una modalidad, la célula eucariota es una célula de animal, incluyendo células de mamífero (por ejemplo células CHO, BHK, Cos, HeLa). Cuando la proteína quimérica se expresa en una célula eucariota, el ADN que codifica la proteína quimérica también puede codificar para una secuencia señal que permitirá que la proteína quimérica sea segregada. Alguien de habilidad en el oficio comprenderá que mientras que la proteína se traduce la secuencia señal se divide por la célula para formar la proteína quimérica madura. Varias secuencias señal se conocen en el oficio por ejemplo, secuencia señal del factor VII nativo, secuencia señal del factor IX nativo y la secuencia señal de cadena ligera de Ig\kappa de ratón. De manera alternativa, donde una secuencia señal no se incluye, la proteína quimérica se puede recuperar por lisis de las células.

La proteína quimérica de la invención se puede sintetizar en un animal transgénico, tal como roedor, cabra, ovejas, cerdo, o vaca. El término "animales transgénicos" se refiere a animales no-humanos que se les ha incorporado un gen foráneo en su genoma. Porque este gen está presente en tejidos de línea germinal, se pasa a partir de progenitor a la descendencia. Los genes exógenos se introducen en embriones de células sencillas (Brinster et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438). Métodos para producir animales transgénicos se conocen en el oficio, incluyendo transgénicos que producen moléculas de inmunoglobulina, (Wagner et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6376; McKnight et al. 1983, Cell 34:335; Brinster et al. 1983, Nature 306:332; Ritchie et al. 1984, Nature 312:517; Baldassarre et al. 2003, Theriogenology 59:831; Robl et al. 2003, Theriogenology 59:107; Malassagne et al. 2003, Xenotransplantation 10(3):267).

Los vectores de expresión pueden codificar para etiquetas que permiten la fácil purificación o identificación de la proteína producida recombinantemente. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, vector pUR278 (Ruther et al. 1983, EMBO J. 2:1791) en el cual, la proteína quimérica descrita en este documento que codifica la secuencia puede ser ligada en el vector en marco con la región de codificación lac z, de tal manera que una proteína híbrido se produce; los vectores pGEX pueden ser utilizados para expresar proteínas con una etiqueta glutationa S-transferasa (GST). Estas proteínas por lo general son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de las células por adsorción con perlas de glutationa-agarosa seguido por la elución en la presencia de glutationa libre. Los vectores incluyen sitios de división (por ejemplo PreCission Protease^{TM} (Pharmacia, Peapack, N.J.)) para eliminación fácil de la etiqueta después de la purificación.

Para aumentar la eficiencia de producción, el polinucleótido se puede diseñar para codificar múltiples unidades de la proteína quimérica de la invención separadas por sitios de división enzimáticos. El polipéptido resultante se puede dividir (por ejemplo por tratamiento con la enzima apropiada) con el fin de recuperar las unidades del polipéptido. Esto puede aumentar la producción de polipéptidos conducidos por un promotor sencillo. Cuando se utiliza en sistemas de expresión viral apropiados, la traducción de cada polipéptido codificado por el mARN se dirige internamente en la transcripción; por ejemplo, por un sitio de entrada de ribosoma interno, IRES. De esta manera, la construcción policistrónica dirige la transcripción de un mARN policistrónico sencillo, grande que, a su vez, dirige la traducción de polipéptidos múltiples, individuales. Esta metodología elimina la producción y procedimiento enzimático de poliproteínas y puede aumentar significantemente la producción de un polipéptido conducido por un promotor sencillo.

Los vectores utilizados en la transformación, por lo general contendrán un marcador genético utilizado para identificar los transformantes. En sistemas bacterianos estos pueden incluir un gen de resistencia de antibiótico tal como ampicilina, blasticidina o Kanamicina. Los marcadores genéticos para utilizar en células de mamífero cultivadas incluyen genes que confieren resistencia a los fármacos, tales como neomicina, higromicina, y metotrexato. El marcador genético puede ser un marcador genético amplificable. Un marcador genético amplificable es el gen de la dihidrofolato reductasa (gen DHFR). Otro marcador amplificable es el cADN del DHFRr (Simonsen and Levinson 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80:2495). Los marcadores genéticos se revisan por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass.) y la elección de marcadores genéticos está dentro del nivel de ordinaria habilidad en el oficio.

Los marcadores genéticos se pueden introducir en la célula sobre un plásmido separado en el mismo tiempo como el gen de interés, o se pueden introducir sobre el mismo plásmido. Si en el mismo plásmido, el marcador genético y el gen de interés pueden estar bajo el control de diferentes promotores o el mismo promotor, la última alineación produce un mensaje dicistrónico. Las construcciones de este tipo se conocen en el oficio (por ejemplo, U.S. Pat. No. 4,713,339).

Los elementos de expresión de los sistemas de expresión varían en su fuerza y especificidades. Dependiendo del sistema huésped/vector utilizado, cualquiera de un número de elementos de transcripción y traducción apropiados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, pueden ser utilizados en el vector de expresión. Por ejemplo, cuando la clonación en sistemas bacterianos, los promotores inducibles tales como pL de bacteriófago A, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y similares pueden ser utilizados; cuando se clonan en sistemas de célula de insecto, pueden ser utilizados promotores tales como el promotor del poliedro del baculovirus; cuando se clonan en sistemas de células de plantas, pueden ser utilizados promotores derivados del genoma de células de plantas (por ejemplo promotores de choque térmico; el promotor para la subunidad pequeña de RUBISCO; el promotor para la proteína de enlace clorofila a/b) o de virus de plantas (por ejemplo el promotor de ARN 35S de CaMV; el promotor de la proteína de cubierta de TMV); cuando se clonan en sistemas de células de mamíferos, se pueden utilizar los promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo promotor de la metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo el promotor del último adenovirus; el promotor 7.5 K del virus de la vaccinia, el promotor CMV); cuando se generan las líneas celulares que contienen múltiples copias del producto de expresión, vectores SV40-, BPV- y EBV-basados pueden ser utilizados con un marcador genético apropiado.

En casos donde los vectores de expresión de plantas se utilizan, la expresión de secuencias que codifican formas lineales o no-cicladas de las proteínas quiméricas de la invención se pueden conducir por cualquiera de un número de promotores. Por ejemplo, promotores virales tales como los promotores de ARN 35S y de ARN 19S de CaMV (Brisson et al. 1984, Nature 310:511-514), o el promotor de la proteína de cubierta de TMV (Takamatsu et al. 1987, EMBO J. 6:307-311) se pueden utilizar; alternativamente, promotores de plantas tales como la subunidad pequeña de RUBISCO (Coruzzi et al. 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al. 1984, Science 224: 838-843) o promotores de choque térmico, por ejemplo, hsp17.5-E o hsp17.3-B de soja (Gurley et al. 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565) pueden ser utilizados. Estas construcciones se pueden introducir en células de plantas empleando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus de plantas, transformación de ADN directo, microinyección, electroporación, etc. Para revisiones de tales técnicas ver, por ejemplo, Weissbach & Weissbach 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463; and Grierson & Corey 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London,
Ch. 7-9.

En un sistema de expresión de insecto, que pueden ser utilizados para producir las proteínas quiméricas de la invención, virus de la polihidrosis nuclear de la Autographa californica (AcNPV) se utiliza como un vector para expresar los genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. Una secuencia codificante se pueden clonar en regiones no-esenciales (por ejemplo, el gen polihedro) del virus y se coloca bajo control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor polihedro). La inserción exitosa de una secuencia codificante dará lugar a la inactivación del gen polihedro y la producción del virus recombinante no-ocluido (i.e. virus carente de la cubierta proteínica codificada por el gen polihedro). Estos virus recombinantes luego se utilizan para infectar las células de Spodoptera frugiperda en las cuales el gen insertado se expresa. (ver, por ejemplo, Smith et al. 1983, J. Virol. 46:584; U.S.. Patent No. 4,215,051). Otros ejemplos de este sistema de expresión se pueden encontrar en Ausubel et al., eds 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2,. Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.

En células huésped de mamífero, un número de sistemas de expresión basados en virus se puede utilizar. En casos donde un adenovirus se utiliza como un vector de expresión, una secuencia codificante se puede ligar a un complejo control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor último y la secuencia líder tripartito. Este gen quimérico luego se puede insertar en el genoma de adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no-esencial del genoma viral (por ejemplo la región E1 o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar un péptido del polipéptido en huéspedes infectados (ver, por ejemplo, Logan & Shenk 1984, Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 81:3655-3659). De manera alternativa, el promotor 7.5 K de vaccinia puede ser utilizado (ver, por ejemplo, Mackett et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci..(USA) 79:7415; Mackett et al. 1984, J. Virol. 49:857; Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:4927).

En casos donde un adenovirus se utiliza como un vector de expresión, una secuencia codificante se puede ligar a un complejo control transcripción/traducción adenovirus, por ejemplo, el promotor último y la secuencia líder tripartito. Este gen quimérico luego se puede insertar en el genoma de adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no-esencial del genoma viral (por ejemplo, región E1 o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar un polipéptido en huéspedes infectados (ver, por ejemplo, Logan & Shenk 1984, Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 81:3655-3659). De manera alternativa, el promotor 7.5 K de vaccinia puede ser utilizado (ver, por ejemplo, Mackett et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackett et al. 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:4927).

Las células huésped que contienen las construcciones de ADN de la proteína quimérica se cultivan en un medio de crecimiento apropiado. Como se emplea aquí, el término "medio de crecimiento apropiado" significa un medio que contiene los nutrientes requeridos para el cultivo de las células. Los nutrientes necesarios para el cultivo celular pueden incluir una fuente de carbón, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y factores de crecimiento. En una modalidad, el medio contiene vitamina K que es necesaria para una \gamma carboxilasa celular para conferir actividad en un factor de coagulación producido recombinantemente, por ejemplo, factor VII. Opcionalmente, el medio puede contener suero de ternera o suero fetal bovino. El medio de crecimiento, generalmente se seleccionará para células que contienen la construcción de ADN mediante, por ejemplo, selección de fármaco o deficiencia en un nutriente esencial, que se complementa por el marcador genético en la construcción de ADN o co-transfectan con la construcción de ADN. Las células de mamífero cultivadas generalmente se siembran en medio que contiene suero o libre de suero, comercialmente disponible (por ejemplo MEM, DMEM). La selección de un medio apropiado para la línea celular particular utilizada está dentro del nivel de ordinaria habilidad en el oficio.

La proteína quimérica producida recombinantemente de la invención se puede aislar del medio de cultivo empleando procedimientos bien establecidos en el oficio (por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de permeación sobre gel, cromatografía de intercambio iónico). La proteína quimérica de la invención se puede aislar del medio de cultivo por cromatografía de columna, por ejemplo, una columna de proteína A, o por cromatografía de intercambio iónico. Cuando una columna de proteína A o columna de intercambio iónico se utiliza para separar la proteína quimérica de la invención, la separación cromatográfica puede contribuir a la activación de la proteína quimérica de la invención, por ejemplo, convirtiendo el factor VII a factor VIIa. El medio de cultivo de células huésped transformadas cultivadas apropiadamente o transfectadas, se separa del material celular, y la presencia de proteínas quiméricas se demuestra. Un método para detectar las proteínas quiméricas, por ejemplo, es por el enlace de las proteínas quiméricas o porciones de las proteínas quiméricas con un anticuerpo específico que reconoce la proteína quimérica de la invención (por ejemplo, un anticuerpo anti-Fc). Un anticuerpo anti-proteína quimérica puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal construido contra la proteína quimérica en cuestión. Por ejemplo, la proteína quimérica puede contener una porción de una región constante de inmunoglobulina. Los anticuerpos que reconocen la región constante de muchas inmunoglobulinas se conocen en el oficio y son comercialmente disponibles. Un anticuerpo se puede utilizar para realizar un ELISA o un western blot para detectar la presencia de la proteína quimérica de la invención.

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F. Métodos para utilizar Proteínas Quiméricas

Las proteínas quiméricas de la invención tienen muchos usos, como será reconocido por alguien de habilidad en el oficio, incluyendo, pero no limitando a métodos para tratar un sujeto que tiene un trastorno hemostático y métodos para tratar un sujeto con necesidad de un agente hemostático general.

1. Métodos para tratar un Sujeto que Tiene un Trastorno Hemostático

La invención se relaciona con un método para tratar un sujeto que tiene un trastorno hemostático, que comprende la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de al menos una proteína quimérica, en donde la proteína quimérica comprende al menos a porción de una región constante de inmunoglobulina y al menos un factor de coagulación.

La proteína quimérica de la invención trata o previene un trastorno hemostático, promoviendo la formación de un coágulo de fibrina. La proteína quimérica de la invención puede activar cualquier miembro de una cascada de coagulación. El factor de coagulación puede ser un participante en la ruta extrínseca, la ruta intrínseca o ambas. En una modalidad, el factor de coagulación es el factor VII o factor VIIa. El factor VIIa puede activar el factor X que interactúa con el factor Va para convertir la protrombina a la trombina, que a su vez convierte el fibrinógeno a
fibrina.

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a. Condiciones Que Se Pueden Tratar

La proteína quimérica de la invención, se puede utilizar para tratar cualquier trastorno hemostático. Los trastornos hemostáticos que se pueden tratar por la administración de la proteína quimérica de la invención incluyen, pero no se limitan a, hemofilia A, hemofilia B, enfermedad de von Willebrand, deficiencia del factor XI (deficiencia PTA), deficiencia del factor XII, así como deficiencias o anormalidades estructurales en fibrinógeno, protrombina, factor V, factor VII, factor X, o factor XIII.

En una modalidad, el trastorno hemostático es una enfermedad hereditaria. En una modalidad, el sujeto tiene hemofilia A, y la proteína quimérica comprende el factor VIII o el factor VIIIa. En otra modalidad, el sujeto tiene hemofilia A y la proteína quimérica comprende el factor VII o el factor VIIa. En otra modalidad, el sujeto tiene hemofilia B y la proteína quimérica comprende el factor IX o el factor IXa. En otra modalidad, el sujeto tiene hemofilia B y la proteína quimérica comprende el factor VII o el factor VIIa. En otra modalidad, el sujeto tiene anticuerpos inhibidores al factor VIII o al factor VIIIa y la proteína quimérica comprende el factor VII o el factor VIIa. En incluso otra modalidad, el sujeto tiene anticuerpos inhibidores contra el factor IX o el factor IXa y la proteína quimérica comprende el factor VII o el factor VIIa.

La proteína quimérica de la invención se puede utilizar para tratar profilácticamente un sujeto con un trastorno hemostático. La proteína quimérica de la invención se puede utilizar para tratar un episodio de sangrado agudo en un sujeto con un trastorno hemostático.

En una modalidad, el trastorno hemostático es el resultado de una deficiencia en un factor de coagulación, por ejemplo, factor IX, factor VIII, factor VII. En otra modalidad, el trastorno hemostático puede ser el resultado de un factor de coagulación defectuoso, por ejemplo, factor de von Willebrand.

En otra modalidad, el trastorno hemostático puede ser un trastorno adquirido. El trastorno adquirido puede resultar de una enfermedad o condición secundaria fundamental. La condición no-relacionada puede ser, como un ejemplo, pero no como una limitación, cáncer, una enfermedad auto-inmune, o embarazo. El trastorno adquirido puede resultar de la vejez o de la medicación para tratar un trastorno secundario fundamental (por ejemplo, quimioterapia para el cáncer).

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2. Métodos para tratar un Sujeto Con Necesidad de un Agente Hemostático General

La invención también se relaciona con métodos para tratar un sujeto que no tiene un trastorno hemostático o una condición o enfermedad secundaria, que resulta en la adquisición de un trastorno hemostático. La invención de esta manera se relaciona con un método para tratar un sujeto con necesidad de un agente hemostático general que comprende la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de al menos una proteína quimérica, en donde la proteína quimérica comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina y al menos un factor de coagulación.

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a. Condiciones Que Se Pueden Tratar

En una modalidad, el sujeto con necesidad de un agente hemostático general, que está experimentando, o está a punto de someterse a una cirugía. La proteína quimérica de la invención se puede administrar antes de, durante, o después de cirugía como un profiláctico. La proteína quimérica de la invención se pueden administrar antes de, durante, o después de la cirugía para controlar un episodio de sangrado agudo. La cirugía puede incluir, pero no se limita a trasplante de hígado, resección hepática, o trasplante de células madre.

La proteína quimérica de la invención se puede utilizar para tratar un sujeto que tiene un episodio de sangrado agudo, que no tiene un trastorno hemostático. El episodio de sangrado agudo puede resultar de un trauma severo, por ejemplo, cirugía, un accidente de coche, herida, laceración por disparo, o cualquier otro evento traumático resultando en sangrado no controlado.

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b. Las Modalidades de Tratamiento

La proteína quimérica de la invención se puede administrar vía intravenosa, subcutánea, intra-muscular, o vía cualquier superficie de mucosa, por ejemplo, vía oral, sublingual, bucal, nasal, rectal, vaginal o por vía pulmonar. La proteína quimérica puede ser implantada dentro de o unida a un soporte sólido biopolímero que permite la liberación lenta de la proteína quimérica en el sitio de sangrado o implantada en el vendaje/apósito.

La dosis de la proteína quimérica de la invención, variará dependiendo del sujeto y bajo la ruta de administración particular utilizada. Las dosificaciones pueden oscilar de 0.1 a 100,000 \mug/kg peso corporal. En una modalidad, el rango de dosificación es 0.1-1,000 \mug/kg. La proteína se puede administrar continuamente o a intervalos de tiempo específicos. Se pueden emplear ensayos in vitro para determinar rangos de dosis óptimos y/u horarios para la administración. Los ensayos in vitro que miden la actividad del factor de coagulación se conocen en el oficio, por ejemplo, ensayo de coagulación STA-CLOT VIIa-rTF. Adicionalmente, dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de curvas dosis-respuesta, obtenidas de modelos de animales, por ejemplo, un perro hemofílico (Mount et al. 2002, Blood 99(8):2670).

La invención también se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación, al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina y un portador farmacéuticamente aceptable o excipientes. Ejemplos de apropiados portadores farmacéuticos se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin. Ejemplos de excipientes pueden incluir almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, silica gel, estearato de sodio, glicerol monoestearato, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol, y similares. La composición también puede contener reactivos reguladores de pH, y agentes de humectación o emulsificantes.

Para la administración oral, la composición farmacéutica puede tomar la forma de comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales. La composición también se puede preparar como un líquido por ejemplo un jarabe o una suspensión. El líquido pueden incluir agentes de suspensión (por ejemplo jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas), agentes emulsificantes (lecitina o acacia), vehículos no-acuosos (por ejemplo aceite de almendras, ésteres grasos, alcohol etílico, o aceites vegetales fraccionados), y preservativos (por ejemplo metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden incluir saborizantes, colorantes y agentes edulcorantes. De manera alternativa, la composición se puede presentar como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo apropiado.

Para la administración bucal, la composición puede tomar la forma de comprimidos o pastillas de acuerdo con protocolos convencionales.

Para la administración por inhalación, los compuestos para utilizar de acuerdo con la presente invención se entregan convenientemente en la forma de un aerosol nebulizado con o sin excipientes o en la forma de un atomizador en aerosol de un envase presurizado o nebulizador, con opcionalmente un propulsor, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas apropiado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para entregar una cantidad medida de Cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para utilizar en un inhalador o insufladores puede ser formulado que contienen una mezcla de polvo del compuesto y una apropiada base de polvo tal como lactosa o almidón.

La composición farmacéutica, se puede formular para la administración parenteral (i.e. intravenosa o intramuscular) por inyección de bolo. Formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación por unidad, por ejemplo, en ampollas o en contenedores multidosis con un conservante adicionado. Las composiciones pueden tomar tales formas como suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y contienen agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o de dispersión. De manera alternativa, el ingrediente activo puede ser en forma de polvo para constitución con un vehículo apropiado, por ejemplo, agua libre de pirógeno.

La composición farmacéutica también se puede formular para administración rectal como un supositorio o enema de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorios convencionales, tales como mantequilla de cacao u otros glicéridos.

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c. Terapia de Combinación

En otra modalidad, la invención se relaciona con un método para tratar un sujeto con un trastorno hemostático que comprende la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de al menos una proteína quimérica que comprende al menos un factor de coagulación y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, en combinación con al menos otro factor de coagulación o agente que promueve la hemostasis. Dicho factor de coagulación o agente que promueve la hemostasis puede ser cualquier terapéutico con actividad de coagulación demostrada. Como un ejemplo, pero no como una limitación, el factor de coagulación o agente hemostático puede incluir el factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factores XI, factor XII, factor XIII, protrombina, fibrinógeno, factor de von Willebrand o factor tisular soluble recombinante (rsTF) o formas activas de cualquiera de los anteriores. El factor de coagulación de agente hemostático también puede incluir fármacos anti-fibrinolíticos, por ejemplo, ácido epsilon-amino-caproico, ácido tranexámico.

G. Kits

La invención proporciona un kit para el diagnóstico de un trastorno hemostático. El kit puede incluir un contenedor y una proteína quimérica que comprende al menos un factor de coagulación y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina. La proteína quimérica se puede suministrar en una solución reguladora o solvente apropiados. La solución reguladora puede ser una solución reguladora acuosa, por ejemplo, PBS o alternativamente la proteína quimérica se puede liofilizar. El kit también puede proporcionar instrucciones para detectar la presencia de un factor de coagulación en una muestra, por ejemplo, por contacto de una alícuota de una muestra con la proteína quimérica de la invención y detección de la presencia de un coágulo. La detección puede incluir detección visible. El kit opcionalmente puede proporcionar una alícuota de sangre carente de un factor de coagulación conocido.

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Ejemplos Ejemplo 1 Clonación de pcADN 3.1-Fla-g-Fc

La secuencia para el péptido FLAG (Asp-Tyr Lys-Asp-Asp-Asp= Asp-Lys)(SEQ ID NO: 23), una etiqueta de afinidad común utilizada para identificar o purificar las proteínas, se clonó en el plásmido 3.1-Fc del pcADN, que contiene la secuencia señal Ig\kappa de ratón seguida por el fragmento Fc de humano IgG1 (aminoácidos 221-447, numeración EU). La construcción se creó por solapamiento de PCR empleando los siguientes cebadores:

\quad: FlagFc-F1: 5'- GCTGGCTAGCCACCATGGA -3'(SEQ ID NO: 10)

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\quad: FlagFc-R2: 5'- TAGTGGATCCTCATTTACCCG -3' (SEQ ID NO:13)

La plantilla de pcADN 3.1-Fc luego se adicionó a dos reacciones de PCR separadas que contienen 50 pmol cada una de los pares del cebador FlagFc-F1/R1 o FlagFc-F2/R2 en una reacción de 50 \mul empleando Pfu Ultra ADN polimerasa (Stratagene, CA) de acuerdo con el protocolo estándar del fabricante en un Thermocycler MJ empleando los siguientes ciclos: 95ºC 2 minutos; 30 ciclos de (9.5ºC 30 segundos, 52ºC 30 segundos, 72ºC 45 segundos), seguido por 72ºC por 10 minutos. Los productos de estas dos reacciones luego se mezclaron en otra reacción de PCR (2 \mul cada una) con 50 pmol de los cebadores FlagFc-F1 y FlagFc-R2, en una reacción de 50 \mul empleando Pfu Ultra ADN polimerasa (Stratagene, CA) de acuerdo con el protocolo estándar del fabricante en un Thermocycler MJ, empleando los siguientes ciclos: 95ºC 2 minutos; 30 ciclos de (95ºC 30 segundos, 52ºC 30 segundos, 72ºC 45 segundos), seguido por 72ºC por 10 minutos. El fragmento resultante se purificó con gel, se digirió y se insertó en el plásmido pcADN 3.1-Fc Nhel-Bam HI. El plásmido resultante contiene la secuencia señal Ig\kappa de ratón que produce la proteína FlagFc.

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Ejemplo 2 Clonación de la construcción PACE

La secuencia codificante para PACE (enzima convertidora de aminoácidos básicos en pares) humana, una endoproteasa, se obtuvo por RT-PCR. Se utilizaron los siguientes cebadores:

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\quad: PACE-R1: 5'- GTTTTCAATCTCTAGGACCCACTCGCC -3'(SEQ ID NO: 16)

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\quad: PACE-F2: 5'- GCCAGGCCACATGACTACTCCGC -3'(SEQ ID NO:17)

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El cebador PACE-F1 añade un sitio HindIII al terminal 5' de la secuencia de PACE, iniciando con 3 nucleótidos antes del codón inicial, mientras que el cebador PACE-R2 añade un codón de terminación después del aminoácido 715, que ocurre en el terminal del dominio extracelular de PACE, así como la adición de un sitio EcoRI en el terminal 3' del codón de terminación. Los cebadores PACE-R1 y -F2 hibridizan en los lados 3' y 5' de un sitio BamHI interno, respectivamente. Dos reacciones de RT-PCR luego se establecieron empleando 25 pmol de cada uno de los pares del cebador de PACE-F1/R1 o PACE-F2/R2 con 20 ng de ARN de hígado humano adulto (Clontech; Palo Alto, CA) en unos 50 \mul de reacción de RT-PCR empleando el sistema SuperScript.^{TM} One-Step RT-PCR con PLATINUM® Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. La reacción se llevó a cabo en un Thermocycler MJ, empleando los siguientes ciclos: 50ºC 30 minutos; 94ºC 2 minutos; 30 ciclos de (94ºC 30 segundos, 58ºC 30 segundos, 72ºC 2 minutos), seguido por 72ºC 10 minutos. Estos fragmentos se ligaron cada uno en el vector pGEM T-Easy (Promega, Madison, WI) y se secuenciaron completamente. El fragmento F2-R2 luego se subclonó en pcDNA6 V5/His (Invitrogen, Carlsbad, CA) empleando los sitios BamHI/EcoRI, y a continuación el fragmento F1-R1 se clonó en esta construcción empleando los sitios HindIII/BamHI. El plásmido final, pcDNA6-PACE, produce una forma soluble de PACE (aminoácidos 1-715), como la región de transmembrana ha sido suprimida. La secuencia de PACE en pcDNA6-PACE es esencialmente como se describe en Harrison et al. 1998, Seminars in Hematology 35:4.

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Ejemplo 3 Clonación de la construcción del Fc-Factor VII

La secuencia codificante para el Factor VII. se obtuvo por RT-PCR a partir de ARN de hígado fetal humano (Clontech, Palo Alto, CA). La región clonada se compone de la secuencia de cADN de 36 bp a 1430 bp que termina justo antes del codón de terminación. Un sitio SbfI se introdujo en el terminal-N. Un sitio BspEI se introdujo en el terminal-C. La construcción se clonó por PCR empleando los cebadores:

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y las siguientes condiciones: 95ºC por 5 minutos seguido por 30 ciclos de 95ºC por 30 segundos, 55ºC por 30 segundos, 72ºC por 1 minuto y 45 segundos, y un ciclo de extensión final de 72ºC por 10 minutos.

El fragmento fue digerido SbfI - BspE I y se insertó en pED.dC-Fc, un plásmido codificado por el fragmento Fc de un IgG1.

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Ejemplo 4 Expresión y purificación del híbrido monómero-dímero del Factor VII-Fc

Las células CHO DG-44 que expresan el Factor VII-Fc se implementaron. Las células CHO DG-44 se cultivaron a 37ºC, 5% de CO_{2}, en MEM Alpha más nucleósido y ribonucleósidos y suplementado con 5% de suero fetal bovino inactivo por calor hasta la transfección.

Las células DG44 se sembraron en placas en cajas de petri de cultivo de tejido de 100 mm y se cultivaron a una confluencia de 50%-60%. Un total de 10 \mug de ADN se utilizó para transfectar una caja de 100 mm: ya sea 9 \mug pED.dC.FVII-Fc + 1 \mug de pcDNA6-PACE para la transfección del dímero, o 7.5 \mug de pED.dC.FVII-Fc + 1.5 \mug pcDNA3/Flag-Fc.+1 \mug de pcDNA6-PACE para la transfección del monómero. Las células se transfectaron como se describe en Superfect transfección reagent manual (Qiagen. Valencia, CA). El medio se retiró después de 48 horas y se reemplazó con MEM Alpha sin nucleósidos más 5% de suero fetal bovino dializado y 10 \mug/ml de Blasticidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) para ambas transfecciones, mientras que la transfección del híbrido monómero-dímero también se suplementó con 0.2 mg/ml de geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 10 días, la células se liberaron de la placa con 0.25% de tripsina y se transfirieron en frascos de cultivo de tejido T25, y la selección se continuó por 10-14 días hasta que las células comenzaron a crecer, así como líneas celulares estables se implementaron. La expresión de la proteína posteriormente se amplificó por la adición de metotrexato 25 nM.

Aproximadamente 2x10^{7} células se utilizaron para inocular 300 ml de medio de crecimiento en un frasco rotativo de 1700 cm^{2} (Corning, Coming, NY) suplementado con 5 \mug/L de vitamina K3 (menadiona sodio bisulfito) (Sigma, St Louis, MO). Los frascos rotativos se incubaron en CO_{2} al 5% a 37ºC por 72 horas. El medio de crecimiento luego se cambió con 300 ml de medio de producción libre de suero (DMEM/F12 con 5 \mug/ml de insulina bovina y 10 \mug/ml de Gentamicina) suplementado con 5 \mug/L de vitamina K3. El medio de producción (medio acondicionado) se recolectó cada día por 10 días y se almacenó a 4ºC. El medio de producción fresco, se adicionó a los frascos rotativos después de cada recolección y los frascos se regresan de nuevo a la incubadora. El medio mezclado se clarificó en primer lugar empleando un filtro de fibra de vidrio Sartoclean (3.0 \mum + 0.2 \mum) (Sartorious Corp. Gottingen, Germany) seguido por un filtro Acropack 500 (0.8 \mum + 0.2 \mum) (Pall Corp., East Hills, NY). El medio clarificado luego se concentró aproximadamente 20-veces empleando casetes de filtración de flujo tangencial Pellicon Biomax (10 kDa MWCO) (Millipore Corp., Billerica, MA).

Las quimeras de Fc luego se capturaron del medio concentrado, por pasaje sobre una Columna de Flujo Rápido Proteína A Sefarosa 4 (AP Biotech, Piscataway, NJ). Una columna de 5 x 5 cm (100 ml) se cargó con \leq5 mg de proteína Fc por ml del volumen de la columna a una velocidad de flujo lineal de 100 cm/hora para lograr un tiempo de residencia de \geq3 minutos. La columna luego se lavó con >5 volúmenes de la columna de 1X DPBS para retirar las proteínas unidas no- específicamente. La proteínas unidas se eluyeron con Glicina 100 mM pH 3.0. A continuación, las fracciones de elución que contienen el pico de proteína se neutralizaron, adicionando 1 parte de Tris- HCL1 M, pH 8 a 10 partes de la fracción eluida. El pasaje de la proteína quimérica sobre la columna Proteína A convirtió el factor VII inactivo a factor VIIa activo (figura 2). Otra activación se podría lograr pasando la proteína sobre una columna de intercambio aniónico (Peders et al. 1989, Biochemistry 28:9331-36).

La muestra de la proteína de la transfección del híbrido monómero-dímero se sometió a otra purificación, según esta contenga una mezcla de FVII-Fc:FVII-homodímero Fc, FVII-Fc: híbrido monómero-dímero FLAG-Fc, y FLAG-Fc: FLAG-homodímero Fcs. Para eliminar el FLAG-homodímero Fcs de la preparación, la mezcla de Proteína A Sefarosa 4 de Flujo Rápido en primer lugar se dializó en MES 20 mM, NaCl 20 mM, pH 6.1 y luego se pasó sobre una columna de intercambio catiónico Unosphere S (BioRad Corp., Richmond, CA). Bajo las condiciones de operación para la columna, el híbrido monómero-dímero FLAG-Fc tiene una carga neutral neta (FLAG-Fc teórica pl=6.19) y fluye a través de la columna mientras que las construcciones hFVII-Fc son de carga positiva, y de esta manera se unen a la columna y eluyen a una fuerza iónica superior. El material dializado luego se cargó sobre una columna 1.1 x 11 cm (9.9 ml) a 150 cm/hora. Durante el lavado y elución, la velocidad de flujo se incrementó a 500 cm/hora. La columna se lavó secuencialmente con 8 volúmenes de la columna de MES 20 mM, NaCl 20 mM, pH 6.1 y 8 volúmenes de la columna de MES 20 mM, NaCl 40 mM, pH 6.1. La proteína unida se eluyó con MES 20 mM, NaCl 750 mM, pH -6.1. Las fracciones de la elución que contienen el pico de proteína se mezclaron y se filtraron estériles a través de un disco de filtro de 0.2 \mum antes de almacenar a -80ºC.

Una columna de afinidad anti-FLAG MAB se utilizó para separar dímeros quiméricos de Fc con hFVII fusionado a ambas moléculas de Fc de aquellos con un péptido FLAG y una fusión HFVII. La mezcla Eluida Unosphere S se diluyó 1:1 con Tris 20 mM, NaCl 50 mM, CaCl_{2} 5 mM, pH 8 y se cargó en una columna 1.6 x 5 cm M2 anti-FLAG sefarosa (Sigma Corp., St. Louis, MO) a una velocidad de flujo lineal de 60 cm/hora. La carga se dirigió a < 2.5 mg híbrido monómero-dímero/ml del volumen de la columna. Después de la carga, la columna se lavó con 5 volúmenes de la columna Tris 20 mM, NaCl 50 mM, CaCl_{2} 5 mM, pH 8.0. Los híbridos monómero-dímero luego se eluyeron con Glicina 100 mM, pH 3.0. Las fracciones de la elución que contienen el pico de proteína, a continuación se neutralizaron adicionando 1 parte de Tris-HCl 1 M, pH 8 con 10 partes de la fracción eluida. Las mezclas se almacenaron a -80ºC.

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Ejemplo 5 Análisis de Actividad de Coagulación de Factor VII-Fc Homodímero e híbridos Monómero/Dímero

El kit de ensayo StaClot FVIIa-rTF se adquirió de Diagnostica Stago (Parsippany, NJ) y se modificó como se describe en Johannessen et al. 2000, Blood Coagulation and Fibrinolysis 11: S159. Una curva estándar se llevó a cabo con el estándar 89/688 de FVIIa World Health Organization. El ensayo comparó un homodímero compuesto de dos moléculas del factor VII y dos moléculas Fc con un híbrido monómero/dímero compuesto de una molécula del factor VII y dos moléculas de Fc. Se observó una actividad de coagulación significante, para ambos el híbrido monómero/dímero y el homodímero. La actividad de coagulación del híbrido monómero/dímero en comparación con el homodímero fue casi cuatro veces mayor (Figura 4).

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Ejemplo 6 Enlace del Factor VII-Fc con shFcRn

El enlace del factor VII-Fc con receptor Fc neonatal humano soluble (shFcRn), se analizó empleando un instrumento Biacore 3000 (Biacore, Uppsala, Sweden). Un CM5 chip (Biacore, Uppsala, Sweden) se deslizó con 3500 unidades de resonancia (RU) de shFcRn empleando química de aminas. El factor VII-Fc se diluyó, 10 veces o 100 veces, en PO_{4} 50 mM, pH 6.0, NaCl 100 mM, 0.01% de Tween-20 y se inyectó (por duplicado) sobre la superficie por 14 minutos a 10 \muL/minuto. Las muestras también se inyectaron sobre una superficie de cubierta-falsa, que sirve como un control referencia. El chip se regeneró con PO_{4} 100 mM pH 8.0. La respuesta (en RU), registrada 30 segundos antes de la inyección se detuvo, indicó el enlace específico (Figura 5).

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Ejemplo 7 Absorción Oral del Factor VII-Fc en Ratas Neonatales

Ratas recién nacidas de 9 días 25 gramos se adquirieron de Charles River (Wilmington, MA) y se adquirieron para aclimatar por 24 horas. Las ratas se dosificaron vía oral con FVIIa-homodímero Fc, o híbrido monómero/dímero (que consiste de dos cadenas Fc, uno del cual se unió a Fc-VII). Un volumen de 200 \mul de una solución de FVIIa-Fc se utilizó por una dosis de 1 mg/kg. La solución se compuso de una solución reguladora Tris-HCl pH 7.4 con 5 mg/ml de inhibidor de la tripsina de soja. Las ratas se sacrificaron con CO_{2} en varios puntos del tiempo, y 200 \mul de sangre se extrajo por punción cardíaca. Se obtuvo plasma por la adición de un volumen 1/10 de solución de citrato de sodio al 3.8% y se centrifugó a temperatura ambiente a una velocidad de 1268xg. Las muestras de plasma se utilizaron tanto en los ensayos frescos o congelados a -20ºC.

Las muestras luego se analizaron por ELISA. El Asserachrom Factor VII:Ag ELISA, se llevó a cabo en las muestras de plasma de rata neonatal. Un ensayo de ELISA Factor VII:Ag se adquirió de Diagnostica Stago (Parsippany, NJ) y se realizó como se describe en el manual del kit con un cambio. El estándar para la curva estándar se reemplazó con Factor VIIa-Fc purificado. Para experimentos in vivo, el estándar se corrió en el mismo porcentaje de plasma de animal normal como se está analizando. Los resultados mostraron que la administración oral de ambos los híbridos monómero/dímero y los dímeros tuvieron éxito (Figura 7). Un ensayo de evolución empleando híbridos monómero/dímero demostraron niveles sostenidos en plasma del Factor VIIa-Fc administrado vía oral en el tiempo con un T1/2 de 18 horas
(Figura 6).

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Ejemplo 8 Dosificación intravenosa del Factor VII-Fc en Minipigs

Minipigs Gottingen adultos (6 kg) se adquirieron de Marshall Farms y se dejaron aclimatar por dos semanas. Los cerdos se anestesiaron con 12 mg/kg de Telazol y 8 mg/kg de Xilaxina y se dosificaron vía intravenosa a través de la vena yugular con 3 ml de una solución al 0.5 mg/kg del Factor VIIa-Fc en una solución reguladora Tris-HCl pH 7.4. Tres mililitros de sangre se recolectaron en tubos vacutainer citrados (BD Sciences, Franklin Lakes, NJ) en varios puntos de tiempo vía punción venosa. Se obtuvo plasma por centrifugación de las muestras a temperatura ambiente a una velocidad de 1268xg. Las muestras de plasma se congelaron a -20ºC y posteriormente se analizaron por ELISA.

El ELISA de Factor VII:Ag Asserachrom, se llevó a cabo en las muestras de minipig. Un ensayo de Elisa Factor VII:Ag se adquirió de Diagnostica Stago (Parsippany, NJ) y se realizó como se describe en el manual del kit con un cambio. El estándar para la curva estándar se reemplazó con Factor VIIa-Fc purificado. Para los experimentos in vivo, el estándar se corrió en el mismo porcentaje de plasma de animal normal tal como se analiza. Los niveles en plasma de híbrido monómero/dímero administrado vía intravenosa se mostraron en la Figura 8A. La vida media se determinó que era 9.4 horas. Un ensayo de evolución empleando proteína quimérica del híbrido monómero/dímero demostró niveles sostenidos en plasma de Factor VIIa-Fc administrado vía intravenosa en el tiempo con un T1/2 de 22 horas (Figura 8A).

La actividad de coagulación que se emplea se midió por el kit de ensayo StaClot FVIIa-rTF (Figura 8B). El T1/2 para coagulación se encontró que era 6.4 horas para un cerdo y 5.7 para el otro cerdo.

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Ejemplo 9 Clonación de la construcción Fc-Factor IX

La secuencia codificante del Factor IX humano, incluyendo la secuencia del prepropéptido, se obtuvo por amplificación RT-PCR de ARN de hígado humano adulto empleando los siguientes cebadores:

8

20 ng de ARN de hígado humano adulto (Clontech, Palo Alto, CA) y 25 pmol de cada cebador se adicionaron a una reacción de RT-PCR empleando el RT-PCR SuperScript.^{TM} de Una-Etapa con el sistema Taq PLATINUM® (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. La reacción se llevó a cabo en un Thermocycler MJ empleando los siguientes ciclos: 50ºC 30 minutos; 94ºC 2 minutos; 35 ciclos de (94ºC 30 segundos, 58ºC 30 segundos, 72ºC 1 minuto), y uno final de 10 minutos a 72ºC. El fragmento se purificó con gel empleando el Kit Qiagen Gel Extraction (Qiagen, Valencia, CA), y se digirió con PstI-ECoRI, gel purificado, y se clonó en el extracto correspondiente del plásmido, pED.dC.XFc. El aminoácido y las secuencias de ADN del factor IX-Fc se muestran en la figura 9.

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Ejemplo 10 Expresión y purificación del Factor IX-homodímero Fc y del híbrido monómero-dímero

Las células CHO DG-44 que expresan el Factor IX-Fc se implementaron. Las células DG44 se sembraron en placas en cajas de petri de cultivo de tejido de 100 mm y se cultivaron a una confluencia de 50%-60%. Un total de 10 \mug de ADN se utilizó para transfectar una caja de 100 mm: para la transfección del homodímero, 8 \mug de pED.dC.Factor IX-Fc + 2 \mug de pcDNA6-PACE se utilizaron; para la transfección del híbrido monómero-dímero, 8 \mug de pED.dC.Factor IX-Fc + 1 \mug de pcDNA3-FlagFc +1 \mug pcDNA6-PACE se utilizaron. Las células se transfectaron como se describe en Superfect transfección reagent manual (Qiagen, Valencia, CA). El medio se retiró de la transfección después de 48 horas y se reemplazó con MEM Alpha sin nucleósidos más 5% de suero fetal bovino dializado y 10 \mug/ml de Blasticidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) para ambas transfecciones, mientras que la transfección del híbrido monómero-dímero también se suplementó con 0.2 mg/ml de geneticina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 3 días, la células se liberaron de la placa con 0.25% de tripsina y se transfirieron en frascos de cultivo de tejido T25, y la selección se continuó por 10-14 días hasta que las células comenzaron a crecer así como las líneas celulares estables se implementaron. La expresión de la proteína posteriormente se amplificó por la adición de metotrexato 10 nM o 100 nM para el homodímero o híbrido monómero-dímero, respectivamente.

Para ambas líneas celulares, aproximadamente 2 x10^{7} células se utilizaron para inocular 300 ml de medio de crecimiento en un frasco rotativo de 1790 cm^{2} (Coming, Corning, NY), suplementado con 5 \mug/L de vitamina K3 (menadiona sodio bisulfito) (Sigma, St. Louis, MO). Los frascos rotativos se incubaron en un CO_{2} al 5% a 37ºC por aproximadamente 72 horas. El medio de crecimiento se intercambió con 300 ml de medio de producción libre de suero (DMEM/F12 con 5 \mug/m) de insulina bovina y 10 \mug/ml de Gentamicina), suplementado con 5 \mug/L de vitamina K3. El medio de producción (medio acondicionado) se recolectó todos los días por 10 días y se almacenó a 4ºC. El medio de producción fresco se adicionó a los frascos rotativos después de cada recolección y los frascos se regresaron a la incubadora. Antes de la cromatografía, el medio se clarificó empleando un filtro SuporCap-100 (0.8/0.2 \mum) de Pall Gelman Sciences (Ann Arbor, MI). Todas de las siguientes etapas se realizaron a 4ºC. El medio clarificado se aplicó a la columna Proteína A Sefarosa, se lavó con 5 volúmenes de la columna de 1X PBS (fosfato 10 mM, pH 7.4, KCI 2.7 mM, y NaCl 137 mM), se eluyó con glicina 0.1 M, pH 2.7, y luego se neutralizó con 1/10 volumen de Tris-HCl 1 M, pH 9.0. La proteína luego se dializó en PBS.

La transfección de la muestra de proteína híbrido monómero-dímero se sometió a otra purificación, según esta contenga una mezcla de homodímero FIX-Fc:FIX-Fc, híbrido monómero-dímero FIX-Fc:Flag-Fc, y homodímero Flag-Fc:Flag-Fc. El material se concentró y aplicó a una columna de 2.6 cm x 60 cm (318 ml) Superdex 200 Grado Prep a una velocidad de flujo de 4 ml/minuto (36 cm/hora) y luego se eluyó con 3 volúmenes de la columna de 1X PBS. Las fracciones que corresponden a dos picos en el detector UV se recolectaron y analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones del primer pico contuvieron cualquiera el homodímero FIX-Fc:FIX-Fc o el híbrido monómero-dímero FIX-Fc:FlagFc, mientras que el segundo pico contenía homodímero FlagFc:Rag-Fc. Todas las fracciones que contienen el híbrido monómero-dímero pero no homodímero Flag-Fc se mezclaron y aplicaron directamente a una columna de 1.6 x 5 cm M2 anti-FLAG sefarosa (Sigma Corp., St. Louis, MO) a una velocidad de flujo lineal de 60 cm/hora. Después de la carga, la columna se lavó con 5 volúmenes de la columna PBS. Los híbridos monómero-dímero luego se eluyeron con Glicina 100 mM, pH 3.0. A continuación, las fracciones de la elución que contienen el pico de proteína se neutralizaron adicionando 1/10 volúmenes de Tris-HCl 1 M, y se analizaron por SDS-PAGE reducción y no-reducción. Las fracciones se dializaron en PBS, se concentraron a 1-5 mg/ml, y se almacenaron a -80ºC.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto.

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\bulletPeders et al. Biochemistry, 1989, vol. 28, 9331-36 [0136]

Claims

1. Una proteína quimérica que comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, al menos un factor de coagulación seleccionado del grupo que consiste del factor VIII, factor VIIIa, factor V, factor Va, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII o factor de von Willebrand, y opcionalmente al menos un ligador.

2. La proteína quimérica de la reivindicación 1, en donde dicha inmunoglobulina es una IgG.

3. La proteína quimérica de la reivindicación 2, en donde la porción de una región constante de inmunoglobulina es un fragmento Fc.

4. La proteína quimérica de la reivindicación 2, en donde la porción de una región constante de inmunoglobulina es un socio de enlace FcRn.

5. La proteína quimérica de la reivindicación 2, en donde el fragmento Fc comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 80% de identidad con la secuencia enunciada en SEQ ID NO:2.

6. La proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, en donde el factor de coagulación es el factor IX.

7. Una composición farmacéutica que comprende la proteína quimérica de la reivindicación 1, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

8. La proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, en donde dicha proteína quimérica es un dímero.

9. La proteína quimérica de la reivindicación 8, en donde el dímero es un homodímero.

10. Una proteína quimérica que comprende un dímero que comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde dicha primera cadena comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina y Factor VII o Factor VIIa y dicha segunda cadena comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina sin el factor VII o factor VIIa.

11. La proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, que comprende la fórmula

X-L-F

en donde F es un fragmento Fc de una inmunoglobulina y L es un ligador o un enlace directo, y X se selecciona del grupo que consiste del factor VIII, factor VIIIa, factor V, factor Va, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII o factor de von Willebrand.

12. La proteína quimérica de la reivindicación 11, en donde F comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 80% de identidad con la secuencia de aminoácido enunciada en SEQ ID NO:2.

13. La proteína quimérica de la reivindicación 11, en donde L es un ligador que comprende aproximadamente 1 a aproximadamente 20 aminoácidos.

14. La proteína quimérica de la reivindicación 11, en donde L es un ligador que comprende aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos.

15. La proteína quimérica de la reivindicación 11, en donde L es un ligador que comprende aproximadamente 1 a aproximadamente 5 aminoácidos.

16. La proteína quimérica de la reivindicación 11, en donde L es un ligador que comprende la secuencia - (Gly)_{n}-, en donde n es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.

17. La proteína quimérica de la reivindicación 11, en donde L es un ligador que comprende la secuencia - (GGS)_{n}-
o (GGGGS)_{n}, en donde n es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.

18. La proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, en donde la proteína quimérica promueve la hemostasis.

19. El uso de una cantidad efectiva terapéuticamente de la proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4 en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno hemostático.

20. El uso de la reivindicación 19, en donde el trastorno hemostático es la hemofilia A o B.

21. El uso de la reivindicación 19, en donde el factor de coagulación es el factor IX.

22. El uso de la reivindicación 19, en donde el medicamento se formula para la administración vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, o vía una superficie de mucosa.

23. El uso de la reivindicación 22, en donde el medicamento se formula para la administración vía oral, nasal, rectal, vaginal, o administración vía bucal.

24. El uso de la reivindicación 22, en donde el medicamento se formula para la administración vía una ruta pulmonar.

25. El uso de la reivindicación 19, en donde el medicamento se formula para la administración no-parenteral.

26. El uso de la reivindicación 19, en donde el medicamento se formula para la administración en una dosis de 0.1-1000 \mug/kg.

27. El uso de la reivindicación 19, en donde el medicamento se formula para la administración diaria.

28. Un método para hacer una proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, dicho método que comprende:

a) transfección de una célula con una construcción de ADN que comprende una primera secuencia de ADN que codifica al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina ligada operativamente a una segunda secuencia de ADN que codifica un factor de coagulación y opcionalmente una tercera secuencia de ADN que codifica una endoproteasa;

b) cultivo de dicha célula bajo condiciones, de tal manera que la proteína quimérica se exprese; y

c) aislamiento de dicha proteína quimérica a partir de dicha célula.

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29. El método de la reivindicación 28, en donde las condiciones de cultivo incluyen vitamina K.

30. El método de la reivindicación 29, en donde la endoproteasa es PACE.

31. El método de la reivindicación 28, en donde la célula es una célula eucariota.

32. El método de la reivindicación 31, en donde la célula es una célula CHO o una célula BHK.

33. El método de la reivindicación 28 que además comprende la transfección de una célula con una segunda construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina sin dicha segunda secuencia que codifica un factor de coagulación.

34. El método de la reivindicación 28 o 33, en donde dicha porción de una región constante de inmunoglobulina es un fragmento Fc.

35. El método de la reivindicación 28 o 33, en donde dicha porción de una región constante de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG.

36. El método de la reivindicación 28 o 33, en donde dicha porción de una región constante de inmunoglobulina es un socio de enlace FcRn.

37. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4.

38. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 37.

39. El vector de la reivindicación 38, en donde el factor de coagulación es el factor IX.

40. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 38.

41. La célula huésped de la reivindicación 40, en donde dicha célula huésped es una célula CHO o una célula BHK.

42. La proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4, que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:2.

43. El vector de la reivindicación 39, que comprende la secuencia de ADN de SEQ ID NO:3.

44. El uso de al menos una proteína quimérica de la reivindicación 1, 2, 3, o 4 en combinación con cualquier agente conocido que tenga actividad del factor de coagulación en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno hemostático.

45. El uso de la reivindicación 44 en donde dicho segundo agente es el factor VIII, factor IX, factor XI, factor XII, fibrinógeno, protrombina, factor V, factor VII, factor X, factor XIII o factor de von Willebrand.

46. La proteína quimérica de la reivindicación 8, en donde la proteína quimérica es un dímero que comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde dicha primera cadena comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina y el Factor VIII y dicha segunda cadena comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina sin el factor VIII.

47. La proteína quimérica de la reivindicación 8, en donde la proteína quimérica es un dímero que comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde dicha primera cadena comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina y el Factor IX y dicha segunda cadena comprende un fragmento Fc de una inmunoglobulina sin el factor IX.