ES2201822T3

ES2201822T3 - Combinaciones de inhibididores de la proteina de transferencia de ester de colesterilo y de derivados de acido nicotinico para indicaciones cardiovasculares.

Info

Publication number: ES2201822T3
Application number: ES99965035T
Authority: ES
Inventors: James A. Sikorski; Kevin C. Glenn
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2019-12-17
Also published as: AU3103800A; US6890958B2; EP1140184B1; EP1140184A1; DK1140184T3; DE69908643D1; EP1340508A1; WO2000038721A1; PT1140184E; US6489366B1; JP2002533408A; DE69908643T2; CA2356158A1; US20030109558A1; ATE242007T1; CA2356158C

Abstract

Una combinación terapéutica que comprende una primera cantidad de un compuesto derivado de ácido fíbrico y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de éster de colesterilo, en donde la primera cantidad y la segunda cantidad comprenden conjuntamente una cantidad eficaz para un estado anti-hiperlipidémico, una cantidad eficaz para un estado anti-aterosclerótico o una cantidad eficaz para un estado anti-hipercolesterolémico de los compuestos y en donde dicho compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de éster de colesterilo está representado por la fórmula (C-12) o sus enantiómeros o racematos.

Description

Combinaciones de inhibidores de la proteína de transferencia de éster de colesterilo y de derivados de ácido nicotínico para indicaciones cardiovasculares.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se relaciona con composiciones para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y, concretamente, se relaciona con combinaciones de compuestos, composiciones y su uso en medicina, particularmente en la profilaxis y tratamiento de estados hiperlipidémicos tales como aquellos asociados con aterosclerosis, hipercolesterolemia y otras enfermedades de las arterias coronarias en mamíferos. Más particularmente, la invención se relaciona con compuestos que inhiben la actividad de la proteína de transferencia de éster de colesterilo (CETP). La invención se relaciona también con compuestos derivados de ácido nicotínico.

Descripción del estado de la técnica

Es un hecho bien establecido que los estados hiperlipidémicos asociados con concentraciones elevadas de colesterol total y de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL) son los principales factores de riesgo para la enfermedad coronaria del corazón y en particular para aterosclerosis. Numerosos estudios han demostrado que una baja concentración en plasma de colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL) constituye un potente factor de riesgo para el desarrollo de aterosclerosis (Barter y Rye, Atherosclerosis, 121, 1-12 (1996). La HDL es una de las clases principales de lipoproteínas que funcionan en el transporte de lípidos a través de la sangre. Los principales lípidos encontrados en asociación con HDL incluyen colesterol, éster de colesterilo, triglicéridos, fosfolípidos y ácidos grasos. Las otras clases de lipoproteínas encontradas en la sangre son lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de densidad intermedia (IDL) y lipoproteína de densidad muy baja (VLDL). Dado que los niveles de colesterol HDL aumentan el riesgo de aterosclerosis, los métodos para elevar el colesterol HDL en plasma serían terapéuticamente beneficiosos para el tratamiento de aterosclerosis y de otras enfermedades asociadas con la acumulación de lípidos en los vasos sanguíneos. Estas enfermedades incluyen, pero no de forma limitativa, enfermedad coronaria del corazón, enfermedad vascular periférica y embolia.

La aterosclerosis subyace en la mayoría de las enfermedades de las arterias coronarias (CAD), la principal causa de morbidez y mortalidad en la sociedad moderna. Se ha comprobado que el alto nivel de colesterol LDL (por encima de alrededor de 180 mg/dl) y el bajo nivel de colesterol HDL (por debajo de 35 mg/dl) contribuyen de forma importante al desarrollo de aterosclerosis. Otras enfermedades o factores de riesgo, tal como enfermedad vascular periférica, embolia e hipercolesterolemia, se ven afectadas negativamente por la presencia de relaciones HDL/LDL adversas.

Se ha comprobado que la interferencia con la recirculación de ácidos biliares procedentes del lumen del tracto intestinal reduce los niveles de colesterol en suero según una relación causal. Se han acumulado datos epidemiológicos que indican que dicha reducción conduce a una mejora en el estado de la enfermedad de aterosclerosis. Stendronsky, en "Interaction of bile acids and colesterol with nonsystemic agents having hypocholesterolemic properties", Biochimica et Biophysica Acta, 1210, 255-287 (1994) expone la bioquímica, fisiología y agentes activos conocidos que se encuentran alrededor de los ácidos biliares y del colesterol.

Se ha demostrado que la inhibición de la proteína de transferencia de éster de colesterilo (CETP) modifica de un modo eficaz las relaciones HDL/LDL en plasma y cabe esperar que ello sirva para comprobar el proceso y/o formación de ciertas enfermedades cardiovasculares. La CETP es una proteína de plasma que facilita el movimiento de ésteres de colesterilo y de triglicéridos entre las diversas lipoproteínas de la sangre (Tall, J. Lipid Res., 34, 1255-74 (1993)). El movimiento de éster de colesterilo desde HDL a LDL por CETP tiene el efecto de disminuir el colesterol HDL. Por tanto, se deduce que la inhibición de CETP conduciría al aumento del colesterol HDL en plasma y a la disminución del colesterol LDL en plasma, proporcionando con ello un perfil de lípidos en plasma terapéuticamente beneficioso. La evidencia de este efecto se describe en McCarthy, Medicinal Res. Revs., 13, 139-59 (1993). Otra evidencia de este efecto se describe en Sitori, Pharmac. Ther., 67, 443-47 (1995). Este fenómeno fue demostrado por primera vez por Swenson et al.,(J. Biol. Chem., 264, 14318 (1989)) con el uso de un anticuerpo monoclonal que inhibe CETP de forma específica. En conejos, el anticuerpo causó un aumento del colesterol HDL en plasma y un descenso del colesterol LDL. Son et al. (Biochim. Biophys. Acta, 795, 743-480 (1984)) describen proteínas de plasma humano que inhiben CETP. La Patente US 5.519.001, concedida a Kushwaha et al., describe un péptido de 36 aminoácidos derivado de apo C-1 de babuino que inhibe la actividad de CETP. Cho et al. (Biochim. Biophys. Acta 1391, 133-144 (1998)) describen un péptido de plasma de perro que inhibe CETP humana. Bonin et al. (J. Peptide Res., 51, 216-225 (1998)) describen un decapéptido inhibidor de CETP. Un metabolito fúngico de depspéptido es descrito como un inhibidor de CETP por Hedge et al. en Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, 1277-80 (1998).

Existen varios informes sobre compuestos no peptídicos que actúan como inhibidores de CETP. Barrett et al. (J. Am. Chem. Soc., 188, 7863-63 (1996)) describen inhibidores de CETP que contienen ciclopropano. Otros inhibidores de CETP que contienen ciclopropano son descritos por Kuo et al. (J. Am. Chem. Soc., 117, 10629-34 (1995)). Pietzonka et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 1951-54 (1996)) describen análogos de éster de colesterilo que contienen fosfonato como inhibidores de CETP. Coval et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 605-610 (1995)) describen Wiedendiol-A y -B y compuestos de sesquiterpeno relacionados como inhibidores de CETP. Lee et al. (J. Antibiotics, 49, 693-96 (1996)) describen inhibidores de CETP derivados de un hongo de insectos. Busch et al. (Lipids, 25, 216-220 (1990)) describen acetilbromuro de colesterilo como un inhibidor de CETP. Morton y Zilversmit (J. Lipid Res., 35, 836-47 (1982)) describen que el p-cloromercurifenilsulfonato, el p-hidroximercuribenzoato y el etilmercuritiosalicilato inhiben CETP. Connolly et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm., 223, 42-47 (1996)) describen otros reactivos de modificación de cisteína como inhibidores de CETP. Xia et al. describen 1,3,5-triazinas como inhibidores de CETP (Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 919-22 (1996)). Bisgaier et al. (Lipids, 29, 811-8 (1994)) describen 4-fenil-5-tridecil-4H-1,2,4-triazol-tiol como un inhibidor de CETP. Otros triazoles inhibidores de CETP son descritos en la solicitud de patente US número de serie 09/153.360. Sikorski et al. han descrito otros nuevos inhibidores de CETP en la solicitud de patente PCT No. WO 9914204.

Los compuestos de 2-mercaptoanilina amida sustituidos se pueden utilizar como inhibidores de CETP y dichos compuestos terapéuticos son descritos por H. Shinkai et al. en la solicitud de patente PCT No. WO 98/35937.

Algunos compuestos de heteroalquilaminas sustituidos son conocidos como inhibidores de CETP. En la solicitud de patente europea No. 796846, Schmidt et al. describen piridinas 2-aril-sustituidas como inhibidores de la proteína de la transferencia de éster de colesterol útiles como agentes cardiovasculares. Uno de los sustituyentes en C_{3} del anillo piridina puede ser un grupo hidroxialquilo. En la solicitud de patente europea No. 801060, Dow y Wright describen derivados heterocíclicos sustituidos por un producto de adición de aldehído de una alquilamina para proporcionar 1-hidroxi-1-aminas. Estas son consideradas como agonistas de receptores \beta3-adrenérgicos útiles para el tratamiento de diabetes y otros trastornos. En la solicitud de patente británica No. 2305665, Fisher et al. describen derivados de piridina 3-sustituidos con aminoalcoholes secundarios agonistas útiles para el tratamiento de varios trastornos, incluyendo niveles de colesterol y enfermedades ateroscleróticas. En la solicitud de patente europea No. 818448, Schmidt et al. describen derivados de tetrahidroquinolina como inhibidores de la proteína de transferencia de éster de colesterol. La solicitud de patente europea No. 818197, Schemk et al. describen piridinas con heterociclos condensados como inhibidores de la proteína de transferencia de éster de colesterol. Brandes et al. en la solicitud de patente alemana No. 19627430 describen derivados de piridina bicíclicos condensados como inhibidores de la proteína de transferencia de éster de colesterol. En la solicitud de patente PCT No. WO 9839299, Muller-Gliemann et al. describen derivados de quinolina como inhibidores de la proteína de transferencia de éster de colesterilo.

Compuestos policíclicos que son útiles como inhibidores de CETP son también descritos por A. Oomura et al. en la patente japonesa No. 10287662. Por ejemplo, se prepararon compuestos terapéuticos que tienen las estructuras C-1 y C-8 mediante cultivo de Penicillium spp.

Cicloalquilpiridinas útiles como inhibidores de CETP son descritas por Schmidt et al. en la patente europea No. EP 818448. Por ejemplo, el compuesto terapéutico que tiene la estructura C-9 es descrito como particularmente eficaz como inhibidor de CETP.

Compuestos de tetrahidronaftaleno sustituidos útiles como inhibidores de CETP son descritos en la solicitud de patente PCT No. WO 9914174. Concretamente, en dicha referencia se describe como un inhibidor útil de CETP el compuesto (8S)-3-ciclopentil-1-(4-fluorfenil)-2-[(S)-fluor(4-trifluormetilfenil)metil]-8- hidroxi-6-espirociclobutil-5,6,7,8-tetrahidronaftaleno.

Ciertas 4-heteroaril-tetrahidroquinolinas útiles como inhibidores de CETP se describen en la solicitud de patente No. WO 9914215. Por ejemplo, dicha referencia describe el compuesto 3-(4-trifluormetilbenzoil)-5,6,7,8-tetrahidroquinolin-5-ona como un inhibidor útil de CETP.

El ácido nicotínico (niacina) es una vitamina de complejo-B que ya en 1995 se indicó que actuaba como un agente hipolipidémico (R. Altschl, et al., Arch. Biochem. Biophys., 54, 558-9 (1995)). A veces se emplea para subir bajos niveles de HDL y bajar los niveles de VLDL y LDL. Formulaciones comerciales útiles de ácido nicotínico incluyen Niacor, Niaspan, Nicobid, Nicolar, Slo-Niacin. El ácido nicontínico está contraindicado en pacientes que presentan disfunción hepática, úlcera péptica activa o sangrado arterial. Otro compuesto de esta clase útil para indicaciones cardiovasculares es niceritrol (T. Kazumi et el., Curr. Ther. Res., 55, 546-51). J.Sasaki et al. (Int. J. Clin. Pharm. Ther., 33 (7), 420-26 (1995) describen una reducción de la actividad de transferencia de éster de colesterilo mediante monoterapia con niceritrol. El Acipimox (4-óxido de ácido 5-metilpirazina-2-carboxílico, Patente US No. 4.002.750) es estructuralmente similar a ácido nicotínico y tiene actividad anti-hiperlipidémica.

En la bibliografía al respecto se han descrito ciertas terapias combinadas para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. En la solicitud de patente US No. 09/037.308 se describen combinaciones de inhibidores de IBAT con inhibidores de HMG CoA reductasa útiles en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

Una terapia combinada de fluvastatina y niceritrol es descrita por J. Sasaki et al. (Id.). Dichos investigadores llegan a la conclusión de que la combinación de fluvastatina con niceritrol "a una dosis de 750 mg/día no parece aumentar o atenuar los efectos beneficiosos de la fluvastatina".

L. Cashin-Hemphill et al. (J. Am. Med. Assoc., 264 (23), 3013-17 (1990)) describen efectos beneficiosos de una terapia combinada de colestipol y niacina sobre aterosclerosis coronaria. Los efectos descritos incluyen los de no progresión y regresión en las lesiones naturales de la arteria coronaria.

Una terapia combinada de acipimox y simvastatina muestra efectos beneficiosos sobre el HDL en pacientes que tienen altos niveles de triglicéridos (N. Hoogerbrugge et al., J. Internal Med., 241, 151-55 (1997)).

Una terapia combinada de sitostanol éster margarina y pravastatina es descrita por H. Gylling et al. (J. Lipid Res., 37, 1776-85 (1996)). Se indica que dicha terapia, de manera simultánea, inhibe la absorción de colesterol y rebaja el colesterol LDL de manera importante en hombres diabéticos no dependientes de insulina.

Brown et al. (New Eng. J. Med., 323 (19), 1289-1339 (1990)) describen una terapia combinada de lovastatina y colestipol que reduce la progresión de la lesión aterosclerótica y aumenta la regresión de la lesión con respecto al uso de lovastatina únicamente.

Una terapia combinada de un inhibidor de la secreción de apoB con un inhibidor de CETP fue descrita por Chang et al. en la solicitud de patente PCT No. WO9823593.

Buch et al. (solicitud de patente PCT No. WO 9911263) describe una terapia combinada que comprende amlodipina y un compuesto de estatina para el tratamiento de sujetos que padecen de angina de pecho, aterosclerosis, hipertensión e hiperlipidemia combinadas, y para el tratamiento de síntomas de parada cardiaca. Buch et al. describen en la solicitud de patente PCT No. WO 9911259 una terapia combinada que comprende amlodipina y atorvastatina.

Scott et al. (solicitud de patente PCT No. WO 9911260) describen una terapia combinada que comprende atorvastatina y un agente antihipertensivo.

Dettmar y Gibson (solicitud de patente británica No. GB 2329334 A) reivindican una composición terapéutica de utilidad a la hora de reducir los niveles en plasma de lipoproteína de baja densidad y de colesterol, en donde la composición comprende un inhibidor de HMG CoA reductasa y un agente complejante biliar.

Las anteriores referencias demuestran que continúa existiendo la necesidad de encontrar agentes eficaces y seguros para la profilaxis o tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

Resumen de la invención

Para enfocar la necesidad continua de encontrar agentes seguros y eficaces para la profilaxis y tratamiento de enfermedades cardiovasculares, se ofrecen ahora terapias combinadas de fármacos cardiovasculares.

Entre sus diversas modalidades, la presente invención proporciona una terapia combinada que comprende una primera cantidad de un compuesto inhibidor de CETP y una segunda cantidad de un derivado de ácido nicotínico útil en la profilaxis o tratamiento de hiperlipidemia, aterosclerosis o hipercolesterolemia, en donde dichas primera y segunda cantidades comprenden conjuntamente una cantidad eficaz para un estado anti-hiperlipidémico, una cantidad eficaz para un estado anti-aterosclerótico o una cantidad eficaz para un estado anti-hipercolesterolémico de dichos compuestos. Por ejemplo, una de las muchas modalidades de la presente invención consiste en una terapia combinada que comprende dosis terapéuticas de un compuesto inhibidor de CETP y de un derivado de ácido nicotínico (incluyendo ácido nicotínico o niacina).

Otra modalidad de la presente invención comprende el uso de cualquiera de las terapias combinadas cardiovasculares aquí descritas en la preparación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de hipercolesterolemia, aterosclerosis o hiperlipidemia. Por tanto, en una modalidad, la presente invención proporciona el uso, en la preparación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de un estado hiperlipidémico, de una combinación de una forma de unidad de dosificación en donde la combinación comprende una primera cantidad de un compuesto derivado de ácido nicotínico y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de CETP en donde la primera cantidad y la segunda cantidad comprenden conjuntamente una cantidad de los compuestos que es eficaz para un estado anti-hiperlipidémico.

En otra modalidad, la presente invención proporciona el uso, en la preparación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de un estado aterosclerótico, de una combinación de una forma de unidad de dosificación en donde la combinación comprende una primera cantidad de un compuesto derivado de ácido nicotínico y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de CETP en donde la primera cantidad y la segunda cantidad comprenden conjuntamente una cantidad de los compuestos que es eficaz para un estado anti-aterosclerótico.

Según otra modalidad, la presente invención proporciona el uso, en la preparación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de hipercolesterolemia, de una combinación de una forma de unidad de dosificación en donde la combinación comprende una primera cantidad de un compuesto derivado de ácido nicotínico y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de CETP en donde la primera cantidad y la segunda cantidad comprenden conjuntamente una cantidad de los compuestos que es eficaz para un estado anti-hipercolesterolémico.

Otro alcance de la capacidad de aplicación de la presente invención llegará a ser evidente a partir de la descripción detallada ofrecida a continuación. Sin embargo, ha de entenderse que la descripción detallada y ejemplos que se ofrecen a continuación, si bien indican modalidades preferidas de la invención, únicamente se ofrecen a título ilustrativo puesto que para los expertos en la materia serán evidentes, a partir de esta descripción detallada, varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención.

Descripción detallada de las modalidades preferidas

Se ofrece la siguiente descripción detallada para que los expertos en la materia puedan poner en práctica la presente invención. No obstante, dicha descripción detallada no deberá ser considerada como una limitación indebida de la presente invención, dado que los expertos en la materia podrán realizar diversas modificaciones y variaciones en las modalidades aquí expuestas sin desviarse por ello del alcance del descubrimiento de la presente invención.

a. Definiciones

Se ofrecen las siguientes definiciones con el fin de que el lector pueda entender más fácilmente la descripción detallada de la presente invención:

"Derivado de ácido nicotínico" o "compuesto derivado de ácido nicotínico" significa un compuesto terapéutico que comprende una estructura de piridina-2-carboxilato o una estructura de pirazina-2-carboxilato, incluyendo las formas de ácido, sales, ésteres, zwitteriones y tautómeros. Los derivados de ácido nicotínico incluyen, por ejemplo, ácido nicotínico (niacina), niceritrol y acipimox.

Tal como se emplea aquí, el término "inhibidor de CETP" o "compuesto que inhibe CETP" significa cualquier compuesto terapéutico derivado de fuentes químicas o biológicas que inhibe la actividad de la proteína de transferencia de éster de colesterilo.

"Terapia combinada" representa la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar un estado hiperlipidémico, por ejemplo aterosclerosis e hipercolesterolemia. Dicha administración abarca la co-administración de estos agentes terapéuticos de un modo prácticamente simultáneo, tal como en una sola forma de dosificación que tiene una relación fija de ingredientes activos, o bien en múltiples formas de dosificación, separadas, para cada agente inhibidor. Además, dicha administración abarca también el uso de cada tipo de agente terapéutico de un modo secuencial. En cualquier caso, el régimen de tratamiento proporcionará efectos beneficiosos de combinación de fármacos en el tratamiento del estado hiperlipidémico.

La frase "terapéuticamente eficaz" está destinada a cualificar la cantidad combinada de inhibidores en la terapia combinada. Esta cantidad combinada conseguirá el objetivo de reducir o eliminar el estado hiperlipidémico.

"Compuesto terapéutico" significa un compuesto de utilidad en la profilaxis o tratamiento de un estado hiperlipidémico, incluyendo aterosclerosis e hipercolesterolemia.

b. Combinaciones

Las combinaciones de la presente invención tendrán diversos usos. Por ejemplo, por medio del ajuste de la dosificación y a través del control médico, las dosificaciones individuales de los compuestos terapéuticos usados en las combinaciones de la presente invención serán más bajas que las habituales para dosificaciones de los compuestos terapéuticos cuando se utilizan en monoterapia. El hecho de rebajar la dosificación proporcionará ventajas, incluyendo la reducción de efectos secundarios de los compuestos terapéuticos individuales, en comparación con la monoterapia. Además, los menores efectos secundarios de la terapia combinada, en comparación con la monoterapia, conducirá a una mayor complacencia del paciente con los regímenes de terapia.

Los compuestos útiles en la presente invención abarcan una amplia variedad de compuestos terapéuticos. Algunos compuestos inhibidores individuales de CETP se describen por separado en las siguientes solicitudes de patente individuales.

R9. Solicitud de Patente US No. de serie 60/101661

R10. Solicitud de Patente US No. de serie 60/101711.

R11. Solicitud de Patente US No. de serie 60/101660.

R12. Solicitud de Patente US No. de serie 60/101664.

R13. Solicitud de Patente US No. de serie 60/101668.

R14. Solicitud de Patente US No. de serie 60/101662.

R15. Solicitud de Patente US No. de serie 60/101663.

R16. Solicitud de Patente US No. de serie 60/101669.

R17. Solicitud de Patente US No. de serie 60/101667.

R18. Solicitud de Patente US No. de serie 09/401.916.

R19. Solicitud de Patente US No. de serie 09/405.524.

R20. Solicitud de Patente US No. de serie 09/404.638.

R21. Solicitud de Patente US No. de serie 09/404.638.

R22. Solicitud de Patente US No. de serie 09/400.915.

R23. Patente US No. 5.932.587.

R24. Patente US No. 5.925.645.

El compuesto inhibidor de CETP usado en la presente invención es el compuesto C-12 mostrado en la tabla 1, así como sus diastereomeros, enantiómeros, racematos, sales y tautómeros.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

2

3

4

5

6

Los derivados de ácido nicotínico útiles en las combinaciones y métodos de la presente invención comprenden una amplia variedad de estructuras y funcionalidades. En la tabla 2 se describen compuestos derivados de ácido nicotínico preferidos para la presente invención. Los compuestos terapéuticos de la tabla 2 se pueden emplear en la presente invención en diversas formas, incluyendo la forma de ácido, la forma de sal, los racematos, los enantiómeros, los zwitteriones y los tautómeros.

TABLA 2

Compuesto número	Nombre común	Número registro CAS	Patentes
G-118	Acido nicotínico	59-67-6
G-117	Niceritrol	5868-05-3	GB 1022880
G-3	Acipimox	51037-30-0	GB 1351967

Los compuestos (por ejemplo, derivados de ácido nicotínico o compuestos inhibidores de CETP) útiles en la presente invención pueden no tener átomos de carbono asimétricos o, alternativamente, los compuestos útiles pueden tener uno o más átomos de carbono asimétricos. Cuando los compuestos útiles tienen uno o más átomos de carbono asimétricos, los mismos incluyen, por tanto, racematos y estereoisómeros, tales como diastereomeros y enantiomeros, tanto en forma pura como en mezcla. Dichos estereoisómeros se pueden preparar usando técnicas convencionales, bien por reacción de materiales de partida enantioméricos o bien separando isómeros de compuestos de la presente invención.

Los isómeros pueden incluir isómeros geométricos, por ejemplo, isómeros cis o isómeros trans a través de un doble enlace. Todos esos isómeros quedan contemplados entre los compuestos útiles en la presente invención.

Los compuestos de utilidad en la presente invención incluyen también tautómeros.

Los compuestos útiles en la presente invención, como más abajo se expone, incluyen sus sales, solvatos y profármacos.

Dosificaciones, formulaciones y vías de administración

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar para la profilaxis y tratamiento de enfermedades o estados hiperlipidémicos por cualquier medio, preferentemente oral, que produzca el contacto de estos compuestos con su punto de acción en el cuerpo, por ejemplo en el íleo, plasma o hígado de un mamífero, por ejemplo, un humano.

Para la profilaxis o tratamiento de los estados antes indicados, los compuestos útiles en las composiciones de la presente invención pueden ser usados como el compuesto per se. Las sales farmacéuticamente aceptables son en particular adecuadas para aplicaciones médicas debido a su mayor solubilidad acuosa con respecto al compuesto principal. Dichas sales deben tener evidentemente un anión o catión farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, adecuadas, de los compuestos de la presente invención, incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos, tales como ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico, sulfónico y sulfúrico, y de ácidos orgánicos tales como ácidos acético, bencenosulfónico, benzoico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glicólico, isotiónico, láctico, lactobiónico, maleico, málico, metanosulfónico, succínico, toluenosulfónico, tartárico y trifluoracético. La sal hidrocloruro es particularmente preferida para fines médicos. Las sales básicas farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen sales amónicas, sales de metales alcalinos, tales como sales de sodio y potasio, y sales de metales alcalinotérreos tales como sales de magnesio y calcio.

Como es lógico, es necesario que los aniones útiles en la presente invención sean también farmacéuticamente aceptables y, por tanto, se elegirán también entre la lista anterior.

Los compuestos útiles en la presente invención pueden ser presentados con un vehículo aceptable en forma de una composición farmacéutica. Como es lógico, el vehículo debe ser aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición y no ha de resultar perjudicial para el receptor. El vehículo puede ser un sólido o un líquido, o bien ambos, y preferentemente se formula con el compuesto como una composición de unidad de dosificación, por ejemplo, un comprimido, que puede contener de 0,05 a 95% en peso del compuesto activo. También pueden estar presentes otras sustancias farmacológicamente activas, incluyendo otros compuestos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar por cualquiera de las técnicas farmacéuticas ya bien conocidas, consistentes esencialmente en mezclar los componentes.

Opcionalmente, la combinación de la presente invención puede comprender una composición que incluye un compuesto inhibidor de CETP y un compuesto derivado de ácido nicotínico. En dicha composición, el compuesto inhibidor de CETP y el compuesto derivado de ácido nicotínico pueden estar presentes en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, una píldora, una cápsula o un líquido que contiene ambos compuestos.

Dichos compuestos se pueden administrar por cualquier medio convencional disponible para utilizarse en combinación con productos farmacéuticos, bien como compuestos terapéuticos individuales o bien como una combinación de compuestos terapéuticos.

La cantidad de compuesto que se requiere para conseguir el efecto biológico deseado dependerá, como es lógico, de varios factores tales como el compuesto específico elegido, el uso al cual se destina, el modo de administración y el estado clínico del receptor.

La dosis diaria total de un derivado de ácido nicotínico puede ser generalmente del orden de 500 a 10.000 mg/día aproximadamente, con preferencia de 1.000 a 8.000 mg/día aproximadamente y más preferentemente de 3.000 a 6.000 mg/día aproximadamente, en dosis simples o divididas.

Para un inhibidor de CETP, en general puede ser adecuada una dosis diaria total de alrededor de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal/día y con preferencia entre 0,5 y 20 mg/kg de peso corporal/día aproximadamente.

Las dosis diarias descritas en los párrafos anteriores para los diversos compuestos terapéuticos se pueden administrar al paciente en una sola dosis o en subdosis múltiples proporcionadas. Las subdosis se pueden administrar 2 a 6 veces al día. Las dosis pueden estar en una forma de liberación sostenida eficaz para obtener los resultados deseados.

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En el caso de sales farmacéuticamente aceptables, los pesos indicados anteriormente se refieren al peso del equivalente ácido o del equivalente básico del compuesto terapéutico derivado de la sal.

La administración oral de las composiciones de la presente invención pueden incluir formulaciones, como ya son bien conocidas en la técnica, para proporcionar la liberación prolongada o sostenida del fármaco en el tracto gastrointestinal por cualquier número de mecanismos. Estos incluyen, pero no de forma limitativa, liberación sensible al pH de la forma de dosificación, basado en el pH cambiante del intestino pequeño, la erosión lenta de un comprimido o cápsula, la retención en el estómago basado en las propiedades físicas de la formulación, la bioadhesión de la forma de dosificación al revestimiento mucosal del tracto intestinal o la liberación enzimática del fármaco activo a partir de la forma de dosificación. Para algunos de los compuestos terapéuticos útiles en la presente invención (por ejemplo, un inhibidor de CETP o un derivado de ácido nicotínico), el efecto contemplado es el de extender el periodo de tiempo durante el cual se suministra la molécula de fármaco activo al punto de acción (por ejemplo, el íleo) por manipulación de la forma de dosificación. De este modo, dentro del alcance de la presente invención se encuentran las formulaciones de liberación controlada provistas de revestimientos entéricos. Revestimientos entéricos adecuados incluyen acetato-ftalato de celulosa, acetato-ftalato de polivinilo, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa y polímeros aniónicos de ácido metacrílico y éster metílico de ácido metacrílico.

Las combinaciones de la presente invención se pueden suministrar por vía oral en forma sólida, semi-sólida o líquida. En el caso de una forma líquida o semi-sólida, las combinaciones de la presente invención pueden encontrarse, por ejemplo, en forma de un líquido, jarabe o contenidas en una cápsula de gel. Según una modalidad, el inhibidor de CETP se puede proporcionar en forma de un líquido, jarabe o puede estar contenido en una cápsula de gel. En otra modalidad, el derivado de ácido nicotínico se puede proporcionar en forma de un líquido, jarabe o puede estar contenido en una cápsula de gel.

Para un inhibidor de CETP, la dosis administrable por vía intravenosa puede ser, por ejemplo, del orden de alrededor de 0,003 a 1 mg/kg de peso corporal, con preferencia de alrededor de 0,01 a 0,75 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de alrededor de 0,1 a 0,6 mg/kg de peso corporal.

Cuando se administra por vía intravenosa, la dosis para un derivado de ácido nicotínico puede ser, por ejemplo, del orden de alrededor de 150 a 3.000 mg/kg de peso corporal, con preferencia de alrededor de 300 a 2.000 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de alrededor de 500 a 1.000 mg/kg de peso corporal.

La dosis de cualquiera de estos compuestos terapéuticos se puede administrar convenientemente como una infusión de 10 a 100 ng/kg de peso corporal por minuto aproximadamente. Los fluidos de infusión adecuados para esta finalidad pueden contener, por ejemplo, de alrededor de 0,1 ng a 10 mg, con preferencia de alrededor de 1 ng a 10 mg por mililitro. Las dosis unitarias pueden contener, por ejemplo, de alrededor de 1 mg a 10 g del compuesto de la presente invención. De este modo, las ampollas para inyección pueden contener, por ejemplo, de alrededor de 1 a 100 mg.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención incluyen aquellas que son adecuadas para administración oral, rectal, local, bucal (por ejemplo, sublingual) y parenteral (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa), aunque la vía más adecuada dependerá en cualquier caso dado de la naturaleza y severidad del estado a tratar y de la naturaleza del compuesto particular que esté siendo utilizado. En la mayoría de los casos, la vía de administración preferida es la oral.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración oral se pueden presentar en unidades discretas, tales como cápsulas, sellos, pastillas o comprimidos, conteniendo cada una de tales unidades una cantidad predeterminada de al menos un compuesto terapéutico útil en la presente invención; como un polvo o gránulos; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión en aceite en agua o de agua en aceite. Como se ha indicado, dichas composiciones se pueden preparar por cualquier método de farmacia adecuado y que incluye la etapa de poner en asociación el compuesto o compuestos activos con el vehículo (el cual puede constituir uno o más ingredientes accesorios). En general, las composiciones se preparan mezclando uniforme e íntimamente el compuesto activo con un vehículo líquido o sólido finamente dividido, o con ambos, tras lo cual, si es necesario, se conforma el producto. Por ejemplo, se puede preparar un comprimido comprimiendo o moldeando un polvo o gránulos del compuesto, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos se pueden preparar mediante compresión, en una máquina adecuada, del compuesto en una forma que fluye libremente, tal como un polvo o gránulos opcionalmente mezclados con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte y/o uno o más agentes de superficie activa/dispersantes. Los comprimidos moldeados se pueden preparar mediante moldeo, en una máquina adecuada, del compuesto en polvo mojado con un diluyente líquido inerte.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración bucal (sublingual) incluyen pastillas que comprenden un compuesto de la presente invención en una base aromatizada, normalmente sucrosa, y acacia o tragacanto, y pastillas que comprenden el compuesto en una base inerte tal como gelatina o glicerina o sucrosa y acacia.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral comprenden convenientemente preparados acuosos estériles de un compuesto de la presente invención. Estos preparados se administran con preferencia por vía intravenosa, si bien la administración también se puede efectuar por medio de inyección subcutánea, intramuscular o intradérmica. Dichos preparados se pueden obtener convenientemente mezclando el compuesto con agua y haciendo que la solución resultante sea estéril e isotónica con la sangre. Las composiciones inyectables según la invención contendrán generalmente de 0,1 a 5% p/p de un compuesto como el aquí descrito.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración rectal se presentan preferentemente como supositorios de dosis unitaria. Estos se pueden preparar mezclando un compuesto de la presente invención con uno o más vehículos sólidos convencionales, por ejemplo, manteca de cacao, y conformando entonces la mezcla resultante.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para aplicación tópica en la piel tienen preferentemente la forma de un ungüento, crema, loción, pasta, gel, pulverización, aerosol o aceite. Vehículos que pueden ser usados incluyen petrolato (por ejemplo, vaselina), lanolina, polietilenglicoles, alcoholes y combinaciones de dos o más de los anteriores. El compuesto activo está presente generalmente en una concentración de 0,1 a 50% p/p de la composición, por ejemplo, de 0,5 a 2%.

También es posible la administración transdérmica. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración transdérmica se pueden presentar como parches discretos adaptados para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un largo periodo de tiempo. Dichos parches contienen adecuadamente un compuesto de la presente invención en una solución acuosa, opcionalmente tamponada, disuelto y/o dispersado en un adhesivo o dispersado en un polímero. Una concentración adecuada del compuesto activo es de alrededor de 1 a 35%, con preferencia de alrededor de 3 a 15%. Como una posibilidad particular, el compuesto puede ser suministrado desde el parche mediante electrotransporte o iontofóresis, por ejemplo, como se describe en Pharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986).

En cualquier caso, la cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con los materiales usados como vehículos, para producir una forma de dosificación individual que ha de ser administrada, variará dependiendo del hospedante tratado y del modo de administración particular.

Las formas de dosificación sólidas para la administración oral que incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos, cápsulas de gel y gránulos como se ha indicado anteriormente, comprenden uno o más compuestos útiles en la presente invención mezclados con al menos un diluyente inerte tal como sucrosa, lactosa o almidón. Dichas formas de dosificación pueden comprender también, como en la práctica normal, otras sustancias distintas de diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tal como estearato de magnesio o agentes solubilizantes tal como ciclodextrinas. En el caso de cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas de gel y píldoras, las formas de dosificación pueden comprender también agentes tampón. Los comprimidos y las píldoras pueden prepararse además con revestimientos entéricos.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires, farmacéuticamente aceptables, que contienen los diluyentes inertes normalmente usados en este campo, tal como agua. Dichas composiciones pueden comprender también adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes de suspensión, así como agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes.

Los preparados inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas estériles, inyectables, se pueden formular según la técnica conocida empleando agentes dispersantes y agentes de suspensión adecuados. El preparado inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico y parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden ser usados se encuentran agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, como medio disolvente o medio de suspensión se emplean convencionalmente aceites fijos, estériles. Para esta finalidad, se puede emplear cualquier aceite fijo insípido, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. En adición, en la preparación de inyectables encuentran aplicación los ácidos grasos, tal como ácido oleico.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables abarcan todos los anteriores.

En la terapia combinada, la administración de dos o más agentes terapéuticos, útiles en la presente invención, puede tener lugar secuencialmente en formulaciones separadas, o bien se puede realizar por administración simultánea en una sola formulación o en formulaciones separadas. La administración se puede efectuar por vía oral o por inyecciones intravenosas, intramusculares o subcutáneas. La formulación puede estar en forma de un bolo o en forma de soluciones o suspensiones inyectables, estériles, isotónicas, acuosas o no acuosas. Estas soluciones y suspensiones se pueden preparar a partir de polvos o gránulos estériles que tienen uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, o un aglutinante tal como gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa, junto con uno o más de un lubricante, un conservante, un agente de superficie activa o un agente dispersante.

Para administración oral, la composición farmacéutica puede estar en forma, por ejemplo, de un comprimido, cápsula, suspensión o líquido. Las cápsulas, los comprimidos, etc, se pueden preparar por métodos convencionales bien conocidos en este campo. La composición farmacéutica se prepara preferentemente en forma de una unidad de dosificación que contiene una cantidad particular del ingrediente o ingredientes activos. Ejemplos de unidades de dosificación son los comprimidos o las cápsulas. Estas unidades pueden contener convenientemente uno o más compuestos terapéuticos en la cantidad anteriormente descrita. Por ejemplo, en el caso de un inhibidor de CETP, las dosis pueden ser del orden de 0,01 mg/día a 500 mg/día aproximadamente o cualquier otra dosis, dependiendo del inhibidor específico, como es conocido en la técnica. En el caso de un derivado de ácido nicotínico, la dosis puede ser del orden de 0,01 a 500 mg aproximadamente o cualquier otra dosis, dependiendo del inhibidor específico, como es conocido en la técnica.

Los ingredientes activos se pueden administrar también por inyección como una composición en donde, por ejemplo, se puede emplear salina, dextrosa o agua como un vehículo adecuado. Una dosis diaria adecuada de cada compuesto terapéutico activo es aquella que consigue el mismo nivel en suero sanguíneo que el producido por administración oral, como se ha descrito anteriormente.

Los compuestos terapéuticos puede ser administrados además por cualquier combinación de vías oral/oral,
oral/parenteral o parenteral/parenteral.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar en forma oral o por administración intravenosa. Se prefiere la administración oral de la terapia combinada. La dosificación para la administración oral puede efectuarse con un régimen que requiere una sola dosis diaria o bien una sola dosis en días alternos, o bien múltiples dosis espaciadas durante todo el día. Los compuestos terapéuticos que constituyen la terapia combinada se pueden administrar de forma simultánea, bien en una forma de dosificación combinada o bien en forma de dosificación separadas destinadas a una administración oral prácticamente simultánea. Los compuestos terapéuticos que constituyen la terapia combinada se pueden administrar en secuencia, administrándose cualquiera de los compuestos terapéuticos mediante un régimen que requiere la ingestión en dos etapas. Así, un régimen puede requerir la administración en secuencia de los compuestos terapéuticos con ingestión, espaciada entre sí de los agentes activos separados. El periodo de tiempo entre las múltiples etapas de ingestión puede oscilar entre unos pocos minutos y varias horas, dependiendo de las propiedades de cada compuesto terapéutico tales como potencia, solubilidad, biodisponibilidad, vida media en plasma y perfil cinético del compuesto terapéutico, así como dependiendo del efecto de la ingestión de alimentos y de la edad y estado del paciente. La variación circadiana de la concentración de la molécula diana puede determinar también el intervalo óptimo de dosificación. Los compuestos terapéuticos de la terapia combinada independientemente de que se administren de forma simultánea, prácticamente de forma simultánea o en secuencia, pueden implicar un régimen que requiere la administración de un compuesto terapéutico por vía oral y de otro compuesto terapéutico por vía intravenosa. Independientemente de que los compuestos terapéuticos de la terapia combinada se administren por vía oral o intravenosa, por separado o juntos, cada uno de dichos compuestos terapéuticos estará contenido en una formulación farmacéutica adecuada de excipientes, diluyentes u otros componentes para formulaciones, todos ellos farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de formulaciones farmacéuticamente aceptables, adecuadas, que contienen los compuestos terapéuticos para administración oral, han sido ofrecidos anteriormente.

Régimen de tratamiento

En función de diversos factores, se selecciona el régimen de dosificación para prevenir, aliviar o mejorar un estado de enfermedad que presenta hiperlipidemia como un elemento de la enfermedad, por ejemplo, aterosclerosis, o para proteger contra, o tratar, otros niveles altos de colesterol en plasma o sangre con los compuestos y/o composiciones de la presente invención. Dichos factores incluyen el tipo, edad, peso, sexo, dieta y estado médico del paciente, la severidad de la enfermedad, la vía de administración, consideraciones farmacológicas tales como los perfiles de actividad, eficacia, farmacocinética y toxicología del compuesto particular empleado, independientemente de que sistema de administración del fármaco se utilice e independientemente de que el compuesto se administre como parte de una combinación de fármacos. De este modo, el régimen de dosificación realmente usado puede variar ampliamente y, por tanto, puede desviarse del régimen de dosificación preferido anteriormente indicado.

El tratamiento inicial de un paciente que padece de un estado hiperlipidémico puede iniciarse con las dosis antes indicadas. El tratamiento deberá continuarse generalmente según sea necesario durante un periodo de varias semanas a varios meses o años hasta que el estado de la enfermedad hiperlipidémica ha sido controlado o eliminado. Los pacientes sometidos a tratamiento con los compuestos o composiciones que aquí se describen pueden ser controlados de forma rutinaria, por ejemplo, midiendo los niveles de LDL y de colesterol total en suero por cualquiera de los métodos ya conocidos en la técnica, para determinar la eficacia de la terapia combinada. El análisis continuo de dichos datos permite modificar el régimen de tratamiento durante la terapia, de manera que en cada momento de tiempo se administren las cantidades eficaces óptimas de cada tipo de compuesto terapéutico y de manera que pueda determinarse también la duración del tratamiento. De este modo, el régimen de tratamiento/programa de dosificación puede ser modificado de forma racional en el transcurso de la terapia, de manera que se administre la cantidad más baja de los compuestos terapéuticos que, de forma conjunta, exhiben una eficacia satisfactoria y de manera que la administración se continúe únicamente en tanto en cuanto sea necesario para tratar con éxito el estado hiperlipidémico.

Una ventaja potencial de la terapia combinada aquí descrita puede consistir en el uso de una menor cantidad de dosificación de cualquier compuesto terapéutico individual, o bien de todos los compuestos terapéuticos, eficaz en el tratamiento de estados hiperlipidémicos tales como aterosclerosis e hipercolesterolemia. La disminución de la dosis proporcionará ventajas, incluyendo una reducción de los efectos secundarios de los efectos terapéuticos individuales en comparación con la monoterapia.

Una de las diversas modalidades de la presente invención comprende una terapia combinada que incluye el uso de una primera cantidad de un inhibidor de CETP y de una segunda cantidad de otro compuesto terapéutico cardiovascular de utilidad en la profilaxis o tratamiento de hiperlipidemia o aterosclerosis, en donde dicha primera cantidad y dicha segunda cantidad comprenden, conjuntamente, una cantidad eficaz para un estado anti-hiperlipidémico o una cantidad eficaz para un estado anti-aterosclerótico de dichos compuestos. Por ejemplo, una de las muchas modalidades de la presente invención es una terapia combinada que comprende dosis terapéuticas de un inhibidor de CETP y de un derivado de ácido nicotínico.

Las modalidades de la presente invención pueden comprender una terapia combinada en donde se emplean dos o más de los compuestos terapéuticos aquí descritos o incorporados. La terapia combinada puede comprender dos o más compuestos terapéuticos de diferentes clases químicas, por ejemplo, un derivado de ácido nicotínico se puede combinar terapéuticamente con un inhibidor de CETP. Las combinaciones terapéuticas pueden comprender más de dos compuestos terapéuticos. Por ejemplo, la terapia puede comprender el uso de un derivado de ácido nicotínico, un inhibidor de CETP y un inhibidor de HMG CoA reductasa. Alternativamente, dos o más compuestos terapéuticos de la misma clase química pueden constituir la terapia, por ejemplo, una terapia combinada que comprende dos o más derivados de ácido nicotínico o dos o más inhibidores de CETP.

Otra modalidad de la presente invención comprende el uso de cualquiera de las terapias combinadas cardiovasculares aquí descritas para la profilaxis o tratamiento de hipercolesterolemia, aterosclerosis o hiperlipidemia.

Los siguientes ejemplos no limitativos sirven para ilustrar los diversos aspectos de la presente invención.

c. Ejemplos

La tabla 3 ilustra ejemplos de algunas combinaciones de la presente invención y algunas otras combinaciones para fines ilustrativos en donde la combinación comprende una primera cantidad de un inhibidor de CETP y una segunda cantidad de un derivado de ácido nicotínico, en donde dicha primera cantidad y dicha segunda cantidad, conjuntamente, comprenden una cantidad eficaz para un estado anti-hiperlipidémico o una cantidad eficaz para un estado anti-aterosclerótico de dichos compuestos.

TABLA 3

Ejemplo número	Componente 1	Componente 2
1	C-1	Acido nicotínico (niacina)
2	C-2	Acido nicotínico (niacina)
3	C-3	Acido nicotínico (niacina)
4	C-4	Acido nicotínico (niacina)
5	C-5	Acido nicotínico (niacina)
6	C-6	Acido nicotínico (niacina)
7	C-7	Acido nicotínico (niacina)
8	C-8	Acido nicotínico (niacina)
9	C-9	Acido nicotínico (niacina)
10	C-10	Acido nicotínico (niacina)
11	C-11	Acido nicotínico (niacina)
12	C-12	Acido nicotínico (niacina)
13	C-13	Acido nicotínico (niacina)
14	C-14	Acido nicotínico (niacina)
15	C-15	Acido nicotínico (niacina)
16	C-16	Acido nicotínico (niacina)
17	C-17	Acido nicotínico (niacina)
18	C-18	Acido nicotínico (niacina)

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo número	Componente 1	Componente 2
19	C-19	Acido nicotínico (niacina)
20	C-20	Acido nicotínico (niacina)
21	C-1	Niceritrol
22	C-2	Niceritrol
23	C-3	Niceritrol
24	C-4	Niceritrol
25	C-5	Niceritrol
26	C-6	Niceritrol
27	C-7	Niceritrol
28	C-8	Niceritrol
29	C-9	Niceritrol
30	C-10	Niceritrol
31	C-11	Niceritrol
32	C-12	Niceritrol
33	C-13	Niceritrol
34	C-14	Niceritrol
35	C-15	Niceritrol
36	C-16	Niceritrol
37	C-17	Niceritrol
38	C-18	Niceritrol
39	C-19	Niceritrol
40	C-20	Niceritrol
41	C-1	Acipimox
42	C-2	Acipimox
43	C-3	Acipimox
44	C-4	Acipimox
45	C-5	Acipimox
46	C-6	Acipimox
47	C-7	Acipimox
48	C-8	Acipimox
49	C-9	Acipimox

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo número	Componente 1	Componente 2
50	C-10	Acipimox
51	C-11	Acipimox
52	C-12	Acipimox
53	C-13	Acipimox
54	C-14	Acipimox
55	C-15	Acipimox
56	C-16	Acipimox
57	C-17	Acipimox
58	C-18	Acipimox
59	C-19	Acipimox
60	C-20	Acipimox

Ensayos biológicos

La utilidad de las combinaciones de la presente invención se puede demostrar por los siguientes ensayos. Estos ensayos son realizados in vitro y en modelos con animales usando esencialmente procedimientos reconocidos para demostrar la utilidad de la presente invención.

Ensayo in vitro de compuestos que inhiben la absorción, mediada por IBAT, de [^{14}C]-Taurocolato(TC) en células H14

Células de riñón de hámster bebé (BHK) transfectadas con el cDNA de IBAT humano (células H14) se siembran en la proporción de 60.000 células/pocillo en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos para ensayos a realizar en el plazo de 24 horas desde la siembra, en la proporción de 30.000 células/pocillo para ensayos a realizar en el plazo de 48 horas y en la proporción de 10.000 células/pocillo para ensayos a realizar en el plazo de 72 horas.

En el día del ensayo, la monocapa de células se lava suavemente una vez con 100 \mul de tampón de ensayo (medio de Tagle modificado según Dulbecco con 4,5 g/l de glucosa + 0,2% (p/v) de albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos (FAF)BSA). A cada pocillo se añaden 50 \mul de un concentrado doble de compuesto de ensayo en el tampón de ensayo junto con 50 \mul de 6 \muM [^{14}C]-taurocolato en tampón de ensayo (concentración final: 3 \muM de [^{14}C]-taurocolato). Las placas de cultivo de células se incuban 2 horas a 37ºC antes de lavar suavemente cada pocillo dos veces con 100 \mul de salina tamponada con fosfato a 4ºC según Dulbecco (PBS) conteniendo 0,2% (p/v) de (FAF)BSA. Los pocillos son entonces lavados suavemente una vez con 100 \mul de PBS a 4ºC sin (FAF)BSA. A cada uno de ellos se añaden 200 \mul de fluido líquido para el recuento por escintilación, se sellan las placas por calor y se sacuden durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de medir la cantidad de radioactividad en cada pocillo empleando un instrumento Packard Top-Count.

Ensayo in vitro de compuestos de inhiben la absorción de [^{14}C]-Alanina

El ensayo de absorción de alanina puede ser realizado de un modo idéntico al ensayo con taurocolato, con la excepción de que se utiliza alanina radiomarcada en lugar de taurocolato radiomarcado.

Ensayo in vivo de compuestos que inhiben la absorción ileal de la rata de [^{14}C]-taurocolato en bilis

(Véase "Metabolism of 3\alpha,7\beta-dihydroxy-7\alpha-methyl- 5\beta-cholanoic acid and 3\alpha,7\beta-dihydroxy-7\alpha-methyl-5\beta-cholanoic acid in hamsters" en Biochimica et Biophysica Acta, 833, 196-202 (1985) de Une et al.).

Se anestesian ratas Wistar machos (200-300 g) con inactiva @100 mg/kg. Se canulan los conductos biliares con una longitud de 10 pulgadas de tubo de PE10. Se deja expuesto el intestino delgado y se deposita sobre una compresa de gasa. Se inserta una cánula (adaptador hembra ahusado, cierre leer de 1/8 pulgadas) a 12 cm de la unión del intestino delgado con el ciego. Se practica una raja a 4 cm de esta misma unión (utilizando una longitud de íleo de 8 cm). Para lavar el segmento de intestino se utilizan 20 ml de salina tamponada con fosfato caliente de Dulbecco, pH 6,5 (PBS). La abertura distal se canula con una longitud de 20 cm de tubo de silicona (0,02'' D.I. x 0,037'' D.E.). La cánula proximal se conecta a una bomba peristáltica y el intestino se lava durante 20 minutos con PBS caliente a 0,25 ml/min. La temperatura del segmento de intestino se controla de forma continua. Al comienzo del experimento, se cargan en el segmento de intestino, por medio de una jeringa de 3 ml, 2 ml de muestra de control ([^{14} C]-taurocolato @ 0,05 mCi/ml con 5 mM de taurocolato no radiomarcado) y se inicia la recogida de muestras biliares. La muestra de control es infusionada a una velocidad de 0,25 ml/minuto durante 21 minutos. Se recogen fracciones de muestras biliares cada 3 minutos durante los primeros 27 minutos del procedimiento. Después de los 21 minutos de infusión de la muestra, el bucle ileal se lava con 20 ml de PBS caliente (usando una jeringa de 30 ml) y luego se lava el bucle durante 21 minutos con PBS caliente a 0,25 ml/min. Se inicia una segunda perfusión como se ha descrito anteriormente pero esta vez administrándose también el compuesto del ensayo (21 minutos de administración seguido por 21 minutos de lavado) y se toman muestras de bilis cada 3 minutos durante los primeros 27 minutos. Si es necesario, se realizará una tercera perfusión como anteriormente que normalmente contiene la muestra de control.

Medición de la concentración de colesterol hepático (COL HEPATICO)

Se pesa tejido hepático y se homogeniza en cloroformo/metanol (2:1). Después de la homogenización y del centrifugado, el sobrenadante se separa y se seca bajo nitrógeno. El residuo se disuelve en isopropanol y se mide enzimáticamente el contenido en colesterol usando una combinación de colesterol oxidasa y peroxidasa, como ha sido descrito por Allain, C. A. et al., Clin. Chem., 20, 470 (1974).

Medición de la actividad hepática de HMG CoA-reductasa (HMG COA)

Se preparan microsomas hepáticos homogenizando muestras hepáticas en un tampón de fosfato/sucrosa, seguido por separación centrífuga. El material pelletizado final se resuspende en tampón y se analiza una parte alícuota respecto a la actividad de HMG CoA reductasa por incubación durante 60 minutos a 37ºC en presencia de ^{14}C-HMG-CoA (Dupont-NEN). La reacción se detiene añadiendo 6 N HCl seguido por centrifugado. Se separa una parte alícuota del sobrenadante por cromatografía de capa delgada y la mancha correspondiente al producto enzimático se separa de la placa mediante raspado, se extrae y se determina la radiactividad mediante recuento por escintilación. (Referencia: Akerlund, J. y Bjorkhem, I. (1990) J. Lipid. Res. 31, 2159).

Determinación de colesterol (SER. COL, HDL-COL, TGI y VLDL + LDL) en suero

Se mide el colesterol total en suero (SER-COL) enzimática usando un kit comercial de Wako Fine Chemicals (Richmond, VA); Cholesterol C11, catálogo No. 276-64909. Se analiza el colesterol HDL (HDL-COL) usando este mismo kit después de la precipitación de VLDL y LDL con reactivo de Sigma Chemical Co. HDL Cholesterol, catálogo No. 352-3 (método del dextrano sulfato). Se analiza el total de triglicéridos en suero (preliminar) (TGI) enzimáticamente usando reactivo de Sigma Chemical Co. GPO-Trinder, catálogo No. 337-B. Las concentraciones de colesterol VLDL y LDL (VLDL + LDL) se calculan como la diferencia entre el colesterol total y el colesterol HDL.

Medición de la actividad hepática de colesterol 7-\alpha-hidroxilasa (7a-OHasa)

Se preparan microsomas hepáticos por homogenización de muestras hepáticas en un tampón de fosfato/sucrosa, seguido por separación centrífuga. El material pelletizado final se resuspende en tampón y se analiza una parte alícuota respecto a la actividad de colesterol 7-\alpha-hidroxilasa por incubación durante 5 minutos a 37ºC en presencia de NADPH. Después de la extracción en éter de petróleo, el disolvente orgánico se evapora y el residuo se disuelve en acetonitrilo/metanol. El producto enzimático se separa por inyección de una parte alícuota del extracto en una columna HPLC de fase invertida C_{18} y cuantificando el material eluido usando detección UV a 240 nm. (Referencia: Horton, J. D., et al (1994) J. Clin. Invest. 93, 2084).

Ensayo de administración en ratas por medio de sonda

Ratas Wister machos (275-300 g) se administran con inhibidores de IBAT usando un procedimiento de alimentación oral por sonda. Se administra fármaco o vehículo (0,2% TWEEN 80 en agua) una vez al día (9:00-10:00 a.m.) durante 4 días a dosis variables en un volumen final de 2 ml por kg de peso corporal. (TWENN 80 es un surfactante de óxido de polietileno-monooletato de sorbitan 20 molar preparado por ICI Specialty Chemicals, Wilmington, Delaware, USA). Durante las 48 horas finales del periodo de tratamiento se recogen todas las muestras fecales y se analizan respecto al contenido en ácido biliar usando un análisis enzimático como más abajo se describe. La eficacia del compuesto se determinará comparando el incremento de la concentración de ácido biliar fecal (FBA) en las ratas tratadas con la concentración media de FBA de ratas del grupo tratado con vehículo.

Medición de la concentración de ácido biliar fecal (FBA) en hamsters

Se recoge durante 24 o 48 horas toda la materia fecal de hamsters enjaulados individualmente, se seca bajo una corriente de nitrógeno, se pulveriza, se mezcla y se pesa. Se pesan aproximadamente 0,1 g y esta cantidad se extrae en un disolvente orgánico (butanol/agua). Después de la separación y del secado, el residuo se disuelve en metanol y se mide enzimáticamente la cantidad de ácido biliar presente usando la reacción de 3\alpha-hidroxiesteroide esteroide dehidrogenasa con ácidos biliares para reducir NAD. (Véase Mashige, F. et al. Clin.Chem., 27, 1352 (1981).

Absorción de [^{3}H]-taurocolato en vesículas de la membrana del borde en cepillo del conejo (BBMV)

Se preparan membranas del borde en cepillo ileal del conejo a partir de mucosa ileal congelada mediante el método de precipitación con calcio descrito por Malathi et al. (Biochimica Biophysica Acta, 554, 259 (1979). El método para medir taurocolato es esencialmente el descrito por Kramer et al. (Biochimica Biophysica Acta, 1111, 93 (1992) excepto que el volumen de ensayo será de 200 \mul en lugar de 100 \mul. De forma resumida, se incuba a temperatura ambiente una solución de 190 \mul que contiene 2 \muM [^{3}H]-taurocolato (0,75 \muCi), 20 mM tris, 100 mM NaCl, 100 mM manitol, pH 7,4, durante 5 segundos, con 10 \mul de vesículas de la membrana del borde en cepillo (60-120 \mug de proteína). La incubación se inicia por adición de las BBMV mientras se aplica movimiento vorticial y la reacción se detiene por adición de 5 ml de tampón enfriado con hielo (20 mM Hepes-tris, 150 mM KCl) seguido inmediatamente por filtración a través de un filtro de nylon (poros de 0,2 \mum) y de un lavado adicional con 5 ml de tampón de parada.

Acil-CoA; Colesterol Acil Transferasa (ACAT)

Se preparan microsomas de hígado de hámster y de intestino de rata a partir de tejido como anteriormente se ha descrito (J. Biol. Chem., 255, 9098 (1980)) y se utilizan como una fuente de enzima de ACAT. El ensayo consistirá en una incubación de 2 ml conteniendo 24 \muM Oleoil-CoA (0,05 \muCi) en un tampón de 50 mM de fosfato sódico, 2 mM de DTT, pH 7,4, conteniendo 0,25% de BSA y 200 \mug de proteína microsómica. El ensayo se iniciará por adición de oleoil-CoA. La reacción procede durante 5 minutos a 37ºC y se terminará por adición de 8 ml de cloroformo/metanol (2:1). A la extracción se añaden 125 \mug de oleato de colesterol en cloroformo/metanol para actuar como un vehículo y las fases orgánica y acuosa de la extracción se separan por centrifugado después de someterse a fondo a movimiento vorticial. La fase clorofórmica se lleva hasta sequedad y luego se mancha sobre una placa de gel de sílice 60 TLC y se desarrolla en hexano/éter etílico (9:1). La cantidad formada de éster de colesterol se determinará midiendo la cantidad de radioactividad incorporada en la mancha de oleato de colesterol sobre la placa de TLC, usando un Packard Instaimager.

Modelo con perros para evaluar fármacos que disminuyen los niveles de lípidos

Perros sabuesos machos, adquiridos en las granjas Marshall y que pesan 6-12 kg, se alimentan una vez al día durante 2 horas y luego son administrados con agua ad libitum. Los perros se asignan aleatoriamente a grupos de dosificación consistentes en 6 a 12 perros cada uno de ellos, tales como: vehículo, i.g.; 1 mg/kg, i.g.; 2 mg/kg, i.g.; 4 mg/kg, i.g.; 2 mg/kg, p.o. (polvo en cápsula). Empleando un tubo de alimentación por sonda se puede efectuar la dosificación intragástrica de un material terapéutico disuelto en solución acuosa (por ejemplo, solución de Tween 80 al 0,2% [mono-oleato de polioxietileno, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO]). Antes de iniciar la dosificación, se pueden extraer muestras de sangre de la vena cefálica en la mañana antes de realizar la alimentación con el fin de evaluar los niveles de colesterol (total y HDL) y de triglicéridos en suero. Durante varios días consecutivos, los animales son dosificados por la mañana, antes de ser alimentados. Se deja que los animales coman durante 2 horas antes de retirar cualquier resto de alimento. Las heces se recogen durante un periodo de 2 días al término del estudio y se analizan respecto al contenido en ácidos biliares o lípidos. Se toman también muestras de sangre, al término del periodo de tratamiento, para compararse con los niveles de lípidos en suero previos al estudio. La significación estadística se determinará usando el ensayo T de student estándar con p<0,05.

Medición en lípidos en sueros de perros

Se recoge sangre de la vena cefálica de perros en ayunas en tubos separadores de suero (Vacutainer SST, Becton Dickinson y Co., Franklin Lakes, NJ). La sangre se centrifuga a 2.000 rpm durante 20 minutos y se decanta el suero.

El colesterol total se puede medir en un formato de 96 pocillos empleando un kit de diagnóstico enzimático de Wako (Cholesterol CII) (Wako Chemicals, Richmond, VA), empleando la reacción de colesterol oxidasa para producir peróxido de hidrógeno el cual se mide colorimétricamente. En las dos primeras columnas de la placa se prepara una curva estándar de 0,5 a 10 \mug de colesterol. Las muestras de suero (20-40 \mul, dependiendo de la concentración de lípidos esperada) o muestras de control de suero conocidas se añaden a pocillos separados por duplicado. Se añade agua para llevar el volumen a 100 \mul en cada pocillo. A cada pocillo se añade una parte alícuota de 100 \mul de reactivo de color y las placas se leen a 500 nm después de una incubación de 15 minutos a 37ºC.

El colesterol HDL puede ser analizado usando el kit de Sigma No. 352-3 (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) que utiliza sulfato de dextrano e iones Mg para precipitar selectivamente LDL y VLDL. Se añade un volumen de 150 \mul de cada muestra de suero a los tubos individuales de una micrófuga, seguido por 15 \mul de reactivo para colesterol HDL (Sigma 352-3). Las muestras se mezclan y se centrifugan a 5.000 rpm durante 5 minutos. Se mezcla entonces una parte alícuota de 50 \mul del sobrenadante con 200 \mul de salina y se analiza empleando el mismo procedimiento como el usado para la medición del colesterol total.

Los triglicéridos se miden empleando el kit de Sigma No. 337 en un formato de placa de 96 pocillos. Este procedimiento medirá la cantidad de glicerol, después de su liberación por reacción de los triglicéridos con lipoproteína lipasa. Se utilizan soluciones estándar de glicerol (Sigma 339-11) que van desde 1 a 24 \mug para generar la curva estándar. A los pocillos se añaden, por duplicado, muestras de suero (20-40 \mul, dependiendo de la concentración esperada de lípidos). Se añade agua para llevar el volumen a 100 \mul en cada pocillo y también se añade, a cada pocillo, 100 \mul de reactivo de color. Después de mezclar y tras una incubación de 15 minutos, las placas son leídas a 540 nm y se calculan los valores de triglicéridos a partir de la curva estándar. También se analiza una placa de réplica empleando un reactivo enzimático testigo para corregir cualquier glicerol endógeno presente en las muestras de suero.

Medición de ácidos biliares fecales en perros

Se pueden recoger muestras fecales para determinar la concentración de ácidos biliares fecales (FBA) en cada animal. Las recogidas fecales se pueden efectuar durante las 48 horas finales del estudio, durante 2 periodos consecutivos de 24 horas entre 9:00 am y 10:00 am cada día, antes de la dosificación y de la alimentación. Las recogidas de 2 días, separadas, de cada animal, se pesan, se combinan y se homogenizan con agua destilada en un procesador (Cuisinart) para generar una suspensión espesa homogénea. Se extraen aproximadamente 1,4 g del homogenado en una concentración final de 50% de butanol terciario/agua destilada (2:0,6) durante 45 minutos en un baño de agua a 37ºC y se centrifuga durante 13 minutos a 2.000 x g. La concentración de ácidos biliares (mmoles/día) se puede determinar usando un sistema de análisis enzimático con 96 pocillos (1,2). Se añade una parte alícuota de 20 \mul del extracto fecal a dos series cada una de ellas de pocillos triplicados en una placa de análisis de 96 pocillos. También se analizan, respecto al control de calidad del ensayo, una solución normalizada de taurocolato sódico y una solución normalizada de extracto fecal (previamente preparada a partir de muestras reunidas y caracterizadas por su concentración de ácidos biliares). De manera similar, se añaden a dos series de pocillos triplicados partes alícuotas de 20 microlitros de taurocolato sódico, diluidas en serie para generar una curva estándar. A cada pocillo se añaden 230 \mul de mezcla de reacción que contiene 1 M de hidrato de hidracina, 0,1 M de pirofosfato y 0,46 mg/ml de NAD. A una de las dos series de pocillos triplicados se añade entonces una parte alícuota de 50 \mul de enzima 3a-hidroxiesteroide dehidrogenasa (HSD; 0,8 unidades/ml) o tampón de ensayo (pirofosfato sódico 0,1 M). Todos los reactivos pueden ser adquiridos en Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Después de 60 minutos de incubación a temperatura ambiente, se mide la densidad óptica a 340 nm y se calcula entonces la media de cada serie de muestras triplicadas. La diferencia en la densidad óptica \pm enzima HSD se utiliza entonces para determinar la concentración de ácidos biliares (mM) de cada muestra tomando como base la curva estándar de taurocolato sódico. La concentración de ácidos biliares del extracto, el peso del homogenado fecal (gramos) y el peso corporal del animal se emplean entonces para calcular la correspondiente concentración de FBA en mmoles/kg/día para cada animal. La concentración media de FBA (mmoles/kg/día) del grupo suministrado con vehículo se resta de la concentración FBA de cada grupo de tratamiento para determinar así el incremento (valor delta) en la concentración de FBA como resultado del tratamiento.

Ensayo de la actividad de CETP en plasma humano (éster de colesterilo tritiado)

Se obtiene sangre de voluntarios sanos. La sangre se recoge en tubos que contienen EDTA (colección de EDTA-plasma). La colección de EDTA-plasma humano previamente guardada a -20ºC, se descongela a temperatura ambiente y se centrifuga durante 5 minutos para separar cualquier materia en partículas. Se añade HDL tritiada, radiomarcada en la mitad éster de colesterilo ([^{3}H]CE-HDL) en la forma descrita por Morton y Zilversmit (J. Biol. Chem., 256, 11992-95 (1981)) al plasma a una concentración final de 25 \mug/ml de colesterol. Los compuestos inhibidores se añaden al plasma como sigue: mediante una pipeta se añaden volúmenes iguales del plasma que contiene [^{3}H]CE-HDL (396 \mul) al interior de micro-tubos (Titertube®, Bio-Rad laboratorios, Hercules, CA). Los compuestos, disueltos normalmente como soluciones madre 20-50 mM en DMSO, se diluyen en serie con DMSO (o con un disolvente alternativo en algunos casos, tal como dimetilformamida o etanol). A cada uno de los tubos de plasma se añaden entonces 4 \mul de cada una de las diluciones en serie de compuestos inhibidores o de solo DMSO. Los tubos se mezclan inmediatamente. Se transfieren entonces partes alícuotas por triplicado (100 \mul) de cada uno de los tubos de plasma a pocillos de placas de microvaloración de poliestireno de 96 pocillos de fondo redondo (Corning, Corning, NY). Las placas se sellan con película de material plástico y se incuban a 37ºC durante 4 horas. Los pocillos de ensayo contienen plasma con diluciones de compuestos inhibidores. Los pocillos de control contienen plasma con solo DMSO. Los pocillos testigo que contienen plasma con solo DMSO se dejan en los micro-tubos a 4ºC durante las cuatro horas de incubación y se añaden a los pocillos de microvaloración al término del periodo de incubación. Se precipitan VLDL y LDL mediante la adición de 10 \mul de reactivo precipitante (1% (p/v) de sulfato de dextrano (Dextralip50)/0,5 M de cloruro de magnesio, pH 7,4) a todos los pocillos. Los pocillos se mezclan en un mezclador de placas y luego se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las placas se centrifugan entonces a 1.000 x g durante 30 minutos a 10ºC. Los sobrenadantes (50 \mul) de cada pocillo se transfieren entonces a pocillos de placas Picoplate™ 96 (Packard, Meriden, CT) que contienen 250:1 Microscint™-40 (Packard, Meriden, CT). Las placas se sellan por calor (TopSeal^{TM}-P, Packard, Meriden, CT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se mezclan durante 30 minutos. La radioactividad se mide en un contador de escintilación de microplacas (TopCount, Packard, Meriden, CT). Se determinan los valores IC_{50} como la concentración del compuesto inhibidor que inhibe la transferencia de [^{3}H]CE desde la [^{3}H]CE-HDL de los sobrenadantes a las VLDL y LDL precipitadas en un 50% en comparación con la transferencia obtenida en los pocillos de control. El porcentaje máximo de transferencia (en los pocillos de control) se determina usando la siguiente ecuación:

% Transferencia = \frac{[dpm_{testigo} - dpm_{control}] \ x \ 100}{dpm_{testigo}}

El porcentaje de transferencia de control determinado en los pocillos que contienen compuestos inhibidores se determina como sigue:

% Control = \frac{[dpm_{testigo} - dpm_{ensayo}] \ x \ 100}{dpm_{testigo} - dpm_{control}}

Los valores IC_{50} se calculan a partir de gráficas del porcentaje de control versus la concentración de compuesto inhibidor.

Actividad de CETP in vitro

La capacidad de los compuestos para inhibir la actividad de CETP se evalúa empleando un ensayo in vitro que mide la velocidad de transferencia de éster de colesterilo radiomarcado ([^{3}H]CE) desde partículas donantes de HDL a partículas aceptoras de LDL. Los detalles del ensayo son ofrecidos por Glenn et al. (Glenn y Melton, "Quantification of Cholesteryl Ester Transfer Protein (CETP): A) CETP Activity an B) Immunochemical Assay of CETP Protein", Meth. Enzymol., 263, 339-351 (1996)). La CETP se puede obtener a partir del medio acondicionado, libre de suero, de células CHO transfectadas con un cDNA para CETP (Wang, S. et al. J. Biol. Chem., 267, 17487-17490 (1992)). Para medir la actividad de CETP, se incuban HDL radiomarcada con [^{3}H]CE, LDL, CETP y tampón de ensayo (50 mM de tris(hidroximetil)aminometano, pH 7,4; 150 mM de cloruro sódico; 2 mM de ácido etilendiamina-tetraacético, 1% de albúmina de suero bovino) en un volumen de 200 \mul, durante 2 horas a 37ºC en placas de 96 pocillos. La LDL se precipita diferencialmente por adición de 50 \mul de 1% (p/v) de sulfato de dextrano/0,5 M de cloruro de magnesio, se mezcla con movimiento vorticial y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. La solución (200 \mul) se transfiere a una placa de filtración (Millipore). Después de la filtración, se mide la radioactividad presente en la LDL precipitada mediante recuento por escintilación de líquidos. La corrección respecto a la transferencia o precipitación no específica se efectúa incluyendo muestras que no contienen CETP. La velocidad de transferencia de [^{3}H]CE usando este ensayo es lineal con respecto al tiempo y concentración de CETP, hasta 25-30% de [^{3}H]CE transferido.

La potencia de los compuestos de ensayo se puede determinar efectuando el ensayo antes descrito en presencia de concentraciones variables de los compuestos de ensayo y determinando la concentración requerida para una inhibición del 50% de la transferencia de [^{3}H]CE desde HDL a LDL. Este valor se define como IC_{50}. Los valores IC_{50} determinados a partir de este ensayo serán exactos cuando el valor IC_{50} sea mayor de 10 nM. En el caso en donde los compuestos tienen una mayor potencia inhibidora, las mediciones exactas de IC50 se pueden determinar usando tiempos de incubación más prolongados (hasta 18 horas) y concentraciones finales más bajas de CETP (< 50 nM).

Inhibición de la actividad de CETP in vivo

La inhibición de la actividad de CETP mediante un compuesto de ensayo se puede determinar administrando el compuesto a un animal por inyección intravenosa o mediante el uso de una sonda oral, midiendo la cantidad de transferencia de éster de colesterilo radiomarcado con tritio ([^{3}H]CE) desde partículas de HDL a VLDL y LDL, y comparando la cantidad de transferencia con la cantidad de transferencia observada en animales de control.

Se mantienen hamsters sirios dorados machos con una dieta para perros que contiene 0,24% de colesterol durante al menos 2 semanas antes del estudio. Para los animales que reciben una dosificación intravenosa, inmediatamente antes del experimento, los animales se anestesian con pentobarbital. La anestesia se mantiene durante todo el experimento. Se introducen catéteres fijos en la vena yugular y en la arteria carótida. Al comienzo del experimento todos los animales reciben 0,2 ml de una solución que contiene [^{3}H]CE-HDL en la vena yugular. [^{3}H]CE-HDL es un preparado de éster de colesterilo radiomarcado con tritio que contiene HDL humana, y se obtiene de acuerdo con el método de Glenn et al. (Meth. Enzymol., 263, 339-351 (1996)). El compuesto de ensayo se disuelve como una solución madre 80 mM en vehículo (2% etanol: 98% PEG 400, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA) y se administra bien mediante una inyección de bolo o bien mediante infusión continua. Transcurridos dos minutos desde la administración de la dosis de [^{3}H]CE-HDL, los animales reciben 0,1 ml de la solución del ensayo inyectada en la vena yugular. Los animales de control reciben 0,1 ml de la solución de vehículo intravenosa sin compuesto de ensayo. Después de 5 minutos, se toman las primeras muestras de sangre (0,5 ml) de la arteria carótida y se recogen en tubos de microvaloración estándar que contienen ácido etilendiamina-tetraacético. Se inyecta salina (0,5 ml) para lavar el catéter y se sustituye el volumen de sangre. Las posteriores muestras de sangre se toman a las 2 horas y 4 horas por el mismo método. Las muestras de sangre se mezclan bien y se mantienen en hielo hasta el término del experimento. Se obtiene plasma por centrifugado de las muestras de sangre a 4ºC. El plasma (50 \mul) se trata con 5 \mul de reactivo precipitante (sulfato de dextrano, 10 g/l; 0,5 M de cloruro de magnesio) para separar VLDL/LDL. Después del centrifugado, el sobrenadante resultante (25 \mul) que contiene la HDL se analiza respecto a la radioactividad usando un contador de escintilación de líquidos.

El porcentaje de [^{3}H]CE transferido desde HDL a LDL y VLDL (% de transferencia) se calcula en base a la radioactividad total en muestras de plasma equivalentes antes de la precipitación. Generalmente, la cantidad de transferencia de HDL a LDL y VLDL en los animales de control será de 20 a 35% después de 4 horas.

Alternativamente, animales conscientes, no anestesiados, pueden recibir una dosis oral por medio de sonda del compuesto de ensayo como una suspensión en 0,1% de metilcelulosa en agua. En un momento determinado para cada compuesto en donde los niveles en plasma de la sustancia de ensayo alcanzan su pico (C_{max}) después de la dosificación oral, los animales son anestesiados con pentobarbital y luego dosificados con 0,2 ml de una solución que contiene [^{3}H]CE-HDL en la vena yugular como se ha descrito anteriormente. Los animales de control reciben 0,25 ml de la solución de vehículo sin compuesto de ensayo mediante una sonda oral. Después de 4 horas, los animales son sacrificados, se recogen muestras de sangre y determina como se ha descrito anteriormente el porcentaje de [^{3}H]CE transferido desde HDL a LDL y VLDL (% de transferencia).

Alternativamente, la inhibición de la actividad de CETP por un compuesto del ensayo se puede determinar administrando el compuesto a ratones que han sido seleccionados respecto a la expresión de CETP humana (hCETP) mediante manipulación transgénica (ratones hCETP). Los compuestos del ensayo se pueden administrar por inyección intravenosa o mediante una sonda oral y se determina la cantidad de transferencia de éster de colesterilo radiomarcado con tritio ([3H]CE) desde partículas de HDL a partículas de VLDL y LDL y se compara con la cantidad de transferencia observada en los animales de control. Ratones C57B1/6 que son homocigotos respecto al gen de hCETP se mantienen con una dieta para perros de alto contenido en grasas, tal como TD 88051, en la forma descrita por Nishina et al. (J. Lipid Res., 31, 859-869 (1990)) durante al menos dos semanas antes del estudio. Los ratones reciben una dosis por sonda oral del compuesto de ensayo como una suspensión en 0,1% de metilcelulosa en agua o mediante una inyección de bolo intravenosa del compuesto del ensayo en 10% de etanol y 90% de polietilenglicol. Los animales de control reciben la suspensión de vehículos sin compuesto de ensayo mediante sonda oral o mediante una inyección de bolo intravenosa. Al comienzo del experimento todos los animales reciben 0,05 ml de una solución que contiene [^{3}H]CE-HDL en la vena del rabo. La [^{3}H]CE-HDL es un preparado de éster de colesterilo radiomarcado con tritio que contiene HDL humana y se obtiene de acuerdo con el método de Glenn et al. (Meth. Enzymol., 263, 339-351 (1996)). Después de 60 minutos, los animales son exsanguinados y se recoge sangre en tubos de microvaloración estándar que contienen ácido etilendiamina-tetraacético. Las muestras de sangre se mezclan bien y se mantienen en hielo hasta el término del experimento. El plasma se obtiene por centrifugado de las muestras de sangre a 4ºC. El plasma se separa y se analiza por cromatografía de filtración en gel y se determina la proporción relativa de [^{3}H]CE en las regiones de VLDL, LDL y HDL.

Se calcula el porcentaje de [^{3}H]CE transferido desde HDL a LDL y VLDL (% de transferencia) en base a la radioactividad total en muestras de plasma equivalentes antes de la precipitación. Normalmente, la cantidad de transferencia desde HDL a LDL y VLDL en los animales de control es de 20 a 35% después de 30 minutos.

Ensayo de la absorción intestinal de colesterol

Con este ensayo se demuestra que varios compuestos inhiben la absorción de colesterol del tracto intestinal. Estos compuestos bajan los niveles de colesterol en suero al reducir la absorción intestinal de colesterol tanto de origen exógeno (colesterol dietético) como de origen endógeno (segregado por la vesícula biliar hacia el tracto intestinal).

En hamsters, el uso de un método de la relación en plasma con doble isótopo, para medir la absorción intestinal de colesterol, ha sido refinado y evaluado en la forma descrita por Turley et al. (J. Lipid Res. 35, 329-339 (1994).

Se administran hamsters machos de 80-100 g de peso con alimento y agua ad libitum en una habitación con periodos alternos de 12 horas de luz y oscuridad. A las 4 horas en el periodo de luz, cada hámster se administra primeramente con una dosis intravenosa de 2,5 \muCi de [1,2-^{3}H]colesterol suspendido en Intralipid (20%) y luego con una dosis oral de [4-^{14}C]colesterol en un aceite de triglicéridos de cadena media (MCT). La dosis i.v. se suministra por inyección de un volumen de 0,4 ml de la mezcla Intralipid en la vena femoral distal. La dosis oral se suministra alimentando por sonda un volumen de 0,6 ml de la mezcla de aceite MCT introducida intragástricamente por vía de un tubo de polietileno. Después de 72 horas, se practica una sangría en los hamsters y se determina la cantidad de ^{3}H y ^{14}C en el plasma y en la cantidad original de marcador administrado mediante espectrometría de escintilación líquida. La absorción de colesterol se calcula en base a la siguiente ecuación:

Porcentaje de colesterol absorbido = \frac{% \ de \ dosis \ oral \ por \ ml \ de \ muestra \ de \ plasma \ a \ las \ 72 \ horas}{% \ de \ dosis \ i.v. \ por \ ml \ de \ muestra \ de \ plasma \ a \ las \ 72 \ horas} x 100

Ensayo de proteína microsómica de transferencia de triglicéridos (MTP)

La MTP se puede purificar a partir de tejido o células cultivadas de hígado (por ejemplo, células HepG2) usando métodos estándar como el descrito por Ohringer et al. (Acta Crystallogr. D52, 224-225 (1996).

El posterior análisis de la actividad de MTP se puede realizar en la forma descrita por Jamil et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 11991-11995 (1996).

La base de este ensayo consiste en medir la transferencia de triglicéridos radiomarcados desde una población de vesículas donantes a una población de vesículas aceptoras en presencia de MTP. Los inhibidores de MTP pueden ser evaluados añadiéndolos a la mezcla antes de de la introducción de MTP. Las vesículas donantes se preparan por sonicación de una mezcla acuosa de fosfolípitos de huevo, cardiolipina, fosfolípido marcado con ^{3}H y triglicéridos marcados con ^{14}C. Las vesículas aceptoras se preparan por sonicación de una mezcla acuosa de fosfolípidos de huevo. Las soluciones de vesículas se mezclan entre sí, con o sin adición de inhibidores de MTP, y se añade MTP para iniciar la reacción de transferencia. El ensayo se termina después de 60 minutos por adición de 0,5 ml de celulosa DE-52 seguido por centrifugado para pelletizar las moléculas donantes. La cantidad de ^{3}H y ^{14}C en el pellet y en la cantidad original del marcador en la mezcla se determina por espectrometría de escintilación de líquidos. La velocidad de transferencia de lípidos se calcula en base a una cinética de primer orden usando la expresión:

[S] = [S]_{0} \ e^{-kt}

en donde [S]_{0} y [S] son las fracciones de marcador ^{14}C en el pellet de la membrana donante en los tiempos 0 y t, respectivamente, y el término k es la fracción de marcador transferido por unidad de tiempo.

Análisis de lípidos en plasma de conejos

Los lípidos en plasma pueden ser analizados usando métodos estándar como los indicados por J.R. Schuh et al., J. Clin. Invest., 91, 1453-1458 (1993). Grupos de conejos blancos machos de New Zealand se ponen a una dieta estándar (100 g/día) suplementada con 0,3% de colesterol y 2% de aceite de maíz (Zeigler Bothers, Inc., Gardners, PA). Se suministra agua ad lib. Después de 1 y 3 meses de tratamiento se sacrifican grupos de control y grupos de animales tratados. Los tejidos son retirados para la caracterización de las lesiones ateroscleróticas. Se toman muestras de sangre para determinar las concentraciones de lípidos en plasma.

Lípidos en plasma

El plasma para el análisis de lípidos se obtiene extrayendo sangre de la vena de la oreja al interior de tubos que contienen EDTA (Vacutainer; Becton Dickenson & Co., Rutherford, NJ), seguido por separación centrífuga de las células. El colesterol total se determinar enzimáticamente, usando la reacción de colesterol oxidasa (C.A. Allain et al., Clin. Chem., 20, 470-475 (1974)). También se mide el colesterol HDL enzimáticamente, después de la precipitación selectiva de LDL y de VLDL por sulfato de dextrano y magnesio (G.R. Warnick et al., Clin. Chem., 28, 1379-1388 (1982)). Los niveles de triglicéridos en plasma se determinan midiendo la cantidad de glicerol liberado por lipoproteína lipasa a través de un análisis unido a una enzima (G. Bucolo et al., Clin. Chem., 19, 476-482 (1993)).

Aterosclerosis

Los animales son sacrificados mediante una inyección de pentobarbital. Las aortas torácicas son separadas rápidamente, fijadas por inmersión en formalina tamponada neutra al 10% y manchadas con oil red O (0,3%). Después de una sola incisión longitudinal a lo largo de la pared opuesta a la ostia arterial, los vasos son prendidos con alfileres para evaluar la superficie de la placa. El porcentaje de recubrimiento de la placa se determina a partir de los valores para la superficie total examinada y para la superficie manchada, mediante análisis de umbral empleando un analizador preciso de imágenes en color (Videometric 150; American Innovision, Incl., San Diego, CA), interconectado con una cámara de color (Toshiba 3CCD) dispuesta en un microscopio de disección. El colesterol del tejido se mide enzimáticamente como se ha descrito, después de la extracción con una mezcla de cloroformo/metanol (2:1) de acuerdo con el método de Folch et al. (J. Biol. Chem., 226, 497-509 (1957)).

Respuesta vascular in vitro

Las aortas abdominales son cortadas rápidamente, después de la inyección de pentobarbital sódico, y colocadas en tampón de bicarbonato-Krebs oxigenado. Una vez retirado el tejido perivascular, se cortan segmentos anulares de 3 mm, se colocan en un baño de músculos a 37ºC que contiene solución de bicarbonato-Krebs y se suspenden entre dos alambres de acero inoxidable, uno de los cuales está unido a un transductor de fuerza (Grass Instrument Co., Quincy, MA). En un aparato de registro de gráficos se registran los cambios de fuerza en respuesta a la angiotensina II añadida al baño.

Los ejemplos aquí ofrecidos pueden ser realizados empleando los compuestos terapéuticos o ingredientes inertes genérica o específicamente descritos en lugar de los utilizados en los ejemplos anteriores.

Habiendo descrito así la invención, es evidente que la misma puede ponerse en práctica de muchas formas. Dichas variaciones no han de ser consideradas como una desviación del alcance de la presente invención y queda contemplado que todas esas modificaciones y equivalentes, como serán evidentes para el experto en la materia, quedan incluidas dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Una combinación terapéutica que comprende una primera cantidad de un compuesto derivado de ácido nicotínico y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de éster de colesterilo, en donde la primera cantidad y la segunda cantidad comprenden conjuntamente una cantidad eficaz para un estado anti-hiperlipidémico, una cantidad eficaz para un estado anti-aterosclerótico o una cantidad eficaz para un estado anti-hipercolesterolémico de los compuestos y en donde dicho compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de éster de colesterilo está representado por la fórmula (C-12)

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o sus enantiómeros o racematos.

2. Una combinación terapéutica según la reivindicación 1, en donde el compuesto derivado de ácido nicotínico comprende ácido nicotínico.

3. Una combinación terapéutica según la reivindicación 1, en donde el compuesto derivado de ácido nicotínico comprende niceritrol.

4. Una combinación terapéutica según la reivindicación 1, en donde el compuesto derivado de ácido nicotinico comprende acipimox.

5. Uso de una combinación según la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de un estado hiperlipidémico.

6. Uso de una combinación según la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de un estado aterosclerótico.

7. Uso de una combinación según la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de hipercolesterolemia.