ES2249041T3

ES2249041T3 - Tamiz de alta capacidad.

Info

Publication number: ES2249041T3
Application number: ES99957097T
Authority: ES
Inventors: David Geraint Owen; Nicholas Gerard Byrne
Original assignee: Xention Discovery Ltd
Current assignee: Xention Discovery Ltd
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1999-06-14
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2019-06-14
Also published as: CA2334770A1; HUP0102915A3; AU768862B2; DE69940707D1; US20110048939A1; DE69926883D1; US20130288289A1; US20160054298A9; EP1621888A1; CA2334770C; EP1084410A1; HUP0102915A2; EP1084410B3; JP2002518678A; ZA200007296B; DE69926883T2; US20150068925A1; DK1084410T5; US8449825B2; MXPA00012345A

Abstract

Una estructura que comprende una membrana biológica adherida con un sello de alta resistencia a un sustrato para su uso en un procedimiento de cribado de alta capacidad, en la que: la membrana biológica comprende un canal iónico o transportador; y el sustrato es poroso en virtud de las perforaciones que a través del mismo forman poros a través de sustrato.

Description

Tamiz de alta capacidad.

La presente invención se refiere a una estructura que comprende una membrana biológica y un sustrato poroso o perforado, una membrana biológica, un sustrato, un tamiz de alta capacidad, procedimientos para la producción de la membrana y del sustrato de la estructura, y a un procedimiento para cribar un gran número de compuestos de prueba en un periodo corto. Más particularmente, se refiere a una estructura que comprende una membrana biológica adherida a un sustrato poroso o perforado, una membrana biológica capaz de adherirse con un sello de alta resistencia a un sustrato, tal como vidrio perforado, y la capacidad para formar láminas que tienen predominantemente un canal iónico o transportador de interés, un tamiz de alta capacidad para determinar el efecto de los compuestos de prueba sobre la actividad del canal iónico o transportador, procedimientos para fabricar la estructura, la membrana y el sustrato, y un procedimiento para controlar la actividad del canal iónico o transportador en una membrana.

En el contexto de esta memoria descriptiva, la palabra "comprende" debe entenderse que significa "incluye" y no pretende significar "se limita a sólo".

Los canales iónicos son proteínas transmembranales que forman poros en la membrana que permiten el paso de los iones desde un lado al otro (Hille, 1992). Pueden mostrar una especificidad iónica, permitiendo que iones específicos difundan pasivamente a través de una membrana a favor de sus gradientes electroquímicos. Aunque ciertos tipos de canales están como término medio abiertos todo el tiempo y en todos los potenciales fisiológicos de membrana (los denominados canales de fuga), muchos canales tienen "puertas" que se abren en respuesta a una perturbación específica de la membrana. Las perturbaciones conocidas por provocar la apertura de los canales iónicos incluyen un cambio en el potencial eléctrico a través de la membrana (canales operados por voltaje), la estimulación mecánica (canales operados mecánicamente) o la unión de una molécula de señalización (canales operados por ligando).

Los transportadores son proteínas de la membrana celular que catalizan el movimiento de iones inorgánicos tales como Na^{+} y K^{+}, así como de moléculas orgánicas tales como neurotransmisores, como el caso de las denominadas bombas de recaptación, por ejemplo, GABA, dopamina y glicina. Dos características que distinguen a los portadores frente a los poros son i) su cinética de movimiento de los iones a través de los transportadores es mucho más lenta que los >10^{6} iones por segundo que se encuentra en los canales iónicos, y ii) los canales iónicos conducen a favor de gradiente electroquímico, mientras que los transportadores pueden "bombear" en contragradiente, es decir, en contra de la concentración de gradiente (Hille, 1992). Este último proceso normalmente depende directamente de la energía proporcionada de una forma estequiométrica.

La invención tiene aplicación principalmente en la medida de la actividad del canal iónico, pero también de los transportadores para los que éstos son electrogénicos, por ejemplo, Na^{+}/K^{+}; Na^{+}/Ca^{+2}; transportador de recaptación de glutamato (Brew y Attwell, 1987)

La actividad del canal iónico se ha estudiado usando una técnica denominada "patch clamping" (pinzamientó en porción) (Hamill y col., 1981). Según esta técnica, una pequeña porción de una membrana celular se aísla generalmente con la punta de una micropipeta presionando la punta contra la membrana. Se ha sugerido que si se establece un fuerte sello entre la micropipeta y la porción de la membrana, una corriente eléctrica puede pasar a través de la micropipeta sólo a través de los canales iónicos de la porción de la membrana. Si esto se consigue, puede controlarse la actividad de los canales iónicos y su efecto sobre el potencial de membrana, la resistencia y la corriente. Si el potencial eléctrico a través de la membrana permanece constante, la corriente suministrada a la misma es igual a la corriente que fluye a través de los canales iónicos de la membrana. Si los canales iónicos de la membrana se cierran, la resistencia de la membrana aumenta. Si la corriente aplicada permanece constante, el aumento en la resistencia es directamente proporcional a un aumento del potencial eléctrico a través de la membrana.

Se sabe que muchos fármacos ejercen su efecto modulando los canales iónicos, pero el desarrollo de nuevos compuestos que actúen sobre ellos se ve considerablemente obstaculizado por la dificultad en el cribado a altas tasas de capacidad con respecto a la actividad.

Los procedimientos electrofisiológicos convencionales, tales como las técnicas de pinzamiento en porción o de voltaje, proporcionan una información mecanicista definitiva, pero adolecen del problema de que no son aptos para el cribado rápido de compuestos de prueba.

El documento WO96/13721 describe un aparato para llevar a cabo una técnica de pinzamiento en porción utilizada para estudiar el efecto de ciertos materiales sobre los canales de transferencia de iones en tejido biológico. Describe un aparato de pinzamiento en porción que utiliza un automuestreador, tales como los utilizados con los aparatos de HPLC, para proporcionar una capacidad mayor que la que se puede conseguir mediante la técnica de pinzamiento en porción convencional. Este aparato adolece del problema de que simplemente semiautomatiza el sistema de administración del fármaco, pero no el registro del pinzamiento en porción. Adolece por tanto de las mismas limitaciones que el pinzamiento en porción tradicional con respecto a la velocidad del tratamiento de compuestos, y en modo alguno puede ser considerado como un sistema de alta capacidad. El sistema requiere todavía un tratamiento lineal (es decir, el tratamiento de los datos obtenidos de una célula tras otra). En contraste directo, la invención descrita en este documento proporciona un tratamiento paralelo, y por tanto una legítima alta capacidad de los compuestos.

El documento WO97/25616 describe un Sensor de Canal Iónico (SCI) que usa una membrana con una bicapa lipídica para cribar anticuerpos o antígenos en una muestra biológica, para determinar la compatibilidad de dos muestras sanguíneas y para detectar antígenos.

Los productos sanguíneos se introducen en la celda de un biosensor que comprende un SCI en el que el ionóforo y los lípidos que abarcan la membrana (MSL's) presentan moléculas capaces de unirse a sitios epítopos de un glóbulo rojo, de forma que la llegada del lóbulo rojo a la membrana retícula el ionóforo y los MSL, y afecta a la corriente iónica a través de la membrana. Los productos sanguíneos deben pasar a través de una fina capa de esferas de percolación para alcanzar la membrana. Las moléculas preferibles capaces de unirse a los sitios epítopos de un glóbulo rojo son anticuerpos que se unen selectivamente a las moléculas de glucoproteínas que están presentes en la superficie del glóbulo rojo. Facilita además la determinación del estado de coagulación de una población de eritrocitos usando un conjunto de electrodos de oro de pequeño diámetro portadores de una membrana biosensora, en los que el elemento de reconocimiento era típicamente un anticuerpo anti-glucoproteína. Cada electrodo puede dirigirse independientemente usando un conjunto multiplexado.

El término "membrana biológica" usado en este documento pretende incluir membranas artificiales tales como bicapas lipídicas y otras membranas conocidas por una persona experta en la materia.

La presente invención se dirige a los problemas relacionados con los tamices y los procedimientos de cribado conocidos.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una estructura que comprende una membrana biológica adherida con un sello de alta resistencia a un sustrato poroso o perforado para su uso en un procedimiento de cribado de alta capacidad, en el que la membrana biológica comprende un canal iónico o transportador, y el sustrato es poroso en virtud de las perforaciones que a través del mismo forman poros a través de sustrato.

En un segundo aspecto, la invención proporciona una membrana biológica para su uso en la estructura, que es capaz de adherirse a un sustrato con un sello de alta resistencia, en el que cada célula forma una unión estrecha con las células adyacentes y expresa un canal iónico que está localizado en la membrana celular.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un sustrato para su uso en un cribado de alta capacidad, que está perforado.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona un tamiz de alta capacidad (HiT) para la detección y el ensayo de compuestos de prueba con actividad sobre canales iónicos operados por voltaje, que comprende la membrana biológica.

En un quinto aspecto, la invención proporciona un procedimiento para fabricar una estructura que comprende una membrana biológica adherida con un sello de alta resistencia a un sustrato perforado, que comprende las etapas de elegir el sustrato, perforarlo, introducir una membrana biológica en el sustrato y sellar cada poro con la membrana biológica.

En un sexto aspecto, la invención proporciona un procedimiento para fabricar la membrana biológica que comprende las etapas de elegir un tipo de célula, evaluar su capacidad para formar capas de células contiguas con uniones estrechas y un número entre bajo y despreciable de canales iónicos operados por voltaje, cultivar las células en un sustrato y asegurarse de que crece una capa de células contiguas.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona un procedimiento para fabricar un sustrato perforado que comprende las etapas de irradiar con un láser a un área focal, intensidad o tiempo de exposición preseleccionados, sobre un cubreobjetos para perforarlo. Éste procedimiento también puede incluir la etapa adicional de la modificación del área perforada mediante la exposición a plasma y/o calor localizado, con objeto de alcanzar el nivel apropiado de suavidad en la(s) perforación(es).

En un octavo aspecto, la invención proporciona un procedimiento de cribado para la detección o el ensayo de compuestos con actividad sobre canales iónicos, que comprende las etapas de poner en contacto una membrana biológica que expresa los canales iónicos de interés con el compuesto de prueba en una disolución fisiológica o en una disolución no fisiológica que comprende un disolvente tal como su dimetilsulfóxido, y medir la resistencia o la impedancia de la membrana biológica bajo la influencia del compuesto de prueba.

Preferiblemente, una forma de realización de la membrana biológica comprende células con un canal iónico o transportador que reside de forma natural en la membrana celular de las mismas, o que puede ser insertado mediante transfección con ADNc y/o ARNc que codifica para el canal iónico o transportador. La invención tiene por tanto la ventaja de que permite el estudio de canales o transportadores naturales en los que se desconoce la composición exacta de la subunidades, o en los que de hecho la identidad molecular es completamente desconocida (es decir, todavía no se ha clonado), pero también de canales o transportadores clonados expresados heterogéneamente en los que la identidad del canal o transportador natural es conocida o en los que se requiere un conocimiento exacto de la interacción entre las estructuras del compuesto y las fracciones químicas del canal iónico o transportador. Por lo tanto, el sistema es sustancialmente más versátil, existiendo entonces metodologías que son insensibles y se basan en alcanzar altas concentraciones de células (lo que no siempre es posible con neuronas) y altas proporciones entre la señal y el ruido, que limita su uso a sólo ciertos tipos de células y canales iónicos.

Preferiblemente, una forma de realización de la membrana biológica comprende una pluralidad de canales iónicos o transportadores que son predominantemente canales iónicos o transportadores preseleccionados de interés. Esto provee a la invención con la ventaja de permitir un cribado paralelo de diferentes canales, proporcionando potencialmente una capacidad incluso mayor de los compuestos.

Más preferiblemente, una forma de realización de la membrana biológica comprende células modificadas genéticamente que han sido modificadas para expresar predominantemente un canal iónico o transportador.

Preferiblemente, los canales iónicos son canales iónicos operados por voltaje.

Preferiblemente, una forma de realización de la membrana biológica comprende células elegidas del grupo que comprende células HEK-293, células de ovario de hámster chino (CHO) modificadas genéticamente, tejido neuronal primario tal como hipocampo, ganglios de las raíces dorsales, ganglios cervicales superiores, etc.; músculo esquelético; músculo liso; músculo cardíaco; células inmunitarias; epitelio; endotelio, etc..

Las células CHO y los subclones CHO, tales como CHO-K1 y CHO-dhfr (también conocidos como Dukx) tienen unos niveles excepcionalmente bajos de expresión de canales iónicos endógenos, proporcionando así la ventaja de tener unas excelentes características entre la señal y el ruido en un entorno de células de mamífero. De forma similar, las células HEK-293 (riñón embrionario humano) expresan bajos niveles de canales naturales y proporcionan un "entorno" de expresión humano. Estos dos sistemas de expresión son infinitamente preferibles a la técnica usada del ovocito de Xenopus cuando no sólo son abundantes los canales y las subunidades naturales, sino cuando el entorno de la célula anfibia difiere de forma importante del de las células de mamífero.

Preferiblemente, una forma de realización de la membrana biológica comprende canales iónicos con rápidas cinéticas de activación e inactivación que los procedimientos existentes de cribado de alta capacidad no pueden analizar. Los sistemas existentes, por lo tanto, promedian señales transitorias de los canales iónicos frecuentemente durante periodos de muchos segundos. Los canales que se inactivan con constantes temporales del orden de milisegundos y sin la presencia de un estado estacionario son efectivamente indetectables en dicho sistemas. Sin embargo, la invención aquí presentada tiene la ventaja de que puede analizar fácilmente dichas cinéticas, tal como lo hacen los tradicionales pinzamientos en porción, pero con altas tasas de capacidad.

Preferiblemente, una forma de realización de la membrana biológica comprende canales iónicos que muestran especificidad para los iones elegidos del grupo que comprende sodio, potasio, calcio, cloruro.

Preferiblemente, una forma de realización de la membrana biológica comprende una capa de células contiguas capaz de adherirse con un sello de alta resistencia a sustratos elegidos del grupo que comprende vidrio perforado, plástico, caucho, politetrafluoroetileno (PTFE), PTFE/lana de vidrio y tereftalato de polietileno (PETP).

Preferiblemente, una forma de realización de la membrana biológica comprende un pseudoepitelio en el que una cara de una capa de células contiguas está permeabilizada, proporcionando así acceso al interior de las células. Esto tiene la gran ventaja de proporcionar el medio para el pinzamiento de corriente y de voltaje, que no es posible con ningún sistema de cribado de alta capacidad existente. Esto no sólo permite un alto registro de tiempo-resolución, sino que también proporciona el medio para estimular o activar los canales iónicos operados por voltaje de una forma precisa y controlada. Por ejemplo, no es necesario alterar la composición iónica, por ejemplo, elevando el K^{+} para despolarizar las células, que por sí mismo puede modular la cinética de los canales iónicos (por ejemplo, los canales de K^{+}) y también interferir en la actividad de los nuevos ligandos mediante la competición en los sitios de unión del canal iónico. Esto es una ventaja muy grande sobre todos los sistemas existentes. La permeabilización también permite la introducción en el citosol de compuestos que, de otro modo, no podrían hacerlo, ya sea en virtud de su peso molecular o de sus características fisicoquímicas.

Preferiblemente, una forma de realización de la membrana biológica comprende una capa de células contiguas que está permeabilizada mediante un antibiótico elegido del grupo que comprende anfotericina y nistatina; o un detergente elegido del grupo que comprende digitonina y saponina; o una desestabilización física usando un campo de alto voltaje; o mediante digestión enzimática de una parte de la membrana usando una enzima apropiada.

Una ventaja del uso de campos de alto voltaje para permeabilizar la membrana (electropermeabilización) es que dicha técnica puede permeabilizar la membrana plasmática conservando a la vez las estructuras intracelulares menores, tales como la mitocondria y el retículo endoplásmico. La técnica también puede ser controlada de forma muy precisa y no necesitaría una instalación para intercambiar las disoluciones en una cámara inferior del aparato de registro.

Preferiblemente, una forma de realización del sustrato comprende un cubreobjetos perforado.

Preferiblemente, una forma de realización del sustrato tiene poros con un diámetro de entre 0,5 \mum y 10 \mum. Más preferiblemente, los poros tienen un diámetro de entre 1 y 7 \mum. Más preferiblemente, el diámetro es de 1-2 \mum.

Preferiblemente, una forma de realización del sustrato comprende una rejilla de poros con un número mayor de 4 pero menor de 10. Esto proporciona la ventaja de un número estadísticamente aceptable de registros en paralelo (es decir, \geq 4) en cada tratamiento, pero lo suficientemente pequeña para que la proporción entre los poros y las células pueda hacerse desvanecidamente pequeña, y por lo tanto la probabilidad de que un poro esté sellado y por lo tanto ocluido por una célula extremadamente alta.

Preferiblemente, una forma de realización del sustrato según la invención se fabrica a partir de un material elegido del grupo que comprende vidrio, plástico, caucho, politetrafluoroetileno (PTFE), PTFE/lana de vidrio y tereftalato de polietileno (PETP).

Preferiblemente, una forma de realización del tamiz comprende:

una pluralidad de cámaras, teniendo cada una superficie periférica permeable que proporciona un sustrato para la membrana biológica;

una pluralidad de pocillos, siendo cada uno capaz de recibir una cámara y un compuesto de prueba en una disolución fisiológica o en una disolución no fisiológica que comprende dimetilsulfóxido (DMSO) u otro disolvente;

una pluralidad de electrodos de referencia, teniendo al menos uno contacto eléctrico con cada pocillo;

un cabezal registrador móvil portador de al menos un electrodo de registro, proporcionando así el requerimiento básico para el registro automatizado de la actividad del canal iónico en un formato de placa multipocillos;

medios para medir la resistencia o la impedancia eléctrica entre los electrodos de registro y de referencia; en los que

la corriente eléctrica puede pasar entre los electrodos de registro y de referencia a través de la superficie periférica permeable de cada cámara únicamente a través de los canales iónicos o transportadores de la membrana biológica.

Preferiblemente, una forma de realización del tamiz comprende pocillos que son proporcionados por una placa multipocillos. Siendo la ventaja de esto que puede conseguirse una alta capacidad usando componentes industriales estándar que pueden tratarse usando equipamiento y robótica automatizada disponible comercialmente. Los usuarios tendrán la posibilidad de usar su equipo de tratamiento de placa actual, conteniendo así los costes de establecer un tamiz de electrofisiología de alta capacidad en el estado de la técnica.

Preferiblemente, una forma de realización del tamiz comprende un sustrato perforado para la membrana biológica.

Preferiblemente, una forma de realización adicional del tamiz comprende una estructura o membrana biológica descrita anteriormente con los canales iónicos de interés en un conjunto de gotitas sobre un sustrato poroso. Preferiblemente se fabrica un conjunto de cámaras de registro en miniatura colocando una "tapa" que incorpora electrodos de registro sobre la matriz de gotitas, de forma que se establezca un menisco de la disolución de gotitas. Preferiblemente se coloca un compuesto de prueba en una disolución eléctricamente conductora en al menos una de las gotitas, o se aplica a través de los puertos de acceso de la "tapa", y se mide la resistencia/impedancia (en la configuración de pinzamiento de corriente) de la membrana biológica, o la conductancia (en la configuración de pinzamiento de voltaje) bajo la influencia del compuesto de prueba. Una ventaja de esta metodología es que las láminas de sustrato pueden ser diseñadas sin la necesidad de transferir piezas del sustrato (por ejemplo, discos) a placas multipocillos, y también evita el complejo diseño de la cámara con sellos, anillos en "O" y similares. La invención todavía puede acomodar la adición de disoluciones, y tiene la ventaja adicional de usar volúmenes muy pequeños, y por lo tanto, cantidades de reactivos y de células pequeñas. Los huecos de aire proporcionan un excelente aislamiento entre las gotitas adya-
centes.

Preferiblemente, una forma de realización del cabezal registrador comprende un único electrodo de registro capaz de ser movido para visitar secuencialmente cada cámara. Más preferiblemente, una forma de realización de cabezal registrador comprende una pluralidad de electrodos de registro dispuestos en línea. Incluso más preferiblemente, el cabezal registrador comprende una pluralidad de electrodos de registro dispuestos en una matriz. La ventaja de esta configuración es que es posible el registro simultáneo desde todos los pocillos a través del sistema multiplexador de adquisición de datos.

Preferiblemente, una forma de realización del tamiz es capaz de multiplexar hasta 384 elementos de registro hacia un sistema de adquisición de datos utilizando amplificadores múltiples del pinzamiento de voltaje. Esto tiene la ventaja de proporcionar un tiempo de resolución extremadamente alto y de medir efectivamente de forma simultánea desde todos los pocillos. Esto tiene la ventaja de proveer al sistema TERM con el potencial para alcanzar tasas de capacidad similares a las mejores posibles para los ensayos convencionales de unión ligando-receptor basados en fluorescencia (\geq 150.000 compuestos por semana).

Preferiblemente, una forma de realización del procedimiento para fabricar la estructura comprende las etapas de perforar simultáneamente un cubreobjetos y sellar los poros con la membrana biológica. Esta forma de realización proporciona la ventaja de eliminar las etapas de establecimiento de la configuración final, a saber, los procedimientos requeridos para optimizar la probabilidad de sellar una célula con poros en el sustrato perforado. Esto tiene la ventaja de simplificar el producto final.

Preferiblemente, una forma de realización del procedimiento de fabricación la membrana biológica incluye la etapa de permeabilizar una superficie de la capa de células contiguas, proporcionando así acceso al interior de las células. Esto tiene la gran ventaja de proporcionar el medio para el pinzamiento de corriente y de voltaje, que no es posible con ningún sistema de cribado de alta capacidad existente. Esto no sólo permite un alto registro de tiempo-resolución, sino que también proporciona el medio para estimular o activar los canales iónicos operados por voltaje de una forma precisa y controlada. Por ejemplo, no es necesario alterar la composición iónica, por ejemplo, elevando el K^{+} para despolarizar las células, que por sí mismo puede modular la cinética de los canales iónicos (por ejemplo, los canales de K^{+}) y también interferir en la actividad de los nuevos ligandos mediante la competición en los sitios de unión del canal iónico. Esto es una ventaja muy grande sobre todos lo sistemas existentes. La permeabilización también permite la introducción en el citosol de compuestos que, de otro modo, no podrían hacerlo, ya sea en virtud de su peso molecular o de sus características fisicoquímicas.

Preferiblemente, las permeabilización se lleva a cabo mediante la etapa de poner en contacto la superficie con un antibiótico elegido del grupo que comprende anfotericina y nistatina; o un detergente elegido del grupo que comprende digitonina y saponina; o una desestabilización física usando un campo de alto voltaje; o mediante digestión enzimática de una parte de la membrana celular usando una enzima apropiada.

Preferiblemente, una forma de realización del procedimiento de fabricación de la membrana biológica incluye las etapas de transfectar las células con ADNc o ARNc que codifica para un canal iónico de interés, y clonar las células que expresan el canal iónico de interés. Estas etapas proveen a la invención con la ventaja de permitir el estudio de canales clonados expresados heterogéneamente en los que la identidad del canal natural es conocida o en los que se requiere un conocimiento preciso de la interacción entre las estructuras del compuesto y las fracciones químicas del canal iónico.

Preferiblemente, una forma de realización del procedimiento de fabricación del sustrato perforado comprende las etapas de ajustar el perfil, el ahusamiento o el diámetro del poro con un láser.

Preferiblemente, la fuente del láser está controlada por una etapa automatizada bajo el control de un ordenador y de un microscopio de contraste en fase invertida que proporciona la ventaja de permitir el examen visual de las características del poro, por ejemplo, el perfil, el ahusamiento y el diámetro.

Preferiblemente, una forma de realización del procedimiento de fabricación del sustrato perforado comprende otros procedimientos sin láser tales como fotograbado, vaciado y perforación física del sustrato.

Preferiblemente, una forma de realización del procedimiento de cribado comprende la etapa de medir la actividad del canal iónico controlando las medidas de resistencia transepitelial (TERM) a través de una capa celular intacta.

En una forma de realización adicional del procedimiento de cribado, se permeabiliza preferiblemente una superficie de la capa de células contiguas, proporcionando así acceso al interior de las células. Esto tiene la gran ventaja de proporcionar el medio para el pinzamiento de corriente y de voltaje, que no es posible con ningún sistema de cribado de alta capacidad existente. Esto no sólo permite un alto registro de tiempo-resolución, sino que también proporciona el medio para estimular o activar los canales iónicos operados por voltaje de una forma precisa y controlada. Por ejemplo, no es necesario alterar la composición iónica, por ejemplo, elevando el K^{+} para despolarizar las células, que por sí mismo puede modular la cinética de los canales iónicos (por ejemplo, los canales de K^{+}) y también interferir en la actividad de los nuevos ligandos mediante la competición en los sitios de unión del canal iónico. Esto es una ventaja muy grande sobre todos lo sistemas existentes. La permeabilización también permite la introducción en el citosol de compuestos que, de otro modo, no podrían hacerlo, ya sea en virtud de su peso molecular o de sus características fisicoquímicas.

Preferiblemente, se permeabiliza una superficie de la capa de células contiguas mediante un antibiótico elegido del grupo que comprende anfotericina y nistatina; o un detergente elegido del grupo que comprende digitonina y saponina; o una desestabilización física usando un campo de alto voltaje; o mediante digestión enzimática de una parte de la membrana usando una enzima apropiada, permitiendo así realizar las medidas de voltaje o de corriente intracelulares.

Una ventaja del uso de campos de alto voltaje para permeabilizar la membrana (electropermeabilización) es que dicha técnica puede permeabilizar la membrana plasmática conservando a la vez las estructuras intracelulares menores, tales como la mitocondria y el retículo endoplásmico. La técnica también puede ser controlada de forma muy precisa y no necesita una instalación para intercambiar las disoluciones en una cámara inferior del aparato de registro.

Preferiblemente, una forma de realización de la invención proporciona un procedimiento de cribado que incluye la etapa de multiplexar hasta 384 elementos de registro hacia un sistema de adquisición de datos utilizando amplificadores múltiples del pinzamiento de voltaje. Esto tiene la ventaja de proporcionar un tiempo de resolución extremadamente alto y de medir efectivamente de forma simultánea desde todos los pocillos. Esto tiene la ventaja de proveer al sistema TERM con el potencial para alcanzar tasas de capacidad similares a las mejores posibles para los ensayos convencionales de unión ligando-receptor basados en fluorescencia (\geq 150.000 compuestos por semana).

Preferiblemente, una forma de realización del procedimiento de cribado para la detección o ensayo de compuestos con actividad sobre los canales iónicos de interés en un conjunto de gotitas sobre un sustrato poroso. Puede fabricarse un conjunto de cámaras de registro en miniatura colocando una "tapa" que incorpora electrodos de registro sobre la matriz de gotitas, de forma que se establezca un menisco de la disolución de gotitas. Se coloca un compuesto de prueba en una disolución conductora en al menos una de las gotitas, o se aplica a través de los puertos de acceso de la "tapa", y se mide la resistencia de la membrana biológica, o la conductancia (en la configuración de pinzamiento de voltaje) bajo la influencia del compuesto de prueba.

En una forma de realización alternativa del procedimiento de cribado la membrana biológica se coloca en una pluralidad de cámaras, y se añade a las cámaras el compuesto de prueba en una disolución fisiológica, o en una disolución no fisiológica que comprende un disolvente, por ejemplo, dimetilsulfóxido.

Preferiblemente, una forma de realización del procedimiento de cribado comprende las etapas de administración del fármaco y de lavado de la placa multipocillos.

Preferiblemente, una forma de realización del procedimiento de cribado incorpora una etapa de estimulación de las células que implica el uso de un "capturador de iones" fotoactivable, por ejemplo, de iones tales como K^{+}. La entidad activa puede ser liberada iluminando toda la placa de una vez con una fuente de luz de alta intensidad, por ejemplo, un láser o una lámpara de xenón. La ventaja de este sistema es que el potencial de membrana puede ser alterado alterando la distribución iónica de una forma no invasiva y con un fino control temporal.

Sorprendentemente se ha averiguado que una membrana biológica puede adherirse con un sello de alta resistencia a un sustrato perforado para su uso en un tamiz de alta capacidad para compuestos de prueba con actividad sobre canales iónicos. Al principio esto no se consideraba obvio para una persona experta en la materia a la vista del hecho de que el logro de un sello de alta resistencia no había sido posible sin una carga indebida. Adicionalmente, los sustratos perforados con una membrana biológica sellada a los mismos no habían sido sugeridos para su uso en tamices de alta capacidad.

Sorprendentemente se ha averiguado que puede construirse una membrana biológica capaz de adherirse con un sello de alta resistencia a un sustrato para su uso en un tamiz de alta capacidad. Sorprendentemente se ha averiguado que la membrana biológica puede construirse con canales iónicos que sean predominantemente los canales iónicos de interés. Adicionalmente, sorprendentemente se ha averiguado que puede construirse un tamiz de alta capacidad y usarse para detectar y ensayar una capacidad de compuestos de prueba que puede estar en un exceso de 30.000 por semana.

Sorprendentemente, el tamiz puede usarse para obtener datos electrofisiológicos fiables relativos a la actividad funcional de un canal iónico.

La membrana biológica de la invención no era obvia al principio para una persona experta en la materia. La construcción de una membrana biológica con un sello de alta resistencia con un sustrato tal como vidrio perforado no se había conseguido y no se consideraba posible sin una carga indebida. Además, la construcción de una membrana con canales iónicos que sean predominantemente un canal iónico de interés no se había considerado posible sin una carga indebida.

Los tamices de alta capacidad y los procedimientos de la invención no eran obvios al principio para una persona experta en la materia a la vista del hecho de que no se había considerado posible sin una carga indebida cribar la alta capacidad de compuestos de prueba que puede conseguirse mediante la invención.

Además de la ventaja de la alta capacidad de compuestos de prueba, las formas de realización del tamiz y del procedimiento de la invención pueden proporcionar ensayos funcionales (cotéjese digamos la unión de ligando) en los que el modo de acción (por ejemplo, bloqueo o incremento) del compuesto de prueba sobre los canales iónicos operados por voltaje se mide a través de los cambios de la resistencia de la membrana o registrando el flujo de corriente a través de los canales iónicos directamente en la membrana.

La invención se describirá ahora haciendo referencia a los siguientes ejemplos de formas de realización preferibles y a los dibujos anexos, en los que:

La Figura 1 muestra una versión de células epiteliales de un tamiz según una forma de realización de la invención.

La Figura 2 muestra una forma de realización del tamiz de la invención con un sustrato perforado.

La Figura 3 muestra la datación de una placa multipocillos disponible comercialmente para su uso en un tamiz según una forma de realización de la invención. La figura muestra un agrupamiento integral de cabezales de electrodos multirregistradores.

La Figura 4 muestra una forma de realización que usa un cabezal registrador móvil en el que un único cabezal registrador lee secuencialmente pocillos individuales.

La Figura 5 muestra una forma de realización de un sistema de matriz fluido en el que se crea un conjunto de cámaras registradoras en miniatura dispensando gotitas sobre sustrato de registro con un patrón y una densidad predeterminados. La Figura 5 (f) muestra la inserción completa (configuración de registro) del sistema.

La Figura 6 muestra una forma de realización adicional de un sistema de matriz fluido en el que múltiples conjuntos de gotitas son insertadas conjuntamente.

La Figura 7 muestra un poro formado en un sustrato, según la invención. La micrografía clara muestra un poro en un delgado sustrato de vidrio. El poro, que tenía aproximadamente 2 micrómetros de diámetro, se creó usando pulsos de energía láser concentrada, seguidos de una combinación de pulido al fuego y modificación en plasma. La barra de escala es de 10 micrómetros de un lado a otro.

Ejemplos

Una forma de realización del tamiz de la invención comprende una placa multipocillos con dispositivos de registro integrados, medio mediante el cual puede realizarse un pinzamiento masivo de voltaje en paralelo (MPVC) sobre una pluralidad de pocillos de una placa en cortos períodos de tiempo (de aproximadamente 1-60 s). Preferiblemente se emplean placas de 96 ó 384 pocillos disponibles comercialmente, o se adopta el formato de 96 ó 384 posiciones de conjunto.

Una forma de realización del tamiz de la invención proporciona preferiblemente una capacidad de compuestos de prueba en exceso de 30.000 por semana, con lecturas electrofisiológicas fiables de la actividad funcional del canal iónico. Una forma de realización del tamiz puede proporcionar una elevada resolución tanto en términos de tiempo; para una placa de 96 pocillos, una configuración de pinzamiento de 1ms/punto/voltaje. La sensibilidad a la modulación de la actividad del canal es \geq 1%.

Una forma de realización de la presente invención proporciona un procedimiento que comprende las etapas de medir la resistencia eléctrica transepitelial a través de una capa de células contiguas que expresan predominantemente un canal iónico de interés. La persona experta en la materia apreciará que el procedimiento depende de la adherencia de las células a un sustrato, lo que permite la formación de uniones estrechas entre las células adyacentes de forma que se forme una lámina de alta resistencia. Los cambios en la actividad de los canales y únicos expresados en la membrana de las células individuales son reflejados por los cambios en la resistencia a través de la lámina como un todo. En un perfeccionamiento de esta forma de realización de la invención, se obtiene acceso al interior de las células que comprenden la lámina mediante un medio que permite realizar el registro de las poblaciones de pinzamiento de corriente y voltaje.

Las medidas de la resistencia transepitelial se han llevado a cabo como sigue:

a) Células de tipo epitelial/endotelial

La resistencia transepitelial global está formada por dos componentes principales, la suma de las conductancias "de la célula completa" de las células individuales que forman el pseudoepitelio y la suma de las vías de conductancia intercelulares.

Las células epiteliales (y endoteliales) naturales forman uniones estrechas entre sí. Este estrecho empaquetamiento reduce la pérdida de iones/solutos entre las células, dando como resultado un número relativamente bajo de vías de conductancia intercelulares a través de la membrana como un todo. Por lo tanto, cuando las condiciones permiten la formación de uniones estrechas, los cambios en la conductancia transmembranal de las células son medibles. Una metodología para este procedimiento fue elegir una célula hospedadora con unas propiedades de crecimiento apropiadas. Los tipos celulares que también expresan canales iónicos naturales a bajos niveles son considerados adecuados para la expresión de canales iónicos clonados. Un gran impedimento para una persona experta en la materia en esta metodología reside en la obtención de células en las que esto último es cierto.

b) Medida de la resistencia transepitelial en células no epiteliales

Una alternativa a la metodología descrita anteriormente es el uso de células no epiteliales, conocidas por expresar un número despreciable de canales iónicos por sí mismas, como sistema de expresión básico para células clonadas que expresan los canales iónicos de elección. Hay numerosos tipos celulares que cumplen este criterio. Sin embargo, se presentó un gran impedimento para una persona experta en la materia cuando no formaban capas de células contiguas en cultivo con uniones estrechas. En una forma de realización de la invención se prevé una capa "epitelial" de alta resistencia en la que este impedimento se ha superado.

Medida de la corriente transepitelial (pinzamiento masivo de voltaje en paralelo (MPVC)

Una forma de realización de la invención se obtuvo consiguiendo el acceso al interior de las células en el "epitelio" desestabilizando o permeabilizando una cara de cada célula que contribuye a la capa celular. Esto se ha llevado a cabo mediante procedimientos químicos, por ejemplo, permitiendo que ciertos tipos de antibióticos (por ejemplo, anfotericina) o de detergentes (digitonina) entraran en contacto con una cara de la superficie celular, o mediante una desestabilización física usando, por ejemplo, campos de alto voltaje (electroporación/zapper (disruptor) integral).

Sistemas de registro eléctricos

Se han desarrollado numerosos sistemas, y se detallan a continuación:

Sistemas de prueba preliminares

Para las pruebas preliminares de la integridad de las capas pseudoepiteliales se midió la resistencia transepitelial usando una cámara en la que se habían insertado soportes de cultivos de tejido celular permeables (Fig. 1). Las células se hicieron crecer hasta confluencia en cultivo en este soporte. En el caso de sustratos perforados, el material (por ejemplo, un cubreobjetos) se insertó en un equipo de prueba fabricado expresamente que permitía variar la presión del compartimento inferior y/o de la cámara superior, y al mismo tiempo permitía realizar medidas de la resistencia (Fig. 2). Para evitar la polarización de los electrodos se hizo pasar una señal de voltaje oscilante a través de la capa de células mediante unos electrodos lineales o circulares colocados por encima y por debajo del soporte permeable sobre el que estaba creciendo la capa de células, y se midió la impedancia de la capa de células. En el caso de capas de células permeabilizadas (Figuras 1b y 2b), el registro del pinzamiento de voltaje y de corriente se llevó a cabo usando un amplificador de
pinzamiento de voltaje conectado con un ordenador para controlar los protocolos experimentales y muestrear los datos.

Aumento de escala y sistemas de funcionamiento

Tanto en TERM como en MPVC los tamices comerciales utilizan un sistema de medida en placa multipocillos (Fig. 3) o equivalente (por ejemplo, usando una matriz de gotitas producida usando un piezodispensador de nanolitros). Esto procedía hasta cierto punto del equipo de prueba preliminar, pero requirió el diseño de un cabezal registrador integral, cuyas formas de realización de la invención incluyen varias posibilidades. Se describen a continuación.

i) cabezal registrador simple que lee pozos individuales secuencialmente (Figura 4).

ii) hilera lineal móvil de cabezales registradores (por ejemplo, 12 para un sistema de placa de 96 pocillos; 24 para un sistema de 384 pocillos) que se mueven a través de la placa en 8 (96 pocillos) o 16 (384 pocillos) etapas.

iii) matriz de electrodos construida en la placa con multiplexado para la captación de la señal de registro y el sistema de adquisición. Para las placas de densidad mayor se usaron pinzamiento de voltaje múltiple para mantener la frecuencia de muestreo y por lo tanto el tiempo de resolución (Figura 3).

iv) sistema de gotitas (Figura 5).

Adaptación a la placa multipocillos

Las formas de realización del tamiz de la presente invención incluyen preferiblemente un pipeteador automático integral en las versiones de trabajo de TERM y MPVC.

Preferiblemente, las formas de realización del tamiz de la invención incluyen una instalación para el lavado de los cabezales registradores entre su uso en hileras separadas.

Según una forma de realización de la invención, el procedimiento de fabricación de la membrana biológica comprende las etapas de obtener un sello de alta resistencia con un sustrato de vidrio perforado (u otro soporte) y/o la etapa de obtener una línea celular con la capacidad para forman láminas y con un número bajo o despreciable de canales iónicos naturales.

Metodología de las células epiteliales

Se han desarrollado líneas celulares naturales y líneas celulares modificadas. Se describen a continuación:

Líneas celulares naturales

Se ha evaluado la aplicabilidad "off the shelf" (como producto terminado) de las líneas celulares mencionadas en la bibliografía. Los candidatos iniciales incluían células ECV-304, RBE4 y C6 de glioma. Los criterios para su uso fueron:

a): capacidad para formar capas de células contiguas con uniones estrechas; resistencia transepitelial de \geq 125 \Omegacm^{-2}.

b): un número entre bajo y despreciable de un entorno de canales iónicos operados por voltaje, evaluado mediante un pinzamiento en porción celular total mediante procedimientos estándar. Preferiblemente, el nivel de conductancia es \leq 2 nS por célula.

Líneas celulares modificadas

Se preparó una línea celular adecuada mediante modificación molecular. Si el entorno de las conductancias de la líneas celulares naturales estaba por encima del umbral dado en (b) anterior, la línea celular se evaluaba para comprobar posibles anulaciones de genes para modificar una nueva célula hospedadora.

Epitelio artificial Sustratos perforados

Los sustratos perforados se han desarrollado según se establece a continuación:

Sustratos producidos por láser a) Prototipos

Se perforaron cubreobjetos de vidrio de forma secuencial (1 orificio cada vez) usando una fuente de energía láser en conjunción con una etapa automatizada bajo control de un ordenador y un microscopio de óptica invertida. Esto permitió construir los prototipos con un fino control de los parámetros tales como el área focal, la potencia del láser y el tiempo de exposición. Se comprobó la capacidad para conseguir un sello de alta resistencia entra las células y el sustrato usando cubreobjetos fabricados de este modo.

Se produjeron patrones en rejilla de forma reproducible en formatos variables mediante una etapa controlada por ordenador que estaba conectada con el láser a través del ordenador. Se usaron cubreobjetos de diversos materiales, incluyendo vidrio (así como plástico y otros materiales biocompatibles). Sus diámetros eran 10 mm (placa de 96 pocillos) o 5 mm (placa de 384 pocillos); y de un espesor variable (de aproximadamente 1-20 \mum). Los poros se produjeron con diámetros que variaban entre 0,5 \mu y 10 \mu. El perfil del poro, su ahusamiento y los diámetros interno y externo se evaluaron para optimizar el sello con las células de prueba. Es importante establecer el nivel apropiado de suavidad del poro. La densidad del poro se optimizó para las características entre señal y ruido, la fidelidad del registro del pinzamiento de voltaje y las consideraciones estadísticas.

Para facilitar el sello entre la célula y el poro se utilizaron varias metodologías (Fig. 1). Se detallan a continuación:

i) presión negativa en el compartimento de líquido inferior, por ejemplo, usando un efecto venturi provocado por una disolución que fluye a través del orificio anterior y/o suministrando la disolución que fluye a una presión global reducida.

ii) presión positiva en el compartimento de líquido superior

iii) cubrir el cubreobjetos con un material antiadherente que se quema en la región del poro durante el procedimiento de fabricación del poro (es decir, formación de poro inducida por láser)

iv) instalación para mover o vibrar el cubreobjetos para ayudar a las células a "encontrar" los poros antes de adherirse al sustrato en localizaciones que no son poros

v) bien un carrusel de cubreobjetos o un carrusel de placas multipocillos para permitir la centrifugación.

vi) aplicación de un campo de voltaje a través de los poros para mover las células hacia la boca del poro.

Sorprendentemente, la formación de poro inducida por láser proporcionó unos resultados notables.

La Figura 7 muestra un poro típico producido mediante este procedimiento. Cuando se añadieron disoluciones fisiológicas a cualquier lado del poro, se observaron rutinariamente las resistencias trans-sustrato, típicamente en el intervalo de 200 k\Omega a 400 k\Omega. Con la adición de las células, la resistencia observada era de aproximadamente el doble de esta cifra. Con la aplicación adicional de una o más de las metodologías detalladas anteriormente, se observaron medidas de la resistencia que se aproximaban al intervalo de los G\Omega.

b) Aumentos de escala

Se evaluaron la perforación en masa y el registro simultáneo (sellado). La metodología comprendió "iluminar" toda la superficie del fondo de una placa multipocillos (o una matriz equivalente) con una fuente de láser de alta energía. Con la estructura apropiada de los pocillos se conocía la localización precisa de los poros requeridos, y con la apropiada medida de la densidad celular se consiguió una alta probabilidad de tener una célula "en residencia". La placa se perforó, y la superficie anterior celular se rompió casi simultáneamente. Esto requirió una energía del láser mucho mayor que la usada en los prototipos (anteriormente).

c) Tipos celulares

Aunque para desarrollar la invención se han usado células de ovario de hámster chino (CHO), será apreciable para una persona experta habitual en la materia que puede emplearse una amplia variedad de líneas celulares y células primarias tales como neuronas aisladas a partir de tejido intacto.

Otros procedimientos de perforación

Se han evaluado procedimientos alternativos para perforar cubreobjetos de vidrio y otros materiales, tales como el grabado, vaciados de vidrio o láminas de plástico.

Caucho poroso

Los sustratos de caucho poroso están disponibles comercialmente para hacer crecer células en un cultivo celular. Se ha evaluado la porosidad en el contexto de las aplicaciones para la medida de la corriente y de la resistencia descritas en este documento.

Otros materiales

La persona experta en la materia apreciará que puede emplearse otros materiales adicionales tales como PTFE, PETP etc., según la presente invención. Estos tienen la ventaja de tener unas constantes dieléctricas altas, pero también de ser fabricados en unas láminas extremadamente delgadas. Esto tiene la ventaja de reducir las resistencias en serie mínimas en todo el sistema, y también de facilitar la introducción de sustancias exógenas en el citosol celular.

Aparato de registro en placa multipocillos

La placa basal multipocillos del aparato de registro acomoda preferiblemente un formato de localización de 96 pocillos. Preferiblemente se construyen formatos múltiplos de los 96 pocillos, con una expansión mínima hasta un formato de 384 pocillos. Una ventaja de aumentar la densidad de pocillos es que la cantidad de compuesto de prueba usado se reduce y se usan menos placas, con las correspondientes reducciones en los costes de ejecución auxiliares por compuesto probado.

Se han evaluado las dos siguientes metodologías:

a) una base de trabajo TORM diseñada para prestarse con robots y procesadores de placas disponibles comercialmente.

b) un sistema único completamente integrado que proporciona la manipulación de las placas, los cambios de disolución y la captación de las señales de registro.

Sistema de matriz fluida

Se creó un conjunto de cámaras de registro en miniatura dispensando gotitas que contenían una suspensión de células sobre el sustrato de registro con un patrón y una densidad predeterminados (véase la Figura 5). El sustrato puede ser de cualquiera de los tipos descritos anteriormente, por ejemplo, vidrio perforado, plástico, caucho, etc.. La configuración de registro completa se consigue colocando una "tapa" o cabezal registrador móvil que incorpora electrodos de registro sobre la matriz de gotitas de forma que se establece un menisco de la disolución de gotitas, según se ejemplifica en la Fig. 5. También puede producirse un conjunto de gotitas en el reverso de sustrato poroso para proporcionar una vía conductora hacia al menos un electrodo de referencia, y también el medio mediante el cual la sustancias pueden ser aplicadas sobre la superficie inferior del sustrato, y por tanto, de las membranas celulares. De forma similar, los reactivos puedan aplicarse a "la placa de registro" a través de una matriz de gotitas adicional, según se muestra en la Figura 6. Las disoluciones de fármacos pueden dispensarse sobre una placa de "cabezales" registradores; entonces la placa puede invertirse; y la placa invertida puede entonces anclarse a la matriz celular para poner en contacto el fármaco con las células. La ventaja de esta metodología es que las láminas de sustrato pueden ser diseñadas sin la necesidad de transferir discos de sustrato a placas multipocillos, y también evita el complejo diseño de la cámara con sellos, anillos en "O" y similares. La invención todavía puede acomodar la adición de disoluciones, y tiene la ventaja adicional de usar volúmenes muy pequeños, y por tanto cantidades pequeñas de reactivos y células.

Bibliografía

Brew, H. y Attwell, D. (1987). Electrogenic glutamate uptake is a major current carrier in the membrane of axolotl retinal glial cells. Nature, 327, 707-9.

Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B. y Sigworth, F. J. (1981). Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflüger's Archives, 391, 85-100.

Hille, B. (ed). Ionic channels of excitable membranes. 1992.

Sinauer Associates, Sunderland. Sakmann, B. y Neher, E. (eds). Single-channel recording. 1995. Plenum Press, Nueva York y Londres.

Margolskee, R. F., McHendry-Rinde, B. y Horn, R. (1993). Panning transfected cells for electrophysiological studies. Biotechniques, 15, 906-911.

Sheng, M. (1996). PDZs and receptor/channel clustering: rounding up the latest suspects. Neuron, 17.

Leyendas de las figuras

1:: células

2:: superficie celular permeabilizada

3:: pinzamiento de voltaje

4:: sustrato poroso

5:: electrodo

6:: pared del pocillo

7:: canal de perfusión de la disolución

8:: línea celular o célula primaria

9:: célula permeabilizada

10:: placa multipocillos (por ejemplo, de 96 pocillos)

11:: agrupamiento de cabezales registradores integrales

12:: multiplexador

13:: ADC/ordenador

14:: nivel de fluido

15:: poro

16:: junta tórica

17:: ensamblaje de registro

18:: placa de células

19:: placa de referencia

20:: placa de registro

21:: electrodo de referencia

22:: electrodo de registro

23:: "semi-inserción"

24:: inserción completa (configuración de registro)

Claims

1. Una estructura que comprende una membrana biológica adherida con un sello de alta resistencia a un sustrato para su uso en un procedimiento de cribado de alta capacidad, en la que:

la membrana biológica comprende un canal iónico o transportador; y

el sustrato es poroso en virtud de las perforaciones que a través del mismo forman poros a través de sustrato.

2. Una estructura según la reivindicación 1 en la que la membrana biológica comprende una capa de células contiguas que es capaz de adherirse a un sustrato con un sello de alta resistencia, en la que cada célula forma una unión estrecha con las células adyacentes y expresa un canal iónico o transportador que está localizado en la membrana celular.

3. Una estructura según la reivindicación 1 ó 2 que comprende células con un canal iónico o transportador que reside de forma natural en la membrana celular de las mismas, o que puede ser insertado mediante transfección con ADNc y/o ARNc que codifica para el canal iónico o transportador.

4. Una estructura según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una pluralidad de canales iónicos o transportadores que son predominantemente canales iónicos o transportadores de interés preseleccio-
nados.

5. Una estructura según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende células modificadas genéticamente que han sido modificadas para expresar predominantemente un canal iónico o transportador.

6. Una estructura según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende canales iónicos operados por voltaje.

7. Una estructura según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 en la que las células se eligen del grupo que comprende células HEK-293, células de ovario de hámster chino (CHO) modificadas genéticamente, tejido neuronal primario tal como hipocampo, ganglios de las raíces dorsales, ganglios cervicales superiores, etc.; músculo esquelético; músculo liso; músculo cardíaco; células inmunitarias; epitelio; endotelio.

8. Una estructura según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende un canal iónico con rápidas cinéticas de activación e inactivación.

9. Una estructura según cualquiera de las reivindicaciones precedentes con un canal iónico que muestra especificidad por un ión elegido del grupo que comprende sodio, potasio, calcio, cloruro.

10. Una estructura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la que la capa de células contiguas es capaz de adherirse con un sello de alta resistencia a un sustrato elegido del grupo que comprende vidrio, plástico, caucho, politetrafluoroetileno (PTFE), PTFE/lana de vidrio y tereftalato de polietileno (PETP).

11. Una estructura según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende un pseudoepitelio en el que una cara de una capa de células contiguas está permeabilizada, proporcionando así acceso al interior de las células.

12. Una estructura según la reivindicación 11 que comprende un pseudoepitelio en el que una cara de la capa de células contiguas está permeabilizada mediante un antibiótico elegido del grupo que comprende anfotericina y nistatina; o un detergente elegido del grupo que comprende digitonina y saponina; o una desestabilización física usando un campo de alto voltaje; o mediante digestión enzimática de una parte de la membrana usando una enzima apropiada.

13. Una estructura según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el sustrato está perforado.

14. Una estructura según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende un portaobjetos perforado.

15. Una estructura según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el sustrato tiene poros con un diámetro de entre 0,5 \mum y 10 \mum.

16. Una estructura según la reivindicación 15 en la que los poros tienen un diámetro de entre 1 \mum y 7 \mum.

17. Una estructura según la reivindicación 15 ó 16 en la que los poros tienen un diámetro de 1-2 \mum.

18. Una estructura según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende un portaobjetos con una rejilla de poros.

19. Una estructura según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende un sustrato perforado que se fabrica con un material elegido del grupo que comprende vidrio, plástico, caucho, politetrafluoroetileno (PTFE), PTFE/lana de vidrio y tereftalato de polietileno (PETP).

20. Un aparato de cribado de alta capacidad para detectar y ensayar compuestos con actividad sobre los canales iónicos operados por voltaje que comprende una estructura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

21. Un aparato de cribado de alta capacidad según la reivindicación 20 que comprende:

una pluralidad de cámaras, teniendo cada una de ellas una superficie periférica permeable que proporciona un sustrato para la membrana biológica;

una pluralidad de pocillos, siendo cada uno capaz de recibir una cámara y un compuesto de prueba en una disolución fisiológica o en una disolución no fisiológica que comprende dimetilsulfóxido (DMSO);

una pluralidad de electrodos de referencia, teniendo contacto eléctrico con cada pocillo;

un cabezal registrador móvil portador de al menos un electrodo de registro;

22. Un aparato de cribado de alta capacidad según la reivindicación 21 en el que los pocillos son proporcionados por una placa multipocillos.

23. Un aparato de cribado de alta capacidad según la reivindicación 20 que comprende un conjunto de gotitas sobre un sustrato poroso.

24. Un aparato de cribado de alta capacidad según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 que comprende un cabezal registrador con un único electrodo de registro capaz de ser movido para visitar secuencialmente cada cámara.

25. Un aparato de cribado de alta capacidad según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 que comprende un cabezal registrador con una pluralidad de electrodos de registro dispuestos en línea.

26. Un aparato de cribado de alta capacidad según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 que comprende un cabezal registrador con una pluralidad de electrodos de registro dispuestos en una matriz.

27. Un procedimiento para fabricar la estructura de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 que comprende las etapas de elegir un sustrato, perforarlo, introducir una membrana biológica en el sustrato y sellar cada poro con la membrana biológica.

28. Un procedimiento según la reivindicación 27 que comprende las etapas de perforar simultáneamente un sustrato y sellar los poros con la membrana biológica.