ES2207330T3

ES2207330T3 - Combinaciones de un inhibidor de ibat y de un inhibidor de mtp para indicaciones cardiovasculares.

Info

Publication number: ES2207330T3
Application number: ES99965901T
Authority: ES
Inventors: Bradley T. Keller; David B. Reitz; Joseph R. Schuh; James A. Sikorski; Samuel J. Tremont; Rodney W. Lappe
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2019-12-17
Also published as: US20040058908A1; DK1140187T3; DE69911058T2; JP2002533411A; ZA200105059B; AU779264B2; ATE248606T1; ZA200105061B; EP1140187B1; EP1140187A1; CZ20012344A3; AR037482A1; HUP0104655A2; BR9916564A; CN1342091A; PT1140187E; NZ512532A; NO20013157L; MXPA01006468A; ZA200105062B

Abstract

Una combinación terapéutica que comprende una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales, donde la primera cantidad y la segunda cantidad juntas comprenden una cantidad eficaz anti-hiperlipidémica, una cantidad eficaz anti- aterosclerótica, o una cantidad eficaz anti- hipercolesterolémica de los compuestos.

Description

Combinaciones de un inhibidor de IBAT y de un inhibidor de MTP para indicaciones cardiovasculares.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones para tratar enfermedades cardiovasculares y, específicamente, se refiere a combinaciones de compuestos y composiciones y a su uso en medicina, particularmente en la profilaxis y tratamiento de afecciones hiperlipidémicas tales como las asociadas con la aterosclerosis, la hipercolesterolemia y otros factores que intervienen en la enfermedad de las arterias coronarias en mamíferos, incluyendo la hipertensión. Más particularmente, la invención se refiere a inhibidores de los transportadores de ácidos biliares en el íleon (IBAT) y a inhibidores de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales (MTP).

Descripción de la técnica relacionada

Está bien establecido que las afecciones hiperlipidémicas asociadas con altas concentraciones de colesterol total y de colesterol asociado a lipoproteínas de baja densidad (LDL) son factores de riesgo importantes para las enfermedades cardíacas coronarias y particularmente la aterosclerosis. Numerosos estudios han demostrado que una baja concentración en plasma de colesterol asociado a lipoproteínas de alta densidad (HDL) es un potente factor de riesgo para el desarrollo de aterosclerosis (Barter y Rye, Atherosclerosis, 121, 1-12 (1996)). Las HDL son una de las clases principales de lipoproteínas que intervienen en el transporte de lípidos a través de la sangre. Los principales lípidos que se encuentran asociados con las HDL incluyen el colesterol, colesteril éster, triglicéridos, fosfolípidos y ácidos grasos. Las otras clases de lipoproteínas que se encuentran en la sangre son las lipoproteínas de baja densidad (LDL), las lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), y las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Como los bajos niveles de colesterol HDL aumentan el riesgo de aterosclerosis, los métodos para elevar el colesterol HDL en plasma serían beneficiosos terapéuticamente para el tratamiento de la aterosclerosis y de otras enfermedades asociadas con la acumulación de lípidos en los vasos sanguíneos. Estas enfermedades incluyen, pero sin limitación, la enfermedad cardíaca coronaria, la enfermedad vascular periférica y la apoplejía.

La aterosclerosis está detrás de la mayoría de casos de enfermedad de las arterias coronarias (CAD), una causa principal de morbididad y mortalidad en la sociedad moderna. Se ha demostrado que un alto nivel de colesterol LDL (por encima de aproximadamente 180 mg/dl) y un bajo nivel de colesterol HDL (por debajo de 35 mg/dl) son factores importantes que contribuyen al desarrollo de la aterosclerosis. Otras enfermedades o factores de riesgo tales como la enfermedad vascular periférica, la apoplejía y la hipercolesterolemia se ven afectados de forma negativa por relaciones de HDL/LDL adversas.

Se ha descubierto que la interferencia en la recirculación de ácidos biliares desde la luz del tracto intestinal reduce los niveles de colesterol en el suero en una relación causal. Se han acumulado datos epidemiológicos que indican que tal reducción conduce a una mejoría en el estado de enfermedad de la aterosclerosis. Stedronsky, en "Interaction of bile acids and cholesterol with nonsystemic agents having hypocholesterolemic properties," Biochimica et Biophysica Acta, 1210, 255-287 (1994), describe la bioquímica, la fisiología y los agentes activos conocidos relacionados con los ácidos biliares y el colesterol.

Se ha demostrado que ciertas alteraciones patofisiológicas transitorias son consistentes con la interrupción de la circulación enterohepática de ácidos biliares en seres humanos con una carencia hereditaria de actividad IBAT, como se informa por Heubi, J.E., et al. Véase "Primary Bile Acid Malabsorption: Defective in Vitro Ileal Active Bile Acid Transport", Gastroenterology, 83, 804-11 (1982).

En otra estrategia para la reducción de la recirculación de ácidos biliares, el sistema de transporte de ácidos biliares en el íleon es una supuesta diana farmacéutica para el tratamiento de la hipercolesterolemia basado en una interrupción de la circulación enterohepática con inhibidores de transporte específicos (Kramer, et al., "Intestinal Bile Acid Absorption" The Journal of Biological Chemistry, 268 (24), 18035-46 (1993).

En varias solicitudes de patente individuales, Hoechst Aktiengesellschaft describe polímeros de diversos constituyentes naturales del sistema de circulación enterohepática y sus derivados, incluyendo ácidos biliares, que inhiben el transporte fisiológico de ácidos biliares con el objetivo de reducir el nivel de colesterol LDL suficientemente como para ser eficaces como agentes farmacéuticos y, en particular, para uso como agentes hipocolesterolémicos. A continuación se indican por separado las solicitudes de patentes individuales de Hoechst que describen tales compuestos inhibidores del transporte de ácidos biliares.

R1. Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.025.294.

R2. Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.078.588.

R3. Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.085.782.

R4. Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.085.830.

R5. Solicitud de Patente Europea Nº 0 379 161.

R6. Solicitud de Patente Europea Nº 0 549 967.

R7. Solicitud de Patente Europea Nº 0 559 064.

R8. Solicitud de Patente Europea Nº 0 563 731.

En la solicitud de patente mundial número WO 93/321146 se describen benzotiepinas seleccionadas para numerosos usos incluyendo el metabolismo de ácidos grasos y enfermedades vasculares coronarias.

Se conocen otras benzotiepinas seleccionadas para uso como agentes hipolipémicos e hipocolesterolémicos, especialmente para el tratamiento o prevención de la aterosclerosis como se describe en la solicitud Nº EP 508425. Una solicitud de patente francesa, FR 2661676 describe otras benzotiepinas para uso como agentes hipolipémicos e hipocolesterolémicos. Además, la solicitud de patente Nº WO 92/18462 indica otras benzotiepinas para uso como agentes hipolipémicos e hipocolesterolémicos. Patente de Estados Unidos Nº 5.994.391 (Lee et al.). Cada uno de los agentes hipolipémicos e hipocolesterolémicos de benzotiepina descritos en estas solicitudes de patente individuales está limitado por una amida unida al carbono adyacente al anillo de fenilo del anillo de biciclobenzotiepina condensado.

En la solicitud de patente Nº PCT/US95/10863 se describen otras benzotiepinas útiles para el tratamiento de la hipercolesterolemia e hiperlipidemia. En el documento PCT/US97/04076 se describen más benzotiepinas útiles para la profilaxis y el tratamiento de la hipercolesterolemia e hiperlipidemia, así como composiciones farmacéuticas de tales benzotiepinas. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/816.065 se describen otras benzotiepinas adicionales y composiciones de las mismas útiles para la profilaxis y el tratamiento de la hipercolesterolemia e hiperlipidemia.

En la descripción de la Solicitud de Patente Nº WO 93/16055 de The Wellcome Foundation Limited para "Compuestos de Benzotiazepina Hipolipidémicos", se describe que la inhibición del transporte de ácidos biliares in vitro está correlacionada con la actividad hipolipidémica. Esta publicación describe varios compuestos de benzotiazepina hipolipidémicos. En la Solicitud de Patente Nº WO 96/05188 se describen otros compuestos de benzotiazepina hipolipidémicos (particularmente compuestos de 2,3,4,5-tetrahidrobenzo-1-ti-4-azepina). Un compuesto de benzotiazepina particularmente útil descrito en el documento WO 96/05188 es el compuesto de fórmula B-2. En la Solicitud de Patente Nº WO 96/16051 se describen otros compuestos de benzotiazepina hipolipidémicos adicionales.

1

1,1-dióxido de (3R,5R)-3-butil-3-etil-2,3,4,5-tetrahidro-7,8-dimetoxi-5-fenil-1-4-benzotiazepina

Otros compuestos de benzotiazepina útiles para el control del colesterol son compuestos inhibidores de IBAT de 2,3,4,5-tetrahidrobenzo-1-ti-5-azepina, descritos en la Solicitud de Patente PCT Nº WO 99/35135. El compuesto de fórmula B-7 está incluido en esta descripción.

2

Otros compuestos inhibidores de IBAT incluyen una clase de compuestos de naftaleno inhibidores de IBAT, descritos por T. Ichihashi et al., en J. Pharmacol. Exp. Ther., 284 (1), 43-50 (1998). En esta clase, es particularmente útil el S-8921 (1-(3,4-dimetoxifenil)-3-(3-etilvaleril)-4- hidroxi-6,7,8-trimetoxi-2-naftoato de metilo). La estructura del

\hbox{S-8921}

se muestra en la fórmula B-20. En la Solicitud de Patente PCT Nº WO 94/24087 se describen otros compuestos de naftaleno o derivados de lignina útiles para el tratamiento o profilaxis de la hiperlipidemia o aterosclerosis.

3

Otra clase de fármaco reductor de lípidos es un fármaco antiobesidad. Un ejemplo de un fármaco antiobesidad es orlistat. El orlistat se describe en la Patente Europea Nº EP 0 129 748.

Se ha demostrado que la inhibición de la proteína de transferencia de colesteril éster (CETP) modifica de forma eficaz las relaciones de HDL/LDL en plasma, y es de esperar que controle el progreso y/o la formación de ciertas enfermedades cardiovasculares. La CETP es una proteína plasmática que facilita el movimiento de los colesteril ésteres y los triglicéridos entre las diversas lipoproteínas presentes en la sangre (Tall, J. Lipid Res., 34, 1255-74 (1993)). El movimiento del colesteril éster desde las HDL a las LDL por la CETP tiene el efecto de reducir el colesterol HDL. Por lo tanto, se deduce que la inhibición de la CETP debería conducir a un aumento del colesterol HDL en plasma y a una reducción del colesterol LDL en plasma, proporcionado de esta manera un perfil de lípidos en plasma terapéuticamente beneficioso. Se describen indicios de este efecto en McCarthy, Medicinal Res. Revs., 13, 139-59 (1993). Se describen indicios adicionales de este efecto en Sitori, Pharmac. Ther., 67, 443-47 (1995)). Este fenómeno se demostró por primera vez por Swenson et al., (J. Biol. Chem., 264, 14318 (1989)) con el uso de un anticuerpo monoclonal que inhibe específicamente la CETP. En conejos, el anticuerpo ocasionaba un aumento del colesterol HDL en plasma y una reducción del colesterol LDL. Son et al. (Biochim. Biophys. Acta, 795, 743-480 (1984)) describen proteínas procedentes de plasma humano que inhiben la CETP. La patente de Estados Unidos 5.519.001 expedida a Kushwaha et al., describe un péptido de 36 aminoácidos derivado de la apo C-1 de mandril que inhibe la actividad CETP. Cho et al. (Biochim. Biophys. Acta 1391, 133-144 (1998)) describen un péptido procedente del plasma de cerdo que inhibe la CETP humana. Bonin et al. (J. Peptide Res., 51, 216-225 (1998)) describen un decapéptido inhibidor de la CETP. Hedge et al., en Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, 1277-80 (1998) describen un metabolito fúngico que es un depsipéptido como inhibidor de la CETP.

Ha habido varios informes de compuestos no peptídicos que actúan como inhibidores de la CETP. Barrett et al. (J. Am. Chem. Soc., 188, 7863-63 (1996)) describen inhibidores de CETP que contienen ciclopropano. Luo et al. (J. Am. Chem. Soc., 117, 10629-34 (1995)) describen otros inhibidores de CETP que contienen ciclopropano. Pietzonka et al (Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 1951-54, (1996)) describen análogos de colesteril éster que contienen fosfonato como inhibidores de CETP. Coval et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 605-610 (1995)) describen Wiedendiol-A y -B, y compuestos de sesquiterpeno relacionados como inhibidores de la CETP. Lee et al. (J. Antibiotics, 49, 693-96 (1996)) describen inhibidores de CETP derivados de un hongo de insectos. Busch et al. (Lipids, 25, 216-220, (1990)) describen el bromuro de colesteril acetilo como un inhibidor de la CETP. Morton y Zilversmit (J. Lipid Res., 35,

\hbox{836-47}

(1982)) describen que el sulfonato de p-cloromercurifenilo, p-hidroximercuribenzoato y mercuritiosalicilato de etilo inhiben la CETP. Connolly et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm., 223, 42-47 (1996)) describen otros reactivos de modificación de cisteína como inhibidores de la CETP. Xia et al. describen 1,3,5-triazinas como inhibidores de la CETP (Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 919-22 (1996)). Bisgaier et al. (Lipids, 29, 811-8 (1994)) describen 4-fenil-5-tridecil-4H-1,2,4-triazol-tiol como un inhibidor de la CETP. En la Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie Nº 09/153.360 se describen otros triazoles inhibidores de la CETP. Sikorski et al. describió nuevos inhibidores de CETP adicionales en la Solicitud de Patente PCT Nº WO 9914204.

Ciertos compuestos de 2-mercaptoanilina amida substituidos pueden usarse como inhibidores de la CETP y tales compuestos terapéuticos se describen por H. Shinkai et al. en la Solicitud de Patente PCT Nº WO 98/35937.

Algunos compuestos de heteroalquilamina substituidos se conocen como inhibidores de la CETP. En la Solicitud de Patente Europea Nº 796846, Schmidt et al. describen piridinas 2-aril-substituidas como inhibidores de la proteína de transferencia de colesterol éster útiles como agentes cardiovasculares. Un substituyente en el C_{3} del anillo de piridina puede ser un grupo hidroxialquilo. En la Solicitud de Patente Europea Nº 801060, Dow y Wright describen derivados heterocíclicos substituidos con un producto de adición de aldehído de una alquilamina para producir 1-hidroxi-1-aminas. Se ha informado que estos derivados son agonistas de receptores \beta3-adrenérgicos útiles para tratar la diabetes y otros trastornos. En la Solicitud de Patente de Gran Bretaña Nº 2305665, Fisher et al. describen 3 derivados de piridina substituidos con aminoalcohol secundario que son agonistas útiles para tratar varios trastornos, incluyendo los niveles de colesterol y enfermedades ateroscleróticas. En la Solicitud de Patente Europea Nº 818448, Schmidt et al. describen derivados de tetrahidroquinolina como inhibidores de la proteína de transferencia de colesterol éster. En la Solicitud de Patente Europea Nº 818197, Schmek et al. describen piridinas con heterociclos condensados como inhibidores de la proteína de transferencia de colesterol éster. En la Solicitud de Patente Alemana Nº 19627430, Brandes et al. describen derivados de piridina bicíclicos condensados como inhibidores de la proteína de transferencia de colesterol éster. En la Solicitud de Patente PCT Nº WO 9839299, Muller-Gliemann et al. describen derivados de quinolina como inhibidores de la proteína de transferencia de colesteril éster.

También se han descrito compuestos policíclicos que son útiles como inhibidores de la CETP por A. Oomura et al. en la Patente Japonesa Nº 10287662. Por ejemplo, se prepararon compuestos terapéuticos con las estructuras C-1 y
C-8 cultivando Penicillium spp.

En la Patente Europea Nº EP 818448, Schmidt et al. describen cicloalquilpiridinas útiles como inhibidores de la CETP. Por ejemplo, el compuesto terapéutico con la estructura C-9 se describe como un compuesto particularmente eficaz como inhibidor de la CETP.

En la Solicitud de Patente PCT Nº WO 9914174 se describen compuestos de tetrahidronaftaleno substituidos útiles como inhibidores de la CETP. En esta solicitud, se describe específicamente como un inhibidor de la CETP útil el (8S)-3-ciclopentil-1-(4-fluorofenil)-2-[(S)-fluoro-(4- trifluorometilfenil)metil]-8-hidroxi-6-espirociclobutil-5,6,7,8- tetrahidronaftaleno.

En la Solicitud de Patente PCT Nº WO 9914215 se describen algunas 4-heteroaril-tetrahidroquinolinas útiles como inhibidores de la CETP. Por ejemplo, esta descripción describe la 3-(4-trifluorometilbenzoil)-5,6,7,8-tetrahidroquinolin-5-ona como un inhibidor de la CETP útil.

En otra estrategia para reducir el colesterol total, se hace uso del entendimiento de que la HMG CoA reductasa cataliza la etapa limitante de la velocidad en la biosíntesis del colesterol (The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9ª ed., J.G. Hardman y L.E. Limberd, ed., McGraw-Hill, Inc., New York, pág. 884-888 (1996)). Los inhibidores de la HMG CoA reductasa (incluyendo la clase de productos terapéuticos denominados comúnmente "estatinas") reducen los niveles del colesterol LDL en el suero sanguíneo mediante la inhibición competitiva de esta etapa biosintética (M.S. Brown, et al., J. Biol. Chem. 253, 1121-28 (1978)). Varias estatinas se ha desarrollado o comercializado en todo el mundo. La mevastatina estuvo entre las primeras estatinas que se desarrollaron y se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 3.983.140. La lovastatina, otro inhibidor importante de la HMG CoA reductasa, se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.231.938. La simvastatina se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.444.784. Cada uno de estos inhibidores de la HMG CoA reductasa contiene una función lactona de seis miembros que aparentemente imita la estructura de la HMG CoA compitiendo por la reductasa. La clase de fármacos reductores de colesterol inhibidores de la HMG CoA reductasa se ejemplifica adicionalmente por un grupo de fármacos que contienen funcionalidades de ácido 2,4-dihidroxiheptanoico en lugar de la lactona. Un miembro de este grupo es la pravastatina, descrita en la Patente de Estados Unidos Nº 4.346.227. Otro inhibidor de la HMG CoA reductasa que contiene un grupo de ácido 2,4-dihidroxiheptanoico es la fluvastatina, descrita en la Patente de Estados Unidos Nº 5.354.772. Las advertencias de efectos secundarios del uso de inhibidores de la HMG CoA reductasa incluyen disfunción hepática, miopatía musculoesquelética, rabdomiolisis e insuficiencia renal aguda. Algunos de estos efectos se exacerban cuando los inhibidores de la HMG CoA reductasa se combinan con fibratos o ácido nicotínico.

Los derivados de ácido fíbrico constituyen otra clase de fármacos que tienen efectos sobre los niveles de lipoproteínas. Entre los primeros de éstos que se desarrollaron estaba el clofibrato, descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 3.262.850. El clofibrato es el éster etílico del ácido p-clorofenoxiisobutírico. Un fármaco ampliamente usado en esta clase es el gemfibrozil, descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 3.674.836. El gemfibrozil se usa frecuentemente para reducir los niveles de triglicéridos o aumentar las concentraciones de colesterol HDL (The Pharmacological Basis of Therapeutics, pág. 893). El fenofibrato (Patente de Estados Unidos Nº 4.058.552) tiene un efecto similar al del gemfibrozil, pero además reduce los niveles de LDL. El ciprofibrato (Patente de Estados Unidos Nº 3.948.973) tiene efectos similares a los del fenofibrato. Otro fármaco de esta clase es el bezafibrato (Patente de Estados Unidos Nº 3.781.328). Las advertencias de efectos secundarios del uso de derivados del ácido fíbrico incluyen enfermedad de la vesícula biliar (colelitiasis), rabdomiolisis e insuficiencia renal aguda. Algunos de estos efectos se exacerban cuando los fibratos se combinan con inhibidores de la HMG CoA reductasa.

El probucol es un potente antioxidante que ha demostrado capacidad para reducir los niveles de colesterol en suero y provocar la regresión de xantomas en pacientes con hipercolesterolemia familiar homocigótica (A. Yamamoto, et al., Am. J. Cardiol., 57, 29H-35H (1986)). Sin embargo, el tratamiento con probucol solo algunas veces muestra un control errático de LDL y una reducción frecuente de HDL (The Pharmacological Basis of Therapeutics, pág. 891). El probucol está contraindicado para pacientes con lesión de miocardio progresiva y/o arritmias ventriculares.

Una clase de materiales que funcionan por medio de otro mecanismo para reducir el nivel de colesterol LDL comprende agentes complejantes de ácidos biliares. Tales agentes son típicamente polímeros de intercambio aniónico que se administran por vía oral a un paciente. Según pasa el agente a través del intestino, los aniones de ácidos biliares forman complejos con el agente y se excretan. Se ha especulado que tal formación de complejos impide la reabsorción en el intestino, por ejemplo en el íleon, impidiendo de esta manera la conversión de los ácidos biliares en colesterol. Uno de estos agentes complejantes de ácidos biliares es la colestiramina, un copolímero de estireno-divinilbenceno que contiene grupos catiónicos de amonio cuaternario capaces de unirse a ácidos biliares. Se cree que la colestiramina se une a los ácidos biliares en el tracto intestinal, interfiriendo de esta manera con su circulación enterohepática normal. Este efecto se describe en Reihnér et al., en "Regulation of hepatic cholesterol metabolism in humans: stimulatory effects of cholestyramine on HMG-CoA reductase activity and low density lipoprotein receptor expression in gallstone patients", Journal of Lipid Research, 31, 2219-2226 (1990). Se encuentra una descripción adicional de este efecto en Suckling et al. en "Cholesterol Lowering and bile acid excretion in the hamster with cholestyramine treatment", Atherosclerosis, 89, 183-90 (1991). Esto ocasiona un aumento en la síntesis de ácidos biliares en el hígado porque el hígado usa colesterol así como una regulación positiva de los receptores hepáticos de LDL, lo que mejora la eliminación del colesterol y reduce los niveles de colesterol LDL en suero.

Otro agente complejante de ácidos biliares es el colestipol, un copolímero de dietilentriamina y 1-cloro-2,3-epoxipropano. El colestipol se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 3.692.895. Un efecto secundario frecuente del colestipol y de la colestiramina son las molestias gástricas.

En la Patente de Estados Unidos Nº 5.703.188, cedida a Geltex Pharmaceuticals Inc., se describen otros agentes complejantes de ácidos biliares adicionales. Por ejemplo, uno de estos agentes complejantes de ácidos biliares es el cloruro de 3-metacrilamidopropiltrimetilamonio copolimerizado con dimetacrilato de etilenglicol para producir un copolímero.

Otra clase más de materiales propuestos como agentes complejantes de ácidos biliares comprende partículas que comprenden copolímeros anfífilos con un dominio de cubierta reticulado y un dominio de núcleo interior (solicitud de Patente Nº PCT/US 97/11610). Las estructuras y la preparación de tales copolímeros anfífilos reticulados se describen en el documento PCT/US97/11345. A tales partículas se les ha dado el nombre común de "knedels" (K.B. Thurmond et al., J. Am. Chem. Soc., 118, (30), 7239-40 (1996)).

El ácido nicotínico (niacina) es una vitamina del complejo B que, como ya se informó en 1955, actúa como agente hipolipidémico (R. Altschl, et al., Arch. Biochem. Biophys., 54, 558-9 (1955)). Algunas veces se usa para aumentar los bajos niveles de HDL y para reducir los niveles de VLDL y LDL. Las formulaciones comerciales útiles de ácido nicotínico incluyen Niacor, Niaspan, Nicobid, Nicolar y Slo-Niacin. El ácido nicotínico está contraindicado en pacientes con disfunción hepática, úlcera péptica activa o hemorragias arteriales. Otro compuesto de esta clase útil para indicaciones cardiovasculares es niceritrol (T. Kazumi et al., Curr. Ther. Res., 55, 546-51). J. Sasaki et al. (Int. J. Clin. Pharm. Ther., 33 (7), 420-26 (1995)) describen una reducción en la actividad de transferencia del colesterol éster por monoterapia con niceritrol. El Acipimox (4-óxido del ácido 5-metil-pirazina-2-carboxílico, Patente de Estados Unidos Nº 4.002.750) es estructuralmente similar al ácido nicotínico y tiene actividad antihiperlipidémica.

Un estudio de Wetterau et al. (Science, 282, 751-54 (1998)) describe varios compuestos de alquilpiperidina, compuestos de isoindol y compuestos de fluoreno útiles para inhibir la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales (inhibidores de MTP). Los roedores y conejos con hiperlipidemia hereditaria de Watanabe tratados con estos compuestos muestran una menor producción de partículas de lipoproteínas.

Los antagonistas de la absorción del colesterol también pueden ser útiles para el tratamiento o profilaxis de enfermedades cardiovasculares tales como hipercolesterolemia o aterosclerosis. Por ejemplo, las azetidinonas tales como SCH 58235 ([3R-[3\alpha(S*), 4\beta]]-1-(4-fluorofenil)-3-[3-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropil]-4-(4- hidroxifenil)-2-azetidinona) (fórmula A-1), descrita en J. Med. Chem., 41(6), 973-980 (1998), son antagonistas de la absorción del colesterol útiles. El SCH 58235 se describe adicionalmente por Van Heek et al., en J. Pharmacol. Exp. Ther., 283(1), 157-163 (1997). En la Patente de Estados Unidos Nº 5.767.115 se describen otros compuestos de azetidinona útiles para el tratamiento o profilaxis de enfermedades cardiovasculares.

4

[3R-[3a(S*),4b]]-1-(4-fluorofenil)-3-[3-(4-fluorofenil)-3-hidroxipropil]-4-(4- hidroxifenil)-2-azetidinona

Se ha demostrado que los fitosteroles, y especialmente los estanoles inhiben eficazmente la absorción de colesterol del tracto gastrointestinal, y afectan negativamente a la síntesis de colesterol. Es de esperar que los fitosteroles ralenticen o inhiban el progreso y formación de ciertas afecciones cardiovasculares, incluyendo afecciones hiperlipidémicas tales como hipercolesterolemia y aterosclerosis. Los estanoles son derivados 5\alpha saturados de los fitosteroles. (Straub, Patente de Estados Unidos Nº 5.244.887). Se ha sugerido que los fitosteroles reducen los niveles de colesterol en sangre reduciendo la absorción del colesterol en el intestino (Ling y Jones, "Minireview Dietary Phytosterols: A Review of Metabolism, Benefits and Side Effects," Life Sciences, 57(3), 195-206 (1995)).

Straub, en la Patente de Estados Unidos número 5.244.887 describe el sitostanol, clionastanol, 22,23-dihidrobrassicastanol, campestanol, y mezclas de los mismos contenidos en aditivos alimentarios destinados a reducir la absorción del colesterol de alimentos y bebidas que contienen colesterol.

Miettinen et al., en la Patente de Estados Unidos Nº 5.502.045, describen un éster de ácido graso o una mezcla de ésteres de ácidos grasos de beta-sitostanol que reduce el colesterol en suero.

Wester et al., en el documento WO 9806405 describen una composición de estanol que contiene sitostanol y campestanol que reduce eficazmente los niveles de colesterol en suero cuando se incorpora en comestibles.

Haines, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.929.062 describe una composición terapéutica de uno o más oxiesteroles y un vehículo adecuado para inhibir la absorción de colesterol de la dieta.

La enfermedad cardiovascular también se produce o se agrava por la hipertensión. La hipertensión se define como una alta presión sanguínea persistente. Generalmente, los adultos se consideran hipertensos cuando la presión sanguínea sistólica está por encima de 140 mmHg de forma persistente o cuando la presión sanguínea diastólica está por encima de 90 mmHg. Los riesgos a largo plazo de mortalidad cardiovascular aumentan en una relación directa con la presión sanguínea persistente (E. Braunwald, Heart Disease, 5ª ed, W.B. Saunders & Co., Philadelphia, 1997, pág. 807-823). Se han explotado diversos mecanismos ventajosamente para controlar la hipertensión. Por ejemplo, los agentes antihipertensivos útiles pueden incluir, sin limitación, un bloqueante adrenérgico, un bloqueante adrenérgico mixto alfa/beta, un bloqueante adrenérgico alfa, un bloqueante adrenérgico beta, un estimulante adrenérgico, un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), un antagonista del receptor de la angiotensina II, un bloqueante de los canales de calcio, un diurético o un vasodilatador. Un agente antihipertensivo particularmente útil es la eplerenona (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.559.332). La eplerenona reduce la presión sanguínea funcionando como un diurético. La eplerenona se denominó anteriormente epoximexrenona.

En la bibliografía se han descrito algunas terapias de combinación para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 09/037.308 y en la Solicitud de Patente PCT Nº 98/40375 se describen combinaciones de inhibidores de IBAT con inhibidores de HMG-CoA reductasa útiles para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

J. Sasaki et al. (Id.) describen una terapia de combinación de fluvastatina y niceritrol. Esos investigadores concluyen que la combinación de fluvastatina con niceritrol "a una dosis de 750 mg/día no parece aumentar ni atenuar los efectos beneficiosos de la fluvastatina."

L. Cashin-Hemphill et al. (J. Am. Med. Assoc., 264, (23), 3013-17 (1990)) describen los efectos beneficiosos de una terapia de combinación de colestipol y niacina sobre la aterosclerosis coronaria. Los efectos descritos incluyen la falta de progresión y la regresión en lesiones nativas en las arterias coronarias.

Una terapia de combinación de acipimox y simvastatina muestra efectos beneficiosos sobre las HDL en pacientes con altos niveles de triglicéridos (N. Hoogerbrugge et al., J. Internal Med., 241, 151-55 (1997)).

\newpage

H. Gylling et al. (J. Lipid Res., 37, 1776-85 (1996)) describen una terapia de combinación con margarina de éster de sitostanol y pravastatina. Se informa que esta terapia inhibe la absorción de colesterol y reduce al mismo tiempo el colesterol LDL de forma significativa en hombres diabéticos no dependientes de insulina.

Brown et al. (New Eng. J. Med., 323 (19), 1289-1339 (1990)) describen una terapia de combinación de lovastatina y colestipol que reduce la progresión de lesiones ateroscleróticas y aumenta la regresión de las lesiones con respecto a la lovastatina sola.

Scott (Solicitud de Patente PCT Nº WO 99/11260) describe combinaciones de atorvastatina (un inhibidor de la HMG CoA reductasa) con un agente antihipertensivo para el tratamiento de la angina de pecho, aterosclerosis, hipertensión e hiperlipidemia combinadas, y síntomas de riesgo cardíaco.

Egan et al. (Solicitud de Patente PCT Nº WO 96/40255) describen una terapia de combinación de un antagonista de la angiotensina II y un antagonista de aldosterona epoxi-esteroideo. El antagonista de aldosterona epoxi-esteroideo de la solicitud de Egan incluye eplerenona.

Las referencias anteriores muestran una necesidad irresoluta de encontrar agentes seguros y eficaces para la profilaxis o tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

Sumario de la invención

Para abordar la necesidad irresoluta de encontrar agentes seguros y eficaces para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, a continuación se presentan terapias de combinación de fármacos cardiovasculares.

La presente invención proporciona una composición terapéutica que comprende una primera cantidad de un inhibidor de IBAT y una segunda cantidad de un inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales (inhibidor de MTP), donde la primera y la segunda cantidades juntas constituyen una cantidad anti-hiperlipidémica eficaz o una cantidad anti-aterosclerótica eficaz de los compuestos. El inhibidor de IBAT en las realizaciones de esta invención es preferiblemente un inhibidor de IBAT de benzotiepina. En otra realización, el inhibidor de IBAT puede ser un inhibidor de IBAT de benzotiazepina. En otra realización más, el inhibidor de IBAT puede ser un inhibidor de IBAT de naftaleno.

Entre sus diversas realizaciones, la presente invención proporciona además una combinación que comprende una primera cantidad de un inhibidor de IBAT y una segunda cantidad de otro producto terapéutico cardiovascular útil en la profilaxis o tratamiento de la hiperlipidemia o la aterosclerosis, donde la primera y la segunda cantidades juntas comprenden una cantidad eficaz anti-hiperlipidémica o una cantidad eficaz anti-aterosclerótica de los compuestos.

Otra realización adicional de la presente invención comprende el uso de cualquiera de las terapias de combinación cardiovasculares descritas en este documento en la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de la hipercolesterolemia o la aterosclerosis.

En otra realización, la presente invención proporciona el uso, para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de una afección o trastorno hiperlipidémico en un mamífero, de una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales donde la primera cantidad y la segunda cantidad juntas constituyen una cantidad eficaz anti-hiperlipidémica, una cantidad eficaz anti-aterosclerótica o una cantidad eficaz anti-hipercolesterolémica de los compuestos.

En otra realización, la presente invención proporciona un kit para conseguir un efecto terapéutico en un mamífero que comprende una cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon en una primera forma de dosificación unitaria; una cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales en una segunda forma de dosificación unitaria; y un recipiente para contener dicha primera y segunda formas de dosificación unitarias.

El alcance adicional de la aplicabilidad de la presente invención se hará evidente tras la descripción detallada que se proporciona a continuación. Sin embargo, debe apreciarse que la siguiente descripción detallada y ejemplos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan sólo como ilustración, ya que con esta descripción detallada se harán evidentes para los especialistas en la técnica diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La siguiente descripción detallada se proporciona para ayudar a los especialistas en la técnica a poner en práctica la presente invención. Aún así, no debe considerarse que esta descripción detallada limita indebidamente la presente invención, ya que los especialistas habituales en la técnica pueden realizar diversas modificaciones y variaciones en las realizaciones descritas en este documento sin apartarse del alcance del descubrimiento de la presente invención.

a. Definiciones

Las siguientes definiciones se proporcionan para ayudar al lector a comprender la descripción detallada de la presente invención:

"Inhibidor de IBAT de benzotiepina" significa un inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon que comprende un compuesto terapéutico que comprende una estructura de 1,1-dióxido de 2,3,4,5-tetrahidro-1-benzotiepina o una estructura de 1-óxido de 2,3,4,5-tetrahidro-1-benzotiepina.

"Inhibidor de IBAT de benzotiazepina" significa un inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon que comprende un compuesto terapéutico que comprende una estructura de 1,1-dióxido de 2,3,4,5-tetrahidro-1-benzoti-4-azepina o una estructura de 1,1-dióxido de 2,3,4,5-tetrahidro-1-benzoti-5-azepina.

"Inhibidor de IBAT de naftaleno" significa un inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon que comprende un compuesto terapéutico que comprende una estructura de naftaleno substituida.

"Terapia de combinación" significa la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar un estado de hipertensión o un estado hiperlipidémico, por ejemplo aterosclerosis e hipercolesterolemia. Tal administración incluye la co-administración de estos agentes terapéuticos de una manera substancialmente simultánea, tal como en una sola forma de dosificación con una relación fija de ingredientes activos o en múltiples formas de dosificación separadas para cada agente inhibidor. Además, tal administración también incluye el uso de cada tipo de agente terapéutico de una manera secuencial. En cualquier caso, el régimen de tratamiento proporcionará efectos beneficiosos de la combinación de fármacos en el tratamiento del estado de hipertensión o del estado hiperlipidémico.

La frase "terapéuticamente eficaz" pretende cualificar la cantidad combinada de inhibidores en la terapia de combinación. Esta cantidad combinada conseguirá el objetivo de reducir o eliminar el estado de hipertensión o el estado hiperlipidémico.

"Compuesto terapéutico" significa un compuesto útil en la profilaxis o tratamiento de un estado de hipertensión o un estado hiperlipidémico, incluyendo aterosclerosis e hipercolesterolemia.

b. Combinaciones

Las combinaciones de la presente invención tendrán varios usos. Por ejemplo, por medio del ajuste de la dosificación y el control médico, las dosificaciones individuales de los compuestos terapéuticos usados en las combinaciones de la presente invención serán menores que las típicos en dosificaciones de los compuestos terapéuticos cuando se usan en monoterapia. La reducción de la dosis proporcionará ventajas incluyendo la reducción de efectos secundarios de los compuestos terapéuticos individuales en comparación con la monoterapia. Además, la existencia de menos efectos secundarios de la terapia de combinación en comparación con las monoterapias conducirá a una mayor aceptación por parte del paciente de los regímenes de terapia.

Otro uso de la presente invención será en combinaciones con efectos complementarios o modos de acción complementarios. Por ejemplo, los inhibidores de IBAT a menudo reducen las lipoproteínas LDL, pero también reducen las lipoproteínas HDL. Por el contrario, los inhibidores de CETP (proteína de transferencia de colesteril éster) aumentan las HDL. Una combinación terapéutica de un inhibidor de IBAT y un inhibidor de CETP, en dosificaciones ajustadas de forma óptima, reducirá las LDL y mantendrá o aumentará las HDL.

Los compuestos útiles en la presente invención incluyen un amplio intervalo de compuestos terapéuticos. Los inhibidores de IBAT útiles en la presente invención se describen en la solicitud de patente Nº PCT/US95/10863. En el documento PCT/US97/04076 se describen más inhibidores de IBAT. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos con Número de Serie Nº 08/816.065 se describen otros inhibidores de IBAT útiles en la presente invención. En el documento WO 98/40375 se describen más compuestos inhibidores de IBAT útiles en la presente invención. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/816.065 se describen otros compuestos inhibidores de IBAT útiles en la presente invención. En la tabla 1 se muestran inhibidores de IBAT de particular interés en la presente invención, así como los diastereómeros, enantiómeros, racematos, sales y tautómeros de los inhibidores de IBAT de la tabla 1.

TABLA 1

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

Los compuestos inhibidores de MTP útiles en las combinaciones y métodos de la presente invención comprenden una amplia diversidad de estructuras y funcionalidades. Algunos de los compuestos inhibidores de MTP de particular interés para uso en la presente invención se muestran en la tabla 4b. Los compuestos terapéuticos de la tabla 4b pueden usarse en la presente invención en una diversidad de formas, incluyendo en forma ácida, forma de sal, racematos, enantiómeros, zwitteriones y tautómeros. Pueden encontrarse descripciones de los compuestos terapéuticos de la tabla 4b en Science, 282, 23 de octubre de 1998, pág. 751-754.

TABLA 4b.

19

20

21

En la combinación de la presente invención, el inhibidor de IBAT es preferiblemente un inhibidor de IBAT de benzotiazepina. En una realización preferida, el inhibidor de IBAT de benzotiazepina es el compuesto B-2. En otra realización preferida, el inhibidor de IBAT de benzotiazepina es el compuesto B-7. En otra realización preferida, el inhibidor de IBAT es un inhibidor de IBAT de benzotiepina. Cada uno de los siguientes inhibidores de IBAT de benzotiepina representa una realización preferida distinta de la presente invención.

B-1.

B-3.

B-4.

B-5.

B-6.

B-8.

B-9.

B-10.

B-11.

B-12.

B-13.

B-14.

B-15.

B-16.

B-17.

B-18.

B-19.

B-21.

B-22.

B-23.

B-24.

B-25.

B-26.

B-27.

B-28.

B-29.

B-30.

B-31.

B-32.

B-33.

B-34.

B-35.

B-36.

B-37.

B-38.

B-39.

En otra realización preferida, el inhibidor de IBAT es un inhibidor de IBAT de naftaleno, por ejemplo, compuesto B-20.

La hipertensión se define como una presión sanguínea persistentemente alta. Generalmente, los adultos se clasifican como hipertensos cuando la presión sanguínea sistólica está persistentemente por encima de 140 mmHg o cuando la presión sanguínea diastólica está por encima de 90 mmHg. Los riesgos a largo plazo de mortalidad cardiovascular aumentan en una relación directa con una presión sanguínea persistente. (E. Braunwald, Heart Disease, 5ª ed, W.B. Saunders & Co., Philadelphia, 1997, pág. 807-823). La presión sanguínea es una función del rendimiento cardíaco y de la resistencia periférica del sistema vascular y puede representarse por la siguiente ecuación:

BP = CO \ X \ PR

en la que BP es la presión sanguínea, CO es el rendimiento cardíaco, y PR es la resistencia periférica. (Id., pág. 816.) Los factores que afectan a la resistencia periférica incluyen la obesidad y/o la constricción funcional. Los factores que afectan al rendimiento cardíaco incluyen la constricción venosa. La constricción funcional de los vasos sanguíneos puede provocarse por una diversidad de factores, incluyendo el aumento del espesor de las paredes de los vasos sanguíneos que tiene como resultado una disminución del diámetro interior de los vasos. Otro factor que afecta a la presión sanguínea sistólica es la rigidez de la aorta (Id., pág. 811.)

A menudo, en un paciente coexisten la hipertensión y la aterosclerosis u otras afecciones hiperlipidémicas. Es posible que ciertas afecciones hiperlipidémicas tales como la aterosclerosis tengan un efecto directo o indirecto sobre la hipertensión. Por ejemplo, la aterosclerosis a menudo ocasiona una disminución del diámetro interno de los vasos sanguíneos. Además, la aterosclerosis a menudo ocasiona un aumento de la rigidez de los vasos sanguíneos, incluyendo la aorta. Tanto la reducción del diámetro interior como la rigidez de los vasos sanguíneos son factores que contribuyen a la hipertensión.

El infarto de miocardio es la necrosis de células del músculo cardíaco debida a una privación de oxígeno y normalmente se provoca por una obstrucción del suministro de sangre al tejido afectado. Por ejemplo, la hiperlipidemia o hipercolesterolemia puede originar la formación de placas ateroscleróticas que pueden causar una obstrucción del flujo sanguíneo y por lo tanto causar un infarto de miocardio. (Id., pág. 1185-1187.) Otro factor de riesgo principal para el infarto de miocardio es la hipertensión. (Id., pág. 815.) En otras palabras, la hipertensión y las afecciones hiperlipidémicas tales como la aterosclerosis o la hipercolesterolemia actúan conjuntamente para causar un infarto de miocardio.

La enfermedad cardíaca coronaria es otra enfermedad que se origina o se agrava por múltiples factores, incluyendo las afecciones hiperlipidémicas y la hipertensión. El control de las afecciones hiperlipidémicas y de la hipertensión es importante para controlar los síntomas o la progresión de la enfermedad cardíaca coronaria.

La angina de pecho es un dolor agudo en el pecho que está provocado por una reducción del suministro de sangre al corazón. La reducción del suministro de sangre al corazón se conoce como isquemia de miocardio. La angina de pecho puede ser el resultado de, por ejemplo, estenosis de la aorta, estenosis pulmonar, e hipertrofia ventricular. Algunos agentes antihipertensivos, por ejemplo, la amlodipina, controlan la angina de pecho reduciendo la resistencia periférica.

Ahora se describe que una terapia que controla la hipertensión y que además controla las afecciones hiperlipidémicas reducirá el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares o síntomas de enfermedades cardíacas, por ejemplo, enfermedad cardíaca coronaria, infarto de miocardio o angina de pecho.

Muchos de los compuestos útiles de la presente invención pueden tener al menos dos átomos de carbono asimétricos y, por lo tanto, incluyen racematos y estereoisómeros, tales como diastereómeros y enantiómeros, tanto en forma pura como en mezclas. Tales estereoisómeros pueden prepararse usando técnicas convencionales, por medio de la reacción de materiales de partida enantioméricos o por medio de la separación de isómeros de compuestos de la presente invención.

Los isómeros pueden incluir isómeros geométricos, por ejemplo isómeros cis o isómeros trans a través de un enlace doble. Todos estos isómeros se contemplan entre los compuestos útiles en la presente invención.

Los compuestos útiles en la presente invención también incluyen tautómeros.

Los compuestos útiles en la presente invención como se describen más adelante incluyen sus sales, solvatos y profármacos.

Dosificaciones, formulaciones y vías de administración

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades o afecciones hiperlipidémicas por cualquier medio, preferiblemente oral, que produzca el contacto de estos compuestos con su sitio de acción en el cuerpo, por ejemplo, en el íleon de un mamífero, por ejemplo, un ser humano.

Para la profilaxis o el tratamiento de las afecciones mencionadas anteriormente, los compuestos útiles en las composiciones y métodos de la presente invención pueden usarse como el compuesto per se. Las sales farmacéuticamente aceptables son particularmente adecuadas para aplicaciones médicas dada su mayor solubilidad en agua en relación con el compuesto parental. Naturalmente, tales sales deben tener un anión o catión farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables adecuadas de los compuestos de la presente invención, cuando es posible, incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico, sulfónico y sulfúrico, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, bencenosulfónico, benzoico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glicólico, isotiónico, láctico, lactobiónico, maleico, málico, metanosulfónico, succínico, toluenosulfónico, tartárico y trifluoroacético. La sal cloruro se prefiere particularmente para fines médicos. Las sales básicas farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos tales como sales de sodio y potasio, y sales de metales alcalinotérreos tales como sales de magnesio y de calcio.

Por supuesto, también se requiere que los aniones útiles en la presente invención sean farmacéuticamente aceptable y también se seleccionan de la lista anterior.

Los compuestos útiles en la presente invención pueden presentarse con un vehículo aceptable en forma de una composición farmacéutica. Por supuesto, el vehículo debe ser aceptable en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la composición y no debe ser perjudicial para el receptor. El vehículo puede ser un sólido o un líquido, o ambos, y preferiblemente se formula con el compuesto como una composición de dosis unitaria, por ejemplo, un comprimido, que puede contener de un 0,05% a un 95% en peso del compuesto activo. También pueden estar presentes otras substancias farmacológicamente activas, incluyendo otros compuestos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse por cualquiera de las técnicas bien conocidas de farmacia, que constan esencialmente de mezclar los componentes.

\newpage

Estos compuestos pueden administrarse por cualquier medio convencional disponible para uso junto con productos farmacéuticos, como compuestos terapéuticos individuales o como una combinación de compuestos terapéuticos.

Por supuesto, la cantidad de compuesto que se necesita para conseguir el efecto biológico deseado dependerá de varios factores tales como el compuesto específico seleccionado, el uso para el que está destinado, el modo de administración, y el estado clínico del receptor.

En general, una dosis diaria total de un inhibidor de IBAT puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1000 mg/día, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 50 mg/día, más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/día.

En el caso de los inhibidores de MTP, generalmente será apropiada una dosis diaria de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 800 mg/kg de peso corporal/día, preferiblemente entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal/día, más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal/día, y más preferiblemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal/día.

Las dosis diarias descritas en los párrafos anteriores para los diversos compuestos terapéuticos pueden administrarse al paciente en una sola dosis, o en múltiples subdosis proporcionadas. Las subdosis pueden administrarse de 2 a 6 veces al día. Las dosis pueden estar en una forma de liberación sostenida eficaz para obtener los resultados deseados.

En el caso de las sales farmacéuticamente aceptables, los pesos indicados anteriormente se refieren al peso del equivalente ácido o del equivalente básico del compuesto terapéutico derivado de la sal.

La administración oral de las combinaciones de la presente invención puede incluir formulaciones, como es bien conocido en la técnica, para proporcionar una liberación prolongada o sostenida del fármaco en el tracto gastrointestinal mediante diversos mecanismos. Éstos incluyen, pero sin limitación, la liberación sensible al pH desde la forma de dosificación basándose en el pH cambiante del intestino delgado, la erosión lenta de un comprimido o una cápsula, la retención en el estómago basándose en las propiedades físicas de la formulación, la bioadhesión de la forma de dosificación al revestimiento de mucosa del tracto intestinal, o la liberación enzimática del fármaco activo desde la forma de dosificación. Para algunos de los compuestos terapéuticos útiles en la presente invención (por ejemplo, inhibidores de IBAT), el efecto deseado es prolongar el período de tiempo durante el que la molécula de fármaco activo se libera al sitio de acción (por ejemplo, el íleon) mediante la manipulación de la forma de dosificación. De esta forma, dentro del alcance de la presente invención se encuentran las formulaciones de liberación controlada con recubrimiento entérico. Los recubrimientos entéricos adecuados incluyen acetato ftalato de celulosa, ftalato de polivinilacetato, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa y polímeros aniónicos de ácido metacrílico y éster metílico del ácido metacrílico.

Las combinaciones de la presente invención pueden administrarse por vía oral en forma de un sólido, de un semi-sólido o de un líquido. Cuando se administran en forma de un líquido o un semi-sólido, las combinaciones de la presente invención pueden estar, por ejemplo, en forma de un líquido, jarabe o contenidas en una cápsula de gel (por ejemplo, una gel cap).

Cuando se administran por vía intravenosa, la dosis de inhibidor de IBAT puede estar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 1,0 mg/kg de peso corporal, preferiblemente de aproximadamente 0,25 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 0,75 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente de aproximadamente 0,4 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 0,6 mg/kg de peso corporal.

La dosis de cualquiera de estos compuestos terapéuticos puede administrarse convenientemente como una infusión de aproximadamente 10 ng/kg de peso corporal a aproximadamente 100 ng/kg de peso corporal por minuto. Los líquidos de infusión adecuados para este propósito pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 ng a aproximadamente 10 mg, preferiblemente de aproximadamente 1 ng a aproximadamente 10 mg por mililitro. Las dosis unitarias pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 g de compuesto de la presente invención. De esta forma, las ampollas para inyección pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, tópica, bucal (por ejemplo, sublingual) y parenteral (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa), aunque la vía más adecuada en cualquier caso dado dependerá de la naturaleza y la gravedad de la afección a tratar y de la naturaleza del compuesto particular que se esté usando. En la mayoría de los casos, la vía de administración preferida es la oral.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración oral pueden presentarse en unidades discretas, tales como cápsulas, cachets, grageas o comprimidos, conteniendo cada una cantidad predeterminada de al menos un compuesto terapéutico útil en la presente invención; en forma de polvo o gránulos; como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite. Como se ha indicado, tales composiciones pueden prepararse por cualquier método adecuado de farmacia que incluye la etapa de asociar el/los compuesto(s) activo(s) y el vehículo (que puede constituir uno o más ingredientes auxiliares). En general, las composiciones se preparan mezclando íntima y uniformemente el compuesto activo con un vehículo líquido o sólido finamente dividido, o ambos, y después, si es necesario, dando forma al producto. Por ejemplo, un comprimido puede prepararse comprimiendo o moldeando un polvo o granulado del compuesto, opcionalmente con uno o más ingredientes auxiliares. Los comprimidos obtenidos por compresión pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada el compuesto en forma fluida, tal como un polvo o gránulos mezclados opcionalmente con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, y/o agente(s) tensioactivo(s)/de dispersión. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse moldeando, en una máquina adecuada, el compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración bucal (sublingual) incluyen grageas que comprenden un compuesto de la presente invención en una base aromatizada, normalmente sacarosa, y goma arábiga o tragacanto, y pastillas que comprenden el compuesto en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral convenientemente comprenden preparaciones estériles acuosas de un compuesto de la presente invención. Estas preparaciones se administran preferiblemente por vía intravenosa, aunque la administración también puede efectuarse mediante inyección subcutánea, intramuscular o intradérmica. Tales preparaciones pueden prepararse convenientemente mezclando el compuesto con agua y haciendo la solución resultante estéril e isotónica con la sangre. Las composiciones inyectables de acuerdo con la invención generalmente contendrán de un 0,1 a un 5% p/p de un compuesto descrito en este documento.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración rectal se presentan preferiblemente como supositorios de dosis unitaria. Éstos pueden prepararse mezclando un compuesto de la presente invención con uno o más vehículos sólidos convencionales, por ejemplo, manteca de cacao, y dando forma después a la mezcla resultante.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para aplicación tópica en la piel preferiblemente toman la forma de una pomada, crema, loción, pasta, gel, pulverización, aerosol o aceite. Los vehículos que se pueden usar incluyen petrolato (por ejemplo, vaselina), lanolina, polietilenglicoles, alcoholes, y combinaciones de dos o más de los mismos. El compuesto activo generalmente está presente a una concentración de aproximadamente un 0,1 a un 50% p/p de la composición, por ejemplo, de un 0,5 a un 2%.

También es posible la administración transdérmica. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración transdérmica pueden presentarse como parches discretos adaptados para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un período de tiempo prolongado. Tales parches convenientemente contienen un compuesto de la presente invención en una solución acuosa opcionalmente tamponada, disuelto y/o disperso en un adhesivo, o disperso en un polímero. Una concentración adecuada del compuesto activo es de aproximadamente un 1% a un 35%, preferiblemente de aproximadamente un 3% a un 15%. Como posibilidad particular, el compuesto puede liberarse desde el parte por medio de electrotransporte o iontoforesis, por ejemplo, como se describe en Pharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986).

En cualquier caso, la cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con los materiales de vehículo para producir una sola forma de dosificación a administrar variará dependiendo del hospedador tratado y del modo particular de administración.

Las formas de dosificación sólidas para administración oral, incluyendo las cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos, cápsulas de gel y gránulos descritos anteriormente, comprenden uno o más compuestos útiles en la presente invención mezclados con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación también pueden comprender, como en la práctica normal, substancias adicionales distintas de diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio o agentes solubilizantes tales como ciclodextrinas. En el caso de cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas de gel y píldoras, las formas de dosificación también puede comprender agentes tamponantes. Los comprimidos y las píldoras pueden prepararse adicionalmente con recubrimientos entéricos.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables que contiene diluyentes inertes usados normalmente en la técnica, tales como agua. Tales composiciones también pueden comprender adyuvantes, tales como agentes humectantes, emulsionantes y agentes de suspensión, edulcorantes, aromatizantes y perfumes.

Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, puede formularse de acuerdo con la técnica conocida usando agentes de dispersión o solidificación y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse está el agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, como medio disolvente o de suspensión convencionalmente se emplean aceites estériles fijos. Para este propósito se puede usar cualquier aceite fijo insípido, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables.

Los vehículos farmacéuticamente aceptable incluyen todos los anteriores y similares.

En la terapia de combinación, la administración de dos o más de los agentes terapéuticos útiles en la presente invención puede tener lugar secuencialmente en formulaciones separadas, o puede realizarse por medio de la administración simultánea en una sola formulación o en formulaciones separadas.

La administración puede realizarse por vía oral, o mediante inyecciones intravenosas, intramusculares o subcutáneas. La formulación puede estar en forma de un bolo, o en forma de suspensiones o soluciones acuosas o no acuosas isotónicas estériles para inyección. Estas soluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos o gránulos estériles con uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, o un aglutinante tal como gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa, junto con uno o más de los siguientes: agentes lubricantes, conservantes, tensioactivos o dispersantes.

Para la administración oral, la composición farmacéutica pueden estar, por ejemplo, en forma de un comprimido, cápsula, suspensión o líquido. Las cápsulas, comprimidos, etc., pueden prepararse por métodos convencionales bien conocidos en la técnica. La composición farmacéutica se prepara preferiblemente en forma de una unidad de dosificación que contiene una cantidad particular del ingrediente o ingredientes activos. Son ejemplos de unidades de dosificación comprimidos o cápsulas. Éstos pueden contener ventajosamente uno o más compuestos terapéuticos en una cantidad descrita anteriormente. Por ejemplo, en el caso de un inhibidor de IBAT, el intervalo de dosificación puede ser de aproximadamente 0,01 mg/día a aproximadamente 500 mg/día, o cualquier otra dosis, dependiendo del inhibidor específico, como se conoce en la técnica.

Los ingredientes activos también pueden administrarse por inyección como una composición en la que, por ejemplo, se puede usar solución salina, dextrosa o agua como vehículo adecuado. Una dosis diaria adecuada de cada compuesto terapéutico activo es una que consigue el mismo nivel en sangre que el producido por la administración oral como se ha descrito anteriormente.

Los compuestos terapéuticos también pueden administrarse por cualquier combinación de vías oral/oral, oral/
parenteral o parenteral/parenteral.

Las composiciones farmacéuticas para uso en los métodos de tratamiento de la presente invención pueden administrarse en forma oral o por administración intravenosa. Se prefiere la administración oral de la terapia de combinación. Para la administración oral, la dosificación puede realizarse con un régimen que requiera una sola dosis diaria, o que requiera una sola dosis un día sí y otro no, o que requiera múltiples dosis espaciadas a lo largo del día. Los compuestos terapéuticos que constituyen la terapia de combinación pueden administrarse simultáneamente, en una forma de dosificación combinada o en formas de dosificación separadas destinadas para una administración oral substancialmente simultánea. Los compuestos terapéuticos que constituyen la terapia de combinación también pueden administrarse secuencialmente, administrándose cualquiera de los compuestos terapéuticos mediante un régimen que requiera una ingestión en dos etapas. De esta forma, un régimen puede requerir la administración secuencial de los compuestos terapéuticos con una ingestión espaciada de agentes activos separados. El período de tiempo entre las múltiples etapas de ingestión puede variar de unos pocos minutos a varias horas, dependiendo de las propiedades de cada compuesto terapéutico tales como la potencia, la solubilidad, la biodisponibilidad, la vida media en plasma y el perfil cinético del compuesto terapéutico, así como del efecto de la ingestión de alimentos y la edad y estado del paciente. La variación circadiana de la concentración de la molécula diana también puede determinar el intervalo de dosis óptimo. Los compuestos terapéuticos de la terapia combinada, tanto si se administran de forma simultánea, como si se administran substancialmente de forma simultánea o secuencialmente, pueden implicar un régimen que requiera la administración de un compuesto terapéutico por vía oral y otro compuesto terapéutico por vía intravenosa. Tanto si los compuestos terapéuticos de la terapia combinada se administran por vía oral o intravenosa, de forma separada o conjunta, cada uno de estos compuestos terapéuticos estará contenido en una formulación farmacéutica adecuada de excipientes, diluyentes u otros componentes de la formulación farmacéuticamente aceptables. Ya se han proporcionado anteriormente ejemplos de formulaciones farmacéuticamente aceptables que contienen los compuestos terapéuticos para administración oral.

Régimen de tratamiento

El régimen de dosificación para prevenir, aliviar o mejorar un estado de enfermedad con hiperlipemia como elemento de la enfermedad, por ejemplo, aterosclerosis, o para proteger contra o tratar altos niveles de colesterol en plasma o sangre con los compuestos y/o composiciones de la presente invención, se selecciona de acuerdo con una diversidad de factores. Éstos incluyen el tipo, edad, peso, sexo, dieta y estado médico del paciente, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración, consideraciones farmacológicas tales como la actividad, eficacia, perfiles farmacocinéticos y toxicológicos del compuesto particular empleado, si se utiliza un sistema para la liberación del fármaco, y si el compuesto se administra como parte de una combinación de fármacos. De esta forma, el régimen de dosificación empleado realmente puede variar ampliamente y, por lo tanto, desviarse del régimen de dosificación preferido indicado anteriormente.

El tratamiento inicial de un paciente que padece una afección hiperlipidémica puede empezar con las dosificaciones indicadas anteriormente. El tratamiento generalmente debe continuarse según sea necesario durante un período de varias semanas a varios meses o años hasta que la enfermedad hiperlipidémica se haya controlado o eliminado. Los pacientes en tratamiento con los compuestos o composiciones descritas en este documento pueden controlarse de forma rutinaria, por ejemplo, midiendo los niveles en suero de LDL y colesterol total por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, para determinar la eficacia de la terapia de combinación. El análisis continuo de tales datos permite la modificación del régimen de tratamiento durante la terapia de forma que se administren cantidades óptimas eficaces de cada tipo de compuesto terapéutico en cualquier punto de tiempo, y de forma que también pueda determinarse la duración del tratamiento. De esta forma, el régimen de tratamiento/programa de dosificación puede modificarse racionalmente durante el curso de la terapia de forma que se administre la menor cantidad de compuestos terapéuticos que muestren conjuntamente una eficacia satisfactoria, y de forma que la administración continúe sólo el tiempo necesario para tratar satisfactoriamente la afección hiperlipidémica.

Una ventaja potencial de la combinación descrita en este documento puede ser la reducción de la cantidad de cualquier compuesto terapéutico individual, o de todos los compuestos terapéuticos, eficaz en el tratamiento de afecciones hiperlipidémicas tales como aterosclerosis e hipercolesterolemia.

Una de las diversas realizaciones de la presente invención proporciona una combinación que comprende el uso de una primera cantidad de un inhibidor de IBAT y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de la hiperlipidemia o la aterosclerosis, donde la primera y la segunda cantidades juntas comprenden una cantidad eficaz anti-hiperlipidémica o una cantidad eficaz anti-aterosclerótica de los compuestos.

En una realización preferida, el inhibidor de IBAT es un inhibidor de IBAT de benzotiepina. En otra realización preferida, el inhibidor de IBAT es un inhibidor de IBAT de benzotiazepina. En otra realización preferida más, el inhibidor de IBAT es un inhibidor de IBAT de naftaleno.

Las realizaciones de la presente invención pueden comprender una terapia de combinación que usa dos o más de los compuestos terapéuticos descritos o incorporados en este documento. La terapia de combinación puede comprender dos o más compuestos terapéuticos de distintas clases químicas.

Las combinaciones terapéuticas pueden comprender más de dos compuestos terapéuticos. Por ejemplo, la terapia puede comprender dos o más compuestos terapéuticos de la misma clase química, por ejemplo, una terapia de combinación que comprende dos o más inhibidores de IBAT.

Una realización adicional de la presente invención comprende el uso de cualquiera de las terapias de combinación cardiovasculares descritas en este documento para la profilaxis o tratamiento de la hipercolesterolemia o la aterosclerosis.

Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar diversos aspectos de la presente invención.

En las combinaciones de la presente invención puede usarse cualquiera de los compuestos inhibidores de MTP descritos por Wetterau et al. (Id.), comprendiendo la combinación una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon y una segunda cantidad de un inhibidor de MTP, donde la primera y la segunda cantidades juntas comprenden una cantidad eficaz anti-hiperlipidémica, una cantidad eficaz anti-aterosclerótica, una cantidad eficaz anti-hipercolesterolémica, o una cantidad eficaz anti-hipertensiva de los compuestos. El inhibidor de IBAT en las realizaciones de esta invención es preferiblemente un inhibidor de IBAT de benzotiepina. En otra realización preferida, el inhibidor de IBAT es un inhibidor de IBAT de benzotiazepina. En otra realización preferida, el inhibidor de IBAT es un inhibidor de IBAT de naftaleno. El inhibidor de IBAT puede ser, sin limitación, uno cualquiera o una combinación de los compuestos indicados en la tabla 1.

En otra realización, la presente invención proporciona un método para la profilaxis o tratamiento de una afección o trastorno hiperlipidémico en un mamífero, que comprende administrar una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales, donde la primera cantidad y la segunda cantidad juntas comprenden una cantidad eficaz anti-hiperlipidémica, una cantidad eficaz anti-aterosclerótica o una cantidad eficaz anti-hipercolesterolémica de los compuestos.

En otra realización, la presente invención proporciona un kit para conseguir un efecto terapéutico en un mamífero, que comprende una cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon en una primera forma de dosificación unitaria; una cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales en una segunda forma de dosificación unitaria; y un recipiente para contener dicha primera y segunda formas de dosificación unitaria.

Ensayos biológicos

La utilidad de las combinaciones de la presente invención puede demostrarse mediante los siguientes ensayos. Estos ensayos se han realizado in vitro y en modelos animales usando esencialmente procedimientos reconocidos para demostrar la utilidad de la presente invención.

Se realizan ensayos con compuestos que no se incluyen en el alcance de las reivindicaciones con fines comparativos.

Ensayo in vitro de compuestos que inhiben la captación de [^{14}C]-taurocolato (TC) mediada por IBAT en células H14

Se siembran células de riñón de cría de hámster (BHK) transfectadas con el ADNc de IBAT humano (células H14) a 60.000 células/pocillo en placas de cultivo de tejidos Top-Count de 96 pocillos para los ensayos realizados en las 24 horas posteriores a la siembra, a 30.000 células/pocillo para los ensayos realizados a las 48 horas y a 10.000 células/pocillo para los ensayos realizados a las 72 horas.

En el día del ensayo, la monocapa celular se lava suavemente una vez con 100 \mul de tampón de ensayo (medio de Eagle Modificado de Dulbecco con 4,5 g/l de glucosa + 0,2% (p/v) de albúmina de suero bovino sin ácidos grasos ((FAF)BSA). Se añaden a cada pocillo 50 \mul de un concentrado de dos veces de compuesto de ensayo en tampón de ensayo junto con 50 \mul de [^{14}C]-taurocolato 6 \muM en tampón de ensayo (concentración final de [^{14}C]-taurocolato 3 \muM). Las placas de cultivo de células se incuban durante 2 horas a 37ºC antes de lavar suavemente cada pocillo dos veces con 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) a 4ºC que contiene (FAF)BSA al 0,2% (p/v). Después, los pocillos se lavan suavemente una vez con 100 \mul de PBS a 4ºC sin (FAF)BSA. A cada uno se le añaden 200 \mul de fluido de recuento de centelleo líquido, las placas se sellan por calor y se agitan durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de medir la cantidad de radiactividad en cada pocillo con un instrumento Packard Top-Count.

Ensayo in vitro de compuestos que inhiben la captación de [^{14}C]-alanina

El ensayo de captación de alanina puede realizarse de forma idéntica al ensayo de taurocolato, con la excepción de que el taurocolato marcado se substituye por la alanina marcada.

Ensayo in vivo de compuestos que inhiben la captación de [^{14}C]-taurocolato de íleon de ratas en bilis

(Véase, "Metabolism of 3\alpha,7\beta-dihydroxy-7\alpha-methyl-5\beta-cholanoic acid and 3\alpha,7\beta-dihidroxy-7\alpha-methyl-5\beta-cholanoic acid in hamsters" en Biochimica et Biophysica Acta, 833, 196-202 (1985) de Une et al.).

Se anestesian ratas wistar macho (200-300 g) con inactina a 100 mg/kg. Los conductos biliares se canulan con un tubo de PE10 de 10 pulgadas (25,4 cm) de longitud. El intestino delgado se expone y se extiende sobre una gasa. Una cánula (cierre luer 1/8'', adaptador hembra afilado) se inserta a 12 cm de la unión del intestino delgado y el ciego. Se realiza un corte a 4 cm de esta misma unión (utilizando una longitud de íleon de 8 cm). Se usan 20 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco caliente, pH 6,5 (PBS) para aclarar el segmento de intestino. La abertura distal se canula con una longitud de 20 cm de tubo de silicona (0,02'' D.I. x 0,037''D.E.) (0,05 cm D.I. x 0,09 cm D.E.). La cánula proximal se acopla a una bomba peristáltica y el intestino se lava durante 20 minutos con PBS caliente a 0,25 ml/min. La temperatura del segmento de intestino se controla continuamente. Al inicio del experimento, se introducen 2,0 ml de muestra de control ([^{14}C]-taurocolato a 0,05 mCi/ml con taurocolato no radiomarcado 5 mM) en el segmento de intestino con una jeringa de 3 ml y se comienza la recogida de muestras de bilis. La muestra de control se infunde a una velocidad de 0,25 ml/min durante 21 minutos. Se recogerán fracciones de muestras de bilis cada 3 minutos durante los primeros 27 minutos del procedimiento. Después de 21 minutos de infusión de muestra, el bucle de íleon se lava con 20 ml de PBS caliente (usando una jeringa de 30 ml), y después el bucle se lava con PBS caliente durante 21 minutos a 0,25 ml/min. Se inicia una segunda perfusión como se ha descrito anteriormente pero administrando también el compuesto de ensayo (21 min. de administración seguidos de 21 min. de lavado) y recogiendo muestras de bilis cada 3 minutos durante los primeros 27 minutos. Si es necesario, se realizará una tercera perfusión como se ha descrito anteriormente, que contiene típicamente la muestra de control.

Medición de la concentración de colesterol hepático (COL HEPÁTICO)

Se pesa tejido hepático y se homogeneiza en cloroformo:metanol (2:1). Después de la homogeneización y centrifugación, el sobrenadante se separa y se seca en una atmósfera de nitrógeno. El residuo se disuelve en isopropanol y el contenido de colesterol se mide enzimáticamente, usando una combinación de colesterol oxidasa y peroxidasa, como se describe en Allain, C.A. et al., Clin. Chem., 20, 470 (1974).

Determinación de colesterol en suero, (COL SER., HDL-COL, TGI y VLDL + LDL)

El colesterol total en suero (COL SER.) se mide enzimáticamente usando un kit comercial de Wako Fine Chemicals (Richmond, VA); Cholesterol C11, Nº de catálogo 276-64909. El colesterol HDL (HDL-COL) se ensaya usando este mismo kit después de la precipitación del colesterol VLDL y LDL con reactivo de colesterol HDL de Sigma Chemical Co., Nº de Catálogo 352-3 (método de sulfato de dextrano). Los triglicéridos totales en suero (eliminados) (TGI) se ensayan enzimáticamente con Sigma Chemical Co. GPO-Trinder, Nº de Catálogo 337-B. Las concentraciones de colesterol VLDL y LDL (VLDL + LDL) se calculan como la diferencia entre el colesterol total y el colesterol HDL.

Medición de la actividad 7-\alpha-Hidroxilasa (7a-OHasa) de colesterol hepático

Se preparan microsomas hepáticos homogeneizando muestras de hígado en tampón fosfato/sacarosa, seguido de separación por centrifugación. El material sedimentado final se resuspende en tampón y se analiza la actividad colesterol 7-\alpha-hidroxilasa en una alícuota por incubación durante 5 minutos a 37ºC en presencia de NADPH. Después de la extracción en éter de petróleo, el disolvente orgánico se evapora y el residuo se disuelve en acetonitrilo/metanol. El producto enzimático se separa inyectando una alícuota del extracto en una columna de HPLC de fase inversa C_{18} y cuantificando el material eluido usando detección UV a 240 nm. (Referencia: Horton, J.D., et al. (1994) J. Clin. Invest. 93, 2084).

Ensayo de sonda en ratas

Se administran inhibidores de IBAT a ratas Wister macho (275-300 g) usando un procedimiento de sonda oral. Se administra el fármaco o vehículo (TWEEN 80 al 0,2% en agua) una vez al día (9:00 - 10:00 a.m.) durante 4 días a diversas dosificaciones a un volumen final de 2 ml por kilogramo de peso corporal. (TWEEN 80 es un tensioactivo de monooleato de polioxietileno sorbitán 20 molar fabricado por ICI Specialty Chemicals, Wilmington, Delaware, U.S.A.). Se recogen muestras fecales totales durante las 48 horas finales del período de tratamiento y se analiza el contenido de ácidos biliares usando un ensayo enzimático como el descrito más adelante. La eficacia del compuesto se determinará comparando el aumento de la concentración de ácidos biliares fecales (FBA) en las ratas tratadas con la concentración media de FBA de las ratas del grupo de vehículo.

Medición de la concentración de ácidos biliares fecales (FBA)

Se recogen todas las heces de ratas encerradas individualmente durante 24 o 48 horas, se secan con una corriente de nitrógeno, se pulverizan y se pesan. Se pesan aproximadamente 0,1 gramos y se extraen en un disolvente orgánico (butanol/agua). Después de la separación y del secado, el residuo se disuelve en metanol y la cantidad de ácido biliar presente se mide enzimáticamente usando la reacción de la 3\alpha-hidroxiesteroide esteroide deshidrogenasa con ácidos biliares para reducir el NAD. (véase Mashige, F. et al. Clin. Chem., 27, 1352 (1981)).

Captación de [^{3}H]-taurocolato en vesículas de membrana de borde en cepillo de conejo (BBMV)

Se preparan membranas de borde de cepillo de íleon de conejo a partir de mucosa de íleon congelada por el método de precipitación de calcio descrito por Malathi et al., (Biochimica Biophysica Acta, 554, 259 (1979). El método para medir el taurocolato es esencialmente el descrito por Kramer et al., (Biochimica Biophysica Acta, 1111, 93 (1992)) con la excepción de que el volumen de ensayo será de 200 \mul en lugar de 100 \mul. En resumen, se incuba a temperatura ambiente una solución de 190 \mul que contiene [^{3}H]-taurocolato 2 \muM (0,75 \muCi), tris 20 mM, NaCl 100 mM y manitol pH 7,4 100 mM, durante 5 segundos con 10 \mul de vesículas de membrana de borde en cepillo (60-120 \mug de proteína). La incubación se inicia por adición de las BBMV mientras se agita vorticialmente y la reacción se detiene por adición de 5 ml de tampón enfriado con hielo (Hepes-tris 20 mM, KCl 150 mM) seguido inmediatamente de filtración a través de un filtro de nylon (poros de 0,2 \mum) y un lavado adicional de 5 ml con tampón de detención.

Acil-Coa; colesterol acil transferasa (ACAT)

Se preparan microsomas de hígado de hámster y de intestino de ratas a partir de tejido como se ha descrito previamente (J. Biol. Chem., 255, 9098 (1980)) y se usan como fuente de enzima ACAT. El ensayo consta de una incubación de 2,0 ml que contiene oleoil-CoA 24 \muM (0,05 \muCi) en un tampón de fosfato sódico 50 mM, DTT 2 mM a pH 7,4 2mM que contiene BSA al 0,25% y 200 \mug de proteína microsomal. El ensayo se inicia por adición de oleoil-CoA. La reacción se continúa durante 5 minutos a 37ºC y se termina por adición de 8,0 ml de cloroformo/metanol (2:1). A la extracción se le añaden 125 \mug de oleato de colesterol en cloroformo metanol para actuar como vehículo y las fases acuosa y orgánica de la extracción se separan por centrifugación después de agitar vorticialmente. La fase de cloroformo se lleva a sequedad y se aplica puntualmente en una placa de TLC de gel de sílice 60 y se revela en hexano/éter etílico (9:1). La cantidad de colesterol éster formado se determina midiendo la cantidad de radiactividad incorporada en la mancha de oleato de colesterol en la placa de TLC con un Packard Instaimager.

Modelo en perros para evaluar fármacos reductores de lípidos

Un grupo de perros beagle machos, obtenidos de un distribuidor tal como Marshall, con un peso de 6-12 kg se alimentan una vez al día durante 2 horas y reciben agua ad libitum. Los perros se pueden asignar aleatoriamente a grupos de dosificación que constan de 6 a 12 perros cada uno, tales como: vehículo, i.g.; 1 mg/kg, i.g.; 2 mg/kg, i.g.; 4 mg/kg, i.g.; 2 mg/kg, p.o. (polvo en cápsula). La dosificación intragástrica de un material terapéutico disuelto en solución acuosa (por ejemplo, solución de Tween 80 [mono-oleato de polioxietileno, Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO] al 0,2%) puede realizarse usando un tubo de sonda. Antes de iniciar la dosificación, se pueden extraer muestras de sangre de la vena cefálica por la mañana antes de la comida, para evaluar el colesterol en suero (total y HDL) y los triglicéridos. Durante varios días consecutivos, los animales reciben la dosificación por la mañana, antes de la comida. Se deja que los animales coman durante 2 horas antes de retirar cualquier resto de comida. Se recogen las heces durante un período de 2 días al final del estudio y se analiza el contenido de ácidos biliares o de lípidos. También se toman muestras de sangre al final del período de tratamiento, para comparar los niveles obtenidos con los niveles de lípidos en suero anteriores al estudio. El significado estadístico se determinará usando el ensayo convencional de T de Student con p<0,05.

\newpage

Medición de lípidos en suero de perros

Se recoge sangre de la vena cefálica de perros en ayunas en tubos separadores de suero (Vacutainer SST, Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ). La sangre se centrifuga a 2000 rpm durante 20 minutos y el suero se decanta.

El colesterol total se puede medir en un formato de 96 pocillos usando un kit de diagnóstico enzimático Wako (Cholesterol CII) (Wako Chemicals, Richmond, VA), utilizando la reacción de la colesterol oxidasa para producir peróxido de hidrógeno, que se mide colorimétricamente. Se prepara una curva patrón a partir de 0,5 a 10 \mug de colesterol en las primeras 2 columnas de la placa. Las muestras de suero (20-40 \mul, dependiendo de la concentración de lípidos esperada) o muestras conocidas de suero de control se añaden a pocillos distintos por duplicado. Se añade agua para obtener un volumen de 100 \mul en cada pocillo. Se añade una alícuota de 100 \mul de reactivo de color a cada pocillo y las placas se leen a 500 nm después de una incubación de 15 minutos a 37 grados centígrados.

El colesterol HDL puede ensayarse usando el kit de Sigma Nº 352-3 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) que utiliza sulfato de dextrano e iones de Mg para precipitar selectivamente las LDL y VLDL. Se añade un volumen de 150 \mul de cada muestra de suero a tubos de microcentrífuga individuales, seguido de 15 \mul de reactivo de colesterol HDL (Sigma 352-3). Las muestras se mezclan y se centrifugan a 5000 rpm durante 5 minutos. Después, se mezcla una fracción de 50 \mul del sobrenadante con 200 \mul de solución salina y se ensaya usando el mismo procedimiento que para la medición del colesterol total.

Los triglicéridos se miden usando el kit de Sigma Nº 337 en un formato de placa de 96 pocillos. Este procedimiento mide el glicerol, después de su liberación por reacción de los triglicéridos con la lipoproteína lipasa. Se usan soluciones patrón de glicerol (Sigma 339-11) que varían de 1 a 24 \mug para generar la curva patrón. Se añaden muestras de suero (20-40 \mul, dependiendo de la concentración de lípidos esperada) a los pocillos por duplicado. Se añade agua para llevar el volumen a 100 \mul en cada pocillo y también se añaden 100 \mul de reactivo de color a cada pocillo. Después de mezcla y de una incubación de 15 minutos, las placas se leen a 540 nm y se calculan los valores de los triglicéridos a partir de la curva patrón. También se realiza una placa replicada usando un reactivo enzimático blanco para realizar las correcciones con respecto a cualquier glicerol endógeno en las muestras de suero.

Medición de ácidos biliares fecales en perros

Se pueden recoger muestras fecales para determinar la concentración de ácidos biliares fecales (FBA) para cada animal. La recogida de heces puede realizarse durante las 48 horas finales del estudio, durante dos períodos consecutivos de 24 horas entre las 9:00 am y las 10:00 am de cada día, antes de la dosificación y de la comida. Las recolecciones de dos días distintos de cada animal se pesan, se combinan y se homogeneizan con agua destilada en un procesador (Cuisinart) para generar una suspensión homogénea. Se extraen aproximadamente 1,4 g del homogeneizado en una concentración final de butanol terciario al 50%/agua destilada (2:0,6) durante 45 minutos en un baño de agua a 37ºC y se centrifugan durante 13 minutos a 2000 x g. La concentración de ácidos biliares (mmoles/día) puede determinarse usando un sistema de ensayo enzimático de 96 pocillos (1,2). Se añade una alícuota de 20 \mul del extracto fecal a dos conjuntos de pocillos triplicados en una placa de ensayo de 96 pocillos. También se analizan una solución estandarizada de taurocolato sódico y una solución estandarizada de extracto fecal (preparada previamente a partir de muestras reunidas y caracterizada por su concentración de ácidos biliares) para el control de calidad del ensayo. De forma similar, se añaden alícuotas de veinte microlitros de taurocolato sódico, diluidas en serie para generar una curva patrón, a dos conjuntos de pocillos triplicados. Se añade una mezcla de reacción de 230 \mul que contiene hidrato de hidrazina 1 M, pirofosfato 0,1 M y NAD a 0,46 mg/ml a cada pocillo. Después, a una de las dos series de triplicados se le añade una alícuota de 50 \mul de enzima 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD; 0,8 unidades/ml) o tampón de ensayo (pirofosfato sódico 0,1 M). Todos los reactivos pueden obtenerse a partir de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Después de 60 minutos de incubación a temperatura ambiente, se mide la densidad óptica a 340 nm y se calcula la media de cada conjunto de muestras triplicadas. La diferencia en densidad óptica \pm enzima HSD se usa para determinar la concentración de ácidos biliares (mM) de cada muestra basándose en la curva patrón de taurocolato sódico. La concentración de ácidos biliares del extracto, el peso del homogeneizado fecal (gramos) y el peso corporal del animal se usan para calcular la correspondiente concentración de FBA en mmoles/kg/día para cada animal. La concentración de FBA media (mmoles/kg/día) del grupo de vehículo se resta de la concentración de FBA de cada grupo de tratamiento para determinar el aumento (valor delta) en la concentración de FBA como resultado del tratamiento.

Saponificación y extracción de esteroles neutros en heces de hámster

Generalmente, una muestra de heces secas de los animales se saponifican directamente con KOH 0,3 N/metanol durante 1 hora. Después de la saponificación, las muestras se filtran para retirar la materia sólida. Las muestras se extraen dos veces con éter de petróleo, y los extractos se combinan y se evaporan a sequedad con calentamiento en una corriente de gas nitrógeno. La muestra se puede analizar con un Hewlett Packard Modelo 6890 GC con un automuestreador usando de una columna capilar de 50 metros HP-5 Ultra 2, con un espesor de película de 0,33 \mum, 0,23 ID, relación de división 100:1, y un detector FID.

Para la preparación de las muestras saponificadas, cada muestra de 0,25 gramos de heces secas en polvo se transfiere a un tubo etiquetado de 20 x 150 milímetros con tapa a rosca. Se añaden a los tubos tres mililitros de KOH 0,3 N/MeOH (7,5 ml de KOH 8 N (45%) qs 200 ml con metanol de calidad de HPLC) y 25 microlitros de 20 mg/ml de 5-alfa colestano como patrón interno. Los tubos se tapan fuertemente y se agitan vorticialmente. Los tubos se ponen en un bloque de calentamiento Reacti-Therm en una campana y se calientan a 70ºC durante una hora con mezcla intermitente.

Para la preparación de patrones saponificados, cada solución madre de patrón se mezcla con 3 mililitros de KOH 0,3N/MeOH 0,3 N y 25 microlitros de 5-alfa colestano. Los patrones se tapan, se calientan durante una hora a 70ºC y se extraen. El patrón 1 incluirá una combinación de 40 microlitros de solución madre de 20 mg/ml de cada uno de los siguientes: estigmasterol, coprostanol y beta-sitosterol. El patrón 2 será una combinación de un microlitro de colesterol a 20 mg/ml (0,04 \mug/\mul) y 5 microlitros de sitostanol a 20 mg/ml (0,2 \mug/\mul). El patrón 3 será una combinación de 40 microlitros de colesterol a 20 mg/ml (1,6 \mug/\mul) y 200 microlitros de sitostanol a 20 mg/ml (8,0 \mug/\mul).

Para la preparación de patrones no saponificados, los patrones se introducen por medio de una pipeta en viales-V de un mililitro y se añaden 25 microlitros de 5-alfa colestano. Los patrones se evaporan a sequedad en el bloque de calentamiento Reacti-Therm, se retiran del bloque y se dejan enfriar. Se añade cloruro de metileno (500 \mul). Los extractos se mezclan y se filtran a través de filtros Whatman Anatop. El patrón 1 incluirá la combinación de 40 microlitros de soluciones madre a una concentración de 20 ml/ml de estigmasterol, coprostanol y beta-sitosterol. El patrón 2 incluirá la combinación de 5 microlitros de colesterol a 20 mg/ml (0,2 \mug/\mul) y 25 microlitros de sitostanol a 20 mg/ml (1,0 \mug/\mul). El patrón 3 incluirá la combinación de 20 microlitros de colesterol a 20 mg/ml (0,8 \mug/\mul) y 100 microlitros de sitostanol a 20 mg/ml (4,0 \mug/\mul). El patrón 4 incluirá la combinación de 80 microlitros de colesterol a 20 mg/ml (3,2 \mug/\mul) y 300 microlitros de sitostanol a 20 mg/ml (12,0 \mug/\mul).

Todos los tubos se retiran de los bloques de calentamiento y se enfrían. Cada muestra saponificada y patrón se filtra a través de un Dispositivo de Filtrado sin Jeringa Autovial Whatman, con membrana de 0,45 \mum de PTFE (Teflon). Cada tubo se lava con 10 ml de éter de petróleo, se agita vorticialmente y se combina en el dispositivo de filtrado. El émbolo se empuja para recoger la muestra en un tubo de vidrio limpio de 50 ml. Se añade más éter de petróleo (10 ml) a la muestra en el tubo de 50 ml junto con 2 ml de agua. Cada muestra se agita vorticialmente a una velocidad moderada (mezclar demasiado rápido hará que se formen emulsiones) durante 20 segundos. Después de separar las capas, se retiran 2 x 7 ml de la fase de éter de petróleo y se transfieren a tubos de vidrio de 16 x 125 ml. Las muestras se extraen una vez más con adición de 10 ml de éter de petróleo y se retiran 8 ml, combinando los extractos de cada muestra. Todos los tubos se evaporan a sequedad en una corriente de gas nitrógeno a 70ºC. El residuo de cada muestra se transfiere cuantitativamente a viales cónicos de vidrio de 1,5 ml usando lavados de 3 x 0,5 ml de éter de petróleo. Las muestras se evaporan una vez más a sequedad. Después de que los viales se enfríen a temperatura ambiente, se añaden 500 microlitros de cloruro de metileno. Todas las muestras y los patrones se filtran a través de filtros con jeringa (0,2 \mum, 10 mm) Whatman Anotop 10 Plus. Se recoge suficiente filtrado (aproximadamente 300 microlitros) en microtubos de muestra de GC con pie. Los microtubos con pie se colocan en viales con cierre a rosca y se cierran fuertemente. Los análisis se realizarán por el procedimiento de GC de Hewlett Packard.

Análisis de actividad CETP en plasma humano (colesteril éster tritiado)

Se obtiene sangre de voluntarios sanos. La sangre se recoge en tubos que contienen EDTA (grupo de EDTA-plasma). El grupo de EDTA-plasma humano previamente almacenado a -20ºC se descongela a temperatura ambiente, y se centrifuga durante 5 minutos para retirar cualquier material particulado. Al plasma se le añade HDL tritiado, radiomarcado en el resto de colesteril éster ([^{3}H]CE-HDL) como se describe por Morton y Zilversmit (J. Biol. Chem., 256, 11992-95 (1981)), a una concentración final de (25 \mug/ml de colesterol). Los compuestos inhibidores se añaden al plasma como se indica a continuación: se añaden volúmenes iguales del plasma que contiene [^{3}H]-CE-HDL (396 \mul) por medio de una pipeta en microtubos (Titertube®, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Los compuestos, normalmente disueltos como soluciones madre 20-50 mM en DMSO, se diluyen en serie en DMSO (o un disolvente alternativo en algunos casos, tal como dimetilformamida o etanol). Después se añaden cuatro \mul de cada una de las diluciones en serie de compuestos inhibidores o de DMSO solo a cada uno de los tubos de plasma. Los tubos se mezclan inmediatamente. Después se transfieren alícuotas triplicadas (100 \mul) de cada tubo de plasma a pocillos de placas de microtitulación de poliestireno de fondo redondo de 96 pocillos (Corning, Corning, NY). Las placas se cierran herméticamente con película de plástico y se incuban a 37ºC durante 4 horas. Los pocillos de ensayo contienen plasma con diluciones de compuestos inhibidores. Los pocillos de control contienen plasma con DMSO solo. Los pocillos blanco contienen plasma con DMSO solo que se dejan en los microtubos a 4ºC durante la incubación de 4 horas y se añaden a los pocillos de microtitulación al final del período de incubación. Las VLDL y LDL se precipitan por la adición de 10 \mul de reactivo de precipitación (sulfato de dextrano al 1% (p/v) (Dextralip 50)/cloruro de magnesio 0,5 M, pH 7,4) a todos los pocillos. Los pocillos se mezclan en un mezclador de placas y después se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después, las placas se centrifugan a 1000 x g durante 30 minutos a 10ºC. Después, los sobrenadantes (50 \mul) de cada pocillo se transfieren a placas de 96 pocillos PicoPlate^{TM} (Packard, Meriden, CT) que contienen 250:1 Microscint^{TM}-40 (Packard, Meriden, CT). Las placas se sellan por calor (TopSeal^{TM}-P, Packard, Meriden, CT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se mezclan durante 30 minutos. La radioactividad se mide en un contador de centelleo de microplacas (TopCount, Packard,
Meriden, CT). Los valores de IC_{50} se determinan como la concentración de compuesto inhibidor que inhibe la transferencia de [^{3}H]CE del sobrenadante [^{3}H]CE-HDL a las VLDL y LDL precipitadas en un 50% en comparación con la transferencia obtenida en los pocillos de control. El porcentaje máximo de transferencia (en los pocillos de control) se determina usando la siguiente ecuación:

% de Transferencia =\frac{[dpm_{blanco} - dpm_{control}] \ x \ 100}{dpm_{blanco}}

El porcentaje de transferencia de control determinado en los pocillos que contienen compuestos inhibidores se determina como se indica a continuación:

% de Control =\frac{[dpm_{blanco} - dpm_{ensayo}] \ x \ 100}{dpm_{blanco} - dpm_{control}}

Los valores de IC_{50} se calculan a partir de gráficos de porcentaje de control frente a concentración de compuesto inhibidor.

Actividad CETP in vitro

La capacidad de los compuestos para inhibir la actividad CETP se evalúa usando un ensayo in vitro que mide la velocidad de transferencia de colesteril éster radiomarcado ([^{3}H]CE) desde partículas donadoras de HDL a partículas aceptoras de LDL. Los detalles del ensayo se proporcionan en Glenn et al. (Glenn and Melton, "Quantification of Cholesteryl Ester Transfer Protein (CETP): A) CETP Activity and B) Immunochemical Assay of CETP Protein," Meth. Enzymol., 263, 339-351 (1996)). La CETP se puede obtener a partir del medio acondicionado sin suero de células CHO transfectadas con un ADNc de CETP (Wang, S. et al. J. Biol. Chem. 267, 17487-17490 (1992)). Para medir la actividad CETP, se incuban HDL marcadas con [^{3}H]CE, LDL, CETP y tampón de ensayo (tris(hidroximetil)aminometano 50 mM, pH 7,4; cloruro sódico 150 mM; ácido etilendiamina-tetraacético 2 mM; y albúmina de suero bovino al 1%) en un volumen de 200 \mul, durante 2 horas a 37ºC en placas de 96 pocillos. Las LDL se precipitan diferencialmente añadiendo 50 \mul de sulfato de dextrano al 1% (p/v)/cloruro de magnesio 0,5M, mezclando vorticialmente, e incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos. La solución (200 \mul) se transfiere a una placa de filtro (Millipore). Después de la filtración, la radiactividad presente en las LDL precipitadas se mide por recuento de centelleo líquido. La corrección de la transferencia o precipitación no específica se realiza incluyendo muestras que no contienen CETP. La velocidad de transferencia de [^{3}H]CE usando este ensayo es lineal con respecto al tiempo y a la concentración de CETP, hasta el 25-30% de [^{3}H]CE transferido.

La potencia de los compuestos de ensayo puede determinarse realizando el ensayo descrito anteriormente en presencia de concentraciones variables de los compuestos de ensayo y determinando la concentración que se requiere para una inhibición del 50% de la transferencia de [^{3}H]CE desde las HDL a las LDL. Este valor se define como IC_{50}. Los valores de IC_{50} determinados en este ensayo serán precisos cuando el valor de IC_{50} sea mayor que 10 nM. En caso de que los compuestos tengan mayor potencia inhibidora, las medidas precisas de la IC_{50}pueden determinarse usando tiempos de incubación más largos (de hasta 18 horas) y menores concentraciones finales de CETP (< 50 nM).

Inhibición de la actividad CETP in vivo

La inhibición de la actividad CETP por un compuesto de ensayo se puede determinar administrando el compuesto a un animal por inyección intravenosa o sonda oral, midiendo la cantidad de transferencia de colesteril éster marcado con tritio ([^{3}H]CE) desde partículas de HDL a partículas de VLDL y LDL, y comparando esta cantidad de transferencia con la cantidad de transferencia observada en los animales de control.

Se mantienen hámsteres sirios macho de color dorado con una dieta de pienso que contiene colesterol al 0,24% durante al menos dos semanas antes del estudio. Los animales que reciben la dosificación intravenosa, inmediatamente antes del experimento, se anestesian con pentobarbital. La anestesia se mantiene a lo largo de todo el experimento. Se insertan catéteres en la vena yugular y en la arteria carótida. Al inicio del experimento, todos los animales reciben 0,2 ml de una solución que contiene [^{3}H]CE-HDL en la vena yugular. [^{3}H]CE-HDL es una preparación de HDL humanas que contienen colesteril éster marcado con tritio, y se prepara de acuerdo con el método de Glenn et al. (Meth. Enzymol., 263, 339-351 (1996)). El compuesto de ensayo se disuelve como una solución madre 80 mM en vehículo (etanol al 2%: PEG 400 al 98%, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA) y se administra por inyección en embolada o por infusión continua. Dos minutos después de administrar la dosis [^{3}H]CE-HDL, los animales reciben 0,1 ml de la solución de ensayo inyectada en la vena yugular. Los animales de control reciben 0,1 ml de solución del vehículo intravenosa sin compuesto de ensayo. Después de 5 minutos, se extraen las primeras muestras de sangre (0,5 ml) de la arteria carótida y se recogen en tubos microtainer convencionales que contienen ácido etilendiamina tetraacético. Se inyecta solución salina (0,5 ml) para lavar el catéter y reemplazar el volumen de sangre. Posteriormente, se toman muestras de sangre a las dos y a las cuatro horas por el mismo método. Las muestras de sangre se mezclan bien y se mantienen en hielo hasta que se completa el experimento. Se obtiene plasma por centrifugación de las muestras de sangre a 4ºC. El plasma (50 \mul) se trata con 5 \mul de reactivo de precipitación (sulfato de dextrano, 10 g/l; cloruro de magnesio 0,5 M) para eliminar las VLDL/LDL. Después de la centrifugación, se analiza la radioactividad del sobrenadante resultante (25 \mul) que contiene las HDL usando un contador de centelleo líquido.

El porcentaje de [^{3}H]CE transferido desde las HDL a las LDL y VLDL (% de transferencia) se calcula basándose en la radiactividad total en muestras de plasma equivalentes antes de la precipitación. Típicamente, la cantidad de transferencia desde las HDL a las LDL y VLDL en los animales de control será del 20% al 35% después de 4 horas.

Como alternativa, los animales conscientes no anestesiados pueden recibir una dosis por sonda oral de compuesto de ensayo en forma de suspensión en metilcelulosa al 0,1% en agua. En un momento determinado para cada compuesto en el que los niveles en plasma de la substancia de ensayo alcanzan su punto máximo (C_{max}) después de la dosificación oral, los animales se anestesian con pentobarbital y después se reciben 0,2 ml de una solución que contiene

\hbox{[ ^{3} H]CE-HDL}

en la vena yugular como se ha descrito anteriormente. Los animales de control reciben 0,25 ml de la solución de vehículo sin compuesto de ensayo por sonda oral. Después de 4 horas, los animales se sacrifican, se toman muestras de sangre y se analiza el porcentaje de [^{3}H]CE transferido desde las HDL a las LDL y VLDL (% de transferencia) como se ha descrito anteriormente.

Como alternativa, la inhibición de la actividad CETP de un compuesto de ensayo se puede determinar administrando el compuesto a ratones que se han seleccionado para la expresión de CETP humana (hCETP) por manipulación transgénica (ratones hCETP). Los compuestos de ensayo se pueden administrar mediante inyección intravenosa o por sonda oral, y se calcula la cantidad de transferencia de colesteril éster marcado con tritio ([^{3}H]CE) desde las partículas de HDL a las partículas de VLDL y LDL, y se compara con la cantidad de transferencia observada en los animales de control. Los ratones C57B1/6 que son homocigotos para el gen hCETP se mantienen con una dieta de pienso de alto contenido de grasa, tal como TD 88051, como se ha descrito en Nishina et al. (J. Lipid Res., 31, 859-869 (1990)) durante al menos dos semanas antes del estudio. Los ratones reciben una dosis por sonda oral de compuesto de ensayo como una suspensión en metilcelulosa al 0,1% en agua o una inyección intravenosa en embolada de compuesto de ensayo en etanol al 10% y polietilenglicol al 90%. Los animales de control reciben la solución de vehículo sin compuesto de ensayo mediante sonda oral o por inyección intravenosa en embolada. Al inicio del experimento, todos los animales reciben 0,05 ml de una solución que contiene [^{3}H]CE-HDL en la vena de la cola. [^{3}H]CE-HDL será una preparación de HDL humanas que contienen colesteril éster marcado con tritio, y se prepara de acuerdo con el método de Glenn et al. (Meth. Enzymol., 263, 339-351 (1996)). Después de 30 minutos, los animales se desangran y la sangre se recoge en tubos microtainer convencionales que contienen ácido etilendiamina tetraacético. Las muestras de sangre se mezclan bien y se mantienen en hielo hasta que se completa el experimento. El plasma se obtiene por centrifugación de las muestras de sangre a 4ºC. El plasma se separa y se analiza por cromatografía de exclusión molecular y se calcula la proporción relativa de [^{3}H]CE en las regiones de VLDL, LDL y HDL.

El porcentaje de [^{3}H]CE transferido desde las HDL a las LDL y VLDL (% de transferencia) se calcula basándose en la radiactividad total en muestras de plasma equivalentes antes de la precipitación. Típicamente, la cantidad de transferencia desde las HDL a las LDL y VLDL en animales de control será del 20% al 35% después de 30 minutos.

Ensayo de absorción intestinal de colesterol

Se ha demostrado que una diversidad de compuestos inhiben la absorción del colesterol en el tracto intestinal. Estos compuestos reducen los niveles de colesterol en el suero reduciendo la absorción intestinal tanto del colesterol de origen exógeno (colesterol de la dieta) como del colesterol endógeno (secretado por la vesícula biliar en el tracto intestinal).

En los hámsteres, se ha refinado y evaluado el uso de un método de relación en plasma de isótopo dual para medir la absorción intestinal del colesterol como se describe por Turley et al. (J. Lipid Res. 35, 329-339 (1994), incorporado en este documento como referencia).

A hámsteres macho que pesan 80-100 g se les administran alimentos y agua ad libitum en una sala con períodos alternos de luz y oscuridad de 12 horas. A las cuatro horas del período de luz, a cada hámster se le administra primero una dosis intravenosa de 2,5 \muCi de [1,2-^{3}H] colesterol suspendido en Intralipid (20%) y después una dosis oral de

\hbox{[4- ^{14} C]colesterol}

en un aceite de triglicéridos de cadena media (MCT). La dosis i.v. se administra inyectando un volumen de 0,4 ml de la mezcla Intralipid en la vena femoral distal. La dosis oral se administra introduciendo un volumen de 0,6 ml de la mezcla de aceite MCT intragástricamente a través de un tubo de polietileno. Después de 72 horas, se toman muestras de sangre de los ratones y se calcula la cantidad de ^{3}H y ^{14}C en el plasma y en la cantidad original de marcador administrado mediante espectrometría de centelleo líquido. La absorción de colesterol se calcula basándose en la siguiente ecuación:

Porcentaje \ de \ colesterol \ absorbido =\frac{\text{% de dosis oral por ml de muestra de plasma de 72 horas}}{\text{% de dosis i.v. por ml de muestra de plasma de 72 horas}} \ x \ 100

Ensayo de proteína de transferencia de triglicéridos microsomales (MTP)

La MTP se puede purificar a partir de tejido hepático o de células cultivadas (por ejemplo, células HepG2) usando métodos convencionales como los descritos por Ohringer et al. (Acta Crystallogr. D52, 224-225 (1996)).

El análisis posterior de la actividad MTP puede realizarse como se describe en Jamil et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 11991-11995 (1996)).

La base de este ensayo es medir la transferencia de triglicéridos marcados desde una población de vesículas donadoras a una población de vesículas aceptoras en presencia de MTP. Los inhibidores de MTP pueden evaluarse añadiéndolos a la mezcla antes de la introducción de la MTP. Las vesículas donadoras se preparan por sonicación de una mezcla acuosa de fosfolípidos de huevo, cardiolipina, fosfolípidos marcados con ^{3}H y triglicéridos marcados con ^{14}C. Las vesículas aceptoras se preparan sonicando una mezcla acuosa de fosfolípidos de huevo. Las soluciones de vesículas se mezclan, con o sin añadir inhibidores de MTP, y se añade MTP para iniciar la reacción de transferencia. El ensayo se termina después de 60 minutos por adición de 0,5 ml de celulosa DE-52 seguido de centrifugación para sedimentar las moléculas donadoras. La cantidad de ^{3}H y ^{14}C en el sedimento y en la cantidad original de marcador en la mezcla se determina por espectrometría de centelleo líquido. La velocidad de transferencia de lípidos se calcula basándose en la cinética de primer orden usando la expresión:

[S] = [S]_{0} \ e^{-kt}

donde [S]_{0} y [S] son las fracciones de marcador ^{14}C en el sedimento de la membrana donadora a los tiempos 0 y t, respectivamente, y el término k es la fracción de marcador transferida por unidad de tiempo.

Ensayo de lípidos en plasma en conejos

Los lípidos en plasma se pueden ensayar usando métodos convencionales como los descritos en J.R. Schuh et al., J. Clin. Invest., 91, 1453-1458 (1993). Se ponen grupos de conejos blancos de Nueva Zelanda macho con una dieta convencional (100 g/día) suplementada con colesterol al 0,3% y aceite de maíz al 2% (Zeigler Bothers, Inc., Gardners, PA). Hay agua disponible ad lib. Los animales de los grupos de control y los animales tratados se sacrifican después de 1 y 3 meses de tratamiento. Los tejidos se retiran para caracterizar las lesiones ateroscleróticas. Se toman muestras de sangre para determinar las concentraciones de lípidos en plasma.

Lípidos en plasma

El análisis de lípidos en plasma se obtiene extrayendo sangre de la vena de la oreja en tubos que contienen EDTA (Vacutainer; Becton Dickenson & Co., Rutherford, NJ), seguido de separación de las células por centrifugación. El colesterol total se determina enzimáticamente, usando la reacción de la colesterol oxidasa (C.A. Allain et al., Clin. Chem., 20, 470-475 (1974). El colesterol HDL también se mide enzimáticamente, después de la precipitación selectiva de las LDL y VLDL mediante sulfato de dextrano con magnesio (G.R. Warnick et al., Clin. Chem., 28, 1379-1388 (1982)). Los niveles de triglicéridos en plasma se determinan midiendo la cantidad de glicerol liberada por la lipoproteína lipasa mediante un ensayo unido a enzimas (G. Bucolo et al., Clin. Chem., 19, 476-482 (1973)).

Aterosclerosis

Los animales se sacrifican por inyección de pentobarbital. Se retiran rápidamente las aortas torácicas, se fijan por inmersión en formalina tamponada neutra al 10%, y se tiñen con rojo oleoso O (al 0,3%). Después de una sola incisión longitudinal a lo largo de la pared opuesta a la ostia arterial, los vasos se abren para la evaluación del área de placa. El porcentaje de cobertura de placa se determina a partir de los valores del área total examinada y el área teñida, mediante un análisis de umbral usando un analizador de imágenes de color verdadero (Videometric 150; American Innovision, Incl, San Diego, CA) conectado a una cámara de color (Toshiba 3CCD) montada sobre un microscopio de disección. El colesterol del tejido se mide enzimáticamente como se ha descrito, después de la extracción con una mezcla de cloroformo/metanol (2:1) de acuerdo con el método de Folch et al. (J. Biol. Chem., 226, 497-509 (1957)).

Respuesta vascular in vitro

Las aortas abdominales se escinden rápidamente, después de una inyección de pentobarbital sódico, y se ponen en tampón de solución de Krebs oxigenada-bicarbonato. Después de retirar el tejido perivascular, se cortan segmentos anulares de 3 mm, se ponen en un baño de músculo a 37ºC que contiene solución de Krebs-bicarbonato y se suspenden entre dos alambres de acero inoxidable, uno de los cuales se ha unido a un transductor de fuerza (Grass Instrument Co., Quincy, MA). Los cambios de fuerza en respuesta a la angiotensina II añadida al baño se registrarán en una registrador de gráficos.

Modelo de hipertensión renal en ratas

Con fines comparativos, se puede evaluar la actividad reductora de la presión sanguínea de una terapia de combinación de un agente antihipertensivo y un inhibidor del transporte del ácidos biliares en el íleon en ratas con hipertensión con la arteria renal ligada, un modelo de hipertensión con altos niveles de renina. En este modelo, seis días después de la litigación de la arteria renal izquierda, tanto la actividad de la renina en plasma como la presión sanguínea se elevan significativamente (J.L. Cangiano et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 206, 310-313 (1979)). Se equipan ratas Sprague-Dawley con un transmisor por radiotelemetría de presión sanguínea para controlar continuamente la presión sanguínea. Las ratas se anestesian con una mezcla de ketamina-HCl (100 mg/kg) y maleato de acepromazina (2,2 mg/kg). La aorta abdominal se expone mediante una incisión en la línea media. Se colocan grapas microvasculares de la aorta distal a las arterias renales y la bifurcación ilíaca. La aorta se perfora con una aguja de calibre 22 y se introduce la punta de un catéter. El catéter, que se mantiene en su sitio por una ligadura en el músculo psoas, se conecta a un transmisor por radiotelemetría de presión sanguínea (Mini-Mitter Co., Inc., Sunriver, OR). El transmisor se coloca en la cavidad peritoneal y se sutura al músculo abdominal al cerrar la incisión. Las ratas se encierran de forma individual sobre un receptor de radiotelemetría y se les proporciona pienso de rata y agua ad libitum. Se deja que las ratas se recuperen de la cirugía durante al menos cinco días. La presión arterial media y el ritmo cardíaco se miden en un registrador de datos apropiado, tal como un mini-ordenador. Los datos se muestrean cada 10 segundos a 200-500 Hz a intervalos de 2,5 a 10 minutos 24 horas al día. Después de recoger los datos de control durante 24 horas, la ratas se anestesian con metohexital (30 mg/kg, i.p.) con los suplementos necesarios. Se realiza una incisión abdominal en la línea media, de una longitud de aproximadamente 2 cm, para exponer el riñón izquierdo. La arteria renal se separa de la vena cerca de la aorta, con precaución de no tranatizar la vena. La arteria se liga completamente con seda estéril 4-O. La incisión se cierra suturando cuidadosamente la capa muscular y la piel. Seis días después, cuando la MAP típicamente se eleva en 50-70 mmHg, se administra un agente antihipertensivo o una combinación con uno o más agentes terapéuticos cardiovasculares mediante una sonda cada día durante aproximadamente 8 semanas. La dosificación de un solo fármaco se realiza usando 20 y 200 mg/kg/día del agente antihipertensivo (por ejemplo, eplerenona) y 1, 3, 10, 30 y 100 mg/kg/día del otro agente terapéutico cardiovascular. Las mezclas de fármacos se obtiene administrando una combinación de una dosis de 1, 3, 10, 30 ó 100 mg/kg/día del otro agente terapéutico cardiovascular con una dosis de 20 ó 200 mg/kg/día del agente antihipertensivo. La reducción de la presión sanguínea se controla mediante el sistema de radiotelemetría y las respuestas con los compuestos se comparan a la respuesta obtenida en los animales tratados con vehículo. Los niveles de sodio y potasio en plasma y orina se controlan como una medida de la eficacia del bloqueo de aldosterona. Se recogen muestras de orina durante una noche usando jaulas metabólicas para aislar las muestras. Las muestras de plasma se obtienen por cateterización venosa. El sodio y el potasio se miden por fotometría de llama. La fibrosis cardíaca se determina por mediciones histológicas y químicas de los corazones escindidos después de la fijación de perfusión. Los ventrículos izquierdo y derecho se pesan, se incluyen en bloques y se seccionan. Posteriormente, las secciones se marcan con rojo picrosirio y las áreas de colágeno teñido en rojo se cuantifican mediante análisis de imágenes computerizado. El vértice del corazón se digiere con ácido y la hidroxiprolina libre se mide colorimétricamente. Es de esperar que la MAP se reduzca significativamente a presiones normales en los animales de ensayo tratados con la terapia de combinación y que se detenga o se evite la fibrosis de miocardio.

Efecto de un inhibidor de IBAT y un agente antihipertensivo, solos y en combinación, en el tratamiento de aterosclerosis

Este estudio comparativo será una evaluación prospectiva aleatoria del efecto de una combinación de un inhibidor de IBAT o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un agente antihipertensivo sobre la progresión/regresión de una enfermedad coronaria y de la arteria carótida. El estudio se usa para demostrar que una combinación de un inhibidor de IBAT o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un agente antihipertensivo es eficaz para ralentizar o detener la progresión o causar la regresión de una enfermedad de las arterias coronarias (CAD) existente, como se demuestra por los cambios en una angiografía de coronarias o por ultrasonidos en la carótida en sujetos con la enfermedad establecida.

Este estudió será una documentación angiográfica de la enfermedad de las arterias coronarias realizado como un ensayo doble ciego, controlado con placebo, de un mínimo de aproximadamente 500 sujetos y preferiblemente de aproximadamente 780 a aproximadamente 1200 sujetos. Se prefiere especialmente estudiar aproximadamente 1200 sujetos en este estudio. Los sujetos se admiten en el estudio después de satisfacer ciertos criterios de admisión descritos a continuación.

Criterios de admisión

Los sujetos admitidos en este ensayo deben satisfacer ciertos criterios. De esta forma, el sujeto debe ser un adulto, hombre o mujer, entre 18 y 80 años de edad, en el que esté indicada clínicamente una angiografía coronaria. Los sujetos tendrán una presencia angiográfica de una lesión focal significativa tal como de un 30% a 50% en una evaluación posterior mediante angiografía coronaria cuantitativa (QCA) en un mínimo de un segmento (vaso sin PTCA, sin bypass o sin MI) que se considere con poca probabilidad de requerir intervención en los próximos 3 años. Se requiere que no se haya interferido con los segmentos que se someten al análisis. Como la angioplastia cardíaca transluminal percutánea (PTCA) interfiere con los segmentos por la inserción de un catéter de globo, para el análisis se requieren segmentos sin PTCA. También se requiere que los segmentos a analizar no hayan sufrido un acontecimiento trombótico, tal como un infarto de miocardio (MI). De ahí el requisito de vasos sin MI. Los segmentos analizables incluyen: principal izquierdo, proximal, descendente anterior izquierdo medio y distal, primera y segunda ramificación diagonal, circunflejo izquierdo proximal y distal, primer marginal obtuso o de mayor espacio, y arteria coronaria derecha proximal, media y distal. Los sujetos tendrán una fracción de expulsión mayor que el 40% determinada por cateterización o ventriculografía con radionúclidos o ecocardiograma ECHO en el momento del angiograma de cualificación o en los tres meses previos a la aceptación del angiograma de cualificación siempre que no se haya producido un acontecimiento intermedio tal como un acontecimiento trombótico o un procedimiento tal como PTCA.

Generalmente, debido al número de pacientes y a las limitaciones físicas de cualquier instalación, el estudio se realizará en múltiples sitios. Al entrar en el estudio, los sujetos se someten a una angiografía coronaria cuantitativa así como a ultrasonografía de la arteria carótida en modo B y a una evaluación de la distensibilidad de la arteria carótida en centros de ensayo designados.

Esto establecerá valores iniciales para cada sujeto. Una vez que se admiten en el ensayo, los sujetos reciben aleatoriamente un agente antihipertensivo (por ejemplo, eplerenona) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (la dosis depende del agente antihipertensivo particular o de la sal del mismo seleccionada) y placebo o un agente antihiperlipidémico tal como un inhibidor de IBAT (50 mg) y placebo o un agente antihipertensivo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (la dosis depende del agente antihipertensivo particular o de la sal del mismo seleccionada) y un inhibidor de IBAT (50 mg). El especialista apreciará que puede usarse la forma de base libre o cualquier otra forma de sal del agente antihipertensivo o la forma de base libre u otra forma de sal del inhibidor de IBAT.

El cálculo de la cantidad de dosificación de estas otras formas del inhibidor de IBAT y besilato de amlodipina se consigue fácilmente realizando una simple relación con respecto a los pesos moleculares de las especies implicadas. La cantidad del agente antihipertensivo puede cambiarse según sea necesario. La cantidad de inhibidor de IBAT se valorará de forma descendente desde 80 mg si el médico determina que es por el interés del sujeto. Los sujetos se controlan durante un período de uno a tres años, prefiriéndose generalmente tres años. La evaluación por ultrasonidos de la carótida en modo-B de la aterosclerosis de la arteria carótida y de la distensibilidad se realizan a intervalos regulares a lo largo de todo el estudio. Generalmente, son adecuados intervalos de seis meses. Típicamente, esta evaluación se realiza utilizando un equipo de ultrasonidos de modo B. Sin embargo, un especialista en la técnica puede usar otros métodos para realizar esta evaluación. La angiografía coronaria se realiza al final del período de tratamiento de uno a tres años. Los angiogramas iniciales y posteriores al tratamiento y los ultrasonogramas en modo B de las arterias carótidas de intervención se evalúan para determinar la aparición de nuevas lesiones o la progresión de lesiones ateroscleróticas existentes. Las medidas de distensibilidad arterial se evalúan para detectar cambios desde los valores iniciales y durante los períodos de evaluación de 6 meses.

El objetivo primario de este estudio es demostrar que la combinación de un agente antihipertensivo y un inhibidor de IBAT reduce la progresión de lesiones ateroscleróticas, según se mide por angiografía coronaria cuantitativa (QCA) en sujetos con una enfermedad clínica de las arterias coronarias. La QCA mide la abertura de la luz de las arterias medidas.

El criterio de valoración primario del estudio es el cambio en el diámetro medio del segmento medio del árbol de las arterias coronarias. De esta forma, se mide el diámetro de un segmento arterial en diversas porciones a lo largo del recorrido de ese segmento. Después se determina el diámetro medio de ese segmento. Después de haber determinado el diámetro medio del segmento de muchos segmentos, se determina la media de todas las medias de segmentos para conseguir el diámetro medio del segmento medio. El diámetro del segmento medio de sujetos que toman el inhibidor de IBAT o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y el agente antihipertensivo o una sal de adición de ácidos farmacéuticamente aceptable del mismo se reducirá más lentamente, no se reducirá o aumentará. Estos resultados representarán una progresión más lenta de la aterosclerosis, una progresión interrumpida de la aterosclerosis, y una regresión de la aterosclerosis, respectivamente.

El objetivo secundario de este estudio es demostrar que la combinación de un agente antihipertensivo y el inhibidor de IBAT o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo reduce la velocidad de progresión de la aterosclerosis en las arterias carótidas medida por la pendiente de las mediciones máximas del espesor de la íntima-media promediadas sobre 12 segmentos de pared distintos (máxima media) en función del tiempo, en mayor medida que la amlodipina o una sal de adición de ácidos farmacéuticamente aceptable de la misma o un inhibidor de IBAT o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo por separado. El espesor de la íntima-media de sujetos que toman el inhibidor de IBAT o una sal de adición de ácidos farmacéuticamente aceptable del mismo y amlodipina o una sal de adición de ácidos farmacéuticamente aceptable de la misma aumentará más lentamente, dejará de aumentar o se reducirá. Estos resultados representan una progresión más lenta de la aterosclerosis, una progresión interrumpida de la aterosclerosis, y una regresión de la aterosclerosis, respectivamente. Además, estos resultados se pueden usar para facilitar la determinación de la dosificación.

La utilidad de los compuestos como agentes médicos en el tratamiento de la angina de pecho en mamíferos (por ejemplo, seres humanos) se demuestra por la actividad de los compuestos en ensayos convencionales y en el protocolo clínico descrito más adelante:

Efecto del inhibidor de IBAT y un agente antihipertensivo, solos y en combinación, sobre el tratamiento de la angina

Este estudio será un estudio doble ciego, de ramas paralelas, aleatorio, para demostrar la eficacia de un inhibidor de IBAT o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un agente antihipertensivo administrados en combinación en el tratamiento de la angina sintomática.

Criterios de admisión

Los sujetos son hombres o mujeres entre 18 y 80 años de edad con una historia de dolor típico en el pecho asociado con una de las siguientes evidencias objetivas de isquemia cardíaca: (1) elevación del segmento del ensayo de estrés de aproximadamente 1 milímetro o más en el ECG; (2) ensayo de esfuerzo en tapiz rodante positivo; (3) nuevas anormalidades en el movimiento de la pared detectadas por ultrasonidos; o (4) angiograma coronario con estenosis calificatoria significativa. Generalmente, una estenosis de 30-50% se considera significativa.

Cada sujeto se evalúa durante aproximadamente diez a treinta y dos semanas. Al menos se necesitan diez semanas para completar el estudio. En esta selección, se usan suficientes sujetos para asegurar que se evalúan aproximadamente 200 a 800 sujetos y preferiblemente aproximadamente 400 sujetos para completar el estudio. Se seleccionan sujetos que satisfagan los criterios de admisión, indicados más adelante, durante un ensayo de cuatro semanas en fase. Después de satisfacer los criterios de admisión, los sujetos se retiran de su medicación anti-angina y se estabilizan con un nitrato de acción prolongada tal como nitroglicerina, isosorbida-5-mononitrato o isosorbida dinitrato. El término "retirada", cuando se usa en relación con esta selección, significa la retirada de la medicación anti-angina actual de forma que se elimine substancialmente toda la medicación del cuerpo del sujeto. Preferiblemente, se deja un período de ocho semanas tanto para el período de retirada como para el establecimiento del sujeto con dosis estables del nitrato. A los sujetos que tienen uno o dos ataques de angina por semana cuando están en dosis estables del nitrato de acción prolongada se les permite pasar por alto la fase de retirada de la medicación. Después de estabilizar a los sujetos con nitratos, los sujetos entran en la fase de aleatorización siempre que los sujetos sigan teniendo uno o dos ataques de angina por semana. En la fase de aleatorización, los sujetos se asignan aleatoriamente a una de las cuatro ramas del estudio indicadas más adelante. Después de completar la fase de retirada, los sujetos que satisfacen los criterios de admisión se someten a un electrocardiograma (ECG) ambulatorio de 24 horas tal como un control Holter, a un ensayo de esfuerzo de ejercicio tal como en un tapiz rodante y a una evaluación de perfusión miocárdica usando una exploración PET (tomografía de emisión de fotones) para establecer un valor inicial para cada sujeto. Al realizar el ensayo de esfuerzo, un técnico puede controlar la velocidad del tapiz rodante y el gradiente del tapiz rodante. La velocidad del tapiz rodante y el ángulo del gradiente generalmente se aumentan durante el ensayo. Los intervalos de tiempo entre cada aumento de velocidad y gradiente se determinan generalmente usando un protocolo de Bruce modificado.

Después de completar las investigaciones iniciales, los sujetos se inician en una de las siguientes cuatro ramas del estudio: (1) placebo; (2) inhibidor de IBAT (aproximadamente 1 mg a aproximadamente 80 mg); (3) un agente antihipertensivo (la dosis depende del agente antihipertensivo particular seleccionado); o (4) una combinación de las dosis anteriores de inhibidor de IBAT y agente antihipertensivo juntos. El especialista debe apreciar que se puede usar la forma de base libre u otras formas de sal del besilato de amlodipina o la forma de base libre u otras formas de sal del inhibidor de IBAT. El cálculo de la cantidad de dosificación de éstas otras formas del inhibidor de IBAT y del besilato de amlodipina se realiza fácilmente por medio de una relación sencilla relativa a los pesos moleculares de las especies implicadas. Después, los sujetos se controlan durante un período de dos a veinticuatro semanas.

Después de finalizar el período de control, los sujetos se someten a las siguientes investigaciones: (1) ECG ambulatorio de 24 horas, tal como un control de Holler*, (2) ensayo de esfuerzo de ejercicio (por ejemplo, tapiz rodante, usando el Protocolo de Bruce modificado); y (3) evaluación de la perfusión miocárdica usando una exploración PET. Los pacientes mantienen un diario de episodios isquémicos dolorosos y del consumo de nitroglicerina. Generalmente, es deseable tener un registro preciso del número de ataques de angina que sufre el paciente durante el ensayo. Como un paciente generalmente toma nitroglicerina para aliviar el dolor de un ataque de angina, el número de veces que el paciente se administra nitroglicerina proporciona un registro razonablemente preciso del número de ataques de angina.

Para demostrar la eficacia y la dosificación de la combinación de fármacos, la persona que dirige el ensayo evaluará al sujeto usando las pruebas descritas. Un tratamiento satisfactorio que produce menos casos de episodios isquémicos detectados por ECG, permitirá al sujeto hacer más ejercicio o a un mayor nivel de intensidad en el tapiz rodante, o hacer ejercicio sin dolor en el tapiz rodante, o producirá mejor perfusión o menos defectos de perfusión detectados por ultrasonidos.

La utilidad de los compuestos como agentes médicos en el tratamiento de la hipertensión y la hiperlipidemia en animales (por ejemplo, seres humanos) que padecen una combinación de hipertensión e hiperlipidemia, se demuestra por la actividad de los compuestos en ensayos convencionales y en el protocolo clínico descrito más adelante:

Efecto de un inhibidor de IBAT y un agente antihipertensivo, solos y en combinación, en el tratamiento de sujetos con hipertensión e hiperlipidemia

Este estudio será un estudio doble ciego, de ramas paralelas, aleatorio para demostrar la eficacia de un inhibidor de IBAT o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un agente antihipertensivo dministrados en combinación para controlar tanto la hipertensión como la hiperlipidemia en sujetos con hipertensión e hiperlipidemia leve, moderada o grave.

Cada sujeto se evalúa durante 10 a 20 semanas y preferiblemente durante 14 semanas. En esta selección se usan suficientes sujetos para asegurar que se evalúan de aproximadamente 400 a 800 sujetos para completar el estudio.

Criterios de admisión

Los sujetos son hombres o mujeres entre 18 y 80 años de edad que tienen tanto hiperlipidemia como hipertensión. La presencia de hiperlipidemia se demuestra por la evaluación del nivel de lipoproteínas de baja densidad (LDL) del sujeto en relación con ciertos factores de riesgo positivos. Si el sujeto no tiene ninguna enfermedad cardíaca coronaria (CHD) y tiene menos de dos factores de riesgo positivos, se considera que el sujeto tienen hiperlipidemia que requiere terapia con fármacos si el nivel de LDL del sujeto es mayor o igual a 190. Si el sujeto no tiene CHD y tiene dos o más factores de riesgo positivos, entonces se considera que el sujeto tiene hiperlipidemia que requiere terapia con fármacos si el nivel de LDL del sujeto es mayor o igual que 160. Si el sujeto tiene una CHD, entonces se considera que el sujeto tiene hiperlipidemia si el nivel de LDL del sujeto es mayor o igual a 130.

\newpage

Los factores de riesgo positivos incluyen (1) hombre mayor de 45 años, (2) mujer mayor de 55 años que no está sometida a una terapia de reposición de hormonas (HIRT), (3) historia familiar de enfermedad cardiovascular prematura, (4) el sujeto es fumador habitual, (5) el sujeto tiene diabetes, (6) un nivel de HDL menor que 45, y (7) el sujeto tiene hipertensión. Un nivel de HDL mayor que 60 se considera un factor de riesgo negativo y desplazará a uno de los factores de riesgo positivos mencionados anteriormente. La presencia de hipertensión se demuestra por una presión sanguínea (BP) diastólica en posición sentada mayor que 90 o una BP sistólica en posición sentada mayor que 140. Todas las presiones sanguíneas se determinan generalmente como la media de tres medidas tomadas con una separación de cinco minutos. Los sujetos se seleccionan de manera que satisfagan los criterios de admisión descritos anteriormente. Después de comprobar que se satisfacen todos los criterios de admisión, se retiran las medicaciones antihipertensivas y de reducción de lípidos de los sujetos y se someten a la dieta de etapa 1 del NCEP ATP 11. La dieta de etapa 1 del NCEP ATP 11 (panel de tratamiento de adultos, 2º revisión) establece la cantidad de grasa saturada e insaturada que puede consumirse como una proporción de la ingesta calórica total. El término "retirada", cuando se usa en relación con esta selección, significa la retirada de la medicación antihipertensiva y de reducción de lípidos de forma que se elimine substancialmente toda la medicación del cuerpo del sujeto. Los sujetos diagnosticados recientemente generalmente permanecen sin tratar hasta que comienza el ensayo. Estos sujetos también se someten a la dieta de etapa 1 del NCEP. Después de un período de retirada y de estabilización de la dieta de cuatro semanas, los sujetos se someten a las siguientes investigaciones basales: (1) presión sanguínea y (2) selección de lípidos en ayunas. La selección de lípidos en ayunas determina los niveles basales de lípidos en ayunas de un sujeto. Generalmente, el sujeto se abstiene de comer durante doce horas, momento en el que se miden los niveles de lípidos. Después de realizar las investigaciones basales, los sujetos inician uno de los siguientes tratamientos: (1) una dosis fija de agente antihipertensivo, dosis que depende del agente antihipertensivo particular seleccionado; (2) una dosis fija de un inhibidor de IBAT, generalmente de aproximadamente 1 a 80 mg; o (3) una combinación de las dosis anteriores del inhibidor de IBAT y el agente antihipertensivo. El especialista reconocerá que se puede usar la forma de base libre u otras formas de sal de besilato de amlodipina o la forma de base libre u otras formas de sal del inhibidor de IBAT. El cálculo de la cantidad de dosificación de éstas otras formas del inhibidor de IBAT y del besilato de amlodipina se realiza fácilmente haciendo una relación sencilla con respecto a los pesos moleculares de las especies implicadas. Los sujetos siguen con estas dosis durante un mínimo de seis semanas, y generalmente durante no más de ocho semanas. Los sujetos vuelven al centro de ensayo al final de las seis a ocho semanas de forma que se puedan repetir las evaluaciones basales. La presión sanguínea del sujeto al final del estudio se compara con la presión sanguínea del sujeto en la entrada. La selección de lípidos mide el colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL, triglicéridos, apoB, VLDL (lipoproteínas de muy baja densidad), y otros componentes del perfil de lípidos del sujeto. Las mejoras en los valores obtenidos después del tratamiento en relación con los valores anteriores al tratamiento indican la utilidad de la combinación de fármacos. La utilidad de los compuestos como agentes médicos en el tratamiento del riesgo cardíaco en mamíferos (por ejemplo, seres humanos) con riesgo de un acontecimiento cardíaco adverso se demuestra por la actividad de los compuestos en ensayos convencionales y el protocolo clínico descrito más adelante.

Efecto de un inhibidor de IBAT y un agente antihipertensivo, solos y en combinación, en sujetos con riesgo de acontecimientos cardiovasculares futuros

Este estudio será un estudio doble ciego, de ramas paralelas, aleatorio, para demostrar la eficacia de un inhibidor de IBAT o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un agente antihipertensivo en combinación en la reducción de riesgo total calculado de acontecimientos futuros en sujetos con riesgo de acontecimientos cardiovasculares futuros. Este riesgo se calcula usando la ecuación de riesgo de Framingham. Se considera que un sujeto tiene riesgo de tener un futuro acontecimiento cardiovascular si el sujeto tiene más de una desviación típica por encima de la media calculada según la ecuación de riesgo de Framingham. El estudio se usa para evaluar la eficacia de una combinación fija del inhibidor de IBAT o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y el agente antihipertensivo en el control del riesgo cardiovascular controlando tanto la hipertensión como la hiperlipidemia en pacientes que tienen hipertensión e hiperlipidemia de leve a moderada.

Cada sujeto se evalúa durante 10 a 20 semanas y preferiblemente durante 14 semanas. Se reclutan suficientes sujetos para asegurar que se evalúan aproximadamente de 400 a 800 sujetos para completar el estudio.

Criterios de admisión

Los sujetos incluidos en el estudio son sujetos adultos hombres o mujeres entre 18 y 80 años de edad con un riesgo basal de cinco años que está por encima de la media para la edad y sexo del sujeto, como se define en el estudio del corazón de Framingham, que es un estudio prospectivo en curso de hombres y mujeres adultos que demuestra que se pueden usar ciertos factores de riesgo para predecir el desarrollo de una enfermedad cardíaca coronaria. Para determinar si un paciente tiene riesgo de sufrir un acontecimiento cardíaco adverso se evalúan la edad, el sexo, la presión diastólica y sistólica, el hábito de fumar, la presencia o ausencia de intolerancia a carbohidratos, la presencia o ausencia de hipertrofia del ventrículo izquierdo, colesterol en suero y lipoproteínas de alta densidad (HDL) de más de una desviación típica por encima de la norma de la población de Framingham. Los valores de los factores de riesgo se insertan en la ecuación de riesgo de Framingham y se calculan para determinar si un sujeto tiene riesgo de un futuro acontecimiento cardiovascular. Los sujetos se seleccionan de forma que satisfagan los criterios de admisión descritos anteriormente. Después de comprobar que se satisfacen todos los criterios de admisión, se retiran de los sujetos las medicaciones antihipertensivas y la medicación de reducción de lípidos y cualquier otra medicación que afecte a los resultados de la selección. Después, los pacientes se someten a la dieta de etapa 1 del NCEP ATP 11. Los sujetos diagnosticados recientemente permanecen generalmente sin tratar hasta que comienza el ensayo. Estos sujetos también se someten a la dieta de etapa 1 del NCEP ATP 11. Después del período de retirada y de estabilización de la dieta de cuatro semanas, los sujetos se someten a las siguientes investigaciones basales: (1) presión sanguínea; (2) ayunas; (3) selección DPW; (4) ensayo de tolerancia a la glucosa; (5) ECG; y (6) ultrasonidos cardíacos. Estos ensayos se realizan usando procedimientos convencionales bien conocidos por las personas especialistas en la técnica. Los ultrasonidos cardíacos y el ECG se usan generalmente para medir la presencia o ausencia de hipertrofia del ventrículo izquierdo.

Después de realizar las investigaciones basales, los sujetos inician uno de los siguientes tratamientos: (1) una dosis fija de un agente antihipertensivo, dosis que depende del agente antihipertensivo particular seleccionado; (2) una dosis fija de un inhibidor de IBAT (de aproximadamente 1 a 80 mg); o (3) la combinación de las dosis anteriores del inhibidor de IBAT y un agente antihipertensivo. El especialista debe apreciar que se puede utilizar la forma de base libre u otras formas de sal de besilato de amlodipina o la forma de base libre u otras formas de sal del inhibidor de IBAT. El cálculo de la cantidad de dosificación de éstas otras formas del inhibidor de IBAT y del besilato de amlodipina se realiza fácilmente por medio de una relación sencilla con respecto a los pesos moleculares de las especies implicadas. Los pacientes se mantienen a estas dosis y se les pide que vuelvan en seis a ocho semanas para que se puedan repetir las evaluaciones basales. En este momento, los valores nuevos se introducen en la ecuación de riesgo de Framingham para determinar si el sujeto tiene un riesgo menor, mayor o igual de acontecimientos cardiovasculares futuros.

Los ensayos anteriores que demuestran la eficacia de la amlodipina o sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables de la misma y un inhibidor de IBAT o sales farmacéuticamente aceptables del mismo en el tratamiento de la angina de pecho, aterosclerosis, hipertensión e hiperlipidemia, y en el tratamiento del riesgo cardíaco, también proporcionan un medio por el que las actividades de los compuestos se pueden comparar entre sí y con las actividades de otros compuestos conocidos. Los resultados de estas comparaciones son útiles para determinar los niveles de dosificación en mamíferos, incluyendo seres humanos, para el tratamiento de tales enfermedades. Las siguientes cantidades de dosificación y otras cantidades de dosificación descritas en otro lugar de esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas son para un sujeto humano medio con un peso de aproximadamente 65 kg a aproximadamente 70 kg. El especialista será capaz de determinar fácilmente la cantidad de dosificación que se necesita para un sujeto cuyo peso está fuera del intervalo de 65 a 70 kg, basándose en la historia médica del sujeto y en la presencia de enfermedades, por ejemplo, diabetes, en el sujeto. Todas las dosis descritas en este documento, y en las reivindicaciones adjuntas, son dosis diarias.

Como ejemplo general, los agentes antihipertensivos enumerados a continuación pueden administrarse en las siguientes cantidades de dosificación diarias:

diltiazem, generalmente de aproximadamente 120 mg a aproximadamente 480 mg;

verapamil, generalmente de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 48 mg;

felodipina, generalmente de aproximadamente 2,5 mg a aproximadamente 40 mg;

isradipina, generalmente de aproximadamente 2,5 mg a aproximadamente 40 mg;

lacidipina, generalmente de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 6 mg;

nicardipina, generalmente de aproximadamente 32 mg a aproximadamente 120 mg;

nifedipina, generalmente de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 120 mg;

nimodipina, generalmente de aproximadamente 120 mg a aproximadamente 480 mg;

nisoldipina, generalmente de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 80 mg;

nitrendipina, generalmente de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 20 mg;

benazepril, generalmente de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 80 mg;

captopril, generalmente de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 150 mg;

enalapril, generalmente de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 40 mg;

fosinopril, generalmente de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 80 mg;

lisinopril, generalmente de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 80 mg;

quinapril, generalmente de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 80 mg;

losartan, generalmente de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg;

valsartan, generalmente de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 640 mg;

doxazosina, generalmente de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 16 mg;

prazosina, generalmente de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 40 mg;

trimazosina, generalmente de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg;

amilorida, generalmente de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 20 mg; y

eplerenona, generalmente de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 150 mg.

Los especialistas en la técnica deben apreciar que las dosificaciones de los compuestos antihipertensivos anteriores deben individualizarse para cada sujeto específico. Esta individualización dependerá de la historia médica del sujeto y de si el sujeto está tomando al mismo tiempo otras medicaciones que puedan o puedan no interferir o tener un efecto adverso en combinación con los antihipertensivos anteriores. La individualización se consigue comenzando con una dosis baja del compuesto y valorando la cantidad hasta que se consiga el efecto terapéutico deseado. En general, el inhibidor de IBAT se administra generalmente en una dosificación de aproximadamente 0,1 mg/día a aproximadamente 500 mg/día. Preferiblemente, el inhibidor de IBAT se administra en una dosificación de aproximadamente 1 mg/día a aproximadamente 100 mg/día.

Como la presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades y afecciones con una combinación de ingredientes activos que pueden administrarse de forma separada, la invención también se refiere a la combinación de distintas composiciones farmacéuticas en forma de kit. El kit incluye dos composiciones farmacéuticas separadas.

El kit incluye un recipiente para contener las distintas composiciones tal como un frasco dividido o un envase laminado dividido, sin embargo, las distintas composiciones también pueden estar contenidas en un único recipiente no dividido. Típicamente, el kit incluye instrucciones para la administración de los distintos componentes. La forma en kit es particularmente ventajosa cuando los distintos componentes se administran preferiblemente en formas de dosificación diferentes (por ejemplo, oral y parenteral), se administran en intervalos de dosificación diferentes, o cuando el médico que lo prescribe desea la valoración de los componentes individuales de la combinación.

Los ejemplos de este documento pueden realizarse substituyendo los compuestos terapéuticos o ingredientes inertes descritos genérica o específicamente por los usados en los ejemplos precedentes.

Habiéndose descrito la invención de esta manera, es evidente que puede variarse de muchas maneras. Tales variaciones no se deben considerar una desviación del alcance de la presente invención, y como será evidente para un especialista en la técnica, se pretende que todas estas modificaciones y equivalentes estén incluidas dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Una combinación terapéutica que comprende una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales, donde la primera cantidad y la segunda cantidad juntas comprenden una cantidad eficaz anti-hiperlipidémica, una cantidad eficaz anti-aterosclerótica, o una cantidad eficaz anti-hipercolesterolémica de los compuestos.

2. La combinación terapéutica de la reivindicación 1, donde el compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon tiene una de las siguientes estructuras:

(1)

22

o un enantiómero o racemato de la misma;

(2)

23

o un enantiómero o racemato de la misma;

\newpage

(3)

24

o un enantiómero o racemato de la misma, donde PEG es una cadena de polímero de polietilenglicol con un peso molecular de aproximadamente 3000 a aproximadamente 4000.

(4)

25

o un enantiómero o racemato de la misma.

3. Uso de una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales, para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de una enfermedad o trastorno hiperlipidémico en un mamífero, donde la primera cantidad y la segunda cantidad juntas comprenden una cantidad eficaz anti-hiperlipidémica, una cantidad eficaz anti-aterosclerótica, o una cantidad eficaz anti-hipercolesterolémica de los compuestos.

4. Un kit para conseguir un efecto terapéutico en un mamífero que comprende una cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon en una primera forma de dosificación unitaria; una cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales en una segunda forma de dosificación unitaria; y un recipiente para contener dichas primera y segunda formas de dosificación unitaria.

5. Una combinación terapéutica que comprende una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares en el íleon (IBAT) y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales (MTP), donde dicha primera cantidad y dicha segunda cantidad juntas comprenden una cantidad eficaz anti-hiperlipidémica, una cantidad eficaz anti-aterosclerótica, o una cantidad eficaz anti-hipercolesterolémica de dicho compuesto inhibidor de IBAT y de dicho compuesto inhibidor de MTP, y donde dicho compuesto inhibidor de MTP se selecciona entre el grupo compuesto por M-1, M-2, M-3, M-4, M-5, M-6, M-7, M-8 y M-9 representado por:

26

27

28

29

30

31

32

33

34

y enantiómeros, racematos, tautómeros y sales de los mismos.

6. La combinación terapéutica de la reivindicación 5, donde dicho compuesto inhibidor de IBAT se representa por la fórmula B-5:

35

o enantiómeros o racematos del mismo.

\newpage

7. La combinación terapéutica de la reivindicación 6, donde dicho compuesto inhibidor de MTP se representa por la fórmula M-9:

36