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Elektrophysiologische Messungen an Xenopus Oocyten, besonders mit heterologer Expression von membranständigen Ionenkanälen und Rezeptoren, sind von grosser Bedeutung für die Suche nach neuen Wirkstoffen, insbesondere auch zur Therapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems.
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Zahlreiche apparative Vorrichtung sind erdacht und geschaffen worden, um diese Messungen möglichst einfach, praktisch, schnell oder auch automatisiert durchführen zu können. Ein immer wiederkehrendes Problem dabei ist aber, dass relativ grosse Mengen an Messlösungen benötigt werden, und damit auch entsprechende Mengen der Testsubstanzen.
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Neue Substanzen, die als Wirkstoffe in Frage kommen, liegen aber oft nur in sehr kleinen Mengen vor, sind sehr teuer oder schwer zu beschaffen. Deshalb wäre es vorteilhaft, wenn elektrophysiologische Messungen an Xenopus Oocyten mit möglichst geringen Mengen an Testlösung durchgeführt werden könnten, denn dann könnten auch seltene oder teure Stoffe mit dieser Methode untersucht werden, für die dies zur Zeit prohibitiv erscheint.
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Deshalb sollte eine neue Art von Messkammer für biophysikalische Messungen an Oocyten entwickelt werden, die einen schnellen und vollständigen Austausch der Messlösung mit 50 μl Volumen oder weniger erlaubt, so dass wertvolle Testsubstanzen effektiver genutzt werden können. Die neue Messkammer sollte darüber hinaus möglichst einfach aufgebaut sein, also möglichst ohne zusätzliche Zuleitungen, Pumpen, Ventile, Pipetten, Absaugvorrichtungen und dergl. auskommen und auch einfach zu benutzen, zu reinigen und zu handhaben sein. Auch die Möglichkeit einer späteren Automatisierung der Messungen sollte gegeben sein.
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Die hier beschriebene, neuartige Messkammer für elektrophysiologische Messungen an Oocyten erfüllt diese Aufgabe auf besonders elegante Weise. Ein vollständiger Austausch der Messlösung in der Kammer kann mit weniger als 50 μl durchgeführt werden. Zugleich ist der Lösungstausch besonders einfach durchzuführen, es werden keine Pumpen, Schläuche, Ventile, oder andere komplizierten Apparaturen dafür benötigt.
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Die hier beschriebene Messkammer löst zugleich auf elegante Weise ein weiteres Problem. Bei den bisher bekannten Messkammern zur Untersuchung von Oocyten wird die Messlösung in der Regel durch ein Perfusionssystem in die Kammer gebracht und auf der anderen Seite der Kammer durch eine Absaugung wieder entfernt. Dabei entsteht bekanntlich das Problem, dass sich die Höhe des Füllstands in der Kammer nicht sehr gut kontrollieren lässt. Ist der Zulauf schneller als der Ablauf, dann läuft die Kammer über; ist der Zulauf zu langsam, dann sinkt der Stand der Flüssigkeit, bis die Zelle auf dem Trockenen liegt und zerstört wird. Auch mit aufwändigen Pumpen oder Kontrollsystemen lässt sich dieses Problem nicht ganz befriedigend lösen, weil das Wechselspiel von Schwerkraft, Oberflächenspannung und Kapillarkräften immer wieder zu unangenehmen Überraschungen führt.
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Mit der hier beschriebenen Messkammer wird auch dieses Problem sehr elegant gelöst. Obwohl die Kammer auf der Unterseite offen ist, ist durch das Gleichgewicht von Oberflächenspannung und Kapillarkräften einerseits und der Schwerkraft andererseits stets sichergestellt, dass die Kammer mit Flüssigkeit so weit gefüllt ist, dass die Zelle vollständig benetzt ist. Dieser Zustand bleibt auch ohne Zugabe weiterer Flüssigkeit über lange Zeit erhalten. Wird weitere Lösung zugegeben, so kann die Kammer nicht überlaufen, denn überschüssige Flüssigkeit tropft einfach nach unten ab, und die Kammer bleibt trotzdem korrekt befüllt. So stellt sich die optimale Füllhöhe der Kammer selbsttätig ein, ohne jeden Einsatz von Pumpen, Absaugungen, Dosierventilen, oder komplizierten Steuerungen.
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Der Aufbau der erfindungsgemässen Messkammer ist in den Zeichnungen 1–4 illustriert. Die Messkammer (1) besitzt eine senkrechte Öffnung (2), so dass die Messlösungen die Kammer in vertikaler Richtung von oben nach unten durchfliessen können. Die untere Seite der Öffnung ist durch ein wasserdurchlässiges Sieb oder Netz (4) verschlossen, auf dem die Oocyte (5) aufliegt. Die Kammer wird mit Salzlösung (7) gefüllt, die durch Kapillarkräfte in der Kammer gehalten wird. So ist sichergestellt, dass die Oocyte zu jeder Zeit von wässriger Lösung umgeben ist. Überschüssige Salzlösung bildet unterhalb der Kammer einen Tropfen oder tropft einfach nach unten ab.
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Ein kompletter Austausch der die Zelle umgebenden Messlösung wird nun erreicht, indem ganz einfach ein Tropfen der zu applizierenden, wirkstoffhaltigen Salzlösung auf der Oberseite der Kammer (1) zugegeben wird. Der zugegebene Tropfen fliesst in die Kammeröffnung (2) hinein und vedrängt dort die bereits vorhandene Lösung (7), von der die Oocyte (5) umgeben war, und die jetzt nach unten abtropft. Die Oocyte is nunmehr vollständig von der applizierten Testlösung umgeben, die für eine beliebig lang gewählte Dauer der Messung dort verbleiben kann. Das anschliessende Auswaschen eines Wirkstoffs erfolgt in derselben Weise, indem von oben wirkstofffreie Salzlösung zugegeben wird.
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Diese Anordnung erlaubt einen vollständigen Austausch der die Oocyte umgebenden Salzlösung mit einem Volumen vom 50 μl oder weniger. Wenn eine Testsubstanz nur probeweise zugegeben werden soll, also ein kompletter Lösungstausch nicht erforderlich ist, dann genügt sogar ein noch deutlich kleineres Volumen.
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Die Zugabe kann mit einer einfachen Pipette erfolgen, und die aufgetragene Messlösung fliesst vollständig in die Messkammer hinein. Es müssen also keinerlei Schläuche, Ventile oder andere Vorrichtungen mit Messlösung befüllt werden. Dies ist sehr bequem, und bedeutet gegenüber allen anderen bisher bekannten Messanordnungen einen ausserordentlich sparsamen Einsatz der Testsubstanzen und deutlich verringerten apparativen Aufwand.
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Da die Füllhöhe in dieser neuartigen Kammer durch das Gleichgewicht der Kapillarkräfte und der Schwerkraft bestimmt wird, ist sie gleichsam automatisch vorgegeben und ein Über- oder Leerlaufen der Kammer ist nicht zu befürchten. Das ist im Vergleich zu den bisher üblichen Perfusionskammern, bei denen die Füllhöhe stets aufmerksam überwacht werden muss, ein nicht zu unterschätzender Vorteil.
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Ebenfalls im Gegensatz zu allen anderen bisher bekannten Anordnungen, erlaubt diese neue Messkammer sogar die Rückgewinnung wertvoller Testsubstanzen. Da die verbrauchte Messlösung (7) von der Unterseite der Kammer abtropft, kann sie sehr einfach sortenrein gesammelt und wieder aufgearbeitet werden. Bei allen anderen bekannten, vergleichbaren Messanordnungen vermischen sich die verbrauchten Messlösungen, z. B. in einer Absaugvorrichtung, so dass eine Rückgewinnung ausserordentlich aufwändig wäre und üblicherweise auch nicht erfolgt.
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Für elektrophysiologische Untersuchungen nach der klassischen Voltage-Clamp-Methode (two electrode voltage clamp, TEVC) werden zwei Glas-Mikrokapillaren (6a, b) von oben in die Kammer eingeführt, um in die Oocyte (5) eingestochen zu werden. Die zusätzlich erforderlichen Badelektroden (3a, b) sind wie üblich als mit Silberchlorid beschichtete Silberdrähte ausgeführt. Diese werden am besten unter dem Netz (4) angebracht, das die Kammer (2) unten abschliesst. So bilden sie einen guten elektrischen Kontakt mit der die Oocyte umgebenden Salzlösung, ohne die Oocyte mechanisch zu beengen oder zu beschädigen. Es ist vorteilhaft, zwischen diese Badelektroden (3a, b) und das Netz (4) ein kleines Stück eines hydrophilen Gewebes, wie z. B. Filterpapier, zu bringen, um einen guten und dauerhaften elektrischen Kontakt mit der Salzlösung in der Kammer sicherzustellen.
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Die Abmessungen der inneren Öffnung (2) der Messkammer werden so gewählt, dass eine Zelle darin lose Platz findet und vollständig von Salzlösung umgeben ist. Idealerweise ist diese Öffnung zylindrisch, aber auch andere Querschnittsformate wären möglich. Für Xenopus Oocyten, die bekanntlich etwa kugelförmige Zellen mit 1,0–1,3 mm Durchmesser sind, sollte der Durchmesser der Öffnung zwischen 1,5 und 2,0 mm liegen und die Höhe sollte ebenfalls 1,5–2,0 mm betragen. Für andere Arten von Zellen, wie z. B. für kleinere oder grössere Oocyten, oder auch für andere messtechnische Zwecke sind selbstverständlich andere Abmessungen der Kammer ebenfalls denkbar.
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Es kann zweckmässig sein, am oberen Rand der Messkammer seitliche Kerben vorzusehen, die das Einführen der Kapillarelektroden von oben erleichtern. Dann ist es in der Regel möglich, in einem üblichen TEVC-Messplatz die vorhandene horizontale Perfusionskammer durch eine Messkammer des hier beschriebenen Typs direkt und ohne grössere Umbauten zu ersetzen.
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Ebenso können für optische oder andere Messvorgänge beliebige Kapillaren, Linsen, Leuchtmittel, Sensoren, oder andere Vorrichtungen in die Kammer eingebracht oder an der Kammer befestigt werden, wie sie für die entsprechenden Messzwecke erforderlich sind.
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Als Werkstoff für die Fertigung der Messkammer eignen sich alle Materialien, aus denen eine solche Struktur mit vertretbarem Aufwand hergestellt werden kann und deren Oberflächeneigenschaften damit vereinbar sind, dass die wässrigen, salzhaltigen Messlösungen durch Kapillarkräfte in der Öffnung der Kammer festgehalten werden. Dies sind viele der gängigen Kunststoffe, aber auch Glas oder Keramik könnten benutzt werden. Das Material muss natürlich resistent gegen wässrige Lösungen sein, also chemisch beständig, und insbesondere sollte es keinerlei Fremdstoffe an die wässrigen Messlösungen abgeben können. Zu den üblichen Materialien für solche Aufgaben zählen Polyacrylate (Plexiglas), Polycarbonate (Makrolon), Polyamide (z. B. Nylon), oder viele andere Kunststoffe, die diese erforderlichen Eigenschaften aufweisen. Für einen ersten Prototyp der Messkammer haben sich zum Beispiel handelsübliche Hemdsknöpfe aus Polyester, in denen bereits Löcher mit den erforderlichen Abmessungen vorhanden waren, ganz hervorragend bewährt. Je nach Art der beabsichtigten elektrischen oder optischen Messvorgänge kann es vorteilhaft sein, die Kammer aus einem klar durchsichtigen, oder aus schwarzem, oder aus sonst eingefärbtem Material herzustellen.
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Die obere Seite der Messkammer kann eben sein, oder zur Verbesserung der Funktionalität auch anders gestaltet werden. Vorteilhaft ist es, wenn die Kammeroberseite zur Optimierung des Einstroms der zugegebenen Messlösungen nach innen schüssel- oder trichterförmig verläuft. Auch könnten Rinnen oder Kanäle zur Zuleitung der Messlösungen vorgesehen werden.
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Es ist besonders vorteilhaft, wenn das Material auf der Kammeroberseite hydrophobe Eigenschaften aufweist. Eine hydrophobe Kammeroberseite bewirkt, dass ein von oben zugegebener Tropfen mit wirkstoffhaltiger Messlösung zunächst komplett auf der Kammeroberfläche abgelegt werden kann, bevor er dann in Kontakt mit der in der Kammer vorhanden Lösung gerät oder gebracht wird und hineinfliesst. Das hat gegenüber einer direkten Zugabe der Messlösung folgende Vorteile: 1) Der zugegebene Tropfen wird auf die Oberseite der Kammer pipettiert und man muss mit der Pipette nicht genau in die Öffnung der Kammer treffen, 2) Wenn der zugegebene Tropfen die Oberfläche der in der Kammer befindlichen Lösung berührt, fliesst der ganze Tropfen sehr schnell und vollständig in die Kammer, was einen optimal schnellen Lösungstausch bewirkt, und 3) da die zugegebene Lösung erst nach Abschluss des mechanischen Pipettiervorgangs in die Kammer fliesst, werden mechanische Störungen weitgehend vermieden, die sonst die Genauigkeit der Messungen beeinträchtigen könnten.
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Die hydrophobe Eigenschaft der Kammeroberseite kann zum Beispiel erreicht werden durch eine Beschichtung mit einem geeigneten hydrophoben Material, wie z. B. PTFE, PE, oder Silikon, oder mit einer super-hydrophoben Beschichtung (”Lotus-Effekt”), oder auch durch einfaches Einwachsen oder Einfetten der Kammeroberseite.
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Den Boden der Kammer bildet ein wasserdurchlässiges Sieb oder Netz (4), auf dem die zu untersuchende Zelle ruht und das für wässrige Lösungen durchlässig ist, so dass die wässrigen Lösungen leicht hindurchströmen können. Obwohl die wässrige Salzlösung eigentlich durch das Netz hindurch abfliessen könnte, bewirken Kapillarkräfte im Inneren der Kammer, dass die Lösung in der Kammer gehalten und die Kammer so stets mit Salzlösung gefüllt bleibt.
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Der Kammerboden (4) kann aus jedem chemisch inerten Material bestehen, das eine Oocyte mechanisch tragen kann, ohne den Durchfluss wässriger Lösungen zu behindern. Filtergewebe aus Glas, Polyester, Zellulose, u. v. a. m. können diese Aufgabe erfüllen. Bevorzugt kommen hier Siebgewebe aus Polyamid oder Polyester zum Einsatz, wie sie in der Lebensmittelindustrie als Trennsiebe oder Filter verwendet werden. Bevorzugt wird z. B. für Xenopus Oocyten ein Siebgewebe aus Polyamid oder Polyester, mit einer Maschengrösse von 0,02–0,5 mm; besonders bevorzugt ist eine Maschengrössen zwischen 0,05–0,2 mm. Es muss lediglich sichergestellt sein, dass die Zelle mechanisch stabil auf dem Netz liegen kann, während die wässrigen Messlösungen ungehindert hindurchfliessen können.
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Das Netz (4) wird auf die Unterseite der Messkammer (1) aufgeklebt, dazu werden handelsübliche Klebstoffe wie Epoxy-Zweikomponentenkleber, Cyanacrylatkleber, Silikon, oder jeder andere geeignete Klebstoff eingesetzt. Alternativ kann das Netz auch thermisch mit dem Kammerboden verschweisst werden, wenn die eingesetzten Materialien dies erlauben. Ein Klebstoff muss so natürlich so aufgetragen werden, dass die Sieböffnungen des Netzes nicht verklebt werden und dass der Klebstoff nicht in den freien Raum der Messkammer eindringt. Dies bedeutet, dass viskose oder pastöse Klebstoffe hier tendenziell besser geeignet sind als solche, die sehr flüssig sind.
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Bei der elektrophysiologischen TEVC-Messmethode kommen mindestens drei, bevorzugt aber vier Messelektroden zum Einsatz. Zwei der Elektroden sind mit Salzlösung gefüllte Mikrokapillaren aus Glas (6a, b), die wie üblich von oben in die Kammer eingebracht werden. Die anderen zwei Elektroden sind mit Silberchlorid beschichtete Silberdrähte (3a, b), die mit der wässrigen Lösung in der Messkammer in Kontakt stehen müssen. Diese Silberdrähte werden an der unteren Seite des Netzes angebracht, das den Boden der Messkammer bildet. Sie können angeklebt oder auch sonst irgendwie befestigt und positioniert werden. Geeignet ist das Einbringen weiterer kleiner Bohrungen in Körper oder Halterung der Messkammer, durch welche die Drähte geführt und gehalten werden, in der Art wie es in dargestellt ist. Geeignet sind Silberdrähte mit einer Stärke von 0,05–1,0 mm; besonders geeignet sind Drähte zwischen 0,2–0,5 mm.
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Wichtig ist, dass diese Drähte aus reinem Silber (.999) bestehen und keine anderen Metalle zulegiert sind. Diese zwei Silberdrähte müssen beide mit der Messlösung in der Kammer in Kontakt stehen, dürfen aber keinesfalls einander berühren. Die Silberdrähte müssen lang genug sein, dass sie aus dem von Messlösungen benetzten Bereich der Kammer sicher herausführen, bevor sie durch Stecker, Lötstellen, o. ä., die aus anderen Metallen als Silber bestehen, mit der Messelektronik verbunden werden.
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Die erforderliche Beschichtung der Drähte mit Silberchlorid kann entweder bereits vor der Installation der Drähte erfolgen, oder es werden zunächst blanke Silberdrähte verwendet, die dann vor der ersten Inbetriebnahme der Kammer elektrolytisch mit einer Silberchloridschicht überzogen werden, wie es in der Elektrophysiologie allgemein üblich ist.
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Aus Gründen der Stabilität der elektrischen Ableitung ist es besonders vorteilhaft, wenn die Silberdraht-Elektroden (3a, b) geometrisch so ausgeführt werden, wie in dargestellt. Die stromableitende Elektrode (3b) wird rings um den unteren Rand der Messkammer herumgeführt. So steht eine grössere Oberfläche in Kontakt mit der Messlösung, was die Ableitung auch höherer Ströme ohne einen störenden Spannungsabfall begünstigt. Die zweite, Spannungs-Referenzelektrode (3a) dagegen wird in der Mitte der Kammer, direkt unterhalb der Oocyte positioniert. So misst sie das Potential der Badlösung räumlich zwischen der Oocyte und der Stromableit-Elektrode, was für eine stabile Funktion der TEVC-Ableitung von grosser Vorteil ist (wie jeder Fachmann bestätigen kann, der mit der Praxis der Voltage-Clamp Ableitung an Oocyten vertraut ist.) Dessenungeachtet würden auch viele andere Anordnungen dieser Badelektroden den erfindungsgemässen Zweck ebenfalls erfüllen.
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Es erweist sich als vorteilhaft, wenn zwischen die Silberdrähte und das Netz ein kleines Stück eines hydrophilen Gewebes, wie z. B. Filterpapier, Baumwollfasern, oder dergl eingesetzt wird, weil dies den Kontakt der Badlösung mit den Elektroden verbessert und die Bildung von Luftblasen, die den Kontakt unterbrechen könnten, mit verhindert. Dies begünstigt auch die Benetzbarkeit des Unterbodens der Kammer und verbessert damit auch den Ablauf und das Abtropfen der verbrauchten Messlösungen.
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Nach Abschluss einer Messung wird die Oocyte mit der Spitze einer handelsüblichen 50 μl Pipettenspitze (Eppendorf) ganz einfach angesaugt und entfernt. Dann kann sofort eine neue Zelle eingesetzt und die Messreihe fortgesetzt werden.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Messkammer
- 1a
- Seitlich angebrachte Halterung
- 2
- Öffnung der Messkammer
- 3a
- Spannungs-Referenzelektrode
- 3b
- Stromableit- bezw. Erdungs-Elektrode
- 4
- Netz oder Sieb als Kammerboden
- 5
- Zelle, z. B. Xenopus Oocyte
- 6a, b
- Kapillar-Messelektroden
- 7
- Wässrige Salzlösung
